CN1256313A - 使用棒状细菌发酵生产d－泛酸的方法 - Google Patents

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Abstract

能在棒状杆菌属微生物中复制的任选重组的DNA,所述DNA得自棒状杆菌属并含有至少一个选自下列的核苷酸序列:a)SEQ ID NO:1所示的编码panB基因(酮泛解酸羟基甲基转移酶)的序列,b)SEQ ID NO:1所示的编码panC基因(泛酸合成酶),尤其是panBC操纵子的序列,和任选地c))SEQ IDNO:4所示的编码ilvD基因(二羟酸脱水酶)的序列。使用棒状杆菌属微生物发酵生产D－泛酸的方法,所述微生物中上述基因被增强。

Description

使用棒状细菌发酵生产D-泛酸的方法
泛酸构成了具有商业价值的维生素，可用于化妆品，药物以及人类和动物的营养品。
泛酸可以化学合成，也可通过生物技术，在适当的营养液中发酵适当的微生物来生产泛酸。利用微生物进行生物技术生产的优点在于形成了所需的立体异构的D型泛酸。
多种类型的细菌，如大肠杆菌，产红棒状杆菌(Corynebacteriumerythrogenes)，产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)以及酵母，如Debaromyces castellii可以如EP-A 0 493 060中所述在含有葡萄糖，DL-泛解酸和β-丙氨酸的营养液中生产D-泛酸。EP-A 0 493060还表明：对大肠杆菌而言，利用质粒pFV3和pFV5扩增生物合成泛酸所用的基因可改良D-泛酸的形成。
EP-A 0 590 857涉及携有多种抗代谢物抗性，并在含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养液中可生产D-泛解酸和D-泛酸的大肠杆菌菌株，所述抗代谢物如水杨酸，α-丁酮酸，β-羟基天冬氨酸等。EP-A 0590 857中还描述了通过扩增得自大肠杆菌的生物合成泛酸所用的基因可改良大肠杆菌中D-泛解酸和D-泛酸的生产，所述基因未经任何详细限定，只知其包含在质粒pFV31中。
WO97/10340中阐明在形成泛酸的大肠杆菌突变体中，通过增加一种缬氨酸生物合成酶，即乙酰羟酸合成酶II的活性可进一步提高泛酸的产量。
发明人自己制订的目标是利用新的基本原理，借助于棒状细菌来改良发酵生产D-泛酸的方法。
维生素泛酸构成了具有商业价值的产物，可用于化妆品，药物以及人类和动物的营养品。因此，人们普遍的兴趣是改良生产泛酸的方法。下文中无论何处提及的D-泛酸或泛酸或泛酸盐，不仅指的是游离的酸，也指D-泛酸的盐，如钙，钠，氨或钾盐。
本发明提供了能在棒状杆菌属微生物中复制的任选重组的DNA，所述DNA得自棒状杆菌属并含有至少一个下列核苷酸序列，所述序列选自：
a)SEQ ID NO：1所示的编码panB基因(酮泛解酸羟基甲基转移酶)的序列，
b)SEQ ID NO：1所示的编码panC基因(泛酸合成酶)，尤其是panBC操纵子的序列，和任选地
c)SEQ ID NO：4所示的编码ilvD基因(二羟酸脱水酶)的序列。
本发明提供了能与上述类似地进行复制的DNA，该DNA含有：
(i)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并性的范围内对应于(i)中各个序列的序列中的至少一个序列或
(iii)与(i)或(ii)中各个序列的互补序列杂交的序列中的至少一个序列，和任选地
(iv)(i)中功能上中性的有义突变。
本发明还提供了通过导入一种或多种可复制的DNA而被转化的棒状微生物，尤其是棒状杆菌属微生物。本发明还提供了使用已经能产生D-泛酸的棒状细菌生产此酸的方法，所述棒状细菌中panB和panC基因或单独或与一个其它基因联合，任选与ilvA基因中的缺损突变或与ilvBN，ilvC或ilvD基因的增强联合被增强，尤其是被过量表达。
本文中所用术语“增强”描述了微生物内因基因拷贝数增加、使用了强的启动子或使用了编码高活性相应酶的基因和任选地联合使用上述手段，使得由相应DNA编码的一种或多种酶的胞内活性增加。
作为本发明主题的微生物可由葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉，纤维素或甘油和乙醇，尤其是从葡萄糖或蔗糖生产泛酸。这是棒状细菌，如棒状杆菌或节杆菌属细菌的问题。对棒状杆菌属而言，应特别地提及谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，已知该菌种形成氨基酸的能力很强。此菌种包括野生型菌株，如谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，黄色短杆菌ATCC14067，Corynebacterium melassecola ATCC17965及其衍生菌株。
本发明人发现新近从谷氨酸棒状杆菌中分别或联合(panBC操纵子)分离的D-泛酸生物合成基因panB(编码酮泛解酸羟基甲基转移酶)和panC(编码泛酸合成酶)增强，尤其是过量表达之后，D-泛酸的生产得以改良。
本发明人还观察到得自谷氨酸棒状杆菌的新的缬氨酸生物合成基因ilvD(编码二羟酸脱水酶)表达的增强能使D-泛酸的产量增加。根据本发明，除了此基因外，编码乙酰羟酸合成酶的ilvBN基因和编码异构还原酶的ilvC基因表达的增强也会使谷氨酸棒状杆菌中D-泛酸的产量增加。
为了达到增强(过量表达)的目的，例如可增加相应基因的拷贝数，或者可突变位于结构基因上游的启动子和调控区域。掺入结构基因上游的表达盒以类似的方式起作用。利用可诱导的启动子，还可以在发酵生产D-泛酸的过程中增强表达。利用延长mRNA寿命的方法同样可以改善表达。另外，通过防止酶蛋白质的降解同样可以增强酶活性。此时，基因或基因构建体或存在于拷贝数不同的质粒载体中，或整合于染色体中并扩增。或者，通过改变培养基的组成和改变控制培养的方式可使所需基因过量表达。本领域技术人员可在下列文献中发现有关指导：Martin等(Bio/Technology 5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EP 0 472 869，美国专利4,601,983，Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))，Reinscheid等(应用和环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246，Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58，191-195(1998))或美国细菌学学会出版的“普通细菌学方法手册”(Washington D.C.，USA，1981)和遗传学，分子生物学的教科书。
为了从谷氨酸棒状杆菌中分离panB和panC基因，首先应在大肠杆菌中建立此微生物的基因库。一般的教科书和手册中描述了基因库的建立，例如，可参见Winnacker所编的教科书：基因和克隆，EineEinführung in die Gentechnologie(Verlag Chemie，Weinheim，德国，1990)或Sambrook等人所编的手册：分子克隆，实验室手册(冷泉港实验室出版社，1989)。已知的基因库是由Kohara等人(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的大肠杆菌K-12菌株W3110的基因库。Bathe等(分子和普通遗传学，252：255-265，1996)描述了谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因库，该基因库是借助于粘粒载体SuperCosI(Wahl等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 84：2160-2164)在大肠杆菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)中建立的。为了在大肠杆菌中产生谷氨酸棒状杆菌基因库，也可使用质粒，如pBR322(Bolivar，生命科学，25，807-818(1979))或pUC19(Norrander等，1983，基因，26：101-106)。特别适合的宿主是限制性缺损和重组缺损的大肠杆菌菌株。例如Grant等(Proc.Natl.Acad.Sci，USA 87(1990)4645-4649)所述的菌株DH5αmcr。
随后，通过转化(Hanahan，分子生物学杂志166，557-580，1983)或电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通讯，123：343-347)将基因库掺入指示菌株。指示菌株的区别特征在于其中的所需基因具有突变，产生了可测的表型，例如辅源营养。指示菌株或突变体可由已公知的来源或原种保藏中心得到，也可自己生产。在本发明的范围内，特别优选的是panC基因携有突变的大肠杆菌突变体DV39(Vallari和Rock，细菌学杂志1985，164：136-142)。另一个需要泛酸的大肠杆菌突变体例子是菌株SJ2，其panB基因携有突变，可得自Yale大学的Genetic Stock Center(New Haven，Connecticut，USA)。另一例是在本发明范围内分离的谷氨酸棒状杆菌突变体R127/7，其编码二羟酸脱水酶的ilvD基因是缺损的。用携有所需基因，如panB基因的重组质粒转化指示菌株，如panB突变体SJ2，并表达所需基因之后，指示菌株在相应的特性，如对泛酸的需求方面变为原养型的。
通过如Sanger等(Proc.Natl.Acad.Sci，USA 74：5463-5467，1977)所述测定序列可鉴定以此方法分离的基因或DNA片段。
使用此方法从谷氨酸棒状杆菌中得到编码panB和panC基因的新DNA序列，即SEQ ID NO：1所示序列，该序列是本发明的组成部分。另外，用上述方法从本发明的DNA序列中得到相应酶的氨基酸序列。SEQ ID NO：2描述的是所得panB基因产物，即酮泛解酸羟基甲基转移酶的氨基酸序列，SEQ ID NO：3描述的是所得panC基因产物，即泛酸合成酶的氨基酸序列。另外，使用此方法从谷氨酸棒状杆菌中得到编码ilvD基因的新DNA序列，即SEQ ID NO：4所示序列，该序列是本发明的组成部分。SEQ ID NO：5描述的是所得ilvD基因产物，即二羟酸脱水酶的氨基酸序列。
利用简并的遗传密码由SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4所得的编码DNA序列同样是本发明的组成部分。同样，与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4杂交的DNA序列也是本发明的组成部分。另外，本领域技术人员熟知保守的氨基酸变化，如在蛋白质中用丙氨酸替代甘氨酸或用谷氨酸替代天冬氨酸作为“有义突变”，这种突变不会导致蛋白质活性发生根本的变化，即该突变在功能上是中性的。另外，蛋白质N-末端和/或C-末端的变化基本上不会损害其功能，或甚至还可使蛋白质稳定化。本领域技术人员可从下列文献中发现有关细节：Ben-Bassat等(细菌学杂志169：751-757(1987))，O’Regan等(基因77：237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3：240-247(1994))，Hochuli等(Bio/Technology 6：1321-1325(1988))和遗传学及分子生物学的教科书。以相应的方法由SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3和/或SEQ ID NO：5得到的氨基酸序列同样是本发明的组成部分。
随后，在适当微生物中单独地表达或与其它基因联合表达以这种方法鉴定的基因。表达或过量表达基因的已知方法为借助于质粒载体扩增所述基因，另外，所述载体可被赋予表达信号。作为质粒载体，应考虑能在相应微生物中复制的载体。例如，对谷氨酸棒状杆菌而言，考虑使用载体pEKEx1(Eikmanns等，基因102：93-98(1991))或pZ8-1(欧洲专利说明书0 375 889)或pEKEx2(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))或pECM2(Jger等，细菌学杂志174(16)：5462-5465(1992))。此种类型质粒的例子是pEKEx2panBC和pECM3ilvBNCD，它们包含在菌株DH5αmcr/pEKEx2panBC和DH5αmcr/pECM3ilvBNCD中。质粒pEKEx2panBC是携有panB和panC基因的大肠杆菌/谷氨酸棒状杆菌穿梭载体。质粒pECM3ilvBNCD是除了携有ilvD基因外，还携有ilvBN和ilvC基因的大肠杆菌/谷氨酸棒状杆菌穿梭载体。
