CZ428299A3 - Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií - Google Patents

Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií Download PDF

Info

Publication number
CZ428299A3
CZ428299A3 CZ19994282A CZ428299A CZ428299A3 CZ 428299 A3 CZ428299 A3 CZ 428299A3 CZ 19994282 A CZ19994282 A CZ 19994282A CZ 428299 A CZ428299 A CZ 428299A CZ 428299 A3 CZ428299 A3 CZ 428299A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ala
gly
leu
gene
wall
Prior art date
Application number
CZ19994282A
Other languages
English (en)
Inventor
Lothar Dr. Eggeling
Georg Dr. Thierbach
Hermann Prof. Dr. Sahm
Original Assignee
Degussa-Hüls Aktiengesellschaft
Forschungszentrum Jülich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa-Hüls Aktiengesellschaft, Forschungszentrum Jülich GmbH filed Critical Degussa-Hüls Aktiengesellschaft
Priority to CZ19994282A priority Critical patent/CZ428299A3/cs
Publication of CZ428299A3 publication Critical patent/CZ428299A3/cs

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Popisuje se DNApocházející z bakterií rodu Corynebacterium replikovatelná v bakteriích tohoto rodu a popřípadě rekombinantní DNA, která obsahuje alespoňjednu z následujících nukleotidových sekvencí: d) kódující sekvenci genu panB (ketopantoáthydroxymehyl transferázy) podle Sekvence id.č.: 1 e) kódující sekvenci genu panC (pantothenát syntázy) podle Sekvence iďč.: 1, zvláště pak operon panBC a popřípadě f) kódující sekvenci genu ilvD (dehydratázy dihydroxy-kyselin) podle Sekvence id.č.:4. Dále popisuje způsob fenrentativní výroby kyseliny D-pantothenové využívající mikroorganismy z rodu Corynebacterium, ve kterých se zesílí uvedené geny.

Description

Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií
Oblast techniky
Kyselina pantothenové představuje komerčně významný vitamín, který nalézá uplatnění v kosmetice, lékařství a ve výživě lidí i zvířat.
Kyselina pantothenové může být vyrobena pomocí chemické syntézy nebo biotechnologicky pomocí fermentace vhodného mikroorganizmu ve vhodném živném roztoku. Výhodou biotechnologického způsobu výroby za pomoci mikroorganizmů je, že vzniká požadovaný stereoizomer a to D-forma kyseliny pantothenové.
Dosavadní stav techniky
Různé druhy bakterií, jako jsou například Escherichia coli, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes nebo kvasinek, jako jsou například Debaromyces castellii, mohou v živném roztoku obsahujícím glukózu, DLpantoinovou kyselinu a β-alanin, produkovat kyselinu D-pantothenovou, jak je to popsáno v EP-A 0 493 060. Ve spise EP-A 0 493 060 se dále uvádí, že u bakterií Escherichia coli lze pomocí plazmidů pFV3 a pFVS zesílit geny pro biosyntézu kyseliny D-pantothenové a tím i zvýšit tvorbu této kyseliny.
EP-A 0 590 857 popisuje kmeny bakterií Escherichia coli, které nesou rezistenci k různým antimetabolitům , jako například ke kyselině salicylové, α-ketomáselné kyselině, β-hydroxyasparagové kyselině atd., a v živném roztoku obsahujícím glukózu a β-alanin, produkují D-pantoinovou a
-2D-pantothenovou kyselinu. V dokumentu EP- 0 590 857 se dále uvádí, že produkce D-pantoinové a D- pantothenové kyseliny v E.coli může být zvýšena amplifikaci blíže nedefinovaných genů pro biosyntézu pantothenové kyseliny z E.coli, které se nacházejí na plazmidu pFV31.
WO 97/10340 mimo to popisuje, že v mutantních bakteriích Escherichia coli, které vytvářejí kyselinu pantothenovou, lze zvýšením aktivity syntázy hydroxyoctové kyseliny II, enzymu, který se podílí na biosyntéze valinu, dále zvýšit produkci kyseliny pantothenové.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje nový způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantothenové prostřednictvím koryneformních bakterií.
Vitamín pantothenová kyselina představuje komerčně významný produkt s využitím v kosmetice, lékařství a v lidské i zvířecí výživě. Z toho vyplývá všeobecný zájem o vylepšený způsob výroby pantothenové kyseliny.
V následujícím textu se výrazy D-pantothenová kyselina nebo pantothenová kyselina nebo pantothenát rozumí nejen volná kyselina, ale také její soli, jako například vápenatá, sodná, amonná nebo draselná sůl.
Vynález popisuje DNA, která je replikovatelná v bakteriích rodu Corynebacterium, popřípadě i rekombinantní DNA pocházející z bakterií Corynebacterium, a která obsahuje alespoň jednu z následujících nukleotidových sekvencí:
a) kódující sekvence genu panB (ketopantoáthydroxymethyltransferáza), viz Sekvence id.čís.:!
• ·
b) kódující sekvence genu panC (pantothenátsyntetázy), viz Sekvence id.čís.:l, zejména operon panBC a případně
c) kódující sekvence genu ilvD (dehydratázy dihydroxy kyselin), viz Sekvence id.čís.:4.
Předmětem vynálezu jsou rovněž replikovatelné DNA podle nároku 1, které obsahují:
(i) nukleotidové sekvence uvedené v Sekvenci id.čís.:l, a Sekvenci id.čís.:4 (ii) alespoň jednu sekvenci, která odpovídá uvedeným sekvencím podle bodu (i) díky degeneraci genetického kódu (iii) alespoň jednu sekvenci, která hybridizuje s uvedenými sekvencemi podle bodů (i) nebo (ii), nebo se sekvencemi komplementárními a případně (iv) funkčně neutrální mutace v sekvencích podle bodu(i).
Vynález dále popisuje koryneformní mikroorganismy, zejména z rodu Corynebacterium, transformované zavedením jedné nebo několika replikovatelných DNA.
Předmětem vynálezu je dále způsob výroby kyseliny
D-pantothenové za použití koryneformních bakterií, zejména takových, které kyselinu D-pantothenovou již produkují, a ve kterých jsou geny panB a panC jednotlivě, nebo v kombinaci zesíleny, zejména pak, je-li zvýšena jejich exprese. Zesílení těchto genů může být popřípadě spojeno s mutací, způsobující defekt v genu ilvA nebo se zesílením genů ilvBN, ilvC nebo ilvD.
Výrazem zesílení se v tomto případě rozumí zvýšení intracelulární aktivity jednoho nebo několika enzymů, které jsou v mikroorganizmu kódovány příslušnými DNA,' například
-4tím, že se zvýší počet kopií genu (genů) na buňku, použije se silný promotor, nebo se použije gen kódující enzym se zvýšenou aktivitou, popřípadě kombinace těchto účinků.
Předmětem vynálezu jsou dále mikroorganismy, které jsou schopné vytvářet kyselinu pantothenovou z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy nebo z glycerinu a ethanolu, výhodně pak z glukózy nebo sacharózy. Jde o koryneformní bakterie například rodů Corynebacterium nebo Arthrobacter. Z bakterií rodu Corynebacterium třeba jmenovat zejména Corynebacterium glutamicum, které jsou mezi odborníky známy pro svojí schopnost tvorby aminokyselin. K tomuto druhu náleží divoce se vyskytující kmeny jako například Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Corynebacterium melassecola ATCC17965 a od nich odvozené kmeny.
Vynález dále popisuje skutečnost, že ke zvýšené produkci D-pantothenátu dojde rovněž po zvýšení aktivity, zvláště pak po zesílení exprese nově izolovaných genů panB a panC ať již každého zvlášť nebo obou dohromady (zesílení panBC operonu). Tyto geny z bakterií Corynebacterium glutamicum kódují enzymy důležité pro biosyntézu D-pantothenátu a to ketopantoát hydroxymethyl transferázu a pantothenát synthetázu.
Vynález dále popisuje skutečnost, že ke zvýšené produkci D-pantothenátu přispívá rovněž zesílení exprese nového genu pro biosyntézu valinu z Corynebacterium glutamicum, který kóduje dehydratázu dihydroxykyselin.
Podle vynálezu účinkuje na zvýšení produkce D-pantothenátu kromě genu ilvD také zvýšení exprese genu ilvBN, který kóduje syntézu kyseliny hydroxyoctové, a genu ilvC, který kóduje izomeroreduktázu. Zvýšení jejich exprese vede ke zvýšené tvorbě D-pantothenátu.
« ·
Zvýšení aktivity příslušného enzymu (respektive jeho zvýšené exprese) lze docílit například zvýšením počtu kopií příslušného genu na buňku nebo mutací v oblasti promotoru a/nebo v regulační oblasti proti směru transkripce od strukturního genu. Stejným způsobem mohou účinkovat expresní kazety zabudované proti směru transkripce od strukturního genu. Pomocí indukovatelných promotorů lze dále zesílit expresi v průběhu fermentativní produkce D-pantothenátu. Expresi lze dále zlepšit prodloužením životnosti m-RNA v buňce nebo inhibici rozkladu enzymatických proteinů. Geny nebo rekombinantní genové konstrukty podle vynálezu se přitom nacházejí plazmidovém vektoru s různým počtem kopií na buňku nebo jsou integrovány v chromozómu a amplifikovány. Alternativně může být exprese příslušného genu dále zvýšena změnou složení média a způsobu kultivace. Návody k tomu mohou odborníci nalézt mimo jiné v publikacích Martin a další (Bio/Technology 5, strana 137 až 146 (1987)), Guerrero a další (Gene 138, strana 35 až 41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, strana 428 až 430 (1988)), Eikmanns a další (Gene 102, strana 93 až 98 (1991)), v Evropském patentovém spise EPS 0 472 869, v patentu USA č.: 4,601,893, Schwarzer a Púhler (Bio/Technology 9, strana 84 až 87 (1991), Reinscheid a další (Applied and Environmental Microbiology 60, strana 126 až 132 (1994)), při LaBarre a další (Journal of Bacteriology 175, strana 1001 až 1007 (1993)), v patentové přihlášce WO 96/15246, Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, strana 191 až 195 (1998)) nebo v příručce Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pro obecnou bakteriologii) vydané Americkou bakteriologickou společností (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA v roce 1981 a dále ve známých učebnicích zaměřených na výuku genetiky a molekulární biologie.
