CZ427799A3 - Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající kmenů bakterií z čeledi Enterobacteriacae - Google Patents

Abstract

Popisuje se způsob výroby kyseliny D-pantothenové fermentací mikroorganismu z čeledi Enterobacteriacae produkujících kyselinu D-pantothenovou za použití takových kmenů, které a) obsahují plazmid pVF31 a/nebo plazmid pFV202 a b) mají zesílen alespoň gen panD a popřípadě další nukleotidové sekvence kódující aspartát-l-dekarboxylázu, ato zejména zvýšenímjejich exprese, přičemž se c) kyselina Dpantothenová hromadí v kultivačnímmédiu nebo buňkách a d) izoluje se vytvořená kyselina D-piantothenová

Description

Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající kmenů bakterií z čeledi Enterobacteriaceae

Oblast techniky

Kyselina pantothenová představuje komerčně významný vitamín, který nalézá uplatnění v kosmetice, lékařství a ve výživě lidí i zvířat.

Kyselina pantothenová může být vyrobena pomocí chemické syntézy nebo biotechnologicky pomocí fermentace vhodného mikroorganizmu ve vhodném živném roztoku. Při chemické syntéze je důležitým meziproduktem DL-pantolakton. DL-pantolakton se vyrábí vícestupňovou syntézou z formaldehydu, isobutylaldehydu a kyanidu. V dalších krocích syntézy se pak dělí vzniklá racemická směs a kondenzací D-pantolaktonu s β-alaninem se získá kyselina D-pantothenová.

Výhodou fermentativního způsobu výroby za pomoci mikroorganizmů je, že vzniká požadovaný stereoizomer a to D-forma kyseliny pantothenové, která je zcela prostá L-formy.

Dosavadní stav techniky

Různé druhy bakterií, jako jsou například Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes nebo také kvasinek, jako jsou například Debaromyces castellii, mohou v živném roztoku obsahujícím glukózu, DL-pantoinovou kyselinu a β-alanin, produkovat kyselinu D-pantothenovou, jak je to popsáno • ·

-2v EP-A O 493 060. Ve spise EP-A O 493 060 se dále uvádí, že u bakterií Escherichia coli lze biosyntézu kyseliny pantothenové, v plazmidech pFV3 a pFV5, zvýšit v kultivačním médiu obsahujícím glukózu, kyselinu a β-alanin.

zesílením které se tvorbu genu pro nacházej í této kyseliny

DL-pantoinovou

EP-A 0 590 857 a patent USA č. :5,518, 906 popisují mutantní kmeny bakterií odvozené od Escherichia coli IFO03547, označené jako FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221,

FV6051 a FV5069, které nesou rezistenci k různým antimetabolitům, jako například ke kyselině salicylové, α-ketomáselné kyselině, β-hydroxyasparagové kyselině, 0-methylthreoninu a α-ketoisovalerové kyselině, roztoku obsahujícím glukózu a β-alanin D-pantothenovou kyselinu. V dokumentu EPA-0 a v živném produkuj í 590 857 a v patentu USA 5,518,906 se dále uvádí, že zesílením genů pro biosyntézu kyseliny pantothenové, které se nacházejí v plazmidu pFV31, lze ve výše uvedených kmenech E.coli zvýšit produkci D-pantoinové kyseliny v kultivačním médiu obsahujícím glukózu a produkci D-pantothenové kyseliny v kultivačním médiu obsahujícím glukózu a β-alanin.

Dokument WO 97/10340 mimo to popisuje, že ve kmenech bakterií Escherichia coli, které vytvářejí kyselinu pantothenovou, lze dále zvýšit produkci kyseliny pantothenové zvýšením aktivity syntázy hydroxyoctové kyseliny II - enzymu, který se podílí na biosyntéze valinu. Tento enzym je kódován genem ilvGM uloženým na plazmidu pFV202. Ke zvýšení produkce dochází v médiu obsahujícím glukózu a β-alanin.

• ·

-3V uvedených dokumentech se nepopisují kmeny, které by produkovaly kyselinu pantothenovou v živném médiu obsahujícím jako substrát toliko glukózu nebo sacharózu.

Podstata vynálezu

Vynález se snaží popsat nové vylepšené kmeny bakterií produkujících kyselinu D-pantothenovou a zejména ty, které patří do čeledi Enterobacteriaceae.

Vitamín kyselina pantothenová představuje komerčně významný produkt s využitím v kosmetice, lékařství a v lidské i zvířecí výživě. Z toho vyplývá všeobecný zájem o vylepšený způsob výroby pantothenové kyseliny.

V následujícím textu se výrazy D-pantothenová kyselina nebo pantothenová kyselina nebo pantothenát rozumí nejen volná kyselina, ale také její soli, jako například vápenatá, sodná, amonná nebo draselná sůl.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantothenové za použití mikroorganismů z čeledi Enterobacteriaceae, zejména pak rodu Escherichia, které

a) obsahují plazmid pFV31 a/nebo pFV202, (ve výhodném provedení plazmid pFV31), a ve kterých je

b) zesílen gen, ve výhodném provedení zvýšena exprese genu panD a popřípadě dalších nukleotidových sekvencí kódujících aspartát-l-dekarboxylázu (E.C. 4.1.1.11) .

• ·

-4Ve výhodném provedení se použijí mikroorganismy obsahující DNA, jejíž nukleotidová sekvence kóduje protein panD pocházející z E.coli, a výhodně z koryneformních bakterií.

Ve výhodném provedení se jedná o replikovatelnou DNA která:

(i) odpovídá nukleotidové sekvenci podle

Sekvence.id.č.:1, kódující gen panD nebo (i) odpovídá sekvenci (i) díky degeneraci genetického kódu (ii) hybridizuje se sekvencí komplementární k sekvencím podle bodů (i) nebo (ii) a případně (iii) obsahuje funkčně neutrální mutace v sekvenci podle bodu(i).

Ve výhodném provedení se fermentace provádí v živném roztoku, který obsahuje jako substrát pouze glukózu nebo sacharózu a neobsahuje β-alanin a pantoinovou kyselinu.