本发明人还发现，单独地，连带地或与ilvBN，ilvC和ilvD基因联合地增强panB和panC基因对苏氨酸和异亮氨酸合成量降低的微生物具有有利的影响。通过减弱或消除相应的生物合成酶或其活性可使合成量降低。为此，可考虑例如高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶，苏氨酸合成酶或甚至苏氨酸脱水酶。减弱或消除酶和其活性的一个可能的方法是诱变方法。
这些方法包括非定向法，该方法使用化学试剂(如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)或UV照射进行诱变，随后筛选需要L-苏氨酸或L-异亮氨酸的所需微生物。引发突变和突变体筛选的方法一般是已知的，可参见Miller(细菌遗传学短期课程，大肠杆菌和相关细菌的实验室指南和手册(冷泉港实验室出版社，1992))或美国细菌学学会出版的“普通细菌学方法手册”(Washington D.C.，USA，1981)。
另外，这些方法也包括定向重组DNA技术。借助于这些方法，可使染色体中编码苏氨酸脱水酶ilvA的基因缺失。用于此目的的适当方法描述于Schfer等(基因(1994)145：69-73)或Link等(细菌学杂志(1998)179：6228-6237)。也可以仅使部分基因缺失，或使苏氨酸脱水酶基因的突变片断被交换。以此方式缺失或交换的结果是苏氨酸脱水酶活性丧失或降低(Mckel等(1994)分子微生物学13：833-842；Morbach等(1996)应用微生物学和生物技术45：612-620)。此类突变体的例子是谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032ΔilvA，其ilvA基因携有缺失。
可用分批法或补料分批法或重复补料分批法连续或不连续地培养根据本发明产生的微生物以生产泛酸。已知培养方法的概要描述于Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
所用培养基应以适当方式满足各个微生物的需求。多种微生物培养基的描述见于美国细菌学学会出版的“普通细菌学方法手册”(Washington D.C.，USA，1981)。作为碳源，可使用糖和碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素；油和脂肪，如豆油，葵花子油，花生油和椰子脂；脂肪酸，如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些物质可以单独使用，也可以以混合物的形式使用。作为氮源，可使用有机含氮化合物，如蛋白胨，酵母提取物，肉汁浸膏，麦芽膏，玉米浸出汁，大豆粉和尿素或无机化合物，如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独使用，也可以以混合物的形式使用。作为磷源，可使用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。培养基中还必须含有生长所必需的金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质外，还可使用必需的生长调节物质，如氨基酸和维生素。另外，为了再增加泛酸的产量，可在培养基中混合加入泛酸的前体，如天冬氨酸，β-丙氨酸；酮异戊酸，酮泛解酸，泛解酸和任选加入它们的盐。可以一次性加足的形式将上述培养基成分加入培养物中，或在培养过程中以适当的方式补料。
为了控制培养物的pH，可以适当的方式使用如氢氧化钠，氢氧化钾，氨水的碱性化合物，或如磷酸或硫酸的酸性化合物。为了控制泡沫，可使用抗泡沫剂，如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可在培养基中加入选择性作用的适当物质，如抗生素。为了维持需氧条件，可在培养物中通入氧气或含氧气的气体混合物，如空气。培养温度一般为20℃-50℃左右，优选为25℃-45℃左右。连续培养直至生产出最高产量的泛酸。一般在10小时-160小时之内即可达到这一目的。
用已知方法可测定所形成泛酸的浓度(Velisek；层析科学60，515-560(1992))。为了对泛酸进行微生物学检测，一般使用植物乳杆菌菌株ATCC8014(U.S.Pharmacopeia 1980；AOAC International1980)。另外，也可以使用其它检测生物，如乳酸片球菌NCIB6990对泛酸浓度进行微生物学检测(Sollberg和Hegna；酶学方法62，201-204(1979))。
根据布达佩斯条约，将下列微生物保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心[Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen](DSMZ，Braunschweig，德国)：
·大肠杆菌K12菌株DH5αmcr/pEKEx2panBC，保藏号为DSM12456
·大肠杆菌K12菌株DH5αmcr/pECM3ilvBNCD，保藏号为DSM12457
·谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ΔilvA，保藏号为DSM12455
图1：pUR1的限制性图谱和测序片断的基因座。图2：质粒pEKEx2panBC的限制性图谱。图3：质粒pECM3ilvBNCD的限制性图谱。
实施例
下文中将根据实施方案的例子更完整地阐明本发明。实施例1从谷氨酸棒状杆菌中克隆，测序和表达泛酸生物合成基因panB和panC1.克隆panB和panC基因
如Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9(1990)84-87)所述分离谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切核酸酶Sau3A切割。凝胶电泳分离之后，提取大小范围为3-7kb和9-20kb的DNA片断，再连接到载体pBR322唯一的BamHI界面上。用连接物转化(Hanahan，分子生物学杂志166(1983)557-580)大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87(1990)4645-4649)。接种至含10μg/ml四环素的LB琼脂平板上之后，根据其对四环素的敏感性鉴定携有插入物的菌落。利用混合克隆的质粒制品(Sambrook等，分子克隆，实验室手册(1989)冷泉港实验室出版社)，分离出8组各含有400个质粒，9组各含有500个质粒，前者插入物大小为9-20kb，后者插入物大小为3-7kb。利用电穿孔(Wehrmann等，1994，微生物学140：3349-3356)用此基因库转化大肠杆菌panB突变体SJ2(Cronan等，1982，细菌学杂志149：916-922)。将转化物直接铺于含15g/l琼脂的CGXII培养基上(Keilhauer等，细菌学杂志(1993)175：5595-5603)。由能在不补加泛酸的情况下生长的克隆中分离质粒DNA(Sambrook等，分子克隆，实验室手册(1989)冷泉港实验室出版社)。通过再转化可以证实有8个质粒能异源性地互补大肠杆菌突变体SJ2的panB缺损。
用这8个质粒绘制限制性图谱。研究了其中一个质粒载体，下文将其称为pUR1，它含有长度为9.3kb的插入物(图1)。对大肠杆菌panC突变体DV39(Vallari和Rock 1985，细菌学杂志164：136-142)的转化表明载体pUR1同样也能互补此突变体的panC缺损。2.测序panB和panC基因
根据Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)74：5463-5467)的双脱氧链终止法测序pUR1中大小为2.2kb的插入物片断(图1)。为此，首先利用外切核酸酶III产生亚克隆，然后借助于标准引物(德国Boehringer Mannheim公司生产的通用引物和反向引物)测定亚克隆的序列。用Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)生产的自动激光荧光测序仪(A.L.F.)对测序物进行凝胶电泳分析。用HUSAR程序包(Release 4.0，EMBL，Cambridge，GB)分析所得的核苷酸序列。该核苷酸序列示于SEQ ID NO：1。经分析鉴定出两个开放阅读框。一个开放阅读框长度为813bp，将其鉴定为panB基因，它编码271个氨基酸的多肽，该多肽示于SEQ ID NO：2。第二个开放阅读框被鉴定为panC基因，它含有837个碱基对。它编码279个氨基酸的多肽，该多肽示于SEQ ID NO：3。3.表达panB和panC基因
将panB和panC基因克隆至谷氨酸棒状杆菌表达载体pEKEx2(Eikmanns等，1994，微生物学140：1817-1828(1994))，其中两个基因处于能被IPTG诱导的强tac启动子的控制之下。克隆分两步进行。首先，利用PCR扩增panB基因的开始部分。为此，借助于相应引物将SalI界面插入panB起始密码子前19bp处(引物1：5’GATCGTCGACCATCACATCTATACTCATGCCC3’)。选择第二个引物以使扩增片断中含有panB内部的EcoRI位点(引物2：5’ACCCGATGTGGCCGACAACC3’)。根据Sambrook等(分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社(1989))所述，以质粒pUR1为基质进行PCR，其退火温度为62℃。用限制性内切核酸酶SalI和EcoRI切下大小为468bp的所得PCR产物，并连接于经类似处理的载体pEKEx2中。用连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr。从DH5αmcr/pEKEx2panB’型转化体中分离载体pEKEx2panB’。
通过限制性消化从质粒pUR1中切下大小为1761bp的EcoRI片断，该片断含有panBC簇的另一半。将所述片断克隆至已含有panB PCR产物，并已被EcoRI线性化的pEKEx2panB’载体中。用相应的连接物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr。从DH5αmcr/pEKEx2panBC型转化体中分离载体pEKEx2panBC(图2)，其中panBC基因簇处于tac启动子的控制之下。实施例2从谷氨酸棒状杆菌中克隆和测序编码二羟酸脱水酶的ilvD基因1.分离谷氨酸棒状杆菌的ilvD突变体
用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍诱变(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社(1989))谷氨酸棒状杆菌菌株R127(Haynes 1989，FEMS微生物学通讯61：329-334)。为此，将5ml谷氨酸棒状杆菌的过夜培养物与250μl N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(5mg/ml二甲基甲酰胺)混合，并于30℃，200rpm保温30分钟(Adelberg 1958，细菌学杂志76：326)。随后用无菌的NaCl溶液(0.9％)将细胞洗涤2次。通过在含15g/l琼脂的极限培养基平板CGXII上进行影印铺板(Keilhauer等，细菌学杂志175：5595-5603)，分离出仅在加入L-缬氨酸，L-异亮氨酸和L-亮氨酸(各0.1g/l)时才能生长的突变体。
测定这些突变体的粗提取物中二羟酸脱水酶的酶活性。为此，在60ml LB培养基中培养克隆，离心收集指数生长期的细胞。用0.05M磷酸钾缓冲液将细胞沉淀物洗涤1次并重新悬浮于相同缓冲液中。超声处理10分钟(Branson-Sonifier W-250，Branson Sonic Power公司，Danbury，USA)以破碎细胞。随后于4℃，以13,000rpm离心30分钟以除去细胞碎片，将上清液用作酶检测试验中的粗提取物。酶检测试验中的反应物中含有0.2ml 0.25M Tris/HCl，pH8，0.05ml粗提取物和0.15ml 65mMα，β-二羟基-β-甲基戊酸。将检测物置于30℃保温，10，20和30分钟之后取出200μl样品，利用HPLC分析方法(Hara等，1985，Analytica Chimica Acta 172：167-173)测定其酮甲基戊酸的浓度。如表1所示，菌株R127/7未表现出二羟酸脱水酶活性，而异构还原酶和乙酰羟酸合成酶活性同合成支链氨基酸的其它酶一样仍然存在。表1谷氨酸棒状杆菌菌株中多种酶的比活(μmol/min和mg蛋白质)
    菌株   二羟酸脱水酶   异构还原酶   乙酰羟酸合成酶
    R127     0.003     0.05       0.07
    R127/7     0.000     0.06       0.09
2.克隆谷氨酸棒状杆菌的ilvD基因
如Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9(1990)84-87)所述分离谷氨酸棒状杆菌R127的染色体DNA。用限制性酶Sau3A(BoehringerMannheim)裂解所述DNA并通过蔗糖密度梯度离心(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社(1989))分离之。使用含大小范围约为6-10kb之片断的组分与载体pJC1(Cremer等，分子和普通遗传学220(1990)478-480)连接。为此，用BamHI使载体pJC1线性化和脱磷酸化。将5ng载体与20ng上述染色体DNA组分连接，通过电穿孔(Haynes和Britz，FEMS微生物学通讯61(1989)329-334)转化突变体R127/7。检测转化体在未添加支链氨基酸的CGXII琼脂平板上生长的能力。在所检测的5,000个转化体中，影印铺板并于30℃保温2天后，8个克隆可在极限培养基平板上生长。按Schwarzer等(Bio/Technology(1990)9：84-87)所述从这些克隆中制备质粒。对质粒DNA的限制性分析表明所有8个克隆中都含有相同的质粒，下文称之为pRV。该质粒携有4.3kb的插入物，并通过再次转化检测其互补ilvD突变体R127/7的能力。利用亚克隆，将负责互补突变体R127/7的区域限定为2.9kb ScaI/XhoI片断。3.测序ilvD基因
根据Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)74：5463-5467)的双脱氧链终止法测定2.9kb ScaI/XhoI片断的核酸序列。此方法中使用了Auto-Read测序试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。用Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)生产的自动激光荧光测序仪(A.L.F.)进行凝胶电泳分析。用HUSAR程序包(Release 4.0，EMBL，Cambridge，GB)分析所得的核苷酸序列。该核苷酸序列示于SEQ ID NO：4。经分析鉴定出一个长度为1836bp的开放阅读框，将其鉴定为ilvD基因，它编码612个氨基酸的多肽，该多肽示于SEQ ID NO：5。实施例3构建谷氨酸棒状杆菌的ilvA缺失突变体
用Schfer等(基因145：69-73(1994))所述的基因交换系统在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的ilvA基因中掺入缺失。为了构建失活载体pK19mobsacBΔilvA，首先从存在于载体pBM21(Mckel等，1994，分子微生物学13：833-842)之EcoRI片断上的ilvA基因中除去内部的241bp BglII片断。为此，用BglII切割载体，通过琼脂糖凝胶电泳除去ilvA内部的BglII片断之后再重新连接。随后，以EcoRI片断的形式从载体中分离不完整的基因，并连接到已用EcoRI线性化的载体pK19mobsacB(Schfer 1994，基因145：69-73)中。通过转化至大肠杆菌菌株S17-1(Hanahan 1983，分子生物学杂志166：557-580)导入所得的失活载体pK19mobsacBΔilvA，并通过接合转移至谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(Schfer等，1990，细菌学杂志172：1663-1666)。得到谷氨酸棒状杆菌的卡那霉素抗性克隆，其中失活载体整合于基因组内。为了选择载体的切除，将卡那霉素抗性克隆铺于含蔗糖的LB培养基(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社(1989))上，该培养基中含有15g/l琼脂，2％葡萄糖/10％蔗糖，得到因第二次重组事件而再次失去载体的菌落(Jger等，1992，细菌学杂志，174：5462-5465)。接种于含和不含2mM L-异亮氨酸以及含和不含50μg/ml卡那霉素的极限培养基平板(含15g/l琼脂的CGXII培养基(Keilhauer等，细菌学杂志175(1993)5595-5603))之后，分离出36个克隆，它们因载体的切除而成为卡那霉素敏感型和异亮氨酸营养缺陷型，其中不完整的ilvA基因(ΔilvA等位基因)此时存在于基因组中。将其中一个克隆称为菌株ATCC13032ΔilvA供进一步使用。实施例4表达谷氨酸棒状杆菌的ilvBN，ilvC和ilvD基因
为了进行表达，将乙酰羟酸合成酶(ilvBN)和异构还原酶(ilvC)(Cordes等，1992，基因112：113-116和Keilhauer等，1993，细菌学杂志，175：5595-5603)和二羟酸脱水酶(ilvD)(实施例2)的基因克隆至载体pECM3中。载体pECM3是pECM2(Jger等，1992，细菌学杂志174：5462-5465)的衍生物，pECM2缺失长度约为1kbp，携有卡那霉素抗性基因的BamHI/BglII DNA片断的结果产生了pECM3。
在载体pKK5(Cordes等，1992，基因112：113-116)中，基因ilvBNC已经以克隆的形式存在于载体pJC1(Cremer等，1990，分子和普通遗传学220：478-480)中。从所述载体中分离出5.7kb的XbaI-ilvBNC片断，并和载体pRV含有ilvD基因的3.1kb XbaI片断一起导入经XbaI线性化的载体pECM3中。将此时的连接物转化至大肠杆菌菌株DH5αmcr。质粒pECM3ilvBNCD(图3)得自DH5αmcr/pECM3ilvBNCD型转化体。
利用电穿孔(Haynes 1989，FEMS微生物学通讯61：329-334)和氯霉素抗性选择，将质粒pECM3ilvBNCD导入菌株ATCC13032ΔilvA，得到菌株ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD。另外，利用电穿孔(Haynes1989，FEMS微生物学通讯61：329-334)和卡那霉素抗性选择，将质粒pEKEx2panBC导入菌株ATCC13032和菌株ATCC13032ΔilvA，得到菌株ATCC13032/pEKEx2panBC和ATCC13032ΔilvA/pEKEx2panBC。利用电穿孔(Haynes 1989，FEMS微生物学通讯61：329-334)和卡那霉素及氯霉素抗性选择，将质粒pEKEx2panBC和pEKEX2导入菌株ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD，得到菌株ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD pEKEX2和ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCDpEKEx2panBC。实施例5构建需要泛酸的谷氨酸棒状杆菌panC突变体
借助于失活载体pK18mob(Schfer等，1994，基因145：69-73)，产生了谷氨酸棒状杆菌R127 panC突变体。
为了构建panC失活载体，首先通过聚合酶链反应(PCR)扩增谷氨酸棒状杆菌panC基因大小为168bp的中间片断(长度为837bp之基因的核苷酸265-432)。使用载体pUR1为基质(见实施例6)，利用两个20聚体的引物1和引物2作为引物：引物15’GTTCGCACCCGATGTGGAGG3’和引物25’ATGCACGATCAGGGCGCACC 3’。根据Sambrook等(分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社(1989))的方法进行PCR，退火温度为55℃。立即克隆之后将所得片断连接至载体pUC18的SmaI位点，再以EcoRI/SalI片断的形式导入失活载体pK18mob(Schfer等，1994，基因145：69-73)。用以此方式得到的载体pK18mob’panC’转化大肠杆菌菌株S17-1，随后通过接合导入谷氨酸棒状杆菌R127中。用卡那霉素抗性进行选择，结果得到谷氨酸棒状杆菌R127的克隆，其中整合载体利用同源重组事件整合至panC基因中。以此方式得到的菌株R127panC∷pK18mob’panC’适于检测D-泛酸。实施例6定量检测D-泛酸
为了定量测定D-泛酸，构建了谷氨酸棒状杆菌panC突变体R127panC∷pK18mob’panC’(见实施例5)，其生长直接依赖于培养基中的D-泛酸浓度。此菌株为泛酸营养缺陷型，在添加β-丙氨酸和D-泛解酸时未显示出生长。
为了用此指示菌株测定泛酸，使用CGXII培养基(Keilhauer等，细菌学杂志(1993)175：5595-5603)作为检测培养基。为此，每种情况下，在保温管(Falcon 2057，Becton and Dickinson，New Jersey，USA)中将3ml以4/3比例浓缩的CGXII培养基与1ml无菌的校准溶液或含泛酸并接种有指示菌株的检测溶液混合。每次接种使用的是60μl指示菌株的甘油培养物。30℃保温40小时之后，测定检测物的细胞密度(OD600)(Novaspec 4049分光光度计，LKB Biochrom，Cambridge，GB)，利用校准曲线确定泛酸浓度。到浓度为25μg/l时，菌株表现出对泛酸浓度线性依赖性的生长，光密度为0.5-10。为了产生指示菌株的甘油培养物，将此菌株保温于未添加过的CGXII培养基中达24小时(D-泛酸饥饿)。随后，将1050μl培养物与700μl甘油混合。将这种甘油培养物立即置于-70℃冷冻，按上述方法，将60μl用于测定D-泛酸。作为对照，使用的是Sigma(Deisenhofen，德国)生产的泛酸钠。实施例7用多种谷氨酸棒状杆菌菌株生产D-泛酸
为了研究菌株形成泛酸的能力，于30℃，在60ml脑心浸制培养基(Difco Laboratories，Detroit，USA)中将菌株ATCC13032，ATCC13032/pEKEx2panBC，ATCC13032ΔilvA和ATCC13032ΔilvA/pEKEx2panBC预培养14小时。随后，用0.9％NaCl溶液(w/v)将细胞洗涤2次，并用此悬浮液接种每个60ml CgXII培养基以使OD600为0.5。所用培养基与Keilhauer等(细菌学杂志(1993)175：5595-5603)所述的相同，但另外含有2mM L-异亮氨酸。Keilhauer等所述的CgXII培养基示于表2。表2CGXII培养基的组成
     组分     浓度
    (NH4)2SO4     20g/l
    尿素     5g/l
    KH2PO4     1g/l
    K2HPO4     1g/l
    Mg2O4*7H2O     0.25g/l
    3-吗啉代丙烷磺酸     42g/l
    CaCl2     10mg/l
    FeSO4*7H2O     10mg/l
    MnSO4*H2O     10mg/l
    ZnSO4*7H2O     1mg/l
    CuSO4     0.2mg/l
    NiCl2*6H2O     0.02mg/l
    生物素(pH7)     0.2mg/l
    葡萄糖     40g/l
    原儿茶酸     0.03mg/l
在菌株ATCC13032/pEKEx2panBC和ATCC13032ΔilvA/pEKEx2panBC的培养过程中，5小时之后，在培养基中再混入1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷。培养24小时之后，取样，离心除去细胞，对上清液进行无菌过滤。借助于实施例6所述的泛酸试验测定上清液中泛酸的浓度。结果示于表3。表3多种谷氨酸棒状杆菌菌株形成的D-泛酸
    菌株     D-泛酸(mg/L)
    ATCC13032     0.01
    ATCC13032/pEKEx2panBC     0.03
    ATCC13032ΔilvA     0.06
    ATCC13032ΔilvA/pEKEx2panBC     0.3
实施例9多种谷氨酸棒状杆菌菌株在添加β-丙氨酸时生产的D-泛酸
为了定量菌株形成的泛酸，于30℃，在60ml含有25mg/l卡那霉素和3mg/l氯霉素的脑心浸制培养基(Difco Laboratories，Detroit，USA)中将菌株ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2和ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2panBC预培养14小时。随后，用0.9％NaCl溶液(w/v)洗涤2次，并用此悬浮液接种每个60ml CgXII培养基以使OD600为0.5。此时所用培养基含有2mM L-异亮氨酸，25mg/l卡那霉素，3mg/l氯霉素和终浓度为20mM的β-丙氨酸。培养5小时之后，在每种情况下向培养基中加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)。49和74小时之后，取样，离心除去细胞，对上清液进行无菌过滤。如实施例6所述测定上清液中泛酸的浓度。结果示于表4。表4多种谷氨酸棒状杆菌菌株积累的D-泛酸
                  菌株   保温后的D-泛酸(mg/l)
