CN1630712A - 指导b2∶b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因 - Google Patents

指导b2∶b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因 Download PDF

Info

Publication number
CN1630712A
CN1630712A CNA038037416A CN03803741A CN1630712A CN 1630712 A CN1630712 A CN 1630712A CN A038037416 A CNA038037416 A CN A038037416A CN 03803741 A CN03803741 A CN 03803741A CN 1630712 A CN1630712 A CN 1630712A
Authority
CN
China
Prior art keywords
avec
avermectin
cyclohexyl
deinsectization streptomycete
sudden change
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA038037416A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1630712B (zh
Inventor
金·J·施图茨曼-恩格沃尔
克莱斯·E·D·古斯塔夫森
安克·克雷伯
森·A·雷拉德
杰里米·S·明舒尔
塞兰·金
陈燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zoetis Services LLC
Original Assignee
Pfizer Products Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Products Inc filed Critical Pfizer Products Inc
Publication of CN1630712A publication Critical patent/CN1630712A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1630712B publication Critical patent/CN1630712B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及含有编码AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，该多核苷酸分子可被用于改变除虫链霉菌发酵培养物中所产生的除虫菌素2类∶1类的比例或量。本发明进一步涉及除虫链霉菌的载体、宿主细胞和突变菌株，其中AveC基因已失活或突变以改变所产生的除虫菌素2类∶1类的比例或量。