Vynález tak popisuje zlepšení výroby kyseliny pantothenové. Pro zvýšení tvorby kyseliny pantothenové lze kultivační médium ještě obohatit například o aspartát, β-alanin; ketoisovalerát, ketopantoinovou kyselinu, pantoinovou kyselinu a/nebo o jejich soli.

Výrazem zesílení se v tomto případě rozumí zvýšení intracelulární aktivity jednoho nebo několika enzymů, které jsou v mikroorganizmu kódovány příslušnými DNA, například tím, že se zvýší počet kopií genu (genů) na buňku, použije se silný promotor, nebo se použije gen kódující enzym se zvýšenou aktivitou, popřípadě kombinace těchto účinků.

• » • ·

-5Předmětem vynálezu jsou dále mikroorganismy, které jsou schopné vytvářet kyselinu pantothenovou z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy nebo z glycerinu a ethanolu. Ve výhodném provedení z glukózy nebo sacharózy. Jde zejména o Gram-negativní bakterie, například z čeledi Enterobacteriaceae. Z nich je třeba jmenovat zejména bakterie rodu Escherichia, druh Escherichia coli. Z bakterií tohoto druhu, které mají schopnost produkovat pantothenovou kyselinu, je dále třeba zmínit bakterie Escherichia coli kmene K-12, mezi které patří například kmeny MG1655 nebo W3110 (Neidhard a další, Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D.C.) či E. coli přirozeně se vyskytujícího kmene IF03547 (Ústav pro fermentaci, Osaka, Japonsko) a od něj odvozené mutanty. Dále je třeba uvést kmeny 3547/pFV31, 5714/pFV31, 525/pFV31, 814/pFV31, 521/pFV31, FV221/PFV31, FV6051/PFV31, FV5069/PFV31, FV5069/PFV202 a déle takové, které byly z uvedených kmenů odvozeny pomocí konvenční mutageneze, selekce, například na rezistenci k antimetabolitům, jako k azidothymidinu nebo thiaisoleucinu, dále pomocí a skríningu. Zvláště výhodné jsou kmeny FV5069/pFV31 a FV5069/pFV202, které byly uloženy pod čísly FERM BP4395 a FERM BP 5227 podle pravidel Budapešťské smlouvy (viz dokumenty EP-A-0590857 a WO 97/10340).

Zvýšení aktivity příslušného enzymu, respektive jeho zvýšené exprese, lze docílit například zvýšením počtu kopií příslušného genu na buňku nebo mutací v oblasti promotoru a/nebo v regulační oblasti proti směru transkripce od strukturního genu. Stejným způsobem mohou účinkovat expresní kazety zabudované proti směru transkripce od strukturního genu. Pomocí indukovatelných promotorů lze dále regulovat • · • · • ·· ··· · · ·· ·· · • · · · · · · ··»· ·· ·· · · ···· · · · ·

-6expresi v průběhu fermentativní produkce D-pantothenátu. Expresi lze dále zlepšit prodloužením životnosti m-RNA v buňce nebo inhibici rozkladu enzymatických proteinů. Geny nebo rekombinantní genové konstrukty podle vynálezu se přitom nacházejí na plazmidovém vektoru s různým počtem kopií na buňku nebo jsou integrovány v chromozómu a amplifikovány. Alternativně může být exprese příslušného genu dále zvýšena změnou složení média a způsobu kultivace.

Návody k tomu mohou odborníci nalézt mimo jiné v publikacích Chang a Cohen (Journal of Bacteriology 134: strana 1141 až 1156 (1978)), Hartley a Gregori (Gene 13: strana 347 až 353 (1981)), Amann a Brosius (Gene 40:strana 183 až 190 (1985)), de Broer a další (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: strana 21 až 25 (1983)), LaVallie a další (BIO/TECHNOLOGY 11, strana 187 až 193, (1993)), a dále v PCT/US97/13359, v publikacích Llosa a další (Plasmid 26: strana 222 až 224 (1991)), Quandt a Klipp (Gene 80: strana 161 až 169 (1989)), Hamilton (Journal of Bacteriology 171: strana 4617 až 4622 (1989), Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, strana 191 až 195 (1998) a ve známých učebnicích genetiky a molekulární biologie.

Gen panD z bakterie E. coli je znám. Jeho nukleotidová sekvence byla publikována Merkelsem a Nicholsem (FEMS Microbiology Letters 143, strana 247 až 252 (1996)). K jeho izolaci respektive syntéze může být použita polymerázová řetězová reakce (PCR) v některém všeobecně známém provedení, nebo některý z dále uvedených způsobů.

Před vlastní izolací genu panD z bakterie C. glutamicum je nejprve nutno vytvořit DNA knihovnu tohoto mikrorganismu v bakteriích E. coli. Způsob vytvoření • *

-7takovéto DNA knihovny je popsán ve všeobecně známých učebnicích a příručkách jako je například učebnice Winnacker: Gene und Klone: Eine Einfilhrung in die Gentechnologie (Geny a Klony: Úvod do genového inženýrství, nakladatelství Chemie, Weinheim, SRN, 1990) či příručka Sambrook a další: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Laboratorní manuál molekulárního klonování, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Jednou takovou známou knihovnou je knihovna E. coli K-12 kmene W3110 v λ-vektorech vytvořená a popsaná Koharou a dalšími (viz Cell 50, strana 495 až 508 (1987)). Bathe a další popisují (viz Molecular and General Genetics, 252: strana 255 až 265, 1996) DNA knihovnu bakterie C. glutamicum ATCC13032, vytvořenou pomocí kosmidu SuperCos I (Wahl a další 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: strana 2160 až 2164) v bakteriích E.coli K-12 kmene NM554 (viz Raleigh a další 1988, Nucleic Acids Research 16: strana 1563 až 1575). K přípravě DNA knihovny bakterie C. glutamicum v E. coli mohou být použity také plazmidy jako například pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, strana 807 až 818 (1979)) nebo pUC19 (Norrander a další 1983, Gene 26: strana 101 až 106) . Jako hostitelské jsou vhodné zvláště takové kmeny E. coli, které jsou restrikčně a rekombinačně deficientní. Příkladem takového kmene jsou buňky kmene DH5aMCR, popsané Grantem a dalšími v Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990), strana 4645 až 4649.

