CN1730661A - 通过阻断负调控基因提高格尔德霉素发酵产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用分子生物学操作技术、通过阻断生物合成调控基因提高抗生素产量的方法，具体来讲，就是在获得gdm RII基因的基础上，构建gdm RII基因阻断重组载体，筛选获得gfm RII基因阻断变株，再进行gdm RII基因阻断变株发酵产量的检测，实验结果证明，gdm RII基因为一个负调控基因，将其阻断后，可以提高格尔德霉素的发酵产量近60％，为其工业化生产创造了有利条件，并在宏观层面上，为提高抗生素产量展现了良好前景。

Description

通过阻断负调控基因提高格尔德霉素发酵产量的方法

技术领域：

本发明涉及利用分子生物学操作技术、通过阻断生物合成调控基因提高抗生素产量的方法。

背景技术：

吸水链霉菌17997(Streptomyces hygrocopicus 17997)是中国医学科学院医药生物技术研究所从中国土壤中分离到的，经鉴定其发酵产物为格尔德霉素(geldanamycin，GDM)，该抗生素具有抗肿瘤和广谱抗病毒的作用。近年研究显示，GDM可以特异性抑制热休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)的功能。Hsp90是许多信号蛋白的伴侣分子，GDM通过对Hsp90的抑制，可以间接影响细胞内信号蛋白的功能，因此GDM是一种很有潜力的抗肿瘤和抗病毒药物。吸水链霉菌17997产生GDM的过程诸如微生物次级代谢产物生物合成，是一个有多种酶参与并极其耗能和消耗底物的生化过程。因此，其合成过程受到非常严格的调控，如当微生物的生长不受限制，能以最佳速度进行时，次级代谢产物的合成一般会受到抑制；只有当生长速度因某种营养因素受限或环境条件不利而减慢时，便引起细胞分化和次级代谢产物的合成。因此，环境因素中过剩的营养往往对次级代谢产物的合成起着负调节作用。适宜的环境因素如温度、pH、溶解氧水平、适度的营养供应等均有利于次级代谢产物的合成。除环境因素对次级代谢产物合成的生理性调节以外，还存在着对不同抗生素生物合成途径所形成的代谢产物的途径特异调控因子。如参与放线紫红素和十一烷基灵红菌素合成的调控基因actII-orf4和redD基因；链霉素产生菌灰色链霉菌中的调节基因strR；棒酸产生菌中的ccaR基因等。它们大多数对生物合成是正调控基因起着转录激活的作用。对抗生素生物合成起负调节作用的基因比较少见。负调节基因是指该基因的存在不利于生物合成基因的转录与表达。如果将负调控基因破坏，将有利于抗生素的形成。迄今相关的报道有：与次甲基霉素生物合成相关的负调控基因mmyR，参与放线紫红素生物合成的负调控基因actII-orf1，四并菌素生物合成中的负调控基因tcm R等，这些基因均与抗生素的抗性基因连锁，有的与抗生素输出胞外机制相关，它们可能是通过抗性的调节来调控抗生素的产生，从捷达霉素产生菌中也发现了负调控基因iadR2。通过阻断其基因，捷达霉素发酵产量提高了41％。本实验室在研究吸水链霉菌17997格尔德霉素的生物合成基因簇中，通过序列分析比较，发现在基因簇内有两个调节基因gdm RI和gdm RII，属于LuxR家族。在吸水链霉菌NRRL3602中也曾有过类似基因的报道[Rascher A，et al(2003)FEMS Microbiol Lett.218(2)：223-230]。已知LuxR家族的基因在革兰氏阴性菌中普遍存在，是群体感应(Quorum sensing)系统中的受体蛋白，在其N端有ATP/GTP结合结构域WalkerA/B基序，在C端有DNA结合结构域螺旋—转角—螺旋结构域(helix-turn-helix)，分子量比较大。在链霉菌中也发现了LuxR家族的蛋白，如Streptomyces avermitilis MA4680 oligomycin基因簇中olmRI，avermictin基因簇中ave R，Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253的rap H，莫能素产生菌Streptomyces cinnamonensis的mon H，苦霉素产生菌Streptomyces venezuelae的pik D，匹马菌素产生菌Streptomycesnatalensis的pim R等基因编码蛋白。对大多数这类基因的调控方式还不十分清楚，而对苦霉素产生菌Streptomyces venezuelae中pik D调节基因的研究表明，pik D为正调控基因，它参与苦霉素聚酮合酶及其糖苷化的调控，但是不影响羟基化酶的功能，其调控是发生在聚酮合酶PikAI、Pik抗性基因RI和糖苷化基因desI的启动子，而对抗性基因和羟基化酶基因pik C启动子无影响。在Streptomyces natalensis中pim R是调控匹马菌素的正调节基因，激活其合成匹马菌素的相关基因。吸水链霉菌格尔德霉素产生菌中有关两个LuxR家族的调节基因gdm RI和gdm RII的具体功能和调控作用迄今尚未见有报道。本发明通过基因阻断的方法，研究证明gdm RII是一个负调控基因，将该基因破坏后获得的格尔德霉素变株—吸水链霉菌17997-WHLR-2的GDM发酵产量可以提高近60％。本发明的目的在于，通过阻断吸水链霉菌17997中格尔德霉素生物合成负调控基因gdm RII的方法，以提高格尔德霉素的发酵产量。

