BRPI0307620B1 - Moléculas de polinucleotídeo codificando variantes de avec, métodos para produzir uma cepa recombinante de streptomyces avermitilis, bem como as referidas células recombinantes e composição de avermectinas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE POLINUCLEOTÍDEO CODIFICANDO VARIANTES DE AVEC, MÉTO- DOS PARA PRODUZIR UMA CEPA RECOMBINANTE DE STREPTOMY- CES AVERMITILIS, BEM COMO AS REFERIDAS CÉLULAS RECOMBI- NANTES E COMPOSIÇÃO DE AVERMECTINAS".

1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições e métodos para a produção eficiente de avermectinas tais como "doramectina", que são princi- palmente úteis no campo da saúde animal. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a moléculas de polinucleotídeo compreendendo seqüên- cias de nucleotídeo codificando um produto de gene AveC, o qual pode ser usado para modular a razão de avermectinas de classe 2:1 produzidas por culturas de fermentação de Streptomyces avermitilis. A presente invenção refere-se ainda a vetores, células do hospedeiro transformadas, e novas ce- pas mutantes de S. avermitilis em que o gene aveC foi submetido à mutação de modo a modular a razão de avermectinas de classe 2:1 produzidas.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 2.1 - Avermectinas As espécies Streptomyces produzem uma ampla variedade de metabolitos secundários, incluindo as avermectinas, que compreendem uma série de oito latonas macrocíclicas com dezEsseis membros afins apresen- tando potente atividade anti-helmíntica e inseticida. Os oito compostos distin- tos mas intimamente relacionados são referidos como A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B2a e B2b. A série "a" de compostos refere-se à avermectina natural onde o substituinte na posição C25 é (S)-sec-butila, e a série "b" refere-se aos compostos onde o substituinte na posição C25 é isopropila. As designações "A" e "B" referem-se a avermectinas onde o substituinte na posição C5 é me- tóxi e hidróxi, respectivamente. O número "1" refere-se a avermectinas onde esteja presente uma dupla ligação na posição C22,23, e o número "2" refere- se a avermectinas tendo um hidrogênio na posição C22 e um hidróxi na posi- ção C23. Dentre as avermectinas afins, o tipo B1 de avermectina, tal como doramectina, é reconhecido com possuindo a atividade antiparasitária e pesti- cida mais eficaz, sendo assim a avermectina comercial mente mais desejável.

As avermectinas e a sua produção por fermentação aeróbica de cepas de S. avermitilis são descritas nas Patentes dos E.U.A. Nos. 4.310.519 e 4.429.042. Pensa-se que a biossíntese de avermectinas natu- rais seja iniciada endogenamente a partir dos análogos de tioéster CoA de ácido isobutírico e ácido S-(+)-2-metiI butírico.

Uma combinação tanto da melhoria da cepa através de mutagê- nese aleatória como a utilização de ácidos graxos fornecidos exogenamente levou à produção eficiente de análogos da avermectina. Mutantes de S. avermitilis que são deficientes em desidrogenase de ácido 2-oxo de cadeia ramificada (mutantes deficientes em bkd) podem apenas produzir avermecti- nas quando as fermentações são suplementadas com ácidos graxos. Ras- treamento e isolamento de mutantes deficientes em atividade de desidroge- nase de cadeia ramificada (por exemplo, S. avermitilis, ATCC 53567) são descritos na Patente Européia (EP) 276103. A fermentação desses mutantes na presença de ácidos graxos fornecidos de um modo exógeno dá origem à produção de apenas as quatro avermectinas correspondendo ao ácido graxo utilizado. Assim, a suplementação de fermentações de S. avermitilis (ATCC 53567) com ácido S-(+)-2-metilbutírico dá origem à produção das avermecti- nas naturais A1a, A2a, B1a e B2a; fermentações de suplementação com ácido isobutírico dão origem à produção das avermectinas naturais A1b, A2b, B1 b, e B2b; e fermentações de suplementação com ácido ciclopenta- nocarboxílico dão origem à produção das quatro novas ciclopentílavermecti- nas A1, A2, B1 e B2.

Se forem suplementadas com outros ácidos graxos, produzir-se- ão novas avermectinas. Ao rastrear 800 precursores potenciais, foram iden- tificadas mais de 60 outras novas avermectinas. (Ver, por exemplo, Dutton et ai., 1991, J. Antibiot 44:357-365; e Banks et ai, 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Além disso, mutantes de S. avermitilis deficientes em atividade de 5-O-metiltransferase produzem essencialmente apenas as avermectinas análogas B. Conseqüentemente, mutantes de S. avermitilis faltando tanto a desidrogenase do ácido 2-oxo de cadeia ramificada como a atividade da 5- O-metiltransferase produzem apenas as avermectinas B correspondendo ao ácido graxo utilizado para suplementar a fermentação. Assim, a suplementa- ção desses duplos mutantes com ácido S-(+)-2-metilbutírico dá origem à produção de apenas as avermectinas naturais B1a e B2a, enquanto que a suplementação com ácido isobutírico ou com ácido ciclopentanocarboxíiico dá origem à produção das avermectinas naturais B1b e B2b ou das novas avermectinas ciclopentila B1 e B2, respectivamente. A suplementação da cepa de mutação dupla com ácido ciclohexano carboxílico constitui um mé- todo preferido para a produção da nova avermectina comercialmente impor- tante, ciclohexilavermectina B1 (doramectina). O isolamento e características desses duplos mutantes, por exemplo S. avermitilis (ATCC 53692), são des- critos em EP 276103. 2.2. Genes Envolvidos na Biossíntese de Avermectina Em muitos casos, genes envolvidos na produção de metabolitos secundários e genes codificando um antibiótico particular são encontrados agrupados entre si no cromossomo. Isso acontece com o agrupamento de gene de sintase policetônica de Streptomyces (PKS) (ver Hopwood and Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:37-66). Assim, uma estratégia para clonar genes em uma via biossintética consistiu em isolar um gene de resis- tência à droga e em seguida testar regiões adjacentes do cromossomo quanto a outros genes relacionados com a biossíntese desse antibiótico par- ticular. Uma outra estratégia para clonar genes envolvidos na biossíntese de metabolitos importantes consistiu na complementação de mutantes. Por exemplo, porções de uma biblioteca de DNA a partir de um organismo capaz de produzir um metabolito particular são introduzidas em um mutante não- produtor e transformantes rastreados para produção de metabolitos. Adicio- nalmente, a hibridização de uma biblioteca usando sondas derivadas de ou- tras espécies de Streptomyces foi usada para identificar e clonar genes em vias biossintéticas.

Genes envolvidos na biossíntese de avermectina (genes ave), tal como os genes requeridos para biossíntese de outros metabolitos secun- dários de Steptomyces (por exemplo, PKS), são encontrados agrupados no cromossomo. Vários genes ave foram clonados com sucesso usando veto- res para complementar mutantes de S. avermitilis bloqueados na biossíntese de avermectina. A clonagem desses genes é descrita na Patente dos E.U.A.

No. 5.252.474. Além disso, Ikeda et ai, 1995, J. Antibiot. 48:532-534, des- creve a localização de uma região cromossômica envolvendo a etapa de desidratação (aveC) até um fragmento SamHI 4,82 Kb de S. avermitilis, as- sim como mutações no gene aveC que dão origem à produção de um único produtor de componente B2a. Como a ivermectina, um potente composto anti-helmíntico, pode ser produzido quimicamente a partir de avermectina B2a, um tal único produtor de avermectina B2a é considerado como sendo particularmente útil para produção comercial de avermectina. A Patente dos E.U.A. No. 6.248.579 por Stutzman-Engwalt et al., publicada em 19 de Junho de 2001, descreve certas mutações para o gene aveC de Streptomyces avermitilis levando a uma redução na razão ciclohexil B2:ciclohexi! B1 até uma razão de cerca de 0,75:1. A Publicação PCT WO 01/12821 por Pfizer Products Inc., publi- cada em 22 de Fevereiro de 2001, descreve certas mutações adicionais para o gene aveC de Streptomyces avermitilis levando a posteriores reduções na razão entre ciclohexil B2:ciclohexil B1 até 0,40:1. A identificação de mutações adicionais ou de combinações de mutações no gene aveC que ainda minimizam mais a complexidade da pro- dução de avermectina, tal como, por exemplo, mutações que diminuem mais a razão B2:B1 de avermectinas, iria simplificar a produção e purificação de avermectinas comercialmente importantes.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma molécula de polinucleotí- deo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é por outro lado igual ao alelo de aveC de Streptomyces avermitilis, a seqüência que codifica o produto gene AveC de S. avermitilis de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou a seqüência de nucleotídeos do ORF aveC de S. avermitilis tal como é apresentada na Figura 1 (SEQ ID NO:1), ou uma sua variante degenerada, mas cuja seqüência de nucleotídeos compreende ainda mutações que codi- ficam uma combinação de substituições de aminoácidos em resíduos de aminoácidos correspondendo às posições de aminoácidos de SEQ ID NO:2, de modo a que as células de S.avermitilis da cepa ATCC 53692, em que o alelo aveC do tipo selvagem foi inativado e que expressa a molécula de poli- nucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos com mutação, sejam capazes de produzir uma razão da classe 2:1 de avermectinas que seja reduzida em comparação com a razão produzida por células da cepa S.

avermitilis ATCC 53692 que pelo contrário expressam apenas o alelo aveC do tipo selvagem, em que quando as avermectinas da classe 2:1 são aver- mectinas ciclohexil B2:ciclohexíl B1, a razão das avermectinas da classe 2:1 seja de 0,35:1 ou menor. Em uma modalidade mais preferida, a razão entre avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,30:1 ou inferior. Em uma modalidade mais preferida, a razão entre avermectinas ciclohexil B2:cic!ohexil B1 é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Em uma modalidade mais preferida, a razão entre avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,20:1 ou inferior.

Em uma modalidade particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende uma combinação selecionada dentre o grupo consistindo em: (a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S; (j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L; (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (l) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L; (n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (o) Y28C, D48E, Α61Τ, Α89Τ, S138T, Α139Τ, G179S, E238D; (ρ) D48E, Α61Τ, Α107Τ, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L; (q) D48E, L136P, G179S, R250W; (r) D48E, Α89Τ, S138T, Α139Τ, R163Q, G179S; (s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L; (t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L; (v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S; (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D; (z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S; (ab) D84E, L136P, R163Q, G179S, S231L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S, P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q63R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, Κ154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; e (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. A presente invenção proporciona ainda uma molécula de polinu- cleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é por outro lado a mesma que o alelo aveC de Streptomyces avermitffls, a seqüência codificando produto AveC de S. avermititis de plasmídeo pSE 186 (ATCC 209604) ou a seqüência de nucleotídeos do ORF aveC de S. avermitilis tal como está presente na Figura 1 (SEQ ID NO:1), ou uma sua variante dege- nerada, mas cuja seqüência de nucleotídeos compreende ainda mutações codificando uma combinação de substituições de resíduos de aminoácidos correspondendo às posições de aminoácido de SEQ ID NO:2, de modo a que as células de S. avermitilis da cepa ATCC 53692, em que o alelo aveC do tipo selvagem foi inativado e que expressa uma molécula de polinucleotí- deo compreendendo a seqüência de nucleotídeos submetida à mutação, seja capaz de produzir uma razão 2:1 de avermectinas que seja reduzida em comparação com a razão produzida por células da cepa S. avermitilis ATCC 53692 que como alternativa expresse apenas o aielo aveC do tipo selvagem em que quando a classe de avermectinas 2:1 é constituída por avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, a razão das avermectinas da classe 2:1 seja re- duzida até cerca de 0,40:1 ou inferior, e em que a combinação de substitui- ções de aminoácido compreenda uma combinação selecionada dentre o grupo consistindo em: (bf) D48E, S138T, Α139T, G179$, E238D; e (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D. A presente invenção proporciona ainda um vetor recombinante compreendendo uma molécula de polinucleotídeo da presente invenção. A presente invenção proporciona ainda uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de polinucleotídeos ou um vetor recombi- nante da presente invenção. Em uma modalidade preferida, a célula hospe- deira é uma célula de Streptomyces. Em uma modalidade mais preferida, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces avermitilis. A presente invenção proporciona ainda um método para produzir uma nova cepa de Streptomyces avermitilis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC em uma célula de uma cepa de S. avermitilis, cuja mutação dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introduzindo para uma célula de uma cepa de S. avermitilis um alelo aveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codifi- cando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substi- tuições de aminoácido, em que a combinação de substituições de aminoáci- do é selecionada dentre (a) até (b) acima indicados. A presente invenção proporciona ainda um método para produzir uma nova cepa de Streptomyces avermitilis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC em uma célula de uma cepa de S. avermitilis, cuja mutação dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introduzindo em uma célula de uma cepa de S. avermitilis um alelo aveC submetida à mutação ou uma sua variante degenerada codifi- cando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substi- tuições de aminoácido, em que células compreendendo o alelo aveC sub- metido à mutação ou uma sua variante degenerada sejam capazes de pro- duzir avemnectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,35:1 ou inferior. Em uma modalidade não-limitativa, o alelo AveC submetido à muta- ção ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC com- preendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em (a) a (b) acima indicados.

Em uma modalidade preferida, a razão de avermectinas ciclohe- xil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,30:1 ou inferior. Em uma modalidade não-limitativa, o alelo aveC ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.

Em uma modalidade preferida. A razão de avermectinas ciclohe- xil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Em uma modalidade não-limitativa, o alelo aveC submetido à mutação ou uma sua variante dege- nerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.

Em uma modalidade mais preferida, a razão de avermectinas cicfohexilB2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,20:1 ou inferior. Em uma modali- dade não-iímitatíva, o alelo aveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combina- ção de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. A presente invenção proporciona ainda um método para produzir uma nova cepa de Streptomyces avermitilís, compreendendo (I) mutação do alelo aveC em uma célula de uma cepa de S. avermitilís, cuja mutação dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introduzindo em uma célula de uma cepa de S. avermitilís um alelo aveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codifi- cando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substi- tuições de aminoácido, em que a combinação de substituições de aminoáci- do é selecionada dentre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados.

Em uma modalidade preferida, células de S. avermitiiis compreendendo esse alelo aveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada são capazes de produzir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexíl B1 em uma razão de cerca de 0,40:1 ou inferior. A presente invenção proporciona ainda uma célula de uma es- pécie de Streptomyces que compreende um alelo aveC de S. avermitiiis submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um pro- duto gene AveC compreendendo uma combinação de substituição de ami- noácido selecionada dentre (a) a (be) acima indicados. Em uma modalidade preferida, a espécie de Streptomyces é S. avermitiiis. A presente invenção proporciona ainda uma célula de Streptomyces avermitiiis capaz de produzir avermectinas ciclohexil B2:cic!ohexil B1 em uma razão de 0,35:1 ou inferior. Em uma modalidade não-limitativa, a célula compreende um alelo aveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compre- endendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada den- tre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicados.

Em uma modalidade preferida, a razão de avermectinas ciclohe- xil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 30:1 ou inferior. Em uma modalidade não- limitativa, as células compreendem um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compre- endendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada den- tre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.

Em uma modalidade mais preferida, a razão de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Em uma modali- dade não-limitativa, as células compreendem um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido se- lecionada dentre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.

Em uma modalidade mais preferida, a razão de avermectinas ciciohexil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,20:1 ou inferior. Em uma modali- dade não-limitativa, as células compreendem um aleto AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido se- lecionada dentre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. A presente invenção proporciona ainda uma espécia de Streptomyces, compreendendo um alelo aveC de S. avermitiiis ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados. Em uma modalidade preferida, a espécie de Streptomyces é S. avermitiiis. Em uma modalidade mais preferi- da, a célula é uma célula de S. avermitiiis capaz de produzir avermectinas ciciohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de cerca de 0,40:1 ou inferior. A presente invenção proporciona ainda um processo para a pro- dução de avermectinas, compreendendo a cultura de uma cepa de células de Streptomyces avermitiiis da presente invenção em meio de cultura em condições que permitam ou induzam a produção de avermectinas a partir dela, e recuperando as referias avermectinas a partir da cultura. A presente invenção proporciona ainda uma composição de avermectinas ciciohexil B2:ciciohexil B1 produzidas por células de Streptomyces avermitiiis, compreendendo as avermectinas ciciohexil B2:ciclohexi! B1 presentes em um meio de cultura em que as células foram cultivadas, em que a razão de avermectinas ciciohexil B2:dclohexil B1 pre- sente no meio de cultura seja de 0,35:1 ou inferior, de preferência de cerca de 0,30:1 ou inferior, com maior preferência cerca de 0,25:1 ou inferior, e com maior preferência cerca de 0,20:1 ou inferior. Em uma modalidade par- ticular, a composição de avermectinas ciciohexil B2:ciclohexil B1 é produzida por células de uma cepa de S. avermitiiis que expressa um alelo AveC sub- metido à mutação ou uma sua variante degenerada que codifica um produto gene que dá origem à redução da razão da classe 2:1 de avermectinas ci- ciohexil B2:ciclohexil B1 produzido pelas células em comparação com célu- Ias da mesma cepa de S. avermitilis que não expressam o alelo AveC sub- metido à mutação mas em vez disso expressam apenas o alelo aveC do tipo selvagem.

Em uma modalidade preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,35:1 ou infe- rior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um pro- duto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de ami- noácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indi- cados.

Em uma outra modalidade preferida, onde a composição é cons- tituída por avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de cerca de 0,30:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codi- ficando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de subs- tituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.

Em uma outra modalidade preferida, onde a composição é cons- tituída por avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de cerca de 0,25:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codi- ficando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de subs- tituições de aminoácido selecionada dentre os grupos consistindo em de (w) a (be) acima indicados.

Em uma outra modalidade preferida, onde a composição é cons- tituída por avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,20:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. A presente invenção proporciona ainda uma composição cons- tituída por avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 produzidas por células de Streptomyces avermitilis, compreendendo as avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes em um meio de cultura em que as células tenham sido cultivadas, em que a razão de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes no meio de cultura seja de cerca de 0,40:1 ou inferior, e produzi- das por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compre- endendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada den- tre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados. 4. BREVE DESCRIÇÃO DAS Figuras Figura 1. Seqüência de DNA (SEQ ID NO:1) compreendendo ORF aveC S. avermitilis, e seqüência de aminoácido deduzida (SEQ ID NO:2) Figura 2. Vetor de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) compre- endendo a totalidade de ORF do gene aveC de S. avermitilis.

Figura 3. Vetor de substituição de gene pSE180 (ATCC 209605) compreendendo o gene ermE de Sacc. erythraea inserido no ORF aveC de 5. avermitilis.

Figura 4. Mapa de restrição BamH\ do agrupamento de gene de sintase policetônica de avermectina a partir de S. avermitilis com cinco clo- nes cosmídios sobrepostos identificados (isto é, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). A relação de pSE118 e pSE119 é também indicada.

Figura 5. Análise por HPLC de produtos de fermentação produ- zidos por cepas de S. avermitilis. A quantificação de pico foi realizada por comparação com quantidades padrão de ciclohexil B1. O tempo de retenção de ciclohexil B2 foi de 7,4-7,7 minutos; o tempo de retenção de ciclohexil B1 foi de 11,9-12,3 minutos. Figura 5A Cepa de S. avermitilis SE180-11 com um ORF aveC inativado. Figura 5B. cepa de S. avermitilis SE180-11 transfor- mada com pSE186 (ATCC 209604). Figura 5C. Cepa de S. avermitilis SE180-11 transformada com pSE187. Figura 5D. Cepa de S. avermitilis SE180-11 transformada com pSE188.

Tabela 6A-M. Lista combinada de combinações de substituições de aminoácido codificada por mutações com o alelo aveC tal como foi identi- ficado por uma segunda volta de "rearranjo de gene", e seus efeitos sobre a razão de produção de ciclohexil B2:ciclohexil B1. Para cada plasmídeo, na coluna com o título "Mutações", as listas de caixa superior indicam as subs- tituições de aminoácido, e as listas de caixa inferior indicam as modificações da base de nucleotídeo que dão origem a essas substituições de aminoáci- do. As modificações da base de nucleotídeo em parênteses são modifica- ções silenciosas, isto é, não dão origem a modificações para a seqüência de aminoácidos.

5. DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à identificação e caracterização de moléculas de polinucleotídeo apresentando seqüências de nucleotídeos que codificam o produto gene AveC a partir de Steptomyces avermitilis, a construção de novas cepas de S. avermitilis que podem ser usadas para rastrear produtos de gene AveC submetido à mutação quanto ao seu efeito sobre a produção de avermectina, e a descoberta de que certos produtos de gene AveC submetidos à mutação pode reduzir a razão de avermectinas B2:B1 produzidas por S. avermitilis. A título de exemplo, a invenção é des- crita nas secções mais abaixo para uma molécula de polinucleotídeo tendo quer uma seqüência de nucleotídeo que é igual à seqüência de codificação do produto gene AveC de S. avermitilis de plasmídeo pSE186 (ATCC

209604), quer a seqüência de nucleotídeos do ORF da Figura 1 (SEQ ID NO:1), e para moléculas de polinucleotídeos apresentando seqüências de nucleotídeos deles derivados e suas variantes degeneradas. Contudo, os princípios indicados na presente invenção podem ser aplicados de um modo análogo a outras moléculas de polinucleotídeos, incluindo genes de homólo- go aveC a partir de outra espécie de Streptomyces, por exemplo, S. hygros- copicus e S. griseochromogenes, entre outros. 5.1. Moléculas de Polinucleotídeo Codificando o Produto Gene AveC de S, avermitilis A presente invenção proporciona uma molécula isolada de poli- nucleotídeo compreendendo o ORF aveC completo de S. avermitilis ou uma sua porção substancial, a cuja molécula isolada de polinucleotídeo falta o ORF completo seguinte que está localizado para baixo a partir do ORF aveC in situ no cromossomo de S. avermitilis. A molécula isolada de polinucleotídeo da presente invenção compreende de preferência uma seqüência de nucleotídeos que é igual à seqüência que codifica o produto gene AveC de S. avermitilis de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou que é igual à seqüência de nucleotídeo do ORF da Figura 1 (SEQ ID NO:1) ou uma sua porção substancial. Tal como é aqui usada, uma "porção substancial" de uma molécula isolada de polinucleotí- deo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando o produto gene AveC de S. avermitilis significa uma molécula isolada de polinucleotí- deo compreendendo pelo menos cerca de 70% da seqüência ORF aveC completa apresentada na Figura 1 (SEQ ID NO:1), e que codifica um produto gene AveC funcionalmente equivalente. A este respeito, um produto gene AveC "funcionalmente equivalente" é definido como um produto gene que, quando expresso na cepa ATCC 53692 de S. avermitilis em que o alelo aveC nativo foi inativado, dá origem à produção de uma razão e quantidade de avermectinas substancialmente iguais às avermectinas produzidas por cepa de S. avermitilis ATCC 53692 que em alternativa expressa apenas o alelo nativo aveC funcional, do tipo selvagem para a cepa S. avermitilis ATCC 53692.

Para além da seqüência de nucleotídeos do ORF aveC, a molé- cula isolada de polinucleotídeo da presente invenção pode ainda compreen- der seqüências de nucleotídeos que naturalmente flanqueam o gene aveC in situ no S. avermitilis, tais como as que flanqueiam seqüências de nucleotí- deos apresentadas na Figura 1 (SEQ ID NO:1). A presente invenção proporciona ainda uma molécula isolada de polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1 ou uma sua variante degenerada, como baseada na degeneração co- nhecida do código genético.

Tal como são aqui usados, os termos "molécula de polinucleotí- deo," "seqüência de polinucleotídeos," "seqüência de codificação", "quadro de leitura aberta," e "ORF" pretendem referir-se às moléculas tanto de DNA como de RNA, que podem ter hélice simples ou hélice dupla, e que podem ser (DNA) transcritos e traduzidos, ou (RNA) traduzido, para um produto ge- ne AveC, ou para um polipeptideo que seja homólogo para um produto gene AveC em um sistema de expressão de célula hospedeira apropriada quando colocado sob o controle de elementos reguladores apropriados. Uma se- qüência de codificação pode incluir, mas não se limita a, seqüências procari- óticas, seqüências cDNA, seqüências de DNA genômicas, e seqüências de DNA e de RNA sintetizadas quimicamente.

A seqüência de nucleotídeos apresentada na Figura 1 (SEQ ID NO:1)compreende quatro códons GTG diferentes em posições bp 42, 174, 177 e 180. Tal como foi previamente descrito na Patente dos E.U.A. No.

6.248.579, múltiplas deleções da região 5’ do ORF aveC (Figura 1; SEQ ID NO.:1)foram construídas para ajudar a definir qual dos códons poderia funci- onar no aveC ORF como sítios de partida para expressão proteica. A dele- ção do primeiro sítio GTG a bp 42 não elimina a atividade AveC. Deleção adicional de todos os códons GTG nas posições bp 174, 177 e 180 em con- junto eliminaram a atividade de AveC, indicando que esta região é necessá- ria para expressão proteica. A presente invenção abrange assim ORFs aveC de amplitude variável. A presente invenção proporciona ainda uma molécula de polinu- cleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeos que é homologa em relação à seqüência que codifica o produto gene AveC de S. avermitilis de plasmí- deo pSE186 (ATCC 209604), ou em relação à seqüência de nucleotídeos do ORF aveC apresentada na Figura 1 (SEQ ID NO:1) ou uma sua porção substancial. O termo "homólogo" quando usado para se referir a uma molé- cula de polinucleotídeo que seja homóloga em relação a uma seqüência que codifica produto gene AveC de S. avermitilis significa uma molécula de poli- nucleotídeo tendo uma seqüência de polinucleotídeos: (a) que codifique o mesmo produto gene AveC tal como a seqüência de codificação de produto gene AveC de S. avermitilis de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou que codifique o mesmo produto gene AveC que a seqüência de nucleotídeos do ORF aveC apresentado na Figura 1 (SEQ ID NO:1), mas que inclua uma ou mais modificações silenciosas de acordo com a degeneração do código ge- nético (isto é, uma variante degenerada); ou (b) que hibridize para o com- plemento de uma molécula de polinucleotídeo tendo uma sequência de nu- cleotídeos que codifique a seqüência de aminoácido codificada pela sequên- cia de codificação de produto gene AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou que codifique a seqüência de aminoácidos apresentada na Figu- ra 1 (SEQ ID NO:2) em condições moderadamente rigorosas, isto é, hibridi- zação para DNA ligado por filtração em NaHP04 0,5 M, sulfato de dodecila de sódio (SDS) a 7%, EDTA 1 mM a 65°C, e lavagem em 0,2xSSC/0,1% SDS a 42°C (ver Ausubel et aí. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Bioloqy, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., e John Wiley & Sons, Inc., New York, na p. 2.10.3), e codifica um produto gene AveC funcionalmente equivalente tal como foi acima definido. Em uma modalidade preferida, a molécula de polinucleotídeo homólogo hibridiza para o complemento da se- qüência de nucleotídeos que codifica o produto gene AveC de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou para o complemento da seqüência de nucleotí- deos do aveC ORF apresentado na Figura 1 (SEQ ID NO:1) ou uma sua porção substancial em condições altamente rigorosas, isto é, hibridização para DNA ligado por filtração em NaHP04 0,5 M, SDS a 7%, EDTA 1 mM a 65°C, e lavagem em 0,1xSSC/0,1% SDS a 68°C (Ausubel et a!., 1989, acima referido), e codifica um produto gene AveC funcionalmente equivalente, tal como foi acima definido. A atividade de um produto gene AveC e de seus equivalentes funcionais potenciais pode ser determinada através de análise HPLC de produtos de fermentação, tal como será descrito nos exemplos apresentados mais abaixo. Moléculas de polinucleotídeo tendo seqüências de nucleotídeo que codificam equivalentes funcionais do gene AveC de S. avermitilis podem incluir genes AveC que ocorram naturalmente presentes em outras cepas de S. avermitilis, com genes aveC homólogos presentes em outras espécies de Streptomyces, e sofrendo mutação com alelos aveC, quer ocorrendo natu- ralmente quer ocorrendo por engenharia. A presente invenção proporciona ainda uma molécula de poli- peptídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um poiipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos que seja homóloga em relação à seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência que codifica produto gene AveC de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou a seqüência de aminoácido da Figura 1 (SEQ ID NO:2) ou sua porção substancial. Tal como é aqui usada, "porção substancial" da seqüência de aminoácidos da Figura 1 (SEQ ID NO:2) significa um poiipeptídeo compreendendo pelo me- nos cerca de 70% da seqüência de aminoácidos apresentada na Figura 1 (SEQ ID NO:2), e que constitui um produto gene AveC funcionalmente equi- valente, tal como foi acima definido.

Tal como é aqui usado para se referir às seqüências de aminoá- cido que sejam homólogas em relação à seqüência de aminoácidos de um produto gene AveC de S. avermitilis, o termo "homólogo" refere-se a um po- lipeptídeo o qual de outro modo tem a seqüência de aminoácidos da Figura 1 (SEQ ID NO:2), mas em que um ou mais resíduos de aminoácido foi(ram) substituído(s) de um modo moderado com um resíduo de aminoácido dife- rente, em que a seqüência de aminoácidos tem pelo menos cerca de 70%, com maior preferência pelo menos cerca de 80%, e com a maior preferência pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência de aminoácidos para o poiipeptídeo codificado pela seqüência que codifica o produto gene AveC de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou a seqüência de aminoácidos da Figura 1 (SEQ ID NO:2) tal como é determinado por qualquer algoritmo de identidade de seqüência de aminoácidos padrão, tal como o algoritmo BLASTP (GENBANK, NCBI), e onde essa substituição moderada dá origem a um produto gene funcionalmente equivalente, tal como foi acima definido.

Substituições moderadas de aminoácido são bem-conhecidas nesta técnica.

Regras para fazer essas substituições incluem as descritas por Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3, en- tre outros. Mais especificamente, substituições moderadas de aminoácido são aquelas que geralmente têm lugar em uma família de aminoácidos que estão relacionados com a acidez ou com a polaridade. Aminoácidos codifi- cados geneticamente são geralmente divididos em quatro grupos: (1) ácido = aspartato, glutamato; (2) básico = lisina, arginina, histidina; (3) não-polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan; e (4) polar não-carregado = glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofan e tírosina são também classificados em conjunto como aminoácidos aromáticos. Uma ou mais substituições em qualquer grupo particular, por exemplo, de uma leucina com uma isoleucina ou valina, ou de um aspartato com um glutamato, ou de uma treonina com uma serina, ou de qualquer outro resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido estruturalmente afim, por exemplo, um resíduo de aminoácido com acidez ou polaridade semelhante, ou com semelhança em alguma sua combinação, terão geralmente um efeito insignificante sobre a função do polipeptideo. A produção e manipulação das moléculas de polinucleotídeo aqui apresentadas são evidentes para qualquer versado nesta técnica e po- dem ser realizadas de acordo com técnicas recombinantes descritas, por exemplo, em Maniatis, et ai, 1989, Molecular Cloninq, A Laboratorv Manual.

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 1989, Current Protocols In Molecular Bioloqy, Greene Publishing Associ- ates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et ai, 1989, Molecular Cloninq: A

Laboratorv Manual. 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et ai, (eds), 1995, PCR Strateqies. Academic Press, Inc., San Diego; e Erlich (ed), 1992, PCR Technoloav. Oxford Univer- sity Press, New York, sendo todos eles aqui incorporados como referência.

Clones de polinucleotídeo codificando produtos de gene homólogo AveC podem ser identificados usando qualquer método conhecido nesta técnica, incluindo mas não se limitado aos métodos indicados na Seção 7, mais abaixo. Bibliotecas de DNA genômico podem ser rastreadas para aveC e seqüências de codificação homóloga de aveC usando técnicas tais como os métodos indicados em Benton and Davis, 1977, Science 196:180, para bibli- otecas bacteriófagas, e em Grunstein e Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 72:3961-3965, para bibliotecas de plasmídeos. Moléculas de poli- nucleotídeos tendo sequências de nucleotídeos conhecidas por incluírem ORF aveC, como é evidente, por exemplo, em plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou em plasmídeo pSE119 (descrito na Seção 7, mais abaixo), po- dem ser usadas como sondas nessas experimentações de rastreio. De um modo alternativo, podem ser sintetizadas sondas de oligonucleotídeos que correspondem a seqüências de nucleotídeos deduzidas a partir de seqüên- cias de aminoácidos parciais ou completas do produto gene homólogo AveC purificado. 5.2, Sistemas Recombinantes 5.2.1, Clonagem e Vetores de Expressão A presente invenção proporciona ainda vetores de clonagem recombinante e vetores de expressão que são úteis na clonagem ou expres- são de moléculas de polinucleotídeos da presente invenção, compreenden- do, por exemplo, o ORF aveC de S. avermitilis ou qualquer ORFs homólogo aveC. Em uma modalidade não-limitativa, a presente invenção proporciona plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), que compreende o ORF completo do gene aveC de S. avermitilis.

Toda a descrição que se segue no que se refere a ORF aveC de S. avermitilis, ou uma molécula de polinucleotídeo compreendendo o ORF aveC de S. avermitilis ou sua porção, ou um produto gene AveC de S. aver- mitilis, também se refere a alelos aveC com mutação tal como é descrito mais abaixo, a não ser que seja indicado de um modo explícito ou por con- texto.

Foi desenvolvida uma série de diferentes vetores para utilização específica em Streptomyces, incluindo fago, plasmídeos com elevado núme- ro de cópias, plasmídeos com baixo número de cópias, e vetores do tipo ponte (shuttle vector) de E.colbStreptomyces, entre outros, e qualquer um destes poderá ser usado para realizar a presente invenção. Vários genes de resistência à droga foram também clonados a partir de Streptomyces, e vári- os destes genes foram incorporados para vetores como marcadores que se possam selecionar. São apresentados exemplos de vetores correntes para utilização em Streptomyces, entre outros locais, em Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190.

Vetores recombinantes da presente invenção, particularmente vetores de expressão, são de preferência construídos de modo a que a se- qüência de codificação para a molécula de polinucleotídeo da invenção se encontre em associação operativa com um ou mais elementos reguladores necessários para transcrição e transdução da seqüência de codificação para produzir um polipeptideo. Tal como é aqui usado, o termo "elemento regula- dor" inclui, mas não se limita a, sequências de nucleotídeos que codificam promotores induzíveis e não-induzíveis, agentes que melhoram, operadores e outros elementos conhecidos nesta técnica que servem para conduzir e/ou regular a expressão das seqüências de codificação do polinucleotídeo. Tam- bém, tal como é aqui usada, a seqüência de codificação encontra-se em "associação operativa" com um ou mais elementos reguladores onde os elementos reguladores regulam efectivamente e permitem a transcrição da seqüência de codificação ou a transdução do seu mRNA, ou ambos.

Vetores de plasmídeo típicos que podem ser submetidos à en- genharia para conterem uma molécula de polinucleotídeo da presente inven- ção incluem pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (promega), e o vetor do tipo ponte pWHN3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171:5872-5881), entre muitos outros. São bem-conhecidos métodos nesta técnica para a construção de vetores recombinantes contendo seqüências de codificação particulares em associação operativa com elementos reguladores apropriados, e estes podem ser usados para praticar a presente invenção. Estes métodos inclu- em técnicas recombinantes in vitro, técnicas recombinantes, técnicas sintéti- cas, e recombinação genética in vivo. Ver, por exemplo, as técnicas descri- tas em Maniatis et ai, acima referidos; Ausubel et ai, 1989, acima referidos Sambrook et ai, 1989, acima referidos; Innis et ai, 1995, acima referidos; e Erlich, 1992, acima referido.

Os elementos reguladores destes vetores podem variar na sua intensidade e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro/vetor uti- lizado, poderão ser usados qualquer um de vários elementos de transcrição e de transdução. Exemplos não-limitativos de regiões ou promotores regula- dores transcripcionais para bactérias incluem o promotor β-gal, o promotor T7, o promotor TAC, promotores λ esquerdos e direitos, promotores trp e lac, promotores de fusão trp-lac e, mais especifica mente para Streptomyces, os promotores ermE, melC, e tipA, etc. Em uma modalidade específica, po- derá ser gerado um vetor de expressão que contenha o ORF aveC ou o seu ORF submetido à mutação clonado adjacente a um promotor constitutivo forte, tal como o promotor ermE a partir de Saccharopolyspora erythraea. Tal como foi descrito na Patente dos E.U.A. No. 6.248.579, um vetor compreen- dendo o promotor ermE foi transformado em S. avermitffls, e subsequente- mente análise HPLC de produtos de fermentação indicou um título aumenta- do de avermectinas produzidas em comparação com a produção pela mes- ma cepa a qual pelo contrário expressa apenas o alelo aveC do tipo selva- gem.

Vetores de expressão de proteína de fusão podem ser usados para expressar uma proteína de fusão de produto gene AveC. A proteína de fusão purificada pode ser usada para aumentar anti-soros contra o produto gene AveC, para estudar as propriedades bioquímicas do produto gene AveC, para obter por engenharia proteínas de fusão AveC com diferentes atividades bioquímicas, ou para ajudar na identificação ou purificação do produto gene AveC expressado. Vetores de expressão de proteína de fusão possíveis incluem, mas não se limitam a, vetores incorporando seqüências que codificam β-galatosidase e fusões trpE, fusões de maltose-proteína de ligação, fusões de glutationa-S transferase e fusões de polihistidina (regiões de transporte). Em uma modalidade alternativa, um produto gene AveC ou uma sua porção poderão ser fundidos com um produto gene homólogo AveC, ou uma sua porção, derivada de outras espécies ou cepa de Streptomyces, tais como, por exemplo, S. hygroscopicus ou S. griseochro- mogenes. Esses vetores híbridos podem ser transformados em células de S. avermitilis e testados para determinar o seu efeito, por exemplo, na aver- mectina produzida com razão da classe 2:1.

Proteínas de fusão AveC podem ser submetidas à engenharia para compreender uma região útil para purificação. Por exemplo, fusões de AveC-maltose-proteína de ligação podem ser purificados usando resina de amilose; proteínas de fusão AveC-glutationa-S-transferase podem ser purifi- cadas usando pérolas de glutationa-agarose; e fusões AveC-polihistidina podem ser purificadas usando resina de níquel divalente. De um modo alter- nativo, anticorpos contra uma proteína ou peptídeo veículo podem ser usa- dos para purificação por cromatografia de afinidade da proteína de fusão.

Por exemplo, uma codificação de seqüência de nucleotídeo para o epitopo alvo de um anticorpo monoclonal pode ser submetido à engenharia para o vetor de expressão em associação operativa com os elementos reguladores e situados para que o epitopo expresso seja fundido com o polipeptideo AveC. Por exemplo, uma codificação de seqüência de nucleotídeo para a etiqueta de epitopo FLAG™ (International Biotechnologies Inc.), que é um peptideo marcador hidroftlico, pode ser inserida por meio de técnicas padrão no vetor de expressão em um ponto correspondendo, por exemplo, ao tér- mino carboxila do polipeptideo AveC. O produto de fusão epitopo polipepti- deo-FLAG® pode então ser detectado e purificado por afinidade usando anti- corpos anti-FLAG® disponíveis.

O vetor de expressão codificando a proteína de fusão AveC pode também ser submetida à engenharia para conter seqüências de polili- gação que codificam sítios de divagem de protease específica de modo a que polipetideo AveC expressado possa ser liberado a partir da região veí- culo ou parceiro de fusão por tratamento com uma protease específica. Por exemplo, o vetor da proteína da fusão pode incluir seqüências de DNA codi- ficando trombína ou sítios de divagem de fator Xa, entre outros.

Uma seqüência de sinal a montante de, e em um quadro de lei- tura com, o ORF aveC pode ser submetido à engenharia para o vetor de ex- pressão por métodos conhecidos para dirigir o trânsito e secreção do pro- duto gene expresso. Exemplos não-limitativos de seqüências de sinal inclu- em as de fator a, imunoglobulinas, proteínas membranares exteriores, peni- cilinase, e receptores de células T, entre outras.