Tato DNA knihovna se poté přenese do indikátorového kmene ať již pomocí transformace (viz Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, strana 557 až 580, 1983) nebo elektroporace (Tauch a další, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347). Vhodný indikátorový kmen se vyznačuje tím, že obsahuje mutaci ve studovaném genu a to

-8takovou, která vyvolává viditelnou změnu fenotypu, například závislost na přídavku metabolitu do kultivačního média (auxotrofii). Pro tento vynález mají velký význam bakterie

E. coli DV9 (viz Vallari a Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164: strana 136 až 142), které mají mutaci v genu panD. Po transformaci indikátorového kmene, například panDmutantních buněk DV9, rekombinantním plazmidem, který obsahuje hledaný gen, například gen panB, a po expresi příslušného genu, dojde ke změně fenotypu indikátorového kmene, například tento kmen ztratí závislost na přídavku pantothenové kyseliny v kultivačním médiu.

Takto isolovaný gen či DNA fragment může být dále popsán a charakterizován určením jeho sekvence, tak jak je to popsáno například Sangerem a dalšími (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America, 74: strana 5463 až 5467, 1977).

Tímto způsobem byla získána i nová DNA sekvence kódující protein panD z bakterie C. glutamicum. Tato sekvence podle vynálezu je uvedena jako Sekvence id.č.:l. Dále byla z uvedené DNA sekvence výše popsanými metodami odvozena aminokyselinová sekvence příslušného enzymu. Sekvence id.č.: 2 podle vynálezu udává pořadí aminokyselin v produktu genu panD, jmenovitě v L-aspartát 1-dekarboxyláze.

Kódující sekvence DNA, které v důsledku degenerace genetického kódu odpovídají Sekvenci id.č.:l jsou rovněž součástí vynálezu. Rovněž jsou součástí vynálezu sekvence DNA, které se Sekvencí id.č.:l hybridizují. Odborníkům jsou dále známy konzervativní záměny aminokyselin jako je například záměna glycinu za alanin nebo záměna kyseliny asparagové za kyselinu glutamovou. Tyto záměny aminokyselin • · • · • · · · • · · · · ·

-9se nazývají sense mutations a vzhledem k tomu, že nevedou k zásadní změně aktivity proteinu nazývají se rovněž funkčně neutrální. Dále je známo, že změny v N- a/nebo C-konci proteinu nemívají zásadní negativní vliv na funkci proteinu, ba v některých případech může dojít i k její stabilizaci. Odborník může najít údaje, které to potvrzují mimo jiné v práci Ben-Bassata a dalších v časopise Journal of Bacteriology 169: strana 751 až 757 (1987), O’Regana a dalších v časopise Gene 77: strana 237 až 251 (1989), SahinTotha a dalších v časopise Protein Sciences 3: strana 240 až 247 (1994), Hochuliho a dalších v Bio/Technology 6: strana 1321 až 1325 (1988) a ve známých učebnicích genetiky a molekulární biologie.

Takovým způsobem isolovaný a charakterizovaný gen může být následně samostatně nebo v kombinaci s dalšími geny exprimován ve vhodném kmeni E.coli. Jeden způsob exprese, respektive zvýšené exprese (over-expression) genů spočívá v tom, že se gen amplifikuje pomocí plazmidového vektoru, který navíc obsahuje regulační sekvence fungující jako signály pro expresi. Při výběru vhodného plazmidu přicházejí do úvahy takové, které jsou schopny se v příslušném mikroorganismu replikovat.

Pro bakterie E. coli přicházejí v úvahu například vektory pSCIOl (viz Vocke a Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21), strana 6557 až 6561 (1983)) nebo pKK223-3 (Brosius a Holý, Proceedings of the National Academy of Scienees USA 81, 6929 (1984)) či kyvadlový vektor pZ8-l pro bakterie Corynebacterium glutamicum a Escherichia coli (Evropský patentový spis 0 375 889) . Příklady takových bakteriálních kmenů podle vynálezu jsou bakterie E.coli FV5069/pFV31/pND-Dl a FV5069/pFV31 pNDD2, které obsahují plazmidy pND-Dl a pND-D2. Plazmid pND-Dl

-10je kyvadlový vektor pro expresi v E. coli a C. glutamicum založený na plazmidu pZ8-l a obsahující gen panD z bakterie E. coli. Plazmid pND-D2 je rovněž kyvadlový vektor pro expresi v E. coli a C. glutamicum založený na plazmidu pZ8-l a obsahující gen panD z bakterie C.glutamicum.

Odborníkům je zřejmé, že je výhodně možno zkombinovat způsoby podle vynálezu s chromozomálními mutacemi, které způsobují rezistenci k metabolitům a antimetabolitům, popřípadě brání vylučování meziproduktů syntézy pantothenové kyseliny.

Mikroorganismy zkonstruované podle vynálezu mohou být za účelem produkce kyseliny D-pantothenové kultivovány kontinuálním způsobem, nebo způsoby diskontinuálními, ať již vsádkovou kultivací nebo přítokovou kultivací. Přehled známých způsobů kultivace je uveden v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfůhrung in die Bioverfahrenstechnik (Úvod do biotechnik, nakladatelství Gustav Fischer, Stuttgart, 1991) nebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periferní zařízení, nakladatelství Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).

Použité kultivační médium musí patřičným způsobem vyhovovat nárokům příslušného mikroorganismu. Popisy různých známých kultivačních médií pro mikroorganismy jsou uvedeny příručce Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pro obecnou bakteriologii) vydaný Americkou bakteriologickou společností (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roce 1981. Jako zdroje uhlíku mohou být použity cukry a uhlohydráty jako například glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky jako například sójový olej, slunečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk;