发明内容：

本发明所说的通过阻断负调控基因gdm RII提高格尔德霉素发酵产量的方法主要包含以下步骤：

1.gdm RII基因的获得与序列分析：利用参与格尔德霉素生物合成的氨甲酰基转移酶(CT)基因序列(Genbank AY179507，gdmN)，设计引物，经PCR获得732bp产物，以此为探针，从S.hygroscopicus 17997基因柯斯质粒文库(本实验室构建)，经菌落杂交、分子杂交及核苷酸序列测定，确定柯斯质粒pCT4中含有gdm RII基因。经同源性比较表明，gdm RII基因产物属于LuxR家族，它们是一族转录调节因子，其C端含有保守的螺旋—旋转—螺旋(helix-turn-helix)与DNA结合域，gdm RII的N端含有ATP结合域(ABC输出)，含有WalkerA/B基序。

2.构建gdm RII基因阻断重组载体：采用基因同源重组原理，通过PCR的方法或利用gdm RII基因序列中的酶切位点分别扩增或克隆两个同源片段，每个片段的大小应基本相符并大于500bp，在两个同源片段中间连入可供选择的标记基因，再将三片段的连接产物克隆到具有另一种选择标记的大肠杆菌及链霉菌穿梭载体pGH112、pKC1139等，构建gdm RII基因阻断载体pGARII。

3.gdm RII基因阻断变株的筛选和获得：将构建的gdm RII基因阻断载体，通过接合转移，导入吸水链霉菌S.hygroscopicus 17997中，获得接合转移子。将接合转移子进行传代培养，根据插入标记和载体上原有标记基因进行筛选，获得gdmRII基因同源基因片段与宿主菌染色体基因双交换的基因阻断菌株。利用PCR的方法，验证gdm RII基因的阻断。

4.gdm RII基因阻断变株发酵产量的检测：gdm RII基因阻断变株进行发酵，其发酵产物经提取后用HPLC进行检测，结果表明，基因阻断株GDM发酵产量提高近60％，证明gdm RII基因为GDM生物合成负调控基因，其阻断后有利于GDM的形成。

发明效果：

本发明通过实验首次证明，gdm RII基因为GDM生物合成负调控基因，通过阻断吸水链霉菌17997中格尔德霉素生物合成负调控基因gdm RII，可以提高格尔德霉素的发酵产量近60％，为格尔德霉素的工业化生产创造了有利条件，也在利用分子生物学操作技术、通过阻断生物合成调控基因提高抗生素产量的理论与实践方面探索和拓宽了一条新路。