Description

指导B2∶B1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因
                      1. 发明领域
本发明涉及主要应用于动物健康领域的除虫菌素(avermectin)，例如doramectin，的组合物及有效产生除虫菌素的方法。更具体地，本发明涉及含有编码AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其可用于调节除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)培养物发酵所产生的除虫菌素2类∶1类的比例。本发明还涉及除虫链霉菌的载体，转化的宿主细胞，和新型突变株，它们的aveC基因已突变从而调节所产生的除虫菌素2类∶1类的比例。
                      2. 发明背景
                     2.1. 除虫菌素
链霉菌可产生各种各样的次级代谢产物，其中包括除虫菌素，其含有一系列八种相关的能产生有效的抗蠕虫和杀昆虫活性的大环内脂类化合物，有16个成员。这八种截然不同但又密切相关的化合物主要指：A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a及B2b。“a”系列化合物指的是天然除虫菌素，其在C25位的取代基为(S)-仲丁基，“b”系列化合物指的是C25位的取代基为异丙基的那些化合物。代号“A”及“B”指的是C5位取代基分别为甲氧基和羟基的除虫菌素。数字“1”指的是在C22位及C23位为双键的除虫菌素；而数字“2”为C22位有一个氢原子及在C23位有一个羟基的除虫菌素。在这些相关的除虫菌素中，B1型的除虫菌素(如doramectin)被公认为具有最有效的抗寄生虫活性和杀虫活性，因而也是最具商业前景的除虫菌素。
除虫菌素及其由除虫链霉菌菌株需氧发酵而生产的方法在美国专利4,310,519及4,429,042中都已有描述。一般认为天然除虫菌素的生物合成可以通过异丁酸及S-(+)-2-甲基丁酸的辅酶A硫酯类似物来内源启动。
经过随机诱变进行菌株改进并联合使用外源提供的脂肪酸可以有效生产除虫菌素类似物。支链2-氧酸脱氢酶缺陷的除虫链霉菌突变体(bkd缺陷突变体)只有在发酵中补充有脂肪酸时才能产生除虫菌素。筛选和分离支链脱氢酶活性缺陷的突变体(如除虫链霉菌，ATCC 53567)在欧洲专利(EP)276103中已有描述。在有外源提供脂肪酸的情况下发酵这些突变体，导致仅产生四种对应于所用的脂肪酸的除虫菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸补充除虫链霉菌(ATCC 53567)发酵，结果产生天然除虫菌素A1a，A2a，B1a及B2a；用异丁酸补充发酵，结果产生天然除虫菌素A1b，A2b，B1b及B2b；而用环戊烷羧酸补充发酵，结果产生四种新型的环戊基除虫菌素A1，A2，B1及B2。
用其它脂肪酸补充发酵可以产生新的除虫菌素。通过筛选800多种潜在的前体，已经鉴定出60多种其它新的除虫菌素(例见Dutton等，1991，J.Antibiot.，44：357-365；和Banks等，1994，Roy.Soc.Chem.147：16-26)。此外，5-O-甲基转移酶活性缺陷的除虫链霉菌突变体基本上只产生B类除虫菌素，因而，同时缺少支链2-氧酸脱氢酶及5-O-甲基转移酶活性的除虫链霉菌突变体对应于补充发酵所用的脂肪酸仅生产出B类除虫菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸补充这类双重突变体发酵，结果仅产生天然除虫菌素B1a及B2a，而用异丁酸或环戊烷羧酸补充发酵则可以分别产生天然除虫菌素B1b及B2b或新型环戊基B1及B2除虫菌素。用环己烷羧酸补充该双重突变体菌株是产生商业上重要的新型除虫菌素环己基除虫菌素B1(doramectin)的优选方法。这类双重突变体如除虫链霉菌(ATCC 53692)的分离及特性描述在EP 276103中。
              2.2. 参与除虫菌素生物合成的基因
在很多情况下，涉及次级代谢产物生产的基因及编码一种具体抗菌素的基因在染色体上的位置常常是簇集在一起的。例如，链霉菌聚酮化合物合成酶基因簇(PKS)(见Hopwood和Sherman，1990，Ann.Rev.Genet.，24：37-66)。因此，对生物合成途径中的基因进行克隆的一个策略是，分离抗药性基因及然后检测染色体上相邻区域中其它与该具体抗生素的生物合成相关的基因。另外一种克隆重要代谢产物生物合成之相关基因的策略是突变体互补。例如，将来自能产生具体代谢产物的生物的DNA文库部分引入不产生该代谢产物的突变体，并筛选产生该代谢产物的转化株。另外，利用来自其它链霉菌的探针进行文库杂交的方法已被用于鉴别及克隆生物合成途径中的基因。
涉及除虫菌素生物合成的基因(ave基因)，象链霉菌其它次级代谢物(例如，PKS)的生物合成所必需的基因一样，是簇集于染色体上的。目前已使用载体成功克隆了许多ave基因来弥补除虫菌素生物合成受阻的除虫链霉菌突变体。这些基因的克隆在美国专利5,252,474中已有描述。此外，Ikeda等，1995，J. Antibiot. 48：532-534描述了涉及C22，C23脱水步骤的染色体区域(aveC)定位在除虫链霉菌的4.82Kb BamHI片段上，并描述了产生单一组份B2a生产者的aveC基因突变。由于双氢除虫菌素(ivermectin，一种潜在的抗蠕虫化合物)能由除虫菌素B2a化学合成，故认为该除虫菌素B2a的单一组分生产者对于双氢除虫菌素的商业生产特别有用。
2001年6月19日授予Stutzman-Engwall等的美国专利6,248,579，描述了除虫链霉菌aveC基因的一些突变，它们导致环己基B2∶环己基B1的比例减少到约0.75∶1。
2001年2月22日公开的辉瑞产品公司(Pfizer Products Inc.)的PCT申请WO 01/12821，描述了除虫链霉菌aveC基因的另一些突变，它们导致环己基B2∶环己基B1的比例减少到约0.40∶1。
鉴定出aveC基因中导致进一步减小除虫菌素生产的复杂度的突变或突变组合，例如，进一步降低除虫菌素B2∶B1比率的突变，可以简化商业上重要的除虫菌素的生产及纯化。
                      3. 发明简述
本发明提供了一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，与质粒pSE186(ATCC 209604)上编码除虫链霉菌AveC基因产物的序列相同的核苷酸序列，或与图1(SEQ ID NO：1)所示除虫链霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其简并变体，但所述核苷酸序列还包含编码氨基酸取代组合的突变，所述取代发生在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置的氨基酸残基上，使除虫链霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC等位基因、且表达含有突变核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞，相对于仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌ATCC 53692细胞而言，产生的除虫菌素2类∶1类的比例下降，其中当除虫菌素2类∶1类为环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，除虫菌素2类∶1类的比例为0.35∶1或更低。在一优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.30∶1或更低。在一更优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.25∶1或更低。在一更优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.20∶1或更低。
在一个具体实施方案中，氨基酸取代组合包含选自下组的组合：
(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；
(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；
(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；
(f)D48E，L136P，G179S，E238D；
(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；
(h)D48E，A61T，L136P，G179S；
(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；
(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；
(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；
(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；
(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；
(q)D48E，L136P，G179S，R250W；
(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；
(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；
(t)D48E，F78L，A89T，L136P，G179S；
(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F278L；
(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；
(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；
(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；
(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ad)D48E，A61T，A89T，F99S，S138T，A139T，G179S，E238D；
(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；
(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；
(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；
(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；
(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；
(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F234S；
(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(an)D48E，A89T，S138T，G179S；
(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；
(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；
(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；
(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；
(au)D48E，A89T，L136P，G179S；
(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；
(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；
(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；
(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；
(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；
(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；
(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；
(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和
(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。
本发明还提供了一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，与质粒pSE186(ATCC 209604)上编码除虫链霉菌AveC基因产物的序列相同的核苷酸序列，或与图1(SEQ ID NO：1)所示除虫链霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其简并变体，但所述核苷酸序列还包含编码氨基酸取代组合的突变，所述取代发生在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置的氨基酸残基上，导致除虫链霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC等位基因、且表达含有突变核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞，相对于仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌ATCC 53692细胞而言，产生的除虫菌素2类∶1类的比例下降，其中当除虫菌素2类∶1类为环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，除虫菌素2类∶1类的比例约为0.40∶1或更低，且其中氨基酸取代组合包含选自下组的组合：
(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和
(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
本发明还提供了含有本发明多核苷酸分子的重组载体。
本发明还提供了含有本发明的多核苷酸分子或重组载体的宿主细胞。在一优选实施方案中，所述宿主细胞是链霉菌细胞。在一个更优选的实施方案中，所述宿主细胞是除虫链霉菌细胞。
本发明还提供了一种制备除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞的aveC等位基因发生突变，该突变导致AveC基因产物中出现氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有氨基酸取代组合的AveC基因产物，其中所述氨基酸取代组合选自上文中列出的(a)-(be)。
本发明还提供了一种制备除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞的aveC等位基因发生突变，该突变导致在AveC基因产物中的氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有氨基酸取代组合的AveC基因产物，其中含有突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞能产生0.35∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
在一个优选实施方案中，所述环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.30∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(f)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
在一个更优选实施方案中，所述环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.25∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(w)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
在一个更优选实施方案中，所述环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.20∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
本发明还提供了一种制备除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞的aveC等位基因发生突变，该突变导致在AveC基因产物中的氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有氨基酸取代组合的AveC基因产物，其中所述氨基酸取代组合选自上文(bf)和(bg)所列的组。在一个优选实施方案中，含有这样的突变aveC等位基因或其简并变体的除虫链霉菌细胞能产生约0.40∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素。
本发明还提供了链霉菌的细胞，它包含突变的除虫链霉菌aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一优选实施方案中，所述链霉菌是除虫链霉菌。
本发明还提供了能产生0.35∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的除虫链霉菌细胞。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
在一个优选实施方案中，所述环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.30∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(f)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
在一个更优选实施方案中，所述环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.25∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(w)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
在一个更优选实施方案中，所述环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.20∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
本发明还提供了链霉菌的细胞，它包含突变的除虫链霉菌aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。在一优选实施方案中，所述链霉菌是除虫链霉菌。在一个更优选实施方案中，所述细胞是能产生约0.40∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的除虫链霉菌细胞。
本发明还提供了产生除虫菌素的方法，包括在允许或诱导产生除虫菌素的条件下，在培养基中培养本发明除虫链霉菌菌株的细胞，并从培养中回收所述除虫菌素。
本发明还提供了由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的组合物，包括已经培养了细胞的培养基中的环己基B2∶环己基B1除虫菌素，其中所述培养基中环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例为0.35∶1或更低，优选约0.30∶1或更低，更优选约0.25∶1或更低，更优选约0.20∶1或更低。在一个具体实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的组合物由表达突变的aveC等位基因或其简并变体的除虫链霉菌菌株的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的基因产物导致由所述细胞产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的2类∶1类比例，相对于不表达突变的aveC等位基因、仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株的细胞而言，比例减少。
在一个优选实施方案中，当所述组合物为0.35∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
在一个更优选实施方案中，当所述组合物为约0.30∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(f)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
在一个更优选实施方案中，当所述组合物为约0.25∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(w)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
在一个更优选实施方案中，当所述组合物为约0.20∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
本发明还提供了由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的组合物，其包括已经培养了细胞的培养基中的环己基B2∶环己基B1除虫菌素，其中所述培养基中环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.40∶1或更低，本发明还提供了由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的组合物，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自上文(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合的AveC基因产物。
                     4. 附图说明
图1.含有除虫链霉菌aveC ORF的DNA序列(SEQ ID NO：1)及其公认的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图2.含有除虫链霉菌aveC基因完整的ORF的质粒载体pSE186(ATCC209604)。
图3.含有插入除虫链霉菌aveC ORF中的红色糖多孢菌(Sacc.Erythraea)ermE基因的基因取代载体pSE180(ATCC 209605)。
图4.除虫链霉菌的除虫菌素聚酮化合物合成酶基因簇的BamHI限制性酶切图谱，以及鉴定的五种重叠的粘粒克隆(即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，PSE69)。还指示了pSE118与pSE119的关系。
图5.除虫链霉菌菌株的发酵产物的HPLC分析。通过与环己基B1的标准量比较来进行峰定量。环己基B2的滞留时间是7.4-7.7分钟，环己基B1的滞留时间是11.9-12.3分钟。图5A.携带失活的aveC ORF的除虫链霉菌SE180-11菌株。图5B.用pSEI86(ATCC 209604)转化的除虫链霉菌SE180-11菌株。图5C.用pSE187转化的除虫链霉菌SE180-11菌株。图5D.用pSE188转化的除虫链霉菌SE180-11菌株。
图6A-M.汇编列表，显示由第二轮“基因改组”鉴定的aveC等位基因突变所编码的氨基酸取代组合，以及它们对环己基B2∶环己基B1生产比例的影响。对于每一种质粒而言，在题为“突变”的栏中，上面一格列出了氨基酸取代，下面一格列出了导致这些氨基酸取代的核苷酸碱基改变。括号中的核苷酸碱基改变为沉默改变，即它们不改变氨基酸序列。
                     5. 发明详述
本发明涉及鉴定及表征具有编码除虫链霉菌AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，构建可用于筛选突变的AveC基因产物对除虫菌素生产的影响的除虫链霉菌新菌株，并发现一些突变的AveC基因产物可以降低除虫链霉菌产生的除虫菌素B2∶B1的比例。例如，本发明下文中描述了一种多核苷酸分子，它具有与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同的核苷酸序列，或图1(SEQ ID NO：1)的ORF的核苷酸序列，下文中还描述了具有由上述序列衍生的突变核苷酸序列的多核苷酸分子及其简并变体。但本发明所述原理可以类似地应用于其它多核苷酸分子，包括来自其它链霉菌例如吸水链霉菌(S.hygroscopeicus)及灰产色链霉菌(S.griseochromogenes)等的aveC同源基因。
        5.1. 编码除虫链霉菌AveC基因产物的多核苷酸分子
本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，其含有除虫链霉菌的完整aveC ORF或其实质性部分，该分离的多核苷酸分子缺少处于除虫链霉菌染色体中aveC ORF所处位置下游的下一个完整ORF。
本发明所述分离的多核苷酸分子优选包括与质粒pSE186(ATCC209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同，或与图1(SEQ IDNO：1)的ORF的核苷酸序列或其实质性部分相同的核苷酸序列。本文中，含有编码除虫链霉菌AveC基因产物的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子的“实质性部分”指的是一种分离的多核苷酸分子，其至少包括图1(SEQ ID NO：1)所示完整aveC ORF序列的约70％，并且编码功能等效AveC基因产物。这里，“功能等效”的AveC基因产物被定义为一种基因产物，当其在失活了天然aveC等位基因的除虫链霉菌菌株ATCC 53692中表达时，导致与仅表达除虫链霉菌菌株ATCC 53692的天然野生型功能性aveC等位基因的除虫链霉菌菌株ATCC 53692相比，产生基本上相同的比例和量的除虫菌素。
除了aveC ORF的核苷酸序列外，本发明所述分离的多核苷酸分子可以进一步包括天然侧翼于除虫链霉菌原位aveC基因的核苷酸序列，例如图1(SEQ ID NO：1)所示的侧翼核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸分子，其基于已知的遗传密码简并性包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其简并变体。
本文中，术语“多核苷酸分子”，“多核苷酸序列”，“编码序列”，“开放阅读框”及“ORF”都是指DNA分子和RNA分子，其可以是单链或双链，当置于适当调控元件的控制之下时，在适当宿主细胞表达系统中可以被转录并翻译(DNA)或被翻译(RNA)成AveC基因产物，或者，被翻译成与AveC基因产物同源的多肽。编码序列包括但不限于原核序列，cDNA序列，基因组DNA序列，及化学合成的DNA和RNA序列。
图1(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列在bp位置42，174，177及180包含四个不同的GTG密码子。如美国专利6,248,579所示，可构建aveCORF(图1；SEQ ID NO：1)5′区域的多重缺失，以便帮助确定这些密码子中的哪些能在aveC ORF中用作蛋白质表达的起始位点。使bp 42位的第一个GTG位点缺失并不能消除AveC活性。进一步使bp位置174，177及180的所有GTG密码子都缺失消除了AveC活性，这表明该区域对于蛋白质表达是必须的。本发明因此包括具有不同长度的aveC ORF。
本发明还提供了一种多核苷酸分子，其包含与质粒pSE186(ATCC209604)的除虫链霉菌aveC基因产物编码序列同源，或与图1(SEQ IDNO：1)所示aveC ORF的核苷酸序列或其实质性部分同源的核苷酸序列。术语“同源”当用于指与除虫链霉菌AveC基因产物编码序列同源的多核苷酸分子时，指具有以下核苷酸序列的多核苷酸分子：(a)与质粒pSE186(ATCC 209604)上除虫链霉菌AveC基因产物编码序列编码相同的AveC基因产物，或与图1(SEQ ID NO：1)所示aveC ORF的核苷酸序列编码相同的AveC基因产物，但在所述核苷酸序列中含有一或多个基于遗传密码简并性的沉默改变(即简并变体)；或(b)在中度严紧条件下与下述多核苷酸分子的互补序列杂交，并编码上述功能等效AveC基因产物，其中所述多核苷酸分子含有编码由质粒pSE186(ATCC 209604)上AveC基因产物编码序列所编码的氨基酸序列，或编码图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述中度严紧条件也即在65℃，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中与结合于滤膜上的DNA杂交，及在42℃，在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(例见Ausubel等(编)，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley& Sons，Inc.，New York，p.2.10.3)。在优选的实施方案中，同源多核苷酸分子在高度严紧条件下与质粒pSE186(ATCC 209604)中编码AveC基因产物的核苷酸序列的互补序列杂交，或与图1(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列或其实质性部分的互补序列杂交，并编码上述功能等效AveC基因产物，其中所述高度严紧条件是指，在65℃，0.5M NaHPO4，7％SDS，1mMEDTA中与结合于滤膜上的DNA杂交，及在68℃，在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，见上文)。
AveC基因产物及其潜在的功能等效物的活性，可以通过对发酵产物进行HPLC分析来测定，见下文实施例。含有编码除虫链霉菌aveC基因产物之功能等效物的核苷酸序列的多核苷酸分子，包括天然存在于除虫链霉菌其它菌株的aveC基因，存在于链霉菌其它种的aveC同源基因，及突变的aveC等位基因，不管是天然的还是人工合成的。
本发明还提供了一种多核苷酸分子，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列编码的氨基酸序列同源，或与图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列或其实质性部分同源的氨基酸序列。本文中，图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的“实质性部分”是指一种多肽，它包括图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的至少约70％，并且组成了上述功能等效AveC基因产物。
本文用来描述与除虫链霉菌AveC基因产物之氨基酸序列同源的氨基酸序列时，术语“同源”指一种多肽，它含有图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列、但其中一或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守取代，其中所述氨基酸序列与质粒pSE186(ATCC 209604)上AveC基因产物编码序列编码的多肽、或与图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列相比，具有按照任何标准氨基酸序列同一性算法如BLASTP算法(GENBANK，NCBI)所确定的至少约70％，更优选至少约80％，最优选至少约90％的氨基酸序列同一性，其中所述保守氨基酸取代产生了功能等效的基因产物，如上述定义。保守氨基酸取代是本领域众所周知的。进行这类取代的规则参见Dayhof，M.D.，1978，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.，Vol.5，Sup.3等。更具体地，保守氨基酸取代是通常在一族具有相关酸性或极性的氨基酸家族中发生的那些。基因编码的氨基酸一般分为四组：(1)酸性＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；及(4)不带电的极性＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸也可以归类为芳香氨基酸。在任何具体组中的一或多个取代通常对于该多肽的功能没有显著影响，例如，亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸取代，或天冬氨酸被谷氨酸取代，或苏氨酸被丝氨酸取代，或任何其它氨基酸残基被结构相关的氨基酸残基(例如，具有相似的酸性或极性，或具有相似性的一些结合的氨基酸残基)取代。
本文公开的多核苷酸分子的生产和操作是本领域技术范围内的，可以按照下述重组技术进行操作，例如，Maniatis等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY；Ausubel等，1989， Current Protocols In Molecular Biology，GreenePublishing Associates & Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Innis等(编)，1995， PCR Strategies，Academic Press，Inc.，San Diego；Erlich(编)，1992， PCR Technology，Oxford University Press，New York(列入本文作为参考)。编码AveC基因产物或AveC同源基因产物的多核苷酸克隆可以通过本领域已知的任何方法进行鉴别，包括但不限于下文第7节所列举的方法。通过使用如Benton和Davis，1977，Science，196：180中所述的筛选噬菌体文库的方法和Grunstein及Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72：3961-3965所述的筛选质粒文库的方法，可以从基因组DNA文库中筛选aveC及aveC同系物编码序列。具有已知包括aveC ORF核苷酸序列的多核苷酸分子，例如存在于质粒pSE186(ATCC209604)，或质粒pSE119中的那些(见下文第7节)，可以用作这些筛选实验的探针。或者，可以根据纯化的AveC同源基因产物的部分或全部氨基酸序列所推出的核苷酸序列，来合成对应的寡核苷酸探针。
                5.2. 重组系统
                5.2.1. 克隆与表达载体
本发明还提供了重组克隆载体与表达载体，其可用于克隆或表达本发明含有，例如除虫链霉菌aveC ORF或任一aveC同系物ORF的多核苷酸分子。在一非限制性实施方案中，本发明提供了质粒pSE186(ATCC209604)，其含有除虫链霉菌aveC基因的完整ORF。
所有下面有关除虫链霉菌aveC ORF，或含有除虫链霉菌aveC ORF或其部分的多核苷酸分子，或除虫链霉菌AveC基因产物的描述，也是指如下所述的突变的aveC等位基因，除非明确指明或根据上下文可以看出。
已研制出具体用于链霉菌的多种不同载体，包括噬菌体，高拷贝数质粒，低拷贝数质粒，及大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒等，其中任一个都可以用来实践本发明。另外还从链霉菌中克隆了大量药物抗性基因，其中一些基因被掺入载体作为选择性标记。在链霉菌中使用这些载体的例子可参见，如Hutchinson，1980，Applied Biochem.Biotech，16：169～190。
本发明的重组载体，尤其是表达载体，优选被构建为，使得本发明多核苷酸分子的编码序列与转录或翻译编码序列所必需的一或多个调控元件可操作相连，以便产生多肽。本文所用术语“调控元件”包括但不限于这样的核苷酸序列，其编码诱导型和非诱导型启动子，增强子，操纵子，及本领域已知用于驱动和/或调控多核苷酸编码序列的表达的其它元件。此外，如本文所用，编码序列与一或多个调控元件“可操作相连”，其中这些调控元件有效调节并允许转录编码序列和/或翻译其mRNA。
典型的质粒载体经过改造可以包含本发明的多核苷酸分子，这些载体包括pCR-Blunt，pCR2.1(Invitrogen)，pGEM3Zf(Promega)，和穿梭载体pWHM3(Vara等，1989，J.Bact.，171：5872-5881)等。
构建含有具体编码序列并使其与适当调控元件可操作相连的重组载体的方法是本领域众所周知的，可使用这些方法实践本发明。这些方法包括体外重组技术，合成技术，和体内基因重组。例见Maniatis等，1989，文献同上；Ausubel等，1989，文献同上；Sambrook等，1989，文献同上；Innis等，1995，文献同上；及Erlich，1992，文献同上中描述的技术。
这些载体的调控元件在强度和特异性方面可以不同。根据所用的宿主/载体系统，可使用多种适当的转录及翻译元件中的任一种。对于细菌来说，转录调控区或启动子的非限制性例子包括，β-gal启动子，T7启动子，TAC启动子，λ左及右启动子，trp及lac启动子，trp-lac融合启动子，具体对于链霉菌来说，启动子有ermE，melC，及tipA等。在一个具体实施方案中，制备了一种表达载体，其含有已被克隆在与强组成型启动子相邻的位置上的aveC ORF或其突变的ORF，所述启动子如红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的ermE。按照美国专利6,248,579所述，将含有ermE启动子的载体转化到除虫链霉菌中，随后对发酵产物进行的HPLC分析显示，所产生的除虫菌素的滴度相对于仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的产量有所增加。
融合蛋白表达载体可用于表达AveC基因产物-融合蛋白。纯化的融合蛋白可用于产生抗AveC基因产物的抗血清，研究AveC基因产物的生化特性，改造具有不同生化活性的AveC融合蛋白，或辅助鉴定或纯化所表达的AveC基因产物。可能的融合蛋白表达载体包括但不局限于这样的载体，其中掺入了编码β-半乳糖苷酶的序列及trpE融合子，麦芽糖结合蛋白融合子，谷胱甘肽-S-转移酶融合子和多组氨酸融合子(运载区域)。在另一实施方案中，AveC基因产物或其部分可与来源于链霉菌其它种或菌株(例如吸水链霉菌或灰产色链霉菌)的AveC同源基因产物或其部分融合。将这种杂合载体转化至除虫链霉菌细胞中，并检测其效应，例如对所产生的除虫菌素2类∶1类之比例的影响。
AveC融合蛋白经过改造可以含有对纯化有用的区域。例如，AveC-麦芽糖结合蛋白融合可以用直链淀粉树脂纯化；AveC-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白可以用谷胱甘肽-琼脂糖珠纯化；AveC-多组氨酸融合可以用二价镍树脂纯化。或者，可以用抗载体蛋白或肽的抗体进行融合蛋白的亲和纯化。例如，可以将编码单克隆抗体靶表位的核苷酸序列插入表达载体的适当位置处，使其与调控元件可操作相连并使所表达的表位与AveC多肽融合。例如，可通过标准技术将编码FLAGTM表位标记(InternationalBiotechnologies Inc.)(其为亲水性标记肽)的核苷酸序列插入表达载体中，使其插入位置对应于，例如，AveC多肽羧基末端。所表达的AveC多肽-FLAGTM表位融合产物然后可以利用商购的抗-FLAGTM抗体来进行检测及亲和纯化。
编码AveC融合蛋白的表达载体也可以经过改造而含有编码特异性蛋白酶裂解位点的多接头序列，以使表达的AveC多肽在用特异性蛋白酶处理后可以与运载区域或融合配对物脱离。例如，所述融合蛋白载体可以包括编码凝血酶或Xa因子酶切位点等的DNA序列。
位于aveC ORF上游且与其在同一框内的信号序列，可以利用已知方法插入表达载体中，以便指导所表达的基因产物的运输和分泌。信号序列的非限制性例子包括得自α因子，免疫球蛋白，外膜蛋白，青霉素酶和T细胞受体等的信号序列。
为了帮助选择经过本发明克隆载体或表达载体转化或转染的宿主细胞，可以对所述载体进行改造，以使其进一步包括编码报道基因产物或其它选择标记的序列。优选所述编码序列与上述调控元件编码序列可操作相连。对本发明有用的报道基因是本领域已知的，包括那些编码绿色荧光蛋白，萤光素酶，xylE以及酪氨酸酶等的报道基因。编码选择标记的核苷酸序列是本领域已知的，包括编码赋予抗生素抗性或抗代谢物抗性的基因产物的那些，或提供营养缺陷型需求的那些。这类序列的实例包括编码抗红霉素，硫链丝菌肽(thiostrepton)或卡那霉素等的抗性的那些。
                  5.2.2 宿主细胞的转化
本发明进一步提供含有本发明多核苷酸分子或重组载体的经转化的宿主细胞，或由其衍生的新菌株或细胞系。可用于本发明实践中的宿主细胞优选为链霉菌细胞，但也可以用其它原核细胞或真核细胞。这类经转化的宿主细胞一般包括但不局限于微生物，例如经重组噬菌体DNA、质粒DNA、或粘粒DNA载体转化的细菌，或经重组载体转化的酵母，等等。
本发明的多核苷酸分子欲在链霉菌细胞中发挥作用，但也可以被转化至其它细菌或真核细胞中以便实现例如克隆或表达目的。一般使用大肠杆菌菌株，如DH5α菌株，它可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA(保藏号31343)，或可商购(Stratagene)。优选的真核宿主细胞包括酵母细胞，也可以有效利用哺乳动物细胞或昆虫细胞。
本发明的重组表达载体优选被引入(例如，经转化或转染)基本上均一培养的一或多个宿主细胞中。表达载体通常利用已知技术引入宿主细胞，所述技术如原生质体转化，磷酸钙沉淀，氯化钙处理，显微注射，电穿孔，通过与重组病毒接触来进行转染，脂质体介导转染，DEAE-葡聚糖转染，转导，接合，或微粒轰击(microprojectile bombardment)。转化子可以用标准方法来选择，例如，选择那些表达了与重组载体相关的选择标记(如抗生素抗性)的细胞，如上述。
一旦将表达载体引入宿主细胞，aveC编码序列已整合并维持在宿主染色体上或为游离体形式的事实，可以用标准技术如Southern杂交分析、限制酶分析、PCR(包括逆转录酶PCR(rt-PCR))分析来证实，或通过用免疫学试验检测预期基因产物来证实。含有和/或表达重组aveC编码序列的宿主细胞，可以通过本领域公知的至少四种常规方法中的任一种来证实，所述方法包括：(i)DNA-DNA，DNA-RNA，或RNA-反义RNA杂交；(ii)检测标记基因功能的存在；(iii)通过测定宿主细胞中aveC特异性mRNA转录物的表达来评估转录水平，及(iv)通过免疫分析或AveC生物活性的存在(例如，具体比例和量的除虫菌素的产生表示在，例如，除虫链霉菌宿主细胞中存在AveC活性)来测定成熟多肽产物的存在。
             5.2.3. 重组AveC基因产物的表达及鉴定
一旦将天然的或突变的aveC编码序列稳定引入合适的宿主细胞，可以使经过转化的宿主细胞无性繁殖，所得的细胞可以在有助于天然的或突变的AveC基因产物最大量生产的条件下进行培养。所述条件通常包括培养细胞直至高密度。当表达载体含有诱导型启动子时，可以根据诱导表达的需要采用合适的诱导条件，例如，温度变化，使营养耗尽，添加义务诱导物(例如，碳水化合物的类似物，如异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG))，积累过量的代谢副产物等。
当表达的AveC基因产物保留在宿主细胞内部时，收集细胞并裂解，在本领域已知使蛋白质降解最小化的提取条件下，例如，在4℃和/或有蛋白酶抑制剂存在的条件下，从裂解物中分离并纯化产物。当表达的AveC基因产物从宿主细胞中分泌时，只需收集耗尽的营养培养基并从中分离产物。
表达的AveC基因产物，可利用标准方法从相应的细胞裂解物或培养基中分离或基本上纯化，所述方法包括但不局限于下列方法的任何组合：硫酸铵沉淀，大小分级分离，离子交换层析，HPLC，密度离心及亲和层析。当表达的AveC基因产物表现出生物活性时，可使用适当试验在纯化步骤的每一步监控所述制剂不断提高的纯度。不管表达的AveC基因产物是否表现出生物活性，都可以依据其大小或与AveC特异性抗体的反应性来检测，或在融合标记的存在下检测。如本文所用，AveC基因产物当在具体制剂中占蛋白重量比的约20％以上时为“基本上纯化”。同样，如本文所用，AveC基因产物当在具体制剂中占蛋白重量比的至少约80％时是“分离的”。
本发明因此提供分离的或基本上纯化的重组表达型除虫链霉菌AveC基因产物，其含有可以被质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列所编码的氨基酸序列，或图1(SEQ ID NO：2)所示的氨基酸序列或其实质性部分，本发明还提供所述基因产物的突变体和简并变体。
本发明还提供了生产AveC基因产物的方法，包括在有助于产生重组AveC基因产物的条件下，培养经重组表达载体转化的宿主细胞，并从细胞培养物中回收AveC基因产物，其中所述载体含有一种多核苷酸分子，该多核苷酸分子具有编码AveC基因产物的核苷酸序列并与一或多个控制该多核苷酸分子在宿主细胞中的表达的调控元件可操作相连。
重组表达的除虫链霉菌AveC基因产物可用于多种目的，包括筛选可以改变AveC基因产物功能并因此调节除虫菌素生物合成的化合物，以及产生抗AveC基因产物的抗体。
一旦获得纯度足够高的AveC基因产物，就可以用标准方法进行鉴定，所述方法如SDS-PAGE，大小排阻层析，氨基酸序列分析，在除虫菌素生物合成途径中产生合适产物的生物活性等等。例如，可以使用标准的肽测序技术测定AveC基因产物的氨基酸序列。可以用亲水性分析(例见Hopp和Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：3824)或类似的软件运算法来鉴定AveC基因产物的亲水区及疏水区，籍此进一步鉴定AveC基因产物。可进行结构分析以鉴定AveC基因产物中具有特殊二级结构的区域，例如可使用诸如X-射线结晶学等生物物理法(Engstrom，1974，Biochem.Exp.Biol.11：7-13)，计算机建模(Fletterick及Zoller(编)，1986，Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)，和核磁共振(NMR)来作图并研究AveC基因产物与其底物之间相互作用的位点。从这些研究所取得的信息可用于选择aveC ORF中的新突变位点，以帮助开发具有更合适的除虫菌素生产特性的除虫链霉菌新菌株。
             5.3. aveC突变体的构建及应用
本发明的一个主要目的是鉴定除虫链霉菌aveC等位基因中导致B2∶B1除虫菌素的比例改变(最优选减少)的新突变。本发明因此提供了可用于产生除虫链霉菌新菌株的细胞的一种多核苷酸分子，所述细胞与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，除虫菌素生产出现可以检测到的改变。在一个优选实施方案中，所述多核苷酸分子可以用于产生除虫链霉菌新菌株的细胞，这种细胞与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，产生具有较低的2类∶1类比例的除虫菌素。所述菌株的细胞还可以包含其它突变，以便与仅表达单个野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，产生更多量的除虫菌素。
aveC等位基因或编码序列的突变包括下述的任何突变，其在AveC基因产物中引入一或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，或导致AveC基因产物截短，或它们的任何组合，且产生所需结果。所述突变的aveC等位基因序列还包括它们的任何简并变体。例如，本发明提供以下多核苷酸分子，其包含aveC等位基因的核苷酸序列或其简并变体，或包含质粒pSE186(ATCC 209604)上的AveC基因产物编码序列或其简并变体，或图1(SEQID NO：1)所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列或其简并变体，但其进一步含有突变，所述突变编码AveC基因产物选定位点的氨基酸取代的组合。在一个非限制性实施方案中，这类取代发生在AveC基因产物中对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置25，28，35，36，38，40，41，48，55，61，78，84，89，90，99，107，108，111，120，123，136，138，139，141，154，159，163，179，192，196，198，200，202，220，228，229，230，231，234，238，239，250，252，266，275，278，289或298的一或多个氨基酸位置上。优选将要取代的氨基酸位置的组合包含D48，A61，A89，L136，S138，A139，R163，G179，V196，A198，E238和P289中的一或多个。特别优选的氨基酸取代组合包含在D48和G179的取代，更优选D48E和G179S。导致环己基B2∶环己基B1比例下降的氨基酸取代组合的具体实例列在图6A-J中。
本发明因此提供了一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，与质粒pSE186(ATCC 209604)上编码除虫链霉菌AveC基因产物的序列相同的核苷酸序列，或与图1(SEQ ID NO：1)所示除虫链霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其简并变体，但所述核苷酸序列还包含编码氨基酸取代组合的突变，所述取代发生在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置的氨基酸残基上，使除虫链霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC等位基因、且表达含有上述突变核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞，相对于仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌ATCC 53692细胞而言，产生的除虫菌素2类∶1类的比例下降，其中当除虫菌素2类∶1类为环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，除虫菌素2类∶1类的比例为0.35∶1或更低。在一优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.30∶1或更低。在一更优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.25∶1或更低。在一优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.20∶1或更低。
在一个具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(a)组的组合：D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE538(见图6)。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(b)组的组合：G40S，D48E，L136P，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE559。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(c)组的组合：D48E，L136P，R163Q，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE567。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(d)组的组合：D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE572。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(e)组的组合：D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE571。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(f)组的组合：D48E，L136P，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE501和pSE546。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(g)组的组合：D48E，A61T，L136P，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE510。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(h)组的组合：D48E，A61T，L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE512。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(i)组的组合：D48E，A89T，S138T，A139T，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE519。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(j)组的组合：D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE526。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(k)组的组合：D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE528。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(l)组的组合：D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE530。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(m)组的组合：D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE531。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(n)组的组合：D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE534。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(o)组的组合：Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE535。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(p)组的组合：D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE542。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(q)组的组合：D48E，L136P，G179S，R250W。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE545。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(r)组的组合：D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE548。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(s)组的组合：D48E，L136P，G179S，A198G，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE552。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(t)组的组合：D48E，F78L，A89T，L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE557。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(u)组的组合：D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F278L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE564和pSE565。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(v)组的组合：D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE568。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(w)组的组合：D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE543。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(x)组的组合：D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE504。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(y)组的组合：D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE508。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(z)组的组合：D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE511。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(aa)组的组合：D48E，A89T，S138T，A139T，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE520。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ab)组的组合：D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE523。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ac)组的组合：D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE527。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ad)组的组合：D48E，A61T，A89T，F99S，S138T，A139T，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE539。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ae)组的组合：G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE540。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(af)组的组合：D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE547。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ag)组的组合：D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE550。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ah)组的组合：S41G，D48E，A89T，L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE558。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ai)组的组合：D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE563。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(aj)组的组合：D48E，A89T，L136P，G179S，F234S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE566。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ak)组的组合：D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE573和pSE578。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(al)组的组合：Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE574。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(am)组的组合：D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE575和pSE576。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(an)组的组合：D48E，A89T，S138T，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE577。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ao)组的组合：D48E，A89T，L136P，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE502和pSE524。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ap)组的组合：D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE503。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(aq)组的组合：D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE505。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ar)组的组合：D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE506。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(as)组的组合：D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE507。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(at)组的组合：D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE509。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(au)组的组合：D48E，A89T，L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE514和pSE525。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(av)组的组合：D48E，A89T，V120A，L136P，G179S。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE515。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(aw)组的组合：D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE517。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ax)组的组合：D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE518。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ay)组的组合：D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE529和pSE554。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(az)组的组合：D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE532。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(ba)组的组合：D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE536。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(bb)组的组合：D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE537。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(bc)组的组合：D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE541。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(bd)组的组合：D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE549和pSE553。
在另一具体实施方案中，所述氨基酸取代组合包含(be)组的组合：D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。编码这些氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE551。
本发明还提供了一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，与质粒pSE186(ATCC 209604)上编码除虫链霉菌AveC基因产物的序列相同的核苷酸序列，或与图1(SEQ ID NO：1)所示除虫链霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其简并变体，但所述核苷酸序列还包含编码氨基酸取代组合的突变，所述取代发生在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置的氨基酸残基上，导致除虫链霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC等位基因、且表达含有上述突变核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞，相对于仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌ATCC 53692细胞而言，产生的除虫菌素2类∶1类的比例下降，其中当除虫菌素2类∶1类为环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，除虫菌素2类∶1类的比例约为0.40∶1或更低，且其中氨基酸取代组合包含选自下组的组合：
(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和
(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
编码(bf)组氨基酸取代的质粒的非限制性实例是pSE556和pSE569。编码(bg)组氨基酸取代的质粒的一个非限制性实例是pSE561。
本发明涉及，上述任一种氨基酸取代可以通过对aveC等位基因的核苷酸序列或其简并变体进行任何能导致所述取代的修饰来实现。例如，通过将天然密码子序列或其简并变体改换为编码相同氨基酸取代的数个可选密码子中任一种，有可能实现本文所述的大多数氨基酸取代。本领域技术人员基于本文所述以及已知的遗传密码子简并性，可以轻易而明显地确定编码上述氨基酸取代的各种可能序列。在上文所列的每一种具体组合的一个非限制性实施方案中，氨基酸取代通过图6所示非沉默核苷酸改变来实现。
本文中，“氨基酸取代组合包含以下组合...”等等是指，本发明AveC基因产物中的氨基酸取代至少包括具体列出的那些取代，而且可以包括其它氨基酸取代，或氨基酸缺失，或氨基酸添加，或它们的一些组合，其中所得AveC基因产物在除虫链霉菌细胞中的表达导致B2∶B1除虫菌素的比例按照预期的下降。
aveC等位基因或其简并变体的突变可通过多种已知方法的任一种来实施，包括使用易错PCR，或通过盒式诱变。例如，可以使用寡核苷酸定向诱变以一种限定的方式改变aveC等位基因或ORF的序列，如在aveC等位基因或ORF中的具体区域引入一或多个限制性位点或一个终止密码子。正如美国专利5,605,793、5,830,721、5,837,458所述，也可使用涉及随机片断化、诱变的反复循环、以及核苷酸改组的方法，来产生具有编码aveC突变的核苷酸序列的多核苷酸大文库。
靶向突变是有效的，尤其当它们改变AveC基因产物中的一或多个保守氨基酸残基时更是如此。例如，将除虫链霉菌AveC基因产物的公认氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与来自灰产色链霉菌(SEQ ID NO：5)及吸水链霉菌(SEQ ID NO：4)的AveC同源基因产物的公认氨基酸序列(美国专利6,248,579)相比较，显示了这些物种之间显著保守的氨基酸残基位点。导致一或多个所述保守氨基酸残基改变的靶向诱变对于产生可以显示所需的除虫菌素产量改变的新突变株是非常有效的。
随机诱变也是有效的，可以通过将除虫链霉菌细胞暴露于紫外线或X-射线照射，或暴露于化学诱变剂如N-甲基-N′-亚硝基胍，甲烷磺酸乙酯，亚硝酸或氮芥等，来进行诱变。有关诱变技术的综述可参见Ausubel，1989，文献同上。
一旦产生突变的多核苷酸分子，可通过筛选确定它们是否可调节除虫链霉菌中的除虫菌素生物合成。在优选的实施方案中，具有突变的核苷酸序列的多核苷酸分子，可以通过弥补(complementing)除虫链霉菌菌株来检测，所述菌株是aveC基因已失活从而给出aveC阴性(aveC-)背景的菌株。在一个非限制性方法中，突变的多核苷酸分子被剪接到表达质粒中，与一或多个调控元件可操作相连，该质粒优选还包括一或多个药物抗性基因，以便允许对经转化的细胞进行选择。使用已知技术将该载体转化至aveC-宿主细胞，选择经转化的细胞，并在允许或诱导除虫菌素产生的条件下在合适的发酵培养基中进行培养，所述条件例如，在培养基中包括合适的起始亚基，以及在本领域已知的最适合除虫菌素生产的条件下培养。然后通过HPLC分析发酵产物，以测定突变的多核苷酸分子弥补宿主细胞的能力。数种携有能降低除虫菌素B2∶B1比例的突变多核苷酸分子的载体，包括pSE188，pSE199，pSE231，pSE239，以及pSE290至pSE297都在下面8.3章节举例说明。这类质粒载体的其它实例见图6。
本发明上述任一种方法可以用发酵培养基进行，优选在培养基中添加环己烷羧酸，但也可以使用其它合适的脂肪酸前体，例如，表1所列的任一种脂肪酸前体，或甲硫乳酸(methylthiolactic acid)。
一旦鉴定出按所需方向调节除虫菌素生产的突变的多核苷酸分子，就可以确定核苷酸序列上发生突变的位置。例如，具有编码突变AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子可以通过PCR分离，并用已知方法对其进行DNA序列分析。通过比较突变型和野生型aveC等位基因的DNA序列，可以确定负责改变除虫菌素生产的突变。例如，除虫链霉菌AveC基因产物在第55位(S55F)，第138位(S138T)，第139位(A139T)或第230位(G230D)中任一处含有单个氨基酸取代，或在第138位(S138T)和第139位(A139T或A139F)含有双重取代时，导致AveC基因产物的功能发生改变，使所产生的除虫菌素2类∶1类的比例改变(参见下文第8章节)，其中所述氨基酸位置对应于图1(SEQ ID NO：2)中所示。此外，以下7种突变组合分别显示能有效降低除虫菌素的2类∶1类之比：(1)D48E/A89T；(2)S138T/A139T/G179S；(3)Q38P/L136P/E238D；(4)F99S/S138T/A139T/G179S；(5)A139T/M228T；(6)G111V/P289L；(7)A139T/K154E/Q298H。本发明包括显示能降低除虫菌素环己基B2∶环己基B1之比例的另外59种突变组合，它们表示在图6中并引述在权利要求中。