» 4 ·4 4 4 · 4 4 44 ·· 4

4444 444 4···

44 44 4444 · · · ·

-11mastné kyseliny jako například kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy jak například glycerin a ethanol a organické kyseliny jako například kyselina octová. Tyto látky mohou být použity buď jednotlivě nebo ve směsi. Jako zdroje dusíku mohou být použity sloučeniny obsahující organický dusík jako například pepton, kvasničný extrakt, extrakt z masa, extrakt ze sladu, kukuřičný extrakt, sójová mouka a močovina nebo anorganické sloučeniny jako například síran amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný, uhličitan amonný a dusičnan amonný. Tyto zdroje dusíku mohou být použity buď jednotlivě nebo ve směsi. Jako zdroje fosforu lze použít hydrogenfosforečnan nebo dihydrogenfosforečnan draselný či odpovídající sodné soli. Kultivační médium musí dále obsahovat soli kovů které jsou nezbytné pro růst, jako například síran hořečnatý nebo síran železnatý. A konečně může být kultivační médium kromě výše uvedených látek obohaceno o esenciální růstové látky jako například aminokyseliny a vitamíny. Pro zvýšení tvorby kyseliny pantothenové lze kultivační médium ještě obohatit o její prekurzory jako jsou například aspartát, β-alanin; ketoisovalerát, ketopantoovou nebo pantoovou kyselinu a popřípadě jejich soli. Uvedené složky mohou být přidány do média jednorázově na počátku, nebo vhodným způsobem v průběhu kultivace.

Pro kontrolu pH v průběhu kultivace jsou vhodné zásadité sloučeniny jako například hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak nebo kyselé sloučeniny jako například kyselina fosforečná nebo kyselina sírová. Pěnění kultivační směsi lze kontrolovat přídavkem činidel potlačujících tvorbu pěny jako jsou například polyglykolestery mastných kyselin. Stabilitu plazmidů lze udržet prostřednictvím vhodného selekčního činidla například antibiotika. Vhodné aerobní • ·

-12podmínky lze udržovat přiváděním kyslíku nebo kyslíkobsahující směsi plynů, například vzduchu, do kultivačního média. Vhodná teplota pro pěstování bakterií se normálně pohybuje od 25°C do 45°C a výhodně od 30°C do 37°C. Doba kultivace by měla být taková, aby bylo dosaženo maxima tvorby pantothenové kyseliny. Tohoto maxima je obvykle dosaženo během 10 až 160 hodin.

Odborníkům je zřejmé, že kmeny, vykazující vysokou aktivitu enzymu L-aspartát 1-dekarboxylázy, mohou být rovněž použity pro výrobu β-alaninu z L-aspartátu. K tomu mohou být použity fermentativní způsoby, nebo přímá enzymatická přeměna nebo kombinace obou způsobů.

Koncentraci produkované pantothenové kyseliny lze stanovit známými způsoby (viz Velisek; Chromatographic Science 60, strana 515 až 560 (1992).

Následující mikroorganismus byl uložen v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur (DSMZ, Braunschweig, SRN) podle ustanovení Budapešťské smlouvy:

Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2 jako DSM12438.

Popis obrázků

Obrázek 1: na obrázku je schematicky znázorněna mapa kontigu 13 s otevřenými čtecími rámci orfl až orf5.

Obrázek 2: schematická mapa plazmidu pZ8-l a strategie použitá pro klonování plazmidů pND-Dl a pND-D2.

Na obrázcích použité zkratky a symboly mají následující významy:

·« 99

9 · · • ’ · » • · ··

-13·«<· t 9 · · ·« ··

T1T2 - terminátor transkripce genu rrnB

Ptač - promotor tac panD - kódujici oblast genu panD rep-C.g. - oblast nezbytná pro replikaci v bakteriích C glutamicum oriV-E.c. - oblast nezbytná pro replikaci v bakteriích E coli kan - gen pro rezistenci ke kanamycinu

EcoRI - cílové místo restrikčního enzymu EcoRI

E - cílové místo restrikčního enzymu EcoRI

BamHI - cílové místo restrikčního enzymu BamHI

B - cílové místo restrikčního enzymu BamHI

BglII - cílové místo restrikčního enzymu BglII

Clal - cílové místo restrikčního enzymu Clal

H - cílové místo restrikčního enzymu HindlII mcs - klonovací polylinker (multiple cloning sítě)

P - cílové místo restrikčního enzymu Pstl

Pstl	- cílové	místo	restrikčního	enzymu	Pstl
Sáli	- cílové	místo	restrikčního	enzymu	Sáli
Seal	- cílové	místo	restrikčního	enzymu	Seal
Sphl	- cílové	místo	restrikčního	enzymu	Sphl

X - cílové místo restrikčního enzymu Xbal Xhol - cílové místo restrikčního enzymu Xhol

Příklady provedení vynálezu

Vynález bude blíže popsán v následujících příkladech l 9

9 • ·

-149 9 9 9 9 9 ···· ·· ·· ···· ·· ··

Příklad 1: Klonování a sekvenování genu panD z bakterie C. glutamicum

1. Klonování genu panD

Chromozomální DNA z bakterie C. glutamicum ATCC13032 byla izolována způsobem podle Taucha a dalších, 1995, Plazmid, 33: strana 168 až 179, a částečně naštepena restrikční endonukleázou Sau3A (Pharmacia Bio-Tech, Freiburg, Německo), katalogové číslo 27-0913-02). DNA-fragmenty o velikostech 7 až 9 kb byly izolovány pomocí soupravy Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids (Macherey a Nagel, Duřen, Německo; kat. čís. 740584) a naligovány do defosforylovaného cílového místa BamHI vektoru pUC19 (Narrander a další 1982, Gene, 26: strana 101 až 106), dodaného firmou MBI Fermentas (Vilnius, Litva).

Ligace byla provedena v podstatě tak, jak je to popsáno v příručce Sambrook a další. (1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor), přičemž byla směs DNA s T4-ligázou (Pharmacia Bio-Tech, Freiburg, Německo) inkubována přes noc. Touto ligační směsí byly poté elektroporovány (viz Tauch, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347) bakterie E. coli kmene DH5otmcr (viz Grant a další, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87 (1990) strana 4645 až 4649) a poté byly vysety na LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s přídavkem 100 pg/ml ampicilinu. Po 24 hodinové inkubaci při 37°C a opětovné izolaci plazmidové DNA metodou alkalické lýzy (viz Birnboim a Doly (Nucleic Acids Research, 7: strana 1513 až 1523, 1997) byla získána genomová knihovna bakterie C. glutamicum. Touto knihovnou byly elektroporovány kompetentní buňky E. coli kmene DV9 (Vallari a Rock, 1985, • · • · · * · I • * ·

-15Journal of Bacteriology, 164: strana 136 až 142), které nesou mutaci v genu panD. Elektroporační směs byla nejprve ponechána regenerovat (Tauch a další, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347) a poté dvakrát promyta médiem E (Vogel a Bonner, 1956, Journal of Biological Chemistry, 218: strana 97 až 106). Složení média E udává tabulka 1. Těmito buňkami bylo poté inokulováno 50 ml média E s přídavkem 100 pg/ml ampicilinu ve 250 ml Erlenmeyerových baňkách a tyto baňky byly inkubovány ve třepačce při 250 otáčkách/min a teplotě 39°C. Po dvoudenní inkubaci byla bakteriální suspenze naředěna a přeočkována na LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190), s přídavkem 100 pg/ml ampicilinu.

Tabulka 1: složení média E

Sloučenina	Množství na 11	Poznámka
K2HPO4	10 g
NaNH4HPO4*4H2O	3, 5 g
Kyselina citrónová	2 g
MgSO4*7H2O	0,2 g
Glukóza	4 g	Sterilizována separátně
Thiamin	0,2 pg	Sterilně filtrován

Poté byla vyizolována plazmidová DNA z jedné kolonie transformovaných DV9 buněk. Velikost tohoto plazmidu, označeného jako pNIC-1.3, byla stanovena porovnáním se

I

-16·· < » · · ···· · · ·· standardy v elektroforéze na agarózovém gelu (Sambrook a další, Molecular cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Plazmid pNIC-1.3 obsahuje inzert o velikosti 7 komplementovat mutaci potvrzena opětovnou kbp. Schopnost plazmidu pNIC-1.3 v panD genu v buňkách DV9 byla transformací. Takto transformanti byli opět schopni růst v médiu neobsahuje β-alanin za výše uvedených podmínek.

získání E, které

Tento 7 kb inzert byl dále subklonován naštěpením plazmidu pNIC-1.3 restrikčními enzymy BamHI (Pharmacia BioTech (Freiburg, Německo, kat.č. 27-0868-03), EcoRI (Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, Německo, kat.č. 27-0884-03) a BglII (Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, Německo, kat.č. 270946-02) a poté byl zaligován do vektoru pKl8mob naštěpeného odpovídajícími enzymy (Scháfer, 1994, Gene, 145: strana 69 až 73). Získanou ligační směsí byly elektroporovány buňky E. coli DV9 (s mutací v genu panD) a byla provedena selekce na transformanty s komplementujícím fenotypem za výše uvedených podmínek, přičemž plotny s agarózou v tomto případě obsahovaly 50 pg/ml kanamycinu. Byly izolovány plazmidy z jednotlivých kolonií s komplementujícím fenotypem a ty byly charakterizovány pomocí restrikční analýzy. Jeden EcoRI-subklon, dále označovaný jako pNIC-10, který obsahoval asi 3 kb velký DNA-inzert byl vybrán pro další sekvenční analýzu.

2.Sekvenování genu panD

Během dvouvláknového sekvenování 3 kb fragmentu z plazmidu pNIC-10 byl tento plazmid nejprve naštěpen různými restrikčními enzymy a vzniklé fragmenty byly překlonovány do

-17plazmidů pUC19 nebo pK18mob. Plazmidová DNA použitá k sekvenování byla izolována podle instrukcí výrobce křtem QIAGEN Plasmid Mini kit (Qiagen, lne., Chatsworth, CA, USA) a její velikost byla určena pomocí elektroforézy na agarózovém gelu.

Vlastní sekvenování bylo provedeno pomocí Sangerovy metody terminace DNA řetězce dideoxynukleotidy, viz Sanger a další, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: strana 5463 až 5467, s modifikacemi podle Zimmermanna (Nucleic Acids Research, 18: strana 1067, 1990). Byl k tomu použit Cy5-AutoRead Sequencing kit Pharmacia (kat. čís. 27-2690-02, Freiburg, SRN) . Elektroforetická analýza sekvenační směsi byla provedena v polyakrylamidovém gelu Long Ranger Gel Solution od firmy EMC BioProducts (Rockland, Me., USA) na automatickém sekvenátoru využívajícím laserem excitované fluorescence (A.L.F.) od firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech (Uppsala, Švédsko). Získaná hrubá nukleotidová sekvence byla poté analyzována programovým balíkem Staden (Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231, 1986, verze 97-0). Jednotlivé sekvence subklonů plazmidu pNIC-10 byly sestaveny do souvislého 3060 bp dlouhého kontigu, který byl poté označen jako kontig 13. Počítačová analýza celého DNA fragmentu programem XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231) pomohla identifikovat pět otevřených čtecích rámců (ORF). Na obrázku 1 je znázorněna restrikční mapa kontigu 13 jakož i poloha jednotlivých čtecích rámců orf-1 až orf-5. Pomocí programu BLAST (viz Gish and States, 1993, Nátuře of Genetics, 3: strana 266 až 272; Altschul a další, 1990, Journal of Molecular Biology, 215: strana 403 až 410) byla studována homologie těchto čtecích rámců, tak jak to umožňuje on-line služba na serveru

-18NCBI (Národní centrum pro biotechnologické informace) Národní lékařské knihovny (National Library of Medicine, Bethesda, MD, USA) . Z analýzy kontigu 13 vyplývá, že orf-3 odpovídá genu panD. V dalším textu se tedy orf-3 označuje jako panD. Nukleotidová sekvence DNA fragmentu nesoucího gen panD je uvedena jako Sekvence id.č.zl. Aminokyselinová sekvence produktu genu panD, neboli rovněž L-aspartát 1dekarboxylázy je uvedena jako Sekvence id.č.:2.