附图说明：

图1.以吸水链霉菌17997基因组DNA为模板，用CT引物PCR扩增产物电泳图

其中：

1-DL：DL2000DNA分子量标准

2-PCR产物

图2.gdm RII基因阻断载体的构建

图3.gdm RII基因阻断变株PCR验证结果

其中：

M-DNA分子量标准DNA MakerIII

1-17997原株对照

2-gdm RII基因阻断变株17997-WHLR-2

图4.gdm RII基因阻断变株发酵产物GDM的HPLC检测

其中：

A-17997原株对照

B-gdm RII基因阻断变株17997-WHLR-2

HPLC中保留时间在25min左右的主峰为GDM

具体实施方案：

以下实施例对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，其目的是为进一步加深对本发明的理解。

实施例1

gdm RII基因的获得与序列分析：

根据Genbank AY179507，以格尔德霉素生物合成相关的氨甲酰基转移酶基因gdm N序列编码蛋白的保守区设计引物：

上游引物1：5’CCG GAATTCTGGGCCACCGCAGCATCGTC 3’

下游引物2：5’CCG GAATTCTGAGGAACCGCTGCTCCCAC 3’

(划线部分为便于克隆加入的的EcoRI酶切位点)

以吸水链霉菌17997的基因组DNA为模板，经PCR反应扩增出732bp目的条带(图1)。以此为探针，通过与吸水链霉菌17997基因柯斯文库菌落杂交和Southern分子杂交，将gdm N基因定位在6个柯斯质粒pCT1-6上，对柯斯质粒pCT4的外源片段所含基因序列进行测序，从中发现含有完整的gdm RII基因。该基因由2784bp(SEQ ID No1)组成，编码927个氨基酸的蛋白序列(SEQ ID No2)。经过同源性比较，本发明从链霉菌17997中所获得的Gdm RII与Streptomyceshygroscopicus NRRL3602中的Gdm RII一致性为90％。

实施例2

构建gdm RII基因阻断载体：

引物设计：根据gdm RII基因序列，设计两对引物

上游引物3：5’-CCG GAATTCTTCACCGAGCAGGAGGAC-3’

下游引物4：5’-CTAG TCTAGATCCAATGGCTCAGCAAGTC-3’

上游引物5：5’-AAA CTGCAGTCATGGTCGCCGGAGCT-3’

下游引物6：5’-CCG GAATTCCGCCGCACAGCAGAAAG-3’

(划线部分为加入的克隆位点：EcoRI、XbaI、PstI位点)

以链霉菌17997为模板，通过PCR的方法，用primer3和4扩增出带有EcoRI和XbaI位点1200bp的gdm RII上游同源基因片段，用primer5和6扩增出另外一段带有PstI和EcoRI 1000bp的gdm RII下游同源基因片段。在gdm RII上、下游两个同源基因片段之间，通过XbaI和PstI位点，插入阿泊拉霉素(apramycin，Am)抗性基因(1500bp)片段，并通过EcoRI位点将此三个基因片段与pGH112载体(含有硫链丝菌素抗性，tsr^R)[购自中国科学院微生物研究所，菌种保藏中心]相连，得到pGARII重组载体(图2)。

实施例3

gdm RII基因阻断变株的筛选与获得：

将构建好的重组载体pGARII转化到含辅助质粒的大肠杆ET12567/pUZ8002[购自英国John Innes Centre，网址www.jic.ac.uk]中，以载体pGH112上的Am^r为筛选标记，从筛选到的Am^r转化子中提取质粒，验证其分子量大小。将含pGARII重组载体的大肠杆菌ET12567/pUZ8002与链霉菌17997成熟孢子混合，涂布在MS平板培养基(甘露醇2％，黄豆粉2％，琼脂2％)上28℃共培养。次日，用含有Am(50ug/ml)和萘啶酸(100ug/ml)的无菌水覆盖MS平板。将Am^r接合转移子在含有Am抗性的MY培养基(葡萄糖0.4％，酵母膏0.4％，麦芽浸膏1％，琼脂2％)中传代培养。确证其为阿泊拉霉素抗性接合转移子，然后在不含Am抗性的MY培养基中传代数次，使重组载体pGARII上的gdm RII基因的两个同源基因片段与链霉菌17997染色体发生双交换，表现为载体pGH112上硫链丝菌素抗性、tsr^R的丢失。通过接合转移子Am^r和Tsr^s的筛选，获得gdm RII基因阻断变17997-WHLR-2。提取gdm RII基因阻断变株17997-WHLR-2总DNA，以引物3和6进行PCR反应(图3)。由图3可见，17997-WHLR-2变株中由于在gdm RII基因中插入了Am^r基因，故其PCR产物比原株大1500bp。由此证明17997-WHLR-2为gdm RII基因阻断变株。