Para ajudar a seleção de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com vetores de clonagem ou de expressão da presente inven- ção, o vetor pode ser submetido à engenharia para compreender ainda uma seqüência de codificação para um produto gene repórter ou outro marcador que se possa selecionar. Uma tal seqüência de codificação encontra-se de preferência em associação operativa com as seqüências de codificação do elemento regulador, tal como foi acima descrito. Genes repórter que são úteis na invenção são bem-conhecidos nesta técnica e incluem os que codi- ficam proteína fluorescente verde, luciferase, xylE, e tirosinase, entre outros.

Marcadores que podem ser selecionados que codificam seqüências de nu- cleotídeos são bem-conhecidos nesta técnica, e incluem os que codificam produtos gene conferindo resistência a antibióticos ou antimetabolitos, ou que fornecem um requerimento auxotrófieo. Exemplos dessas seqüências incluem as que codificam resistência à eritromicina, tiostrepton ou kanamici- na, entre muitos outros. 5.2.2. Transformação de Células Hospedeiras A presente invenção proporciona ainda células hospedeiras transformadas compreendendo uma molécula de polinucleotídeo ou vetor recombinante da invenção, e novas cepas ou linhagens célulares deles deri- vados. Células hospedeiras úteis na prática da invenção são de preferência células de Streptomyces, embora possam também ser usadas outras células procarióticas ou eucarióticas. Essas células hospedeiras transformadas in- cluem tipicamente, mas não se limitam a, microorganismos, tais como bacté- rias transformadas com DNA de bacteriofago recombinante, vetores de DNA de plasmídeo ou de DNA de cosmídeo, ou levedura transformada com veto- res recombinantes, entre outros.

Pretende-se que as moléculas de polinucleotídeo da presente invenção funcionem em células de Streptomyces, mas podem também ser transformadas em outras células de bactérias ou eucarióticas, por exemplo, tendo como finalidade clonagem ou expressão. Pode ser tipicamente usada uma cepa de E. coli, tal como, por exemplo, a cepa DH5a, disponível a partir da American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (Accessi- on No. 31343), e a partir de fontes comerciais (Stratagene). Células hospe- deiras eucarióticas preferidas incluem células de levedura, embora possam também ser utilizadas de maneira eficaz células de mamíferos ou células de insetos. O vetor de expressão recombinante da invenção é de preferên- cia introduzido, por exemplo, transformado ou transfectado, para uma ou mais células hospdeiras de uma cultura de células substancialmente homo- gênea. O vetor de expressão é geralmente introduzido em células hospedei- ras de acordo com técnicas conhecidas, tais como, por exemplo, por trans- formação do protoplasto, precipitação do fosfato de cálcio, tratamento com cloreto de cálcio, microinjeção, eletroporação, transfecção por contato com um vírus recombinado, transfecção mediada por lipossoma, transfecção DEAE-dextran, transdução, conjugação, ou bombardeamento com micro- projéteis. A seleção da transformação pode ser conduzida por meio de pro- cessos padrão, tais como por seleção para células expressando um marca- dor selecionável, por exemplo, resistência aos antibióticos, associada com o vetor recombinante, tal como foi acima descrito.

Uma vez o vetor de expressão introduzido na célula hospedeira, a integração e manutenção da seqüência de codificação aveC quer no cro- mossomo da célula hospedeira quer episomicamente podem ser confirma- das por meio de técnicas padrão, por exemplo, por análise de hibridização Southern, análise de enzima de restrição, análise PCR, incluindo transcripta- se reversa PCR (rt-PCR), ou por ensaio ímunológico para detectar o produto gene esperado. Células hospedeiras contendo e/ou expressando a seqüên- cia de codificação de aveC recombinante podem ser identificadas por qual- quer uma de pelo menos quatro abordagens gerais que são bem-conhecidas nesta técnica, incluindo: (I) DNA-DNA, DNA-RNA, ou RNA-hibridização RNA anti-sentido; (ii) detecção da presença de funções de gene "marcador"; (iii) rastreio do nível de transcrição tal como é medido pela expressão de aveC- transcritos mRNA específicos na célula hospedeira; e (iv) detecção da pre- sença de produto polipeptideo maduro tal como seja medido, por exemplo, por imunoensaio ou pela presença de atividade biológica de AveC (por exemplo, a produção de razões específicos e de quantidades de avermecti- nas indicativas de atividade de AveC em, por exemplo, células hospedeiras de S. avermitilis). 5.2.3. Expressão e Caracterização De um Produto Gene AveC Recombinante Uma vez que a seqüência de codificação aveC nativa ou sub- metida à mutação tenha sido introduzida de um modo estável em uma célula hospedeira apropriada, a célula hospedeira transformada é propagada me- diante clonagem, e as células resultantes podem ser feitas crescer em con- dições que conduzam à produção máxima do produto gene AveC nativo ou submetido à mutação. Essas condições incluem de um modo típico células em crescimento para dar origem a uma densidade elevada. Quando a ex- pressão do vetor compreende um promotor induzível, condições de indução apropriadas tais como, por exemplo, deslocação da temperatura, esgota- mento de nutrientes, adição de indutores gratuitos (por exemplo, análogos de hidratos de carbono, tais como isopropil-p-D-tiogalatopiranosido (IPTG)), acumulação de subprodutos metabólicos em excesso, etc., são utilizados tal como seja necessário para induzir expressão.

Quando o produto gene AveC expresso é retido no interior das células hospedeiras, as células são colhidas e submetidas à lise, e o produto é isolado e purificado a partir do lisado em condições de extração conheci- das nesta técnica para minimizar degradação de proteína tal como, por exemplo, a 4°C, ou na presença de inibidores da protease, ou ambos.

Quando o produto gene AveC expressado é segregado a partir das células hospedeiras, o meio nutriente esgotado pode ser simplesmente recolhido sendo o produto isolado a partir delas. O produto gene AveC expresso pode ser isolado ou substanci- almente purificado a partir de lisados de células ou de meio de cultura, como seja apropriado, usando métodos padrão, incluindo mas não se limitando a qualquer combinação dos métodos que se seguem: precipitação de sulfato de amônio, fracionamento de tamanho, cromatografia de permuta iônica, HPLC, centrífugação de densidade, e cromatografia de afinidade. Quando o produto gene AveC expresso apresenta atividade biológica, o aumento da pureza da preparação pode ser monitorizado em cada etapa do processo de purificação por utilização de um ensaio apropriado. Se o produto gene AveC expresso ou não apresentar atividade biológica, ele poderá ser detectado tendo como base, por exemplo, o tamanho, ou reatividade com um anticorpo de outro modo específico para AveC, ou pela presença de uma etiqueta de fusão. Tal como é aqui usado, um produto gene AveC é "substancialmente purificado" quando o produto constitui mais do que cerca de 20% em peso da proteína em uma preparação particular. Também, tal como é aqui usado, um produto gene AveC é "isolado" quando o produto constitui pelo menos cerca de 80% em peso da proteína em uma preparação particular.

A presente invenção proporciona assim um produto gene AveC de S. avermitilis expresso de um modo recombinante ou substancialmente purificado compreendendo a sequência de aminoácidos codificados por se- qüência codificando produto gene AveC de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou a seqüência de aminoácido da Figura 1 (SEQ ID NO:2) ou uma sua porção substancial, e versões submetidas à mutação e suas variantes degeneradas. A presente invenção proporciona ainda um método para a pro- dução de um produto gene AveC, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão recombinante, com- preendendo o referido vetor uma molécula de polinucleotídeo tendo um se- qüência de nucleótdos codificando o produto gene AveC, cuja molécula de polinucleotídeo se encontra em associação operativa com um ou mais ele- mentos reguladores que controlam a expressão da molécula de polinucleotí- deo na célula hospedeira, em condições que conduzem à produção do pro- duto gene AveC recombinante, e recuperando o produto gene AveC a partir da cultura de células. O produto gene AveC de S. avermitilis expresso de um modo recombinante é útil para uma série de finalidades, incluindo para rastrear compostos que alteram a função do produto gene AveC e desse modo mo- dulam a biossíntese da avermectina, e para criar antibióticos dirigidos contra o produto gene AveC.

Uma vez obtido um produto gene AveC com suficiente pureza, ele poderá ser caracterizado por métodos padrão, incluindo por SDS-PAGE, cromatografia de exclusão de tamanhos, análise de sequência de aminoáci- dos, atividade biológica na produção de produtos apropriados, na via bios- sintética da avermectina, etc. Por exemplo, a seqüência de aminoácidos do produto gene AveC pode ser determinada usando técnicas de seqüência pepetidicas padrão. O produto gene AveC pode ainda ser caracterizado usando análise sobre hidrofilicidade (ver, por exemplo, Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:3824), ou algoritmos de software análo- gos, para identificar regiões hidrofóbicas e hidrofílicas do produto gene AveC. A análise estrutural pode ser realizada para identificar regiões do pro- duto gene AveC que assumem estruturas secundárias específicas. Métodos biofísicos tais como cristalografia por raios X (Engstrom, 1974, Biochem.

Exp. Biol. 11: 7-13), modelação por computador (Fletterick e Zoller (eds), 1986, em: Current Communications in Molecular Bioioqy. Cold Spring Labo- ratory, Cold Spring Harbor, NY), e ressonância magnética molecular (RMN) poderá ser usada para fazer um mapa e estudar sítios de interação entre o produto gene AveC e seu substrato. Informação obtida a partir destes estu- dos poderá ser usada para selecionar novos sítios para mutação no AveC ORF para ajudar a desenvolver novas cepas de S. avermitilis tendo caracte- rísticas de produção de avermectina mais desejáveis.

Construção e Utilização de Mutantes de AveC

Um objectivo principal da presente invenção consiste em identifi- car novas mutações no alelo aveC de S. avermetilis que dão origem a uma alteração, e com maior preferência uma redução, na razão de avermectinas B2:B1. A presente invenção proporciona assim moléculas de polinucleotídeo úteis para produzir novas cepas de células de S. avermitilis que apresentam uma modificação detectável na produção de avermectina em comparação com células da mesma cepa mas que em vez disso expressam apenas o alelo de aveC do tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, essas molé- culas de polinucleotídeo são úteis para produzir novas cepas de células de S. avermitilis que produzem avermectinas em uma razão reduzida de classe 2:1 em comparação com as células da mesma cepa as quais pelo contrário expressam apenas o alelo aveC do tipo selvagem. As células dessas cepas podem também compreender mutações adicionais para produzir uma quan- tidade aumentada de avermectinas em comparação com células da mesma cepa que pelo contrário expressam apenas um único alelo aveC do tipo sel- vagem.

Mutações para o alelo aveC ou seqüência de codificação inclu- em quaisquer mutações que introduzem uma ou mais substituições, dele- ções e/ou adições de aminoácido para o produto gene AveC, ou que dão origem a truncamento do produto gene AveC, ou qualquer sua combinação, e que produz o resultado desejado. Essas seqüências de alelo aveC subme- tidas a mutação pretendem incluir quaisquer suas variantes degeneradas.

Por exemplo, a presente invenção proporciona uma molécula de polinucleo- tídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos do alelo aveC ou uma sua variante degenerada, ou a seqüência que codifica produto gene AveC de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou uma sua variante degenerada, ou a seqüência de nucleotídeos do ORF aveC de S. avermitilis tal como é apre- sentado na Figura 1 (SEQ ID NO:1) ou uma sua variante degenerada, mas que ainda compreende mutações que codificam uma combinação de subs- tituições de aminoácido em posições selecionadas no produto gene AveC.

Em uma modalidade não-limitativa, essas substituições ocorrem em uma ou mais posições de aminoácido do produto gene AveC correspondendo a po- sições de aminoácido 25, 28, 35, 36, 38, 40, 41, 48, 55, 61, 78, 84, 89, 90, 99, 107, 108, 111, 120, 123, 136, 138, 141, 154, 159, 163, 179, 192, 196, 198, 200, 202, 220, 228, 229, 230, 231, 234, 238, 239, 250, 252, 266, 275, 278, 289 ou 298 de SEQ ID NO:2. Combinações preferidas de posições de aminoácido a serem substituídas compreendem um ou mais resíduos de aminoácido D48, A61, A89, L136, S138, A139, R163, G179, V196, A198, E238 e P289. De um modo específico combinações preferidas de substitui- ções de aminoácido compreendem substituições tanto em D48 como em G179S, e mais especificamente D48E e G179S. Exemplos específicos de combinações de substituições de aminoácido que dão origem a uma redu- ção em razões ciclohexil B2, ciclohexil B1 são indicados na Tabela 6A-J. A presente invenção proporciona assim uma molécula de polinu- cleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos a qual de outro modo é igual ao alelo aveC de Streptomyces avermitilis, à seqüência que codifica produto gene AveC de S. avermitilis de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) da seqüência de nucleotídeos do ORF aveC de S. avermetiiis tal como é apresentado na Figura 1 (SEQ ID NO:1), ou uma sua variante dege- nerada, mas cuja seqüência de nucleotídeos compreende mutações que codificam uma combinação de substituições de aminoácido em resíduos de aminoácido correspondendo às posições de aminoácido de SEQ ID NO:2, de modo a que células de S. avermetiiis da cepa ATCC 53692 em que o alelo aveC do tipo selvagem tenha sido inativado e que expressam a molé- cula de polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos sub- metida à mutação são capazes de produzir uma razão da classe 2:1 de avermectinas que é reduzida em comparação com a razão produzida por células de S. avermitilis da cepa ATCC 53692 que pelo contrário expressa apenas o alelo aveC do tipo selvagem, em que quando as avermectinas da classe 2:1 são avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, a razão de avermec- tinas da classe 2:1 é de 0,35:1. Em uma modalidade mais preferida, a razão de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,30:1 ou inferior.

Em uma modalidade mais preferida, a razão de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,25: ou inferior. Em uma modalidade mais preferida, a razão de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,20:1 ou inferior.

Em uma modalidade particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (a): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE538 (ver Ta- bela 6).

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (b): G40S, D48E, L136P, G179S, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE559.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (C): D48E, L136P, R163Q, G179S. Um exemplo não-limltativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE567.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (d): D48E, L136Q, G179Q, E238D. Exemplos não-limitativos de plasmídeos codificando estas substituições de aminoácido são pSE570 e pSE572.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (e): D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmí- deo codificando estas substituições de aminoácido é pSE571.

Em uma modalidade particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (f): D48E, L136P, G179S, E238D. Exemplos não-limitativos de plasmídeos codificando essas substituições de aminoácido são pSE501 e pSE546.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (g): D48E, A61T, L136P, G179S, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE510.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (h): D48E, A61T, L136P, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE512.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (í): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE519.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo Q): D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE526.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (k): D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE528.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (I): D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE530.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (m): D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE531.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (n): D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE534.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (o): Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE535.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (p): D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L. Um exemplo não- limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE542.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (q): D48E, L136P, R250W. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE545.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (r): D48E, A89T, S138T, Α139Τ, R163Q, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE548.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (s): D48E, L136P, G179S, A198G, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE552.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (t): D48E, F78L, A89T, L136P, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE557.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (u): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L. Exemplos não-limitativos de plasmí- deos codificando estas substituições de aminoácido são pSE564 e pSE565.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (v): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE568.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (w): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Um exemplo não- limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é p$E543.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (x): D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoáci- do é pSE504.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (y): D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE508.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (z): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L. Um exemplo não- limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE511.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (aa): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE520.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ab): D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE523.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ac): D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE527.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ad): D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE539.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ae): G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE540.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (af): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE547.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ag): D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE550.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ah): S41G, D48E, A89T, L136P, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE558.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ai): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE563.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (aj): D48E, A89T, L136P, G179S, F234S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE566.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ak): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D. Exemplos não-limitativos de plasmídeos codificando estas substituições de aminoácido são pSE573 e pSE578.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (aí): Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE574.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (am): D48E, A89T, L136P, R163P, R163G, G179S. Exemplos não-limitativos de plasmídeos codificando estas substituições de aminoácido são pSE575 e pSE576.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (an): D48E, A89T, S138T, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE577.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ao): D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Exemplos não-limitativos de plasmídeos codificando estas substituições de aminoácido são pSE502 e pSE524.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ap): D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE503.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (aq): D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE505.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ar): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE506.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (as): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE507.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (at): D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE509.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (au): D48E, A89T, L136P, G179S. Exemplos não-limitativos de plasmídeos codificando estas substituições de aminoácido são pSE514 e pSE525.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (av): D48E, A89T, V120A, L136P, G179S. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codifi- cando estas substituições de aminoácido é pSE515.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (aw): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D. Um exemplo não- limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE517.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ax): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Um exemplo não- limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE518.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ay): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Exemplos não- limitativos de plasmídeos codificando estas substituições de aminoácido são pSE529 e pSE554.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (az): D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D. Um exemplo não- limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE532 Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (ba): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE536.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (bb): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L. Um exemplo não-fimitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoáci- do é p$E537.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (bc): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE541.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (bd): D48E, A89T, S138T, Α139Τ, G179S, V196A, E238D, P289L. Exemplos não-limitativos de plasmídeos codificando estas substituições de aminoácido são pSE549 e pSE553.

Em uma outra modalidade particular, a combinação de substitui- ções de aminoácido compreende a combinação de grupo (be): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE551. A presente invenção proporciona ainda uma molécula de polinu- cleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é de outro modo a mesma que o alelo aveC de Streptomyces avermitilis, a seqüência que codifica produto gene AveC de S-avermitilis de plasmídeo pSE 186 (ATCC 209604) ou a seqüência de nucleotídeos do ORF aveC de S. avermi- tilis tal como é apresentado na Figura 1 (SEQ ID NO:1), ou uma sua variante degenerada, mas cuja seqüência de nucleotídeos compreende ainda muta- ções codificando uma combinação de substituições de aminoácido em resí- duos de aminoácido correspondendo às posições de aminoácido de SEQ ID NO:2, de modo a que células da cepa de S. avermitilis da cepa ATCC 53692 em que o alelo aveC do tipo selvagem foi inativado e que expressa uma molécula de polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos submetidos a mutação são capazes de produzir uma avermectina da classe 2:1 que é reduzida em comparação com a razão produzido por células de S. avermitilis da cepa ATCC 53692 que pelo contrário expressam apenas o alelo aveC do tipo selvagem, em que quando as avermectinas 2:1 são aver- mectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, a razão das avermectinas da classe 2:1 é reduzida até cerca de 0,40:1 ou inferior, e em que a combinação de subs- tituições de aminoácido compreende uma combinação selecionada dentre o grupo consistindo em: (bf) D48E, S138T, Α139T, G179S, E238S; e (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D.

Exemplos não-limitativos de um plasmídeo codificando as subs- tituições de aminoácido de grupo (bf) são pSE556 e pSE569. Um exemplo não-limitativo de um plasmídeo codificando as substituições de aminoácido de grupo (bg) é pSE561. A presente invenção contempla que qualquer uma das substitui- ções de aminoácidos acima mencionadas poderá ser realizada por meio de qualquer modificação à sequência de nucieotídeos do alelo aveC ou uma sua variante degenerada que dá origem a essas substituições. Por exemplo, é possível efetuar a maior parte das substituições de aminoácido aqui des- critas modificando uma seqüência nativa de códons ou uma sua variante degenerada para quatquer um dos vários códons alternativos que codificam a mesma substituição de aminoácido. As várias sequências possíveis que podem codificar as substituições de aminoácido acima mencionadas pode- rão tornar-se rapidamente aparentes para qualquer versado nesta técnica tendo em vista a modalidade da presente invenção e a degenerescência co- nhecida do código genético. Em uma modalidade não-limitativa para cada combinação particular acima referida, as substituições de aminoácido são conseguidas por modificações de nucleotídeo não silenciosas indicadas na Tabela 6.

Tal como é aqui usada, a frase "a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo ...", etc., significa que as substituições de aminoácido no produto gene AveC de acordo com a pre- sente invenção incluem pelo menos as substituições que são especifica- mente referidas, e pode incluir outras substituições de aminoácido, ou delec- ções de aminoácido, ou adições de aminoácido, ou algumas suas combina- ções, em que a expressão do resultante produto gene AveC resultante na célula de S. avermititis proporciona uma redução desejável na razão de avermectinas B2:B1.