本文中，上述表达方式(如A139T)是指，用单字母表示的起始氨基酸残基(本例中为丙氨酸A)，在指定位置(本例中为SEQ ID NO：2所示多肽的第139位)，被替换起始氨基酸残基的氨基酸残基(本例中为苏氨酸T)取代。
本文中，当由除虫链霉菌染色体中，或者本发明载体或分离的多核苷酸分子中的aveC等位基因所编码的氨基酸残基被描述为“对应于”SEQ IDNO：2的具体氨基酸残基，或者当氨基酸取代被描述为发生在“对应于”SEQ ID NO：2中具体编号的氨基酸残基的具体位置上，这时是表示处在AveC基因产物相同位置上的氨基酸残基，本领域技术人员可以参看本文SEQ ID NO：2所示氨基酸序列很快确定该残基。
本文中，当编码具体突变的aveC等位基因中的具体突变被描述为aveC等位基因中“对应于”SEQ ID NO：1所示具体核苷酸位置的具体核苷酸位置上发生的碱基改变，或者当aveC等位基因中的核苷酸位置被描述为“对应于”SEQ ID NO：1中的具体核苷酸位置，这时是指aveC核苷酸序列或其简并变体中同样相关位置上的核苷酸，本领域技术人员参照本文SEQ IDNO：1所示核苷酸序列能快速确定该核苷酸。
本文中描述除虫菌素环己基B2∶环己基B1的比例时所用的术语“约”是指，具体指明的数值加或减该数值的10％。
本发明的多核苷酸分子可以是“分离的”，这意味着：(i)它已经经过纯化，因此基本上不含具有不同核苷酸序列的其它多核苷酸分子；或(ii)它处在并非天然的环境中，例如来自除虫链霉菌的aveC等位基因或其突变形式处在并非除虫链霉菌细胞的另一种细胞中；或(iii)它表现为并非天然的一种形式，例如更短的DNA片段，如消化细菌染色体所得的限制性片段，它们主要含有aveC编码区或其突变形式，可以含或不含其任何辅助调控序列，或者是随后被整合到异源DNA片段中，如(除了除虫链霉菌细胞以外的)细菌细胞的染色体中，或者诸如质粒或噬菌体等载体的DNA中，或者被整合到除虫链霉菌染色体上并非天然aveC等位基因所处的位置。
本发明还提供了包含本发明多核苷酸分子的重组载体。所述重组载体可用于将任何含有本发明的突变核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除虫链霉菌染色体上的aveC等位基因位点，以通过例如同源重组来插入或取代aveCORF或其部分。然而，按照本发明，此处提供的含有本发明的突变核苷酸序列的多核苷酸分子也可以在插入到除虫链霉菌染色体上除aveC等位基因以外的其它位点时，或在作为除虫链霉菌细胞中的游离体形式维持时，发挥调节除虫菌素生物合成的功能。因此，本发明还提供了包含多核苷酸分子的载体，所述多核苷酸含有本发明所述突变的核苷酸序列，所述载体可用于将所述多核苷酸分子插入到除虫链霉菌染色体上除aveC基因位点以外的位置，或以游离体的形式维持。
在非限制性实施方案中，所述载体是下述基因取代载体，其可以用于将本发明所述突变的aveC等位基因或其简并变体插入除虫链霉菌菌株的细胞中，籍此产生新的除虫链霉菌菌株，所述菌株的细胞与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，产生的除虫菌素2类∶1类的比例下降。这类基因取代载体可以用本文提供的表达载体(例如以下第8章节中所例举的那些表达载体)中的突变多核苷酸分子来构建。
本发明还提供了一种载体，其可用于将突变的aveC等位基因或其简并变体插入除虫链霉菌菌株的细胞中，以便产生新菌株的细胞，所述新细胞与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，除虫菌素的产量有所改变。在优选的实施方案中，所述新细胞产生的除虫菌素的量增加。在具体的非限制性实施方案中，该载体包含本领域已知的强启动子，例如，来自红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的强组成型ermE启动子，使其位于ave ORF上游并与该aveC ORF可操作相连。所述载体可以使用质粒pSE189中的突变的aveC等位基因，按照美国专利6,248,579中所述的方法来构建。
本发明提供了基因取代载体，其可用于灭活野生型除虫链霉菌菌株中的aveC基因。在非限制性实施方案中，所述基因取代载体可以用质粒pSE180(ATCC 209605)中存在的突变的多核苷酸分子来构建，该质粒在下文第8.1章节描述(图3)。本发明还提供了含有多核苷酸分子的基因取代载体，所述多核苷酸分子包含天然侧翼于除虫链霉菌染色体上原位aveC基因的核苷酸序列或由该序列组成，包括，例如那些如图1(SEQ ID NO：1)所示的侧翼核苷酸序列，所述载体可用于使除虫链霉菌aveC ORF缺失。
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸分子或重组载体。所述宿主细胞可以是任何能作为所述多核苷酸分子或重组载体的宿主的原核或真核细胞。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞。在一个更优选实施方案中，所述宿主细胞是链霉菌属的细胞。在一个更优选实施方案中，所述宿主细胞是除虫链霉菌的细胞。
本发明还提供了产生除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的aveC等位基因突变，导致在AveC基因产物中出现氨基酸取代组合，或(ii)将突变的aveC等位基因或其简并变体引入除虫链霉菌菌株的细胞中，所述基因或变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。
本发明还提供了产生除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的aveC等位基因突变，导致在AveC基因产物中出现氨基酸取代组合，或(ii)将突变的aveC等位基因或其简并变体引入除虫链霉菌菌株的细胞中，所述基因或变体编码的AveC基因产物包含氨基酸取代组合，所述含有突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞能以0.35∶1或更低的比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在一个优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.30∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在一个更优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.25∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在一个更优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.20∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合。
本发明还提供了产生除虫链霉菌新菌株的方法，包括(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的aveC等位基因突变，导致在AveC基因产物中出现氨基酸取代组合，或(ii)将突变的aveC等位基因或其简并变体引入除虫链霉菌菌株的细胞中，所述基因或变体编码的AveC基因产物包含选自(bf)和(bg)的氨基酸取代组合。在一优选实施方案中，含有所述突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞能以约0.40∶1或更低的比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素。
按照上述步骤使aveC等位基因突变，或引入突变的aveC等位基因或其简并变体之后，可以产生新的除虫链霉菌菌株。
本发明还提供了包含突变的aveC等位基因或其简并变体的链霉菌属细胞，所述基因或变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。在一个优选实施方案中，链霉菌属的物种是除虫链霉菌。
本发明还提供了能以0.35∶1或更低比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素的除虫链霉菌细胞。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在一个优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.30∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在一个更优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.25∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在一个更优选实施方案中，环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约为0.20∶1或更低。在一个非限制性实施方案中，所述细胞包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合。
本发明还提供了链霉菌属物种的细胞，其包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文所列(bf)和(bg)的氨基酸取代组合。在一优选实施方案中，所述链霉菌属物种是除虫链霉菌。在一个更优选实施方案中，所述细胞是能以约0.40∶1或更低的比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素的除虫链霉菌细胞。
上述任一种突变都可以出现在本发明细胞中的染色体外元件(如质粒)上，但优选所述突变出现在整合到除虫链霉菌染色体中的aveC编码序列中，优选，但并非必需，位于天然aveC等位基因的位置。
所述新菌株的细胞可以用于大量产生具有商业价值的除虫菌素如doramectin。
本发明还提供了产生除虫菌素的方法，包括在培养基中，用允许或诱导本发明的除虫链霉菌细胞产生除虫菌素的条件下，培养所述细胞，并从培养物中回收所述除虫菌素。在一个优选实施方案中，该方法中所用的细胞以0.35∶1或更低的比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素，更优选所述比例为约0.30∶1或更低，更优选所述比例为约0.25∶1或更低，更优选所述比例为约0.20∶1或更低。
在一个优选实施方案中，以0.35∶1或更低比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素的细胞，包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在另一个优选实施方案中，以约0.30∶1或更低比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素的细胞，包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在另一个优选实施方案中，以约0.25∶1或更低比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素的细胞，包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在另一个优选实施方案中，以约0.20∶1或更低比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素的细胞，包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在另一个优选实施方案中，所述细胞以约0.40∶1或更低比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素，且包含突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合。
本发明的方法使具有商业价值的除虫菌素如doramectin的生产效力提高。
本发明还提供了由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的组合物，其在培养所述细胞的培养基中包含环己基B2∶环己基B1除虫菌素，该培养基中环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例为0.35∶1或更低，优选约0.30∶1或更低，更优选约0.25∶1或更低，优选约0.20∶1或更低。在一个具体实施方案中，所述的环己基B2∶环己基B1除虫菌素组合物由表达突变的aveC等位基因或其简并变体的除虫链霉菌菌株的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的基因产物，导致所述细胞与不表达突变的aveC等位基因而是仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株的细胞相比，产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例下降。
在一个优选实施方案中，当所述组合物是0.35∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在另一个优选实施方案中，当所述组合物是约0.30∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在另一个优选实施方案中，当所述组合物是约0.25∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代组合。
在另一个优选实施方案中，当所述组合物是约0.20∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述组合物由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代组合。
本发明还提供了由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的组合物，其在培养所述细胞的培养基中包含环己基B2∶环己基B1除虫菌素，该培养基中环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例约0.40∶1或更低，且是由包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞产生，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码的AveC基因产物包含选自上文中(bf)和(bg)所列的氨基酸取代组合。
优选所述除虫菌素新组合物出现在培养过细胞的培养基中，例如，在部分或完全耗尽的发酵培养液中，另外也可以用已知的生物化学纯化技术，如硫酸铵沉淀，透析，大小分级分离，离子交换层析，HPLC等，将除虫菌素组合物从培养液中部分纯化或实质上纯化出来。
除了如上所述产生除虫链霉菌新菌株，使其包含能产生比例降低的环己基B2∶环己基B1的细胞，本发明还涉及将其它突变引入除虫链霉菌细胞中，以便进一步改进除虫菌素生产的特性。在一个非限制性实施方案中，本发明的细胞还包含一些修饰，以便提高除虫菌素的生产水平。在一个实施方案中，所述细胞可以如下制备：(i)使除虫链霉菌细胞中的aveC等位基因突变，或(ii)将突变的aveC等位基因或其简并变体引入除虫链霉菌菌株的细胞中，其中所述突变的等位基因的表达导致，表达该突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株的细胞，与仅表达单个野生型aveC等位基因的相同菌株的细胞相比，除虫菌素的产量增加，然后选出经转化的细胞，其与仅表达单个野生型aveC等位基因的菌株的细胞相比，除虫菌素的产量增加。例如，可以对aveC等位基因进行修饰，使其包含强启动子，如红色糖多孢菌的强组成型ermE启动子，使其位于ave ORF上游并与该aveC ORF可操作相连。在另一实施方案中，可以将一或多个突变引入除虫链霉菌的aveR1和/或aveR2基因中，从而增加除虫菌素的生产水平，如2001年3月6日授予Stutzman-Engwall的美国专利6,197,5591所述。
                5.4. 除虫菌素的用途
除虫菌素是可具体作为治蠕虫剂、杀体外寄生虫剂、杀虫剂及杀螨剂来使用的高效抗寄生虫药剂。按本发明方法产生的除虫菌素化合物均可用于这些用途。例如，按本发明方法产生的除虫菌素化合物可用于治疗人类的各种疾病或症状，尤其是本领域已知由寄生虫感染造成的那些疾病。参见Ikeda and Omura，1997，Chem.Rev.97(7)：2591-2609。更具体地，按本发明方法产生的除虫菌素化合物可有效治疗由内寄生虫所致的各种疾病，所述内寄生虫如能感染人，家养动物，猪，绵羊，家禽，马或牛的寄生性线虫。
更具体地，按本发明方法产生的除虫菌素化合物可有效抵抗感染人体的线虫以及感染各种动物的线虫。这类线虫包括胃肠道寄生虫如钩虫(Ancylostoma)，线虫(Necator)，蛔虫(Ascaris)，类圆线虫(Strongyloides)，旋毛虫(Trichinella)，毛细线虫(Capillaria)，鞭虫(Trichuris)，蛲虫(Enterobius)，恶丝虫(Dirofilaria)，及在血管或其它组织或器官中发现的寄生虫如丝虫性蠕虫以及类园线虫和旋毛虫的肠道提取物。
按本发明方法产生的除虫菌素化合物也可用于治疗体外寄生虫感染，包括节肢动物对哺乳动物或鸟类的感染，如能感染马和牛的蜱(tick)、螨、虱、蚤、绿头苍蝇、咬虫(biting insect)、或移栖双翅目幼虫等引起的感染。
按本发明方法产生的除虫菌素化合物也可作为杀虫剂用于对抗室内害虫(household pest)如蟑螂、衣蛾、地毯甲虫、及家蝇等，以及侵害储存的谷物和农作物的有害昆虫，包括红蜘蛛(spider mite)、蚜虫、毛虫、和直翅目幼虫如蝗虫(locust)等。
用按本发明方法产生的除虫菌素化合物能治疗的动物包括绵羊、牛、马、鹿、山羊、猪、鸟类包括家禽、狗和猫。
按本发明方法产生的除虫菌素化合物可根据具体用途、接受治疗的宿主动物的具体种类、所涉及的寄生虫或昆虫等情况以相应剂型给药。当作为杀寄生虫剂使用时，按本发明方法产生的除虫菌素化合物可以以胶囊、丸剂、片剂、或灌服液的剂型口服，或以倾注(pour-on)、注射或植入的形式给药。这类制剂可以按标准兽医学实践以传统方式制备。因此，可将活性成分与精确分配的适当稀释剂或载体混合来制备胶囊、丸剂或片剂，所述稀释剂或载体另外含有崩解剂和/或粘合剂如淀粉、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁等。灌服剂是将活性成分与分散剂或润湿剂等一起分散在水溶液中来制备。注射剂可配制成无菌溶液，其中可含其它物质如足够的盐和/或葡萄糖以便使该溶液相对于血液为等渗状态。
这些配制剂中活性化合物的重量可根据患者、或所治疗的宿主动物种类、感染的严重性及类型、宿主的体重等而变化。通常，口服给药的一剂为约0.001-10mg活性化合物/kg患者或动物的体重，单次给药或在1-5天内分次给药。但有时可由医生或兽医根据临床症状确定较高或较低的剂量。
或者，按本发明方法产生的除虫菌素化合物也可以与动物饲料一起给药，为此，可制备浓缩的食物添加剂或预混剂以便与常规动物饲料混合。
当作为杀虫剂使用，及用于处理农业害虫时，按本发明方法产生的除虫菌素化合物也可以按标准农业实践以喷雾剂，粉剂，乳剂和类似形式来使用。
             6. 实施例：除虫链霉菌的发酵
                  及除虫菌素B2∶B1的分析
如果发酵培养基中不补充脂肪酸，则既缺失支链2-氧酸脱氢酶又缺失5-0-甲基转移酶活性的菌株将不产生除虫菌素。该实施例证实这类突变株在有不同脂肪酸的条件下启动生物合成时，可获得很宽范围的除虫菌素B2∶B1比例。
                     6.1. 材料及方法
除虫链霉菌ATCC 53692储存在-70℃的全肉汤接种培养基中，培养基的组成为：淀粉(Nadex，Laing National)-20g；Pharmamedia(Trader′sProtein，Memphis，TN)-15g；Ardamine pH(Yeast Products Inc.)-5g；碳酸钙-1g。终体积用自来水调整为1升，pH调整至7.2，培养基在121℃高压灭菌25分钟。
取2ml上述制剂的解冻后悬浮液接种到一个含有50ml同样培养基的烧瓶中。以180rpm在旋转振荡器上28℃培养48小时后，取2ml肉汤接种到一个含有50ml生产培养基的烧瓶中，该培养基含有：淀粉-80g；碳酸钙-7g；Pharmamedia-5g；磷酸氢二钾-1g；硫酸镁-1g；谷氨酸-0.6g；七水合硫酸亚铁-0.01g；硫酸锌-0.001g；硫酸亚镁-0.001g。终体积用自来水调整为1升，pH调整至7.2，培养基在121℃高压灭菌25分钟。
将不同的羧酸底物(见表1)溶于甲醇中并在接种24小时后添加到发酵液中使终浓度为0.2g/l。将该发酵液于28℃培养14天，然后离心(2,500rpm，2分钟)，去除上清。菌丝沉淀用丙酮(15ml)，然后用二氯甲烷(30ml)提取，分离有机相，过滤，然后蒸发使之干燥。残余物用1ml甲醇吸收，并用配有扫描二极管阵列检测器的Hewlett-Packard 1090A液相色谱在240nm进行HPLC分析，所用柱子是保持在40℃的Beckman Ultrasphere C-18，5μm，4.6mm×25cm柱。将25μl上述甲醇溶液注入该柱子中。以0.85/ml min的流速，用甲醇-水从80∶20到95∶5的线性梯度洗脱40分钟。用环己基B1的两种标准浓度校准检测器的反应，测量除虫菌素B2及B1的曲线以下面积。
                     6.2. 结果
除虫菌素B2和B1的HPLC滞留时间，及2∶1比例如表1所示。
                         表1
 HPLC滞留时间(分钟)     比例
底物     B2     B1     B2∶B1
4-四氢吡喃羧酸     8.1     14.5     0.25
异丁酸     10.8     18.9     0.5
3-糠酸     7.6     14.6     0.62
S-(+)-2-甲基丁酸     12.8     21.6     1.0
环己烷羧酸     16.9     26.0     1.6
3-噻吩羧酸     8.8     16.0     1.8
环戊烷羧酸     14.2     23.0     2.0
3-三氟甲基丁酸     10.9     18.8     3.9
2-甲基戊酸     14.5     24.9     4.2
环庚烷羧酸     18.6     29.0     15.0
表1所列数据证实B2∶B1除虫菌素的产生比有相当宽的范围，其表明根据所提供的脂肪酸侧链起始物单元的性质，2类化合物相对于1类化合物的脱水转化结果有很大的差异。这指示由AveC蛋白的改变所致B2∶B1比例的改变只特异性针对具体底物。因此，对用具体底物获得的B2∶B1比例发生变化的突变体进行筛选时需要该底物的存在。下面这些例子描述了使用环己烷羧酸作为筛选底物。然而，该底物仅用于举例说明本发明潜在的实用性，而不是有意要限制本发明。
               7. 实施例：分离aveC基因
本实施例描述了除虫链霉菌染色体中编码AveC基因产物的区域的分离及鉴定，如下文所证实，aveC基因经鉴定能改变所产生的环己基B2对环己基B1除虫菌素的比例(B2∶B1)。
                      7.1. 材料与方法
               7.1.1. 使链霉菌生长以便分离DNA
下面的方法用于培养链霉菌。除虫链霉菌ATCC 31272株单菌落(单菌落分离物#2)在1/2强度的YPD-6中分离，YPD-6含有：Difco酵母提取物-5g；Difco细菌用胨-5g；葡萄糖-2.5g；MOPS-5g；Difco细菌用琼脂-15g，终体积用dH2O调整至1升，pH调整至7.0，培养基在121℃高压灭菌25分钟。
将上述培养基中生长的菌丝体接种到25mm×150mm试管中的10mlTSB培养基(Difco Tryptic Soy Broth-30g，在1升dH2O中，在121℃高压灭菌25分钟)中，在28℃以300rpm振荡培养48-72小时。
               7.1.2. 从链霉菌中分离染色体DNA
将如上所述生长的菌丝体取等份试样(0.25ml或0.5ml)置于一个1.5ml的微量离心试管中，将细胞在12,000×g离心60秒而浓缩。去除上清液，使细胞重新悬浮于0.25ml TSE缓冲液(20ml 1.5M蔗糖，2.5ml 1M Tris-HCl，pH8.0，2.5ml 1M EDTA，pH8.0，和75ml dH2O)中，该缓冲液含有2mg/ml溶菌酶。样品在37℃振荡培养20分钟，上样至AutoGen 540TM自动核酸分离仪(Integrated Separation Systems，Natick，MA)，用Cycle 159(仪器软件)按照操作手册分离基因组DNA。
或者，将5ml菌丝体置于一个17mm×100mm的试管中，3,000rpm离心5分钟使细胞浓缩，去除上清液。将细胞重新悬浮在1ml TSE缓冲液中，3,000rpm离心5分钟使细胞浓缩，去除上清液。将细胞重新悬浮在含有2mg/ml溶菌酶的1ml TSE缓冲液中，37℃振荡培养30-60分钟。培养后，加入0.5ml 10％十二烷基硫酸钠(SDS)，将细胞在37℃保温，直到裂解完成。裂解产物在60℃保温10分钟，冷却至室温，分到两个1.5mlEppendorf试管中，并用0.5ml苯酚/氯仿(50％苯酚，预先用0.5M Tris平衡，pH8.0；50％氯仿)萃取1次。去除水相，用氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取2到5次。通过加入1/10体积3M醋酸钠，pH4.8沉降DNA，在冰中保温混合物10分钟，在15,000rpm，5℃将混合物离心10分钟，将上清液移至干净试管中，并在其中加入1倍体积的异丙醇。然后将上清液与异丙醇一起在冰中保温20分钟，在15,000rpm 5℃将混合物离心20分钟，将上清液移除，用70％乙醇洗涤DNA粒状沉淀物1次。在粒状沉淀物干燥后，将DNA再悬浮于TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)中。
                7.1.3. 从链霉菌中分离质粒DNA
将一份菌丝体(1.0ml)置于一个1.5ml的微量离心试管中，12,000xg离心60秒浓缩细胞。去除上清液，细胞再悬浮于1.0ml 10.3％蔗糖中，12,000xg离心浓缩60秒，去除上清液。然后将细胞重新悬浮于含有2mg/ml溶菌酶的0.25ml TSE缓冲液中，37℃振荡保温20分钟，然后上样至AutoGen 540TM自动核酸分离仪中。按照操作手册，使用Cycle 106(仪器软件)分离质粒DNA。
或者，将1.5ml的菌丝体置于1.5ml微型离心试管中，12,000xg离心60秒浓缩细胞。去除上清液，细胞再悬浮于1.0ml 10.3％蔗糖中，12,000xg离心浓缩60秒，去除上清液。细胞重新悬浮于含有2mg/ml溶菌酶的0.5ml TSE缓冲液中，37℃保温15-30分钟。保温后，加入0.25ml碱性SDS(0.3N NaOH，2％SDS)，55℃保温15-30分钟或直到溶液变清。将醋酸钠(0.1ml，3M，pH4.8)加入到DNA溶液中，将其在冰中保温10分钟。DNA样品在5℃14,000rpm离心10分钟。将上清液移至干净试管中，并在其中加入0.2ml的苯酚/氯仿(50％苯酚∶50％氯仿)并轻轻混和。DNA溶液在5℃以14,000rpm离心10分钟，上清液移至干净的Eppendorf试管中。加入异丙醇0.75ml，将溶液轻轻混和，然后在室温下保温20分钟。将该DNA溶液在5℃以14,000rpm离心15分钟，移除上清液，用70％乙醇洗涤DNA沉淀颗粒，干燥，再在TE缓冲液中重新悬浮。
           7.1.4. 从大肠杆菌中分离质粒DNA
将单个大肠杆菌转化菌落在5ml Luria-Bertani(LB)培养基(细菌用胨-10g，细菌用酵母提取物-5g，和NaCl-10g在1升dH2O中，pH7.0，121℃高压灭菌25分钟，并添加100μg/ml氨苄青霉素)中保温。将培养物过夜培养，将1μm等分试样置于1.5ml微型离心试管中，将培养样品载至AutoGen 540TM自动核酸分离器中，按照操作手册，使用Cycle 3(仪器软件)分离质粒DNA。
              7.1.5 除虫链霉菌原生质体的制备及转化
将除虫链霉菌单菌落在1/2强度的YPD-6中分离。将菌丝体接种到25mm×150mm试管中的10ml TSB培养基中，在28℃以300rpm振荡培养48小时。将1ml菌丝体接种至50ml YEME培养基。每升YEME培养基含有：Difco酵母提取物-3g；Difco细菌用胨-5g；Difco Malt Extract-3g；蔗糖-300g。121℃高压灭菌25分钟后，加入下列物质：2.5M MgCl2·6H2O(单独在121℃高压灭菌25分钟)-2ml；及甘氨酸(20％)(过滤除菌)-25ml。
将菌丝体30℃培养48-72小时，然后在50ml离心管(Falcon)中在3,000rpm下离心20分钟收获。去除上清液，菌丝体在P缓冲液中重新悬浮，P缓冲液含有：蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl2 6H2O-2.02g；H2O-600ml；K2PO4(0.5％)-10ml；痕量元素溶液-20ml；CaCl2 2H2O(3.68％)-100ml；及MES缓冲液(1.0M，pH6.5)-10ml(*痕量元素溶液每升含有：ZnCl2-40mg；FeCl3·6H2O-200mg；CuCl2·2H2O-10mg；MnCl2·4H2O-10mg；Na2B4O7·10H2O-10mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O-10mg)。pH调至6.5，终体积调至1升，培养基用0.45微米滤膜热过滤。
菌丝体以3,000rpm离心20分钟得到粒状沉淀，去除上清液，将菌丝体在含有2mg/ml溶菌酶的20ml P缓冲液中重新悬浮。菌丝体在35℃振荡保温15分钟，经显微镜镜检确定原生质体的形成程度。当原生质体的形成结束时，将其在8,000rpm离心10分钟。去除上清液，将原生质体在10ml P缓冲液中重新悬浮。将原生质体在8,000rpm离心10分钟，去除上清液，将其在2ml P缓冲液中重新悬浮，将约1×109个原生质体分配至2.0ml低温小瓶(Nalgene)中。
含1×109个原生质体的小瓶在8,000rpm离心10分钟，去除上清液，原生质体在0.1ml P缓冲液中重新悬浮。将2～5μg转化的DNA加入到原生质体中，接着加入0.5ml T工作液。T缓冲基质含有：PEG-1000(Sigma)-25g；蔗糖-2.5g；H2O-83ml。用1N NaOH(已滤膜除菌)将pH调节至8.8，将T缓冲基质经滤膜过滤除菌，于4℃保存。T工作液(于使用当天制备)是T缓冲基质-8.3ml；K2PO4(4mM)-1.0ml；CaCl2·2H2O(5M)-0.2ml；及TES(1M，pH8)-0.5ml。 T工作液的每一组分均分别过滤除菌。
在20秒钟内将T缓冲液加入到原生质体中，还加入1.0ml P缓冲液，然后将原生质体在8,000rpm离心10分钟。去除上清液后将原生质体在0.1mlP缓冲液中重新悬浮。然后将原生质体铺板至RM14培养基上，该培养基含有：蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl2.6H2O-10.12g；葡萄糖-10g；Difco酪蛋白氨基酸-0.1g；Difco酵母提取物-5g；Difco燕麦琼脂-3g；Difco细菌用琼脂-22g；dH2O-800ml。溶液在121℃高压灭菌25分钟。然后加入下列的无菌原液：K2PO4(0.5％)-10ml；CaCl2.2H2O(5M)-5ml；L-脯氨酸(20％)-15ml；MES缓冲液(1.0M，pH6.5)-10ml；痕量元素(同上)-2ml；环己酰亚胺原液(25mg/ml)-40ml；及1N NaOH-2ml。将25ml RM14培养基等分在每个平板上，这些平板在使用前都要干燥24小时。
原生质体在湿度95％、温度30℃保温20-24小时。为了选择硫链丝菌肽抗性转化子，将含有125μg/ml硫链丝菌肽的1ml上层缓冲基质均匀覆盖在RM14再生平板上。每100ml上层缓冲基质含有：蔗糖-10.3g；痕量元素溶液(与上相同)-0.2ml；及MES(1M，pH6.5)-1ml。原生质体在湿度95％、温度30℃保温7-14天直到能观察到硫链丝菌肽抗性(Thior)菌落。
             7.1.6. 变青链霉菌原生质体的转化
有些例子中用变青链霉菌(Streptomyces lividans)TK64(由John Innes研究所，Norwich，U.K提供)进行转化。用于变青链霉菌生长、原生质化及转化的方法和组合物如Hopwood等，1985，Genetic Manipulation ofStreptomyces，A Laboratory Manual，John Innes Foundation，Norwich，U.K.所述并遵照执行。如上文7.1.3中所述从变青链霉菌转化株中分离质粒DNA。
               7.1.7. 除虫链霉菌菌株的发酵分析
除虫链霉菌的菌丝体在1/2强度的YPD-6上培养4-7天后，接种到含有8ml预制培养基及两个5mm玻璃珠的1×6英寸试管中，预制培养基含有：可溶性淀粉(为可溶性淀粉或KOSO，Japan Com Starch Co.，Nagoya)-20g/L；Pharmamedia-15g/L；Ardamine pH-5g/L(Champlain Ind.，Clifton，NJ)；CaCO3-2g/L；2x bcfa(″bcfa″指支链脂肪酸)，其在培养基中含有终浓度为50ppm的2-(+/-)-甲基丁酸，60ppm的异丁酸，及20ppm的异戊酸。将pH调至7.2，培养基在121℃高压灭菌25分钟。
试管以17°角在29℃以215rpm振荡培养3天。将种子培养物的2ml等分试样接种到含有25ml生长培养基的300ml Erlenmeyer烧瓶中，该培养基含有：淀粉(为可溶性淀粉或KOSO)-160g/L；Nutrisoy(Archer DanielsMidland，Decatur，IL)10g/L；Ardamine pH-10g/L；K2HPO4-2g/L；MgSO4.4H2O-2g/L；FeSO4.7H2O-0.02g/L；MnCl2-0.002g/L；ZnSO4.7H2O-0.002g/L；CaCO3-14g/L 2x bcfa(同上)；及环己烷羧酸(CHC)(在pH7.0制成20％的溶液)-800ppm。pH调至6.9，培养基在121℃高压灭菌25分钟。
接种后，将烧瓶在29℃以200rpm振荡培养12天。培养后，从烧瓶中取2ml样品，用8ml甲醇稀释，混合，混合物在1,250xg离心10分钟以沉淀碎片。用Beckman Ultrasphere ODS柱(25cm×4.6mm ID)以0.75ml/min的流速进行HPLC来分析上清液，检测240nm的吸光度。流动相为86/8.9/5.1甲醇/水/乙腈。
             7.1.8. 除虫链霉菌PKS基因的分离
制备除虫链霉菌(ATCC 31272，SC-2)染色体DNA的粘粒文库并使其与由红色糖多孢菌聚酮化合物合成酶(PKS)基因的片段制成的酮合成酶(KS)探针杂交。粘粒文库的制备详见Sambrook等，1989，同上。链霉菌染色体DNA文库的制备详见Hopwood等，1985，同上。带有酮合成酶-杂交区域的粘粒菌落可通过与pEX26(由Dr.P.Leadlay，Cambridge，UK提供)的2.7KbNdeI/Eco47III片段杂交来识别。将约5ng pEX26用Ndel及Eco47III消化。将反应混合物上样至0.8％SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶(FMC BioProducts，Rockland，ME)。电泳后从凝胶中切出2.7Kb的Nde1/Eco47III片段，用FastProtocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)从凝胶中回收DNA。2.7Kb的Nde1/Eco47III片段使用BRL Nick翻译系统(BRL Life Technologies，Gaithersburg，MD)按说明书进行[α-32P]dCTP(脱氧胞苷5′-三磷酸盐，四(三乙胺)盐，[α-32P]-)(NEN-Dupont，Boston，MA)标记。一个典型反应在0.05ml体积中进行。加入5μl终止缓冲液后，用G-25 Sephadex Quick SpinTMColumn(Boehringer Mannheim)按说明书将标记的DNA分子与未发生掺入的核酸分子分离。