  49小时     74小时
    ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2     80     100
  ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2panBC     920     980
                   序列表(1)一般资料：
(i)申请人：
   (A)名称：Degussa Aktiengesellschaft
   (B)街道：Weissfrauenstr.9
   (C)城市：Frankfurt am Main
   (D)州：Hessen
   (E)国家：德国
   (F)邮政编码：D-60311
   (A)名称：Forschungszentrum Juelich GmbH
   (B)街道：Leo-Brandt Strasse
   (C)城市：Juelich
   (D)州：Nordrhein-Westfalen
   (E)国家：德国
   (F)邮政编码：D-52425
(ii)发明题目：使用棒状细菌发酵生产D-泛酸的方法
(iii)序列数：5
(iv)计算机可读形式：
   (A)数据载体：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：2164个碱基对
  (B)类型：核苷酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：基因组DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
   (A)生物：谷氨酸棒状杆菌
   (B)菌株：ATCC13032
(ix)特征：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：351..1163
   (D)其它资料：/起始密码子＝351
                /EC编号＝4.1.2.12
                /产物＝“酮泛解酸羟基甲基转移酶”
                /基因＝“panB”
(ix)特征：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1166..2002
   (D)其它资料：/起始密码子＝1166
                /EC编号＝6.3.2.1
                /产物＝“泛酸合成酶”
                /基因＝“panC”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GCTTCGGGGT ACCAATTCCT TTAAGAACCA TCAGATCAAT CTGTTGTACA TTCTCGGCCA      60GATTCAGCTT TTCGGTAAGG ACGAAACACT TTCACTTGAA TCGGCAGCAA AGTTTCTTAA     120AGTTTCTAAG GCAACTGCAA CGAGGTATTT TAGAACTCTC CGAGAAATGG AATTAGTTCA     180CGAGGTCAGC AAACGCCCTT TGCGGTTTGC GCTCACGGAT AAAGGTCGTG AGATAGTAGG     240TCTTGAGGTA AAAATTTGAC TCCATAACGA GAACTTAATC GAGCAACACC CCTGAACAGT     300GAATCAAATC GGAATTTATT TATTCTGAGC TGGTCATCAC ATCTATACTC ATG CCC        356
                                                   Met Pro
                                                     1ATG TCA GGC ATT GAT GCA AAG AAA ATC CGC ACC CGT CAT TTC CGC GAA       404Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe Arg Glu
      5                  10                  15GCT AAA GTA AAC GGC CAG AAA GTT TCG GTT CTC ACC AGC TAT GAT GCG       452Ala Lys Val Asn Gly Gln Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr Asp Ala
 20                  25                  30CTT TCG GCG CGC ATT TTT GAT GAG GCT GGC GTC GAT ATG CTC CTT GTT       500Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu Leu Val35                  40                  45                  50GGT GAT TCC GCT GCC AAC GTT GTG CTG GGT CGC GAT ACC ACC TTG TCG       548Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr Leu Ser
             55                  60                  65ATC ACC TTG GAT GAG ATG ATT GTG CTG GCC AAG GCG GTG ACG ATC GCT       596Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr Ile Ala
         70                  75                  80ACG AAG CGT GCG CTT GTG GTG GTT GAT CTG CCG TTT GGT ACC TAT GAG       644Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr Tyr Glu
     85                  90                  95GTG AGC CCA AAT CAG GCG GTG GAG TCC GCG ATC CGG GTC ATG CGT GAA       692Val Ser Pro Asn Gln Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met Arg Glu
100                 105                 110ACG GGT GCG GCT GCG GTG AAG ATC GAG GGT GGC GTG GAG ATC GCG CAG       740Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile Ala Gln115                 120                 125                 130ACG ATT CGA CGC ATT GTT GAT GCT GGA ATT CCG GTT GTC GGC CAC ATC       788Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly His Ile
            135                 140                 145GGG TAC ACC CCG CAG TCC GAG CAT TCC TTG GGC GGC CAC GTG GTT CAG       836Gly Tyr Thr Pro Gln Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val Val Gln
        150                 155                 160GGT CGT GGC GCG AGT TCT GGA AAG CTC ATC GCC GAT GCC CGC GCG TTG       884Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg Ala Leu
    165                 170                 175GAG CAG GCG GGT GCG TTT GCG GTT GTG TTG GAG ATG GTT CCA GCA GAG       932Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro Ala Glu
180                 185                 190GCA GCG CGC GAG GTT ACC GAG GAT CTT TCC ATC ACC ACT ATC GGA ATC       980Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile Gly Ile195                 200                 205                 210GGT GCC GGC AAT GGC ACA GAT GGG CAG GTT TTG GTG TGG CAG GAT GCC      1028Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gln Val Leu Val Trp Gln Asp Ala
            215                 220                 225TTC GGC CTC AAC CGC GGC AAG AAG CCA CGC TTC GTC CGC GAG TAC GCC      1076Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu Tyr Ala
            230                     235                     240ACC TTG GGC GAT TCC TTG CAC GAC GCC GCG CAG GCC TAC ATC GCC GAT      1124Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gln Ala Tyr Ile Ala Asp
    245                 250                 255ATC CAC GCG GGT ACC TTC CCA GGC GAA GCG GAG TCC TTT TA ATG CAG       1171Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe    Met Gln
260                 265                 270          1GTA GCA ACC ACA AAG CAG GCG CTT ATC GAC GCC CTC CTC CAC CAC AAA      1219Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His His Lys
      5                  10                  15TCC GTC GGG CTC GTC CCC ACC ATG GGT GCG CTA CAC AGC GGA CAC GCC      1267Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly His Ala
 20                  25                  30TCG TTG GTT AAA GCA GCA CGC GCT GAA AAC GAC ACT GTT GTA GCC AGT      1315Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val Ala Ser35                  40                  45                  50ATT TTT GTC AAT CCC CTG CAG TTT GAA GCA CTC GGT GAT TGC GAT GAT      1363Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys Asp Asp
             55                  60                  65TAC CGC AAC TAT CCC CGC CAA CTC GAC GCC GAT TTA GCA CTG CTT GAA      1411Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu Leu Glu
         70                  75                  80GAG GCA GGT GTG GAT ATT GTG TTC GCA CCC GAT GTG GAG GAA ATG TAC      1459Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu Met Tyr
     85                  90                  95CCC GGT GGC TTG CCA CTA GTG TGG GCG CGC ACC GGT TCC ATC GGA ACA      1507Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile Gly Thr
100                 105                 110AAA TTG GAG GGT GCC AGC AGG CCT GGC CAT TTC GAT GGT GTG GCT ACC      1555Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val Ala Thr115                 120                 125                 130GTG GTG GCG AAG CTG TTC AAT TTG GTG CGC CCT GAT CGT GCA TAT TTT      1603Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala Tyr Phe
            135                 140                 145GGA CAA AAA GAT GCT CAG CAG GTT GCG GTG ATT CGG CGA TTG GTT GCC      1651Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu Val Ala
        150                 155                 160GAT CTA GAC ATT CCC GTG GAG ATT CGT CCC GTT CCG ATT ATT CGT GGC      1699Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile Arg Gly
    165                 170                 175GCC GAT GGC TTA GCC GAA TCC AGC CGC AAT CAA CGT CTT TCT GCG GAT      1747Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser Ala Asp
180                 185                 190CAG CGA GCG CAA GCT CTG GTG CTG CCG CAG GTG TTG AGT GGG TTG CAG      1795Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly Leu Gln195                 200                 205                 210CGT CGA AAA GCA GCT GGT GAA GCG CTA GAT ATC CAA GGT GCG CGC GAC      1843Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala Arg Asp
            215                 220                 225ACC TTG GCC AGC GCC GAC GGC GTG CGC TTG GAT CAC CTG GAA ATT GTC      1891Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu Ile Val
        230                 235                 240GAT CCA GCC ACC CTC GAA CCA TTA GAA ATC GAC GGC CTG CTC ACC CAA      1939Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu Thr Gln
       245                      250                      255CCA GCG TTG GTG GTC GGC GCG ATT TTC GTG GGG CCG GTG CGG TTG ATC      1987Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg Leu Ile
260                 265                 270GAC AAT ATC GAG CTC TAGTACCAAC CCTGCGTTGC AGCACGCAGC TTCGCATAAC      2042Asp Asn Ile Glu Leu275GCGTGCTCAG CTCAGTGTTT TTAGGTGCGC GGTGCGGATC GGAACCGGGA GTTGGCCACT    2102GCGGTGGCGT GGCCTCACCC GACAGCGCCC ATGCCGCCTG ACGAGCTGCA CCCAACGCCA    2162CA                                                                   2164(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：271个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Pro Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe1               5                  10                  15Arg Glu Ala Lys Val Asn Gly Gln Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr
         20                  25                  30Asp Ala Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu
     35                  40                  45Leu Val Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr
 50                  55                  60Leu Ser Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr65                  70                  75                  80Ile Ala Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr
             85                  90                  95Tyr Glu Val Ser Pro Asn Gln Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met
        100                 105                 110Arg Glu Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile
    115                 120                 125Ala Gln Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly
130                 135                 140His Ile Gly Tyr Thr Pro Gln Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val145                 150                 155                 160Val Gln Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg
            165                 170                 175Ala Leu Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro
        180                 185                 190Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile
    195                 200                 205Gly Ile Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gln Val Leu Val Trp Gln
210                 215                 220Asp Ala Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu225                 230                 235                 240Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gln Ala Tyr Ile
            245                 250                 255Ala Asp Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe
        260                 265                 270(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：279个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Gln Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His1               5                  10                  15His Lys Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly
         20                  25                  30His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val
     35                  40                  45Ala Ser Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys
 50                  55                  60Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu65                  70                  75                  80Leu Glu Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu
             85                  90                  95Met Tyr Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile
        100                 105                 110Gly Thr Lys Leu Glu Gly A la Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val
    115                  120                 125Ala Thr Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala
130                 135                 140Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu145                 150                 155                 160Val Ala Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile
            165                 170                 175Arg Gly Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser
        180                 185                 190Ala Asp Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly
    195                 200                 205Leu Gln Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala
210                 215                 220Arg Asp Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu225                 230                 235                 240Ile Val Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu
            245                 250                 255Thr Gln Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg
        260                 265                 270Leu Ile Asp Ash Ile Glu Leu
    275(2)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：2952个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：基因组DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
   (A)生物：谷氨酸棒状杆菌
   (B)菌株：ATCC13032
   (C)个体/分离物：突变体R127
(ix)特征：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：290..2125
   (D)其它资料：/起始密码子＝290
                /EC编号＝4.2.1.9
                 /产物＝“二羟酸脱水酶”
                 /基因＝“ilvD”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AGTACTTGGA GCGCCAAAAG GCACTGGGCA AGCCAGTTCA GTTGAACTTC GATGACGACA      60CCGATGGGAA TACAACACAA ACAGAAAGCG TTGAATCCCA AGAGACCGGA CAAGCCGCGT     120CTGAAACCTC ACATCGTGAT AACCCTGCGT CACAGCACTA GAGTGTAATA AGCCGTCCGA     180ACCAAAGGTC CACACCTCTG CACGAGTAGA AGCTCACCCA AGTTTTCAAA GTGCCGTTGA     240TTCTTGACAA CCACCCGCCG CTCTTTAGAG CAGATTTGAA AAGCGCATC ATG ATC         295
                                                  Met Ile
                                                  280CCA CTT CGT TCA AAA GTC ACC ACC GTC GGT CGC AAT GCA GCT GGC GCT       343Pro Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Val Gly Arg Asn Ala Ala Gly Ala
        285                 290                 295CGC GCC CTT TGG CGT GCC ACC GGC ACC AAG GAA AAT GAG TTC GGC AAG       391Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe Gly Lys
    300                 305                 310CCA ATT GTT GCC ATC GTA AAC TCC TAC ACC CAG TTC GTG CCC GGA CAC       439Pro Ile Val Ala Ile Val Asn Ser Tyr Thr Gln Phe Val Pro Gly His
315                 320                 325GTT CAC CTT AAG AAC GTC GGC GAT ATT GTG GCA GAT GCA GTG CGC AAA       487Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Ile Val Ala Asp Ala Val Arg Lys330                 335                 340                 345GCC GGT GGC GTT CCA AAG GAA TTC AAC ACC ATC GTC GAT GAC GGC ATC       535Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr Ile Val Asp Asp Gly Ile
            350                 355                 360GCC ATG GGA CAC GGC GGC ATG CTG TAC TCC CTG CCA TCC CGT GAA ATC       583Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser Arg Glu Ile
        365                 370                 375ATC GCC GAC TCC GTC GAA TAC ATG GTC AAC GCA CAC ACC GCC GAC GCC       631Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr Ala Asp Ala
    380                 385                 390ATG GTG TGT ATC TCC AAC TGT GAC AAG ATC ACC CCA GGC ATG CTC AAC       679Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly Met Leu Asn
395                 400                 405GCA GCA ATG CGC CTG AAC ATC CCA GTG GTC TTC GTT TCC GGT GGC CCA       727Ala Ala Met Arg Leu Asn Ile Pro Val Val Phe Val Ser Gly Gly Pro410                 415                 420                 425ATG GAA GCT GGC AAG GCT GTC GTC GTT GAG CGC GTT GCA CAC GCA CCA       775Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Glu Arg Val Ala His Ala Pro
            430                 435                 440ACC GAC CTC ATC ACC GCG ATC TCC GCA TCC GCA AGC GAT GCA GTC GAC       823Thr Asp Leu Ile Thr Ala Ile Ser Ala Ser Ala Ser Asp Ala Val Asp
        445                 450                 455GAC GCA GGC CTT GCA GCC GTT GAA CGA TCC GCA TGC CCA ACC TGT GGC       871Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr Cys Gly
    460                 465                 470TCC TGC TCC GGT ATG TTC ACC GCG AAC TCC ATG AAC TGC CTC ACC GAA       919Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu Thr Glu
475                 480                 485GCT CTG GGA CTT TCT CTC CCG GGC AAC GGC TCC ACT CTG GCA ACC CAC       967Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala Thr His490                 495                 500                 505GCA GCA CGT CGC GCA CTG TTT GAA AAG GCC GGC GAA ACC GTC GTT GAA      1015Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val Val Glu
            510                 515                 520CTG TGC CGC CGC TAC TAC GGT GAA GAA GAC GAA TCC GTT CTG CCA CGT      1063Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu Pro Arg
        525                 530                 535GGC ATT GCC ACC AAG AAG GCA TTC GAA AAC GCA ATG GCA CTG GAT ATG      1111Gly Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu Asp Met
    540                 545                 550GCC ATG GGT GGA TCC ACC AAC ACC ATC CTC CAC ATC CTC GCA GCT GCC      1159Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu His Ile Leu Ala Ala Ala
555                 560                 565CAG GAA GGC GAA GTT GAC TTC GAC CTC GCA GAC ATC GAC GAA CTG TCC      1207Gln Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Asp Glu Leu Ser570                 575                 580                 585AAA AAC GTC CCC TGC CTG TCC AAG GTT GCA CCA AAC TCC GAC TAC CAC      1255Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp Tyr His
            590                 595                 600ATG GAA GAC GTC CAC CGC GCC GGT CGC ATT CCA GCA CTG CTC GGC GAG      1303Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Arg Ile Pro Ala Leu Leu Gly Glu
        605                 610                 615CTC AAC CGC GGT GGC CTG CTG AAC AAG GAC GTC CAC TCC GTT CAC TCC      1351Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser Val His Ser
    620                 625                 630AAC GAC CTT GAA GGT TGG TTG GAT GAC TGG GAT ATC CGC TCT GGC AAG      1399Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp Ile Arg Ser Gly Lys
 635                       640                       645ACC ACC GAA GTA GCA ACC GAA CTC TTC CAC GCA GCC CCA GGT GGC ATC      1447Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro Gly Gly Ile650                 655                 660                 665CGC ACC ACC GAA GCA TTC TCC ACC GAG AAC CGC TGG GAC GAA CTC GAC      1495Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu Leu Asp
            670                 675                 680ACC GAC GCT GCC AAG GGC TGC ATC CGC GAC GTT GAA CAC GCC TAC ACC      1543Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His Ala Tyr Thr
        685                 690                 695GCC GAC GGC GGC CTG GTT GTT CTT CGC GGC AAC ATC TCC CCT GAC GGC      1591Ala Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser Pro Asp Gly
    700                 705                 710GCA GTG ATC AAG TCC GCA GGT ATC GAA GAA GAG CTG TGG AAC TTC ACC      1639Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Glu Glu Glu Leu Trp Asn Phe Thr
715                 720                 725GGA CCA GCA CGA GTT GTC GAA AGC CAG GAA GAG GCA GTC TCT GTC ATC      1687Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gln Glu Glu Ala Val Ser Val Ile730                 735                 740                 745CTG ACC AAG ACC ATC CAA GCT GGC GAA GTT CTG GTC GTC CGC TAC GAA      1735Leu Thr Lys Thr Ile Gln Ala Gly Glu Val Leu Val Val Arg Tyr Glu
            750                 755                 760GGC CCA TCA GGT GGA CCA GGC ATG CAG GAA ATG CTT CAC CCA ACC GCA      1783Gly Pro Ser Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu His Pro Thr Ala
        765                 770                 775TTC CTC AAG GGA TCC GGC CTG GGC AAG AAG TGT GCA CTG ATC ACC GAC      1831Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu Ile Thr Asp
    780                 785                 790GGC CGT TTC TCC GGA GGT TCC TCA GGA CTG TCC ATC GGC CAC GTC TCC      1879Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly His Val Ser
795                 800                 805CCA GAA GCA GCA CAC GGC GGA GTC ATT GGT CTG ATC GAA AAC GGC GAC      1927Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Ile Gly Leu Ile Glu Asn Gly Asp810                 815                 820                 825ATC GTC TCC ATC GAC GTT CAC AAC CGC AAG CTC GAA GTT CAG GTC TCC      1975Ile Val Ser Ile Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val Gln Val Ser
            830                 835                 840GAC GAG GAA CTC CAG CGC CGC CGC GAC GCT ATG AAC GCC TCC GAG AAG      2023Asp Glu Glu Leu Gln Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala Ser Glu Lys
        845                 850                 855CCA TGG CAG CCA GTC AAC CGT AAC CGC GTT GTC ACC AAG GCA CTG CGC      2071Pro Trp Gln Pro Val Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala Leu Arg
    860                 865                 870GCA TAC GCA AAG ATG GCT ACc TCC GCT GAT AAG GGT GCA GTC CGT CAG      2119Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val Arg Gln
875                 880                 885GTC GAC TAACCCTTTG TGAGTGTTTG AGCACCGGTT CCCTACTTTG GGTTCCGGTG       2175Val Asp890CTTTTTCATG TCTTGGCCTG TGTGGGCGTG GTGGAGCTCC CCGTTGCAAA TACTCACCAC    2235AAGTTGCAGG ATTTCTGCTG GTTGTGGTGG ATTTTCCCGC TTTATAGCCC TATGCGTGCA    2295ACTTTCGGAC CGATTCCAAA GGGCAAAGCC CTGTTTGTGG TGGATCCTTG CCCTGGAAGC    2355TTTCAGGAAC CACAACTACC CCACTGACCC CAAAGTGGAT AGGCCCTATT CTTCCGTTTA    2415AGCGCCTCAA ACACCTCTCC CCACACTTGA CCCATTAGGC AATTACGAAT CCTTAAACAG    2475CCTTCTACAG CACCATGCCC CAAACCGAAC CCAGGCATGA AAAAGACCCT CACCAGGAGG    2535GTCTTTTTCT AAAACTTTGG CTACGCGATT GGGTTCACAC CCGCACCGAA CCACCACAGC    2595AGAACTGCCG CTGCGATGCC GATGACCACG AAGATCCACG AGCTCACCAG TGGACGCTTT    2655GCCCAACCTC GGCCAGAGTC AAGGGAAATC TTGCCGGGGC CGGTGAACTG AAGTCCGACA    2715ACCACGATAG TGAGGATCAG TGCCAGCATC AATGGCTCAC TAAGTTCACC CCAACCACCT    2775TCATGAGTGT TGACTTGGTG AAGGGTGGTA AAGGATGTCG CCACCGTGGC TACCGCTGCT    2835GCCACTGGGG TCATCAGACC AAGGAGCAGG AAGACACCAG CCGCAAGTTC AATAGATGGA    2895AGCAGGATCG CGAGGATTTC AGGCCACTGG TAACCAGCGA ACTCTGCCTC GACTCTA       2952(2)SEQ ID NO：5的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：612个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Ile Pro Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Val Gly Arg Asn Ala Ala1               5                  10                  15Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe
         20                  25                  30Gly Lys Pro Ile Val Ala Ile Val Asn Ser Tyr Thr Gln Phe Val Pro
     35                  40                  45Gly His Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Ile Val Ala Asp Ala Val