Příklad 2: Konstrukce vektorů vhodných pro expresi genů panD

Geny panD pro biosyntézu pantothenátu z bakterií C. glutamicum a E. coli byly amplifikovány pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a syntetických oligonukleotidových primerů. Tyto PCR reakce byly prováděny s Taq DNA polymerázou od firmy Gibco-BRL (Eggestein, SRN) v termálním cykleru PCT-100 (MJ Research lne., Watertown, Mass., USA). Po počáteční 2 minutové denaturaci při 94 °C následovalo 35 cyklů sestávajících z 90 sekundové denaturace při 94°C, 90 sekundového annealingu při teplotě odvozené od sekvence primerů a vzorce T_a= [ (2AT+4GC)-5 ] °C (viz Suggs, a další 1981, strana 683 až 593, v knize: D. D. Brown, a C. F. Fox (editoři) , Developmental biology using purified genes, Academie Press, New York, USA) a konečně z 90 sekundové polymerace při 72°C. Po 35 cyklech byla reakce zakončena 10 minutovou polymeraci při 72°C. Takto amplifikované produkty byly poté elektroforeticky otestovány na agarózovém gelu a přímo ligovány podle instrukcí výrobce do vektoru pCR®2.1 (TA Cloning Kit, Invitrogene, Leek, Nizozemí, kat. č.. KNM2030-01). Ligační směs byla použita k transformaci bakterií E. coli kmene TOPIOF'. Selekce transformantů byla • ·

-19·« «· ·· ···· · · provedena 24 hodinovou inkubací při teplotě 37 °C na plotnách s LB-agarózou s přídavkem 100 pg/ml ampicilinu a 40 pg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-h-D-galaktosid).

Na základě nukleotidové sekvence genů pro biosyntézu pantothenátu panD z bakterií C. glutamicum ATCC 13032 (viz obrázek 2) a z bakterií E. coli K12 (W. K. Merkel and B.P. Nichols, 1993, GenBank: L17086) byly nasyntetizovány PCR primery (MWG Bio-Tech, Eberberg, SRN) . Tyto primery byly vybrány tak, aby amplifikované fragmenty obsahovaly vlastní geny, jakož i původní vazebná místa pro ribozómy (rbs), avšak nikoliv možné promotorové oblasti. Dodatečně bylo vloženo rovněž vhodné restrikční místo, které usnadnilo klonování do cílového vektoru. Sekvence těchto PCR-primerů včetně vložených cílových míst (podtržené sekvence) jakož i popis jimi amplifikováných genů (velikost fragmentů v bp je uvedena v závorkách) udává následující tabulka.

Tabulka 2: primery použité k amplifikaci genů panD, panBC

Primer	Sekvence s restrikčními místy	Produkt	Plazmid
panD-Ecl	5 ' -GAATTCGACAGGGTAGAAAGGTAGA-3 ' EcoRI	panDE.c. (462bp)	pND-Dl
panD-Ec2	5 ' -AGATCTGGGATAACAATCAAGCAACC-3 ' Bgl11
panD-Cgl	5'-CATCTCACGCTATGAATTCT-3' EcoRI	panDc.g. (405bp)	pND-D2
panD-Cg2	5'-ACGAGGCCTGCAGCAATA-3' Pstl

Jako základní vektor pro expresi jak v bakteriích C. glutamicum tak i v E. coli byl použit kyvadlový expresní vektor pZ8-l pro E. coli-C. glutamicum (viz Evropský patentový spis 0 375 889, vektor je znázorněn na obrázku 2).

• · * · · ·

-20PCR produkty naklonováné v předchozím kroku do vektoru pCR®2.1 byly pomocí restrikčních míst obsažených v primerech naligovány do stejných míst expresního vektoru pZ8-l a tím vloženy pod kontrolu tac-promotoru, který je obsažen na tomto plazmidů. Jedinou výjimkou byl PCR produkt genu panD_E._c. (EcoRI-BglII-fragment) , který byl vložen do kompatibilních restrikčních míst EcoRI-BamHI vektoru pZ8-l. Označení příslušných nově zkonstruovaných expresních plazmidů jsou uvedena v tabulce 2.

Expresní vektor pZ8-l s genem panDE_E._c. z bakterie E. coli byl označen jako pND-Dl a pZ8-l s genem panD_c._g. z bakterie C. glutamicum byl označen jako pND-D2.

Na obrázku 2 je znázorněna strategie klonování genů panD_E._c a panD_c._g. do vektoru pZ8-l. Správný výsledek klonování všech genů do expresních plazmidů byl ověřen sekvenováním příslušných inzertů.

Expresními vektory pND-Dl a pND-D2 byly transformovány bakterie E. coli kmene FV5069/pVF31 a vzniklí transformanti byli selektováni na LB-agaru (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s přídavkem 50 pg/ml kanamycinu. Takto získané kmeny byly pojmenovány FV5069/pFV31/pND-Dl a FV5069/pFV31/pND-D2.

Příklad 3: Produkce pantothenátu v různých klonech bakterií odvozených z E. coli kmene

FV5069/pFV31

Kvantitativní stanovení D-pantothenátu bylo provedeno pomocí bakterií Lactobacillus plantarum (zkušební kmen:

• ·

-21Lactobacillus plantarum ATCC 8014, kat.č.: No.3211-30-3; zkušební kultivační médium: Bacto Pantothenat Assay Medium (DIFCO Laboratories, Michigan, USA), kat.č.: 0604-15-3).

Tento indikátorový kmen může růst jen v přítomnosti pantothenátu v uvedeném kultivačním médiu. Růst bakterií lze určit z fotometrického měření a z lineární závislosti růstu na koncentraci pantothenátu v médiu. Pro kalibraci byla použita vápenatá sůl pantothenátu (hemicalcium salt, Sigma, kat.č.:P-2250). Optická hustota byla měřena na spektrofotometru LKB Biochrom od firmy Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, SRN) při vlnové délce 580 nm (dále O.D.₅₈o) ·

V tomto testu byla stanovena produkce pantothenátu klonů E. coli FV5069/pFV31, FV5069/pFV31/pND-Dl a FV5069/pFV31/pND-D2 v médiu s glukózou nebo sacharózou jakožto hlavním substrátem. Jako zkušební kultivační médium bylo použito médium E s přídavkem buď 4 g/1 glokózy nebo 4 g/1 sacharózy a v případě klonů FV5069/pFV31/pND-Dl a FV5069/pFV31/pND-D2 ještě s přídavkem 50 pg/ml kanamycinu. 16 hodin staré kultury byly přeočkovány do 50 ml stejného zkušebního média v 500 ml Erlenmayerových baňkách tak, aby O.D.580 =0,1. Po 72 hodinové kultivaci při 37°C a třepání při 250 otáčkách v minutě byly bakterie zpeletovány 10 minutovou centrifugací při 5000 x g. Získaný bezbuněčný supernatant byl sterilně přefiltrován a poté uskladněn při teplotě 4°C až do doby vlastního stanovení pantothenátu.

Stanovení D-pantothenátu v supernatantu kultivačního média bylo provedeno pomocí bakterií L. plantarum kmene ATCC 8014 podle instrukcí firmy DIFCO (manuál DIFCO, 10. vydání, strana 1100 až 1102; Michigan, USA). Výsledky měření udávají tabulky 3 a 4.

-22Tabulka 3: Akumulace pantothenátu v médiu obsahujícím glukózu

Kmen	Obsažený gen	Pantothenát (pg/ml)
FV5069/pFV31	-	2
FV5069/pFV31/pND-Dl	panDE.c.	24
FV5069/pFV31/pND-D2	panDc.g.	58

Tabulka 4: Akumulace pantothenátu v médiu obsahujícím sacharózu

Kmen	Obsažený gen	Pantothenát (pg/ml)
FV5069/pFV31	-	2
FV5069/pFV31/pND-Dl	panDE.c.	47
FV5069/pFV31/pND-D2	panDc.g.	69

-23INFORMACE O SEKVENCI ID. C. 1:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 540 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: genomová DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	ANTISENSE: ne
(Vi)	PŮVOD:
	(A) ORGANISMUS: Corynobacterium glutamicum (B) KMEN: ATCC13032
(ix)	CHARAKTERISTICKÉ RYSY: (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA:77 až 484
	(C) DALŠÍ INFORMACE: start kodón= 77; kód EC = 4.1.1
	produkt= L-aspartát -1-dekarboxyláza; gen=panD

(xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 1:

AATATTCCTT TCCTTGTCAT CTCACGCTAT GATTTCTAAA ACTTGCAGGA CAACCCCCAT 60

AAGGACACCA CAGGAC ATG CTG CGC ACC ATC CTC GGA AGT AAG ATT CAC 109

Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His

1

5

10

CGA

GCC

ACT

GTC

ACT

CAA

GCT

GAT

CTA

GAT

TAT

GTT

GGC

TCT

GTA

ACC

157

Arg

Ala

Thr

Val

Thr

Gin

Ala

Asp

Leu

Asp

Tyr

Val

Gly

Ser

Val

Thr

15

20

25

ATC

GAC

GCC

GAC

CTG

GTT

CAC

GCC

GCC

GGA

TTG

ATC

GAA

GGC

GAA

AAA

205

Ile

Asp

Ala

Asp

Leu

Val

His

Ala

Ala

Gly

Leu

Ile

Glu

Gly

Glu

Lys

30

35

40

GTT

GCC

ATC

GTA

GAC

ATC

ACC

AAC

GGC

GCT

CGT

CTG

GAA

ACT

TAT

GTC

253

Val

Ala

Ile

Val

Asp

Ile

Thr

Asn

Gly

Ala

Arg

Leu

Glu

Thr

Tyr

Val

45

50

55

ATT

GTG

GGC

GAC

GCC

GGA

ACG

GGC

AAT

ATT

TGC

ATC

AAT

GGT

GCC

GCT

301

Ile

Val

Gly

Asp

Ala

Gly

Thr

Gly

Asn

Ile

Cys

Ile

Asn

Gly

Ala

Ala

60

65

70

75

GCA

CAC

CTT

ATT

AAT

CCT

GGC

GAT

CTT

GTG

ATC

ATC

ATG

AGC

TAC

CTT

349

Ala

His

Leu

Ile

Asn

Pro

Gly

Asp

Leu

val

Ile

Ile

Met

Ser

Tyr

Leu

80

85

90

CAG

GCA

ACT

GAT

GCG

GAA

GCC

AAG

GCG

TAT

GAG

CCA

AAG

ATT

GTG

CAC

397

Gin

Ala

Thr

Asp

Ala

Glu

Ala

Lys

Ala

Tyr

Glu

Pro

Lys

Ile

Val

His

95

100

105

GTG

GAC

GCC

GAC

AAC

CGC

ATC

GTT

GCG

CTC

GGC

AAC

GAT

CTT

GCG

GAA

445

Val

Asp

Ala

Asp

Asn

Arg

ile

Val

Ala

Leu

Gly

Asn

Asp

Leu

Ala

Glu

110

115

120

GCA

CTA

CCT

GGA

TCC

GGG

CTT

TTG

ACG

TCG

AGA

AGC

ATT

TAGCGTTTTA

494

Ala

Leu

Pro

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Thr

Ser

Arg

Ser

Ile

125

130

135

GCTCGCCAAT ATTGCTGCCG GCCTCGTTGA AAATGGTCAT GGTGGC

540 • ·

-24INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 136 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

(xi)

POPIS SEKVENCE

ID.

č. ;

Met 1

Leu

Arg

Thr

Ile 5

Leu

Gly

Ser

Lys

Ile 10

His

Arg

Ala

Thr

Val 15

Thr

Gin

Ala

Asp

Leu 20

Asp

Tyr

Val

Gly

Ser 25

val

Thr

Ile

Asp

Ala 30

Asp

Leu

Val

His

Ala 35

Ala

Gly

Leu

Ile

Glu 40

Gly

Glu

Lys

Val

Ala 45

Ile

Val

Asp

Ile

Thr 50

Asn

Gly

Ala

Arg

Leu 55

Glu

Thr

Tyr

Val

Ile 60

Val

Gly

Asd

Ala

Gly 65

Thr

Gly

Asn

Ile

Cys 70

Ile

Asn

Gly

Ala

Ala 75

Ala

His

Leu

Ile

Asn 80

Pro

Gly

Asp

Leu

Val 85

Ile

Ile

Met

Ser

Tyr 90

Leu

Gin

Ala

Thr

Asp 95

Ala

Glu

Ala

Lys

Ala 100

Tyr

Glu

Pro

Lys

Ile 105

Val

His

Val

Asp

Ala 110

Asp

Asn

Arg

Ile

Val 115

Ala

Leu

Gly

Asn

Asp 120

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu 125

Pro

Gly

Ser

Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile

Claims (15)

1. Způsob výroby kyseliny D-pantothenové fermentací mikroorganismů produkuj icích

Enterobacteriacae

D-pantothenovou z čeledi kyselinu vyznačující se tím, že se použijí kmeny, které

a) obsahují plazmid pVF31a/nebo plazmid pFV202 a v těchto mikroorganismech se

b) zesílí alespoň gen panD a popřípadě další nukleotidové sekvence kódující aspartát-ldekarboxylázu, a to zejména zvýšením jejich exprese

c) kyselina D-pantothenová se hromadí v kultivačním médiu nebo buňkách

d) izoluje se vytvořená kyselina D-pantothenová

2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že použijí mikroorganismy s takovou replikovatlenou DNA, jejíž sekvence kóduje panD z bakterií Corynobacterium.

3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že replikovatelná DNA je chrakterizována:

i) nukleotidovou sekvencí podle Sekvence id.č.:l, která kóduje panD, nebo ii) sekvencí, která odpovídá sekvenci podle (i) v důsledku degenerace genetického kódu, nebo ι

iii) sekvencí, která hybridizuj e se sekvencemi komplementárními se sekvencemi podle (i) nebo (ii) a popřípadě iv) sekvencí, které vůči sekvenci podle (i) nese funkčně neutrální mutace.

4. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se použijí mikroorganismy, ve kterých se kvůli zesílení (zvýšení exprese) genů respektive nukleotidových sekvencí zvýší počet kopií těchto genů pomocí plazmidových vektorů nesoucích tyto geny respektive nukleotidové sekvence.

5. Způsob podle nároku tím, že se použijí kvůli zvýšení exprese oblasti nacházející strukturního genu.

1 vyznačující se mikroorganismy, ve kterých se mutují promotorové a regulační se proti směru transkripce od

6. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se použijí mikroorganismy, do kterých se kvůli zvýšení exprese vloží proti směru transkripce od strukturního genu expresní kazety.

7. Způsob podle nároku 1 tím, že se uvedeného prodlužením životnosti mRNA, uvedených sekvencí (genů) rozklad odpovídajícího (proteinů).

vyznačující se zesílení genu dosáhne která vzniká transkripcí a/nebo že se inhibuje enzymatického protein • ·

-278. Způsob podle nároků 1 až 7 vyznačujícíse tím, že se použijí mikroorganismy, které navíc obsahují jednotlivě nebo v kombinaci geny pro rezistenci k metabolitům nebo antimetabolitům.

9. Způsob podle nároků 1 až 8 vyznačujícíse tím, že se kvůli zvýšení exprese mikroorganismy

nechají fermentovat ve odpovídaj ícím změněném kultivačním médiu nebo se změní postup a průběh fermentace. 10. Způsob podle nároků 1 až 9 vyznačuj í c í s e

tím, že se použijí mikroorganismy, ve kterých jsou alespoň částečně blokovány metabolické pochody, které snižují tvorbu pantothenátu či pantothenové kyseliny.

11. Způsob podle nároků 1 až 10 vyznačujícíse tím, že se použijí mikroorganismy, ve kterých je kromě genu panD navíc, jednotlivě nebo v kombinaci, zesílena exprese ostatních genů podílejících se na metabolické dráze tvorby pantothenové kyseliny, výhodně pocházející z bakterií Corynebacterium.

12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že se použijí mikroorganismy, ve kterých je kromě genu panD navíc zesílena exprese jednoho nebo více genů, které kódují enzym ketopanthoáthydroxymethyltransferázu (EC 4.1.2.12) a pantothenát syntetázu (EC 6.3.2.1), výhodně pocházejících z bakterií Corynebacterium.

• ·

-2813. Způsob podle nároků 11 a 12 vyznačuj ícíse tím, že se použijí mikroorganismy transformované různými kompatibilními plazmidovými vektory, které obsahují jednotlivé jmenované geny.

14. Způsob podle nároků 11 a 12 vyznačujícíse tím, že se použijí plazmidovým vektorem transformované mikroorganismy druhu E. coli a plazmidový vektor obsahuje jeden nebo více uvedených genů včetně genu panD a tyto geny jsou uspořádány jeden po druhém a pod kontrolou jednoho společného promotoru nebo jsou od sebe odděleny a jsou pod kontrolou různých promotorů.

15. Způsob podle jednoho nebo více z předchozích nároků vyznačující se tím, že se použijí mikroorganismy obsahující plazmidový vektor pND2-D2, který je popsán restrikční mapou uvedenou na obrázku 2, uložené jako Corynobacterium glutamicum ATCC 13032/pND2-D2 pod číslem DSM 12438.

16. Způsob výroby kyseliny D-pantothenové podle jednoho nebo více s předchozích nároků vyznačuj ící se t í m, že se provedou kroky:

a) nechají se fermentovat bakterie druhu E.coli, ve kterých je zesílen alespoň gen panD, popřípadě v kombinaci s geny panB a/nebo panC

b) kyselinou D-pantothenovou se obohatí kultivační médium nebo buňky

c) izoluje se vytvořená kyselina D-pantothenová

-2917. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že zesílené geny pocházejí z kmenů bakterií rodu Corynobacterium.

18. Způsob podle nároku 16 nebo 17 vyznačuj ící se t i m, že v kroku a) se přidá prekurzor kyseliny pantothenové, vybraný ze skupiny tvořené aspartátem, β-alaninem, ketopanthoátem, ketoizovalerátem a pantoátem.

19. Mikroorganismy druhu E. coli, které obsahují plazmid pVF31 a/nebo pFV202 a jsou transformovány vložením replikovatelné DNA charakterizované:

i) nukleotidovou sekvencí kódující gen panD, podle Sekvence id.č.l ii) sekvencí, která odpovídá sekvenci podle (i) v důsledku degenerace genetického kódu, nebo iii) sekvencí, která hybridizuje se sekvencemi komplementárními se sekvencemi podle (i) nebo (ii) a popřípadě iv) sekvencí, které vůči sekvenci podle (i) nese funkčně neutrální mutace.