-6Před vlastní izolací genů panB a panC z bakterie C. glutamicum je nejprve nutno vytvořit DNA knihovnu tohoto mikrorganismu v bakteriích E. coli. Způsob vytvoření takovéto DNA knihovny je popsán ve všeobecně známých učebnicích a příručkách jako je například učebnice Winnacker: Gene und Klone: Eine Einfuhrung in die
Gentechnologie (Geny a Klony: Úvod do genového inženýrství, nakladatelství Chemie, Weinheim, SRN, 1990) či příručka Sambrook a další: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Laboratorní manuál molekulárního klonování, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Jednou takovou známou knihovnou je knihovna E. coli K-12 kmene W3110 v λ-vektorech vytvořená a popsaná Koharou a dalšími (viz Cell 50, strana 495 až 508 (1987)). Bathe a další popisují (viz Molecular and General Genetics, 252: strana 255 až 265, 1996) DNA knihovnu bakterie C. glutamicum ATCC13032, vytvořenou pomocí kosmidu SuperCos I (Wahl a další 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: strana 2160 až 2164) v bakteriích E.coli K-12 kmene NM554 (viz Raleigh a další 1988, Nucleic Acids Research 16: strana 1563 až 1575. K přípravě DNA knihovny bakterie C. glutamicum v E. coli mohou být použity také plazmidy jako například pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, strana 807 až 818 (1979)) nebo pUC19 (Norrander a další 1983, Gene 26: strana 101 až 106) vynaložil být. Jako hostitelské jsou vhodné zvláště takové kmeny E. coli, které jsou restrikčně a a rekombinačně deficientní. Příkladem takového kmene jsou buňky kmene DH5cíMCR, viz Grant a další, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) strana 4645 až 4649.
Tato DNA knihovna se poté přenese do indikátorového kmene ať již pomocí transformace (viz Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, strana 557 až 580, 1983) nebo elektroporace (Tauch a další, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347). Vhodný indikátorový kmen
I
-7se vyznačuje tím, že obsahuje mutaci ve vhodném genu a to takovou, která vyvolává viditelnou změnu fenotypu, například závislost na přídavku metabolitu do kultivačního média (auxotrofii). Indikátorové kmeny či mutanty lze získat z publikovaných zdrojů a nebo ze sbírek kmenů a kultur, nebo je lze popřípadě i přímo vytvořit. Pro tento vynález mají velký význam bakterie E. coli DV39 (viz Vallari a Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164: strana 136 až 142), které mají mutaci v genu panC. Jiným příkladem E. coli s defektem ve tvorbě pantothenové kyseliny je kmen SJ2, který má mutaci v genu panB a lze jej získat z genové banky Univerzity v Yale, New Haven, Connecticut, USA. Dalším příkladem mutantního kmene je mutant C. glutamicum R127/7, který byl izolován v rámci vynálezu. Tento kmen má poškozený gen ilvD, který kóduje dehydratázu dihydroxykyselin. Po transformaci indikátorového kmene, například panB-mutantních buněk SJ2, rekombinantním plazmidem, který obsahuje hledaný gen, například gen panB, a po expresi příslušného genu, dojde ke změně fenotypu indikátorového kmene, například tento kmen ztratí závislost na přídavku pantothenové kyseliny v kultivačním médiu.
Takto isolovaný gen či DNA fragment může být dále popsán a charakterizován určením jeho sekvence, tak jak je to popsáno například Sangerem a dalšími (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America, 74: strana 5463 až 5467, 1977).
Tímto způsobem byly získány i nové DNA sekvence kódující proteiny panB a panC z bakterie C. glutamicum. Tyto sekvence podle vynálezu jsou uvedeny jako Sekvence id.č.:l.
Dále byly z uvedené DNA sekvence výše popsanými metodami odvozeny aminokyselinové sekvence příslušného enzymu. Sekvence id.č.: 2 udává pořadí aminokyselin v produktu genu panB, jmenovitě ketopantoát hydroxymethyl • · ·
transferázy a Sekvence id č.:3 udává pořadí aminokyselin v produktu genu panC tedy pantothenát syntetázy. Dále byla tímto způsobem získána DNA kódující sekvence genu ilvD z bakterie C. glutamicum. Tato sekvence je součástí vynálezu a je uvedena jako Sekvence id.č.:4. Sekvence id.č.:5 udává odvozené pořadí aminokyselin produktu genu ilvD, tedy dehydratázy dihydroxykyselin.
Kódující sekvence DNA, které v důsledku degenerace genetického kódu odpovídají Sekvenci id.č.:l a/nebo Sekvenci id.č.: 4 jsou rovněž součástí vynálezu. Rovněž jsou součástí vynálezu sekvence DNA, které se Sekvencí id.č.:l a/nebo Sekvencí id.č:4 hybridizují. Odborníkům jsou dále známy konzervativní záměny aminokyselin jako je například záměna glycinu za alanin nebo záměna kyseliny asparagové za kyselinu glutamovou. Tyto záměny aminokyselin se nazývají sense mutations a vzhledem k tomu, že nevedou k zásadní změně aktivity proteinu nazývají se rovněž funkčně neutrální. Dále je známo, že změny v N- a/nebo C-konci proteinu nemívají zásadní negativní vliv na funkci proteinu ba v některých případech může dojít i k její stabilizaci. Odborník může najít údaje, které to potvrzují mimo jiné v práci Ben-Bassata a dalších v časopise Journal of Bacteriology 169: strana 751 až 757 (1987), O'Regana a dalších v časopise Gene 77: strana 237 až 251 (1989), SahinTotha a dalších v časopise Protein Sciences 3: strana 240 až 247 (1994), Hochuliho a dalších v Bio/Technology 6: strana 1321 až 1325 (1988) a ve známých učebnicích genetiky a molekulární biologie. Aminokyšelínové sekvence, které jsou v tomto smyslu analogické Sekvencím id. č.:2, id č.:3 a/nebo Sekvenci id č.: 5 jsou rovněž předmětem vynálezu.
Takovým způsobem charakterizovaný gen může být následně samostatně nebo v kombinaci s dalšími geny exprimován ve vhodném mikroorganizmu. Jeden způsob exprese, respektive zvýšené exprese (over-expression) genů spočívá
v tom, že se gen amplifikuje pomocí plazmidového vektoru, který navíc obsahuje regulační sekvence fungující jako signály pro expresi. Při výběru vhodného plazmidu přicházejí do úvahy takové, které jsou schopny se v příslušných mikroorganismech replikovat. Pro bakterie Corynebacterium glutamicum je možno brát v úvahu například vektory pEKExl (viz Eikmanns a další, Gene 102: strana 93 až 98 (1991)), pZ8-l (Evropský patentový spis 0 375 889), pEKEx2 (Eikmanns a další Microbiology 140: strana 1817 až 1828 (1994))nebo pECM2 (Jáger a další, Journal of Bacteriology 174 (16) :
strana 5462 až 5465 (1992)). Příklady takových plazmidů s již zabudovaným inzertem jsou pEKEx2panBC, pECM3ilvBNCD, které jsou vloženy v kmenech DH5amcr/pEKEx2panBC a DH5 ctmcr/pECM3ilvBNCD. Plazmid pEKEx2panBC je binární vektor vhodný jak pro E. coli tak i pro C. glutamicum, který nese geny panB a panC. Plazmid pECM3iIvBNCD je rovněž binární vektor pro E. coli/C. glutamicum obsahující však vedle genu ilvD ještě geny ilvBN a ilvC.
Vynález dále popisuje skutečnost, že posílení genů panB a panC ať již každého zvlášť, obou dohromady nebo v kombinaci s geny ilvBN, ilvC a ilvD se výhodně vyskytuje v takových mikroorganismech, které mají sníženou syntézu aminokyselin threoninu a isoleucinu. Takto snížené syntézy threoninu a isoleucinu může být dosaženo zeslabením nebo vypnutím příslušného biosyntetického enzymu či jeho aktivity. K tomuto účelu se hodí například enzym homoserin dehydrogenáza, homoserin kináza, threonin syntáza nebo také threonin dehydratáza. Další možností jak snížit aktivity enzymů důležitých pro syntézu threoninu a isoleucinu jsou způsoby založené na mutagenezi.
Mezi takové mutageneze, které mutagenní látky způsoby patří jednak způsoby náhodné k indukci mutací využívají chemické jako například N-methyl-N-nitro• · · ····· • · · · · · ······ • · · · · · ········ «······ ·· ··
-10N-nitrosoguanidin nebo ozařování UV paprsky s následným vyhledáváním požadovaných mikroorganismů. V tomto případě by byly vyhledávány mikroorganismy deficientní v syntéze L-threoninu nebo L-isoleucinu, které tudíž vyžadují tyto aminokyseliny v živném médiu. Tyto způsoby neřízené mutageneze a vyhledávání mutantů jsou všeobecně známy, viz například Miller: A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Krátký kurz do genetiky bakterií, laboratorní příručka pro E. coli a příbuzné bakterie), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992), nebo příručku Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pro obecnou bakteriologii) vydaný Americkou bakteriologickou společností (American Society for Bacteriology) , Washington
D.C., USA, v roce 1981.
Druhou skupinou jsou způsoby cílené (site-directed) mutageneze využívající technik rekombinantní DNA. Prostřednictvím těchto metod lze z chromozómu deletovat například gen ilvA kódující enzym threonin dehydratázu. Konkrétní postupy jsou opět všeobecně známé, například viz Scháfer a další (Gene (1994) 145: strana 69 až 73) nebo také Link a další (Journal of Bacteriology (1998) 179: strana
6228 až 6237) . Lze rovněž odstranit jen části genu, nebo zaměnit přirozené fragmenty DNA v genu pro threonin dehydratázu za mutované. Delecí nebo záměnou se tak dosáhne úplné ztráty nebo snížení aktivity threonin dehydratázy, viz Móckel a další (1994), Molecular Microbiology 13: strana 833 až 842; Morbach a další (1996), Applied Microbiology and Biotechnology 45: strana 612 až 620). Příkladem takového mutanta je bakterie C. glutamicum kmene ATCC13032AilvA, která nese deleci v genu ilvA.
Mikroorganismy zkonstruované podle vynálezu mohou být za účelem produkce kyseliny D-pantothenové kultivovány
kontinuálním způsobem, nebo způsoby diskontinuálními, ať již vsádkovou kultivací nebo přítokovou kultivací.
Přehled známých způsobů kultivace je uveden v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Úvod do biotechnik, nakladatelství Gustav Fischer, Stuttgart, 1991) nebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periferní zařízení, nakladatelství Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Použité kultivační médium musí patřičným způsobem vyhovovat nárokům příslušného mikroorganismu. Popisy různých známých kultivačních médií pro mikroorganismy jsou uvedeny příručce Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pro obecnou bakteriologii) vydaný Americkou bakteriologickou společností (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roce 1981. Jako zdroje uhlíku mohou být použity cukry a uhlohydráty jako například glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky jako například sójový olej, slunečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk; mastné kyseliny jako například kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy jak například glycerin a ethanol a organické kyseliny jako například kyselina octová. Tyto látky mohou být použity buď jednotlivě nebo ve směsi. Jako zdroje dusíku mohou být použity sloučeniny obsahující organický dusík jako například pepton, kvasničný extrakt, extrakt z masa, extrakt ze sladu, kukuřičný extrakt, sójová mouka a močovina nebo anorganické sloučeniny jako například síran amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný, uhličitan amonný a dusičnan amonný. Tyto zdroje dusíku mohou být použity buď jednotlivě nebo ve směsi. Jako zdroje fosforu lze použít hydrogenfosforečnan nebo dihydrogenfosforečnan draselný či odpovídající sodné soli.
• · <
I
-12Kultivační médium musí dále obsahovat soli kovů které jsou nezbytné pro růst, jako například síran hořečnatý nebo síran železnatý. A konečně může být kultivační médium kromě výše uvedených látek obohaceno o esenciální růstové látky jako například aminokyseliny a vitamíny. Pro zvýšení tvorby kyseliny pantothenové lze kultivační médium ještě obohatit o její prekurzory jako jsou například aspartát, β-alanin; ketoisovalerát, ketopantoát, pantoát a popřípadě příslušné soli. Uvedené složky mohou být přidány do média jednorázově na počátku, nebo vhodným způsobem v průběhu kultivace.
Pro kontrolu pH v průběhu kultivace jsou vhodné zásadité sloučeniny jako například hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak nebo kyselé sloučeniny jako například kyselina fosforečná nebo kyselina sírová. Pěnění kultivační směsi lze kontrolovat přídavkem činidel potlačujících tvorbu pěny jako jsou například polyglykolestery mastných kyselin. Stabilitu plazmidů lze udržet prostřednictvím vhodného selekčního činidla například antibiotika. Vhodné aerobní podmínky lze udržovat přiváděním kyslíku nebo kyslíkobsahující směsi plynů, například vzduchu, do kultivačního média. Vhodná teplota pro pěstování bakterií se normálně pohybuje od 20°C do 50°C a výhodně od 25°C do 45°C. Doba kultivace by měla být taková, aby bylo dosaženo maxima tvorby pantothenové kyseliny. Tohoto maxima je obvykle dosaženo během 10 až 160 hodin.
Koncentraci produkované pantothenové kyseliny lze stanovit známými způsoby (viz Velisek; Chromatographic Science 60, strana 515 až 560 (1992).
K mikrobiologickému stanovení koncentrace pantothenové kyseliny lze známým způsobem použít bakterie Lactobacillus plantarum kmene ATCC8014 (viz U.S. Pharmacopeia 1980; AOAC International 1980). Kromě toho lze ke stanovení koncentrace pantothenové kyseliny použít také dalších zkušebních
-13organismů jako například Pediococcus acidilactici NCIB6990 (viz Sollberg a Hegna; Methods v Enzymology 62, strana 201 až 204 (1979)).
Následující mikroorganismy byly uloženy v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur (DSMZ, Braunschweig, SRN) podle ustanovení Budapeštské smlouvy:
- Escherichia coli K12 kmene DH5otmcr/pEKEx2panBC jako kmen č. DSM12456
Escherichia coli K12 kmene DH5amcr/pECM3ilvBNCD jako kmen Č.DSM12457
Corynebacterium glutamicum ATCC13032AilvA jako kmen č. DSM12455 • · • ·
-14Popis obrázků
Obrázek 1: Restrikční mapa plazmidu pURl znázorňující polohu sekvenovaných fragmentů. Zkratky: Ss cílové místo SspI, Sc - cílové místo Seal, Ps cílové místo Pstl, Pv - cílové místo PvuII, Sa - cílové místo Sáli, Sp - cílové místo Sphl a Ec - cílové místo EcoRI.
Obrázek 2: Restrikční mapa plazmidu pEKEx2panBC. Zkratka Kanr vyznačuje gen pro rezistenci ke kanamycinu, význam ostatních zkratek odpovídá obrázku 1.
Obrázek 3: Restrikční mapa plazmidu pECM3ilvBNCD. Zkratka
Chlo17 vyznačuje gen pro rezistenci ke chloramfenikolu, Xb označuje cílové místo restrikčního enzymu Xbal.
Příklady provedení vynálezu
Vynález bude blíže popsán v následujících příkladech
Příklad 1: Klonování, sekvenování a exprese genů pro biosyntézu pantothenátu panB a panC z bakterie
C. glutamicum
1. Klonování genů panB a panC
Chromozomální DNA z bakterie C. glutamicum ATCC13032 byla izolována způsobem podle Schwarzera a Půhlera (Bio/Technology 9 (1990) strana 84 až 87) a naštepena • · • ·
-15restrikční endonukleázou Sau3A. Po elektroforetickém rozdělení byly extrahovány fragmenty DNA o velikostech 3 až 7 kb či 9 až 20 kb a ty byly následně naligovány do jedinečného cílového místa BamHI ve vektoru pBR322.
Ligační směsí byly poté transformovány bakterie E. coli kmene DH5ctmcr (viz Grant a další, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87 (1990) strana 4645 až 4649; Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) strana 557 až 580). Kolonie nesoucí inzert byly identifikovány na základě jejich citlivosti k tetracyklinu po přeočkování na plotny s LB-agarózou a přídavkem 10 pg/ml tetracyklinu. Po vyizolovaní plazmidů (viz Sambrook a další, Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) byly klony rozděleny do 8 skupin po 400 plazmidech s inzertem o velikosti 9 až 20 kb a do 9 skupin po 500 plazmidech s inzertem o velikosti 3 až 7kb. Bakterie
E. coli panB s mutací SJ2 (viz Cronan a další 1982, Journal of Bacteriology 149: strana 916 až 922) byly elektroporací transformovány touto knihovnou, viz Wehrmann a další, 1994, Microbiology 140: strana 3349 až 3356. Transformační směsi byly vysety přímo na médium CGXII s přídavkem 15 g/1 agaru (viz Keilhauer a další, Journal of Bacteriology (1993) 175: strana 5595 až 5603) . Z klonů, které byly schopny růst bez přídavku pantothenátu, byla vyizolována plazmidová DNA (viz Sambrook a další, Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). U 8 plazmidů byla pomocí opětovné transformace potvrzena schopnost heterologně komplementovat defekt v genu panB u bakterii E. coli s mutací SJ2.
U těchto 8 plazmidů byla vypracována restrikční mapa. Jeden z takto studovaných plazmidů, následně pojmenovaný jako pURl, obsahoval inzert o velikosti 9,3 kb (viz obrázek 1). Transformací bakterií E. coli s mutací DV39 v genu panC • ·
-16(viz Vallari a Rock, 1985, Journal of Bacteriology 164: strana 136 až 142) bylo potvrzeno, že vektor pURl je rovněž schopen komplementovat defekt v genu panC v tomto mutantu.
2. Sekvenování genů panB a panC
Fragment inzertu o velikosti 2,2 kb (viz obrázek 1) z plazmidu pURl byl sekvenován pomocí Sangerovy metody terminace DNA řetězce dideoxynukleotidy, viz Sanger a další, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: strana 5463 až 5467. K tomu byli nejprve zhotoveny pomocí exonukleázy III menší fragmenty a ty byly sekvenovány pomocí standardních primerů (univerzálního a reverzního primerů firmy Boehringer Mannheim, SRN) . Elektroforetická analýza sekvenační směsi byla provedena automatickým sekvenátorem využívajícím laserem excitované fluorescence (A.L.F.) od firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech (Uppsala, Švédsko). Získaná nukleotidová sekvence byla analyzována programovým balíkem HUSAR (Verze 4.0, EMBL, Cambridge, Velká Británie). Tato nukleotidová sekvence je uvedena jako Sekvence id.č.: 1. Analýzou byly identifikovány dva otevřené čtecí rámce. Jeden otevřený čtecí rámec o délce 813 bp, byl identifikován jako gen panB, kódující polypeptid o délce 271 aminokyselin a je uveden jako Sekvence id.č.:2. Druhý otevřený čtecí rámec obsahující 837 párů baží byl identifikován jako gen panC, kódující polypeptid 279 aminokyselin dlouhý je uveden jako Sekvence id.č.: 3.
3. Exprese genů panB a panC
Geny panB a panC byly nakloňovány do expresního vektoru pEKEx2 vhodného pro expresi v bakteriích C. glutamicum (viz i
-17Eikmanns a další, 1994, Microbiology 140: strana 1817 až 1828 (1994)). V tomto vektoru se oba geny nacházejí pod tou kontrolou silného tac-promotoru, který je indukovatelný pomocí isopropyl-B-D-thiogalatopyranosidu (IPTG). Vlastní klonování bylo provedeno ve dvou krocích. Nejprve byl pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR -polymerase chain reaction) amplifikován počátek genu panB. Do tohoto genu bylo pomocí odpovídajícího primeru 19 bp před start-kodón genu panB vloženo cílové místo pro restrikční enzym Sáli (viz primer 1: 5'GATCGTCGACCATCACATCTATACTCAT 3'). Druhý primer byl zvolen tak, aby bylo v amplifikovaném fragmentu obsaženo interní cílové místo pro enzym EcoRI, které se v genu panB nachází (primer 2: 5'ACCCGATGTGGCCGACAACC 3'). Teplota annealingu při PCR byla 62°C a jako matrice byl použit plazmid pURl (viz Sambrook a další, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) . Výsledný PCR-produkt o velikosti 468 bp byl naštepen restrikčními endonukleázami Sáli a EcoRI a naligován do stejným způsobem ošetřeného vektoru pEKEx2.
Touto ligační směsí byly transformovány buňky E. coli kmene DH5amcr. Z transformantů typu DH5ctmcr/pEKEx2panB' byl vyizolován vektor pEKExžpanB'.
V dalším kroku byl z plazmidu pURl vyštěpen 1761 bp dlouhý EcoRI fragment obsahující druhou polovinu panBC klastru. Tento fragment byl nakloňován do vektoru pEKEx2panB', který již obsahoval PCR-produkt genu panB a byl předtím linearizován restrikčním enzymem EcoRI. Touto ligační směsí byly transformovány buňky E. coli kmene DH5aamcr. Z transformantů typu DH5ctmcr/pEKEx2panBC byl izolován vektor pEKEx2panBC (viz obrázek 2), ve kterém je klastr genů panBC pod kontrolou tac promotoru.
-18Příklad 2:
Klonování a sekvenování genu glutamicum kódujícího dihydroxykyselin ilvD z C. dehydratázu
1. Izolace mutanta ilvD z bakterií C. glutamicum
Bakterie C. glutamicum kmene R127 (viz Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: strana 329 až 334) byly podrobeny mutagenezí pomocí N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidinu (viz Sambrook a další, Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). K tomuto účelu bylo k 5ml kultuře bakterií C. glutamicum pěstované přes noc, přidáno 250 μΐ N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidinu (s 5 mg/ml dimethylformamidu). Bakterie byly inkubovány s tímto mutagenem 30 minut při 30°C a při 200 otáčkách .min1, viz Adelberg 1958, Journal of Bacteriology 76: strana 326. Tyto buňky byly poté dvakrát promyty sterilním 0,9% roztokem NaCI. Plotny s koloniemi byly poté replikovány na plotny s minimálním médiem CGXII s 15 g/1 agaru (Keilhauer a další, Journal of Bacteriology 175: strana 5595 až 5603). Na tomto médiu byli identifikováni mutanti, kteří byli schopni růst pouze po přídavku L-valinu, L-isoleucinu a L-leucinu (po
0, 1 g/1) .
V hrubém extraktu z těchto mutantů byla určována enzymatická aktivita dehydratázy dihydroxykyselin. K tomu byly tyto klony kultivovány v 60 ml LB-média a byly zcentrifugovány v exponenciální fázi růstu.
Buněčná peleta draselno-fosforečnanovým resuspendována. Buněčný byla jednou promyta 0, 05M pufrem a poté ve stejném pufru obsah byl uvolněn 10 minutovou ultra-sonikací (Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA) . Poté byly odděleny buněčné zbytky pomocí jedné 30 minutové centrifugace při 13000 otáčkách.min1 a při 4°C. Supernatant (hrubý extrakt) byl použit »· · β • ·
-19ν enzymatickém, testu, testu sestávala z 0,2 hrubého extraktu a methylvalerátu.
Reakční směs v tomto enzymatickém ml 0,25M Tris/HCl, pH 8; 0,05 ml
0,15 ml 65mM a,B-dihydroxy-BReakční směsi byly inkubovány při teplotě 30°C, po dobu 10, 20 a 30 minut. Ze směsi byly odebírány 200μ1 vzorky, ve kterých byla pomoci HPLC stanovována koncentrace ketomethylvalerátu (viz Hara a další, 1985, Analytica Chimica Acta 172: strana 167 až 173). Jak vyplývá z Tabulky 1, nevykazuje kmen R127/7 žádnou aktivitu dehydratázy dihydroxykyselin, zatímco aktivity izomeroreduktázy a syntázy hydroxyoctové kyseliny jakožto dalších enzymů syntézy aminokyselin s rozvětveným řetězcem jsou stále patrné.
Tabulka 1
Specifické aktivity (v pmol/min na mg proteinu) různých enzymů v kmenech C. glutamicum
kmen dehydratáza dihydroxykyselin izomero reduktáza syntéza hydroxy-octové kyseliny
R127 0, 003 0, 05 0, 07
R127/1 0, 000 0, 06 0, 09
2. Klonování genu ilvD z bakterie C. glutamicum
Chromozomální DNA z bakterie C. glutamicum kmene R127 byla izolována způsobem podle Schwarzera a Puhlera, Bio/Technology 9 (1990) strana 84 až 87. Tato DNA byla poté naštěpena restrikčním enzymem Sau3A (Boehringer Mannheim) a rozdělen centrifugací na sacharózovém gradientu (viz Sambrook a další, Molecular cloning: A laboratory manual
-20• · · · 4 · · 9 • · 4 · 4 9 ······ « ♦ · · · ·
494 4944 ·4« 444« 4« ·· (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Frakce obsahující fragmenty o velikosti asi 6 až 10 kb byla použita k ligaci do vektoru pJCl (viz Cremer a další, Molecular and General Genetics 220 (1990) strana 478 až 480). Vektor pJCl byl k tomuto účelu předem linearizován enzymem BamHI a defosforylován. Pět nanogramů vektorové DNA spolu s 20 ng DNA uvedené frakce chromozomální DNA bylo spojeno v ligační reakci, kterou byly poté elektroporačně transformovány mutanti kmene R127/7 (viz Haynes a Britz, FEMS Microbiology Letters 61 (1989) strana 329 až 334).
Transformanti byli testováni na schopnost růstu na agarových plotnách CGXII bez přídavku aminokyselini s rozvětveným řetezcem. Z více než 5000 testovaných transformantů rostlo po otisknutí na plotny s minimálním médiem a dvoudenní inkubaci při 30°C celkem 8 klonů. Z těchto klonů byly izolovány plazmidy způsobem podle Schwarzera a dalších, Bio/Technology (1990) 9: strana 84 až 87. Restrikční analýza plazmidové DNA ukázala, že ve všech 8 klonech byl přítomen stejný plazmid, který byl poté označen jako pRV. Tento plazmid nese inzert o velikosti 4,3 kb a byl pomocí opakované transformace otestován na svoji schopnost komplementovat mutaci v genu ilvD v mutantu R127/7. Pomocí dalšího subklonován! byla v tomto inzertu odhalena oblast odpovědná za komplementaci mutace genu ilvD v buňkách kmene R127/7 tvořená 2,9 kb dlouhým fragmentem Scal/Xhol.
3. Sekvenování genu ilvD
Sekvence nukleotidů v 2,9 kb dlouhém Scal/Xhol-fragmentu byla stanovena pomocí Sangerovy metody terminace DNA řetězce dideoxynukleotidy, viz Sanger a další, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: strana 5463 až 5467). Přitom byl použit Auto-Read «· • « » · · 4
I · 9 *
9 9 ·
• · ·»
-21Sequencing kit firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech, Uppsala, Švédsko. Elektroforetická analýza sekvenační směsi byla provedena automatickým sekvenátorem využívajícím laserem excitované fluorescence (A.L.F.) od firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech (Uppsala, Švédsko). Získaná nukleotidová sekvence byla analyzována programovým balíkem HUSAR (Verze 4.0, EMBL, Cambridge, Velká Británie). Tato nukleotidová sekvence je uvedena jako Sekvence id.č.: 4. Analýzou byl odhalen otevřený čtecí rámec o délce 1836 bp, který byl identifikován jako gen ilvD, kódující polypeptid o délce 612 aminokyselin. Tento protein je uveden jako Sekvence id.č.:5.
Příklad 3: Konstrukce deleční mutanty bakterie C. glutamicum v genu ilvA
Nejprve byla v genu ilvA bakterie Corynebacterium glutamicum ATCC13032 provedena deleční mutace způsobem, který využívá systému pro záměnu genů podle Scháfera a dalších, Gene 145: strana 69 až 73 (1994)). Ke konstrukci inaktivačního vektoru pK19mobsacBA ilvA byl nejprve z EcoRI fragmentu genu ilvA z vektoru pBM21 (Mockel a další, 1994, Molecular Microbiology 13: strana 833 až 842) vyštěpen interní, 241 bp dlouhý BglII fragment. Tato operace proběhla tak, že byl nejprve vektor naštepen enzymem BglII, poté provedena elektroforéza na agarózovém gelu, z kterého byl vyříznut interní BglII fragment genu ilvA a nakonec byl vektor opět zaligován. V dalším kroku byl z vektoru izolován neúplný gen ilvA jako EcoRI fragment a ten byl naligován do vektoru pK19mobsacB linearizovaného rovněž enzymem EcoRI (Scháfer 1994, Gene 145: strana 69 až 73). Získaným inaktivačním vektorem pK19mobsacBÁ ilvA byly transformovány bakterie E. coli kmene s 17-1 (Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166: strana 557 až 580). Poté byl tento vektor
• ·
-22přenesen konjugací do bakterií C. glutamicum ATCC13032 (viz Scháfer a další, 1990, Journal of Bacteriology 172: strana 1663 až 1666). Tak byly získány klony bakterie C. glutamicum rezistentní ke kanamycinu, v jejichž genomu byl integrován inaktivační vektor. V dalším kroku byly na LB médiu se sacharózou (konkrétně na médiu s 15 g/1 agaru, 2 % glukózy a 10 % sacharózy, viz Sambrook a další, Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) selektovány bakterie rezistentní ke kanamycinu, které díky druhé rekombinační události tento vektor opět ztratily, viz Jáger a další, 1992, Journal of Bacteriology 174: strana 5462 až 5465. Kolonie těchto bakterií byly přeočkovány na plotny s minimálním médiem CGXII s 15 g/1 agaru (Keilhauer a další, Journal of Bacteriology 175 (1993), strana 5595 až 5603) s přídavkem a bez přídavku 2 mM L-isoleucinu, či s přídavkem a bez přídavku 50 pg/ml kanamycinu. Tímto postupem bylo získáno 36 klonů, které byly díky deleci vektoru senzitivní ke kanamycinu a auxotrofní s ohledem na isoleucin, a jejichž genom obsahoval neúplný gen ilvA (aleluÁilvA). Jeden z těchto klonů byl označen jako kmen ATCC13032A ilvA a byl použit v dalších pokusech.
Příklad 4: Exprese genů ilvBN, ilvC a ilvD v bakteriích C. glutamicum
Geny pro syntázu hydroxyoctové kyseliny (ilvBN) a izomeroreduktázy (ilvC), viz Cordes a další, 1992, Gene 112: strana 113 až 116 a Keilhauer a další 1993, Journal of Bacteriology 175: strana 5595 až 5603 a gen pro dehydratázu dihydroxykyselin (ilvD, viz příklad 2) byly pro účely exprese nakloňovány do vektoru pECM3. Tento vektor je
-23·· · ··· · · · · · • · · ····· • · · · · ·····« odvozen od vektoru pECM2 (viz Jáger a další 1992, Journal of Bacteriology 174: strana 5462 až 5465), od kterého se liší delecí přibližně 1 kbp dlouhého fragmentu BamHI/BglII, který nese gen pro rezistenci ke kanamycinu.
Ve vektoru pKK5 (viz Cordes a další, 1992, Gene 112: strana 113 až 116) se nacházejí geny ilvBNC přenesené z vektoru pJCl (viz Cremer a další, 1990, Molecular and General Genetics 220: strana 478 až 480). Z tohoto vektoru byl izolován 5,7 kb dlouhý Xbal-fragment obsahující geny ilvBNC a ten byl spojen s 3,1 kb dlouhým Xbal fragmentem obsahujícím gen ilvD z vektoru pRV a s vektorem pECM3 linearizovaným restrikčním enzymem Xbal. Takto připravená ligační směs byla použita k transformaci E. coli kmene DH5amcr.
Z jednoho z transformantů typu DH5amcr/pECM3ilvBNCD byl získán plazmid pECM3ilvBNCD (viz obrázek 3).
Pomocí elektroporace (viz Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: strana 329 až 334) a následné selekce na rezistenci ke chloramfenikolu byl vpraven plazmid pECM3ilvBNCD do E.coli kmene ATCC13032AilvA za vzniku kmene ATCC13032AilvA/pECM3ilvBNCD. Dále byl elektroporací (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 51: strana 329 až 334) a následnou selekcí na rezistenci ke kanamycinu vložen plazmid pEKEx2panBC do bakteriálních kmenů ATCC13032 a ATCC13032A ilvA a tak byly získány kmeny ATCC13032/pEKEx2panBC a ATCC13032A HvA/pEKEx2panBC. Do bakterií kmene ATCC13032A ilvA/pECM3ilvBNCD byly elektroporací (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: strana 329 až 334) a následnou selekcí na rezistenci ke kanamyciny a chloramfenikolu vloženy plazmidy pEKEx2panBC a pEKEX2. Tímto způsobem byly získány kmeny ATCC13032AilvA/pECM3ilvBNCD pEKEX2 a ATCC13032 Δ ilvA/pECM3i!vBNCD pEKEx2panBC.
• ·
-24Příklad 5: Konstrukce panC-mutanta bakterie C. glutamicum neschopného syntetizovat kyselinu pantothenovou
Mutantní kmen bakterie C. glutamicum R127 panC byl zhotoven pomocí inaktivačního vektoru pK18mob (viz Scháfer a další 1994, Gene 145: strana 69 až 73).
Před vlastní konstrukcí panC-inaktivačniho vektoru byl nejprve polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) amplifikován 168 bp dlouhý centrální fragment genu panC (nukleotidy 265 až 432 z celého genu o 837 bp) C. glutamicum. Jako matrice byl použit vektor pURl (viz Příklad 6); jako primery byly použity 20-mery: primer 1: 5' GTTCGCACCCGATGTGGAGG 3'; primer 2: 5’ ATGCACGATCAGGGCGCACC 3'. Vlastní PCR byla provedena podle Sambrooka a dalších, Molecular cloning. A laboratory manual, (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) přičemž teplota annealingu činila 55°C. Vzniklý fragment byl nejprve nakloňován natupo do cílového místa Smál vektoru pUC18 a z tohoto vektoru byl poté přenesen jako EcoRI/SalI fragment do inaktivačního vektoru pK18mob (viz Scháfer a další 1994, Gene 145: strana 69 až 73) . Takto vzniklý vektor pK18mob'panC' byl použit ke transformaci E. coli kmene s 17-1. Z bakterie E.coli byl následně konjugací přenesen do C. glutamicum kmene R127. Pomocí selekce na rezistenci ke kanamycinu byly získány klony bakterií C. glutamicum R127, ve kterých došlo k homologní rekombinaci integračního vektoru do genu panC. Takto vzniklý kmen R127panC::pK18mob 'panC' je používán ke stanovení D-pantothenátu.
Příklad 6: Kvantitativní stanovení D-pantothenátu
Ke kvantitativnímu stanovení D-pantothenátu byl zkonstruován panC mutantní kmen bakterií C. glutamicum • · · ····· • · · · · · ······ • · · · · · ········ «000000 ·· 0 ·
-25R127panC::pK18mob'panC' (viz příklad 5). Růst těchto bakterií je přímo závislý na koncentraci D-pantothenátu v kultivačním médiu. Tento kmen je auxotrofní vzhledem ke kyselině pantothenové a nevykazuje žádný růst v přítomnosti β-alaninu a D-pantoátu.
Jako vhodné testovací médium ke stanovení pantothenátu tímto indikátorovým kmenem bylo vybráno médium CGXII (viz Keilhauer a další Journal of Bacteriology (1993) 175: strana 5595 až 5603). Do inkubačních zkumavek (Falcon 2057, Becton a Dickinson, New Jersey, USA) byly napipetovány vždy 3 ml média CGXII koncentrovaného 4/3 spolu s jedním mililitrem standardu obsahujícího pantothenovou kyselinu nebo testovaného roztoku. Tyto zkumavky byly poté inokulovány indikátorovým kmenem bakterie. Jako inokulum bylo vždy použito 60 μΐ glycerinové kultury indikátorového kmene. Po 40 hodinách inkubace při teplotě 30°C byla na spektrofotometru Novaspec 4049 (LKB Bio-chrom,Cambridge, Velká Británie) změřena optická hustota kultury při vlnové délce 600 nm. Pomocí kalibrační křivky byla pak určena koncentrace kyseliny pantothenové. Tento kmen vykazuje až do koncentrace 25 pg/l lineární závislost růstu na koncentraci kyseliny pantothenové při optických hustotách v rozsahu od 0,5 do 10. Při přípravě glycerinových kultur se nejprve indikátorový kmen po 24 hodin pěstuje na médiu CGXII (tzv. vyhladovění na D-pantothenát). Po tomto vyhladovění se 1050 μΐ této kultury smíchá se 700 μΐ glycerinu. Tato kultura se poté skladuje při -70°C a na stanovení se poté výše popsaným způsobem používají 60 μΐ alikvoty. Pro referenční měření byl použit pantothenát sodný od firmy Sigma (Deisenhofen, SRN).
• · • · · ····· • · · 9 · · ······ • · · · · · ········ ······· ·· ·«
-26Příklad 7: Výroba D-pantothenátu v různých kmenech bakterie C. glutamicum
Kmeny ATCC13032, ATCC13032/pEKEx2panBC, ATCC13032Á ilvA a ATCC13032AilvA/pEKEx2panBC byly testovány z hlediska schopnosti tvořit kyselinu pantothenovou. Bakterie byly nejprve nasazeny do 60 ml média BHIM (Brain Heart Infusion Medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) a inkubovány 14 hodin při 30°C. Poté byly buňky dvakrát promyty 0,9% (w/v) roztokem NaCl a touto suspenzí bylo naočkováno 60 ml média CgXII tak, aby OD5qo činila 0,5. Toto médium bylo identické s médiem popisovaným Keilhauerem a dalšími v Journal of Bacteriology (1993) 175: strana 5595 až 5603, až na to, že navíc obsahovalo 2mM L-isoleucin. Médium CgXII popisované Keilhauerem a dalšími, je uvedeno v tabulce 2.
• · · · « ·
-27Tabulka 2: Složení média CGXII
Složka Koncentrace
(NH4) 2SO4 20 g/1
močovina 5 g/1
KH2PO4 1 g/1
k2hpo4 1 g/1
Mg204*7 H20 0, 25 g/1
Kyselina 3-morfolino propansulfonová 42 g/1
CaCl2 10 mg/1
FeS04*7 H20 10 mg/1
MnS04* H20 10 mg/1
ZnS04*7 H20 1 mg/1
CuSO.j 0,2 mg/1
NiCl2*6 H20 0,02 mg/1
biotin (pH7) 0,2 mg/1
glukóza 40 g/1
Kyselina protokatechuová (3,4-dihydroxy benzoová) 0,03 mg/L
Během kultivace kmenů ATCC13032/pEKEx2panBC a ATCC1303AilvA/pEKEx2panBC byl k médiu po 5 hodinách přidán isopropylthio-h-D-galactosid (IPTG) do konečné koncentrace 1 mM. Po další 24 hodinové kultivací byly odebrány vzorky, buňky odstraněny centrifugací a supernatant sterilně přefiltrován. Koncentrace vzniklého pantothenátu byla určena • ·
způsobem popsaným v příkladu 6. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3: Produkce D-pantothenátu tvoření v různých kmenech C. glutamicum
Kmen Koncentrace D-pantothenátu v (mg/1)
ATCC13032 0, 01
ATCC13032/pEKEx2panBC 0, 03
ATCC13032AilvA 0, 06
ATCC13032AilvA/pEKEx2panBC 0, 3
Příklad 9: Produkce D-pantothenátu v různých kmenech C. glutamicum s přídavkem β-alaninu
Ke kvantifikaci tvorby pantothenátu byly vybrány kmeny ATCC13032A ilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2 a ATCC13032A ilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2panBC. Bakterie byly nejprve 14 hodin inkubovány v 60 ml média BHMI (Difco Laboratories, Detroit, USA) s přídavkem 25 mg/1 kanamycinu a 3 mg/1 chloramfenikolu při teplotě 30°C. Poté byly kultury dvakrát promyty 0,9% (w/v) roztokem NaCl a tato suspenze byla použita k naočkování 60 ml média CGXII tak, že počáteční OD60o činila 0,5. Médium obsahovalo navíc 2mM L-isoleucin, 25 mg/1 kanamycin, 3 mg/1 chloramfenikol a β-alanin v konečné 20 mM koncentraci. Po pětihodinové kultivaci byl k médiu přidán isopropylthio-B-D-galactosid (IPTG) do • · ·
• · · «
-29konečné koncentrace 1 mM. Po 49 a 74 hodinách byly odebrány vzorky. Z těchto vzorků byly nejprve odstraněny centrifugací buňky a supernatant byl poté sterilně přefiltrován. Koncentrace vzniklého pantothenátu byla určena způsobem popsaným v příkladu 6. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4: Akumulace D-pantothenátu v různých kmenech bakterie C. glutamicum
Kmen Koncentrace [mg/l] po D-pantothenátu
49 hodinách 74 hodinách
ATCC13032AilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2 80 100
ATCC13032AilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2panBC 920 980
-3 0.INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1: ............... ’* (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2164 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTISENSE: ne (vi) PŮVOD:
(A) ORGANISMUS: Corynobacterium glutamicum (B) KMEN: ATCC13032 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA:351 až 1163 (C) DALŠÍ INFORMACE: start kodón= 351; produkt= ketopantoáthydroxy-methyltransferáza; gen=panB (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA:1166 až 2002 (C) DALŠÍ INFORMACE: start kodón= 1166; produkt= pantothenátsyntáza; gen=panC (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 1:
GCTTCGGGGT ACCAATTCCT TTAAGAACCA TCAGATCAAT CTGTTGTACA TTCTCGGCCA 60
GATTCAGCTT TTCGGTAAGG ACGAAACACT TTCACTTGAA TCGGCAGCAA AGTTTCTTAA 120
AGTTTCTAAG GCAACTGCAA CGAGGTATTT TAGAACTCTC CGAGAAATGG AATTAGTTCA 180
CGAGGTCAGC AAACGCCCTT TGCGGTTTGC GCTCACGGAT AAAGGTCGTG AGATAGTAGG 240
TCTTGAGGTA AAAATTTGAC TCCATAACGA GAACTTAATC GAGCAACACC CCTGAACAGT 300