实施例4

gdm RII基因阻断变株的GDM发酵产量检测：

将gdm RII基因阻断变株—链霉菌17997-WHLR-2涂布在加有Am(50ug/ml)的MY培养基上，在28℃恒温箱中培养7天后，接种到种子培养基(葡萄糖1％，酵母浸膏0.4％，玉米浆0.5％，棉子饼粉0.5％，KH₂PO₄0.05％，MgSO₄0.05％，CaCO₃0.3％)，在28℃的摇床培养24-28h后，转种到发酵培养基(淀粉2％，棉子饼粉0.5％，葡萄糖0.5％，玉米浆0.5％，酵母粉0.5％，CaCO₃ 0.2％)，28℃的摇床发酵培养5天，用乙酸己酯萃取发酵培养物的上清，提取物进行HPLC检测(图4)。该变株进行了3批次发酵、提取和HPLC重复实验。由图4可以清楚地看到，原株GDM产量在HPLC检测中所占峰面积为45.1％(图4A)，gdm RII基因阻断变株17997--WHLR-2的GDM产量峰面积为76.2％(图4B)，GDM产量提高值达59.2％。

本发明通过实验首次证明，gdm RII基因为GDM生物合成负调控基因，通过阻断吸水链霉菌17997中格尔德霉素生物合成负调控基因gdm RII，可以提高格尔德霉素的发酵产量。

                       序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>通过阻断负调控基因提高格尔德霉素发酵产量的方法

<160>2

<210>1

<211>2784

<212>DNA

<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)(2784)

<400>

atgcccttca gctatgccat gccggtgaat accgagcgga attcccatcc gatggacacg    60

gtattgaatg ccgcggcgca cctcggacac gcgttcggtg actctttggt gcggcccggg    120

caggctcttc tcctggacgg accgctggca tgcggtaaga ccaccctgct ccggtcgttc    180

gccgagcggg ccgcggcggc cggccggctc gtcatcacgg cgacgtgttc tccctgcgag    240

cgggatcttc ccttcggtgt cgtctcccaa ctggcccgcg gcgcccggaa gtcagcgggc    300

gggccgcccg aggtgccggg gctgccggac atcctccgcg ggaccagcga cccggtggac    360

cgggccgaga tcgcccggct gtgccatcgg ctgtgcacct tgctgatcga ctacgcggaa    420

cacaccccgc tgctgctcgc cgtggacgat gtgcgccaca gcgatccggc ctccgcgcac    480

ttcctcctcc aactggtgcg gcggctggac tcggcacgga tcgccgccgt gttcaccgac    540

gatctgagcc tgcccgcgcc caccctgccg ctccgctacg aactgctgcg ctcccagcgc    600

ctgcaccgga tcggcctcgg cccgctcacc cccgacgagg tggccgacgt ggtcgtggcg    660

gagctggggg agaccgcgag cccccgcgcc ggcgatgtct acgccgccac cggtggcaac    720

cggctgctgc tgcacaccct gctggccgac taccgcgagc acggcgaggc ccgccagacc    780

ggctatggcc agtccttcct gagctgtctg caccgcaatg agccgatctt cctggacgtg    840

gtgcgcgcgc tggccgtggt gggcttctcc ttgcccgcca ccgacctggc ctggctgacc    900

ggacacgagc ccgagcccat cggccaggtg ctggcggcgc tgaccggcgc cggactgatg    960

gacgagggcg cgttccggca ggaggcggcg cggctgagcg tgctcaacga cacgccggcg    1020

ctgacccgca ggaccctgca ccagcgggcc gcgcggctgc tgcacgacca gggcaggccc    1080

gccaccacga tcgcccgtca tctggtgcgg gccgggcgga tccccgattc atggtcgccg    1140

gagctgctgc tggaagtggc cgagcaggtc gcggtgggcg aagaggcgtc cgtcgccgtc    1200

gacttactgg agcagtccct cgaacagtgt ccgcaccagg agcggcgcgc cgccttgcag    1260

gcgaagctcg ccgaggcgga atggaagatc aacccgtcca ccgccacccg gcaccacaca    1320

ccgctgtacg gcgccgtccg ggccggccgg ctcggcctcc ccgacagcgt caccctgctc    1380

atgcagctgc tgtggaaggg cgggctgacc gaggtggagg ggctgctcgc ccatctgcgc    1440

gaggaccccg ccgccaccga ccagctccat gccatcgagg ccgcgctcac ctgcacctac    1500

ccctggctcg cggagcggcg gccggccccg gcgcaccacg gtggctccgc cgcgacgcgg    1560

gcggcggtgt ggccgcgggc cggcaccgta ctcgcggacg tgctcaccgg cgggcagacc    1620

catgacaccg tccggcgggc cgaggaggtg ctgcgcgaac tccagctcgg gcacgacccg    1680

gcgtgccagg agcaggccgg gctgttcgcc ctgctcgcgc tggtctacgg cggccggatc    1740

gacctggcgt ccgcatggtg cgagggggcg ctcggcgaga ccggcgcggg gccgcacgtc    1800

ccgatgcggc aggcggtgct ggcggcggcc aggtcggaga tcgcgctgcg ccgaggtgac    1860

ctcgccgagg ccgcggagcg gtcccgggcc gccctcaccc acgcctctcc cggcgcctgg    1920

ggtgtcgcgg tcgggctgcc gctcggctcc ctgatcctgg cgtgtacgcg gatgggccgg    1980

cacgaggagg cggggttcca cgtcgcgcag accgtgccca acgccatgtt caaaagctcc    2040

tacgggctgc actacctgta cgcgcgcggc cactacttcc tggcggccgg ccggcaccag    2100

gccgcgctcg cggactttct gctgtgcggc gagctgctca ccgactgggg gctgagcagc    2160

ggctgcgacc cggtgccatg gcggatcggc gcggcggagg catggctcgc gcagggcaac    2220

cacgaccagg cccggatcct ggtctaccag cagctcagcc gtccgcatac ggacggcgcc    2280

cgggcccgcg ggcagtcctt gcgcctcctg gccgccacca gctcggccaa gcggcggccg    2340

cagctgctca acgaggcggt gggcctgttc accgagcagg aggacaagta cgagctggct    2400

cgcacgctgt gggacctcag ccaggcgtac cacgcgctcg gcgagaagaa gcaggcccgc    2460

cggaccatgc gccgggcctg gcatgtggcg aagatgtgcg acgccgcgtc gctgtacgag    2520

gagtggctgc cggccgacga ccagtcccag gccgtggcgc cggctccgaa ggcggacgcc    2580

gggatcgagc ggttgacgca ctccgaacgg cgtgtcgcgt cgctggccgc catgggctac    2640

accaaccggg agatcgccgg gaagctgtat gtcacggcca gcacggtgga gcagcatctg    2700

acccgggtct tccgcaagct ggacatcaag caccgggagc agctgcccac cgaactctac    2760

gcggaccgca tggagttggc gtga                                           2784

<210>2

<211>927

<212>PRT

<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)