 50                  55                  60Arg Lys Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr Ile Val Asp Asp65                  70                  75                  80Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser Arg
             85                  90                  95Glu Ile Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr Ala
        100                 105                 110Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly Met
    115                 120                 125Leu Asn Ala Ala Met Arg Leu Asn Ile Pro Val Val Phe Val Ser Gly
130                 135                 140Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Glu Arg Val Ala His145                 150                 155                 160Ala Pro Thr Asp Leu Ile Thr Ala Ile Ser Ala Ser Ala Ser Asp Ala
            165                 170                 175Val Asp Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr
        180                 185                 190Cys Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu
    195                 200                 205Thr Glu Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala
210                 215                 220Thr His Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val225                 230                 235                 240Val Glu Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu
            245                 250                 255Pro Arg Gly Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu
        260                 265                 270Asp Met Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu His Ile Leu Ala
    275                 280                 285Ala Ala Gln Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Asp Glu
290                 295                 300Leu Ser Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp305                 310                 315                 320Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Arg Ile Pro Ala Leu Leu
            325                 330                 335Gly Glu Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser Val
        340                 345                 350His Ser Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp Ile Arg Ser
    355                 360                 365Gly Lys Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro Gly
370                 375                 380Gly Ile Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu385                 390                 395                 400Leu Asp Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His Ala
            405                 410                 415Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser Pro
        420                 425                 430Asp Gly Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Glu Glu Glu Leu Trp Asn
    435                 440                 445Phe Thr Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gln Glu Glu Ala Val Ser
450                 455                 460Val Ile Leu Thr Lys Thr Ile Gln Ala Gly Glu Va1 Leu Val Val Arg465                 470                 475                 480Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu His Pro
            485                 490                 495Thr Ala Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu Ile
        500                 505                 510Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly His
    515                 520                 525Val Ser Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Ile Gly Leu Ile Glu Asn
530                 535                 540Gly Asp Ile Val Ser Ile Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val Gln545                 550                 555                 560Val Ser Asp Glu Glu Leu Gln Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala Ser
            565                 570                 575Glu Lys Pro Trp Gln Pro Val Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala
        580                 585                 590Leu Arg Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val
    595                 600                 605Arg Gln Val Asp
610

Claims (21)

1.能在棒状杆菌属微生物中复制的任选重组的DNA，所述DNA得自棒状杆菌属并含有至少一个下列核苷酸序列，所述序列选自：
a)SEQ ID NO：1所示的编码panB基因(酮泛解酸羟基甲基转移酶)的序列，
b)SEQ ID NO：1所示的编码panC基因(泛酸合成酶)，尤其是panBC操纵子的序列，和任选地
c)SEQ ID NO：4所示的编码ilvD基因(二羟酸脱水酶)的序列。
2.根据权利要求1的可复制DNA，该DNA含有：
(i)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并性的范围内对应于(i)中各个序列的序列中的至少一个序列或
(iii)与(i)或(ii)中各个序列的互补序列杂交的序列中的至少一个序列，和任选地
(iv)(i)中功能上中性的有义突变。
3.通过导入一种或多种根据权利要求1或2的可复制DNA而转化的微生物，尤其是棒状杆菌属微生物。
4.穿梭载体pECM3ilvBNCD，其特征在于，限制性图谱如图3所示，并作为大肠杆菌DH5αmcr/pECM3ilvBNCD被保藏，保藏号为DSM 12457。
5.穿梭载体pEKEx2panBC，其特征在于，限制性图谱如图2所示，并作为大肠杆菌DH5αmcr/pEKEx2panBC被保藏，保藏号为DSM 12456。
6.生产泛酸的方法，其特征在于，在棒状杆菌属微生物中将panB和panC基因和任选地将其它编码相应酶的核苷酸序列增强(过量表达)，并将这些微生物用于发酵。
7.根据权利要求6的生产方法，其特征在于，还增强(过量表达)了ilvD基因。
8.根据权利要求6或7的方法，其特征在于，还增强(过量表达)了ilvBNCD基因。
9.根据权利要求6或7的方法，其特征在于，为了达到增强的目的，通过用携有基因或核苷酸序列的这些质粒载体进行转化增加了微生物中基因或核苷酸序列的拷贝数。
10.根据权利要求6或7的方法，其特征在于，为了达到增强的目的，突变了位于结构基因上游的启动子和调控区域。
11.根据权利要求6或7的方法，其特征在于，为了达到增强的目的，将表达盒掺入了结构基因的上游。
12.根据权利要求6或7的方法，其特征在于，为了达到增强的目的，延长了利用基质由上述序列读出的mRNA的寿命和/或防止相应酶蛋白质被降解。
13.根据权利要求6至12的方法，其特征在于，在棒状杆菌中过量表达了根据权利要求1的基因，所述棒状杆菌还表现出代谢物抗性或抗代谢物抗性突变。
14.根据权利要求6至12的方法，其特征在于，为了达到过量表达的目的，培养基和/或控制发酵的方式被改变。
15.根据权利要求6至14的方法，其特征在于，微生物中至少一个减少泛酸盐(泛酸)形成的代谢途径被消除。
16.根据权利要求6至15的方法，其特征在于，所用的微生物中除了一个或多个基因以外，其余涉及泛酸形成的代谢途径基因单独地或联合地被过量表达。
17.根据权利要求15的方法，其特征在于，代谢途径中ilvA基因被消除。
18.根据权利要求6至17中一项或多项的方法，其特征在于，使用了含有穿梭载体pECM3ilvBNCD的棒状杆菌属微生物。
19.根据权利要求6至17中一项或多项的方法，其特征在于，使用了含有穿梭载体pEKEx2panBC的棒状杆菌属微生物。
20.通过发酵根据上述权利要求中一项或多项的棒状杆菌属微生物生产泛酸的方法，其特征在于，
a)panB或panC基因中的至少一个，优选为panBC，任选与ilvD基因联合被增强(过量表达)，和
b)培养基或微生物细胞中的泛酸被富集，和
c)分离泛酸。
21.根据权利要求19和20的方法，其特征在于，在发酵过程中混入泛酸前体，所述前体选自天冬氨酸，β-丙氨酸，酮异戊酸，酮泛解酸或泛解酸。
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