Mutações para o alelo aveC ou sua variante degenerada pode- rão ser realizadas por qualquer uma de uma série de métodos conhecidos, incluindo por utilização de PCR sujeito a erro, ou por mutagênese de casse- te. Por exemplo, mutagênese dirigida a oligonucleotídeo poderá ser utilizada para alterar a seqüência do alelo aveC ou ORF em um modo definido tal como, por exemplo, para introduzir um ou mais sítios de restrição, ou um códon de terminação, para regiões específicas no alelo aveC ou ORF. Méto- dos tais como os descritos na Patente U.S. N° 5.605.793, Patente U.S. N° 5.830.721 e Patente U.S. N° 5.837.458, que envolvem fragmentação aleató- ria, ciclos repetidos de mutagênese, e rearranjo de nucleotídeo, podem tam- bém ser usados para dar origem a grandes bibliotecas de polínucleotídeos tendo seqüências de nucleotídeos codificando mutações de aveC.

Mutações alvo podem ser úteis, particularmente quando servem para alterar um ou mais resíduos de aminoácido conservados no produto gene AveC. Por exemplo, uma comparação da sequência de aminoácido deduzida do produto gene AveC de S, avermitílis (SEQ iD NO:2) com pro- dutos gene homólogo AveC a partir de S. griseochromogenes (SEQ ID NO:5) e S. hygroscopicus (SEQ ID NO:4), tal como é descrito na Patente U.S. N° 6.248.579, indica sítios de conservação sugnificativa de resíduos de aminoácido entre estas espécies. Mutagênese submetida à alvo que leva a uma modificação em um ou mais destes resíduos de aminoácido conserva- dos pode ser eficaz na produção de novas cepas mutantes que apresentam alterações desejáveis em produção de avermectina.

Mutagênese aleatória pode também ser útil, e pode ser realizada expondo células de S. avermitílis à radiação ultravioleta ou a raios X, ou a agentes químicos mutagênicos tais como N-metil-N'-nitrosoguanidina, meta- nossulfonato de etila, ácido nitroso ou mostardas de nitrogênio. Ver, por exemplo, Ausubel, 1989, acima referido, para revisão de técnicas de muta- gênese.

Uma vez geradas moléculas de polinucleotídeo submetidas a mutação, elas são rastreadas para determinar se podem modutar biossínte- se de avermectina em S. avermitílis. Em uma modalidade preferida, uma molécula de polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo submetida à mutação é testada por complementação de uma cepa de S. avermitílis em que o gene aveC tenha sido inativado para dar origem a um fundo aveC ne- gativo (aveC'). Em um método não-limitativo, a molécula de polinucleotídeo submetida à mutação é ligada a um piasmídeo de expressão em associação operativa com um ou mais elementos regulatórios, cujo piasmídeo também compreende de preferência um ou mais genes de resistência à droga para permitir uma seleção de células transformadas. Este vetor é então transfor- mado em células hospedeiras aveC' usando técnicas conhecidas, e células transformadas são selecionadas e cultivadas em meios de fermentação apropriados em condições que permitam ou induzam produção de avermec- tina, por exemplo, incluindo subunidades de partida no meio, e cultivando em condições óptimas para produção de avermectina tal como é conhecido nesta técnica. Produtos de fermentação são então analisados por HPLC a fim de determinar a capacidade da molécula de polinucleotídeo submetida à mutação para complementar a célula hospedeira. Vários vetores de plasmí- deo tendo moléculas de polinucleotídeo submetidas a mutação capazes de reduzira razão B2:B1 de avermectinas, incluindo pSE188, pSE199, pSE231, pSE239, e pSE290 a pSE297 são exemplificados na Seção 8.3, mais abai- xo. Outros exemplos desses vetores de plasmídeo são apresentados na Ta- bela 6.

Qualquer um dos métodos acima mencionados da presente in- venção poderá ser realizado usando meios de cultura de fermentação de preferência suplementados com ácido ciclohexano carboxílico, embora ou- tros precursores de ácido graxo apropriados, tais como qualquer um dos precursores de ácido graxo indicados no Tabela 1, ou ácido metiltioláctico, possam também ser usados.

Uma vez que tenha sido identificada uma molécula de polinucle- otídeo submetida à mutação que module a produção de avermectina em uma direcção desejável, a localização da mutação na seqüência de nucleo- tídeos poderá ser determinada. Por exemplo, uma molécula de polinucleotí- deo tendo uma seqüência de nucleotídeos codificando um produto gene AveC submetido à mutação poderá ser isolada por PCR e submetida à aná- lise de seqüência de DNA usando métodos conhecidos. Comparando a se- qüência de DNA do alelo AveC submetido à mutação com a do alelo aveC do tipo selvagem, a{s) mutação (mutações) responsável(responsáveis) pela alteração na produção de avermectina poderá (poderão) ser determinada(s).

Por exemplo, produtos gene AveC de S. avermitilis compreendendo quer substituições de aminoácido simples em qualquer um dos resíduos 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (Α139Τ), ou 230 (G230D), quer substituições du- plas nas posições 138 (S138T) e 139 (A139T ou A139F), proporcionaram modificações na função do produto gene AveC tais que a razão da classe 2:1 de avermectinas produzidas foi alterada (ver Seção 8, mais abaixo), em que as posições de aminoácido correspondem às apresentadas na Figura 1 (SEQ ID NO:2). Além disso, as seguintes sete combinações de mutações cada uma delas revelou que reduzia de um modo eficaz a razão 2:1 de avermectinas. (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4) F99S/S138T/ A139T/G179S; (5) A139T/M228T; (6) G111V/P289L; (7) A139T/ K154E/Q298H. A presente invenção proporciona cinquenta e nove (59) combinações adicionais de mutações que demons- tram reduzir a razão ciclohexil B2:ciclohexil B1 de avermectinas e estas são apresentadas na Tabela 6 e indicadas nas reivindicações apensas.

Tal como são aqui usadas, as designações acima mencionadas, tais como A139T, indicam o resíduo original de aminoácido por simples de- signação de letra, a qual neste exemplo é alanina (A) na posção indicada, que neste exemplo se situa na posição 139 (referindo-se à SEQ ID NO:2) do polipeptideo, seguindo-se o resíduo de aminoácido que substitui o resíduo de aminoácido original, o qual neste exemplo é treonina (T).

Tal como é aqui usado, quando um resíduo de aminoácido codi- ficado por um alelo aveC no cromossomo de S. avermitilis, ou em um vetor ou molécula isolada de polinucleotídeo da presente invenção é referido como "correspondendo a" um resíduo particular de aminoácido de SEQ ID NO:2, ou quando uma substituição de aminoácido é referida como ocorrendo em uma posição particular "correspondendoa" à de um resíduo de aminoáci- do numerado específico de SEQ ID NO:2, isto pretende referir-se ao resíduo de aminoácido na mesma localização relativa no produto gene AveC, o qual o versado poderá rapidamente determinar tendo como referência a seqüên- cia de aminoácidos aqui apresentada como SEQ ID NO:2.

Tal como é aqui usado, quando mutações específicas no alelo aveC codificando mutações particulares são indicadas como modificações de base em posições específicas de nucleotídeo no alelo aveC "correspon- dendo a" posições particulares de nucleotídeo tal como é indicado em SEQ ID N0.1, ou quando uma posição de nucleotídeo no alelo aveC é de outro modo referido como "correspondendo a" uma posição particular de nucleotí- deo na SEQ ID NO:1, isto pretende referir-se ao nucleotídeo na mesma lo- calização relativa na sequência de nucleotídeos aveC ou uma sua variante degenerada, que o versado poderá determinar rapidamente tendo como re- ferência à seqüência de nucleotídeos aqui apresentada como SEQ ID NO:1.

Tal como é aqui usado para se referir a razões de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, o termo "cerca de" refere-se ao valor numérico especificamente referido mais ou menos 10% desse valor indicado.

Uma molécula de polinucleotídeo da presente invenção pode ser "isolada", o que significa que é ou (i) purificado até ao grau que se encontre substancialmente livre de outras moléculas de polinucleotídeo tendo dife- rentes sequências de nucleotídeos, ou (ii) presente no meio ambiente em que ele não ocorrería naturalmente, por exemplo, onde um alelo aveC de S. avermitilis, ou uma sua versão submetida à mutação, está presente em uma célula diferente de uma célula de S. avermitilis, ou (iii) presente sob a forma em que não correria naturalmente, por exemplo, como uma peça mais curta de DNA, tal como um fragmento de restrição digerido a partir de um cromos- somo bacteriano, compreendendo de um modo predominante a região de codificação aveC ou uma sua versão submetida à mutação, com ou sem quaisquer suas seqüências reguladoras associadas, ou como integradas subseqüentemente em uma peça heteróloga de DNA, tal como o cromosso- mo de uma célula bacteriana (diferente de uma célula de S. avermitilis) ou o DNA de um vetor tal como um plasmídeo ou agente fágico, ou integrado em um cromossomo de S. avermitilis em um local diferente do local do alelo aveC nativo. A presente invenção proporciona ainda um vetor recombinante compreendendo uma molécula de polinucleotídeo da presente invenção. Um tal vetor recombinante poderá ser usado para atingir qualquer uma das mo- léculas de polinucleotídeo compreendendo seqüências de nucleotídeos submetidas a mutação da presente invenção para o sítio do alelo aveC do cromossomo de S. avermitilis para inserir ou substituir o ORF aveC de uma sua porção, por exemplo, por recombinação homóloga. De acordo com a presente invenção, contudo, uma molécula de polinucleotídeo compreen- dendo uma sequência de nucleotídeos submetida à mutação da presente invenção aqui proporcionada poderá também funcionar de modo a modular à biossíntese de avermectina quando inserida no cromossomo de S.avermitilis em um sítio diferente do sítio do alelo aveC, ou quando mantido episomica- mente nas células de S. avermitilis. Assim a presente invenção proporciona ainda vetores compreendendo uma molécula de polinucleotídeo compreen- dendo uma seqüência de nucleotídeos submetida à mutação da presente invenção, cujos vetores podem ser usados para inserir a molécula de polinu- cleotídeo em um sítio no cromossomo de S. avermitilis diferente de um sítio no gene aveC, ou para ser mantido episomicamente.

Em uma modalidade não-limitativa, o vetor é um vetor de subs- tituição de gene que pode ser usado para inserir um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada de acordo com a presente inven- ção para células de uma cepa de S. avermitilis, dando desse modo origem a novas cepas de <S. avermitilis, cujas células podem produzir avermectinas em uma razão reduzida de classe 2:1 em comparação com células da mes- ma cepa que pelo contrário expressam apenas o alelo aveC de tipo selva- gem. Esses vetores de substituição de gene podem ser construídos usando moléculas de polinucleotídeo submetidas a mutação presentes em vectoes de expressão aqui proporcionados, tais como os vetores de expressão exemplificados na Seção 8 mais abaixo. A presente invenção proporciona ainda vetores que podem ser usados para inserir um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua vari- ante degenerada para células de uma cepa de S. avermitilis para dar origem a novas cepas de células que produzem quantidades alteradas de avermec- tinas em comparação com células da mesma cepa que pelo contrário ex- pressam apenas o alelo aveC de tipo selvagem. Em uma modalidade prefe- rida, a quantidade de avermectinas produzidas pelas células é aumentada.

Em uma modalidade específica embora não-limitativa, um tal vetor compre- ende um promotor forte tal como é conhecido nesta técnica^tal como, por exemplo, o promotor ermE constitutivo forte a partir de Saccharopolyspora erythraea, que está situada a motante de, e em associação operativa com o ORF aveC. Esses vetores podem ser construídos usando o alelo AveC sub- metido à mutação de plasmídeo pSE189, e de acordo com métodos descri- tos na Patente U.S. N° 6.248.579. A presente invenção proporciona vetores de substituição de ge- ne que são úteis para inativar o gene aveC em uma cepa de tipo selvagem de S. avermitilis. Em uma modalidade não-limitativa, esses vetores de subs- tituição de gene podem ser construídos usando a molécula de polinucleotí- deo submetido à mutação presente no plasmídeo pSE180 (ATCC 209605), que é exemplificado na Seção 8.1, mais abaixo (Figura 3). A presente inven- ção proporciona ainda vetores de substituição de gene que compreendem uma molécula de polinucleotídeo ou consistindo em seqüências de nucleotí- deo que naturalmente flanqueiam o gene aveC in situ no cromossomo de S. avermitilis, incluindo, por exemplo, as seqüências de nucleotídeos que flan- queiam apresentadas na Figura 1 (SEQ ID NO:1), cujos vetores podem ser usados para deletar o S. avermitilis com ORF. A presente invenção proporciona ainda uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de polinucleotídeo ou vetor recombinante da presente invenção. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica capaz de ser usada como um hospedeiro para a molécula de polinucleotídeo ou vetor recombinante. Em uma modalidade preferida, a cé- lula hospedeira é uma célula bacteriana. Em uma modalidade mais preferi- da, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces. Em uma modalidade mais preferida, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces avermeti- lis. A presente invenção proporciona ainda um método para produzir uma nova cepa de Streptomyces avermitilis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC em uma célula de uma cepa de S. avermitilis, cuja mutação dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene Avec, ou (ii) introduzindo para uma célula de uma cepa de S. avermitilis um alelo AveC submetido à mutação com alelo aveC ou uma sua variante dege- nerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combina- ção de substituições de aminoácido, em que a combinação de substituições de aminoácido é selecionada dentre (a) a (be) acima indicados. A presente invenção proporciona ainda um método para produzir uma nova cepa de S. avermitilis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC em uma célula de urria cepa de S. avermitilis, mutação essa que dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introdução para uma célula de uma cepa de S. avermitilis de um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que células compreendendo o alelo AveC submetido à mu- tação ou uma sua variante degenerada são capazes de produzir avermecti- nas cíclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,35:1 ou inferior. Em uma modalidade não-limitativa, o alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicados.

Em uma modalidade preferida, a razão de avermectinas ciclohe- xil B2:cíclohexil B1 é de cerca de 0,30:1 ou inferior. Em uma modalidade não-limitativa, o alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante de- generada codifica um produto gene compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.

Em uma modalidade preferida, a razão de avermectinas ciclohe- xil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Em uma modalidade não-limitativa, o alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante de- generada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.

Em uma modalidade mais preferida, a razão de avermectinas cíclohexil B2:cic!ohexil B1 é de cerca de 0,20:1 ou inferior. Em uma modali- dade não-limitativa, o alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combina- ção de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. A presente invenção proporciona ainda um método para produzir uma nova cepa de Streptomyces avermitilis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC em uma célula de uma cepa de S. avermitilis, mutação essa que dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introdução para uma célula de uma cepa de S. avermitilis de um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que a combinação de substituições de ami- noácido é selecionada dentre o grupo consistindo em (bf) e (bg). Em uma modalidade preferida, células de S. avermitilis compreendendo um tal alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada são capazes de produzir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de cerca de 0,40:1 ou inferior.

Ao submeter assim a mutação o alelo aveC, ou ao introduzir as- sim um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada, de acordo com as etapas acima indicados, é produzida uma nova cepa de S. avermitilis. A presente invenção proporciona ainda uma célula de uma es- pécie de Streptomyces que compreende um alelo AveC submetido à muta- ção ou uma sua variante codificando um produto gene AveC compreenden- do uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre (a) a (be) acima indicados. Em uma modalidade preferida, a espécie de Streptomyces é S.avermitilis. A presente invenção proporciona ainda uma célula de S. avermi- tilis capaz de produzir avermectinas ciclohexil B2:cielohexil B1 em uma razão de 0,35:1 ou inferior. Em uma modalidade não-limitativa, a célula compreen- de um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene Avec compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicada.

Em uma modalidade preferida, a razão de avermectinas ciclohe- xil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,30:1 ou inferior. Em uma modalidade não-limitativa, a célula compreende um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compre- endendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada den- tre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicado.

Em uma modalidade mais preferida, a razão de avermectinas ciclohexil B2:cic!ohexil B1 é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Em uma modali- dade não-limitativa, a célula compreende um alelo AveC submetido à muta- ção ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecio- nada dentre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.

Em uma modalidade mais preferida, a razão de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,20:1 ou inferior. Em uma modali- dade não-limitativa, a célula compreende um alelo AveC submetido à muta- ção ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecio- nada dentre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. A presente invenção proporciona ainda uma célula de uma es- pécie de Streptomyces, compreendendo um alelo AveC submetido à muta- ção ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecio- nada dentre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados. Em uma modalidade preferida, a célula é uma célula de S. avermitilis capaz de pro- duzir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexilç B1 em uma razão de cerca de 0,40:1 ou inferior.

Embora qualquer uma das mutações indicadas possa estar pre- sente em células da presente invenção em um elemento extracromossomico tal como um plasmídeo, é preferido que essas mutações estejam presentes em uma seqüência de codificação aveC integrada para o cromossomo de S, avermitilis, e de preferência, embora não necessariamente, no sítio do alelo aveC nativo.

Essas novas cepas de células são úteis na produção em larga escala de avermectinas comercialmente desejáveis tais como doramectina. A presente invenção proporciona ainda um processo para a pro- dução de avermectinas, compreendendo a cultura de células de S. avermiti- lis da presente invenção em meios de cultura em condições que permitam ou induzam a produção de avermectinas a partir delas, e recuperando as referidas avermectinas a partir da cultura. Em uma modalidade preferida, as células usadas no processo produzem avermectinas ciciohexil B2:ciclohexit B1 em uma razão de 0,35:1 ou inferior, com maior preferência em uma razão de cerca de 0,30:1 ou inferior, com maior preferência em uma razão de cer- ca de 0,25:1 ou inferior, e com maior preferência em uma razão de cerca de 0,20:1 ou inferior.

Em uma modalidade preferida, células produzindo avermectinas ciciohexil B2:ciciohexil B1 em uma razão de 0,35:1 ou inferior compreende um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codi- ficando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de subs- tituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicados.

Em uma outra modalidade preferida, células produzindo aver- mectinas ciciohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,30:1 ou inferior com- preende um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degene- rada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.

Em uma outra modalidade preferida, células produzindo aver- mectinas ciciohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,25:1 ou inferior com- preende um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degene- rada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.

Em uma outra modalidade preferida, células produzindo aver- mectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,20:1 ou inferior com- preende um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degene- rada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados.

Em uma outra modalidade preferida, células produzindo aver- mectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,40:1 ou inferior com- preende um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degene- rada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em (bf) e (be) acima indicados. O processo da invenção proporciona eficácia aumentada na produção de avermectinas comercialmente importantes tais como doramec- tína. A presente invenção proporciona ainda uma composição de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexi! B1 produzidas por células de Streptomyces avermitilis, compreendendo as avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes em um meio de cultura em que as células tenham sido cultivadas, em que a razão das avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes no meio de cultura é de 0,35:1 ou inferior, de preferência cerca de 0,30:1 ou inferior, com maior preferência cerca de 0,25:1 ou inferior, e com maior preferência cerca de 0,20:1 ou inferior. Em uma modalidade preferida, a composição de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 é produzida por células de uma cepa de S. avermitilis que expressa um alelo AveC submeti- do à mutação ou uma sua variante degenerada que codifica um produto ge- ne que dá origem a uma redução na razão de avermectinas ciclo-hexcil B2:ciclohexil B1 produzidas pelas células em comparação com células da mesma cepa de S. avermitilis que não expressa o alelo AveC submetido à mutação mas pelo contrário expressa apenas o alelo aveC do tipo selvagem.

Em uma modalidade preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclohexil B2:ciclohexi! B1 em uma razão de 0,35:1 ou infe- rior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um pro- duto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de ami- noácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indi- cados.

Em uma modalidade preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,30:1 ou infe- rior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um pro- duto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de ami- noácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indi- cados.

Em uma modalidade preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,25:1 ou infe- rior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um pro- duto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de ami- noácido selecionada dentre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indi- cados.

Em uma modalidade preferida, onde a composição é avermecti- nas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,20:1 ou inferior, a compo- sição é produzida por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido se- lecionada dentre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. A presente invenção proporciona ainda uma composição de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexi! B1 produzida por células de Streptomyces avermitilis, compreendendo as avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes em um meio de cultura em que as células foram cultivadas, em que a razão de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexii B1 pre- sentes no meio de cultura é de cerca de 0,40:1 ou inferior, e que é produzido por células compreendendo um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreenden- do uma combinação de substituições de aminoácido selecionada dentre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados.

Embora seja preferido que a nova composição de avermectina esteja presente em um meio de cultura em que as células tenham sido culti- vadas, por exemplo, em líquido de cultura de fermentação totalmente esgo- tado, a composição de avermectina pode de um modo alternativo ser parci- almente ou substancialmente purificada a partir do líquido de cultura por meio de técnicas bioquímicas conhecidas de purificação, tais como precipi- tação de sulfato de amônio, diálise, fracionamento por tamanhos, cromato- grafia de permuta de íons, HPLC, etc.

Embora seja preferido que a nova composição de avermectina esteja presente em um meio de cultura em que as células tenham sido culti- vadas, por exemplo, em líquido de cultura de fermentação parcialmente ou totalmente esgotado, a composição de avermectina pode de um modo alter- nativo ser parcialmente ou substancialmente purificada a partir do líquido de cultura por meio de técnicas bioquímicas conhecidas de purificação, tais como precipitação de sulfato de amônio, diálise, fracionamento por tama- nhos, cromatografia de permuta de íons, etc.

Para além da produção de novas cepas de S. avermitilis com- preendendo células que sejam capazes de produzir razões reduzidos de ci- clohexil B2:ciclohexil B1 tal como foi acima descrito, a presente invenção contempla que mutações adicionais podem ser incorporadas em células de S. avermitilis para melhorar ainda mais características da produção de aver- mectina. Em uma modalidade não-limitativa, células da presente invenção podem ainda compreender modificações para aumentar a produção do nível de avermectinas. Em uma modalidade, essas células podem ser preparadas por (i) mutação do alelo aveC em uma célula de S. avermitilis, ou (ii) introdu- ção de um alelo AveC submetido à mutação ou uma sua variante degenera- da em células de uma cepa de S. avermitilis, em que a expresssão do alelo submetido à mutação dá origem a um aumento na quantidade de avermecti- nas produzidas por células de uma cepa de S. avermitilis expressando o alelo AveC submetido à mutação em comparação com células da mesma cepa que pelo contrário expressam apenas um alelo aveC do tipo selvagem simples, e seleção de células transformadas que produzem avermectinas em uma quantidade aumentada em comparação com a quantidade de avermec- tinas produzidas por células da cepa que pelo contrário expressa apenas o alelo aveC do tipo selvagem simples. Por exemplo, o alelo aveC pode ser modificado de modo a compreender um promotor forte, tal como o promotor ermE constitutivo forte a partir de Saccharopolyspora erythraea, inserido a montante de e em associação operativa com o ORF aveC. Em uma modali- dade, uma ou mais mutações podem ser introduzidas nos genes aveR1 e/ou aveR2 de S. avermilitis, desse modo aumentando o nível de produção de avermectina tal como é descrito na Patente U.S. N° 6.197.591 de Stutzman- Engwall et a!., publicada em 6 de Março de 2001. 5.4. Utilizações de Avermectinas As avermectinas são agentes antiparasitários altamente ativos apresentando uma utilidade particular como anti-helmínticos, ectoparasitici- das, inseticidas e acaricidas. Compostos de avermectina produzidos de acordo com os métodos da presente invenção são úteis para qualquer uma das finalidades. Por exemplo, compostos de avermectina produzidos de acordo com a presente invenção são úteis para o tratamento de várias do- enças ou condições em seres humanos, particularmente onde essas doen- ças ou condições sejam causadas por infecções por parasitas, tal como é conhecido nesta técnica. Ver, por exemplo, Ikeda and Omura, 1997, Chem.

Rev. 97(7):2591-2609. Mais particularmente, compostos de avermectina produzidos de acordo com a presente invenção são eficazes no tratamento de uma série de doenças ou de condições causadas por endoparasitas, tais como nematóides parasitários, os quais podem infectar o ser humano, ani- mais domésticos, porcos, carneiros, aves domésticas, cavalos ou gado.

Mais especificamente, compostos de avermectina produzidos de acordo com a presente invenção são eficazes contra nematóides que infec- tam o ser humano, assim como os que infectam várias espécies de animais.

Esses nematóides incluem parasitas gastrointestinais tais como Ancylosto- ma, necator, Ascaris, Strongyloídes, Trichineíla, CapiUaria, Trichuris, Entero- bius, Dirofilaria, e parasitas que se encontram no sangue ou em outros teci- dos ou orgãos, tais como vermes da filaria e extrato de estados intestinais de Strongyloídes e de Trichineíla.

Os compostos de avermectina produzidos de acordo com a pre- sente invenção são também úteis no tratamento de infecções ectoparasíticas incluindo, por exemplo, infestações por artrópodos de mamíferos e pássaros, causados por carraças, ácaros, piolhos, pulgas, moscas da carne, insetos que picam, ou larvas de dípteros que podem afectar gado e cavalos, entre outros.

Os compostos de avermectina produzidos de acordo com a pre- sente invenção são também úteis como inseticidas contra pragas domésti- cas tais como, por exemplo, baratas, traças da roupa, escaravelhos e mosca doméstica entre outras, assim como pragas de insetos de cereais armaze- nados e de plantas agrícolas, cujas pragas incluem aracnídios, afídeos, la- gartas, e ortopterans tais como gafanhotos, entre outros.

Animais que podem ser tratados com os compostos de aver- mectina produzidos de acordo com a presente invenção incluem carneiros, gado, cavalos, veados, cabras, porcos, pássaros incluindo aves domésticas, e cães e gatos.

Um composto de avermectina produzido de acordo com a pre- sente invenção é administrado em uma formulação apropriada à utilização específica pretendida, à espécie particular de animal hospedeiro a ser trata- do, e ao parasita ou inseto envolvido. Para utilização como um parasiticida, um composto avermectina produzido de acordo com a presente invenção pode ser administrado por via oral sob a forma de cápsulas, bólus, compri- midos ou poção com líquidos ou, de um modo alternativo, poderá ser admi- nistrado por derrame, ou por injeção, ou como um implante. Essas formula- ções são preparadas de um modo conveniente de acordo com a prática ve- terinária padrão. Assim, cápsulas, bolus ou comprimidos podem ser prepa- rados misturando o ingrediente ativo com um diluente ou veículo finamente dividido apropriado contendo adicionalmente um agente de desintegração e/ou um agente de ligação tal como amido, latose, talco, estearato de mag- nésio, etc. Uma formulação para derramar poderá ser preparada dispersan- do o ingrediente ativo em uma solução aquosa juntamente com um agente de dispersão ou de umidificação, etc. Formulações injetáveis podem ser preparadas sob a forma de uma solução estéril, a qual poderá conter outras substancias tais como, por exemplo, sais e/ou glicose suficientes para tornar a solução isotôníca com o sangue.

Essas formulações irão variar no que se refere ao peso do com- posto ativo dependendo do paciente, da espécie do animal hospedeiro a ser tratado, da gravidade e do tipo de infecção, e do peso corporal do hospedei- ro. Geralmente, para administração por via oral uma dose do composto ativo variando entre 0,001 e 10 mg em kg do peso corporal do paciente ou do animal administrado como uma dose única ou em doses divididas durante um período variando entre 1 e 5 dias será satisfatória. Contudo, poderá ha- ver casos em que faixas de dosagem mais elevadas ou mais baixas serão indicadas, tal como é determinado, por exemplo, por um médico ou veteriná- rio, tendo como base sintomas clínicos.

Como uma alternativa, um composto de avermectina produzido de acordo com a presente invenção poderá ser administrado em combina- ção com a ração do animal, e para este fim um aditivo alimentar concentrado ou uma pré-mistura poderá ser preparado para mistura com a ração animal normal.

Para utilização como um inseticida, e para o tratamento de pra- gas agrícolas, um composto de avermectina produzido de acordo com a pre- sente invenção poderá ser aplicado sob a forma de um spray, poeira, emul- são, etc., de acordo com a prática agrícola padrão.

6. EXEMPLO: FERMENTAÇÃO DE STREPTOMYCES AVERMITILIS E ANÁLISES DE AVERMECTINA B2:B1 Cepas a que faltam tanto a desidrogenase do ácido 2-oxo de cadeia ramificada como as atividades de 5-O-metiltransferase não produzem avermectinas se o meio de fermentação não for suplementado com ácidos graxos. Este exemplo demonstra que nesses mutantes uma ampla faixa de razões B2:B1 de avermectinas poderá ser obtida quando a biosintese seja iniciada na presença de diferentes ácidos graxos. 6.1. Materiais e Métodos Streptomyces avermitilis ATCC 53692 foi armazenado a -70°C como um caldo total preparado em meio de sementeira consistindo em: Amido (Nadex, Laing National) - 20 g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) -15 g; Ardamine pH (Yeast Products Inc.) - 5 g; carbonato de cálcio -1 g. O volume final foi ajustado até 1 litro com água corrente, o pH foi ajustado até 7,2, e o meio foi submetido à autoclave a 121 °C durante 25 mi- nutos.

Dois ml de uma suspensão descongelada da preparação acima mencionada foram usados para inocular um frasco contendo 50 ml do mes- mo meio. Após 48 horas de incubação a 28°C em um agitador rotativo a 180 rpm, 2 ml do caldo foram usados para inocular um frasco contendo 50 ml de um meio de produção consistindo em: Amido - 80 g; carbonato de cálcio - 7 g; Pharmamedia - 5 g; hidrogen fosfato de dipotássio - 1 g; sulfato de mag- nésio - 1 g; ácido glutâmico - 0,6 g; sulfato heptahidrato ferroso - 0,01 g; sulfato de zinco - 0,001 g; sulfato de manganésio - 0,001 g. O volume final foi ajustadao até 1 litro com água corrente, o pH foi ajustado até 7,2, e o meio foi submetido à autoclave a 121°C durante 25 minutos. Vários substratos de ácido carboxílico (ver TABELA 1) foram dissolvidos em metanol e foram adicionados ao caldo de fermentação du- rante 24 horas após inoculação para dar origem a uma concentração final de 0,2 g/litro. O caldo de fermentação foi incubado durante 14 dias a 28°C, e em seguida o caldo foi centrifugado (2.500 rpm durante 2 minutos) e o so- brenadante foi eliminado. O pélete micelial foi extraída com acetona (15 ml), e em seguida com diclorometano (30 ml), e a fase orgânica foi separada, filtrada, sendo em seguida evaporada até à secura. O resíduo foi misturado com metanol (1 ml) e foi analisado por HPLC com um cromatógrafo líquido Hewlett-Packard 1090A equipado com um varredor detector de díodos de varrimento ligado para 240 nm. A coluna usada foi uma Beckman Ultrasphe- re C-18, 5 pm, coluna de 4,6 mm x 25 cm mantida a 40°C. Vinte e cinco μΙ da solução de metanol acima referida foram injetados para a coluna. A elui- ção foi realizada com um gradiente linear de metanol-água a partir de 80:20 a 95:5 durante 40 minutos a 0,85/m! minutos. Duas concentrações padrão de ciclohexil B1 foram usadas para calibrar a resposta do detector, e foi medida a área sob as curvas para avermectinas B2 e B1. 6.2. Resultados Os tempos de retenção HPLC observados para as avermectinas B2 e B1, e as razões 2:1, são apresentados no TABELA 1.

Os dados apresentados no TABELA 1 demonstram uma faixa extremamente ampla de razões de produto avermectinas B2:B1, indicando uma considerável diferença nos resultados de conversão desídrativa de compostos da classe 2 para compostos da classe 1, dependendo da nature- za da unidade iniciadora de cadeia lateral de ácido graxo fornecida. Isto indi- ca que modificações nas razões B2:B1 resultantes de alterações feitas à proteína Avec podem ser específicas para substratos particulares. Conse- quentemente, rastreio para mutantes apresenta modificações na razão B2;B1 obtido com um substrato particular necessita de ser feita na presença desse substrato. Os exemplos subseqüentes abaixo descritos utilizam ácido ciclohexanocarboxílico como o substrato de rastreio. Contudo, este substrato é usado meramente para exemplificar o potencial, e não pretende limitar a capacidade de aplicação, da presente invenção.

7. EXEMPLO: ISOLAMENTO DO GENE aveC

Este exemplo descreve o isolamento e caracterização de uma região do cromossomo de Strepíomyces avermitifis que codifica o produto gene AveC. Tal como é demonstrado mais abaixo, o gene aveC foi identifi- cado como sendo capaz de modificar a razão de avermectinas ciclohexil-B2 a ciclohexil-B1 (B2:B1) produzidas. 7.1. Materiais e Métodos 7.1.1. Crescimento de Streptomvces para Isolamento de DNA O método que se segue foi seguido para crescimento de Strepíomyces. Colônias simples de S. avermitiiis ATCC 31272 (isolado de colônia simples n° 2)foram isoladas em YPD-6 de intensidade Vz contendo: Difco Extrato de Levedura - 5 g; Difco Bato-peptona - 5 g; dextrose - 2,5 g; MOPS - 5 g; Difco Bato agar - 15 g. O volume final foi ajustado para 1 litro com dH20, o pH foi ajustado para 7,0, e o meio foi submetido à autoclave a 121°C durante 25 minutos.

Micélios feitos crescer no meio acima indicado foram usados para inocular 10 ml de meio TSB (Difco Tryptic Soy Broth - 30 g, em 1 litro dH20, foram submetidos a autoclave a 121 °C durante 25 minutos) em um tubo de 25 mm x 150 mm que foi mantido com agitação (300 rpm) a 28°C durante 48-72 horas. 7.1.2. Isolamento de DNA Cromossômico a partir de Streptomvces Porções alíquotas (0,25 ml ou 0,5 ml) de micélios feitos crescer tal como foi acima descrito foram colocados em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e as células foram concentradas por centrífugação a 12.000 x g du- rante 60 segundos. O sobrenadante foi eliminado e as células foram sus- pensas de novo em 0,25 ml de tapão TSE (20 ml de sacarose 1,5 M, 2,5 ml de Tris-HCI 1 M, pH 8,0, 2,5 ml de EDTA 1 M, pH 8,0, e 75 ml dHaO) con- tendo 2 mg/ml de lisozima. As amostras foram incubadas a 37°C durante 20 minutos com agitação, foram carregadas para um instrumento de isolamento de ácido nucléico automático AutoGen 540® (Integrated Separation Systems, Natick, MA), e DNA genômico isolado usando Cycle 159 (equipamento software) de acordo com as instruções do fabricante.

De um modo alternativo, 5 ml de micélios foram colocados em um tubo de 17 mm x 100 mm, as células foram concentradas por centrífuga- ção a 3.000 rpm, e o sobrenadante foi removido. As células foram suspen- sas de novo em 1 ml de tampão TSE, concentradas por centrífugação a 3.000 rpm durante 5 minutos, e o sobrenadante foi removido. As células fo- ram suspensas de novo em 1 ml de tampão TSE contendo 2 mg/ml de liso- zima, e foram incubadas a 37°C com agitação durante 30-60 minutos. Após incubação, 0,5 ml 10% de dodecil sulfato de sódio (SDS) foi adicionado e as células foram incubadas a 37°C até a lise ficar completa. O produto da lise foi incubado a 65°C durante 10 minutos, foi arrefecido até à temperatura ambiente, foi dividido entre dois tubos Eppendorf de 1,5 ml, e extraído 1 x com 0,5 ml de fenol/clorofórmio (50% de fenol previamente equilibrada com Tris 0,5 M, pH 8,0; 50% de clorofórmio). A fase aquosa foi removida e ex- traída 2 a 5x com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). O DNA foi precipitado por adição 1/10 volume de acetato de sódio 3 M, pH 4,8, incubando a mistu- ra sobre gelo durante 10 minutos, centrifugando a mistura a 15.000 rpm a 5°C durante 10 minutos, e removendo o sobrenadante para um tubo ao qual se adicionou 1 volume de isopropanol. A mistura do sobrenadante mais iso- propanol foi então incubada sobre gelo durante 20 minutos, foi centrifugada a 15.000 rpm durante 20 minutos a 5°C, o sobrenadante foi removido, e o pélete de DNA foi lavado 1x com etanol a 70%. Depois do pélete ficar seco, o DNA foi suspenso de novo em tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). 7.1.3. Isolamento de DNA de Plasmídeo a partir de Streptomvces Uma porção alíquota (1,0 ml) de micélios foi colocada em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e as células foram concentradas por centrífu- gação a 12.000 x g durante 60 segundos. O sobrenadante foi eliminado, as células foram suspensas de novo em 1,0 ml de sacarose a 10,3% e concen- tradas por centrífugação a 12.000 x g durante 60 segundos, e o sobrena- dante foi eliminado. As células foram então suspensas de novo em 0,25 ml de tampão TSE contendo 2 mg/ml de lisozima, e foram incubadas a 37°C durante 20 minutos com agitação e foram carregadas para o instrumento de isolamento de ácido nucléico automatizado AutoGen 540®. DNA de plasmí- deo foi isolado usando Cycle 106 (equipamento software) de acordo com as instruções do fabricante.

De um modo alternativo, 1,5 ml de micélios foram colocados em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e as células foram concentradas por centrífugação a 12.000 x g durante 60 segundos. O sobrenadante foi elimi- nado, as células foram suspensas de novo em 1,0 ml de sacarose a 10,3% e concentradas por centrífugação a 12.000 x g durante 60 segundos, e o so- brenadante foi eliminado. As células foram suspensas de novo em 0,5 ml de tampão TSE contendo 2 mg/ml de lisozima, e foram incubadas a 37°C du- rante 15-30 minutos. Após incubação, foi adicionado 0,25 ml de SDS alcalino (NaOH 0,3N, 2% de SDS) e as células foram incubadas a 55°C durante 15- 30 minutos ou até a solução ficar transparente. Acetato de sódio (0,1 ml, 3M, pH 4,8) foi adicionado à solução de DNA, que foi então incubada em gelo durante 10 minutos. As amostras de DNA foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 10 minutos a 5°C. O sobrenadante foi removido para um tubo limpo, e 0,2 mf de fenokclorofórmio (50% de fenol:50% de clorofórmio) foi adiciona- do e foi misturado suavemente. A solução de DNA foi centrifugada a 14.000 rpm durante 10 minutos a 5°C e a camada superior foi removida para um tubo Eppemdorf limpo. Foi adicionado isopropanol (0,75 ml), e a solução foi misturada suavemente sendo em seguida incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. A solução de DNA foi centrifugada a 14.000 rpm du- rante 15 minutos a 5°C, o sobrenadante foi removido, e o pélete de DNA foi lavado com etanol a 70%, foi seco, e suspenso de novo em tampão TE. 7.1.4. Isolamento de DNA de Plasmídeo A Partir De E.coli Uma única colônia de E. coli. Transformada foi inoculada em 5 ml de meio Luria-Bertani (LB) (Bato-Tryptone - 10 g, extrato de levedura Bato - 5 g, e NaCI -10 g em 1 litro de dH20, pH 7,0, submetidos a autoclave a 121 °C durante 25 minutos, e suplementados com 100 pg/,l de ampicilina). A cultura foi incubada durante a noite, e uma porção alíquota de 1 ml foi co- locada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. As amostras da cultura foram carregadas para o instrumento de isolamento de ácido nucléico auto- mático AutoGen 540® usando Cycie 3 (equipamento de software) de acordo com instruções do fabricante. 7.1.5. Preparação e Transformação de Protoplastos de S. avermitilis Colônias simples de S. avermitilis foram isoladas em YPD de força Vi. Os micélios foram usados para inocular 10 ml de meio TSB em um tubo de 25 mm x 150 mm, o qual foi então incubado com agitação (300 rpm) a 28°C durante 48 horas. Um ml de micélios foi usado para inocular 50 ml de meio YEME. O meio YEME contém por litro: Extrato de Levedura Difco - 3 g;

Bato-peptona Difco - 5 g; Extrato de Malte Difco - 3 g; Sacarose - 300 g.

Após autoclave a 121°C durante 25 minutos, foram adicionados os que se seguem: MgCl2 2,5 M . 6H20 (submetidos a autoclave separadamente a 121°C durante 25 minutos) - 2 ml; e glicina (20%) (esterilizados por filtração)- 25 ml.

Os micélios foram feitos crescer a 30°C durante 48-72 horas e foram colhidos por centrífugação em um tubo de centrífuga de 50 ml (Fal- con) a 3.000 rpm durante 20 minutos. O sobrenadante foi eliminado e os mi- célios foram suspensos de novo em tampão P, que contém: sacarose - 205 g: K2S04 - 0,25 g; MgC!2.6H20 - 2,02 g; H20 - 600 ml; K2P04 (0,5%) - 10 ml; solução de elemento vestigial - 20 ml; CaCI2.2H20 (3,68%) - 100 ml; e tampão MES (1,= M, pH 6,5) - 10 ml. (A solução de elementos vestigiais contém por litro: ZnCI2 - 40 mg; FeCI3 . 6H20 - 200 mg; CuCI2 . 2H20 - 10 mg; MnCI2.4H20 -10 mg; Na2B4C>7.10H2O -10 mg; (NH4)6 Mo7024.4H20 -10 mg). O pH foi ajustado para 6,5, 0 volume final foi ajustado para 1 litro, e 0 meio foi filtrado a quente através de um filtro de 0,45 mícron.

Os micélios foram reduzidos 0 pélete a 3.000 rpm durante 20 minutos, o sobrenadante foi eliminado, e os micélios foram suspensos de novo em 20 ml de tampão P contendo 2 mg/ml de lisozima. Os micélios fo- ram incubados a 35°C durante 15 minutos com agitação, e foram rastreados microscopicamente para determinar o grau de formação de protoplasto.

Quando a formação de protoplasto ficou completa, os protoplastos foram centrifugados a 8.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido e os proíoplastos foram suspensos de novo em 10 ml de tampão P. Os pro- toplastos foram centrifugados a 8.000 rpm durante 10 minutos, o sobrena- dante foi removido, os protoplastos foram suspensos de novo em 2 ml de tampão P, e aproximadamente 1 x 109 de protoplastos foram distribuídos para 2,0 ml de frascos criogênicos (Nalgene).

Um frasco contendo 1 x 109 de protoplastos foi centrifugado a 8.000 rpm durante 10 minutos, o sobrenadante foi removido, e os protoplas- tos foram suspensos de novo em 0,1 ml de tampão P. Dois a 5 pg de DNA de transformação foram adicionados aos protoplastos, imediatamente segui- dos pela adição de 0,5 ml de tampãp T em ação. A base de tampão P con- tém: PEG-1000 (Sigma) - 25 g; sacarose - 2,5 g; H2O - 83 ml. O pH foi ajus- tado para 8,8 com NaOH 1 N (esterilizado por filtração), e a base de tampão P foi esterilizada por filtração e foi armazenada a 4°C. Tampão T em ação, feito no mesmo dia que foi usado, foi base de tampão T - 8,3 ml; K2PO4 (4 mM) - 1,0 ml; CaCI2.2H20 (5 M) - 0,2 ml; e TES (1 M, pH 8) - 0,5 ml. Cada componente do tampão T em ação foi individualmente esterilizado por filtra- ção. 20 segundos após a adição de tampão T aos protoplastos, 1,0 ml de tampão P foi também adicionado e os protoplastos foram centrifuga- dos a 8.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi eliminado e os protoplastos foram suspensos de novo em 0,1 ml de tampão P. Os proto- plastos foram então colocados em placas com meio RM14, que contém: sa- carose - 205 g; K2SO4 - 0,25 g; MgCb . 6H20 -10,12 g; glucose -10 g; Difco Casamino Acids - 0,1 g; Extrato de levedura Difco - 5 g; Difco Oatmeal Agar - 3 g; Difco Bato Agar - 22 g; dH20 - 800 ml. A solução foi submetida à auto- clave a 121°C durante 25 minutos. Após autoclave, foram adicionados lotes estéreis do que se segue: K2PO4 (0,5%) -10 ml; CaCh . 2H20 (5 M) - 5 ml; L-prolina (20%) - 15 ml; tampão MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml; solução de elementos vestigiais (tal como acima) - 2 ml; lote de ciclo-heximida (25 mg/ml) - 40 ml; e NaOh 1N - 2 ml. Vinte e cinco ml de meio RM14 foram di- vididos em porções alíquotas por placa, e as placas foram secas durante 24 horas antes da sua utilização.

Os protoplastos foram incubados em humidade a 95% a 30°C durante 20-24 horas. Para selecionar transformantes resistentes a tiostrep- ton, 1 ml de tampão recoberto contendo 125 pg por ml de tiostrepton foi es- palhado de um modo uniforme sobre as placas de regeneração RM14. O tampão recoberto contém por 100 ml: sacarose - 10,3 g; solução de ele- mentos vestigiais (tal como acima) - 0,2 ml; e MES (1 M, pH 6,5) -1 ml. Os protoplastos foram incubados em 95% de humidade a 30°C durante 7-14 dias até se tornarem visíveis colônias resistentes a tiostrepton (Thio's). 7.1.6. Transformação de Protoplastos de Streptomvces lividans S. lividans TK64 (proporcionado pelo John Innes Institute, Norwich, U.K.) foi usado para transformações em alguns casos. Métodos e composições para fazer crescer, formar protoplastos, e transformar S. livi- dans são descritos em Hopwood et ai., 1985, Genetic Manipuiation of Streptomvces. A Laboratorv Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K., e foram realizados tal como foi ali descrito. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes de S. lividans tal como foi acima descrito na Se- ção 7.1.3. 7.1.7. Análise de Fermentação de Cepas de S. avermitiiis Micélios de S. avermitiiis feitos crescer em YPD-6 com uma for- ça de Υΐ durante 4-7 dias foram inoculados para tubos de 2,54 x 15,24 cm (1 x 6 polegadas) contendo 8 ml de meio preformado e duas pérolas de vidro de 5 mm. O meio preformado contém: amido solúvel (amido submetido à ebulição delgado ou KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/l; Phar- macia - 15 g/l; Ardamine Ph - 5 g/l (Champlain ind., Clifton, NJ); CaCC>3 - 2 g/l; 2 x bcfa ("bcfa" refere-se a ácidos graxos de cadeia ramificada) contendo uma concentração final no meio de 50 ppm de ácido 2-(+/-)-metii butírico, 60 ppm de ácido isobutírico e 20 ppm de ácido isovalérico. O pH foi ajustado para 7,2, e o meio foi submetido à autoclave a 121°C durante 25 minutos. O tubo foi agitado em um angulo de 17° a 215 rpm a 29°C du- rante 3 dias. Uma alíquota de 2 ml da cultura da sementeira foi usada para inocular um frasco de Erlenmeyer de 300 ml contendo 25 ml de meio de pro- dução que contém: amido (amido submetido à ebulição delgado ou KOSO) - 160 g/l; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) -10 g/l; Ardamina pH - 10 g/l; K2HP04 - 2 g/l; MgS04.4H20 - 2g/l; FeS04.7H20 - 0,02 g/l; MnCI2 - O, 002 g/l; ZnS04.7H20 - 0,002 g/l; CaC03 -14 g/l; 2x bcfa (tal como acima); e ácido ciclohexano carboxílico (CHC) (produzido como uma solução a 20% com um pH 7,0) - 800 ppm. O pH foi ajustado para 6,9, e o meio foi submeti- do à autoclave a 121°C durante 25 minutos. (Tal como foi acima explicado, unidades iniciadoras diferentes de CHC poderão ser utilizadas em sua subs- tituição (ver, por exemplo, Tabela 1)).

Após inoculação, o frasco foi incubado a 29°C durante 12 dias com agitação a 200 rpm. Após incubação, uma amostra de 2 ml foi retirada do frasco, foi diluída com 8 ml de metanol, misturada, e a mistura foi centri- fugada a 1.250 x g durante 10 minutos até se obterem detritos de pílulas. O sobrenadante foi então ensaiado por HPLC usando uma coluna Beckman Ultrasphere ODS (25 cm x 4,6 mm ID) com uma taxa de fluxo de 0,75 ml/min e detecção por absorvência a 240 nm. A fase móvel foi constituída por 86/8,9/5,1 metanol/água/acetonitrila.

Isolamento de Genes PKS De S. avermitilis Uma biblioteca de cosmídeos do DNA cromossômico de S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) foi preparado e hibridizado com uma sonda cetosintase (KS) formada a partir de um fragmento do gene sintase poliketi- do de Saccharopolyspora erythraea (PKS). Uma descrição detalhada da preparação de bibliotecas de cosmídios pode ser encontrada em Sambrook et ai, 1989, acima referido. Uma descrição detalhada da preparação de bi- bliotecas de DNA cromossômico de Steptomyces é apresentado em Hopwo- od et al., 1985, acima referido. Clones de cosmídeos contendo cetosintase- regiões de hibridização foram identificados por hibridização até 2,7 Kb de um fragmento de A/del/Eco47lll a partir de pEX26 (gentilmente fornecido por Dr. P. Leadlay, Cambridge, UK). Aproximadamente 5 ng de pEX26 foram digeri- dos usando Λ/del e Eco47lll. A mistura da reação foi carregada para um gel de agarose SeaPlaque GTG a 0,8% (FMC BioProducts, Rockland, ΜΕ). O fragmento 2,7 Kb /Vdel/£co47lll foi excisado a partir do gel após eletroforese e o DNA recuperado a partir do gel usando GELase® a partir de Epicentre Technologies usando o Fast Protocol. O fragmento 2,7 kb A/del/Eco47lll foi marcado com [a-32P]dCTP (5'-trifosfato de desoxicitidina, sal te- tra(trietilamônio), [alfa-32P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) usando o BRL Nick Translation System (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) seguin- do as instruções do fornecedor. Uma reação típica foi realizada em 0,05 ml de volume. Após adição de 5 pl de tampão "Stop", o DNA rotulado foi sepa- rado a partir de nucieotídeos não incorporados usando um G-25 Sephadex Quick Spin® Column (Boehringer Mannheim) seguindo as instruções do for- necedor.

Aproximadamente 1.800 clones de cosmídeos foram rastreados por hibridização de colônia. Foram identificados dez ciones que hibridizaram fortemente para a sonda Sacc. Erythraea KS. Colônias de DNA contendo DNA de cosmídeo foram feitas crescer em meio líquido LB e DNA de cosmí- deo foi isolado a partir de cada cultura no instrumento de isolamento de áci- do nucléico automatizado AutoGen 540® usando Cycle 3 (equipamento de software) de acordo com as instruções do fabricante. As análises fazendo mapas da endonuclease de restrição e de hibridização de Southern blot re- velaram que cinco dos clones continham regiões cromossômicas sobrepos- tas. Um mapa de restrição BamH\ genômico de S. avermitilis dos cinco cos- mídeos (isto é, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) foi construído por análise de cosmídios sobrepostos e hibridizações (Figura 4). 7.1.9. Identificação de DNA que Modula Razões de Avermectinas B2:B1 e Identificação de um ORF aveC

Os métodos que se seguem foram usados para testar fragmen- tos subclonados derivados do clone de cosmídeo pSE66 quanto à sua capa- cidade para modular razões de avermectinas B2:B1 em mutantes AveC. PSE66 (5 pg) foi digerido com Saci e BamH\. A mistura da reação foi carre- gada para um gel de agarose SeaPlaque® GTG a 0,8% (FMC BioProducts), um fragmento 2,9 Kb Sacl/BamHI foi excisado a partir do gel após eletrofo- rese, e o DNA foi recuperado a partir do gel usando GELase® (Epicentre Te- chnologies) usando o Fast Protocol. Aproximadamente 5 pg do vetor de re- arranjo pWHM3 (Vara etal., 1989, J. Bacteriol. 171:5872-5881) foram digeri- dos com Saci e BamH\. Cerca de 0,5 pg do produto inserido 2,9 Kb e 0,5 pg do pWHM3 digerido foram misturados um com o outro e foram incubados durante a noite com 1 unidade de íigase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) a 15°C, em um volume total de 20 pl, de acordo com as instruções do fornecedor. Após incubação, 5 pl da mistura de ligação foram incubados a 70°C durante 10 minutos, foram arrefecidos atè à temperatura ambiente, e usados para transformar células DH5a de E. coli (BRL) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de trans- formantes resistentes à ampicilina e a presença do elemento inserido 2,9 Kb Sacl/BamHI foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo foi desi- gnado como pSE119.

Protoplastos da cepa de S. avermitilis 1100-SC38 (cepa in- house Pfizer) foram preparados e transformados com pSE119 tal como foi acima descrito na Seção 7.1.5. A cepa 1100-SC38 é um mutante que produz uma quantidade mais significativa de avermectina da forma ciclohexil-B2 em comparação com a forma de avermectina ciclohexil-B1 quando suplementa- da com ácido ciclohexano carboxílico (B2:B1 de cerca de 30:1). PSE119 usado para transformar protoplastos de S. avermitilis foi isolado a partir da cepa de E. coli GM2163 (obtida a partir de Dr. J. BaChmann, Curator, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), cepa E. coli DM1 (BRL), ou cepa S. iividans TK64. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da cepa 1100-SC38 foram isolados e analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. Os transformantes da cepa 1100-SC38 de S. avermitilis con- tendo pSE119 produziram uma razão alterada de avermectinas ciclohexil- B2:ciclohexil-B1 de cerca de 3,7:1 (TABELA 2).

Tendo estabelecido que pSE119 era capaz de modular razões de avermectinas B2:B1 em um mutante AveC, o DNA do elemento inserido foi seqüenciado. Aproximadamente pg de pSE119 foram isolados usando um estojo de isolamento de DNA de plasmídeo (Qiagen, Valencia, CA) se- guindo as instruções do fabricante, e fazendo a sequência usando ABI 373A

Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA). Os dados da seqüência foram reunidos e editados usando programas do Genetic Com- puter Group (GCG, Madison, Wl). A seqüência de DNA e o aveC ORF são apresentados na Figura 1 (SEQ ID NO:1).

Um novo plasmídeo, designado como pSE118, foi construído como se segue. Aproximadamente 5 pg de pSE66 foram digeridos com Sph\ e SamHI. A mistura da reação foi carregada em um gel de agarose SeaPla- que GTG a 0,8% (FMC BioProducts), um fragmento 2,8 Kb Sph\IBamY\\ foi excisado a partir do gel após eletroforese, e o DNA foi recuperado a partir do gel usando GELase® (Epicentre Technologies) usando o Fast protocol.

Aproximadamente 5 pg do vetor de lançamento pWHM3 foram digeridos com Sph\ e BamHI. Cerca de 0,5 pg do elemento de inserção 2,8 Kb e 0,5 pg de pWHM3 digerido foram misturados um com o outro e incubados du- rante a noite com 1 unidade de ligase (New England Biolabs) a 15°C em um volume total de 20 pl de acordo com as instruções do fornecedor. Após in- cubação, 5 pl da mistura de ligação foram incubados a 70°C durante 10 mi- nutos, foram arrefecidos até à temperatura ambiente, e foram usados para transformar células competentes de E. coli DH5a de acordo com as instru- ções do fabricante. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transforman- tes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção 2,8 Kb SphUBamH\ foi confirmada por análise de restrição. O plasmídeo foi desi- gnado como pSE118. O DNA do elemento inserido em pSE118 e pSE119 sobrepõem-se em aproximadamente 833 nucleotídeos (Figura 4).

Protoplastos da cepa de S. avermitilis 1100-SC38 foram trans- formados com pSE118 como foi acima referido. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da cepa 1100-SC38 foram isolados e analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. Agentes de transformação da cepa de S. avermitilis da cepa 1100-SC38 contendo pSE118 não foram alte- rados nas razões de avermectina ciclohexil-B2: avermectina ciclohexil-B1 em comparação com a cepa 1100-SC38 (TABELA 2). 7.1.10. Amplificação de PCR do Gene aveC a partir De DNA de Cromosso- mo de S. avermitilis Um fragmento ~1,2 Kb contendo o ORF aveC foi isolado a partir do DNA cromossômico por amplificação PCR usando iniciadores designados tendo como base a seqiiência de nucleotídeos do aveC acima obtida. Os iniciadores PCR foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. (Te- xas). O iniciador para a direita foi: 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO:6); e o iniciador para a esquerda foi: 5’-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID Ν0.7). A reação PCR foi realizada com polimerase Deep Vent® (New Engiand Biolabs) em tampão proporcionado pelo fabricante, e na pre- sença de 300 μΜ dNTP, 10% de glicerol, 200 pmol de cada iniciador, 0,1 pg de "temptate" (padrão), e 2,5 unidades de enzima em um volume final de 100 pl, usando um agente de ciclo térmico Perkin-Elmer Cetus. O perfil tér- mico do primeiro ciclo foi de 95°C durante 5 minutos (etapa de desnatura- ção), 60°C durante 2 minutos (etapa de recozimento), e 72°C durante 2 mi- nutos (etapa de extensão). Os subseqüentes 24 ciclos tinham um perfil tér- mico semelhante exceptuando o fato da etapa de desnaturação ser encurta- do para 45 segundos e a etapa de recozimento ser encurtado para 1 minuto. O produto PCR foi submetido à eletroforese em um gel de aga- rose a 1% e foi detectada uma banda de DNA de -1,2 Kb. Este DNA foi pu- rificado a partir do gel, e foi ligado com 25 ng de vetor pCR-Blunt (Invitrogen) atenuado, linearizado em uma razão de vetor para elemento inserido de 1:10 seguindo as instruções do fabricante. A mistura de ligação foi usada para transformar células de E. coli One Shot® Competent (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento inserido ~1,2 Kb foi confirmada por análise de restrição. O plasmídeo foi designado como pSE179. O DNA do elemento inserido a partir de pSE179 foi isolado por digestão com BamHUXbal, separado por eletroforese, purificado a partir do gel, e ligado com vetor de rearranjo pWHM3, o qual tinha sido digerido com BamH\lXba\, em uma concentração total de DNA de 1 pg em uma razão vetor para elemento inserido 1:5 molar. A mistura de ligação foi usada para transformar células DH5a de E. coli competente de acordo com as instru- ções do fabricante. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transforman- tes resistentes a ampicilina e a presença de elemento de inserção ~1,2 Kb foi confirmado por análise de restrição. Este plasmídeo, que foi designado como pSE186 (Figura 2, ATCC 209604), foi transformado em E. coli DM1, e o DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a am- picilina. 7.2. Resultados Um fragmento Sacl/SamHI 2,9 Kb a partir de pSE119 foi identifi- cado o qual, quando transformado em cepa S. avermitilis 1100-SC38, alterou de um modo significativo a razão de produção de avermectinas B2.B1. A cepa de S. avermitilis 1100-SC38 tem normaimente uma razão B2:B1 de cerca de 30:1, mas quando transformado com um vetor compreendendo o fragmento Sacl/SamHI 2,9 Kb, a razão de avermectinas B2:B1 diminuiu até cerca de 3,7:1. Análise pós-fermentação de céiuias transformantes verificou a presença do DNA de transformação. O fragmento pSE119 2,9 Kb foi sequenciado e um ORF ~0,9 Kb foi identificado (Figura 1) (SEQ ID NO:1), que abrange um fragmento PstilSph\ que tinha sido previamente submetido à mutação em outro local para produzir apenas produtos B2 (Ikeda et ai., 1995, acima referidos). Uma comparação deste ORF, ou seu polipeptideo deduzido correspondente, con- tra dados de base conhecidos (GenEMBL, SWISS-PROT) não reveiou qual- quer homologia conhecida com DNA conhecido ou seqüências de proteína. O TABELA 2 apresenta a análise de fermentação da cepa S. avermitilis 1100-SC38 transformada com vários plasmídeos.

8. EXEMPLO: CONSTRUÇÃO DE MUTANTES AveC de S. AVERMITILIS

Este exemplo descreve a construção de vários diferentes mu- tantes de AveC de S. avermitilis diferentes usando as composições e méto- dos acima descritos. Uma descrição geral de técnicas para introdução de mutações em um gene em Streotomyces é descrito por Kieser and Hopwo- od, 1991, Meth. Enzym. 204:430-458. Uma descrição mais detalhada é pro- porcionada por Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI(2):226-233, e por Stutzman-Engwall et ai,, 1992, J. Bacteriol. 174(1):144-154. Estas referênci- as são aqui incorpoaradas como referência na sua totalidade. 8.1. Inativacão do Gene aveC de S. avermitilis Mutantes Avec contendo genes aveC inativados foram construí- dos usando vários métodos, tal como é descrito detalhadamente mais abai- xo.

No primeiro método, um fragmento interno Sph\IPst\ 640 bp para o gene aveC em pSE119 (plasmídeo descrito na Seção 7.1.9, acima referi- da) foi substituído com o gene ermE (para resistência a eritromicina) a partir de Sacc, Erythraea. O gene ermE foi isolado a partir de plJ4026 (proporcio- nado pelo John Innes Institute, Norwich, U.K.; ver também Bibb et al., 1985, Gene 41:357-368) por digestão de enzima de restrição com BglII e EcoRI, seguida por eletroforese, e foi purificado a partir do gel. Este fragmento ~1,7 Kb foi ligado para pGEM7Zf (Promega) que tinha sido digerido com SamHI e EcoRI, e a mistura da ligação foi transformada em células competentes de E. co//'DH5a seguindo as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção -1,7 Kb foi confirmado por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado como pSE27. PSE118 (descrito na Seção 7.1.9, acima referido) foi digerido com Sph\ e BamHI, o produto digerido foi submetido à eletroforese, e o ele- mento inserido SphUBamHl -2,8 Kb foi purificado a partir do gel. PSE119 foi digerido com Pst\ e EcoRI, o produto digerido foi submetido à eletroforese, e o elemento de inserção Pst\IEcoR\ ~1,5 Kb foi purificado a partir do gel. O vetor de rearranjo pWHM3 foi digerido com BamH\ e EcoRI. PSE27 foi dige- rido com Psfl e Sph\, o produto digerido foi submetido à eletroforese, e o elemento inserido Pst\ISph\ ~1,7 Kb foi purificado a partir do gel. Os quatro fragmentos (isto é, ~2,8 Kb, ~1,5Kb, ~7,2Kb, ~1,7Kb) foram ligados uns aos outros em uma ligação de 4 vias. A mistura de ligação foi transformada nas células competentes de E. coli DH5a seguindo as instruções do fabricante. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a am- picilina, e a presença do elemento de inserção correto foi confirmado por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado como pSE180 (Figura 3; ATCC 209605). PSE180 foi transformado em S. lividans TK64 e colônias trans- formadas identificadas por resistência a tiostrepton e eritromicina. PSE180 foi isolado a partir de S. lividans e foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis. Quatro transformantes de S. avermitilis resistentes a tiostrep- ton foram identificados, e protoplastos foram preparados e colocados em placa em condições não-seletivas nos meios RM14. Depois de os proto- plastos se regenerarem, colônias simples foram rastreadas quanto à presen- ça de resistência a eritromicina e a ausência de resistência a tiostrepton, indicando integração cromossômica do gene aveC inatívado e perda do re- plicon livre. Um transformante Ermr Tios foi identificado e designado como cepa SE180-11. DNA cromossômico total foi isolado a partir da cepa SE180- 11, foi digerido com enzimas de restrição BamH\, Hind\\\, Psi\, ou Sph\, se- parados por eletroforese em um gel de agarose a 0,8%, transferido para membranas de náilon, e hibridizado para a sonda ermE. Estas análises re- velaram que a integração cromossômica do gene de resistência ermE, e concomitante deleção do fragmento PstUSphl 640 bp tinham ocorrido por um evento cruzado duplo. Análise HPLC de produtos de fermentação da cepa SE180-11 revelou que avermectinas normais tinham deixado de ser produzi- das (Figura 5A).

Em um segundo método para inativar o gene aveC, o gene ermE 1,7 Kb foi removido a partir do cromossomo da cepa S. avermitilis SE180-11, deixando uma deleção Pst\iSph\ 640 bp no gene aveC. Um plasmídeo de substituição de gene foi construído como se segue: pSE180 foi parcialmente digerido com Xba\ e um fragmento -11,4 Kb purificado a partir de gel. À banda -11,4 Kb falta o gene de resistência ermE 1,7 Kb. O DNA foi então ligado e transformado em células de £. coli DH5ot. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina e a presença do elemento inserido correto foi confirmado por análise de restrição. Este plas- mídeo, que foi designado como pSE184, foi transformado em E. coli DM1, e DNA de plaSmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampi- cilina. Este plasmídeo foi usado para transformar protoplastos da cepa S. avermitilis SE180-11. Protoplastos foram preparados a partir de transfor- mantes resistentes a tiostrepton de cepa SE180-11 e foram colocados em placas como colônias simples em RM14. Depois dos protoplastos se regene- rarem, colônias simples foram rastreadas quanto a ausência de ambas a resistência a eritromicina e resistência a tiostrepton, indicando integração cromossômica do gene aveC inativado e perda do replicon livre contendo gene ermE. Um transformante Erms Tios foi identificado e designado como SE184.1.13. A análide de fermentação de SE184-1-13 revelou que as aver- mectinas normais não foram produzidas e que SE184-1-13 tinha o mesmo perfil de fermentação que SE180-11.

Em um terceiro método para inativação do gene aveC, foi intro- duzida uma mutação (frameshift) no gene aveC do cromossomo adicionando dois G's depois do C na posição nt 471 usando PCR, criando desse modo um sítio SspE1. A presença do sítio BspE submetido à engenharia foi útil para detectar o evento de substituição de gene. Os iniciadores PCR foram esboçados para introduzir uma mutação de (frameshift) (desvio) no gene aveC, e foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. O iniciador para a direita foi: 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID NO:8) e o inicia- dor para a esquerda foi: 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO:9). As condições PCR foram tal como foi descrito na Seção 7.1.10 acima referido. O produto PCR 666 bp foi digerido com Sph\ para dar origem a dois fragmentos de 278 bp e 388 bp, respectivamente. O fragmento 388 bp foi purificado a partir do gel. O plasmídeo de substituição de gene foi construído como se se- gue: vetor de rearranjo pWHM3 foi digerido com HcoRI e SamHI. PSE119 foi digerido com BamH\ e Sph\, o produto digerido foi submetido à eletroforese, e um fragmento -840 bp foi purificado a partir do gel. PSE119 foi digerido com EcoRI e Xmnl, o produto digerido foi separado por eletroforese, e um fragmento -1,7 Kb foi purificado a partir do gel. Os quatro fragmentos (isto é, -7,2 Kb, -840 bp, -1,7 Kb, e 388 bp) foram ligados uns aos outros em uma ligação de 4 vias. A mistura de ligação foi transformada em células compe- tentes de E. coli DH5a. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transfor- mantes resistentes a ampicilina e a presença do elemento inserido correto foi confirmado por análise de restrição e análise de seqüência de DNA . Este plasmídeo, que foi designado como pSE185, foi transformado em E. coli DM1 e DNA de plasmídeo isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina. Este plasmídeo foi usado para transformar protoplastos da cepa S. avermitilis 1100-SC38. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da cepa 1100-SC38 foram isolados e analisados por análise HPLC de pro- dutos de fermentação. PSE185 não alterou de um modo significativo as ra- zões de avermectinas B2:B1 quando transformados em S avermitilis da cepa 1100-SC38 (TABELA 2). PSE185 foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis para dar origem a uma mutação de (frameshift) (desvio) no gene aveC do cromossomo. Os protoplastos foram preparados a partir de transformantes resistentes a tiostrepton e foram colocados em placas sob a forma de colô- nias simples em RM14. Depois dos protoplastos se terem regenerado, colô- nias simples foram rastreadas quanto a ausência de resistência a tiostrep- ton. O DNA do cromossomo a partir de colônias sensíveis a tiostrepton foi isolado e avaliado por PCR quanto à presença da mutação de (frameshift) integrada no cromossomo. Os iniciadores PCR foram esboçados tendo como base a seqüência de nucleotídeos aveC, e foram fornecidos por Ge- nosys Biotechnologies, Inc. (Texas). O iniciador PCR para a direita foi: 5'- GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO: 10) e o iniciador PCR para a esquerda foi: 5’-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO: 11), e as con- dições PCR foram tal como foi descrito na Seção 7.1.10 acima referida. O produto PCR obtido foi 543 bp e, quando digerido com SspEI, três fragmen- tos de 368 bp, 96 bp, e 79 bp foram observados, indicando integração cro- mossomica do gene aveC inativado e perda da replicação livre.

Análise de fermentação de mutantes de S. avermitffls contendo a mutação de (frameshift) (desvio) no gene aveC revelou que avermectinas normais deixaram de ser produzidas, e que que estes mutantes tinham o mesmo perfil HPLC de fermentação que cepas SE180-11 e SE184-1-13. Um transformante Tios foi identificado e designado como cepa SE185-5a.

Adicionalmente, foi produzida uma mutação no gene aveC que modifique a posição nt 520 a partir de G a A, que dá origem a alteração do códon codificando um triptofano (W) na posição (W) 116 até um códon de terminação. Uma cepa de S.avermitilis com esta mutação não produziu avermectinas normais e apresentava o mesmo perfil de fermentação que cepas SE180-11, SE184-1 -13, e SE185-5a.

Adicionalmente, foram produzidas mutações no gene aveC que alteram ambos: (i) posição nt 970 a partir de G a A, que modifica o aminoá- cido na posição 266 a partir de uma glicina (G) em um aspartato (D), e (ii) posição nt 996 de T a C, que modifica o aminoácido na posição 275 da tiro- sina (Y) a histidina (H). Uma cepa de S. avermitilis com estas mutações (G266D/Y275H) não produziu avermectinas normais e apresentava o mes- mo perfil de fermentação que cepas Se180-11, Se184-1-13, e SE185-5a.

As cepas de mutante de inativação de aveC de S. avermetilis SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a, e outras aqui proporcionadas, proporcio- nam instrumentos de rastreio do impato de outras mutações no gene aveC. PSE186, que contém uma cópia do tipo selvagem do gene aveC, foi trans- formado em E. coti DM1, e DNA do plasmídeo foi isolado a partir de trans- formantes resistentes a ampicilina. Este DNA de pSE186 foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis da cepa SE180-11. Os transfor- mantes resistentes a tiostrepton da cepa Se180-11 foram isolados, a pre- sença de resistência a eritromicina foi determinada, e transformantes Arm' foram analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. A presença do gene aveC funcional in trans foi capaz de restaurar a normal produção de avermectina para a cepa SE180-11 (Figura 5B), 8.2. Análise de Mutação no Gene aveC que Altera Razões da Classe B2:B1 Tal como foi acima descrito, S. avermitilis da cepa SE180-11 contendo um gene aveC inativo foi complementado por transformação com um piasmídeo contendo um gene aveC funcional (pSE186). A cepa SE180- 11 foi também utilizada como uma cepa hospedeira para caracterizar outras mutações no gene aveC, tal como é descrito mais abaixo. DNA cromossômico foi isolado a partir da cepa 1100-SC38, e foi usado como um template (padrão) para amplificação PCR do gene aveC. O ORF 1,2 Kb foi isolado por amplificação PCR usando iniciadores designados tendo como base a seqüência de nucleotídeos aveC. O iniciador para a di- reita foi SEQ ID NO:6 e o iniciador para a esquerda foi SEQ ID NO:7 (ver Seção 7.1.0, acima referido). O PCR e condições de subclonagem foram tal como foi descrito na Seção 7.1.10. A análise da seqüência de DNA do ORF

1,2 Kb revela uma mutação no gene aveC que modifica posição nt 337 de C a T, o que modifica o aminoácido na posição 55 de serina (S) para fenilala- nina (F). O gene aveC contendo a mutação S55F foi subclonada para pWHM3 para produzir um piasmídeo que foi designado como pSE187, e que foi usado para transformar protoplastos da cepa S. avermitilis SE180-11.

Agentes de transformação resistentes a tíostrepton da cepa SE180-11 foram isolados, a presença de resistência de eritromicina foi determinada, e trans- formantes Tior Ermr foram analisados por análise HPLC de produtos de fer- mentação. A presença do gene aveC codificando uma modificação no resí- duo de aminoácido 55 (S55F) foi capaz de restaurar a produção normal de avermectina da cepa SE180-11 (Figura 5C); contudo, a razão ciclohexii B2:ciclohexi! B1 foi de cerca de 26:1, em comparação com a cepa SE180-11 transformada com pSE186, que apresentava uma razão de B2:B1 de cerca de 1,6:1 (TABELA 3), indicando que a simples mutação (S55F) modula a quantidade de ciclohexil-B2 produzido em relação a ciclohexil-B1.

Foi identificada uma outra mutação no gene aveC que modifica posição nt 862 de G a A, que modifica o aminoácido na posição 230 de glici- na (G) a aspartato (D). Uma cepa de S. avermitilis tendo esta mutação (G230D) produz avermectinas em uma razão B2:B1 de cerca de 30:1. 8.3. Mutações que Reduzem a Razão B2:B1 Foram realizadas várias mutações que reduzem a quantidade de ciclohexi!-B2 produzido em relação a ciclohexil-B1, como se segue.

Foi identificada uma mutação no gene aveC que modifica posi- ção nt 588 a partir de G a A, que modifica o aminoácido na posição 139 de alanina (A) para treonina (T). O gene aveC contendo a mutação A139T foi subclonado para pWHM3 para produzir um plasmídeo que foi designado pSE188, e que foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis da cepa SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da cepa SE180-11 foram isolados, a presença de resistência a eritromicina foi deter- minada, e transformantes Tior Ermr foram analisados por análise HPLC de produtos de transformação. A presença do gene AveC submetido à mutação que codificou uma modificação no resíduo de aminoácido 139 (A139T) foi capaz de restaurar a produção de avermectina para cepa SE180-11 (Figura 5D); contudo, a razão B2:B1 foi de cerca de 0,94:1, indicando que esta mu- tação reduz a quantidade de ciclohexil-B2 produzido em relação a ciclohexil- B1. Este resultado foi inesperado porque resultados publicados, assim como os resultados de mutações acima descritos, apenas demonstraram ou inati- vação do gene aveC ou produção aumentada da forma B2 de avermectina em relação à forma B1 (TABELA 3).

Porque a mutação de A139T alterou as razões B2:B1 na direção B1 mais favorável, foi construída uma mutação que codificou uma treonina em vez de uma serina na posição de aminoácido na posição 138. Assim, pSE186 foi digerido com EcoRI e foi clonado para pGEM3Zf (Promega) que tinha sido digerido com EcoRI. Este plasmídeo, que foi designado como pSE186a, foi digerido com ApaI e Kpn\, os fragmentos de DNA foram sepa- rados em um gel de agarose, e dois fragmentos de -3,8 Kb e ~0,4 Kb foram purificados a partir do gel. O DNA inserido -1,2 Kb de pSE186 foi usado como um template (padrão) PCR para introduzir uma modificação de base simples em posição nt 585. Os iniciadores PCR foram esboçados para intro- duzir uma mutação em posição nt 585, e foram fornecidos por Genosys Bi- otechnologies, Inc. (Texas). O iniciador PCR para a direita foi: 5'- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID NO: 12); e o iniciador PCR para a esquerda foi: 5'- GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID N0:13). A reação PCR foi reali- zada usando um estojo genômico GC Advantage (Clonetech Laboratories, Paio Alto, CA) em tampão proporcionado pelo fabricante na presença de 200 μΜ dNTPs, 200 pmol de cada iniciador, 50 ng DNA template (padrão), 1,0 M GC-Melt e 1 unidade Klen Taq Polymerase Mix em um volume final de 50 pl. O perfil térmico do primeiro ciclo foi de 94°C durante 1 minuto; seguindo-se 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos e 68°C durante 2 minutos; e 1 ciclo a 68°C durante 3 minutos. Um produto PCR de 295 bp foi digerido com Apa\ e Kpn\ para libertar um fragmento 254 bp, o qual foi separado por eletrofores e foi purificado a partir do gel. Os três fragmentos (~3,8 Kb, ~0,4 Kb e 254 bp) foram ligados uns aos outros em uma ligação de 3 vias. A mistura de ligação foi transformada em células competentes de E. coli DH5a. O DNA do plas- mídeo foi isoiado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a pre- sença do elemento inserido correto foi confirmada por análise de restrição. O plasmídeo foi designado como pSE198. PSE198 foi digerido com EcoRI, foi clonado para pWHM3, que tinha sido digerido com EcoRI, e transformado em células de E. coli DH5a. O DNA de plasmidio foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampici- lina e a presença do elemento de inserção correto foi confirmada por análise de restrição e análise de seqüência de DNA. Este DNA de plasmídeo foi transformado em E. coli DM1, DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina e a presença do elemento de inser- ção correto foi confirmada por análise de restrição. O plasmídeo, que foi de- signado como pSE199, foi usado para transformar protoplastos de S. aver- mitilis da cepa SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da cepa Se180-11 foram isolados, a presença de resistência a eritromicina foi determinada, e transformantes Tior Ermr foram analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. A presença do gene AveC submetido à mutação codificando uma modificação no resíduo de aminoácido 138 (S138T) foi capaz de restaurar uma produção normal de avermectina para cepa SE180:11; contudo, a razão B2:B1 foi de 0,88:1 indicando que esta mutação reduz a quantidade de ciclohexil-B2 produzido em relação a ciclo- hexil-B1 (TABELA 3). Esta razão B2:B1 é ainda mais baixa do que a razão 0,94:1 observado com a mutação A139T produzida por transformação da cepa SE180-11 com pSE188, tal como foi acima descrito.

Foi construída outra mutação para introduzir uma treonina em ambas as posições de aminoácido 138 e 139. O DNA inserido -1,2 Kb a partir de pSE186 foi usado como um template (padrão) PCR. Os iniciadores PCR foram esboçados para introduzir mutações em posições nt 585 e 588, e foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). O iniciador PCR para a direita foi: 5'- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC- 3' (SEQ ID NO:14) ; e o iniciador PCR para a esquerda foi: 5'- GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO:15). A reação PCR foi reali- zada usando as condições imediatamente acima descritas nesta Seção. Um produto PCR de 449 bp foi digerido com Apa\ e Kpn\ para libertar um frag- mento 254 bp, que foi separado por eletroforese e foi purificado a partir do gel. PSE186a foi digerido com Apal e Kpn\, os fragmentos de DNA foram separados em gel de agarose, e dois fragmentos de -3,8 Kb e -0,4 Kb fo- ram purificados a partir do gel. Os três fragmentos (-3,8 Kb, -0,4 Kb e 254 bp) foram ligados uns aos outros em uma ligação de 3 vias, e a mistura de ligação foi transformada em células competentes de E. coli DH5a. DNA de plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção correto foi confirmada por análise de res- trição. Este plasmideo foi designado como pSE230. pSE230 foi digerido com EcoRI, foi clonado para pWHM3, que tinha sido digerido com EcoRI, e transformado em células E. coli DH5a. DNA de plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina e a presença de elemento de inserção correto foi confirmada por análise de restrição e análise da seqüência de DNA. Este DNA de plasmideo foi trans- formado em E. coli DM1, DNA de plasmideo isolado a partir de transfor- mantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção cor- reto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmideo, que foi desi- gnado como pSE231, foi usado para transformar protoplastos da cepa de S.avermitilis SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton de SE180-11 foram isolados, a presença de resistência a eritromicina foi determinada, e os transformantes Tior Ermr foram analisados por fermenta- ção. A presença do gene aveC com dupla mutação codificando S138T/A139T, foi capaz de restaurar uma normal produção de avermectina para a cepa Se180:11; contudo, a razão B2:B1 foi de 0,84:1 revelando que esta mutação reduz ainda mais a quantidade de ciclohexil-B2 produzida em relação a ciclohexil-B1 (TABELA 3), superior às reduções proporcionadas por transformação da cepa SE180-11 com pSE188 ou pSE199, tal como foi acima descrito.

Outra mutação foi construída para reduzir ainda mais a quanti- dade de ciclohexil-B2 produzida em relação a ciclohexil-B1. Porque as muta- ções S138T/A139T alteraram as razões B2:B1 na direcção mais favorável de B1, foi construída uma mutação para introduzir uma treonina na posição do aminoácido 138 e uma fentlalanina na posição de aminoácido 139. O DNA de elemento de inserção ~1,2 Kb a partir de pSE186 foi usado como um template (padrão) PCR. Os iniciadores PCR foram esboçados para introduzir mutações em posições nt 585 (mudando um T em A), 588 (mudando um G em T), e 589 (mudando um C em T), e foram fornecidos por Genosys Biote- chnologies, Inc. (Texas). O iniciador PCR para a direita foi: 5'- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC- 3' (SEQ ID NO:16); e o iniciador PCR para a esquerda foi: 5'- GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO:15). A reação PCR foi reali- zada usando um PCR genômico Advantage GC (Clonetech Laboratories, Paio Alto, CA) em tampão proporcionado pelo fabricante na presença de 200 μΜ de dNTPs, 200 pmol de cada iniciador, 50 ng de DNA template (padrão), 1,1 mM de acetato de Mg, 1,0 M GC-Melt e 1 unidade de Tth DNA Polyme- rase em um volume final de 50 μΙ. O perfil térmico do primeiro ciclo foi de 94°C durante 1 minuto; seguiram-se 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos e 68°C durante 2 minutos; e 1 ciclo a 68°C durante 3 minutos. Um produto PCR de 449 bp foi digerido com Apa\ e Kpn\ para liberar um fragmento 254 bp, o qual foi separado por eletroforese e purificado a partir do gel. Os três fragmentos (~3,8 Kb, ~0,4 Kb e 254 bp) foram ligados uns aos outros em uma ligação de 3 vias. A mistura de ligação foi transformada em células competentes de E. coli DH5a. DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inser- ção correto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo foi desi- gnado como pSE238. pSE238 foi digerido com EcoRI, foi clonado para pWHM3, que tinha sido digerido com EcoRI, e transformado em células de E. coli DH5cc. DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampi- ciíina e a presença do elemento de inserção correto foi confirmada por análi- se de restrição e análise de sequência de DNA. Este DNA de plasmídeo foi transformado em E. coli DM1, DNA de plasmídeo isolado a partir de trans- formantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção correto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo, que foi desi- gnado como pSE239, foi usado para transformar protoplastos da cepa de S.avermitilis SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton de SE180-11 foram isolados, a presença de resistência a eritromicina foi determinada, e os transformantes Tior Ermr foram analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. A presença do gene aveC com dupla mutação codificando S138T/A139F, foi capaz de restaurar uma normal pro- dução de avermectina para a cepa Se180:11; contudo, a razão B2:B1 foi de 0,75:1 revelando que esta mutação reduz ainda mais a quantidade de ciclo- hexil-B2 produzida em relação a ciclohexil-B1 (TABELA 3), superior às redu- ções proporcionadas por transformação da cepa SE180-11 com pSE188, pSE199, ou pSE231, tal como foi acima descrito.

Continuação Mutações adicionais foram construídas para reduzir ainda mais a quantidade de ciclohexil-B2 produzida em relação a cic!ohexil-B1 usando a técnica de rearranjo de DNA tal como foi descrito por Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; e Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; e descrita ainda nas Patentes U.S. N°s 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; e 5.837.458.

Plasmídeos com arrrastamento de DNA contendo genes aveC submetidos a mutação foram transformados em células competentes dam dem E. coli. DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resis- tentes à ampicilina, e foi usado para transformar protopiastos de S. avermitl· lis da cepa SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da cepa SE-180-11 foram isolados e rastreados quanto à produção de aver- mectinas com uma razão de ciclohexil-B2:ciclohexil B1 de 1:1 ou inferior. Foi determinada a seqüência de DNA de plasmídeo a partir de transformantes SE180-11 produzindo avermectinas com uma razão B2:B1 de 1:1 ou inferior.

Foram identificados oito transformantes que produziram quanti- dades reduzidas de ciclohexil-B2 em relação a ciclohexil-B1. A razão B2:B1 mais baixa conseguida entre estes transformantes foi de 0,40:1 (TABELA 4). O DNA de plasmídeo foi isolado para cada um dos oito transformantes e a seqüência de DNA foi determinada para identificar as mutações no gene avec. As mutações são como se segue. PSE290 contém 4 mutações de nucleotídeo em posição nt 317 de T a A, em posição nt 353 de C a A, em posição nt 438 de G a A, e em posição nt 1155 de T a A. A modificação do nucleotídeo em posição nt 317 modifica o aminoácido em AA posição 48 de D a E e a modificação do nu- cleotídeo em posição nt 438 modifica o aminoácido na posição 89 de AA de A a T. A razão B2:B1 produzida por células que transportam este plasmídeo foi de 0,42:1 (TABELA 4). PSE291 contém 4 mutações de nucleotídeos em posição nt 272 de G a A, em posição nt 585 de T a A, em posição nt 588 de G a A, e em posição nt 708 de G a A. A modificação do nucleotídeo em posição nt 585 modifica o aminoácido na posição 138 de AA de S a T, a modificação do nu- cleotídeo em posição nt 588 modifica o aminoácido na posição 139 de AA de A a T, e a modificação do nucleotídeo em posição nt 708 modifica o aminoá- cido na posição 170 de AA de G a S. A razão B2:B1 produzida por células transportando este plasmídeo foi de 0,57:1 (TABELA 4). PSE292 contém as mesmas quatro mutações de nucleotídeo que pSE290. A razão B2:B1 produzida por células transportando este plas- mídeo foi de 0,40:1 (TABELA 4). PSE293 contém 6 mutações de nucleotídeo em nt 24 de A a G, em posição nt 286 de A a C, em posição nt 497 de T a C, em posição nt 554 de C a T, em posição nt 580 de T a C, e em posição nt 886 de A a T. A mo- dificação de nucleotídeo em posição nt 286 modifica o aminoácido na posi- ção 38 de AA de Q a P, a modificação do nucleotídeo em posição nt 580 modifica o aminoácido na posição 136 de AA de L a P, e a modificação de nucleotídeo em posição nt 886 modifica o aminoácido na posição 238 de AA de E a D. A razão B2:B1 produzida por células transportando o plasmídeo foi de 0,68:1 (TABELA 4). PSE294 contém 6 mutações de nucleotídeo em nt 469 de T a C, em posição nt 585 de T a A, em posição nt 588 de G a A, em posição nt 708 de G a A, em posição nt 708 de G a A, em posição nt 833 de C a T, em po- sição nt 1184 de G a A. Além disso, nts em posições 173, 174, e 175 são deletadas. A modificação de nucleotídeo em posição nt 469 modifica o ami- noácido na posição 99 de AA de F a S, a modificação de nucleotídeo em posição nt 585 modifica o aminoácido na posição 138 de AA de S a T, a mo- dificação de nucleotídeo em posição nt 588 modifica o aminoácido na posi- ção 139 de AA de A a T, e a modificação de nucleotídeo em posição nt 708 modifica o aminoácido na posição 179 de AA de G a S. A razão B2:B1 pro- duzida por células transportando este plasmídeo foi de 0,53:1 {TABELA 4). PSE295 contém 2 mutações de nucleotídeos em nt 588 de G a A e em nt 856 de T a C. A modificação do nucleotídeo em posição nt 588 modifica o aminoácido na posição 139 de AA de A a T e a modificação do nucleotídeo em posição nt 856 modifica o aminoácido na posição 228 de AA de M a T. A razão B2:B1 produzida por células transportando este plasmídeo foi de 0,80;1 (TABELA 4). PSE296 contém 5 mutações de nucleotídeos em posição nt 155 de T a C, em posição nt 505 de G a T, em posição nt 1039 de C a T, em po- sição nt 1202 de C a T, e em posição nt 1210 de T a C. A modificação de nucleotídeo em posição nt 505 modifica o aminoácido na posição 111 de AA de G a V e a modificação do nucleotídeo em posição nt 1039 modifica o aminoácido na posição 289 de AA de P a L. A razão B2:B1 produzida por células transportando este plasmídeo foi de 0,73:1 (TABELA 4). PSE297 contém 4 mutações de nucleotídeo em posição nt 377 de G a T, em posição nt 588 de G a A, em posição nt 633 de A a G, e em posição nt 1067 de A a T. A modificação do nucleotídeo em posição nt 588 modifica o aminoácido na posição 139 de AA de A a T, a modificação do nu- cieotídeo em posição nt 633 modifica o aminoácido na posição 154 de AA de K a E, e a modificação do nucleotídeo em posição nt 1067 modifica o amino- ácido na posição 298 de AA de Q a Η. A razão B2:B1 produzida por células transportando este plasmídeo foi de 0,67:1 (TABELA 4).

Continuação Uma sucessão adicional de rearranjo de DNA foi conduzida para reduzir ainda mais a quantidade de avermectina ciclohexil-B2 produzida em relação a avermectina ciclohexil-B1 como se segue.

Rearranjo semi-sintético O melhor clone foi rearranjado usando o método descrito em PCT International Publication WO 97/20078 por Maxygen Inc. Oligonucleotí- deos individuais codificando substituições benéficas correspondendo melhor a uma razão B2:B1 diminuída foram adicionados à reação de rearranjo com um excesso moiar de 5 sobre os cordões template (padrão) aveC. Cada nu- cleotídeo mal combinado do oligonucleotídeo foi flanqueado por 20 nucleotí- deos de identidade perfeita para assegurar uma incorporação apropriada ao longo da reação de rearranjo. Os oligonucleotídeos foram adquiridos a partir de Operon Technologies (Alameda, CA).

Crescimento HTP de S. avermitilis Clones independentes foram colhidos a partir das placas de transformação e foram inoculados em 200 pl de meio R5 (Kieser, T., et ai, "Practical Streptomyces Genetics", 2000, Norwich, U.K., John Innes Founda- tion) em placas para semear com 96 cavidades e foram feitos crescera 30°C com agitação. A cada cavidade, foi fornecida uma pérola de vidro para dis- persão de mícélios e agitação da cultura.

Durante este período de tempo, as culturas atingiram um cres- cimento uniforme e denso. Após 4-5 dias, foram fornecidos às placas de produção 20 μΙ de meio de cultura para sementeira e o volume que perma- neceu foi congelado como placas dominantes a -80°C depois da adição de glicerol à concentração final de 20%. As placas de produção foram incuba- das a 30° sob humidade durante 12-14 dias. A esporulação das cepas ocor- reu após 5-8 dias de incubação. As placas de produção foram produzidas essencialmente tal como é descrito em PCT International Publication WO 99/41389 por Pfizer Inc., com a excepção de adição de 1% de agarose para assegurar uma superfície sólida.

Extração e rastreio de ESI-MS/MS

Um total de 1 ml de acetato de etila foi adicionado a cada cavi- dade e foi incubado com agitação à temperatura ambiente durante 20 minu- tos. Aproximadamente 750 pl do acetato de etilo-fase foram recuperados, transferidos para uma placa com 96 cavidades e regulados para evaporação durante a noite.O precipitado foi suspenso de novo em 100 pl de metanol 1 mM NaCI dos quais 5 pl de solução foram injetados em espectrometro de massa por um aparelho automático de amostras em um formato de 96 cavi- dades e analisado directamente na fase de injeção de fluxo sem cromato- grafia líquida ou outra separação. Os compostos foram ionizados por ioniza- ção por eletropulverização e dois canais separados foram monitorizados em duas transições MS/MS. A transição MS/MS para íon sodiado B1 varia entre m/z 921 e m/z 777 e para íon sodiado B2 varia entre m/z 939 e m/z 795 em modo positivo. Um espectrometro de massa Finnigan TSQ-7000, Micromass Quattro-LC e um aparelho automático para amostras Leap Technology Twin-Pal foram usados para este rastreio de elevada produtividade. Integra- ção dos cromatogramas separados B1 e B2 para cada localização de cavi- dade identificou os pontos mais elevados.

Foram identificadas cinqüenta e sete (57) novas combinações de substituições de aminoácido que podem produzir razões de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de 0,35:1 ou inferiores (Tabela 6). Várias destas novas mutações podem produzir razões de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de cerca de 0,30:1 ou inferiores; vários podem produzir ra- zões de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de cerca de 0,25:1 ou infe- riores, e várias podem produzir razões de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de cerca de 0,20:1 ou inferiores. Foram identificadas duas (2) novas mutações que produzem razões de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 de 0,37 ou 0,38.

DEPÓSITO DE MATERIAIS BIOLÓGICOS

Os plasmídeos que se seguem foram depositados com a Ameri- can Type Culture Collection (ATCC) aem12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, em 29 de Janeiro de 1998, e foram-lhes atribuídos os se- guintes números de acesso: O endereço corrente da American Type Culture Collection é 10801 University Blvd, Manassas, VA, 20110, USA.

Todas as patentes, pedidos de patentes, e publicações acima citados são aqui incorporados como referência na sua totalidade. A presente invenção não deverá ser limitada no seu âmbito pela modalidade específica aqui descrita, que pretende constituir uma simples ilustração de aspectos individuais da invenção, e métodos e componentes funcionalmente equivalentes situam-se no âmbito da invenção. Na verdade, várias modificações da invenção, para além das aqui apresentadas e des- critas tornar-se-ão aparentes para os versados na técnica a partir da descri- ção anterior e desenhos acompanhantes. Essas modificações pretendem situar-se no âmbito das reivindicações apensas.

Claims (6)

1. Molécula de polinucleotídeo, caracterizada pelo fato de que é representada pela SEQ ID NO:1 que codifica o produto do gene AveC de S. avermitilis cuja sequência apresenta mutações codificando uma combinação de substituições de aminoácidos correspondendo às posições de aminoácido de SEQ ID NO:2, selecionadas dentre os grupos consistindo em: (a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S; G) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L; (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (l) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L; (n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D; (p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L; (q) D48E, L136P, G179S, R250W; (r) D48E, A89T, S138T, Α139T, R163Q, G179S; (s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L; (t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (u) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S, E238D, F278L; (v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S; (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D; (z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S; (ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, Α139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, Κ154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D, (da) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, F278L, P289L; (db) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, P289L; (dc) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, I280V; (dd) D48E, A61T, R71L, W110L, T149S, G179S, V196A, L206M, E238D, V271A, I280V; (de) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, H279Q, P289L; (df) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, G287E, P289Q; (dg) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dh) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (di) Q38R, D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dj) D48E, A61T, L87V, A89T, W110L, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dk) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dl) D48E, A89T, L136P, Κ154E, G179S, S231L, E238D; (ea) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (eb) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, I280V; (ec) Q36P, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ed) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ee) V2M, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ef) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V, A302T; (eg) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, P289L; (eh) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, A302T; (ei) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ej) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D; (ek) V2M, D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (el) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, R162H, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (em) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, G179S,, S231L, E238D; (en) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, F176C, G179S, S231L, E238D, I280V; (eo) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, S90N, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (ep) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (eq) D48E, R71L, A89T, L136P, Κ154E, G179S, S231L, E238D; (er) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D; e (es) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D; em que moléculas com as ditas substituições quando expressas nas células de S. avermitilis da cepa ATCC 53692, que possuem o alelo aveC selvagem inativado, são capazes de produzir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,35:1 ou inferior.

2. Método para produzir uma cepa recombinante de Streptomyces avermitilis, caracterizado pelo fato de que compreende (i) mutação do alelo aveC em uma célula da cepa de S. avermitilis, cuja mutação dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC ou (ii) introdução em uma célula de uma cepa de S. avermitilis de um alelo AveC submetido à mutação codificando um produto do gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que em que células compreendendo o alelo AveC mutado são capazes de produzir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,35:1 ou inferior, e em que a combinação de substituições de aminoácido no produto do gene AveC compreende uma combinação selecionada dentre o grupo consistindo em: (a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S; (j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L; (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (l) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L; (n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D; (p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L; (q) D48E, L136P, G179S, R250W; (r) D48E, A89T, S138T, Α139T, R163Q, G179S; (s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L; (t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (u) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S, E238D, F278L; (v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S; (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D; (z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S; (ab) D84E, L136P, R163Q, G179S, S231L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, Α139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q63R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, Κ154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (da) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, F278L, P289L; (db) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, P289L; (dc) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, I280V; (dd) D48E, A61T, R71L, W110L, T149S, G179S, V196A, L206M, E238D, V271A, I280V; (de) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, H279Q, P289L; (df) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, G287E, P289Q; (dg) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dh) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (di) Q38R, D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dj) D48E, A61T, L87V, A89T, W110L, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dk) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dl) D48E, A89T, L136P, Κ154E, G179S, S231L, E238D; (ea) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (eb) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, I280V; (ec) Q36P, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ed) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ee) V2M, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ef) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V, A302T; (eg) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, P289L; (eh) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, A302T; (ei) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ej) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D; (ek) V2M, D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (el) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, R162H, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (em) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, G179S,, S231L, E238D; (en) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, F176C, G179S, S231L, E238D, I280V; (eo) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, S90N, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (ep) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (eq) D48E, R71L, A89T, L136P, Κ154E, G179S, S231L, E238D; (er) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D; e (es) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, F176C,

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a razão de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 é de cerca de 0,20:1 ou inferior em que a combinação de substituições de aminoácido no produto do gene AveC compreende um combinação selecionada dentre o grupo consistindo em: (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, Κ154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F.G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (da) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, F278L, P289L; (db) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, P289L; (dc) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, I280V; (dd) D48E, A61T, R71L, W110L, T149S, G179S, V196A, L206M, E238D, V271A, I280V; (de) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, H279Q, P289L; (df) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, G287E, P289Q; (dg) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dh) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (di) Q38R, D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dj) D48E, A61T, L87V, A89T, W110L, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dk) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dl) D48E, A89T, L136P, Κ154E, G179S, S231L, E238D; (ea) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (eb) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, I280V; (ec) Q36P, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ed) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ee) V2M, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ef) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V, A302T; (eg) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, P289L; (eh) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, A302T; (ei) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ej) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D; (ek) V2M, D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (el) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, R162H, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (em) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, G179S,, S231L, E238D; (en) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, F176C, G179S, S231L, E238D, I280V; (eo) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, S90N, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (ep) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (eq) D48E, R71L, A89T, L136P, Κ154E, G179S, S231L, E238D; (er) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D; e (es) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D.

4. Célula recombinante de uma espécie de Streptomyces, caracterizada pelo fato de que compreende um alelo aveC de S. avermitilis codificando um produto do gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que células compreendendo o alelo AveC mutado são capazes de produzir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 em uma razão de 0,35:1 ou inferior, e em que a combinação de substituições de aminoácido no produto do gene AveC compreende uma combinação selecionada dentre o grupo consistindo em: (a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S; (j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L; (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (l) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L; (n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D; (p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L; (q) D48E, L136P, G179S, R250W; (r) D48E, A89T, S138T, Α139T, R163Q, G179S; (s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L; (t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (u) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S, E238D, F278L; (v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S; (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D; (z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S; (ab) D84E, L136P, R163Q, G179S, S231L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, Α139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q63R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, Κ154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, Α139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (da) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, F278L, P289L; (db) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, P289L; (dc) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, I280V; (dd) D48E, A61T, R71L, W110L, T149S, G179S, V196A, L206M, E238D, V271A, I280V; (de) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, H279Q, P289L; (df) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, G287E, P289Q; (dg) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dh) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (di) Q38R, D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dj) D48E, A61T, L87V, A89T, W110L, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dk) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P289L; (dl) D48E, A89T, L136P, Κ154E, G179S, S231L, E238D; (ea) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (eb) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, I280V; (ec) Q36P, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ed) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ee) V2M, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ef) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V, A302T; (eg) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, P289L; (eh) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, A302T; (ei) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ej) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D; (ek) V2M, D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (el) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, R162H, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (em) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, G179S, S231L, E238D; (en) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, F176C, G179S, S231L, E238D, I280V; (eo) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, S90N, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (ep) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (eq) D48E, R71L, A89T, L136P, Κ154E, G179S, S231L, E238D; (er) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D; e (es) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D.

5. Célula de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é uma célula de Streptomyces avermitilis.

6. Composição de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 produzida por células de Streptomyces avermitilis como definidas na reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes em um meio de cultura em que as células tenham sido cultivadas, em que a razão de avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 presentes no meio de cultura é de 0,35:1 ou inferior.