<220>

<400>

Met Pro Phe Ser Tyr Ala Met Pro Val Asn Thr Glu Arg Asn Ser His

1               5                   10                  15

Pro Met Asp Thr Val Leu Asn Ala Ala Ala His Leu Gly His Ala Phe

            20                  25                  30

Gly Asp Ser Leu Val Arg Pro Gly Gln Ala Leu Leu Leu Asp Gly Pro

        35                  40                  45

Leu Ala Cys Gly Lys Thr Thr Leu Leu Arg Ser Phe Ala Glu Arg Ala

    50                  55                  60

Ala Ala Ala Gly Arg Leu Val Ile Thr Ala Thr Cys Ser Pro Cys Glu

65                  70                  75                  80

Arg Asp Leu Pro Phe Gly Val Val Ser Gln Leu Ala Arg Gly Ala Arg

                85                  90                  95

Lys Ser Ala Gly Gly Pro Pro Glu Val Pro Gly Leu Pro Asp Ile Leu

            100                 105                 110

Arg Gly Thr Ser Asp Pro Val Asp Arg Ala Glu Ile Ala Arg Leu Cys

        115                 120                 125

His Arg Leu Cys Thr Leu Leu Ile Asp Tyr Ala Glu His Thr Pro Leu

    130                 135                 140

Leu Leu Ala Val Asp Asp Val Arg His Ser Asp Pro Ala Ser Ala His

145                 150                 155                 160

Phe Leu Leu Gln Leu Val Arg Arg Leu Asp Ser Ala Arg Ile Ala Ala

                165                 170                 175

Val Phe Thr Asp Asp Leu Ser Leu Pro Ala Pro Thr Leu Pro Leu Arg

            180                 185                 190

Tyr Glu Leu Leu Arg Ser Gln Arg Leu His Arg Ile Gly Leu Gly Pro

        195                 200                 205

Leu Thr Pro Asp Glu Val Ala Asp Val Val Val Ala Glu Leu Gly Glu

    210                 215                 220

Thr Ala Ser Pro Arg Ala Gly Asp Val Tyr Ala Ala Thr Gly Gly Asn

225                 230                 235                 240

Arg Leu Leu Leu His Thr Leu Leu Ala Asp Tyr Arg Glu His Gly Glu

                245                 250                 255

Ala Arg Gln Thr Gly Tyr Gly Gln Ser Phe Leu Ser Cys Leu His Arg

            260                 265                 270

Asn Glu Pro Ile Phe Leu Asp Val Val Arg Ala Leu Ala Val Val Gly

        275                 280                 285

Phe Ser Leu Pro Ala Thr Asp Leu Ala Trp Leu Thr Gly His Glu Pro

    290                 295                 300

Glu Pro Ile Gly Gln Val Leu Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gly Leu Met

305                 310                 315                 320

Asp Glu Gly Ala Phe Arg Gln Glu Ala Ala Arg Leu Ser Val Leu Asn

                325                 330                 335

Asp Thr Pro Ala Leu Thr Arg Arg Thr Leu His Gln Arg Ala Ala Arg

            340                 345                 350

Leu Leu His Asp Gln Gly Arg Pro Ala Thr Thr Ile Ala Arg His Leu

        355                 360                 365

Val Arg Ala Gly Arg Ile Pro Asp Ser Trp Ser Pro Glu Leu Leu Leu

    370                 375                 380

Glu Val Ala Glu Gln Val Ala Val Gly Glu Glu Ala Ser Val Ala Val

385                 390                 395                 400

Asp Leu Leu Glu Gln Ser Leu Glu Gln Cys Pro His Gln Glu Arg Arg

                405                 410                 415

Ala Ala Leu Gln Ala Lys Leu Ala Glu Ala Glu Trp Lys Ile Asn Pro

            420                 425                 430

Ser Thr Ala Thr Arg His His Thr Pro Leu Tyr Gly Ala Val Arg Ala

        435                 440                 445

Gly Arg Leu Gly Leu Pro Asp Ser Val Thr Leu Leu Met Gln Leu Leu

    450                 455                 460

Trp Lys Gly Gly Leu Thr Glu Val Glu Gly Leu Leu Ala His Leu Arg

465                 470                 475                 480

Glu Asp Pro Ala Ala Thr Asp Gln Leu His Ala Ile Glu Ala Ala Leu

                485                 490                 495

Thr Cys Thr Tyr Pro Trp Leu Ala Glu Arg Arg Pro Ala Pro Ala His

            500                 505                 510

His Gly Gly Ser Ala Ala Thr Arg Ala Ala Val Trp Pro Arg Ala Gly

        515                 520                 525

Thr Val Leu Ala Asp Val Leu Thr Gly Gly Gln Thr His Asp Thr Val

    530                 535                 540

Arg Arg Ala Glu Glu Val Leu Arg Glu Leu Gln Leu Gly His Asp Pro

545                 550                 555                 560

Ala Cys Gln Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ala Leu Leu Ala Leu Val Tyr

                565                 570                 575

Gly Gly Arg Ile Asp Leu Ala Ser Ala Trp Cys Glu Gly Ala Leu Gly

            580                 585                 590

Glu Thr Gly Ala Gly Pro His Val Pro Met Arg Gln Ala Val Leu Ala

        595                 600                 605

Ala Ala Arg Ser Glu Ile Ala Leu Arg Arg Gly Asp Leu Ala Glu Ala

    610                 615                 620

Ala Glu Arg Ser Arg Ala Ala Leu Thr His Ala Ser Pro Gly Ala Trp

625                 630                 635                 640

Gly Val Ala Val Gly Leu Pro Leu Gly Ser Leu Ile Leu Ala Cys Thr

                645                 650                 655

Arg Met Gly Arg His Glu Glu Ala Gly Phe His Val Ala Gln Thr Val

            660                 665                 670

Pro Asn Ala Met Phe Lys Ser Ser Tyr Gly Leu His Tyr Leu Tyr Ala

        675                 680                 685

Arg Gly His Tyr Phe Leu Ala Ala Gly Arg His Gln Ala Ala Leu Ala

    690                 695                 700

Asp Phe Leu Leu Cys Gly Glu Leu Leu Thr Asp Trp Gly Leu Ser Ser

705                 710                 715                 720

Gly Cys Asp Pro Val Pro Trp Arg Ile Gly Ala Ala Glu Ala Trp Leu

                725                 730                 735

Ala Gln Gly Asn His Asp Gln Ala Arg Ile Leu Val Tyr Gln Gln Leu

            740                 745                 750

Ser Arg Pro His Thr Asp Gly Ala Arg Ala Arg Gly Gln Ser Leu Arg

        755                 760                 765

Leu Leu Ala Ala Thr Ser Ser Ala Lys Arg Arg Pro Gln Leu Leu Asn

    770                 775                 780

Glu Ala Val Gly Leu Phe Thr Glu Gln Glu Asp Lys Tyr Glu Leu Ala

785                 790                 795                 800

Arg Thr Leu Trp Asp Leu Ser Gln Ala Tyr His Ala Leu Gly Glu Lys

                805                 810                 815

Lys Gln Ala Arg Arg Thr Met Arg Arg Ala Trp His Val Ala Lys Met

            820                 825                 830

Cys Asp Ala Ala Ser Leu Tyr Glu Glu Trp Leu Pro Ala Asp Asp Gln

        835                 840                 845

Ser Gln Ala Val Ala Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gly Ile Glu Arg

    850                 855                 860

Leu Thr His Ser Glu Arg Arg Val Ala Ser Leu Ala Ala Met Gly Tyr

865                 870                 875                 880

Thr Asn Arg Glu Ile Ala Gly Lys Leu Tyr Val Thr Ala Ser Thr Val

                885                 890                 895

Glu Gln His Leu Thr Arg Val Phe Arg Lys Leu Asp Ile Lys His Arg

            900                 905                 910

Glu Gln Leu Pro Thr Glu Leu Tyr Ala Asp Arg Met Glu Leu Ala

        915                 920                 925     927

Claims (4)

1、通过阻断格尔德霉素生物合成负调控基因gdm RII提高其发酵产量的方法，其特征是所说方法包括以下步骤：

A、gdm RII基因阻断重组载体的构建；

B、gdm RII基因阻断变株的筛选与获得；

C、gdm RII基因阻断变株的GDM发酵产量的检测。

2、如权利要求1所述的方法，其特征是gdm RII基因阻断重组载体的构建，是通过设计PCR引物或利用酶切位点从gdm RII基因取出两个大小相近、分子量不低于500bp的片段，在其中间插入可供选择的标记基因，将这三个基因片段连接到质粒载体如pGH112，构建成用于gdm RII基因阻断的重组载体；

3、如权利要求1所述的方法，其特征是gdm RII基因阻断变株的筛选与获得，是将构建的gdm RII基因阻断重组载体，导入格尔德霉素产生菌，利用插入的标记基因和载体上原有的标记，进行筛选获得在染色体基因发生双交换的gdm RII基因阻断菌株；

4、如权利要求1所述的方法，其特征是gdm RII基因阻断变株的GDM发酵产量检测，是将gdm RII基因阻断菌株进行发酵培养，对发酵产物GDM进行提取和HPLC分析，根据GDM的峰面积检测其发酵产量。

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