GAATCAAATC GGAATTTATT TATTCTGAGC TGGTCATCAC ATCTATACTC ATG CCC 356
Met Pro
ATG TCA GGC ATT Ile GAT Asp GCA AAG AAA ATC CGC ACC CGT CAT TTC CGC GAA 404
Met Ser Gly 5 Ala Lys Lys 10 Ile Arg Thr Arg His 15 Phe Arg Glu
GCT AAA GTA AAC GGC CAG AAA GTT TCG GTT CTC ACC AGC TAT GAT GCG 452
Ala Lys Val Asn Gly Gin Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr Asp Ala
20 25 30
CTT TCG GCG CGC ATT TTT GAT GAG GCT GGC GTC GAT ATG CTC CTT GTT 500
Leu Ser Ala Arg Xle Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu Leu Val
35 40 45 50
GGT GAT TCC GCT GCC AAC GTT GTG CTG GGT CGC GAT ACC ACC TTG TCG 548
Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr Leu Ser
55 60 65
ATC ACC TTG GAT GAG ATG ATT GTG CTG GCC AAG GCG GTG ACG ATC GCT 596
Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr Ile Ala
70 75 80
ACG AAG CGT GCG CTT GTG GTG GTT GAT CTG CCG TTT GGT ACC TAT GAG 644
Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr Tyr Glu
85 90 95
GTG AGC CCA AAT CAG GCG GTG GAG TCC GCG ATC CGG GTC ATG CGT GAA 692
Val Ser Pro Asn Gin Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met Arg Glu
100 105 110
ACG GGT GCG GCT GCG GTG AAG ATC GAG GGT GGC GTG GAG ATC GCG CAG 740
-3.1-· « · • · • • • • • • • • * • · • · • · • · * · · • • · • · • · • · · •
• «
Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile Ala Gin
115 120 125 130
ACG ATT CGA CGC ATT GTT GAT GCT GGA ATT CCG GTT GTC GGC CAC ATC
Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly His Ile
135 140 145
GGG TAC ACC CCG CAG TCC GAG CAT TCC TTG GGC GGC CAC GTG GTT CAG
Gly Tyr Thr Pro Gin Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val Val Gin
150 155 160
GGT CGT GGC GCG AGT TCT GGA AAG CTC ATC GCC GAT GCC CGC GCG TTG
Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg Ala Leu
165 170 175
GAG CAG GCG GGT GCG TTT GCG GTT GTG TTG GAG ATG GTT CCA GCA GAG
Glu Gin Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro Ala Glu
180 185 190
GCA GCG CGC GAG GTT ACC GAG GAT CTT TCC ATC ACC ACT ATC GGA ATC
Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile Gly Ile
195 200 205 210
GGT GCC GGC AAT GGC ACA GAT GGG CAG GTT TTG GTG TGG CAG GAT GCC
Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gin Val Leu Val Trp Gin Asp Ala
215 220 225
TTC GGC CTC AAC CGC GGC AAG AAG CCA CGC TTC GTC CGC GAG TAC GCC
Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu Tyr Ala
230 235
ACC TTG GGC GAT TCC TTG CAC GAC GCC GCG CAG GCC TAC ATC GCC GAT
Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gin Ala Tyr Ile Ala Asp
245 250 255
ATC CAC GCG GGT ACC TTC CCA GGC GAA GCG GAG TCC TTT TA ATG CAG
Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe Met Gin
260 265 270 i
GTA GCA ACC ACA AAG CAG GCG CTT ATC GAC GCC CTC CTC CAC CAC AAA
Val Ala Thr Thr Lys Gin Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His His Lys
5 10 15
TCC GTC GGG CTC GTC CCC ACC ATG GGT GCG CTA CAC AGC GGA CAC GCC
Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly His Ala
20 25 30
TCG TTG GTT AAA GCA GCA CGC GCT GAA AAC GAC ACT GTT GTA GCC AGT
Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val Ala Ser
35 40 45 50
ATT TTT GTC AAT CCC CTG CAG TTT GAA GCA CTC GGT GAT TGC GAT GAT
Ile Phe Val Asn Pro Leu Gin Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys Asp Asp
55 60 65
TAC CGC AAC TAT CCC CGC CAA CTC GAC GCC GAT TTA GCA CTG CTT GAA
Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gin Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu Leu Glu
70 75 80
GAG GCA GGT GTG GAT ATT GTG TTC GCA CCC GAT GTG GAG GAA ATG TAC
Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu Met Tyr
85 90 95
CCC GGT GGC TTG CCA CTA GTG TGG GCG CGC ACC GGT TCC ATC GGA ACA
Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile Gly Thr
100 105 110
AAA Lys 115 TTG Leu GAG Glu GG i Gly GCC Ala AGC Ser 120 AGG Arg CCJ* GG? CAT ÚC ČMOGrtTtffcCT ACC 1555
pra Giy •His We' 125 Ttep Giy Val* Ala Thr 130
5 GTG GTG GCG AAG CTG TTC AAT TTG GTG CGC CCT GAT CGT GCA TAT TTT 1603
Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala Tyr Phe
135 140 145
GGA CAA AAA GAT GCT CAG CAG GTT GCG GTG ATT CGG CGA TTG GTT GCC 1651
10 Gly Gin Lys Asp Ala Gin Gin Val Ala Val Ile Arg Arg Leu Val Ala
150 155 160
GAT CTA GAC ATT CCC GTG GAG ATT CGT CCC GTT CCG ATT ATT CGT GGC 1699
Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile Arg Gly
15 165 170 175
GCC GAT GGC TTA GCC GAA TCC AGC CGC AAT CAA CGT CTT TCT GCG GAT 1747
Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gin Arg Leu Ser Ala Asp
180 185 190
20
CAG CGA GCG CAA GCT CTG GTG CTG CCG CAG GTG TTG AGT GGG TTG CAG 1795
Gin Arg Ala Gin Ala Leu Val Leu Pro Gin Val Leu Ser Gly Leu Gin
195 200 205 210
25 CGT CGA AAA GCA GCT GGT GAA GCG CTA GAT ATC CAA GGT GCG CGC GAC 1843
Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gin Gly Ala Arg Asp
215 220 225
ACC TTG GCC AGC GCC GAC GGC GTG CGC TTG GAT CAC CTG GAA ATT GTC 1891
30 Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu Ile Val
230 235 240
GAT CCA GCC ACC CTC GAA CCA TTA GAA ATC GAC GGC CTG CTC ACC CAA 195 9
Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu Thr Gin
35 245 250 255
CCA GCG TTG GTG GTC GGC GCG ATT TTC GTG GGG CCG GTG CGG TTG ATC 19 S
Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg Leu Ile
260 265 270
GAC AAT ATC GAG CTC TAGTACCAAC CCTGCGTTGC AGCACGCAGC TTCGCATAAC 2042
Asp Asn Ile Glu Leu
275
GCGTGCTCAG CTCAGTGTTT TTAGGTGCGC GGTGCGGATC GGAACCGGGA GTTGGCCACT 2102
GCGGTGGCGT GGCCTCACCC GACAGCGCCC ATGCCGCCTG ACGAGCTGCA CCCAACGCCA 2162
CA 2164
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 271 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 2:
Met 1 Pro Met Ser Gly 5 Ile Asp Ala Lys Lys 10 Ile Arg Thr Arg His 15 Phe
6 5 Arg Glu Ala Lys 20 Val Asn Gly Gin Lys 25 Val Ser Val Leu Thr 30 Ser Tyr
Asp Ala Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu • · *· · · · • * · * » · · ·
35 40 45
Leu Val Gly Asp Ser Ala Ala 50 55 Asn Val Val Leu Gly 60 Arg Asp Thr Thr
Leu 65 Ser Ile Thr Leu Asp Glu 70 Met Ile Val Leu Ala 75 Lys Ala Val Thr 80
Ile Ala Thr Lys Arg Ala Leu 85 Val Val Val Asp Leu 90 Pro Phe Gly Thr 95
Tyr Glu Val Ser Pro Asn Gin 100 Ala Val Glu Ser Ala 105 Ile Arg Val Met 110
Arg Glu Thr Gly Ala Ala Ala 115 Val Lys Ile Glu Gly 120 Gly Val Glu Ile 125
Ala Gin Thr Ile Arg Arg Ile 130 135 Val Asp Ala Gly Ile 140 Pro Val Val Gly
His 145 Ile Gly Tyr Thr Pro Gin 150 Ser Glu His Ser Leu 155 Gly Gly His Val 160
Val Gin Gly Arg Gly Ala Ser 165 Ser Gly Lys Leu Ile 170 Ala Asp Ala Arg 175
Ala Leu Glu Gin Ala Gly Ala 180 Phe Ala Val Val Leu 185 Glu Met Val Pro 190
Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val 195 Thr Glu Asp Leu Ser 200 Ile Thr Thr Ile 205
Gly Ile Gly Ala Gly Asn Gly 210 215 Thr Asp Gly Gin Val 220 Leu Val Trp Gin
Asp 225 Ala Phe Gly Leu Asn Arg 230 Gly Lys Lys Pro Arg 235 Phe Val Arg Glu 240
Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser 245 Leu His Asp Ala Ala 250 Gin Ala Tyr Ile 255
Ala Asp Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala 260 265 INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 3: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 279 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 3: Glu Ser Phe 270
Met 1 Gin Val Ala Thr Thr Lys 5 Gin Ala Leu Ile Asp 10 Ala Leu Leu His 15
His Lys Ser Val Gly Leu Val 20 Pro Thr Met Gly Ala 25 Leu His Ser Gly 30
His Ala Ser Leu Val Lys Ala 35 Ala Arg Ala Glu Asn 40 Asp Thr Val Val 45
Ala Ser Ile Phe Val Asn Pro 50 55 Leu Gin Phe Glu Ala 60 Leu Gly Asp Cys
Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gin Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu • ·
70 75 80
Leu Glu Glu Ala Gly 85 Val Asp Ile Val Phe ♦ 90 Ala Pro Asp Val Glu 95 Glu
Met Tyr Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile
100 105 110
Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val
115 120 125
Ala Thr Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala
130 135 140
Tyr PhC Gly Gin Lys Asp Ala Gin Gin Val Ala Val Ile Arg Arg Leu
145 150 155 160
Val Ala Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile
165 170 175
Arg Gly Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gin Arg Leu Ser
180 185 190
Ala Asp Gin Arg Ala Gin Ala Leu Val Leu Pro Gin Val Leu Ser Gly
195 200 205
Leu Gin Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gin Gly Ala
210 215 220
Arg Asp Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu
225 230 235 240
Ile Val Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu
245 250 255
Thr Gin Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg
260 265 270
Leu Ile Asp Asn Ile Glu Leu
275
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2952 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTISENSE: ne (vi) PŮVOD:
(A) ORGANISMUS: Corynobacterium glutamicum (B) KMEN: ATCC13032 (C) ISOLÁT: mutant R127 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA:290 až 2125 (D) DALŠÍ INFORMACE: start kodón= 290; číslo EC= 4.2.1.9; produkt= dehydratáza dihydroxy kyselin; gen=ilvD (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 4:
• · ·
AGTACTTGGA GCGCCAAAAG GCACTGGGCA AGCCAGTTCA GTTGAACTTC GATGACGACA
CCGATGGGAA TACAACACAA ACAGAAAGCG TTGAATCCCA AGAGACCGGA CAAGCCGCGT
CTGAAACCTC ACATCGTGAT AACCCTGCGT CACAGCACTA GAGTGTAATA AGCCGTCCGA
ACCAAAGGTC CACACCTCTG CACGAGTAGA AGCTCACCCA AGTTTTCAAA GTGCCGTTGA
TTCTTGACAA CCACCCGCCG CTCTTTAGAG CAGATTTGAA AAGCGCATC ATG ATC Met Ile 280
CCA CTT CGT TCA AAA GTC ACC ACC GTC GGT CGC AAT GCA GCT GGC GCT
Pro Leu Arg Ser 285 Lys Val Thr Thr Val 290 Gly Arg Asn Ala Ala 295 Gly Ala
CGC GCC CTT TGG CGT GCC ACC GGC ACC AAG GAA AAT GAG TTC GGC AAG
Arg Ala Leu 300 Trp Arg Ala Thr Gly 305 Thr Lys Glu Asn Glu 310 Phe Gly Lys
CCA ATT GTT GCC ATC GTA AAC TCC TAC ACC CAG TTC GTG CCC GGA CAC
Pro Ile 315 Val Ala Ile Val Asn 320 Ser Tyr Thr Gin Phe 325 Val Pro Gly His
GTT CAC CTT AAG AAC GTC GGC GAT ATT GTG GCA GAT GCA GTG CGC AAA
Val 330 His Leu Lys Asn Val 335 Gly Asp Ile Val Ala 340 Asp Ala Val Arg Lys 345
GCC GGT GGC GTT CCA AAG GAA TTC AAC ACC ATC GTC GAT GAC GGC ATC
Ala Gly Gly Val Pro 350 Lys Glu Phe Asn Thr 355 Ile Val Asp Asp Gly 360 Ile
GCC ATG GGA CAC GGC GGC ATG CTG TAC TCC CTG CCA TCC CGT GAA ATC
Ala Met Gly His 365 Gly Gly Met Leu Tyr 370 Ser Leu Pro Ser Arg 375 Glu Ile
ATC GCC GAC TCC GTC GAA TAC ATG GTC AAC GCA CAC ACC GCC GAC GCC
Ile Ala Asp 380 Ser Val Glu Tyr Met 385 Val Asn Ala His Thr 390 Ala Asp Ala
ATG GTG TGT ATC TCC AAC TGT GAC AAG ATC ACC CCA GGC ATG CTC AAC
Met Val 395 Cys Ile Ser Asn Cys 4 00 Asp Lys Ile Thr Pro 405 Gly Met Leu Asn
GCA GCA ATG CGC CTG AAC ATC CCA GTG GTC TTC GTT TCC GGT GGC CCA
Ala 410 Ala Met Arg Leu Asn 415 Ile Pro Val Val Phe 420 Val Ser Gly Gly Pro 425
ATG GAA GCT GGC AAG GCT GTC GTC GTT GAG CGC GTT GCA CAC GCA CCA
Met Glu Ala Gly Lys 430 Ala Val Val Val Glu 435 Arg Val Ala His Ala 440 Pro
ACC GAC CTC ATC ACC GCG ATC TCC GCA TCC GCA AGC GAT GCA GTC GAC
Thr Asp Leu Ile 445 Thr Ala Ile Ser Ala 450 Ser Ala Ser Asp Ala 455 Val Asp
GAC GCA GGC CTT GCA GCC GTT GAA CGA TCC GCA TGC CCA ACC TGT GGC
Asp Ala Gly 460 Leu Ala Ala Val Glu 465 Arg Ser Ala Cys Pro 470 Thr Cys Gly
TCC TGC TCC GGT ATG TTC ACC GCG AAC TCC ATG AAC TGC CTC ACC GAA
Ser Cys 475 Ser Gly Met Phe Thr 480 Ala Asn Ser Mer Asn 485 Cys Leu Thr Glu
GCT CTG GGA CTT TCT CTC CCG GGC AAC GGC TCC ACT CTG GCA ACC CAC
« · · · • · · -36-· • • • • • · • • • • · • · • • • • • • • · • · • · • · • · · •
• •
Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala Thr His
490 495 500 505
GCA GCA CGT CGC GCA CTG TTT GAA AAG GCC GGC GAA ACC GTC GTT GAA
Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val Val Glu
510 515 520
CTG TGC CGC CGC TAC TAC GGT GAA GAA GAC GAA TCC GTT CTG CCA CGT
Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu Pro Arg
525 530 535
GGC ATT GCC ACC AAG AAG GCA TTC GAA AAC GCA ATG GCA CTG GAT ATG
Gly Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu Asp Met
540 545 550
GCC ATG GGT GGA TCC ACC AAC ACC ATC CTC CAC ATC CTC GCA GCT GCC
Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu His Ile Leu Ala Ala Ala
555 560 565
CAG GAA GGC GAA GTT GAC TTC GAC CTC GCA GAC ATC GAC GAA CTG TCC
Gin Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Asp Glu Leu Ser
570 575 580 585
AAA AAC GTC CCC TGC CTG TCC AAG GTT GCA CCA AAC TCC GAC TAC CAC
Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp Tyr His
590 595 600
ATG GAA GAC GTC CAC CGC GCC GGT CGC ATT CCA GCA CTG CTC GGC GAG
Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Arg Ile Pro Ala Leu Leu Gly Glu
605 610 615
CTC AAC CGC GGT GGC CTG CTG AAC AAG GAC GTC CAC TCC GTT CAC TCC
Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser Val His Ser
620 625 630
AAC GAC CTT GAA GGT TGG TTG GAT GAC TGG GAT ATC CGC TCT GGC AAG
Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp Ile Arg Ser Gly Lys
635 640 645
ACC ACC GAA GTA GCA ACC GAA CTC TTC CAC GCA GCC CCA GGT GGC ATC
Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro Gly Gly Ile
650 655 660 665
CGC ACC ACC GAA GCA TTC TCC ACC GAG AAC CGC TGG GAC GAA CTC GAC
Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu Leu Asp
670 675 680
ACC GAC GCT GCC AAG GGC TGC ATC CGC GAC GTT GAA CAC GCC TAC ACC
Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His Ala Tyr Thr
685 690 695
GCC GAC GGC GGC CTG GTT GTT CTT CGC GGC AAC ATC TCC CCT GAC GGC
Ala Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser Pro Asp Gly
700 705 710
GCA GTG ATC AAG TCC GCA GGT ATC GAA GAA GAG CTG TGG AAC TTC ACC
Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Glu Glu Glu Leu Trp Asn Phe Thr
715 720 725
GGA CCA GCA CGA GTT GTC GAA AGC CAG GAA GAG GCA GTC TCT GTC ATC
Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gin Glu Glu Ala Val Ser Val Ile
730 735 740 745
CTG ACC AAG ACC ATC CAA GCT GGC GAA GTT CTG GTC GTC CGC TAC GAA
Leu Thr Lys Thr Ile Gin Ala Gly Glu Val Leu Val Val Arg Tyr Glu
750 755 760
GGC CCA TCA GGT GGA CCA GGC ATG CAG GAA ATG CTT CAC CCA ACC GCA
Gly Pro Ser Gly 765 Gly Pro Gly Met Gin 770 Glu Met Leu His Pro 775 Thr Ala
TTC CTC AAG GGA TCC GGC CTG GGC AAG AAG TGT GCA CTG ATC ACC GAC 1831
5 Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu Ile Thr Asp
780 785 790
GGC CGT TTC TCC GGA GGT TCC TCA GGA CTG TCC ATC GGC CAC GTC TCC 1879
Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly His Val Ser
10 795 800 805
CCA GAA GCA GCA CAC GGC GGA GTC ATT GGT CTG ATC GAA AAC GGC GAC 1927
Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Ile Gly Leu Ile Glu Asn Gly Asp
810 815 820 825
15
ATC GTC TCC ATC GAC GTT CAC AAC CGC AAG CTC GAA GTT CAG GTC TCC 1975
Ile Val Ser Ile Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val Gin Val Ser
830 835 840
20 GAC GAG GAA CTC CAG CGC CGC CGC GAC GCT ATG AAC GCC TCC GAG AAG 2023
Asp Glu Glu Leu Gin Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala Ser Glu Lys
845 850 855
CCA TGG CAG CCA GTC AAC CGT AAC CGC GTT GTC ACC AAG GCA CTG CGC 2071
25 Pro Trp Gin Pro Val Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala Leu Arg
860 865 870
GCA TAC GCA AAG ATG GCT ACC TCC GCT GAT AAG GGT GCA GTC CGT CAG 2119
Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val Arg Gin
30 875 880 885
GTC GAC TAACCCTTTG TGAGTGTTTG AGCACCGGTT CCCTACTTTG GGTTCCGGTG 2175
Val Asp
890
CTTTTTCATG TCTTGGCCTG TGTGGGCGTG GTGGAGCTCC CCGTTGCAAA TACTCACCAC 2235
AAGTTGCAGG ATTTCTGCTG GTTGTGGTGG ATTTTCCCGC TTTATAGCCC TATGCGTGCA 2295
ACTTTCGGAC CGATTCCAAA GGGCAAAGCC CTGTTTGTGG TGGATCCTTG CCCTGGAAGC 2355
TTTCAGGAAC CACAACTACC CCACTGACCC CAAAGTGGAT AGGCCCTATT CTTCCGTTTA 2415
AGCGCCTCAA ACACCTCTCC CCACACTTGA CCCATTAGGC AATTACGAAT CCTTAAACAG 2475
CCTTCTACAG CACCATGCCC CAAACCGAAC CCAGGCATGA AAAAGACCCT CACCAGGAGG 2535
GTCTTTTTCT AAAACTTTGG CTACGCGATT GGGTTCACAC CCGCACCGAA CCACCACAGC 2595
AGAACTGCCG CTGCGATGCC GATGACCACG AAGATCCACG AGCTCACCAG TGGACGCTTT 2655
GCCCAACCTC GGCCAGAGTC AAGGGAAATC TTGCCGGGGC CGGTGAACTG AAGTCCGACA 2715
ACCACGATAG TGAGGATCAG TGCCAGCATC AATGGCTCAC TAAGTTCACC CCAACCACCT 2775
TCATGAGTGT TGACTTGGTG AAGGGTGGTA AAGGATGTCG CCACCGTGGC TACCGCTGCT 2835
GCCACTGGGG TCATCAGACC AAGGAGCAGG AAGACACCAG CCGCAAGTTC AATAGATGGA 2895
AGCAGGATCG CGAGGATTTC AGGCCACTGG TAACCAGCGA ACTCTGCCTC GACTCTA 2952
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 612 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární • · • · · ··*·· • · · · · · ······ • · · · · · (ii) TYP MOLEKULY: protein (xii) POPIS SEKVENCE ID.Č. 5:
Met 1 Ile Pro Leu Arg 5 Ser Lys Val Thr Thr 10 Val Gly Arg Asn Ala 15 Ala
Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe
20 25 30
Gly Lys Pro Ile Val Ala Ile Val Asn Ser Tyr Thr Gin Phe Val Pro
35 40 45
Gly His Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Ile Val Ala Asp Ala Val
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr Ile Val Asp Asp
65 70 75 80
Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser Arg
85 90 95
Glu Ile Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr Ala
100 105 110
Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly Met
115 120 125
Leu Asn Ala Ala Met Arg Leu Asn Ile Pro Val Val Phe Val Ser Gly
130 135 140
Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Glu Arg Val Ala His
145 150 155 160
Ala Pro Thr Asp Leu Ile Thr Ala Ile Ser Ala Ser Ala Ser Asp Ala
165 170 175
Val Asp Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr
180 185 190
Cys Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu
195 200 205
Thr Glu Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala
210 215 220
Thr His Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Glu Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu
245 250 255
Pro Arg Gly Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu
260 265 270
Asp Met Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu His Ile Leu Ala
275 280 285
Ala Ala Gin Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Asp Glu
290 295 300
Leu Ser Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp
305 310 315 320
Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Arg Ile Pro Ala Leu Leu
325 330 335
Gly Glu Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser Val • « « · • · · 9
340 345 350
His Ser Asn 355 Asp Leu Glu Gly Trp 360 Leu Asp Asp Trp Asp 365 Ile Arg Ser
Gly Lys Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro Gly
370 375 380
Gly Ile Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu
385 390 395 400
Leu Asp Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His Ala
405 410 415
Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser Pro
420 425 430
Asp Gly Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Glu Glu Glu Leu Trp Asn
435 440 445
Phe Thr Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gin Glu Glu Ala Val Ser
450 455 460
Val I le Leu Thr Lys Thr Ile Gin Ala Gly Glu Val Leu Val Val Arg
465 470 475 480
Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Gly Pro Gly Met Gin Glu Met Leu His Pro
485 490 495
Thr Ala Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu Ile
500 505 510
Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly His
515 520 525
Val Ser Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Ile Gly Leu Ile Glu Asn
530 535 540
Gly Asp Ile Val Ser Ile Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val Gin
545 550 555 560
Val Ser Asp Glu Glu Leu Gin Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala Ser
565 570 575
Glu Lys Pro Trp Gin Pro Val Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala
580 585 590
Leu Arg Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val
595 600 605
Arg Gin Val Asp

Claims (4)

1. DNA pocházející z bakterií rodu Corynebacterium replikovatelná v bakteriích tohoto rodu a popřípadě rekombinantní, která obsahuje alespoň jednu z následujících nukleotidových sekvencí:
a) kódující sekvenci genu panB (ketopantoáthydroxymethyl transferázy) podle Sekvence id.č.:l
b) kódující sekvenci genu panC (pantothenát syntázy) podle Sekvence id.č.:l, zvláště pak operon panBC a popřípadě
c) kódující sekvenci genu ilvD (dehydratázy dihydroxy-kyselin) podle Sekvence id.č.:4.
2. Replikovatelná DNA podle nároku 1, která:
i) má sekvenci nukleotidů podle Sekvence id.č.:l, ii) Sekvence id.č:4 obsahuje alespoň jednu takovou sekvenci, která sekvencím uvedeným v (i) odpovídá díky degeneraci iii) genetického kódu obsahuje alespoň jednu takovou sekvenci, která
hybridizuje se sekvencemi komplementárními k sekvencím uvedeným v (i) nebo (ii) a popřípadě iv) má funkčně neutrální sense-mutaci.
3. Mikroorganismy, zvláště pak z rodu Corynebacterium, které jsou transformovány vložením jedné nebo více replikovatelných DNA podle libovolného z nároků 1 a 2.
4. Kyvadlový vektor pECM3ilvBNCD, který je v buňkách E.coli DH5amcr uložen u DSM pod označením DSM 12457 a jehož restrikční mapa je uvedena na Obrázku 3.
I • · · · » · ·
5. Kyvadlový vektor pEKEx2panBC, který je v buňkách E.coli DH5amcr uložen u DSM pod označením DSM 12456 a jehož restrikční mapa je uvedena na Obrázku 2.
6. Způsob výroby kyseliny pantothenové vyznačující se tím , že se v mikroorganismech rodu Corynebacterium zesílí (zvýší se jejich exprese) geny panB a panC a popřípadě další nukleotidové sekvence, kódující odpovídající enzymy a tyto mikroorganismy se použijí k fermentaci.
7. Způsob výroby podle nároku 6 vyznačující se tím , že se ještě navíc zesílí (zvýší se jeho exprese) gen ilvD.
8.
Způsob výroby podle nároků vyznačující se tím navíc zesílí (zvýší se jeho exprese)
6 nebo 7 , že se ještě gen ilvBNCD.
9. Způsob výroby podle vyznačující se dosáhne zvýšením počtu nároků 6 tím , že kopií genu, nebo 7 se zesílení popřípadě nukleotidových sekvencí v mikroorganismu transformací plazmidem, který tento gen, popřípadě nukleotidovou sekvenci nese.
10. Způsob podle nároků 6 nebo 7 vyznačující se tím , že se zesílení dosáhne mutací promotorové nebo regulační oblasti nacházející se proti proudu transkripce od strukturního genu.
I
-4·2-:
značuj ící dosáhne vložením transkripce od
Způsob podle nároků 6 nebo 7 v se tím , že se zesílení expresní kazety proti proudu strukturního genu.
12. Způsob podle nároků 6 nebo 7 vyznačující se tím , že se zesílení dosáhne prodloužením životnosti mRNA, která vzniká transkripcí uvedených sekvencí a/nebo zpomalením odbourávání odpovídajícího enzymatického proteinu (proteinů).
13. Způsob podle libovolného z nároků 6 až 12 vyznačující se tím , že se zvýší exprese genů podle nároku 1 v bakteriích
Corynebacterium, které obsahují další mutace pro rezistenci k metabolitům popřípadě antimetabolitům.
14. Způsob podle libovolného z nároků 6 až 12 vyznačuj ící se t i m , že se zesílení dosáhne změnou kultivačního média a/nebo průběhu fermentace.
Způsob podle libovolného z nároků vyznačující se tím , mikroorganismu ínhíbuje alespoň jedna dráha, která snižuje tvorbu pantothenátu kyseliny).
6 až 14 že se v metabolická (pantothenové
16. Způsob podle libovolného z nároků 6 až 15 vyznačující se tím , že se použijí mikroorganismy, ve kterých je dodatečně zesílena • · · «
-4 3-’ exprese jednoho nebo více zbývajících genů metabolické dráhy syntézy kyseliny pantothenové.
17. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím , že se v metabolické dráze biosyntézy kyseliny pantothenové inhibuje gen ilvA.
Způsob podle jednoho nebo více z nároků vyznačuj íci mikroorganismy rodu kyvadlový vektor pECM3ilvBNCD.
se tím , že Corynebacterium
6 až 17 se použijí obsahuj ící
Způsob podle jednoho nebo více z nároků vyznačuj ící mikroorganismy rodu kyvadlový vektor pEKEx2panBC.
se tím , že Corynebacterium
6 až 17 se použijí obsahuj ící
20. Způsob výroby pantothenové kyseliny fermentací mikroorganismů rodu Corynebacterium jednoho nebo více z nároků 1 až 19 vyznačující se tím , že se
a) zesílí (zvýší se jeho exprese) alespoň jeden z genů panB nebo panC, výhodně panBC, popřípadě v kombinaci s genem ilvD
b) zvýší koncentrace kyselin pantothenové v médiu nebo v buňkách mikroorganismu a
c) izoluje kyselina pantothenové
21. Způsob podle nároku 19 a 20 vyznačující se tím , že se v průběhu fermentace přidá prekurzor kyseliny pantothenové, vybraný ze skupiny obsahující
-»4 4:» · v «
aspartát, β-alanin, keto-isovalerát, keto-pantoát a pantoát.
CZ19994282A 1999-11-30 1999-11-30 Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií CZ428299A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19994282A CZ428299A3 (cs) 1999-11-30 1999-11-30 Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19994282A CZ428299A3 (cs) 1999-11-30 1999-11-30 Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ428299A3 true CZ428299A3 (cs) 2000-06-14

Family

ID=5467904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19994282A CZ428299A3 (cs) 1999-11-30 1999-11-30 Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ428299A3 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6177264B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using Coryneform bacteria
US7632663B1 (en) Method for microbially producing L-valine
US6184007B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid by enhancement of the panD gene in microorganisms
KR100758831B1 (ko) Ｌ-라이신 생산 코리네박테리아 및 ｌ-라이신의 제조방법
KR100782867B1 (ko) Ｌ-리신을 생산하는 코리네박테리아 및 리신을 제조하는방법
KR20000028952A (ko) 케토판토에이트 리덕타제를 암호화하는 뉴클레오타이드서열의 증폭에 의한 판토텐산의 제조방법
US20100151449A1 (en) Method for poduction of l-amino acids by fermentation
US6861246B2 (en) L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of lysine
US6184006B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using strains of the family enterobacteriaceae
EP1320586B1 (en) Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria
US20020150999A1 (en) Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
KR20010049429A (ko) 발효에 의한 Ｌ-아미노산의 제조 방법 및 ａｃｃＤＡ유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열
CZ428299A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií
US20020042104A1 (en) Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
CZ428199A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech
DE10030702A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
CZ427799A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající kmenů bakterií z čeledi Enterobacteriacae
MXPA99010768A (en) Procedure for the preparation by fermentation of d-pantothenic acid using corinefor bacteria
WO2002024936A1 (en) Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic