SK164099A3 - Method for the fermentative production of d-pantothenic acid using coryneform bacteria - Google Patents

Method for the fermentative production of d-pantothenic acid using coryneform bacteria Download PDF

Info

Publication number
SK164099A3
SK164099A3 SK1640-99A SK164099A SK164099A3 SK 164099 A3 SK164099 A3 SK 164099A3 SK 164099 A SK164099 A SK 164099A SK 164099 A3 SK164099 A3 SK 164099A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ala
gly
leu
gene
wall
Prior art date
Application number
SK1640-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Lothar Eggeling
Georg Thierbach
Hermann Sahm
Original Assignee
Degussa
Forschungszentrum Juelich Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa, Forschungszentrum Juelich Gmbh filed Critical Degussa
Publication of SK164099A3 publication Critical patent/SK164099A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Fermentatívny spôsob výroby D-pantoténovej kyseliny využívajúci koryneformné baktérie
Oblasť techniky
Kyselina pantoténová predstavuje komerčne významný vitamín, ktorý nachádza uplatnenie v kozmetike, lekárstve a vo výžive ludí aj zvierat.
Kyselina pantoténová môže byť vyrobená pomocou chemickej syntézy alebo biotechnologický pomocou fermentácie vhodného mikroorganizmu vo vhodnom živnom roztoku. Výhodou biotechnologického spôsobu výroby pri pomoci mikroorganizmov je, že vzniká požadovaný stereoizomér a to D-forma kyseliny pantoténovej.
Doterajší stav techniky
Rôzne druhy baktérií, ako sú napríklad Escherichia coli, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes alebo kvasiniek, ako sú napríklad Debaromyces castellii, môžu v živnom roztoku obsahujúcom glukózu, DL-pantoinovú kyselinu a β-alanín, produkovať kyselinu D-pantoténovú, ako je to opísané v EP-A 0 493 060. V spise EP-A 0 493 060 sa ďalej uvádza, že pri baktériách Escherichia coli je možné pomocou plazmidov pFV3 a pFVS zosilniť gény na biosyntézu kyseliny D-pantoténovej a tým aj zvýšiť tvorbu tejto kyseliny.
EP-A 0 590 857 opisuje kmene baktérií Escherichia coli, ktoré nesú rezistenciu k rôznym antimetabolitom, ako napríklad ku kyseline salicylovej, α-ketomaslovej kyseline, β-hydroxyasparágovej kyseline apod. a v živnom roztoku obsahujúcom glukózu a β-alanín, produkujú D-pantoinovú a D-pantoténovú kyselinu. V dokumente EP 0 590 857 sa ďalej uvádza, že produkcia D-pantoinovej a D-pantoténovej kyseliny v E. coli môže byť zvýšená amplifikáciou bližšie nedefinovaných génov na bio2 syntézu pantoténovej kyseliny z E. coli, ktoré sa nachádzajú na plazmide pFV31.
WO 97/10340 okrem toho opisuje, že v mutantných baktériách Escherichia coli, ktoré vytvárajú kyselinu pantoténová, je možné zvýšením aktivity syntázy hydroxyoctovej kyseliny II, enzýmu, ktorý sa podiela na biosyntéze valínu, ďalej zvýšiť produkciu kyseliny pantoténovej.
Podstata vynálezu
Vynález opisuje nový spôsob fermentatívnej výroby kyseliny D-pantoténovej prostredníctvom koryneformných baktérií.
Vitamín pantoténová kyselina predstavuje komerčne významný produkt s využitím v kozmetike, lekárstve a vo výžive ľudí aj zvierat. Z toho vyplýva všeobecný záujem o vylepšený spôsob výroby pantoténovej kyseliny.
V nasledujúcom texte sa výrazmi D-pantoténová kyselina alebo pantoténová kyselina alebo pantotenát rozumie nielen volná kyselina, ale tiež jej soli, ako napríklad vápenatá, sodná, amónna alebo draselná sol.
Vynález opisuje DNA, ktorá je replikovatelná v baktériách rodu Corynebacterium, prípadne aj rekombinantná DNA pochádzajúcu z baktérií Corynebacterium, a ktorá obsahuje aspoň jednu z nasledujúcich nukleotidových sekvencii:
a) kódujúca sekvencia génu panB (ketopantoáthydroxymetyltransferáza), viď Sekvencia id. č.: 1
b) kódujúca sekvencia génu panC (pantotenátsyntetázy), viď
Sekvencia id. č.: 1, najmä operón panBC a prípadne
c) kódujúca sekvencia génu iivD (dehydratázy dihydroxykyselín), viď Sekvencia id. č.: 4.
Predmetom vynálezu sú rovnako replikovatelné DNA podlá nároku 1, ktoré obsahujú:
(1) nukleotidové sekvencie uvedené v Sekvencií id. č.: 1, a
Sekvencií id. č.: 4 (2) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá uvedeným sekvenciám podlá bodu (i) vďaka degenerácii genetického kódu (3) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje s uvedenými sekvenciami podlá bodov (i) alebo (ii), alebo so sekvenciami komplementárnymi a prípadne (4) funkčne neutrálne mutácie v sekvenciách podlá bodu (i).
Vynález ďalej opisuje koryneformná mikroorganizmy, najmä z rodu Corynebacterium, transformované zavedením jednej alebo niekolkých replikovatelných DNA.
Predmetom vynálezu je ďalej spôsob výroby kyseliny D-pantoténovej pri použití korynef ormných baktérií, najmä takých, ktoré kyselinu D-pantoténovú už produkujú, a v ktorých sú gény panB a panC jednotlivo, alebo v kombinácii zosilnené, osobitne potom, keď je zvýšená ich expresia. Zosilnenie týchto génov môže byt prípadne spojené s mutáciou, spôsobujúcou defekt v géne ilvA alebo so zosilnením génov ilvBN, ilvC alebo ilvD.
Výrazom zosilnenie sa v tomto prípade rozumie zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo niekolkých enzýmov, ktoré sú v mikroorganizmu kódované príslušnými DNA, napríklad tým, že sa zvýši počet kópií génu (génov) na bunku, použije sa silný promotor, alebo sa použije gén kódujúci enzým so zvýšenou aktivitou, prípadne kombinácia týchto účinkov.
Predmetom vynálezu sú ďalej mikroorganizmy, ktoré sú schopné vytvárat kyselinu pantoténovú z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerínu a etanolu, výhodne potom z glukózy alebo sacharózy. Ide o koryneformné baktérie napríklad rodov Corynebacterium alebo Arthrobacter. Z baktérií rodu Corynebacterium je potrebné menovať najmä Corynebacterium glutamicum, ktoré sú medzi odborníkmi známe pre svoju schopnosť tvorby aminokyselín. K tomuto druhu patria divoko sa vyskytujúce kmene ako napríklad Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium f lavum ATCC14067, Corynebacterium melassecola ATCC17965 a od nich odvodené kmene.
Vynález ďalej opisuje skutočnosť, že k zvýšenej produkcii D-pantotenátu dôjde rovnako po zvýšení aktivity, osobitne potom po zosilnení expresie novo izolovaných génov panB a panC nech už každého jednotlivo alebo obidvoch dohromady (zosilnenie panBC operónu). Tieto gény z baktérií Corynebacterium glutamicum kódujú enzýmy dôležité na biosyntézu D-pantotenátu a to ketopantoát hydroxymetyl transferázu a pantotenát syntetázu.
Vynález ďalej opisuje skutočnosť, že k zvýšenej produkcii D-pantotenátu prispieva rovnako zosilnenie expresie nového génu na biosyntézu valínu z Corynebacterium glutamicum, ktorý kóduje dehydratázu dihydroxykyselín.
Podlá vynálezu účinkuje na zvýšenie produkcie D-pantotenátu okrem génu ilvD tiež zvýšenie expresie génu ilvBN, ktorý kóduje syntázu kyseliny hydroxyoctovej, a génu ilvC, ktorý kóduje izomeroreduktázu. Zvýšenie ich expresie vedie k zvýšenej tvorbe D-pantotenátu.
Zvýšenie aktivity príslušného enzýmu (respektíve jeho zvýšenú expresiu) je možné dosiahnuť napríklad zvýšením počtu kópií príslušného génu na bunku alebo mutáciou v oblasti promotoru a/alebo v regulačnej oblasti proti smeru transkripcie od štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom môžu účinkovať expresné kazety zabudované proti smeru transkripcie od štruktúrneho génu. Pomocou indukovateľných promotórov je možné ďalej zosilniť expresiu počas fermentatívnej produkcie D-pantotenátu. Expresiu je možné ďalej zlepšiť predĺžením životnosti m-RNA v bunke alebo inhibíciou rozkladu enzymatických proteínov.
Gény alebo rekombinantné génové konštrukty podľa vynálezu sa pritom nachádzajú v plazmidovom vektore s rôznym počtom kópií na bunku alebo sú integrované v chromozómu a amplifikované. Alternatívne môže byť expresia príslušného génu ďalej zvýšená zmenou zloženia média a spôsobu kultivácie. Návody k tomu môžu odborníci nájsť okrem iných v publikáciách Martin et al. (Bio/ Technology 5, strana 137 až 146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, strana 35 až 41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, strana 428 až 430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, strana 93 až 98 (1991)), v Európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v patente USA č.. 4,601,893, Schwarzer a Púhler (Bio/Technology 9, strana 84 až 87 (1991), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, strana 126 až 132 (1994)), pri LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, strana 1001 až 1007 (1993)), v patentovej prihláške WO 96/ 15246, Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, strana 191 až 195 (1998)) alebo v príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Manuál metód pre všeobecnú bakteriológiu) vydanú Americkou baktériologickou spoločnosťou (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA v roku 1981 a ďalej v známych učebniciach zamerených na výuku genetiky a molekulárnej biológie.
Pred vlastnou izoláciou génov panB a panC z baktérie C. glutamicum je najskôr nutné vytvoriť DNA knižnicu tohto mikroorganizmu v baktériách E. coli. Spôsob vytvorenia takejto DNA knižnice je opísaný vo všeobecne známych učebniciach a príručkách ako je napríklad učebnica Winnacker: Gene und Klone: Eine Einfiihrung in die Gentechnologie (Gény a Klony: Úvod do génového inžinierstva, nakladatelstvo Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručka Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Laboratorný manuál molekulárneho klonovania, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Jednou takou známou knižnicou je knižnica E. coli K-12 kmeň W3110 v Λ-vektoroch vytvorená a opísaná Koharou et al. (pozri Celí 50, strana 495 až 508 (1987)). Bathe et al. opisujú (Molecular and General Genetics, 252: strana 255 až 265, 1996) DNA knižnicu baktérie C. glutamicum ATCC13032, vytvorenú pomocou kozmidu SuperCos I (Wahl et al. 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: strana 2160 až 2164) v baktériách E. coli K-12 kmeň NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acids Research 16: strana 1563 až 1575. Na prípravu DNA knižnice baktérie C. glutamicum v E. coli môžu byť použité tiež plazmidy ako napríklad pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, strana 807 až 818 (1979)) alebo pUC19 (Norrander et al. 1983, Gene 26: strana 101 až 106). Ako hostiteľské sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a a rekombinačne deficientné. Príkladom takého kmeňa sú bunky kmeňa DHSaMCR, pozri Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) strana 4645 až 4649.