约1,800个粘粒菌落通过菌落杂交进行筛选。鉴定出10个与红色糖多孢菌KS探针强力杂交的菌落。将含有粘粒DNA的大肠杆菌菌落在LB液体培养基中培养，用Cycle 3(仪器软件)在AutoGen 540TM自动核酸分离器中按照操作说明分离每一培养物中的粘粒DNA。限制性核酸内切酶作图及Southern印迹杂交分析揭示五个菌落中含有重叠的染色体区域。五种粘粒(也即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，pSE69)的除虫链霉菌基因组BamH1酶切图谱通过对重叠粘粒的分析及杂交进行构建(图4)。
        7.1.9. 鉴定能调控除虫菌素B2∶B1比例的DNA
                    及鉴定aveC ORF
以下方法用于测试来自pSE66粘粒克隆的亚克隆片段调控AveC突变株中除虫菌素B2∶B1比例的能力。用Sac1及BamH1消化pSE66(5μg)。将反应混合物上样至0.8％SeaplaqueTM GTG琼脂糖凝胶(FMC BioProducts)，电泳后从凝胶中切出2.9Kb的Sac1/BamH1片段，使用Fast Protocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)从凝胶中回收DNA。约5μg穿梭载体pWHM3(Vara等，1989，J.Bacteriol.171：5872-5881)用Sac1及BamHI消化。将约0.5μg所述2.9Kb插入子与0.5μg已消化的pWHM3混合，并按照厂商说明与1个单位的连接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)在15℃、总体积20μl中保温过夜。保温后，将5μl连接混合物在70℃保温10分钟，冷却至室温，按照操作手册用于转化感受态的大肠杆菌DH5α细胞(BRL)。从氨苄青霉素抗性转化子中分离质粒DNA，通过限制性分析可以证实2.9Kb Sac1/BamHI插入子的存在。该质粒被命名为pSE119。
如上7.1.5部分所述，制备除虫链霉菌1100-SC38菌株(Pfizer内部(in-house)菌株)的原生质体并用pSE119转化。1100-SC38株是一种突变体，当补充环己烷羧酸时，相对于除虫菌素环己基-B1形式，其产生明显多的除虫菌素环己基-B2形式(B2∶B1的比例大约是30∶1)。用于转化除虫链霉菌原生质体的pSE119从大肠杆菌GM2163株(得自Dr.B.J.Bachmann，Curator，E. coli Genetic Stock Center，Yale University)、大肠杆菌DM1株(BRL)、或变青链霉菌TK64株中分离。分离1100-SC38菌株的硫链丝菌肽抗性转化子并通过对发酵产物的HPLC分析来进行分析。除虫链霉菌1100-SC38菌株的含有pSE119的转化子产生了比例已改变的除虫菌素环己基B2∶环己基-B1，该比例大约是3.7∶1(表2)。
确定了pSE119能调控AveC突变体中的除虫菌素B2∶B1的比例后，测出插入的DNA序列。按照操作手册，使用质粒DNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)，大约有10μg的pSE119被分离，然后用ABI 373A自动DNA测序仪(Perkin Elmer，Foster City，CA)进行测序。用遗传学计算机组程序(GCG，Madison，WI)组合和编辑测序数据。DNA序列及aveC ORF在图1(SEQ ID NO：1)中已经列出。
如下构建一种新的质粒，命名为pSE118。用SphI及BamHI消化大约5μg的pSE66。将反应混合物上样至0.8％SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶(FMCBioProducts)上，电泳后从凝胶中切出2.8Kb的SphI/BamHI片段，使用FastProtocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)从凝胶中回收DNA。约5μg穿梭载体pWHM3用SphI及BamHI消化。将0.5μg 2.8Kb插入子与0.5μg已消化的pWHM3混合，在15℃、总体积20μl中按照厂商说明与1个单位的连接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)一起保温过夜。保温后，将5μl连接混合物在70℃保温10分钟，冷却至室温，按照操作手册用于转化受感态的大肠杆菌DH5α细胞。从氨苄青霉素抗性转化子中分离质粒DNA，通过限制性分析可以证实2.8Kb SphI/BamHI插入子的存在。该质粒被命名为pSE118。pSE118及pSE119中的DNA插入子约有838个核苷酸重叠(图4)。
除虫链霉菌1100-SC38菌株的原生质体用pSE118如上进行转化。分离1100-SC38菌株的硫链丝菌肽抗性转化子并通过对发酵产物的HPLC分析来进行分析。除虫链霉菌1100-SC38菌株的含pSE118的转化株相对于1100-SC38株而言，除虫菌素环己基B2∶环己基-B1的比例并未改变(表2)。
     7.1.10. 对除虫链霉菌染色体DNA上aveC基因的PCR扩增
通过PCR扩增法从除虫链霉菌染色体DNA中分离含aveC ORF的～1.2Kb片段，所用引物根据从上所获的aveC核苷酸序列进行设计。PCR引物由Genosys Biotechnologies，Inc.(Texas)提供。右向引物是：5′-TCACGAAACCGGACACAC-3(SEQ ID NO：6)；左向引物是：5′-CATGATCGCTGAACCGAG-3′(SEQ ID NO：7)。在由生产商所提供的缓冲液中，在有300μM dNTP，10％甘油，每种引物各200pmol，0.1μg模板及2.5单位酶，终体积100μl的条件下，用Deep VentTM聚合酶(New England-Biolabs)在Perkin-Elmer Cetus热循环仪中进行PCR反应。第一循环为95℃5分钟(变性步骤)，60℃2分钟(退火步骤)，72℃2分钟(延伸步骤)。随后24循环的温度变化与此相似，但变性步骤的时间缩短至45秒且退火时间缩短至1分钟。
PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳后，检测到约1.2Kb的单一DNA带。从凝胶中纯化该DNA，并以1∶10摩尔的载体：插入子比例与25ng线性化钝端PCR-Blunt载体(Invitrogen)按照操作手册进行连接。按照操作手册用该连接混合物转化One ShotTM大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen)。从氨苄青霉素抗性转化子中分离质粒DNA，该～1.2Kb插入子的存在可以通过限制性分析证实。该质粒被命名为pSE179。
将pSE179中的DNA插入子通过BamHI/XbaI消化而分离，电泳分离，从凝胶中纯化，并与已被BamHI/XbaI消化的穿梭载体pWHM3连接，该反应中DNA总浓度为1μg，载体与插入子的摩尔比为1∶5。按照操作手册用该连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，所述～1.2Kb插入子的存在可以通过限制性分析证实。该质粒(被命名为pSE186(图2，ATCC 209604))被转化至大肠杆菌DM1中，并从氨苄青霉素抗性转化子中分离质粒DNA。
                       7.2. 结果
鉴定出来自pSE119的2.9Kb SacI/BamHI酶切片段，当其转化至除虫链霉菌1100-SC38菌株中时，显著地改变了B2∶B1除虫菌素的产量比。一般情况下，除虫链霉菌1100-SC38菌株的B2∶B1比约为30∶1，但当用含有2.9Kb SacI/BamHI酶切片段的载体转化时，除虫菌素B2∶B1的比例减少至大约3.7∶1。对转化体培养物进行发酵后分析证实了转化DNA的存在。
对2.9Kb pSE119片段进行测序，鉴定了约0.9Kb的ORF(图1)(SEQ IDNO：1)，其包含一个已于他处发生突变而仅产生B2产物的PstI/SphI片段(Ikeda等，1995，同上)。该ORF或其相应的推导多肽，与已知数据库(GenEMBL，SWISS-PROT)相比，并不表明其与已知DNA或蛋白序列有任何的同源性。
表2表示用不同质粒转化的除虫链霉菌1100-SC38株的发酵分析
                          表2
除虫链霉菌菌株(转化质粒) 所测转化体的编号 平均B2∶B1比例
1100-SC38(无) 9  30.66
1100-SC38(pWHM3) 21  31.3
1100-SC38(pSE119) 12  3.7
1100-SC38(pSE118) 12  30.4
1100-SC38(pSE185) 14  27.9
          8.实施例： 除虫链霉菌aveC突变株的构建
本实施例描述用上述组合物及方法对几种不同除虫链霉菌aveC突变株的构建。在链霉菌基因中引入突变的技术见Kieser及Hopwood，1991，Meth.Enzym.204：430-458。详见Anzai等，1988，J.Antibiot XLI(2)：226-233和Stutzman-Engwall等，1992，J.Bacteriol.174(1)：144-154。这些参考资料在此都被全文引用。
             8.1. 除虫链霉菌AveC基因的失活
含有失活的AveC基因的AveC突变株可通过下述的几种方法构建。在第一种方法中，将pSE119(上文第7.1.9所述质粒)上aveC基因内部的640bp SphI/PstI片段用红色糖多孢菌的ermE基因(赋予红霉素抗性)取代。ermE基因通过用BglII和EcoRI消化而从pIJ4026(来自John Innes Institute，Norwich，U.K.；还参见Bibb等，1985，Gene 41：357-368)中分离，然后电泳，从凝胶中纯化。将此约1.7Kb的片段连接到用BamHI和EcoRI消化的pGEM7Zf(Promega)中，将该连接混合物依照操作手册转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。从氨苄青霉素抗性转化子中分离质粒DNA，所述约1.7Kb插入子的存在可以通过限制性分析证实。将该质粒命名为pSE27。
pSE118(如上第7.1.9部分描述)用SphI及BamHI消化，将消化物电泳，从凝胶中纯化约2.8Kb的SphI/BamHI插入子。pSE119用PstI和EcoRI消化，然后电泳，从凝胶中纯化约1.5Kb的PstI/EcoRI插入子。将穿梭载体pWHM3用BamHI及EcoRI消化。pSE27用PstI和SphI消化。然后电泳，从凝胶中纯化约1.7Kb的PstI/SphI插入子。将全部四种片段(即：约2.8Kb，约1.5Kb，约7.2Kb，约1.7Kb)通过一个4步骤(4-way)连接反应连接在一起。将该连接混合物依照操作手册转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。从氨苄青霉素抗性转化子中分离质粒DNA，通过限制性分析证实正确插入子的存在。该质粒被命名为pSE180(图3；ATCC209605)。
将pSE180转化入变青链霉菌TK64细胞，用针对硫链丝菌肽和红霉素的抗性鉴定转化的菌落。从变青链霉菌中分离pSE180，用其转化除虫链霉菌的原生质体。鉴定出四种硫链丝菌肽抗性除虫链霉菌转化体，制备原生质体并在非选择性条件下将其铺板至RM14培养基中。使原生质体再生，然后筛选有红霉素抗性而无硫链丝菌肽抗性的单菌落，其表明失活型aveC基因已整合在染色体上但游离复制子已丢失。鉴定出一个Ermr Thios转化体，将其命名为SE180-11菌株。从SE180-11株中分离总染色体DNA，用限制性酶BamHI，HindIII，PstI或SphI消化，在0.8％琼脂糖凝胶中电泳分离，然后转移至尼龙膜上，与ermE探针进行杂交。这些分析显示，通过一个双交换事件使得ermE抗性基因整合至染色体上并同时使640bpPstI/SphI片段缺失。对SE180-11株发酵产物的HPLC分析显示不再产生正常的除虫菌素(图5A)。
在使aveC基因失活的第二种方法中，从除虫链霉菌SE180-11株的染色体上取出1.7Kb的ermE基因，使得aveC基因中出现640bp PstI/SphI的缺失。如下构建基因取代质粒：pSE180用XbaI进行部分消化，从凝胶中纯化约11.4Kb的片段。该约11.4Kb的带缺少所述1.7Kb ermE抗性基因。将此DNA连接并转化进大肠杆菌DH5α细胞。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，正确插入子的存在可以通过限制性分析证实。将该质粒(被命名为pSE184)转化进大肠杆菌DM1中，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA。用该质粒转化除虫链霉菌SE180-11株的原生质体。从SE180-11株的硫链丝菌肽抗性转化体制备原生质体，并在RM14上铺板为单菌落。使原生质体再生，然后筛选出无红霉素抗性和硫链丝菌肽抗性的单菌落，其表明失活型aveC基因已整合在染色体上但含有ermE基因的游离复制子已缺失。鉴定出一个ErmsThios转化子并命名为SE184-1-13。对SE184-1-13的发酵分析显示正常除虫菌素不再产生，且SE184-1-13具有与SE180-11相同的发酵特征。
在第三种使aveC基因失活的方法中，用PCR在第471位核苷酸C之后添加两个G，导致在染色体aveC基因中引入移码突变，从而创建一个BspE1位点。工程化EspE1位点的存在可用于检测基因取代事件。PCR引物被设计为能在aveC基因中引进移码突变，所述引物由Genosys Biotechnologies公司提供。右向引物为：5′-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3′(SEQ ID NO：8)，左向引物为：5′-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3′(SEQ ID NO：9)。PCR条件如上第7.1.10节所述。666bp的PCR产物用Sph1消化，分别得到278bp及388bp的两种片段。从凝胶中纯化所述388bp的片段。
基因取代质粒如下构建：穿梭载体pWHM3用EcoRI及BamHI消化。pSE119用BamHI及SphI消化，然后电泳，从凝胶中分离出约840bp的片段。pSE119用EcoRI及XmmI消化，电泳分离，从凝胶中纯化约1.7Kb的片段。四种片段(也即：～7.2Kb，～840bp，～1.7Kb及388bp)通过一个4步骤连接反应连接在一起。将该连接混合物转化进大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性分析及DNA序列分析证实正确插入子的存在。将该质粒(命名为pSE185)转化至大肠杆菌DM1细胞，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA。用该质粒转化除虫链霉菌1100-SC38菌株的原生质体。分离1100-SC38菌株的硫链丝菌肽抗性转化体，并通过对发酵产物的HPLC分析来分析。当pSE185转化入除虫链霉菌1100-SC38菌株中时，并未明显改变除虫菌素B2∶B1的比例(表2)。
用pSE185转化除虫链霉菌原生质体以在染色体aveC基因中产生一个移码突变。从硫链丝菌肽抗性转化株制备原生质体，并在RM14培养基上铺板为单菌落。使原生质体再生，然后筛选无硫链丝菌肽抗性的单菌落。分离硫链丝菌肽敏感菌落的染色体DNA并通过PCR筛选整合至染色体中的移码突变的存在。PCR引物根据aveC核苷酸序列设计，由GenosysBiotechnologies(Texas)公司提供。右向PCR引物为：5′-GCAAGGATACGGGGACTAC-3′(SEQ ID NO：10)，左向PCR引物为：5′-GAACCGACCGCCTGATAC-3′(SEQ ID NO：11)，PCR条件如上第7.1.10节所述。所获PCR产物为543bp，当用BspE1消化时，可检测到三种片段368bp，96bp，及79bp，其表明失活型aveC基因的染色体整合及游离复制子的缺失。
对aveC基因上含有移码突变的除虫链霉菌突变株的发酵分析显示，正常除虫菌素不再产生，且这些突变株具有与SE180-11株及SE184-1-13株相同的发酵产物HPLC特征。鉴定出一个Thios转化株并命名为SE185-5a。
此外，在aveC基因上产生一个突变，其使第520位核苷酸由G变为A，从而导致第116位上编码色氨酸(W)的密码子变为终止密码子。携带此突变的除虫链霉菌菌株不产生正常除虫菌素且具有与SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a菌株相同的发酵特征。
此外，在aveC基因中产生突变，其导致：(i)第970位核苷酸由G变为A，使第256位氨基酸从甘氨酸(G)变为天冬氨酸(D)，(ii)第996位核苷酸由T变为C，使第275位氨基酸从酪氨酸(Y)变为组氨酸(H)。具有这些突变(G256D/Y275H)的除虫链霉菌菌株并不产生正常除虫菌素但具有与SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a菌株相同的发酵特征。
除虫链霉菌aveC失活突变株SE180-11、SE184-1-13、SE185-5a，及此处所提的其它菌株，为评估aveC基因中其它突变的影响提供了筛选工具。将含有野生型aveC基因的pSE186转化入大肠杆菌DM1细胞中，从氨苄青霉素抗性转化株中分离质粒DNA。用该pSE186 DNA转化除虫链霉菌SE180-11株。分离SE180-11株的硫链丝菌肽抗性转化体，测定红霉素抗性的存在，通过HPLC分析发酵产物来分析Thior Ermr转化体。功能性aveC基因的反位(in trans)存在能将除虫菌素的正常产量恢复到SE180-11株的水平(图5B)。
         8.2 对改变B2∶B1比例的AveC基因中突变的分析
如上所述，含有失活的aveC基因的除虫链霉菌SE180-11菌株通过用含有功能性aveC基因的质粒(pSE186)转化而补充。SE180-11株也可用作宿主菌株来鉴定aveC基因的其它突变，如下所述。
从1100-SC38菌株中分离染色体DNA，并用作aveC基因进行PCR扩增的模板。通过PCR扩增分离1.2Kb ORF，扩增所用引物根据aveC核苷酸序列来设计。右向引物为SEQ ID NO：6，左向引物为SEQ ID NO：7(见第7.1.10节所述)。PCR及亚克隆条件如第7.1.10节所述。1.2Kb ORF的DNA序列分析显示了第337位核苷酸由C变为T的aveC基因突变，第55位的氨基酸由丝氨酸(S)变为苯丙氨酸(F)。将含有S55F突变的aveC基因亚克隆入pWHM3以产生一个质粒，其被命名为pSE187，并用于转化除虫链霉菌SE180-11菌株的原生质体。分离SE180-11株的硫链丝菌肽抗性转化体，以确定红霉素抗性的存在，通过HPLC分析发酵产物来分析Thior Ermr转化体。编码第55位氨基酸之改变(S55F)的aveC基因的存在，能将正常的除虫菌素产量恢复到SE180-11株的水平(图5C)；但环己基B2∶环己基B2的比例约为26∶1，而用pSE186转化的SE180-11株的B2∶B1比约为1.6∶1(表3)，表明该单突变(S55F)调节了环己基B2相对于环己基B1的量。
鉴定出在aveC基因中的另一个突变，其使第862位核苷酸由G变为A，从而第230位的氨基酸由甘氨酸(G)变为天冬氨酸(D)。含有该突变(G230D)的除虫链霉菌菌株产生的除虫菌素B2∶B1比例约为30∶1。
              8.3. 使B2∶B1比例下降的突变
可以如下构建减少环己基-B2相对于环己基-B1的量的几种突变。
鉴定出aveC基因中一个突变，其使第588位核苷酸由G变为A，从而第139位的氨基酸由丙氨酸(A)变为苏氨酸(T)。将含有A139T突变的aveC基因亚克隆入pWHM3中，产生一个质粒(命名为pSE188)，用该质粒转化除虫链霉菌SE180-11株的原生质体。分离SE180-11株的硫链丝菌肽抗性转化体，测定红霉素抗性株的存在，通过HPLC分析发酵产物来分析Thior Ermr转化体。编码氨基酸残基139改变(A139T)的突变型aveC基因的存在能将除虫菌素产量恢复至SE180-11株的水平(图5D)；但B2∶B1的比例约是0.94∶1，这表明该突变减少了环己基B2相对于环己基B1的量。该结果很意外，因为已公布的结果以及上述突变结果仅证明了aveC基因的失活或除虫菌素B2型相对于B1型的产量增加(见表3)。
由于A139T突变以更利于B1的方式改变了B2∶B1的比例，因此构建一个突变，其使第138位的氨基酸由丝氨酸变为苏氨酸。为此，pSE186用EcoRI消化并克隆入已用EcoRI消化的pGEM3Zf(Promega)中。该被命名为psE186a的质粒用ApaI及KpnI消化，在琼脂糖凝胶中分离DNA片段，从凝胶中纯化两种片段～3.8Kb及～0.4Kb。用pSE186的～1.2Kb DNA插入片段作PCR模板，诱导第585位核苷酸的单碱基改变。将PCR引物设计成在核苷酸585位能引进一个突变，该引物由Genosys Biotechnologies公司(Texas)提供。右向PCR引物为：5′-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3′(SEQ ID NO：12)；左向PCR引物为：5′-GGAACCGACCGCCTGATACA-3′(SEQ ID NO：13)。使用Advantage GC基因组PCR试剂盒(Clonetech Laboratories，Palo Alto，CA)，在由厂商提供的缓冲液中，在有200μM dNTPs，每种引物各200pmol，50ng模板DNA，1.0MGC-Melt及1个单位的KlenTaq聚合酶混合物的条件下，在终体积50μl中进行PCR反应。第一循环为94℃1分钟；接下来以94℃30秒钟及68℃2分钟进行25个循环；然后以68℃3分钟进行一个循环。将295bp的PCR产物用ApaI及KpnI消化以释放一个254bp的片段，其通过电泳进行分辨并从凝胶中纯化。所有三种片段(～3.8Kb，～0.4Kb及254bp)用一个3步骤连接反应连接在一起。将该连接混合物转化入完整的大肠杆菌DH5c细胞中。从氨苄青霉素抗性转化株中分离质粒DNA，正确插入子的存在可以通过限制性分析确认。该质粒被命名为pSE198。
pSE198用EcoRI进行消化，克隆进已用EcoRI消化的pWHM3中，并将其转化至大肠杆菌DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化株中分离质粒DNA，通过限制性分析及DNA序列分析确认正确插入子的存在。将该质粒DNA转化至大肠杆菌DM1，从氨苄青霉素抗性转化株中分离质粒DNA，通过限制性分析确认正确插入子的存在。将这一命名为pSE199的质粒用于转化除虫链霉菌SE180-11菌株原生质体。分离SE180-11菌株的硫链丝菌肽抗性转化株，确定红霉素抗性的存在，通过用HPLC法分析发酵产物而分析Thior Ermr转化株。编码138位上氨基酸改变(S138T)的突变aveC基因的存在能将正常除虫菌素产量恢复至SE180-11株的水平；然而，B2∶B1的比例为0.88∶1，表明了该突变减少了环己基-B2相对于环己基-B1的量(见表-3)。该B2∶B1的比例甚至低于0.94∶1(这是用pSE188转化SE180-11菌株而产生的A139T突变所观察到的比例，如上所述)。
构建另一个突变以同时在氨基酸位置138及139处引进一个苏氨酸。用pSE186的约1.2Kb DNA插入片段做PCR的模板。将PCR引物设计成能在核苷酸位置585及588处诱发突变，该引物由Genosys Biotechnologies公司(Texas)提供。右向PCR引物为：5’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3′(SEQ ID NO：14)；左向PCR引物为：5′-GGAACATCACGGCATTCACC-3′(SEQ ID NO：15)。使用本节上述条件进行PCR反应。449bp的PCR产物用Apa1及Kpn1消化以释放254bp的片段，其通过电泳进行分辨并从凝胶中纯化。将pSE186a用ApaI及KpnI消化，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化3.8Kb与0.4Kb的两种片段。所有这三种片段(～3.8Kb，～0.4Kb及254bp)以3步骤连接反应进行连接，将该连接混合物转化至大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性分析确认正确插入子的存在。该质粒被命名为pSE230。
pSE230用EcoRI消化，克隆至已被EcoRI消化的pWHM3质粒中，转化至大肠杆菌DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性分析及DNA序列分析确认正确插入子的存在。将该质粒DNA转化至大肠杆菌DM1中，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性分析确认正确插入子的存在。用这一命名为pSE231的质粒转化除虫链霉菌SE180-11菌株的原生质体。分离SE180-11的硫链丝菌肽抗性转化体，确定红霉素抗性的存在，然后通过发酵分析Thior Ermr转化体。双突变aveC基因(编码S138T/A139T)的存在能使正常的除虫菌素生产恢复到SE180-11株的水平；但B2∶B1的比例为0.84∶1，显示该突变相对于pSE188或pSE199所转化的SE180-11株所提供的降低作用而言，进一步降低了环己基-B2相对于环己基B1的产量(见表3)。
构建另一突变，以便进一步降低环己基B2相对于环己基B1的产量。由于S138T/A139T突变能使B2∶B1之比向更利于B1的方向改变，因此构建一种突变，使得能在第138位氨基酸处引入一个苏氨酸并在第139位氨基酸处引入一个苯丙氨酸。用来自pSE186的约1.2kb DNA插入片段作为PCR的模板。将PCR引物设计为能在第585位核苷酸处引入突变(使T变为A)，第588位核苷酸处引入突变(使G变为T)，第589位核苷酸处引入突变(使C变为T)，这些引物可由Genosys Biotechnologies，Inc.(Texas)提供。正向PCR引物为：5’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3’(SEQ ID NO：16)；反向PCR引物为：5’-GGAACATCACGGCATTCACC-3’(SEQ ID NO：15)。PCR反应用Advantage GC基因组PCR试剂盒(Clonetech Laboratories，Palo Alto，CA)在厂家提供的缓冲液中进行，所述缓冲液中有200μM dNTPs，每种引物各200pmol，50ng模板DNA，101mM乙酸镁，1.0M GC-Melt和1个单位的Tth DNA聚合酶，终体积50μl。热循环过程为，94℃1分钟进行第一个循环；然后94℃30秒和68℃2分钟共25个循环；68℃3分钟进行一个循环。449bp的PCR产物用ApaI和KpnI消化，释放出一个254bp的片段，将其通过电泳分离并在凝胶上纯化。将所有三种片段(约3.8Kb，约0.4Kb和254bp)通过一个三步骤连接反应连接在一起。将该连接混合无转化至感受态的大肠杆菌DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性分析证实正确插入子的存在。将该质粒命名为pSE238。
pSE238用EcoRI消化，克隆至已被EcoRI消化的pWHM3质粒中，转化至大肠杆菌DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性分析及DNA序列分析确认正确插入子的存在。将该质粒DNA转化至大肠杆菌DM1中，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性分析确认正确插入子的存在。用这一命名为pSE239的质粒转化除虫链霉菌SE180-11菌株的原生质体。分离SE180-11菌株的硫链丝菌肽抗性转化体，确定红霉素抗性的存在，然后通过对发酵产物进行HPLC分析来分析Thior Ermr转化体。双突变aveC基因(编码S138T/A139F)的存在能使正常的除虫菌素生产恢复到SE180-11株的水平；但B2∶B1的比例为0.75∶1，表明该突变相对于如上述用pSE188，pSE199或pSE231转化的SE180-11株所提供的降低作用而言，进一步降低了环己基-B2相对于环己基B1的产量(见表3)。
                           表3
除虫链霉菌菌株(转化质粒) 转化体测试号 B2相对浓度 B1相对浓度 平均B2∶B1比例
 SE180-11(无) 30  0  0  0
 SE180-11(pWHM3) 30  0  0  0
 SE180-11(pSE186) 26  222  140  1.59
 SE180-11(pSE187) 12  283  11  26.3
 SE180-11(pSE188) 24  193  206  0.94
 SE180-11(pSE199) 18  155  171  0.88
 SE180-11(pSE231) 6  259  309  0.84
 SE180-11(pSE239) 20  184  242  0.75
可利用DNA改组(shuffling)技术构建另外的突变，以进一步降低环己基B2相对于环己基B1的产量，所述技术如Stemmer，1994，Nature 370：389-391；Stemmer，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751所述；还可详见美国专利5605793，5811238，5830721和5837458。
将含有突变型aveC基因的DNA改组质粒转化至感受态的dam dcm大肠杆菌细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，用于转化除虫链霉菌SE180-11菌株的原生质体。分离SE180-11菌株的硫链丝菌肽抗性转化体，从中筛选能产生除虫菌素但其环己基B2∶环己基B1之比为1∶1或更低的那些转化体。测定能产生除虫菌素但其B2∶B1之比为1∶1或更低的那些转化体中质粒DNA的DNA序列。
鉴定出8株转化体，其产生的环己基B2相对于环己基B1的量减少。这些转化体中最低B2∶B1之比为0.40∶1(表4)。分离这8种转化体每一种的质粒DNA，测定其DNA序列以便鉴定aveC基因中的突变。所述突变如下。
pSE290包含4个核苷酸突变，即第317位的核苷酸从T变为A，第353位的核苷酸从C变为A，第438位的核苷酸从G变为A，第1155位的核苷酸从T变为A。第317位核苷酸的改变使得第48位的氨基酸由D变为E，第438位核苷酸的改变使得第89位的氨基酸由A变为T。携有该质粒的细胞所产生的B2∶B1之比为0.42∶1(表4)。
pSE291包含4个核苷酸突变，即第272位的核苷酸从G变为A，第585位的核苷酸从T变为A，第588位的核苷酸从G变为A，第708位的核苷酸从G变为A。第585位核苷酸的改变使得第138位的氨基酸由S变为T，第588位核苷酸的改变使得第139位的氨基酸由A变为T，第708位核苷酸的改变使得第179位的氨基酸由G变为S。携有该质粒的细胞所产生的B2∶B1之比为0.57∶1(表4)。
pSE292包含与pSE290相同的4个核苷酸突变。携有该质粒的细胞所产生的B2∶B1之比为0.40∶1(表4)。
pSE293包含6个核苷酸突变，即第24位的核苷酸从A变为G，第286位的核苷酸从A变为C，第497位的核苷酸从T变为C，第554位的核苷酸从C变为T，第580位的核苷酸从T变为C，第886位的核苷酸从A变为T。第286位核苷酸的改变使得第38位的氨基酸由Q变为P，第580位核苷酸的改变使得第136位的氨基酸由L变为P，第886位核苷酸的改变使得第238位的氨基酸由E变为D。携有该质粒的细胞所产生的B2∶B1之比为0.68∶1(表4)。
pSE294包含6个核苷酸突变，即第469位的核苷酸从T变为C，第585位的核苷酸从T变为A，第588位的核苷酸从G变为A，第708位的核苷酸从G变为A，第833位的核苷酸从C变为T，第1184位的核苷酸从G变为A。此外，第173、174和175位的核苷酸已缺失。第469位核苷酸的改变使得第99位的氨基酸由F变为S，第585位核苷酸的改变使得第138位的氨基酸由S变为T，第588位核苷酸的改变使得第139位的氨基酸由A变为T，第708位核苷酸的改变使得第179位的氨基酸由G变为S。携有该质粒的细胞所产生的B2∶B1之比为0.53∶1(表4)。
pSE295包含2个核苷酸突变，即第588位的核苷酸从G变为A，第856位的核苷酸从T变为C。第588位核苷酸的改变使得第139位的氨基酸由A变为T，第856位核苷酸的改变使得第228位的氨基酸由M变为T。携有该质粒的细胞所产生的B2∶B1之比为0.80∶1(表4)。
pSE296包含5个核苷酸突变，即第155位的核苷酸从T变为C，第505位的核苷酸从G变为T，第1039位的核苷酸从C变为T，第1202位的核苷酸从C变为T，第1210位的核苷酸从T变为C。第505位核苷酸的改变使得第111位的氨基酸由G变为V，第1039位核苷酸的改变使得第289位的氨基酸由P变为L。携有该质粒的细胞所产生的B2∶B1之比为0.73∶1(表4)。
pSE297包含4个核苷酸突变，即第377位的核苷酸从G变为T，第588位的核苷酸从G变为A，第633位的核苷酸从A变为G，第1067位的核苷酸从A变为T。第588位核苷酸的改变使得第139位的氨基酸由A变为T，第633位核苷酸的改变使得第154位的氨基酸由K变为E，第1067位核苷酸的改变使得第298位的氨基酸由Q变为H。携有该质粒的细胞所产生的B2∶B1之比为0.67∶1(表4)。
                             表4
除虫链霉菌菌株(转化质粒) 所测转化体的编号  相对B2浓度  相对B1浓度  平均B2∶B1比例
 SE180-11(无)     4     0     0     0
 SE180-11(pWHM3)     4     0     0     0
 SE180-11(pSE290)     4     87     208     0.42
 SE180-11(pSE291)     4     106     185     0.57
 SE180-11(pSE292)     4     91     231     0.40
 SE180-11(pSE293)     4     123     180     0.68
 SE180-11(pSE294)     4     68     129     0.53
 SE180-11(pSE295)     4     217     271     0.80
 SE180-11(pSE296)     1     135     186     0.73
 SE180-11(pSE297)     1     148     221     0.67
如下进行另一轮DNA改组，以便使环己基-B2除虫菌素的产量相对于环己基-B1除虫菌素减少。
半合成改组
用Maxygen Inc.的WO97/20078中所述的方法对最佳克隆进行改组。在改组反应中添加多个单独的寡核苷酸，它们编码与降低的B2∶B1比例最佳对应的有益取代，它们的添加量是相对于aveC模板链为5摩尔过量。使所述寡核苷酸的每一核苷酸错配的侧翼为20个具有完美同一性(perfect identity)的核苷酸，以便确保在改组反应期间的正确插入。寡核苷酸购自OperonTechnologies(Alameda，CA)。
除虫链霉菌的HTP生长
从转化平板上挑取独立的菌落，将其接种到96孔深孔接种板的200μlR5培养基(Kieser，T等，“Practical Streptomyces Genetics”，2000，Norwich，U.K.，John Innes Foundation)中，30℃振荡培养。在每一孔中分配玻璃珠，以便分散菌丝体并给培养物通气。在此期间，使培养物实现平稳的密集生长。4-5天后，取20μl接种培养物分散到生产平板中，剩余的体积在加入甘油至终浓度为20％以后，作为主平板冻在-80℃。将生产平板在30℃潮湿环境中保温12-14天。保温5-8天后，这些菌株开始形成孢子。生产平板基本如辉瑞产品公司(Pfizer Inc.)的WO 99/41389所述来制备，不同仅在于添加1％琼脂糖以确保固体表面。
提取以及ESI-MS/MS筛选
将总量为1ml的乙酸乙酯加入每一孔中，室温振荡保温20分钟。回收约750μl乙酸乙酯相，转移到96孔板中，蒸发过夜。将沉淀重悬于100μl甲醇1mM NaCl中，用96孔板模式的自动取样器取5μl溶液注入质谱仪中，不进行液相层析或其它分离就直接分析流动注射相。通过电喷离子化作用(electrospray ionization)使化合物离子化，监控两个不同通道的两轮MS/MS跃迁(transition)。B1钠化离子(sodiated ion)的MS/MS跃迁是从m/z 921到m/z777，B2钠化离子的MS/MS跃迁是从m/z 939到m/z 795。用Finnigan TSQ-7000，Micromass Quattro-LC质谱仪和Leap Technology Twin-Pal自动取样器进行该高通量筛选。将每一孔位置上B1和B2各自的图谱整合可以鉴定出热点(hit)。
最后鉴定出57种新的氨基酸取代组合，它们可以产生0.35∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素(图6)。其中一些新突变可以产生约0.30∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素；一些可以产生约0.25∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素，还有一些可以产生约0.20∶1或更低比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素。鉴定出2种新突变可以产生0.37或0.38的比例的环己基B2∶环己基B1除虫菌素。
                       生物材料的保藏
1998年1月29日，下列生物材料保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852，USA，保藏号为：
质粒                         保藏号
质粒pSE180                  209605
质粒pSE186                  209604
以上所引用的全部的专利，专利申请，及公开文献在此全面引作参考。
本发明并不局限于本文所述具体实施方案的范围，这些仅为本发明各个方面的个别举例，功能上相当的方法及组合物都属于本发明的范围。实际上，除了上述说明及示例外，从上述说明和附图，本发明的各种变化对于本领域技术人员来说都是很明显的。这些变化都将落入所附权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110>辉瑞产品公司(PFIZER PRODUCTS INC.)
<120>指导B2∶B1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因
<130>PC23034A
<140>PC23034A
<141>2002-02-12
<160>16
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1229
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<220>
<221>CDS
<222>(174)..(1085)
<400>1
tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60
tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120
aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg gtg    176
                                                           Val
                                                             1
gtg gtg tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg tac   224
Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala Tyr
              5                  10                  15
gtg ttc agc cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg atc gag acg   272
Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu Thr
         20                  25                  30
gcg ggc cag ggt cag ggc ggc agc aag gat acg ggg act acc gat gtg   320
Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val
     35                  40                  45
gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc atc acc gcc gcg gcg gcg tgg   368
Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala Trp
 50                  55                  60                  65
ctc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa cga cgg ctg ctg ttc gac gcc ctt   416
Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala Leu
                 70                  75                  80
ctc ttc ctc ggg ctg ctg ttc gcg agc tgg cag agc ccg ctc atg aac   464
Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met Asn
             85                  90                  95
tgg ttc cat tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg ggc gcg gtg   512
Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala Val
        100                 105                 110
ggt tcc tgg ggt ccg tat gtg ccc ggc tgg cag ggg gcg ggc ccg ggt   560
Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro Gly
    115                 120                 125
gcg gag gcg gaa atg ccg ctg gcg tcg gcc tcc gtc tgc atg tcg gct   608
Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser Ala
130                 135                 140                 145
ctg atc gtc acc gtg ctg tgc agc aag gca ctg ggg tgg atc aag gcc   656
Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys Ala
                150                 155                 160
cgc cgg ccg gca tgg cgg acc tgg cgg ctg gtc ctg gcc gtg ttc ttc   704
Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe Phe
            165                 170                 175
atc ggc atc gtg ctc ggt ctg tcc gag ccg ctg ccg tcc gcc tcc ggg   752
Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gly
        180                 185                 190
atc agc gta tgg gcc aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg agt ggc   800
Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser Gly
    195                 200                 205
gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc ggt tcc ggc ctg gtc   848
Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu Val
210                 215                 220                 225
tgc tgc atg ctg ggc tcg ctg cgc ttc ttc cgc gac gaa cgc gat gag   896
Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp Glu
                230                 235                 240
tcg tgg gtg gaa cgg gga gcc tgg cgg ttg ccg caa cgg gca gcg aac   944
Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala Asn
            245                 250                 255
tgg gcg cgt ttc ctc gcc gtg gtc ggt ggg gtg aat gcc gtg atg ttc   992
Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met Phe
        260                 265                 270
ctc tac acc tgt ttc cat atc ctc ctg tcc ctc gtc ggt gga cag ccg   1040
Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln Pro
    275                 280                 285
ccc gac caa ctg ccg gac tcc ttc caa gcg ccg gcc gct tac tga       1085
Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr
290                 295                 300
gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc 1145
ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205
acactcctcg gttcagcgat catg                                        1229
<210>2
<211>303
<212>PRT
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>2
Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala
  1               5                  10                  15
Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu
             20                  25                  30
Thr Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp
         35                  40                  45
Val Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala
     50                  55                  60
Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala
 65                  70                  75                  80
Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met
                 85                  90                  95
Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala
            100                 105                 110
Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser
    130                 135                 140
Ala Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys
145                 150                 155                 160
Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe
                165                 170                 175
Phe Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser
            180                 185                 190
Gly Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser
        195                 200                 205
Gly Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu
    210                 215                 220
Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp
 225                230                 235                 240
Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala
                245                 250                 255
Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met
            260                 265                 270
Phe Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln
        275                 280                 285
Pro Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr
    290                 295                 300
<210>3
<211>1150
<212>DNA
<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)
<220>
<221>CDS
<222>(58)..(990)
<400>3
gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg   57
gtg ttc acc ctt ccc gta aca ctg tgg gcg tgt gtc ggc gcg ctg gtg  105
Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val
  1               5                  10                  15
ctg gga ctt cag gtg tac gtg ttc gcc gcc tgg ctc gcc gac agc ggc  153
Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly
             20                  25                  30
tac cgc atc gag aag gcg tcc ccg gcc agg ggc ggt ggg gac tcg gag  201
Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu
         35                  40                  45
cgg atc gcc gat gtg ctg atc ccg ctg ctg tcc gtg gtg gga gcg gtg  249
Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val
     50                  55                  60
gtc ctc gca gtg tgt ctg tac cgg agg tgt cgg gcc agg agg cgg ctg  297
Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu
 65                  70                  75                  80
acg ttc gac gcg tcg ctc ttc atc ggg ctg ctg tcg gcc agt tgg cag  345
Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln
                 85                  90                  95
agt ccc ttg atg aac tgg atc aat ccg gtg ctc gcg tca aac gtc aat  393
Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn
            100                 105                 110
gtg ttc gga gcg gtg gcc tcg tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag  441
Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln
        115                 120                 125
ggg gcg ggg gcg cac cag gag gcc gag ctg ccg ctg gcg acc ctg agc  489
Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser
    130                 135                 140
atc tgt atg acg gcc atg atg gcc gcc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg  537
Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met
145                 150                 155                 160
ggt ctt gcc gcc gcc cgg tgg ccg cgg ctg ggg ccg ctc cgg ctg atc  585
Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile
                165                 170                 175
gcg ctc ggc ttt ctg ctc gtc gtg ctc ctc gac atc gcc gag ccg ctg  633
Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu
            180                 185                 190
gtg tcc ttc gcg ggc gtc tcc gtg tgg acg cgg gca gtg ccc gag ctg  681
Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu
        195                 200                 205
acc atc tgg agt ggg cac tgg tat cag ttc ccg ctg tat cag atg gtg  729
Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val
    210                 215                 220
gct tcg gcg ctc ttc ggc gcc tct ttg ggg gcc gcg cgc cac ttt cgc   777
Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg
225                 230                 235                 240
aac cgg cgc ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gcc ctc cta ccg   825
Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro
                245                 250                 255
gag ggc ccg agg cca tgg gtc cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc   873
Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
            260                 265                 270
aac atc agc atc gcc ctc tac acc ggc gca cac ggc gca cac atc ctg   921
Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu
        275                 280                 285
ttc tcg ctg atg gac ggc gct ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc   969
Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe
    290                 295                 300
cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg tacccgatgt      1020
Arg Pro Ala Ala Gly Tyr
305                 310
gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080
catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140
gcggccgggg                                                        1150
<210>4
<211>310
<212>PRT
<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)
<400>4
Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val
  1               5                  10                  15
Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly
             20                  25                  30
Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu
         35                  40                  45
Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val
     50                  55                  60
Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu
 65                  70                  75                  80
Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln
                 85                  90                  95
Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn
            100                 105                 110
Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln
        115                 120                 125
Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser
    130                 135                 140
Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met
145                 150                 155                 160
Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile
                165                 170                 175
Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu
            180                 185                 190
Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu
        195                 200                 205
Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val
    210                 215                 220
Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro
                245                 250                 255
Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
            260                 265                 270
Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu
        275                 280                 285
Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe
    290                 295                 300
Arg Pro Ala Ala Gly Tyr
305                 310
<210>5
<211>215
<212>PRT
<213>灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)
<400>5
Val Ile Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Val Leu Gln Val
  1               5                  10                  15
Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp
             20                  25                  30
Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg Ile Ile Asp
         35                  40                  45
Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe
     50                  55                  60
Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala
 65                  70                  75                  80
Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met
                 85                  90                  95
Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala
            100                 105                 110
Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro
        115                 120                 125
Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr
    130                 135                 140
Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gln Val Met Ser Arg Val Arg
145                 150                 155                 160
Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gln Leu Val Gly Leu Ala Phe
                165                 170                 175
Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe Ile Ser Phe Ala
            180                 185                 190
Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg
        195                 200                 205
Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg
    210                 215
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>6
tcacgaaacc ggacacac                                               18
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>7
catgatcgct gaaccgag                                               18
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>8
ggttccggat gccgttctcg                                             20
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>9
aactccggtc gactcccctt c                                           21
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>10
gcaaggatac ggggactac                                              19
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>11
gaaccgaccg cctgatac                                               18
<210>12
<211>43
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>12
gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg                   43
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>13
ggaaccgacc gcctgataca                                             20
<210>14
<211>46
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>14
gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc                46
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>15
ggaacatcac ggcattcacc                                             20
<210>16
<211>46
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>16
gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgttc                46

Claims (14)

1.一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因，或质粒pSE186(ATCC 209604)上的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列，或图1(SEQ ID NO：1)所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或其简并变体，但该核苷酸序列还包含突变，所述突变编码相应于SEQ ID NO：2氨基酸位置上的氨基酸残基的取代组合，所述突变使得除虫链霉菌ATCC 53692株中，野生型aveC等位基因已失活但能表达含所述突变型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞能产生除虫菌素，且所产生的除虫菌素中2类∶1类的比例相对于除虫链霉菌ATCC 53692株中仅表达野生型aveC等位基因的那些细胞所产生的比例而言降低，其中当所述2类∶1类除虫菌素为环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述2类∶1类除虫菌素的比例为0.35∶1或更低。
2.权利要求1的多核苷酸分子，其中所述环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例为0.20∶1或更低。
3.权利要求1的多核苷酸分子，其中所述氨基酸取代组合包括选自下组的组合：
(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；
(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；
(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；
(f)D48E，L136P，G179S，E238D；
(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；
(h)D48E，A61T，L136P，G179S；
(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；
(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；
(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；
(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；
(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；
(q)D48E，L136P，G179S，R250W；
(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；
(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；
(t)D48E，F78L，A89T，L136P，G179S；
(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F278L；
(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；
(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R1 63Q，G1 79S，E238D；
(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；
(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；
(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ad)D48E，A61T，A89T，F99S，S138T，A139T，G179S，E238D；
(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；
(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；
(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；
(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；
(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；
(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F234S；
(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(an)D48E，A89T，S138T，G179S；
(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；
(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；
(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；
(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；
(au)D48E，A89T，L136P，G179S；
(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；
(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；
(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；
(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；
(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；
(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；
(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；
(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和
(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。
4.一种多核苷酸分子，其含有与除虫链霉菌aveC等位基因，质粒pSE186(ATCC 209604)上除虫链霉菌AveC基因产物编码序列，或图1(SEQID NO：1)所示除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或其简并变体，但该核苷酸序列还包含突变，所述突变编码相应于SEQ IDNO：2氨基酸位置上的氨基酸残基的取代组合，所述突变使得除虫链霉菌ATCC 53692株中野生型aveC等位基因已失活但能表达含所述突变型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些细胞能产生除虫菌素，且所产生的除虫菌素中2类：1类的比例相对于由除虫链霉菌ATCC 53692株中仅表达野生型aveC等位基因的那些细胞所产生的比例降低，其中当所述2类∶1类除虫菌素为环己基B2∶环己基B1除虫菌素时，所述2类∶1类除虫菌素的比例降低到约0.40∶1或更低，且其中所述氨基酸取代的组合包含选自下组的组合：
(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和
(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
5.一种宿主细胞，其含有权利要求1或4的多核苷酸分子。
6.一种产生除虫链霉菌菌株的方法，包括：(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的aveC等位基因突变，所述突变导致AveC基因产物中的氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码包含氨基酸取代组合的AveC基因产物，所述AveC基因产物中的氨基酸取代组合包含选自下组的组合：
(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；
(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；
(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；
(f)D48E，L136P，G179S，E238D；
(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；
(h)D48E，A61T，L136P，G179S；
(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；
(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；
(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；
(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；
(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；
(q)D48E，L136P，G179S，R250W；
(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；
(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；
(t)D48E，F78L，A89T，L136P，G179S；
(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F278L；
(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；
(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；
(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；
(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ad)D48E，A61T，A89T，F99S，S138T，A139T，G179S，E238D；
(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；
(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；
(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；
(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；
(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；
(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F234S；
(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(an)D48E，A89T，S138T，G179S；
(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；
(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；
(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；
(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；
(au)D48E，A89T，L136P，G179S；
(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；
(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；
(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；
(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；
(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；
(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；
(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；
(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和
(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。
7.一种产生除虫链霉菌菌株的方法，包括：(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的aveC等位基因突变，所述突变导致AveC基因产物中的氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码包含氨基酸取代组合的AveC基因产物，所述包含突变的aveC等位基因或其简并变体的细胞能以0.35∶1或更低的比例产生环己基B2∶环己基B1除虫菌素。
8.权利要求7的方法，其中所述氨基酸取代组合包括选自下组的组合：
(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；
(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；
(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；
(f)D48E，L136P，G179S，E238D；
(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；
(h)D48E，A61T，L136P，G179S；
(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；
(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；
(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；
(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；
(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；
(q)D48E，L136P，G179S，R250W；
(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；
(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；
(t)D48E，F78L，A89T，L136P，G179S；
(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F278L；
(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；
(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；
(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；
(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ad)D48E，A61T，A89T，F99S，S138T，A139T，G179S，E238D；
(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；
(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；
(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；
(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；
(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；
(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F234S；
(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(an)D48E，A89T，S138T，G179S；
(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；
(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；
(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；
(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；
(au)D48E，A89T，L136P，G179S；
(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；
(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；
(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；
(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；
(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；
(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；
(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；
(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和
(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D 。
9.权利要求7的方法，其中所述环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例为约0.20∶1或更低。
10.一种产生除虫链霉菌菌株的方法，包括：(i)使除虫链霉菌菌株的细胞中的aveC等位基因突变，所述突变导致AveC基因产物中的氨基酸取代组合，或(ii)向除虫链霉菌菌株的细胞中引入突变的aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码包含氨基酸取代组合的AveC基因产物，且其中所述氨基酸取代组合包含选自下组的组合：
(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和
(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
11.一种含有突变的除虫链霉菌aveC等位基因或其简并变体的链霉菌细胞，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自下组的氨基酸取代组合的AveC基因产物：
(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；
(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；
(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；
(f)D48E，L136P，G179S，E238D；
(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；
(h)D48E，A61T，L136P，G179S；
(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；
(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；
(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；
(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；
(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；
(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；
(q)D48E，L136P，G179S，R250W；
(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；
(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；
(t)D48E，F78L，A89T，L136P，G179S；
(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F278L；
(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；
(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；
(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；
(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；
(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；
(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ad)D48E，A61T，A89T，F99S，S138T，A139T，G179S，E238D；
(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；
(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；
(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；
(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；
(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；
(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F234S；
(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；
(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；
(an)D48E，A89T，S138T，G179S；
(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；
(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；
(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；
(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；
(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；
(au)D48E，A89T，L136P，G179S；
(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；
(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；
(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；
(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；
(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；
(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；
(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；
(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；
(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和
(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。
12.权利要求11的细胞，其为除虫链霉菌细胞。
13.一种链霉菌细胞，其含有突变的除虫链霉菌aveC等位基因或其简并变体，所述突变的aveC等位基因或其简并变体编码含有选自下组的氨基酸取代组合的AveC基因产物：
(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和
(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
14.一种由除虫链霉菌细胞产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的组合物，所述组合物在培养了细胞的培养基中含有环己基B2∶环己基B1除虫菌素，且该培养基中的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例为0.35∶1或更低。
CN038037416A 2002-02-12 2003-01-31 指导b2:b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因 Expired - Lifetime CN1630712B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35622202P 2002-02-12 2002-02-12
US60/356,222 2002-02-12
PCT/IB2003/000348 WO2003068955A2 (en) 2002-02-12 2003-01-31 Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011102082591A Division CN102392028B (zh) 2002-02-12 2003-01-31 指导b2:b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1630712A true CN1630712A (zh) 2005-06-22
CN1630712B CN1630712B (zh) 2011-09-28

Family

ID=27734621

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011102082591A Expired - Lifetime CN102392028B (zh) 2002-02-12 2003-01-31 指导b2:b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因
CN038037416A Expired - Lifetime CN1630712B (zh) 2002-02-12 2003-01-31 指导b2:b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011102082591A Expired - Lifetime CN102392028B (zh) 2002-02-12 2003-01-31 指导b2:b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因

Country Status (26)

Country Link
US (2) US7388085B2 (zh)
EP (2) EP1476539B1 (zh)
JP (1) JP2005517406A (zh)
KR (1) KR100718378B1 (zh)
CN (2) CN102392028B (zh)
AR (1) AR038405A1 (zh)
AT (2) ATE426659T1 (zh)
AU (1) AU2003245052B2 (zh)
BR (1) BRPI0307620B8 (zh)
CA (1) CA2475214C (zh)
CY (2) CY1110454T1 (zh)
DE (1) DE60326824D1 (zh)
DK (2) DK1476539T3 (zh)
ES (2) ES2321827T3 (zh)
HK (2) HK1074644A1 (zh)
IL (3) IL162866A0 (zh)
ME (1) ME00472B (zh)
MX (1) MXPA04007777A (zh)
PL (1) PL211693B1 (zh)
PT (2) PT1476539E (zh)
RS (1) RS50813B (zh)
RU (1) RU2293117C2 (zh)
SI (2) SI1476539T1 (zh)
TW (1) TWI341330B (zh)
WO (1) WO2003068955A2 (zh)
ZA (1) ZA200405345B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102093997A (zh) * 2010-12-01 2011-06-15 中国科学院上海有机化学研究所 一种改造除虫链霉菌产生多拉菌素的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2293117C2 (ru) * 2002-02-12 2007-02-10 Пфайзер Продактс Инк. Ген streptomyces avermitilis и его применение для изменения соотношения авермектинов b2:b1
CN102241750B (zh) * 2010-05-14 2014-05-28 中国科学院微生物研究所 一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株
CN109576196B (zh) * 2019-01-25 2022-01-04 北大方正集团有限公司 一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE434277B (sv) 1976-04-19 1984-07-16 Merck & Co Inc Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis
US4429042A (en) 1978-09-08 1984-01-31 Merck & Co., Inc. Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds
IN167980B (zh) 1987-01-23 1991-01-19 Pfizer
US5252474A (en) 1989-03-31 1993-10-12 Merck & Co., Inc. Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
RO115884B1 (ro) * 1993-10-05 2000-07-28 Pfizer Derivati de doramectin, procedeu de preparare, metoda de tratare
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6248579B1 (en) * 1998-02-13 2001-06-19 Pfizer Inc Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
NZ518657A (en) * 1998-02-13 2003-10-31 Pfizer Prod Inc Streptomyces hygroscopicus directing the ratio of B2:B1 avermectins
US6197591B1 (en) 1998-09-14 2001-03-06 Pfizer Inc. Streptomyces avermitilis regulatory genes for increased avermectin production
WO2001012621A1 (en) 1999-08-13 2001-02-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated INHIBITORS OF c-JUN N-TERMINAL KINASES (JNK) AND OTHER PROTEIN KINASES
WO2001012821A1 (en) * 1999-08-12 2001-02-22 Pfizer Products Inc. Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins
RU2293117C2 (ru) * 2002-02-12 2007-02-10 Пфайзер Продактс Инк. Ген streptomyces avermitilis и его применение для изменения соотношения авермектинов b2:b1

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102093997A (zh) * 2010-12-01 2011-06-15 中国科学院上海有机化学研究所 一种改造除虫链霉菌产生多拉菌素的方法
CN102093997B (zh) * 2010-12-01 2013-03-13 中国科学院上海有机化学研究所 一种改造除虫链霉菌产生多拉菌素的方法

Also Published As

Publication number Publication date
TWI341330B (en) 2011-05-01
AU2003245052B2 (en) 2008-07-31
ME00472B (me) 2011-10-10
CN102392028A (zh) 2012-03-28
IL162866A (en) 2009-11-18
IL162866A0 (en) 2005-11-20
KR20040081199A (ko) 2004-09-20
ES2321827T3 (es) 2009-06-12
IL192371A0 (en) 2008-12-29
TW200303918A (en) 2003-09-16
CN102392028B (zh) 2013-08-14
ATE530645T1 (de) 2011-11-15
WO2003068955A3 (en) 2003-11-13
EP2050815B1 (en) 2011-10-26
RS50813B (sr) 2010-08-31
RU2004124521A (ru) 2005-04-10
PT1476539E (pt) 2009-04-09
DE60326824D1 (de) 2009-05-07
IL192371A (en) 2010-11-30
WO2003068955A2 (en) 2003-08-21
US8008078B2 (en) 2011-08-30
BRPI0307620B1 (pt) 2015-08-11
BRPI0307620B8 (pt) 2016-09-13
CA2475214A1 (en) 2003-08-21
BR0307620A (pt) 2004-12-07
JP2005517406A (ja) 2005-06-16
PL211693B1 (pl) 2012-06-29
CY1110454T1 (el) 2015-04-29
PL371320A1 (en) 2005-06-13
ES2373629T3 (es) 2012-02-07
AU2003245052A1 (en) 2003-09-04
EP2050815A1 (en) 2009-04-22
ATE426659T1 (de) 2009-04-15
EP1476539B1 (en) 2009-03-25
HK1168383A1 (en) 2012-12-28
PT2050815E (pt) 2012-01-02
AR038405A1 (es) 2005-01-12
SI1476539T1 (sl) 2009-06-30
CY1112491T1 (el) 2015-12-09
US20030166165A1 (en) 2003-09-04
EP1476539A2 (en) 2004-11-17
CN1630712B (zh) 2011-09-28
SI2050815T1 (sl) 2012-01-31
US20090017508A1 (en) 2009-01-15
ZA200405345B (en) 2005-06-14
HK1074644A1 (en) 2005-11-18
MXPA04007777A (es) 2004-10-15
DK1476539T3 (da) 2009-05-11
CA2475214C (en) 2012-07-31
US7388085B2 (en) 2008-06-17
DK2050815T3 (da) 2011-12-12
RU2293117C2 (ru) 2007-02-10
RS70004A (en) 2006-10-27
KR100718378B1 (ko) 2007-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1295336C (zh) 利用微生物生产类异戊二烯化合物的方法和检测具有抗菌或除草活性的化合物的方法
CN1227362C (zh) 生产刺糖噻杀虫剂所用的生物合成基因
CN1633237A (zh) 新的产生spinosyn的聚酮合酶
CN1644696A (zh) 编码黄酮合酶的基因
CN1777681A (zh) Sqs基因
CN1263855C (zh) 来自淡青链霉菌的假寡糖生物合成基因的分离及其应用
CN1186447C (zh) 介导除虫菌素b2:b1比例的除虫链霉菌基因
CN1231591C (zh) 通过发酵棒状细菌生产l－氨基酸的方法
CN1186446C (zh) 介导除虫菌素b2:b1比例的除虫链霉茵基因
CN1104502C (zh) 编码阿佛曼链霉菌支链α－酮酸脱氢酶复合体的基因
CN1676607A (zh) 为抗生素的生物合成从蓝灰链霉菌非产蓝亚种中克隆基因及其使用方法
CN1521180A (zh) 介导除虫菌素b2：b1比例的除虫链霉菌基因
CN1630712A (zh) 指导b2∶b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因
CN1181203C (zh) 对鳞翅目与鞘翅目昆虫高毒力的Bt基因、表达载体和工程菌
CN1252440A (zh) 用于提高除虫菌素产量的阿维链霉菌调节基因
CN1350586A (zh) 经扩增gnd基因发酵制备L－氨基酸的方法
CN100347190C (zh) 编码rpsL基因的核苷酸序列
CN1720329A (zh) 来自红球菌属的新表达系统
CN1056189C (zh) 编码阿凡曼链霉菌支链α－酮酸脱氢酶复合物的基因
CN1387566A (zh) 环状缩肽合成酶及其基因、以及环状缩肽的大规模生产系统
CN100347302C (zh) 尼可霉素生物合成调控基因及其编码蛋白与表达工程菌
CN1192107C (zh) 从带小棒链霉菌分离的5s棒烷基因及其在棒酸生产中的应用
CN1906291A (zh) 用扩增zwf基因制备L－氨基酸的方法
CN1350589A (zh) 经扩增tkt基因发酵制备L－氨基酸的方法
CN1730661A (zh) 通过阻断负调控基因提高格尔德霉素发酵产量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1074644

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1074644

Country of ref document: HK

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: PAH AMERICA 15 CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: PFIZER PRODUCTS INC.

Effective date: 20130508

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: ZOETIS P LLC

Free format text: FORMER NAME: PAH AMERICA 15 CO., LTD.

CP03 Change of name, title or address

Address after: New jersey, USA

Patentee after: Zotis P LLC

Address before: American New York

Patentee before: PAH USA 15 LLC

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20130508

Address after: American New York

Patentee after: PAH USA 15 LLC

Address before: American Connecticut

Patentee before: Pfizer Products Inc.

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SHUOTENG SERVICE LLC

Free format text: FORMER OWNER: ZOETIS P LLC

Effective date: 20150826

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20150826

Address after: New jersey, USA

Patentee after: Zoetis Services LLC

Address before: New jersey, USA

Patentee before: Zotis P LLC

CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20110928

CX01 Expiry of patent term