Táto DNA knižnica sa potom prenesie do indikátorového kmeňa nech už pomocou transformácie (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, strana 557 až 580, 1983) alebo elektroporácie (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347). Vhodný indikátorový kmeň sa vyznačuje tým, že obsahuje mutáciu vo vhodnom géne a to takú, ktorá vy7 voláva viditeľnú zmenu fenotypu, napríklad závislosť od prídavku metabolitu do kultivačného média (auxotrofiu). Indikátorové kmene alebo mutanty je možné získať z publikovaných zdrojov a/alebo zo zbierok kmeňov a kultúr, alebo ich je možné prípadne aj priamo vytvoriť. Pre tento vynález majú velký význam baktérie E. coli DV39 (pozri Vallari a Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164: strana 136 až 142), ktoré majú mutáciu v géne panC. Iným príkladom E. coli s defektom v tvorbe pantoténovej kyseliny je kmeň SJ2, ktorý má mutáciu v géne panB a je možné ho získať z génovej banky Univerzity v Yale, New Haven, Connecticut, USA. Ďalším príkladom mutantného kmeňa je mutant C. glutamicum R127/7, ktorý bol izolovaný v rámci vynálezu. Tento kmeň má poškodený gén ilvD, ktorý kóduje dehydratázu dihydroxykyselín. Po transformácii indikátorového kmeňa, napríklad panB-mutantných buniek SJ2, rekombinantným plazmidom, ktorý obsahuje hladaný gén, napríklad gén panB, a po expresii príslušného génu, dôjde k zmene fenotypu indikátorového kmeňa, napríklad tento kmeň stratí závislosť od prídavku pantoténovej kyseliny v kultivačnom médie.
Takto izolovaný gén alebo DNA fragment môže byt ďalej opísaný a charakterizovaný určením jeho sekvencie, tak ak je to opísané napríklad Sangerom et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America, 74: strana 5463 až 5467, 1977).
Týmto spôsobom boli získané aj nové DNA sekvencie kódujúce proteíny panB a panC z baktérie C. glutamicum. Tieto sekvencie podlá vynálezu sú uvedené ako Sekvencia id. č.: 1.
Ďalej boli z uvedenej DNA sekvencie hore opísanými metódami odvodené aminokyselinové sekvencie príslušného enzýmu. Sekvencia id. č.: 2 udáva poradie aminokyselín v produkte génu panB, menovíto ketopantoát hydroxymetyl transferázy a Sekvencia id. č.: 3 udáva poradie aminokyselín v produkte génu panC teda pantotenát syntetázy. Ďalej bola týmto spôsobom získaná DNA kódujúca sekvencia génu ilvD z baktérie C. glutamicum.
Táto sekvencia je súčasťou vynálezu a je uvedená ako Sekvencia id. č.: 4. Sekvencia id. č.: 5 udáva odvodené poradie aminokyselín produktu génu ilvD, čiže dehydratázy dihydroxykyselín.
Kódujúce sekvencie DNA, ktoré v dôsledku degenerácie genetického kódu zodpovedajú Sekvenciu id. č.: 1 a/alebo Sekvencii id. č.: 4 sú rovnako súčasťou vynálezu. Takisto sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré so Sekvenciou id. č.: 1 a/alebo Sekvenciou id. č.: 4 hybridizujú. Odborníkom sú ďalej známe konzervatívne zámeny aminokyselín ako je napríklad zámena glycínu za alanín alebo zámena kyseliny asparágovej za kyselinu glutámovú. Tieto zámeny aminokyselín sa nazývajú sense mutations a s ohľadom na to, že nevedú k zásadnej zmene aktivity proteínu nazývajú sa rovnako funkčne neutrálne. Ďalej je známe, že zmeny v N- a/alebo C-konci proteínu nemívajú zásadný negatívny vplyv na funkciu proteínu ale v niektorých prípadoch môže dôjsť i k jej stabilizácii. Odborník môže nájsť údaje, ktoré to potvrdzujú okrem iných v práci Ben-Bassata et al. v časopise Journal of Bacteriology 169: strana 751 až 757 (1987), O'Regana et al. v časopise Gene 77: strana 237 až 251 (1989), SahinTotha et al. v časopise Protein Sciences 3: strana 240 až 247 (1994), Hochuliho et al. v Bio/Technology 6: strana 1321 až 1325 (1988) a v známych učebniciach genetiky a molekulárnej biológie. Aminokyselinové sekvencie, ktoré sú v tomto zmysle analogické Sekvenciám id. č.: 2, id. č.: 3 a/alebo Sekvencii id. č.: 5 sú rovnako predmetom vynálezu.
Takým spôsobom charakterizovaný gén môže byť následne samostatne alebo v kombinácii s ďalšími génmi exprimovaný vo vhodnom mikroorganizmu. Jeden spôsob expresie, respektíve zvýšenej expresie (over-expression) génov spočíva v tom, že sa gén amplifikuje pomocou plazmidového vektoru, ktorý navyše obsahuje regulačné sekvencie fungujúce ako signály na expresiu. Pri výbere vhodného plazmidu prichádzajú do úvahy také, ktoré sú schopné sa v príslušných mikroorganizmoch replikovať. Pre baktérie Corynebacterium glutamicum je možné brať do úvahy napríklad vektory pEKExl (pozri Eikmanns et al., Gene 102: strana 93 až 98 (1991)), pZ8-l (Európsky patentový spis 0 375 889), pEKEx2 (Eikmanns et al., Microbiology 140: strana 1817 až 1828 (1994)) alebo pECM2 (Jáger et al., Journal of Bacteriology 174 (16): strana 5462 až 5465 (1992)). Príklady takých plazmidov s už zabudovaným inzertom sú pEKEx2panBC, pECM3ilvBNCD, ktoré sú vložené v kmeňoch DH5amcr/pEKEx2panBC a DH5amcr/pECM3ilvBNCD. Plazmid pEKEx2panBC je binárny vektor vhodný ako pre E. coli tak aj pre C. glutamicum, ktorý nesie gény panB a panC. Plazmid pECM3ilvBNCD je rovnako binárny vektor pre E. coli/C. glutamicum obsahujúci však popri géne ilvD ešte gény ilvBN a ilvC.
Vynález ďalej opisuje skutočnosť, že posilnenie génov panB a panC nech už každého samostatne, obidvoch dohromady alebo v kombinácii s génmi ilvBN, ilvC a ilvD sa výhodne vyskytuje v takých mikroorganizmoch, ktoré majú zníženú syntézu aminokyselín treonínu a izoleucínu. Takto znížená syntéza treonínu a izoleucínu môže byť dosiahnutá zoslabením alebo vypnutím príslušného biosyntetického enzýmu alebo jeho aktivity. Na tento účel sa hodí napríklad enzým homoserín dehydrogenáza, homoserín kináza, treonín syntáza alebo tiež treonín dehydratáza. Ďalšou možnosťou ako znížiť aktivity enzýmov dôležitých na syntézu treonínu a izoleucínu sú spôsoby založené na mutagenéze.
Medzi také spôsoby patria jednak spôsoby náhodnej mutagenézy, ktoré k indukcii mutáciou využívajú chemické mutagénne látky ako napríklad N-metyl-N-nitro-N-nitrózoguanidín alebo ožiarovanie UV lúčmi s následným vyhľadávaním požadovaných mikroorganizmov. V tomto prípade by boli vyhľadávané mikro10 organizmy deficientné v syntéze L-treonínu alebo L-izoleucínu, ktoré preto vyžadujú tieto aminokyseliny v živnom médie. Tieto spôsoby neriadenej mutagenézy a vyhľadávania mutantov sú všeobecne známe, pozri napríklad Miller: A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Krátky kurz genetiky baktérií, laboratórna príručka pre E. coli a príbuzné baktérie), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992), alebo príručku Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pre všeobecnú bakteriológiu) vydaný Americkou baktériologickou spoločnosťou (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roku 1981.
Druhou skupinou sú spôsoby cielenej (site-directed) mutagenézy využívajúce techniky rekombinantnej DNA. Prostredníctvom týchto metód je možné z chromozómu deletovať napríklad gén ilvA kódujúci enzým treonín dehydratázu. Konkrétne postupy sú opäť všeobecne známe, napríklad pozri Schäfer et al. (Gene (1994) 145: strana 69 až 73) alebo tiež Link et al. (Journal of Bacteriology (1998) 179: strana 6228 až 6237). Je rovnako možné odstrániť len časti génu, alebo zameniť prirodzené fragmenty DNA v géne pre treonín dehydratázu za mutované. Deléciou alebo zámenou sa tak dosiahne celková strata alebo zníženie aktivity treonín dehydratázy, pozri Mockel et al.
(1994), Molecular Microbiology 13: strana 833 až 842; Morbach et al. (1996), Applied Microbiology and Biotechnology 45: strana 612 až 620). Príkladom takého mutantu je baktéria C. glutamicum kmeň ATCC130320áilvA, ktorá nesie deléciu v génu ilvA.
Mikroorganizmy skonštruované podlá vynálezu môžu byť za účelom produkcie kyseliny D-pantoténovej kultivované kontinuálnym spôsobom, alebo spôsobmi diskontinuálnymi, nech už vsádzkovou kultiváciou alebo prítokovou kultiváciou.
Prehľad známych spôsobov kultivácie je uvedený v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Úvod do biotechník, nakladateľstvo Gustáv Fischer, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periférne zariadenia, nakladateľstvo Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Použité kultivačné médium musí patričným spôsobom vyhovovať: nárokom príslušného mikroorganizmu. Opisy rôznych známych kultivačných médií pre mikroorganizmy sú uvedené príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pre všeobecnú bakteriológiu) vydaný Americkou baktériologickou spoločnosťou (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roku 1981. Ako zdroj uhlíku môžu byť použité cukry a uhľohydráty ako napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk; mastné kyseliny ako napríklad kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy ako napríklad glycerín a etanol a organické kyseliny ako napríklad kyselina octová. Tieto látky môžu byť použité bud jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroje dusíka môžu byť použité zlúčeniny obsahujúce organický dusík ako napríklad peptón, kvasničný extrakt, extrakt z masa, extrakt zo sladu, kukuričný extrakt, sójová múka a močovina alebo anorganické zlúčeniny ako napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Tieto zdroje dusíka môžu byť použité bud jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroje fosforu je možné použiť hydrogenfosforečnan alebo dihydrogenfosforečnan draselný alebo zodpovedajúce sodné soli.
Kultivačné médium musí dalej obsahovať soli kovov, ktoré sú nezbytné pre rast, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnatý. A konečne môže byť kultivačné médium okrem hore uvedených látok obohatené o esenciálne rastové látky ako napríklad aminokyseliny a vitamíny. Pre zvýšenie tvorby kyseliny pantoténovej je možné kultivačné médium ešte obohatiť θ jej prekurzory ako sú napríklad aspartát, β-alanín; ketoizovalerát, ketopantoát, pantoát a prípadne príslušné soli. Uvedené zložky môžu byť pridané do média jednorázovo na počiatku, alebo vhodným spôsobom počas kultivácie.
Pre kontrolu pH počas kultivácie sú vhodné zásadité zlúčeniny ako napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak alebo kyslé zlúčeniny ako napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Penenie kultivačnej zmesi je možné kontrolovať prídavkom činidiel potlačujúcich tvorbu peny ako sú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Stabilitu plazmidov je možné udržať prostredníctvom vhodného selekčného činidla napríklad antibiotika. Vhodné aeróbne podmienky je možné udržovať privádzaním kyslíka alebo kyslík obsahujúcej zmesi plynov, napríklad vzduchu, do kultivačného média. Vhodná teplota na kultiváciu baktérií sa normálne pohybuje od 20”C do 50’C a výhodne od 25’C do 45’C. Čas kultivácie by mal byt taký, aby bolo dosiahnuté maximum tvorby pantoténovej kyseliny. Toto maximum je zvyčajne dosiahnuté počas 10 až 160 hodín.
Koncentráciu produkovanej pantoténovej kyseliny je možné stanoviť známymi spôsobmi (pozri Velisek; Chromatographic Science 60, strana 515 až 560 (1992).
Na mikrobiologické stanovenie koncentrácie pantoténovej kyseliny je možné známym spôsobom použiť baktérie Lactobacillus plantarum kmeň ATCC8014 (pozri U.S. Pharmacopeia 1980; AOAC International 1980). Okrem toho je možné na stanovenie koncentrácie pantoténovej kyseliny použiť tiež čfalšie skúšobné organizmy ako napríklad Pediococcus acidilactici NCIB6990 (pozri Sollberg a Hegna; Methods v Enzymology 62, strana 201 až 204 (1979)).
Nasledujúce mikroorganizmy boli uložené v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, SRN) podlá ustanovení Budapeštianskej zmluvy:
- Escherichia coli K12 kmeň DH5amcr/pEKEx2panBC ako kmeň č. D5M12456
- Escherichia coli K12 kmeň DH5amcr/pECM3ilvBNCD ako kmeň Č. DSM12457
- Corynebacterium glutamicum ATCC13032AilvA ako kmeň č. D5M12455
Opis obrázkov
Obrázok l: Reštrikčná mapa plazmidu pURl znázorňujúca polohu sekvenovaných fragmentov. Skratky: Ss - cieľové miesto SspI, Sc - cieľové miesto Seal, Ps - cieľové miesto PstI, Pv - cieľové miesto PvuII, Sa cieľové miesto Sali, Sp - cieľové miesto Sphl a Ec - cieľové miesto EcoRI.
Obrázok 2: Reštrikčná mapa plazmidu pEKEx2panBC. Skratka Kanr vyznačuje gén pre rezistenciu ku kanamycínu, význam ostatných skratiek zodpovedá obrázku 1.
Obrázok 3: Reštrikčná mapa plazmidu pECM3ilvBNCD. Skratka Chlor vyznačuje gén pre rezistenciu k chloramfenikolu, Xb označuje cieľové miesto reštrikčného enzýmu Xbal.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vynález bude bližšie opísaný v nasledujúcich príkladoch.
Príklad 1
Klonovanie, sekvenovanie a expresia génov pre biosyntézu pantotenátu panB a panC z baktérie C. glutamicum
1. Klonovanie génov panB a panC
Chromozomálna DNA z baktérie C. glutamicum ATCC13032 bola izolovaná spôsobom podľa Schwarzera a Puhlera (Bio/Technology 9 (1990) strana 84 až 87) a naštiepená reštrikčnou endonukleázou Sau3A. Po elektroforetickom rozdelení boli extrahované fragmenty DNA s veľkosťami 3 až 7 kb alebo 9 až 20 kb a tie boli následne naligované do jedinečného cieľového miesta BamHI vo vektore pBR322.
Ligačnou zmesou boli potom transformované baktérie E. coli kmeň DH5amcr (pozri Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, (1990) strana 4645 až 4649; Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) strana 557 až 580). Kolónie nesúce inzert boli identifikované na základe ich citlivosti k tetracyklínu po preočkovaní na platne s LB-agarózou a prídavkom 10 gg/ml tetracyklínu. Po vyizolovaní plazmidov (pozri Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) boli klony rozdelené do 8 skupín po 400 plazmidoch s inzertom s veľkosťou 9 až 20 kb a do 9 skupín po 500 plazmidoch s inzertom s veľkosťou 3 až 7kb. Baktérie E. coli panB s mutáciou SJ2 (pozri Cronan et al. 1982, Journal of Bacteriology 149: strana 916 až 922) boli elektroporáciou transformované touto knižnicou, pozri Wehrmann et al., 1994, Microbiology 140: strana 3349 až 3356. Transformačné zmesi boli vysiate priamo na médium CGXII s prídavkom 15 g/1 agaru (pozri Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: strana 5595 až 5603). Z klonov, ktoré boli schopné rásť bez prídavku pantotenátu, bola vyizolovaná plazmidová DNA (pozri Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). Pri 8 plazmidoch bola pomocou opätovnej transformácie potvrdená schopnosť heterologne komplementovať defekt v géne panB u baktérií E. coli s mutáciou SJ2.
Pri týchto 8 plazmidoch bola vypracovaná reštrikčná mapa. Jeden z takto študovaných plazmidov, následne pomenúvaný ako pURl, obsahoval inzert s veľkosťou 9,3 kb (pozri obrázok 1). Transformáciou baktérií E. coli s mutáciou DV39 v géne panC (pozri Vallari a Rock, 1985, Journal of Bacteriology 164: strana 136 až 142) bolo potvrdené, že vektor pURl je rovnako schopný komplementovať defekt v géne panC v tomto mutante.
2. Sekvenovanie génov panB a panC
Fragment inzertu s veíkostou 2,2 kb (pozri obrázok 1) z plazmidu pURl bol sekvenovaný pomocou Sangerovej metódy terminácie DNA reťazce dideoxynukleotidy, pozri Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: strana 5463 až 5467. K tomu boli najskôr zhotovené pomocou exonukleázy 111 menšie fragmenty a tie boli sekvenované pomocou štandardných prajmerov (univerzálneho a reverzného prajmeru firmy Boehringer Mannheim, SPN). Elektroforetická analýza sekvenačnej zmesi bola vykonaná automatickým sekvenátorom využívajúcim laserom excitovanú fluorescenciu (A.L.F.) od firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech (Uppsala, Švédsko). Získaná nukleotidová sekvencia bola analyzovaná programovým balíkom HUSAP (Verzia 4.0, EMBL, Cambridge, Veíká Británia). Táto nukleotidová sekvencia je uvedená ako Sekvencia id. č.: 1. Analýzou boli identifikované dva otvorené čítacie rámce. Jeden otvorený čítací rámec s dĺžkou 813 bp, bol identifikovaný ako gén panB, kódujúci polypeptid s dĺžkou 271 aminokyselín a je uvedený ako Sekvencia id. č.:
2. Druhý otvorený čítací rámec obsahujúci 837 párov báz bol identifikovaný ako gén panC, kódujúci polypeptid 279 aminokyselín dlhý je uvedený ako Sekvencia id. č.: 3.
3. Expresia génov panB a panC
Gény panB a panG boli naklonované do expresného vektoru pEKEx2 vhodného pre expresiu v baktériách C. glutamicum (pozri Eikmanns et al., 1994, Microbiology 140: strana 1817 až 1828 (1994)). v tomto vektore sa obidva gény nachádzajú pod tou kontrolou silného tac-promotoru, ktorý je indukovateíný pomocou izopropyl-3~D-tiogalatopyranozidu (IPTG). Vlastné klonovanie bolo uskutočnené v dvoch krokoch. Najskôr bol pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR - polymerase chain re17 action) amplifikovaný počiatok génu panB. Do tohto génu bolo pomocou zodpovedajúceho prajmeru 19 bp pred štart-kodón génu panB vložené cieľové miesto pre reštrikčný enzým Sali (pozri prajmer 1: 5' GATCGTCGACCATCACATCTATACTCAT 3')· Druhý prajmer bol zvolený tak, aby bolo v amplifikovanom fragmente obsiahnuté interné cieľové miesto pre enzým EcoRI, ktoré sa v géne panB nachádza (prajmer 2: 5'ACCCGATGTGGCCGACAACC 3')· Teplota annealingu pri PCR bola 62’C a ako matrica bol použitý plazmid pURl (pozri Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989). Výsledný PCR-produkt s veľkosťou 468 bp bol naštiepený reštrikčnými endonukleázami Sali a EcoRI a naligovaný do rovnakým spôsobom ošetreného vektoru pEKEx2.
Touto ligačnou zmesou boli transformované bunky E. coli kmeň DHôamcr. Z trans formantov typu DH5amcr/pEKEx2panB* bol vyizolovaný vektor pEKEx2panB*.
V ďalšom kroku bol z plazmidu pURl vyštiepený 1761 bp dlhý EcoRI fragment obsahujúci druhú polovinu panBC klasteru. Tento fragment bol naklonovaný do vektoru pEKEx2panB*, ktorý už obsahoval PCR-produkt génu panB a bol predtým linearizovaný reštrikčným enzýmom EcoRI. Touto ligačnou zmesou boli transformované bunky E. coli kmeň DH5aamcr. Z trans formantov typu DHSamcr/pEKEx2panBC bol izolován vektor pEKEx2panBC (pozri obrázok 2), v ktorom je klaster génov panBC pod kontrolou tac promotoru.
Príklad 2
Klonovanie a sekvenovanie génu ilvD z C. glutamicum kódujúceho dehydratázu dihydroxykyselín
1. Izolácia mutantu ilvD z baktérií C. glutamicum
Baktérie C. glutamicum kmeň R127 (pozri Haynes 1989,
FEMS Microbiology Letters 61: strana 329 až 334) boli podrobené mutagenéze pomocou N-metyl-N-nitro-N-nitrózoguanidínu (pozri Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Za týmto účelom bolo k 5ml kultúre baktérií C. glutamicum pestovanej cez noc, pridaných 250 μΐ N-metyl-N-nitro-N-nitrózoguanidínu (s 5 mg/ml dimetylformamidu). Baktérie boli inkubované s týmto mutagénom 30 minút pri 30”C a pri 200 otáčkach . min-1, pozri Adelberg 1958, Journal of Bacteriology 76: strana 326. Tieto bunky boli potom dvakrát premyté sterilným 0,9% roztokom NaCl. Platne s kolóniami boli potom replikované na platne s minimálnym médiom CGXII s 15 g/1 agaru (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175: strana 5595 až 5603). Na tomto médie boli identifikované mutanty, ktoré boli schopné rásť iba po prídavku L-valínu, L-izoleucínu a L-leucínu (po 0,1 g/1).
V hrubom extrakte z týchto mutantov bola určovaná enzymatická aktivita dehydratázy dihydroxykyselín. Za týmto účelom boli tieto klony kultivované v 60 ml LB-média a boli centrifugované v exponenciálnej fáze rastu.
Bunková peleta bola raz premytá 0,05M draselno-fosforečnanovým tlmivým roztokom a potom v rovnakom tlmivom roztoku resuspendovaná. Bunkový obsah bol uvoľnený 10 minútovou ultrasonikáciou (Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). Potom boli oddelené bunkové zvyšky pomocou jednej 30 minútovej centrifugácie pri 13000 otáčkach .min-1 a pri 4eC. Supernatant (hrubý extrakt) bol použitý v enzymatickom teste. Reakčná zmes v tomto enzymatickom teste sa skladala z 0,2 ml 0,25M Tris/HCl, pH 8; 0,05 ml hrubého extraktu a 0,15 ml 65 mM a,p-dihydroxy-p-metylvalerátu.
Reakčné zmesi boli inkubované pri teplote 30’C, počas 10, 20 a 30 minút. Zo zmesi boli odoberané 200μ1 vzorky, v ktorých bola pomocou HPLC stanovovaná koncentrácia ketometylvalerátu (pozri Hara et al., 1985, Analytica Chimica Acta 172: strana 167 až 173). Ako vyplýva z tabulky 1, nevykazuje kmeň R127/7 žiadnu aktivitu dehydratázy dihydroxykyselín, zatial čo aktivity izomeroreduktázy a syntázy hydroxyoctovej kyseliny ako ďalších enzýmov syntézy aminokyselín s rozvetveným reťazcom sú stále patrné.
Tabulka 1:
Špecifické aktivity (v μιποί/ιπΐη na mg proteínu) rôznych enzýmov v kmeňoch C. glutamicum
kmeň dehydratáza dihydroxykyselín izomero- reduktáza syntáza hydroxyoctovej kyseliny
R127 0,003 0,05 0,07
R127/1 0,000 0,06 0,09
2. Klonovanie génu ilvD z baktérie C. glutamicum
Chromozomálna DNA z baktérie C. glutamicum kmeň R127 bola izolovaná spôsobom podlá Schwarzera a Puhlera, Bio/Technology 9 (1990, strana 84 až 87. Táto DNA bola potom naštiepená reštrikčným enzýmom Sau3A (Boehringer Mannheim) a rozdelená centrifugáciou na sacharózovom gradiente (pozri Sambrook et al., Mo20 lecular cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Frakcia obsahujúca fragmenty s velkosťou asi 6 až 10 kb bola použitá na ligáciu do vektoru pJCl (pozri Cremer et al., Molecular and General Genetics 220 (1990) strana 478 až 480). Vektor pJCl bol za týmto účelom vopred linearizovaný enzýmom BamHI a defosforylovaný. Päť nanogramov vektorovej DNA spolu s 20 ng DNA uvedenej frakcie chromozomálnej DNA bolo spojených v ligačnej reakcii, ktorou boli potom elektroporačne transformované mutanty kmeňa R127/7 (pozri Haynes a Britz, FEMS Microbiology Letters 61 (1989) strana 329 až 334).
Transformanty boli testované na schopnosť rastu na agarových platniach CGXII bez prídavku aminokyseliny s rozvetveným reťazcom. Z viac ako 5000 testovaných transformantov rástlo po otlačení na platne s minimálnym médiom a dvojdennej inkubácii pri 30’C celkom 8 klonov. Z týchto klonov boli izolované plazmidy spôsobom podlá Schwarzera et al., Bio/Technology (1990) 9: strana 84 až 87. Reštrikčná analýza plazmidovej DNA ukázala, že vo všetkých klonoch bol prítomný rovnaký plazmid, ktorý bol potom označený ako pRV. Tento plazmid nesie inzert s velkosťou 4,3 kb a bol pomocou opakovanej transformácie otestovaný na svoju schopnosť komplementovať mutáciu v géne ilvD v mutante R127/7. Pomocou ďalšieho subklonovania bola v tomto inzerte odhalená oblasť zodpovedná za komplementáciu mutácie génu ilvD v bunkách kmeňa R127/7 tvorená 2,9 kb dlhým fragmentom Scal/Xhol.
3. Sekvenovanie génu ilvD
Sekvencia nukleotidov v 2,9 kb dlhom Scal/Xhol-fragmente bola stanovená pomocou Sangerovej metódy terminácie DNA reťazca dideoxynukleotidmi, pozri Sanger et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: strana 5463 až 5467). Pritom bol použitý Auto21
Read Seguencing kit firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech, Uppsala, Švédsko. Elektroforetická analýza sekvenačnej zmesi bola vykonaná automatickým sekvenátorom využívajúcom laserom excitovanú fluorescenciu (A.L.F.) od firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech (Uppsala, Švédsko). Získaná nukleotidová sekvencia bola analyzovaná programovým balíkom HUSÁR (Verzia 4.0, EMBL, Cambridge, Veľká Británia). Táto nukleotidová sekvencia je uvedená ako Sekvencia id. č.: 4. Analýzou bol odhalený otvorený čítací rámec s dĺžkou 1836 bp, ktorý bol identifikovaný ako gén ilvD, kódujúci polypeptid s dĺžkou 612 aminokyselín. Tento proteín je uvedený ako Sekvencia id. č.: 5.
Príklad 3
Konštrukcia delečného mutantu baktérie C. glutamicum v géne ilvA
Najskôr bola v géne ilvA baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC13032 vykonaná delečná mutácia spôsobom, ktorý využíva systém na zámenu génov podľa Schäfera et al, Gene 145: strana 69 až 73 (1994)). Na konštrukciu inaktivačného vektoru pK19mobsacB ilvA bol najskôr z EcoRI fragmentu génu ilvA z vektoru pBM21 (Mockel et al., 1994, Molecular Microbiology 13: strana 833 až 842) vyštiepený interný, 241 bp dlhý BglII fragment. Táto operácia bola vykonaná tak, že bol najskôr vektor naštiepený enzýmom BglII, potom bola vykonaná elektroforéza na agarózovom géli, z ktorého bol vyrezaný interný BglII fragment génu ilvA a nakoniec bol vektor opäť zaligovaný.
V ďalšom kroku bol z vektoru izolovaný neúplný gén ilvA ako EcoRI fragment a ten bol naligovaný do vektoru pK19mobsacB linearizovaného rovnako enzýmom EcoRI (Schäfer 1994, Gene 145: strana 69 až 73). Získaným inaktivačným vektorom pK19mobsacB ilvA boli transformované baktérie E. coli kmeň s 17-1 (Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166: strana 557 až 580). Potom bol tento vektor prenesený konju22 gáciou do baktérií C. glutamicum ATCC13032 (pozri Schäfer et al., 1990, Journal of Bacteriology 172: strana 1663 až 1666). Tak boli získané klony baktérie C. glutamicum rezistentné ku kanamycínu, v ktorých genómu bol integrovaný inaktivačný vektor. V ďalšom kroku boli na LB médie so sacharózou (konkrétne na médie s 15 g/1 agaru, 2 % glukózy a 10 % sacharózy, pozri Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) selektované baktérie rezistentné ku kanamycínu, ktoré vďaka druhej rekombinačnej udalosti tento vektor opäť stratili, pozri Jáger et al., 1992, Journal of Bacteriology 174: strana 5462 až 5465. Kolónie týchto baktérií boli preočkované na platne s minimálnym médiom CGX1I s 15 g/1 agaru (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175 (1993), strana 5595 až 5603) s prídavkom a bez prídavku 2 mM L-izoleucínu, alebo s prídavkom a bez prídavku 50 pg/ml kanamycínu. Týmto postupom bolo získaných 36 klonov, ktoré boly vďaka delécii vektoru senzitívne ku kanamycínu a auxotrofné s ohíadom na izoleucín, a ktorých genóm obsahoval neúplný gén ilvA (alelu ilvA). Jeden z týchto klonov bol označený ako kmeň ATCC130320 ilvA a bol použitý v ďalších pokusoch.
Príklad 4
Expresia génov ilvBN, ilvC a ilvD v baktériách C. glutamicum
Gény pre syntézu hydroxyoctovej kyseliny (ilvBN) a izomeroreduktázy (ilvC), pozri Cordes et al., 1992, Gene 112: strana 113 až 116 a Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: strana 5595 až 5603 a gén pre dehydratázu dihydroxykyselxn (ilvD, pozri príklad 2) boli za účelom expresie naklonované do vektoru pECM3. Tento vektor je odvodený od vektoru pECM2 (pozri Jáger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: strana 5462 až 5465), od ktorého sa líši deléciou pri23 blizne 1 kbp dlhého fragmentu BamHI/BglII, ktorý nesie gén rezistencie ku kanamycínu.
Vo vektore pKK5 (pozri Cordes et al., 1992, Gene 112: strana 113 až 116) sa nachádzajú gény ilvBNC prenesené z vektoru pJCl (pozri Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: strana 478 až 480). Z tohto vektoru bol izolovaný 5,7 kb dlhý Xbal-fragment obsahujúci gény ilvBNC a ten bol spojený s 3,1 kb dlhým Xbal fragmentom obsahujúcom gén ilvD z vektoru pRV a s vektorom pECM3 linearizovaným reštrikčným enzýmom Xbal. Takto pripravená ligačná zmes bola použitá k transformácii E. coli kmeň DHSamcr.
Z jedného z transformantov typu DHSamcr/pECM3ilvBNCD bol získaný plazmid pECM3ilvBNCD (pozri obrázok 3).
Pomocou elektroporácie (pozri Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: strana 329 až 334) a následnej selekcie na rezistenciu k chloramfenikolu bol vpravený plazmid pECM3ilvBNCD do E. coli kmeň ATCC13032 ilvA za vzniku kmeňa ATCC13032AilvA/pECM3ilvBNCD. Ďalej bol elektroporáciou (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 51: strana 329 až 334) a následnou selekciou na rezistenciu ku kanamycínu vložený plazmid pEKEx2panBC do baktériálnych kmeňov ATCC13032 a ATCC13032AilvA a tak boli získané kmene ATCC13032/pEKEx2panBC a ATCC13032AilvA/ pEKEx2panBC. Do baktérií kmeňa ATCC13032 ilvA/pECM3ilvBNCD boli elektroporáciou (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: strana 329 až 334) a následnou selekciou na rezistenciu ku kanamycíny a chloramfenikolu vložené plazmidy pEKEx2panBC a pEKEX2. Týmto spôsobom boli získané kmene ATCC13032 AilvA/ pECM3ÍlvBNCD pEKEX2 a ATCC13032AÍlvA/pECM3ÍlvBNCD pEKEx2panBC.
Príklad 5
Konštrukcia panC-mutantu baktérie C. glutamicum neschopného syntetizovať kyselinu pantoténovú
Mutantný kmeň baktérie C. glutamicum R127 panC bol zhotovený pomocou inaktivačného vektoru pKISmob (pozri Schäfer et al. 1994, Gene 145: strana 69 až 73).
Pred vlastnou konštrukciou panC-inaktivačného vektoru bol najskôr polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) amplifikovaný 168 bp dlhý centrálny fragment génu panC (nukleotidy 265 až 432 z celého génu s 837 bp) C. glutamicum. Ako matrica bol použitý vektor pURl (pozri príklad 6); ako prajmery boli použité 20-mery: prajmer 1: 5' GTTCGCACCCGATGTGGAGG 3'; prajmer 2: 5' ATGCACGATCAGGGCGCACC 3'. Vlastná PCR bola vykonaná podľa Sambrooka et al., Molecular cloning. A laboratory manual, (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) pričom teplota annealingu bola 55‘C. Vzniknutý fragment bol najskôr naklonovaný do cieľového miesta Smal vektoru pUC18 a z tohto vektoru bol potom prenesený ako EcoRI/Sall fragment do inaktivačného vektoru pK18mob (pozri Schäfer et al. 1994, Gene 145: strana 69 až 73). Takto vzniknutý vektor pKiemob'panC* bol použitý na transformáciu E. coli kmeň s 17-1. Z baktérie E. coli bol následne konjugáciou prenesený do C. glutamicum kmeň R127. Pomocou selekcie na rezistenciu ku kanamycínu boli získané klony baktérií C. glutamicum R127, v ktorých došlo k homológnej rekombinácii integračného vektoru do génu panC. Takto vzniknutý kmeň R127panC::pK18mob'panC* je používaný na stanovenie D-pantotenátu.
Príklad 6
Kvantitatívne stanovenie D-pantotenátu
Na kvantitatívne stanovenie D-pantotenátu bol skonštruovaný panC mutantný kmeň baktérií C. glutamicum R127panC:: pKISmob'panC' (pozri príklad 5). Rast týchto baktérií je priamo závislý od koncentrácie D-pantotenátu v kultivačnom médie. Tento kmeň je auxotrofný vzhladom na kyselinu pantoténovú a nevykazuje žiadny rast v prítomnosti β-alanínu a D-pantoátu.
Ako vhodné testovacie médium na stanovenie pantotenátu týmto indikátorovým kmeňom bolo vybrané médium CGXII (pozri Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: strana 5595 až 5603). Do inkubačných skúmaviek (Falcon 2057, Becton a Dickinson, New Jersey, USA) boli napipetované vždy 3 ml média CGXII koncentrovaného 4/3 spolu s jedným mililitrom štandardu obsahujúceho pantoténovú kyselinu alebo testovaného roztoku. Tieto skúmavky boli potom inokulované indikátorovým kmeňom baktérie. Ako inokulum bolo vždy použitých 60 μΐ glycerínovej kultúry indikátorového kmeňa. Po 40 hodinách inkubácie pri teplote 30*C bola na spektrofotometre Novaspec 4049 (LKB Bio-chróm, Cambridge, Velká Británia) zmeraná optická hustota kultúry pri vlnovej dĺžke 600 nm. Pomocou kalibračnej krivky bola potom určená koncentrácia kyseliny pantoténovej. Tento kmeň vykazuje až do koncentrácie 25 μg/l lineárnu závislosť rastu od koncentrácie kyseliny pantoténovej pri optických hustotách v rozsahu od 0,5 do 10. Pri príprave glycerínových kultúr sa najskôr indikátorový kmeň počas 24 hodín pestuje na médie CGXII (tzv. vyhladovenie na D-pantotenát). Po tomto vyhladovení sa 1050 μΐ tejto kultúry zmieša so 700 μΐ glycerínu. Táto kultúra sa potom skladuje pri -70C a na stanovenie sa potom hore opísaným spôsobom používajú 60μ1 ali26 kvóty. Na referenčné meranie bol použitý pantotenát sodný od firmy Sigma (Deisenhofen, Nemecko).
Príklad 7
Výroba D-pantotenátu v rôznych kmeňoch baktérie C. glutamicum
Kmene ATCC13032, ATCC13032/pEKEx2panBC, ATCC13032AilvA a ATCC13032ÄilvA/pEKEx2panBC boli testované z hľadiska schopnosti tvoriť kyselinu pantoténovú. Baktérie boli najskôr nasadené do 60 ml média BHIM (Brain Heart Infusion Médium, Difco Laboratories, Detroit, USA) a inkubovaná 14 hodín pri 30’C. Potom boli bunky dvakrát premyté 0,9% (w/v) roztokom NaCl a touto suspenziou bolo naočkovaných 60 ml média CgXIl tak, aby OD6q0 robila 0,5. Toto médium bolo identické s médiom opisovaným Keilhauerom et al. v Journal of Bacteriology (1993) 175: strana 5595 až 5603, až na to, že navyše obsahovalo 2mM L-izoleucín. Médium CgXIl opisované Keilhauerom et al. je uvedené v tabuľke 2.
Tabuľka 2:
Zloženie média CGXII
Zložka Koncentrácia
(nh4)2so4 močovina 20 g/1 5 g/1
kh2po4 K2 hP°4 Mg2°4.7H2O Kyselina 3-morfolinopropánsulfónová i g/1 1 g/1 0,25 g/1 42 g/1
CaCl2 FeSO4.7H2O MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O CuSO4 10 mg/1 10 mg/1 10 mg/1 1 mg/1 0,2 mg/1
NÍC12.6H2O biotín (pH 7) glukóza Kyselina protokatechuová (3,4-dihydroxy- benzoová) 0,02 mg/1 0,2 mg/1 40 g/1 0,03 mg/1
Počas kultivácie kmeňov ATCC13032/pEKEx2panBC a ATCC1303A ilvA/pEKEx2panBC bol k médiu po 5 hodinách pridaný izopropyltio-p-D-galaktozid (IPTG) do konečnej koncentrácie 1 mM. Po ďalšej 24 hodinovej kultivácii boli odobrané vzorky, bunky odstránené centrifugáciou a supernatant sterilné prefiltrovaný. Koncentrácia vzniknutého pantotenátu bola určená spôsobom opísaným v príklade 6. Výsledky sú uvedené v tabulke 3.
Tabuľka 3:
Produkcia D-pantotenátu tvorená v rôznych kmeňoch C. glutamicum
Kmeň Koncentrácia D-pantotenátu v (mg/1)
ATCC13032 0,01
ATCC13 0 3 2/pEKEx2panBC 0,03
ATCC13032Δί1νΑ 0,06
ATCC13032ÄÍlvA/pEKEx2panBC 0,3
Príklad 9
Produkcia D-pantotenátu v rôznych kmeňoch C. glutamicum s prídavkom β-alanínu
Na kvantifikáciu tvorby pantotenátu boli vybrané kmene ATCC13032' AilvA/pECM3ílvBNCD pEKEx2 a ATCC13032áilvA/pEGM3ilvBNCD pEKEx2panBC. Baktérie boli najskôr 14 hodín inkubované v 60 ml média BHMI (Difco Laboratories, Detroit, USA) s prídavkom 25 mg/1 kanamycínu a 3 mg/1 chloramfenikolu pri teplote 30’C. Potom boli kultúry dvakrát premyté 0,9% (w/v) roztokom NaCl a táto suspenzia bola použitá na naočkovanie 60 ml média CGXII tak, že počiatočná OD600 robila 0,5. Médium obsahovalo navyše 2mM L-izoleucín, 25 mg/1 kanamycín, 3 mg/1 chloramfenikol a β-alanín v konečnej 20mM koncentrácii. Po párhodinovej kultivácii bol k médiu pridaný izopropyltio^-D-galaktozid (IPTG) do konečnej koncentrácie 1 mM. Po 49 a 74 hodinách boli odobrané vzorky. Z týchto vzoriek boli najskôr odstránené centrifugáciou bunky a supernatant bol potom sterilné prefiltro29 vaný. Koncentrácia vzniknutého pantotenátu bola určená spôsobom opísaným v príklade 6. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.
Tabuľka 4:
Akumulácia D-pantotenátu v rôznych kmeňoch baktérie
C. glutamicum
Kmeň Koncentrácia D-pantotenátu [mg/l] po
49 hodinách 74 hodinách
ATCC13 0 3 2á i lvA/pECM3 i lvBNCD 80 100
pEKEx2
ATCC1303 2AÍ lvA/pECM3 i 1 vBNCD 920 980
pEKEx2panBC
-30INFORMÁCIE O SEKVENCII ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÉŽKA: 2164 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTISENSE: nie (vi) PÔVOD:
(A) ORGANIZMUS: Corynebacterium glutamicum (B) KMEŇ: ATCC13032 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KÉÚČ: CDS (B) POLOHA: 351 až 1163 (C) ĎALŠIE INFORMÁCIE: štart kodón = 351; produkt = ketopantoáthydroxy-metyltransferáza; gén = panB (A) MENO/KÉÚČ: CDS (B) POLOHA:1166 až 2002 (C) ĎALŠIE INFORMÁCIE: štart kodón = 1166; produkt pantotenátsyntáza; gén = panC (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 1:
GCTTCGGGGT ACCAATTCCT TTAAGAACCA TCAGATCAAT CTGTTGTACA TTCTCGGCCA 60
GATTCAGCTT TTCGGTAAGG ACGAAACACT TTCACTTGAA TCGGCAGCAA AGTTTCTTAA 120
AGTTTCTAAG GCAACTGCAA CGAGGTATTT TAGAACTCTC CGAGAAATGG AATTAGTTCA 180
CGAGGTCAGC AAACGCCCTT TGCGGTTTGC GCTCÁCGGAT AAAGGTCGTG AGATAGTAGG 240
TCTTGAGGTA AAAATTTGAC TCCATAACGA GAACTTAATC GAGCAACACC CCTGAACAGT 300
GAATCAAATC GGAAT'ľTATT TATTCTGAGC TGGTCATCAC ATCTATACTC ATG CCC Met Pro 356
i
ATG TCA GGC Met Ser Gly ATT GAT GCA AAG AAA ATC CGC ACC CGT CAT TTC CGC GAA 404
Íle Asp Ala Lys Lys 10 íle Arg Thr Arg His 1S Phe Arg Glu
5
GCT AAA GTA AAC GGC CAG AAA GTT TCG GTT CTC ACC AGC TAT GAT GCG 452
Ala Lys Val Asn Gly Gin Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr Asp Ala
20 25 30
CTT TCG GCG CGC ATT TTT GAT GAG GCT GGC GTC GAT ATG CTC CTT GTT 500
Leu Ser Ala Arg íle Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu Leu Val
35 40 45 50
GGT GAT TCC GCT GCC AAC GTT GTG CTG GGT CGC GAT ACC ACC TTG TCG 548
Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr Leu Ser
55 60 65
ATC ACC TTG GAT GAG ATG ATT GTG CTG GCC AAG GCG GTG ACG ATC GCT 596
íle Thr Leu Asp Glu Met íle Val Leu Ala Lys Ala Val Thr íle Ala
70 75 80
ACG AAC· CGT GCG CTT GTG GTG GTT GAT CTG CCG TTT GGT ACC TAT GAG 644
Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr Tyr Glu
85 90 95
GTG AGC CCA AAT CAG GCG GTG GAG TCC GCG ATC CGG GTC ATG CGT GAA 692
Val Ser Pro Asn Gin Ala Val Glu Ser Ala íle Arg Val Met Arg Glu
100 105 110
ACG GGT GCG GCT GCG GTG AAG ATC GAG GGT GGC GTG GAG ATC GCG CAG 740
Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys íle Glu Gly Gly 125 Val Glu íle Ala Gin 130
115 120
ACG ATT CGA CGC ATT GTT GAT GCT GGA ATT CCG GTT GTC GGC CAC ATC 788
Thr íle Arg Arg íle Val Asp Ala Gly íle Pro Val Val Gly His Íle
135 ŕ TCC 140 145
GGG TAC ACC CCG CAG TCC GAG CAT TTG GGC GGC CAC GTG GTT CAG 836
Gly Tyr Thr Pro Gin Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val Val Gin
150 155 160
GGT CGT GGC GCG AGT TCT GGA AAG CTC ATC GCC GAT GCC CGC GCG TTG 884
Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu íle Ala Asp Ala Arg Ala Leu
165 170 175
GAG CAG GCG GGT GCG TTT GCG GTT GTG TTG GAG ATG GTT CCA GCA GAG 932
Glu Gin Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro Ala Glu
180 185 190
GCA GCG CGC GAG GTT ACC GAG GAT CTT TCC ATC ACC ACT ATC GGA ATC 980
Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Íle Thr Thr íle Gly íle
195 200 205 210
GGT GCC GGC AAT GGC ACA GAT GGG CAG GTT TTG GTG TGG CAG GAT GCC 1028
Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gin Val Leu Val Trp Gin Asp Ala
215 220 225
TTC GGC CTC AAC CGC GGC AAG AAG CCA CGC TTC GTC CGC GAG TAC GCC 1076
Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu Tyr Ala
230 235 240
ACC TTG GGC GAT TCC TTG CAC GAC GCC GCG CAG GCC TAC ATC GCC GAT 1124
Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gin Ala Tyr íle Ala Asp
245 250 255
ATC CAC GCG GGT ACC TTC CCA GGC GAA GCG GAG TCC TTT TA ATG CAG 1171
íle His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe Met Gin
260 265 270 1
GTA GCA ACC ACA AAG CAG GCG CTT ATC GAC GCC CTC CTC CAC CAC AAA 1219
Val Ala Thr Thr Lys Gin Ala Leu íle Asp Ala Leu Leu His His Lys
5 10 15
TCC GTC GGG CTC GTC CCC ACC ATG GGT GCG CTA CAC AGC GGA CAC GCC 1267
Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly His Ala
20 25 30
TCG TTG GTT AAA GCA GCA CGC GCT GAA AAC GAC ACT GTT GTA GCC AGT 1315
Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val Ala Ser
-35 40 45 50
ATT TTT GTC AAT CCC CTG CAG TTT GAA GCA CTC GGT GAT TGC GAT GAT 1363
íle Phe Val Asn Pro Leu Gin Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys Asp Asp
55 60 65
TAC CGC AAC TAT CCC CGC CAA CTC GAC GCC GAT TTA GCA CTG CTT GAA 1411
Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gin Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu Leu Glu
70 75 80
GAG GCA GGT GTG GAT ATT GTG TTC GCA CCC GAT GTG GAG GAA ATG TAC 1459
Glu Ala Gly Val Asp íle Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu Mec Tyr
85 90 95
CCC GGT GGC TTG CCA CTA GTG TGG GCG CGC ACC GGT TCC ATC GGA ACA 1507
Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser íle Gly Thr
100 105 110
-321555
AAA TTG GAG GGT GCC AGC AGG CCT GGC CAT TTC GAT GGT GTG GCT ACC
Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val Ala Thr
115 120 125 130
GTG GTG GCG AAG CTG TTC AAT TTG GTG CGC CCT GAT CGT GCA TAT TTT
Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala Tyr Phe
135 140 145
GGA CAA AAA GAT GCT CAG CAG GTT GCG GTG ATT CGG CGA TTG GTT GCC
Gly Gin Lys Asp Ala Gin Gin Val Ala Val íle Arg Arg Leu Val Ala
150 1 155 160
GAT CTA GAC ATT CCC GTG GAG ATT CGT CCC GTT CCG ATT ATT CGT GGC
Asp Leu Asp íle Pro Val Glu íle Arg Pro Val Pro Zle íle Arg Gly
165 170 175
GCC GAT GGC TTA GCC GAA TCC AGC CGC AAT CAA CGT CTT TCT GCG GAT
Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gin Arg Leu Ser Ala Asp
180 185 190
CAG CGA GCG CAA GCT CTG GTG CTG CCG CAG GTG TTG AGT GGG TTG CAG
Gin Arg Ala Gin Ala Leu Val Leu Pro Gin Val Leu Ser Gly Leu Gin
195 200 205 210
CGT CGA AAA GCA GCT GGT GAA GCG CTA GAT ATC CAA GGT GCG CGC GAC
Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp íle Gin Gly Ala Arg Asp
215 220 225
ACC TTG GCC AGC GCC GAC GGC GTG CGC TTG GAT CAC CTG GAA ATT GTC
Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu íle Val
230 235 240
GAT CCA GCC ACC CTC GAA CCA TTA GAA ATC GAC GGC CTG CTC ACC CAA
Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu íle Asp Gly Leu Leu Thr Gin
1603
1651
1699
17«; 7
Π95
184 3
1891
1929
245
250
255
CCA GCG TTG GTG GTC GGC GCG ATT TTC GTG GGG CCG GTG CGG TTG ATC 19E7
Pro Ala Leu Val Val Gly Ala íle Phe Val Gly Pro Val Arg Leu íle
260 265 270
GAC AAT ATC GAG CTC TAGTACCAAC CCTGCGTTGC AGCACGCAGC TTCGCATAAC 2042
Asp Asn íle Glu Leu
275
GCGTGCTCAG CTCAGTGTTT TTAGGTGCGC GGTGCGGATC GGAACCGGGA GTTGGCCACT
GCGGTGGCGT GGCCTCACCC GACAGCGCCC ATGCCGCCTG ACGAGCTGCA CCCAACGCCA
CA
2102
2162
2164
INFORMÁCIE O SEKVENCII ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 271 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 2:
Met Pro Met Ser Gly íle Asp Ala Lys Lys íle Arg Thr Arg His Phe
1 5 10 15
65 Arg Glu Ala Lys Val Asn Gly Gin Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ala Leu Ser Ala Arg íle Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu
-3335 40 45
Leu Val Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr
50 55 60
Leu 65 Ser íle Thr Leu Asp Glu 70 Met íle Val Leu Ala Lys Ala Val Thr 75 80
íle Ala Thr Lys Arg Ala Leu 85 Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr 90 95
Tyr Glu Val Ser 100 Pro Asn Gin Ala Val Glu Ser Ala íle Arg Val Met 105 110
Arg Glu Thr 115 Gly Ala Ala Ala Val Lys íle Glu Gly Gly Val Glu íle 120 125
Ala Gin Thr 130 íle Arg Arg íle 135 Val Asp Ala Gly íle Pro Val Val Gly 140
His 145 íle Gly Tyr Thr Pro Gin 150 Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val 155 160
Val Gin Gly Arg Gly Ala Ser 165 Ser Gly Lys Leu íle Ala Asp Ala Arg 170 175
Ala Leu Glu Gin 180 Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro 185 190
Ala Glu Ala 195 Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser íle Thr Thr íle 200 205
Gly íle Gly 210 Ala Gly Asn Gly 215 Thr Asp Gly Gin Val Leu Val Trp Glr. 220
Asp 225 Ala Phe Gly Leu Asn Arg 230 Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu ’ 235 240
Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser 245 Leu His Asp Ala Ala Gin Ala Tyr íle 250 255
Ala Asp íle His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe 260 265 270 INFORMÁCIE 0 SEKVENCIÍ ID. Č. 3: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: (A) DĹŽKA: 279 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 3:
Met 1 Gin Val Ala Thr 5 Thr Lys Gin Ala Leu íle Asp Ala 10 Leu Leu 15 His
His Lys Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Mec Gly Ala Leu His Ser Gly
20 25 30
His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val
35 40 45
Ala Ser íle Phe Val Asn Pro Leu Gin Phe Glu Ala Leu Gly Asp cys
50 55 60
Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gin Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu
-3465 70
5 Leu Met Glu Tyr Glu Ala Gly Val Asp 85
Pro Gly 100 Gly Leu Pro
10 Gly Thr Lvs 1Í5 Leu Glu Gly Ala
Ala Thr 120 Val Val Ala Lys Leu 135
15 Tyr 145 Phe Gly Gin Lys Aso 150 Ala
Val Ala Asp Leu Asd 165 íle Pro
20
Arg Gly Ala Asp 180 Gly Leu Ala
25 Ala Asp Gin 195 Arg Ala Gin Ala
Leu Gin 210 Arg Arg Lys Ala Ala 215
30 Arg 225 Asp Thr Leu Ala Ser 230 Ala
íle Val Asp Pro Ala 245 Thr Leu
35
Thr Gin Pro Ala 260 Leu Val Val
40 Leu íle Asp 275 Asn Zle Glu Leu
80
Zle Val Phe 90 Ala Pro Asp Val Glu 95 Glu
Leu Val 105 Trp Ala Arg Thr Gly 110 Ser íle
Ser 120 t Arg Pro Gly His Phe 125 Asp Gly Val
Phe Asn Leu Val Arg 140 Pro Asp Arg Ala
Gin Gin Val Ala 155 Val íle Arg Arg Leu 160
Val Glu íle 170 Arg Pro Val Pro íle 175 íle
Glu Ser 185 Ser Arg Asn Gin Arg 190 Leu Ser
Leu 200 Val Leu Pro Gin Val 205 Leu Ser Gly
Gly Glu Ala Leu Asd 220 íle Gin Gly Ala
Asp Gly Val Arg 235 Leu Asp His Leu Glu 240
Glu Pro Leu 250 Glu íle Asp Gly Leu 255 Leu
Gly Ala 265 íle Phe Val Gly Pro 270 Val Arg
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 2952 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTISENSE: nie (vi) PÔVOD:
(A) ORGANIZMUS: Corynebacterium glutamicum (B) KMEŇ: ATCC13032 (C) IZOLÁT: mutant R127 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) POLOHA: 290 až 2125 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: štart kodón = 290? číslo EC = 4.2.1.9; produkt = dehydratáza dihydroxy kyselín? gén = ilvD (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 4:
-35AGTACTTGGA GCGCCAAAAG GCACTGGGCA AGCCAGTTCA GTTGAACTTC GATGACGACA
CCGATGGGAA TACAACACAA ACAGAAAGCG TTGAATCCCA AGAGACCGGA CAAGCCGCGT
CTGAAACCTC ACATCGTGAT AACCCTGCGT CACAGCACTA GAGTGTAATA AGCCGTCCGA
ACCAAAGGTC CACACCTCTG CACGAGT^GA AGCTCACCCA AGTTTTCAAA GTGCCGTTGA
TTCTTGACAA CCACCCGCCG CTCTTTAGAG CAGATTTGAA AAGCGCATC ATG ATC Met Íle 280
CCA CTT CGT TCA Pro Leu Arg Ser AAA GTC ACC ACC GTC GGT CGC AAT GCA GCT GGC GCT
Lys Val Thr Thr Val 290 Gly Arg Asn Ala Ala 295 Gly Ala
285
CGC GCC CTT TGG CGT GCC ACC GGC ACC AAG GAA AAT GAG TTC GGC AAG
Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe Gly Lys
300 305 310
CCA ATT GTT GCC ATC GTA AAC TCC TAC ACC CAG TTC GTG CCC GGA CAC
Pro íle Val Ala íle Val Asn Ser Tyr Thr Gin Phe Val Pro Gly His
315 320 325
GTT CAC CTT AAG AAC GTC GGC GAT ATT GTG GCA GAT GCA GTG CGC AAA
Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp íle Val Ala Asp Ala Val Arg Lys
330 335 340 345
GCC GGT GGC GTT CCA AAG GAA TTC AAC ACC ATC GTC GAT GAC GGC ATC
Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr íle Val Asp Asp Gly íle
350 355 360
GCC ATG GGA CAC GGC GGC ATG CTG TAC TCC CTG CCA TCC CGT GAA ATC
Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser Arg Glu íle
365 370 375
ATC GCC GAC TCC GTC GAA TAC ATG GTC AAC GCA CAC ACC GCC GAC GCC
íle Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr Ala Asp Ala
380 385 390
ATG GTG TGT ATC TCC AAC TGT GAC AAG ATC ACC CCA GGC ATG CTC AAC
Met Val Cys íle Ser Asn cys Asp Lys íle Thr Pro Gly Met Leu Asn
395 400 405
GCA GCA ATG CGC CTG AAC ATC CCA GTG GTC TTC GTT TCC GGT GGC CCA
Ala Ala Met Arg Leu Asn íle Pro Val Val Phe Val Ser Gly Gly Pro
410 415 420 425
ATG GAA GCT GGC AAG GCT GTC GTC GTT GAG CGC GTT GCA CAC GCA CCA
Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Glu Arg Val Ala His Ala Pro
430 435 440
ACC GAC CTC ATC ACC GCG ATC TCC GCA TCC GCA AGC GAT GCA GTC GAC
Thr Asp Leu íle Thr Ala íle Ser Ala Ser Ala Ser Asp Ala Val Asp
445 450 455
GAC GCA GGC CTT GCA GCC GTT GAA CGA TCC GCA TGC CCA ACC TGT GGC
Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Arg Ser Ala cys Pro Thr Cys Gly
4 60 465 470
TCC TGC TCC GGT ATG TTC ACC GCG AAC TCC ATG AAC TGC CTC ACC GAA
Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Mec Asn Cys Leu Thr Glu
475 480 485
GCT CTG GGA CTT TCT CTC CCG GGC AAC GGC TCC ACT CTG GCA ACC CAC
Ala 490 Leu Gly Leu Ser Leu 495 Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala 500 Thr His 505
GCA GCA CGT CGC GCA CTG TTT GAA AAG GCC GGC GAA ACC GTC GTT GAA
5 Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val Val Glu
510 I 515 520
CTG TGC CGC CGC TAC TAC GGT GAA GAA GAC GAA TCC GTT CTG CCA CGT
10 Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu Pro Arg
525 530 535
GGC ATT GCC ACC AAG AAG GCA TTC GAA AAC GCA ATG GCA CTG GAT ATG
Gly íle Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu Asp Met
540 545 550
15 GCC ATG GGT GGA TCC ACC AAC ACC ATC CTC CAC ATC CTC GCA GCT GCC
Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr íle Leu His íle Leu Ala Ala Ala
555 560 565
20 CAG GAA GGC GAA GTT GAC TTC GAC CTC GCA GAC ATC GAC GAA CTG TCC
Gin Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp íle Asp Glu Leu Ser
570 575 580 585
25 AAA AAC GTC CCC TGC CTG TCC AAG GTT GCA CCA AAC TCC GAC TAC CAC
Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp Tyr His
590 595 600
ATG GAA GAC GTC CAC CGC GCC GGT CGC ATT CCA GCA CTG CTC GGC GAG
30 Met Glu Asp Val HiS Arg Ala Gly Arg íle Pro Ala Leu Leu Gly Glu
605 610 615
CTC AAC CGC GGT GGC CTG CTG AAC AAG GAC GTC CAC TCC GTT CAC TCC
Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser Val His Ser
620 625 630
35 AAC GAC CTT GAA GGT TGG TTG GAT GAC TGG GAT ATC CGC TCT GGC AAG
Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp íle Arg Ser Gly Lys
635 640 645
40 ACC ACC GAA GTA GCA ACC GAA CTC TTC CAC GCA GCC CCA GGT GGC ATC
Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro Gly Gly íle
650 655 660 665
CGC ACC ACC GAA GCA TTC TCC ACC GAG AAC CGC TGG GAC GAA CTC GAC
45 Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu Leu Asp
670 675 680
ACC GAC GCT GCC AAG GGC TGC ATC CGC GAC GTT GAA CAC GCC TAC ACC
Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys íle Arg Asp Val Glu His Ala Tyr Thr
50 - 685 690 695
GCC GAC GGC GGC CTG GTT GTT CTT CGC GGC AAC ATC TCC CCT GAC GGC
Ala Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn íle Ser Pro Asp Gly
700 705 710
55 GCA GTG ATC AAG TCC GCA GGT ATC GAA GAA GAG CTG TGG AAC TTC ACC
Ala Val íle Lys Ser Ala Gly íle Glu Glu Glu Leu Trp Asn Phe Thr
715 720 725
60 GGA CCA GCA CGA GTT GTC GAA AGC CAG GAA GAG GCA GTC TCT GTC ATC
Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gin Glu Glu Ala Val Ser Val íle
730 735 740 745
CTG ACC AAG ACC ATC CAA GCT GGC GAA GTT CTG GTC GTC CGC TAC GAA
65 Leu Thr Lys Thr íle Gin Ala Gly Glu Val Leu Val Val Arg Tyr Glu
750 755 760
GGC CCA TCA GGT GGA CCA GGC ATG CAG GAA ATG CTT CAC CCA ACC GCA
1015
1063
1111
1159
1207
1255
1303
1351
1399
47
1495
1543
1591
1639
1687
1735
1783
Gly Pro Ser Gly Gly 765 Pro Gly Met Gin 770 Glu Met Leu His Pro 775 Thr Ala
TTC CTC AAG GGA TCC GGC CTG GGC AAG AAG TGT GCA CTG ATC ACC GAC
Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu íle Thr Asp
780 785 790
GGC CGT TTC TCC GGA GGT TCC TCA GGA CTG TCC ATC GGC CAC GTC TCC
Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser íle Gly His Val Ser
755 800 805
CCA GAA GCA GCA CAC GGC GGA GTC ATT GGT CTG ATC GAA AAC GGC GAC
Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val íle Gly Leu íle Glu Asn Gly Asp
810 815 820 825
ATC GTC TCC ATC GAC GTT CAC AAC CGC AAG CTC GAA GTT CAG GTC TCC
íle Val Ser íle Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val Gin Val Ser
830 835 840
GAC GAG GAA CTC CAG CGC CGC CGC GAC GCT ATG AAC GCC TCC GAG AAG
Asp Glu Glu Leu Gin Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala Ser Glu Lys
845 850 855
CCA TGG CAG CCA GTC AAC CGT AAC CGC GTT GTC ACC AAG GCA CTG CGC
Pro Trp Gin Pro Val Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala Leu Arg
860 865 870
GCA TAC GCA AAG ATG GCT ACC TCC GCT GAT AAG GGT GCA GTC CGT CAG
Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val Arg Gin
875 880 885
GTC GAC TAACCCTTTG TGAGTGTTTG AGCACCGGTT CCCTACTTTG GGTTCCGGTG
Val Asp
890
CTTTTTCATG TCTTGGCCTG TGTGGGCGTG GTGGAGCTCC CCGTTGCAAA TACTCACCAC
AAGTTGCAGG ATTTCTGCTG GTTGTGGTGG ATTTTCCCGC TTTATAGCCC TATGCGTGCA
ACTTTCGGAC CGATTCCAAA GGGCAAAGCC CTGTTTGTGG TGGATCCTTG CCCTGGAAGC
TTTCAGGAAC CACAACTACC CCACTGACCC CAAAGTGGAT AGGCCCTATT CTTCCGTTTA
AGCGCCTCAA ACACCTCTCC CCACACTTGA CCCATTAGGC AATTACGAAT CCTTAAACAG
CCTTCTACAG CACCATGCCC C .AAACCGAAC CCAGGCATGA AAAAGACCCT CACCAGGAGG
GTCTTTTTCT AAAACTTTGG CTACGCGATT GGGTTCACAC CCGCACCGAA CCACCACAGC
AGAACTGCCG CTGCGATGCC GATGACCACG AAGATCCACG AGCTCACCAG TGGACGCTTT
GCCCAACCTC GGCCAGAGTC AAGGGAAATC TTGCCGGGGC CGGTGAACTG AAGTCCGACA
ACCACGATAG TGAGGATCAG TGCCAGCATC AATGGCTCAC TAAGTTCACC CCAACCACCT
TCATGAGTGT TGACTTGGTG AAGGGTGGTA AAGGATGTCG CCACCGTGGC TACCGCTGCT
GCCACTGGGG TCATCAGACC AAGGAGCAGG AAGACACCAG CCGCAAGTTC AATAGATGGA
AGCAGGATCG CGAGGATTTC AGGCCACTGG TAACCAGCGA ACTCTGCCTC GACTCTA
INFORMÁCIE O SEKVENCII ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 612 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna
-38(ii) TYP MOLEKULY: proteín
(Xi ) OPIS SEKVEN CIE ID . Č . 5: 1
5 Mec íle Pro Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Val Gly Arg Asn Ala Ala
1 5 r 10 15
Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe
20 25 30
10
Gly Lys Pro íle Val Ala íle Val Asn Ser Tyr Thr Gin Phe Val Pro
35 40 45
15 Gly His Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Íle Val Ala Asp Ala Val
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr íle Val Asp Asp
65 70 75 80
20 Gly íle Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser Arg
85 90 95
Glu íle íle Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr Ala
100 105 110
25
Asp Ala Met Val Cys íle Ser Asn Cys Asp Lys íle Thr Pro Gly Met
115 120 125
30 Leu Asn Ala Ala Met Arg Leu Asn íle Pro Val Val Phe Val Ser Gly
130 135 140
Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Glu Arg Val Ala His
145 150 155 160
35 Ala Pro Thr Asp Leu íle Thr Ala íle Ser Ala Ser Ala Ser Asp Ala
165 170 175
Val Asp Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr
180 185 190
40
Cys Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu
195 200 205
Thr Glu Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala
45 210 215 220
Thr His Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val
225 230 235 240
50 Val Glu Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu
245 250 255
Pro Arg Gly íle Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu
260 265 270
55
Asp Met Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr íle Leu HiS íle Leu Ala
275 280 285
Ala Ala Gin Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp íle Asp Glu
60 290 295 300
Leu Ser Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp
305 310 315 320
65 Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Arg íle Pro Ala Leu Leu
325 330 335
Gly Glu Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser Val
-393*10 345 350
His Ser Asn Asp Leu Glu G1 y Tro Leu Asp Asp Trp Asp íle Arg Ser
355 360 r Glu 365
Gly Lvs Thr Thr Glu Val Ala Thr Leu Phe His Ala Ala Pro Gly
370 375 380
Gly íle Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu
385 390 395 40C
Leu Asp Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys íle Arg Asp Val Glu His r. i e
405 410 415
Tyr Tnr Ala Aso Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn íle Ser Pro
4 20 425 430
Asp Gly Ala Val íle Lys Ser Ala Gly íle Glu Glu Glu Leu Trp s n
435 440 445
Pne Thr Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gin Glu Glu Ala Val Ser
450 455 460
Vôl íle Leu Thr Lys Thr íle Glr. Ala Gly Glu Val Leu Val Val i r
-165 470 475 4 S Ó
Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Giv Pro Gly Met Gin Glu Mec Leu His Pro
485 490 495
T r. r A1 ô Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu * 1 .
500 505 510
Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser íle Gly M ' í*
515 520 525
Val Ser Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val íle Gly Leu íle Glu ŕ. 3 r.
530 535 540
* S L y Asp íle Val Ser íle Asp Val His Asn Are Lys Leu Glu Val a * n
s. * e - 1 w/ 550 555 só:
'i a . Ser Asp Glu Glu Leu Gin Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala
565 570 575
Glu Lys Pro Trp Gin Pro v a i Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Λ A Č
580 535 590
Le — .Are Ala Tyr Ala Lys Me t Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala V 3 í
595 600 605
Arg Gin Val Asp
610

Claims (21)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. DNA pochádzajúca z baktérií rodu Corynebacterium replikovatelná v baktériách tohto rodu a prípadne rekombinantná, ktorá obsahuje aspoň jednu z nasledujúcich nukleotidových sekvencii:
    a) kódujúcu sekvenciu génu panB (ketopantoáthydroxymetyltransferázy, podľa Sekvencie id. č.: 1
    b) kódujúcu sekvenciu génu panC (pantotenát syntázy) podľa Sekvencie id. č.: 1, osobitne potom operón panBC a prípadne
    c) kódujúcu sekvenciu génu ilvD (dehydratázy dihydroxykyselín) podľa Sekvencie id. č.: 4.
  2. 2. Replikovatelná DNA podľa nároku 1, ktorá:
    i) má sekvenciu nukleotidov podľa Sekvencie id. č.: 1, Sekvencie id. č: 4 ii) obsahuje aspoň jednu takú sekvenciu, ktorá sekvenciám uvedeným v (i) zodpovedá vďaka degenerácii genetického kódu iii) obsahuje aspoň jednu takú sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciám uvedeným v (i) alebo (ii, a prípadne (iv) má funkčne neutrálnu sense-mutáciu.
  3. 3. Mikroorganizmy, osobitne potom z rodu Corynebacterium, ktoré sú transformované vložením jednej alebo viacerých replikovateľných DNA podľa ľubovoľného z nárokov 1 a 2.
  4. 4. Kyvadlový vektor pECM3ilvBNCD, ktorý je v bunkách E. coli DH5amcr uložený pri DSM pod označením DSM 12457 a ktorého reštrikčná mapa je uvedená na obrázku 3.
  5. 5. Kyvadlový vektor pEKEx2panBC, ktorý je v bunkách E. coli DH5amcr uložený pri DSM pod označením DSM 12456 a ktorého reštrikčná mapa je uvedená na obrázku 2.
  6. 6. Spôsob výroby kyseliny pantoténovej, vyznačujúci sa tým, že sa v mikroorganizmoch rodu Corynebacterium zosilnia (zvýši sa ich expresia) gény panB a panC a prípadne ďalšie nukleotidové sekvencie, kódujúce zodpovedajúce enzýmy a tieto mikroorganizmy sa použijú na fermentáciu.
  7. 7. Spôsob výroby podľa nároku 6,vyznačuj úci sa t ý m, že sa ešte navyše zosilní (zvýši sa jeho expresia) gén ilvD.
  8. 8. Spôsob výroby podľa nárokov 6 alebo 7, vyznačujúci sa t ý m, že sa ešte navyše zosilní (zvýši sa jeho expresia) gén ilvBNCD.
  9. 9. Spôsob výroby podľa nárokov 6 alebo 7, vyznačujú c i sa t ý m, že sa zosilnenie dosiahne zvýšením počtu kópií génu, prípadne nukleotidových sekvencii v mikroorganizmu transformáciou plazmidom, ktorý tento gén, prípadne nukleotidovú sekvenciu nesie.
  10. 10. Spôsob podľa nárokov 6 alebo 7, vyznačujúci sa t ý m, že sa zosilnenie dosiahne mutáciou promotorovej alebo regulačnej oblasti nachádzajúcej sa proti prúdu transkripcie od štruktúrneho génu.
  11. 11. Spôsob podía nárokov 6 alebo 7, vyznačuj úci sa t ý m, že sa zosilnenie dosiahne vložením expresnej kazety proti prúdu transkripcie od štruktúrneho génu.
  12. 12. Spôsob podía nárokov 6 alebo 7, vyznačuj úci sa t ý m, že sa zosilnenie dosiahne predĺžením životnosti mRNA, ktorá vzniká transkripciou uvedených sekvencií a/alebo spomalením odbúravania zodpovedajúceho enzymatického proteínu (proteínov).
  13. 13. Spôsob podía hocijakého z nárokov 6 až 12, v y značujúci sa tým, že sa zvýši expresia génov podía nároku 1 v baktériách Corynebacterium, ktoré obsahujú ďalšie mutácie na rezistenciu k metabolitom prípadne antimetabolitom.
  14. 14. Spôsob podía hocijakého z nárokov 6 až 12, v y značujúci sa tým, že sa zosilnenie dosiahne zmenou kultivačného média a/alebo priebehu fermentácie.
  15. 15. Spôsob podía hocijakého z nárokov 6 až 14, v y značujúci sa tým, že sa v mikroorganizmu inhibuje aspoň jedna metabolická dráha, ktorá znižuje tvorbu pantotenátu (pantoténovej kyseliny).
  16. 16. Spôsob podía hocijakého z nárokov 6 až 15, v y značujúci sa tým, že sa použijú mikroorganizmy, v ktorých je dodatočne zosilnená expresia jedného alebo viacerých zostávajúcich génov metabolickej dráhy syntézy kyseliny pantoténovej.
  17. 17. Spôsob podía nároku 15,vyznačujúci sa tým, že sa v metabolickej dráhe biosyntézy kyseliny pantoténovej inhibuje gén ilvA.
  18. 18. Spôsob podlá jedného alebo viacerých z nárokov 6 až 17, vyznačujúci sa t ý m, že sa použijú mikroorganizmy rodu Corynebacterium obsahujúce kyvadlový vektor pECM3ilvBNCD.
  19. 19. Spôsob podlá jedného alebo viacerých z nárokov 6 až 17, vyznačujúci sa tým, že sa použijú mikroorganizmy rodu Corynebacterium obsahujúce kyvadlový vektor pEKEx2panBC.
  20. 20. Spôsob výroby pantoténovej kyseliny fermentáciou mikroorganizmov rodu Corynebacterium jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 19, vyznačujúci sa tým, že sa
    a) zosilní (zvýši sa jeho expresia) aspoň jeden z génov panB alebo pane, výhodne panBC, prípadne v kombinácii s génom ilvD
    b) zvýši koncentrácia kyseliny pantoténovej v médie alebo v bunkách mikroorganizmu a
    c) izoluje kyselina pantoténová.
  21. 21. Spôsob podlá nároku 19 a 20,vyznačujúci sa t ý m, že sa počas fermentácie pridá prekurzor kyseliny pantoténovej, vybraný zo skupiny obsahujúcej aspartát, βalanín, keto-izovalerát, keto-pantoát a pantoát.
SK1640-99A 1998-12-01 1999-12-01 Method for the fermentative production of d-pantothenic acid using coryneform bacteria SK164099A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19855312A DE19855312A1 (de) 1998-12-01 1998-12-01 Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK164099A3 true SK164099A3 (en) 2000-07-11

Family

ID=7889568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1640-99A SK164099A3 (en) 1998-12-01 1999-12-01 Method for the fermentative production of d-pantothenic acid using coryneform bacteria

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6177264B1 (sk)
EP (1) EP1006189A3 (sk)
JP (1) JP2000166580A (sk)
KR (1) KR20000047833A (sk)
CN (1) CN1256313A (sk)
BR (1) BR9905783A (sk)
DE (1) DE19855312A1 (sk)
HU (1) HUP9904448A3 (sk)
ID (1) ID25933A (sk)
IL (1) IL133185A0 (sk)
SK (1) SK164099A3 (sk)
YU (1) YU61999A (sk)
ZA (1) ZA997407B (sk)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19907567B4 (de) * 1999-02-22 2007-08-09 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin
US8232081B2 (en) * 1999-09-21 2012-07-31 Basf Se Methods and microorganisms for production of panto-compounds
SK5222002A3 (en) * 1999-09-21 2003-03-04 Basf Ag Methods and microorganisms for production of panto-compounds
DE10026758A1 (de) * 2000-05-30 2001-12-06 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung corymeformer Bakterien
DE10030702A1 (de) 2000-06-23 2002-01-03 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
AU2002218164A1 (en) * 2000-09-20 2002-04-02 Basf Aktiengesellschaft Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use
DE10047142A1 (de) * 2000-09-23 2002-04-11 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
US6911329B2 (en) 2000-09-23 2005-06-28 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
AU2001291825A1 (en) * 2000-09-30 2002-04-15 Degussa A.G. Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria
JP4217070B2 (ja) 2001-01-19 2009-01-28 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア パントテネートの産生増強法
US7244593B2 (en) * 2001-01-19 2007-07-17 Basf Aktiengesellschaft Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate
ATE432338T1 (de) * 2002-01-18 2009-06-15 Novozymes As Alanin-2,3-aminomutase
US20040048343A1 (en) * 2002-01-19 2004-03-11 Theron Hermann Method and microorganisms for the production of 3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)-propionic acid (hmbpa)
CA2491145A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Basf Aktiengesellschaft Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate
DE10344200A1 (de) * 2003-09-22 2005-05-04 Basf Ag Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement
CN1993377A (zh) 2004-07-30 2007-07-04 卡吉尔公司 丙氨酸2,3氨基变位酶
US8273558B2 (en) 2005-10-26 2012-09-25 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
UA96928C2 (ru) 2005-10-26 2011-12-26 Э.И. Дю Пон Де Немур Энд Компани Ферментативное продуцирование спиртов с четырьмя атомами углерода
US9303225B2 (en) 2005-10-26 2016-04-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of isobutanol by recombinant yeast
WO2007131750A1 (en) 2006-05-16 2007-11-22 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of panthenol
BRPI0913552B1 (pt) 2008-09-29 2020-09-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Método para produção de isobutanol e método para conversão de 2,3-dihidroxi isovalerato
NZ591244A (en) 2008-09-29 2013-03-28 Butamax Tm Advanced Biofuels IDENTIFICATION AND USE OF BACTERIAL [2Fe-2S] DIHYDROXY-ACID DEHYDRATASES
CA2736420A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Butamaxtm Advanced Biofuels Llc Enhanced dihydroxy-acid dehydratase activity in lactic acid bacteria
US9169499B2 (en) 2009-09-29 2015-10-27 Butamax Advanced Biofuels Llc Flux to acetolactate-derived products in lactic acid bacteria
CN102782119B (zh) 2010-02-17 2016-03-16 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 改善需Fe-S簇蛋白质的活性
WO2014106107A2 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Dhad variants for butanol production
US9580705B2 (en) 2013-03-15 2017-02-28 Butamax Advanced Biofuels Llc DHAD variants and methods of screening
CN106676051B (zh) * 2016-10-31 2019-07-05 中国科学院微生物研究所 一种制备高效合成泛酸基因工程菌的方法及其应用
CN109868254B (zh) * 2019-03-14 2021-02-19 浙江工业大学 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
CN110317768B (zh) * 2019-07-10 2020-09-04 江南大学 一种消减4-甲基苯酚的乳酸菌及其在酿造体系中的应用
KR102389327B1 (ko) * 2020-07-01 2022-04-20 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
KR102589135B1 (ko) * 2021-05-10 2023-10-12 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
CN114149981B (zh) * 2021-12-09 2024-02-02 浙江工业大学 一种比活提高的泛酸合成酶突变体及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3710497B2 (ja) * 1992-09-25 2005-10-26 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法
DE19855313A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen
DE19907567B4 (de) * 1999-02-22 2007-08-09 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin
KR100878334B1 (ko) * 1999-06-25 2009-01-14 백광산업 주식회사 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰유전자

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9904448A3 (en) 2004-06-28
HUP9904448A2 (hu) 2000-11-28
DE19855312A1 (de) 2000-06-08
KR20000047833A (ko) 2000-07-25
CN1256313A (zh) 2000-06-14
YU61999A (sh) 2003-02-28
BR9905783A (pt) 2001-04-24
ID25933A (id) 2000-11-16
ZA997407B (en) 2000-06-07
EP1006189A2 (de) 2000-06-07
EP1006189A3 (de) 2003-09-17
US6177264B1 (en) 2001-01-23
JP2000166580A (ja) 2000-06-20
HU9904448D0 (en) 2000-01-28
IL133185A0 (en) 2001-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK164099A3 (en) Method for the fermentative production of d-pantothenic acid using coryneform bacteria
US7632663B1 (en) Method for microbially producing L-valine
SK163399A3 (en) Method for the fermentative production of d-pantothenic acid by amplification of the pand gene of microorganisms
KR100758831B1 (ko) Ｌ-라이신 생산 코리네박테리아 및 ｌ-라이신의 제조방법
US20100151449A1 (en) Method for poduction of l-amino acids by fermentation
DE19931314A1 (de) L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Lysin
US6184006B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using strains of the family enterobacteriaceae
EP1320586B1 (en) Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria
US20020150999A1 (en) Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
CZ428299A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií
WO2001092556A1 (en) A process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria with deleted pck (phosphoenolpyruvate carboxykinase, 4.1.1.49) gene
DE10030702A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
MXPA99010768A (en) Procedure for the preparation by fermentation of d-pantothenic acid using corinefor bacteria
WO2002055711A2 (de) Verfahren zur fermentativen herstellung von pantothensäure
CZ428199A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech
CZ427799A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající kmenů bakterií z čeledi Enterobacteriacae
DE10047142A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE10117085A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien