MXPA00008822A - Proceso para la preparacion fermentativa del acido d-pantotenico usando bacterias corineformes. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de acido D-pantotenico por medio de la fermentacion de bacterias coryneformes, utilizando bacterias en las cuales se refuerza en especial se sobre- expresa la secuencia nucleotida (gen pyc) que codifica a la enzima carboxilasa de piruvirato (numero EC 6.4.1.1.), realizando los siguientes pasos: a) fermentacion de las bacterias que producen acido D-pantotenico, en las cuales cuando menos se refuerza un gen codificante a la carboxilasa de piruvirato; b) enriquecimiento del acido D- pantotenico en el medio o en las celulas de las bacterias y c) aislado del acido D-pantotenico producido.

Description

PROCESO PARA LA PREPARACIÓN FERMENTATIVA DEL ÁCIDO D-PANTOTENICO USANDO BACTERIAS CORINEFORMES CAMPO PE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un procedimiento para preparación por fermentación de ácido D-pantoténico utilizan bacterias corineformes, en las cuales cuando menos se encuent reforzado el gen pyc . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ácido pantoténico representa una vitami comercialmente significativa, que encuentra aplicación en cosmetología, la medicina, la alimentación humana y alimentación animal . El ácido pantoténico puede prepararse por medio síntesis química o biotécnicamente por medio de la fermentaci de microorganismos adecuados en soluciones nutritivas adecuadas En la síntesis química la DL-Pantolactona es un compues importante. Se prepara en un procedimiento de múltiples etap a partir de formaldehido, isobutiraldehido y cianuro. En otra etapas del procedimiento se retira la mezcla racémica y s condensa D-pantolactona con ß-alanina, y se obtiene ácido D pantoténico . La ventaja de la preparación por medio de fermentació por microorganismos se encuentra en la formación directa de l forma esteroisomérica D deseada, que está libre de ácido L pantoténico.

REF.: 122774 Varios tipos de bacterias, como por ejempl Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacteriu erythrogenes, Brevibacterim amoniagenes y también levaduras como por ejemplo Debaromyces castellii como se muestra en EPA 493 060, producir ácido'D-pantoténico en una solución nutritiv que contiene glucosa, ácido DL-pantoínico y ß-alanina. EPA 049 060 muestra además, que con Escherichia coli por medio de l amplificación de genes de biosintesis de ácido pantoténico, qu están contenidos en los plasmidos pFV3 y pFV5, en una solució nutritiva que contiene glucosa, ácido DL-pantoínico y ß-alanina se mejora la formación de ácido D-pantoténico. EPA 0 590 857 y la patente US 5,518,906 describe mutantes derivados de la cepa IF03547 de Escherichia coli, com FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 y FV5069 qu presentan resistencias contra diferentes antimetaboli os com ácido salicílico, ácido a-cetobutirico, ácido ß hidroxiasparagínico, 0-metiltreonina y ácido oi cetoisovaleriánico y producen ácido pantoínico en una solució nutritiva que contiene glucosa y ácido D-pantoténico en un solución nutritiva que contiene glucosa y ß-alanina. En EPA 590 857 y la patente US 5,518,906 se muestra además que despué de la amplificación de los genes de biosintesis de ácid pantoténico, que se obtiene en el plasmido pFV31, en las cepa antes mencionadas en una solución nutritiva que contien glucosa, se mejora la producción de ácido D-pantoínico y en un solución nutritiva que contiene glucosa y ß-alanina se mejora l producción de ácido D-pantoténico. Tarea de la Invención Los inventores se han propuesto la tarea de presenta nuevas bases para un procedimiento mejorado para la preparació por fermentación de ácido pantoténico con la ayuda de bacteria corineformes . DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El ácido pantoténico vitamínico representa un product de importancia comercial que encuentra aplicación en l cosrrtetología, la medicina, la alimentación humana y l alimentación animal . Existe por lo tanto un interés general e presentar un procedimiento mejorado para la preparación de ácid pantoténico. Cuando de aquí en adelante se menciona ácido D pantoténico o ácido pantoténico o pantotenato, deben entenders no solo los ácidos libres sino también las sales de ácido D pantoténico como por ejemplo la sal de calcio, sodio, amonio potasio. El objeto de la invención es un procedimiento para l preparación por fermentación de ácido D-pantoténico utilizand bacterias corineformes, en las cuales se refuerza en especial s sobre-expresa la secuencia nucleótida (gen pyc) que codifica la enzima carboxilasa de piruvirato (número EC 6.4.1.1). Las cepas utilizadas eventualmente producen ácido D pantoténico, ya antes del refuerzo del gen pyc. Formas de realización preferidas se encuentran en la reivindicaciones . El concepto "refuerzo" describe en este contexto e aumento de la actividad intracelular de una o varias enzimas e un microorganismo, que son codificadas por medio de correspondiente ADN, aumentándose el número de copias de lo genes, se utiliza un fuerte promotor o un gen que codifique a l enzima correspondiente con una alta actividad específica eventualmente combina esas medidas . Los microorganismos que son objeto de la present invención, pueden producir ácido pantoténico a partir d glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones, celulosa o de glicerina y etanol, en especial d glucosa o sacarosa. Se. trata bacterias corineformes, en especial de los géneros Corynebacterium. En • el género Corynebacteriu puede mencionarse en particular el tipo Corynebacteriu glutamicum, que es conocido en la técnica por su facilidad par formar aminoácidos . Cepas adecuadas del genero Corynebacterium, e especial del tipo Corynebacterium glutamicum, son por ejemplo las cepas tipo nativo conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FEM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC 14067 .Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020 Se encontró que las bacterias corineformes después de la sobre-exprésion, de los genes de pyc codificantes a carboxilasa de piruvirato (número EC 6.4.1.1.) producen ácido pantoténico en forma mejorada. El gen pyc codifica a la enzima carboxilasa de piruvirato (EC número 6.4.1.1) que cataliza la carboxilación del piruvirato a oxalacetato. La secuencia nucleótida del gen pyc se presenta en DE-A-198 31 609 y ha sido descrita igualmente por Koffas et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 50, 346- 352 (1998)) y Peters- endish et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)). Esta disponible en el banco de secuencias nucleótidas del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, US) bajo el número de acceso Y09548. El gen pyc descrito en los textos datos puede utilizarse de acuerdo con la invención. Además se pueden utilizar los alelos de los genes mencionados, que se obtiene por medio de la degeneración del código genético por medio de mutaciones de sentidos (sense mutations) de función neutra. Para lograr una amplificación (sobre-expresión) , se aumenta por ejemplo el numero de copias del gen correspondiente o se muta la región promotora y la de regulación, que se encuentran corriente arriba del gen estructural . De la misma forma funcionan los cartuchos de expresión, que se construyen corriente arriba del gen estructural . Por medio de promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la formación por fermentación del ácido D-pantoténico. Por medio de medidas para alargar la vida del m-ARN se mejora igualmente la expresión. Además evitando la destrucción de la proteína enzimática se amplifica igualmente la actividad enzimática. Los genes o las contrucciones genéticas se encuentran asi ya sea en vectores de plasmido con diferentes números de copias o están integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente se puede lograr además una sobre-expresión del gen en cuestión por medio de la modificación de la composición del medio y el manejo del cultivo. Instrucciones sobre esto las encuentra el técnico entre otras en las de Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), por Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), por Eikmanns et. al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el escrito de patente europeo EPS 0 472 869, en la patente de US 4,601,893, por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), por Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), por LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud de patente WO 96/15246, por Malumbres el al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en el escrito de patente japonés JP-A- -229891, por Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) y en los libros de texto conocidos sobre genética y biología molecular. Un ejemplo de un plasmido con cuya ayuda se sobre-expresa la carboxilasa de piruvirato, es el plasmido pVWExlpyc, que se presenta en DE-A-198 31 609 y se basa en el vector de partida pVWEccl . El plasmido pVWExl contiene las partes constitutivas entre otros de secuencias del plasmido pBLl, el promotor tac y el alelo laclq . Otros vectores de plasmido replicables en C. glutamicum como por ejemplo pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) o pZ8-l (escrito de patente europeo 0 375 889) pueden utilizarse de igual manera. Además puede ser ventajoso para la producción de ácido pantoténico, el reforzar, en particular sobre-expresar además del gen codificante a carboxilasa de piruvirato uno o mas genes codificantes a las enzimas de la vía biosintética del ácido pantoténico o de la vía biosintética del ácido isovaleriánico, como por ejemplo • el gen panD codificante al a decarboxilasa de aspartato (Dusch et al., Applied and Enviromental Microbiology 65, 1520-1539 (1999)) O • el gen panB codificante a la hidroximetiltransferasa de cetopantoato (Sahm et al., Applied and Enviromental Microbiology, 65, 1973-1979 (1999)) o • el gen panC codificante a la sintetasa de pantotenato (Sahm et al., Applied and Enviromental Microbiology, 65, 1973- 1979 (1999)) o • el gen ilvD codificante a dihidratasa de ácido dibhidroxi. Además puede ser ventajoso para la producción de los L-aminoácidos correspondientes además de la sobre-expresión de dihidrogenasa de glutamato evitar reacciones secundarias indeseadas (Nakaya a: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overpoduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikytam Vanek (eds.); Academic Press, Londres, UK, 1982), Los microorganismos preparados de acuerdo con la invención pueden cultivarse continua o discontinuamente en procedimientos por lotes o en procedimiento de alimentación (fed batch) o procedimiento de alimentación repetitivo (repeated fed batch) con el fin de producir ácido pantoténico. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el texto de Chmiel (Bioprozestecnnik 1. Einführung in • die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtingen (Vieweg verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). El medio de cultivo utilizado debe de una forma adecuada ser suficiente para los requisitos de los microorganismos en cuestión. La descripción de medios de cultivo de diferentes microorganismos se encuentra en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la sociedad americana de Bacteriología (Washington D.C., US, 1981). Como fuente de carbono pueden utilizarse azucares y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, latosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones y celulosa, aceites y grasas como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como por ejemplo ácido palmitíco, ácido estearínico y ácido linoléico, alcoholes como por ejemplo glicerina y etanol y ácidos orgánicos como por ejemplo' ácido acético. Esas substancias pueden utilizarse individualmente o en mezclas. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como peptona extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de soya y urea o compuesto inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o como mezclas. Como fuentes de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfats dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe además contener sales de metales como por ejemplo sulfato de magnesio o de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente pueden utilizarse promotores del crecimiento como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las substancias mencionadas . Al medio de cultivo se le pueden agregar pre-etapas del ácido pantoténico como ß-alanina y ácido cetopantoíco. Los aditivos mencionados pueden agregarse al cultivo en forma de una carga única o en un a forma adecuada agregarse durante el cultivo. Para controlar el pH del cultivo se utilizan compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico en forma adecuada. Para controlar la formación de espuma pueden utilizarse agentes anti-espumantes como por ejemplo poliglicoléster de ácido graso o aceites de silicona. Para mantener la estabilidad de los plasmidos pueden agregarse al medio substancias de efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas se introducen al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contengan oxígeno como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente a 20°C a 45°C y preferentemente a 25°C a 40°C. El cultivo se continua hasta que se ha formado una cantidad máxima de ácido pantoténico. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 a- 160 horas. La concentración de ácido pantoténico formada puede determinarse con el procedimiento conocido (Velisek; Cromatographic Science 60, 515-560 (1992)). Los siguientes microorganismos fueron depositados en conformidad con el tratado de Budapest del 1. julio 1999 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ; Braunsc weig, Alemania) : Corinebacterium glutamicum Dg52-5/pVWExlpyc como DSM12893 Ejemplos A continuación se aclara la presente invención con l ayuda de ejemplos de realización. Para este fin se realizaron las pruebas con una cep que requiere isoleucina ATCC13032?ilvA, que fue depositado com DSM1455 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivo Celulares en Braunschweig (Alemania) de acuerdo con el Tratad de Budapest. Ejemplo 1 Preparación de la cepa ATCC13032?ilvA/pVWExlpyc Por medio de electroporación (Tauc et al., 1994, FEM Microbiological Letters, 123; 343-347) del plasmido pVWExlpy (DE-A-198 31 609) en la cepa de C.glutamicum ATCC13032?ilvA la subsecuente selección sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology 1:190-206) + 25 µg/ml canamicina se obtuvo la cep ATCC13032?ilvA/pVWExlpyc . Ejemplo 2 Preparación de ácido pantoténico La formación de pantotenato por medio de las cepas d C.glutamicum ATCC13032?ilvA y ATCC13032?ilvA/pVWExlpyc s comprobó en medio CGXII (Keilhauer et al., 1993 Journal Bacteriology, 175:5595-5603; Tabla 4) que fue suplementado co 25 µg/ml de canamicina y 25 µg/ml de isoleucina. Ee medio continuación se denomina como medio de prueba de C. glutamicum. Sendos 50 ml de medio de prueba de C. glutamicum recié preparado se inocularon en un precultivo de 16 horas de vida del mismo medio, de tal forma que la densidad óptica de l suspensión de cultivo (O.D.S80) al inicio de la incubación fue d 0.1. Después de 24 horas de incubación a 30°C y 174 rpm s determinó la densidad óptica (O.D.580) del cultivo y continuación se separaron las células por medio d centrifugación durante 10 minutos a 5000 g y el residuo s filtro estéril. Para la determinación de la densidad óptica se utilizo el fotómetro Novaspec II de la firma Pharmacia (Friburgo, Alemania) a una longitud de onda de medición de 580 nm. La cuantificación del D-pantotenato en el residuo del cultivo se realizó por medio de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 de acuerdo con los datos del anual de la firma DIFCO (DIFCO MANUAL, 10a. edición, .páginas 1100-1002; Michigan, US) . Para la calibración se utilizó sal hemicálcica de pantotenato de la firma Sigma (Deisenhofen, Alemania) . Los resultados de la producción de pantotenato por medio de las cepas ATCC13032?ilvA y ATCC13032?ilvA/pVWExlpyc se resumen en la tabla 1.

Tabla 1 Ejemplo 3 Preparación del plasmido pXT-panD 3.1 Preparación del vector péndulo pEC-XT99A de E. coli C.glutamicum Como vector de partida para la construcción del vecto de expresión péndulo pEC-XT99A de E.coli-C. glutamicum s utilizo el vector de expresión de E. coli pTRC99A (Amann et al., 1988, Gene 69:301-315) . Después de la disociación de restricció BspHI (Roche Diagnostics GmBH, Mannheim, Alemania, descripció del producto BspHI, producto no. 1467123) y subsecuent tratamiento con Klenow (Ammersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, descripción del producto fragmento Klenow d polimerasa I de ADN, producto no. 27-09-28-091; Método d acuerdo con Sambrook et al., Molecular Clonig: A laborator Manual, Cold Spring Harbor) se intercambio el gen de resistenci a la tetraciclina del plasmido de C. glutamicum pAGl (No. d acceso al banco genético AF121000) . Para esto se clonó la zon que porta al gen de resistencia como fragmento Alul (Amersha Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, descripción del product Alul,. producto no. 27-0994-01) en el vector de expresió linearizado de E. coli pTRC99A. El ligado se realizó como l describe Sambrook et al. ' (1989, Molecular Cloning: A laborator Manual, Cold Spring Harbor) , en donde la mezcla de ADN se incub durante la noche con ligasa T4 (Amesham Pharmacia Biotech. Friburgo, Alemania, descripción del producto ligasa de ADN T4, producto no. 27-0870-04) . Esta mezcla de ligado se electropor subsecuentemente en la cepa de E.coli DHamcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645 4649) (Tauch et al. 1994, FERMS microbiology Letters, 123:343 7) . El vector de expresión construido de E. coli se denomin pXT99A. Como base de la clonación de una replica mínima d Corynebacterium glutamicum se utilizó el plasmido pGAl (Sonne et al., 1991, Gene, 107-69-74). Por medio de disociació BalI/PstI (Promega GmbH, Mannheim, Alemania, descripción de producto Ball, producto no. R6691; Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, denominación del producto PstI, producto no. 27-0976-01) del vector pGAl pudo clonarse un fragmento de 348 bp en el vector pK18mob2 fragmentado con Smal y Pst I (Amersha Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, denominación del product PstI, producto no. 27-0976-01) (Tauch et al., 1998, Archives o Microbiology 169:303-312). Por medio de disociación d restricción BamHI/XhoI (Amersham Pharmacia Biotech Friburgo, Alemania, denominación del producto BamHI, producto no. 27-086803, denominación del producto Xhol, producto no. 27-0950-01) y finalmente tratamiento Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, denominación del producto fragmento Klenow de polimerasa I de ADN, producto no. 27-0928-01; Métodos de acuerdo con Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A láboratory Manual, Cold Spring Harbor) , se borro un fragmento de 839 bp. De la construcción ligada con ligasa T4 (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, denominación del producto ligasa de ADN T4, producto no. 27-0870-04) pudo la replica minima de C. glutamicum clonarse en el vector de expresión de E. coli pXT99A. Para esto se disocio la construcción que portaba el ADN de la replica mínima con las enzimas de restricción Kpnl (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, denominación del producto Kpnl, producto no. 27--0908-01) y Pst (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, denominación del producto PstI, producto no. 27-0886-03) y a continuación se realizó un tratamiento co 3 ' -5 ' -exonucleasa (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) por medio de polimerasa Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, descripción del producto fragmento Klenow de polimerasa I de ADN, producto no. 27-0928-01) . En una carga paralela se disocio el vector de expresión de e. coli pXT99A con la enzima de restricción Rsr II (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, descripción del producto RsrII, producto no. 1292587) y se preparo para le ligado con polimerasa Klenow {Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, . Alemania, descripción del producto fragmento Klenow de polimerasa I de ADN, producto no. 27-0928-01) . El ligado de la replica mínima se realizó con la construcción de vector pXT99 como lo describe Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), incubándose durante la noche la mezcla de ADN con ligasa T4 (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania, denominación del producto ligasa de ' ADN T4, producto no. 27-0870-04) . El vector de expresión péndulo de E.coli-C.glutmaicum pEC-XT99A así construido se trasnfirió a C. glutamicum DSM5715 por medio de electroporación (Liebl et al., 1989., FEMS Microbiology Letter,. 53:299-303). La selección de los transformantes se realizó sobre agar-LBHIS consistente de 18.5 g/1 de caldo de infusión de cerebro-corazón, sorbitol 0.5 M ,5 g/1 Bacto-Trypton, 2.5 g/1 de extracto bacto-levadura, 5 g/1 NaCl y 18 g/1 de bacto-agar, que fue suplementado con 5 mg/1 de tetraciclina. La incubación se realizó durante 2 días a 33°C. El ADN de plasmido se aisló de un transformante de acuerdo con los métodos habituales (Peters-Wendish et al.

(Microbiology 144, 915-927 (1998)) , se corto con endonucleasa de restricción Hind III y el plasmido se verifico por medio de subsecuente electroforesis en gel de agarosa.

La construcción de plasmido así obtenida se denomino pEC-XT99A y se representa en la figura 1. La cepa obtenida por medio de la electroporación del plasmido pEC-XT99A en la cepa de Corynebacterium glutamicum DSM5715 se llamó DSM5715/pEC-XT99A y se deposito en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest, como DSM12967. 3.2 Preparación del plasmido pXT-panD A partir de las secuencias nucleótidas de gel pan D de biosintesis de pantotenato de C. glutamicum ATCC 13032 (Dusch et al. (Applied and Enviromental Microbiology 65(4), 1530-1539 (1999)) y DE 19855313.7) Se selecciono el cebador PCR de tal forma que el fragmento amplificado contenía al gen con sus - puntos de enlace ribosómicos nativos. El fragmento de.405 bp amplificado con cebador PCR pandD-Cgl (5 ' -CATCTCACGCTATGAATTCT- 3') y panD-Cg2 (5 ' -ACGAGGCCTGCGCAATA-39 se ligo de acuerdo con las instrucciones del fabricante en el vector pCR®2.1 (Original TA Cloning Kit, Invitrogene (Leek, Países Bajos) , denominación del producto Original TA Cloning®Kit, cat . no. KNM2030-01) y a continuación se transformó en la cepa de E. coli TOP10F1 (Catalogo "Invitrogen 2000" de la firma Invitrogen, Groningen, Países Bajos) . La selección de los transformantes se realizó por medio de la incubación a 37°C durante 24 horas sobre placas de . agar LB con 100 µg/ml ampicilina y 40 µg/ml X-Gal (5-bromo-4- cloro-3-indolil-ß-D-galactosido) .

El ADN del plasmido construido pCR-D2 se aisló de un transformante de acuerdo con los métodos conocidos, se digirió con las endonuclasas de restricción Sacl y Xbal y se ligo en el vector pEC-XT99A igualmente disociado. Ya que el segundo punto de corte Xbal, que se encuentra en la región de codificación panD, se encuentra metilado en el anfitrión E.coli ToplOF', este punto de corte no se corto y el gen como consecuencia se extrajo intacto del plasmido pCR-D2, por medio de los puntos de corte flanqueantes Sacl y Xbal. Después del ligado se electroporo la carga en la cepa de E.. coli DHarmcr. La selección se realizó sobre placas de agar LB con 50 µg/ml de canamicina. El ADN de plasmido de uno de los transformantes así obtenidos fue asilado, se disocio con las endonucleasas de restricción Sacl y Xbal y los fragmentos se verificaron subsecuentemente por medio de electroforesis de gel de agarosa. El plasmido así construido se denominó pXT-panD y se representa en- la figura 2. Ejemplo 4 Preparación de productores de ácido pantoténico ATCC13032?ilvA/pVWExlpyc, pXT-panD El plasmido pXT-panD descrito en el ejemplo 3 se electroporo en la cepa de C. glutamicum ATCCl3032?ilvA/pVWExlpyc. Después de selección durante dos días a 30°C sobre agar LB, que había sido suplementado con 10 µg/ml tetraciclina y 25 g/ml canamicina, se obtuvo la cepa ATCCl3032?ilvA/pVWExlpyc, pXT-panD.

Ejemplo 5 Preparación de ácido pantoténico La formación de pantotenato por medio de las cepas de C.glutamicum ATCC13032?ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD y ATCC13032?ilvA/pXT-panD y se comprobó en medio CGXII (Keilhauer et al., 1993 Journal o Bacteriology, 175:5595-5603; Tabla 4) que fue suplementado con 10 µg/ml de tetraciclina, 2mM de isoleucina y en caso de la cepa ATCC13032?ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD, adicionalmente con 25 µg/ml de canamicina. Ese medio a continuación se denomina como medio de prueba de C. glutamicum. Sendos 50 ml de medio de prueba de C-glutmaicum recién preparado se inocularon en un precultivo de 16 horas de vida del mismo medio, de tal forma que la densidad óptica de la suspensión de cultivo (O.D.S80) al inicio de la incubación fue de 0.1. Los cultivos se fermentaron a 30°C y 130 rpm. Después de 5 horas de incubación se agregó IPTG /ß-D-tiogalactosido de isopropanilo) en una concentración final de 1 mM. Después de 48 horas de incubación se determinó la densidad óptica (O.D.580) del cultivo y a continuación se separaron las células por medio de centrifugación durante 10 minutos a 5000 g y el residuo se filtro estéril. Para la determinación de la densidad óptica se utilizo el fotómetro Novaspec II de la firma Pharmacia (Friburgo, Alemania) a una longitud de onda de medición de 580 nm. La cuantificación del D-pantotenato en el residuo del cultivo se realizó por medio de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 de acuerdo con los datos del anual de la firma DIFCO (DIFCO MANUAL, 10a. edición, páginas 1100-1002; Michigan, US) . Par ala calibración se utilizo sal hemicálcica de pantotenato de la firma Sigma (Deisenhofe?, Alemania) . Los resultados se presentan en la tabla 3. Tabla 2 Tabla 3 Ilustrac ones Se anexan las siguientes ilustraciones: Ilustración 1: Mapa de restricción del plasmido pEC-XT99A Ilustración 2 : Mapa de restricción del plasmido pXT-panD. Las abreviaturas y denominaciones utilizadas tienen el siguiente significado: •lacZ terminal 3 ' del fragmento genético lacZa laclq alelo Laclq del gen represor lac lacZ1 terminal 5 ' del fragmento genético lacZo? oriV: origen de replicación V panD: gen de decarboxilasa de aspartato per: gen para el control del numero de copias Ptrc: promotor trc rep: región de replicaicon para C. glutamicum TI: terminador de transcripción TI T2 : terminador de transcripción T2 Tet: gen de resistencia a la tetraciclina BamHI : Punto de corte de la enzima de restricción BamHI Dral: Punto de corte de la enzima de restricción Dral EcoRI: Punto de corte de la enzima de restricción EcoRI EcoRV: Punto de corte de la enzima de restricción EcoRV HindII: Punto de corte de la enzima de restricción HindII Kpnl : Punto de corte de la enzima de restricción Kpnl Ndel: Punto de corte de la enzima de restricción Ndel Notl: Punto de corte de la enzima de restricción Notl NruI: Punto de corte de la enzima de restricción Nuri PstI: Punto de corte de la enzima de restricción PstI Sacl: Punto de corte de la enzima de restricción Sacl Smal: Punto de corte de la enzima de restricción Smal Xbal**: Punto de corte metilado de Xbal Xbal: Punto de corte de la enzima de restricción Xbal Se hace constar que con relación a esta fecha, e mejor método conocido por la solicitante para llevar a l práctica la citada invención, es el que resulta claro de l presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, s reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1.- Procedimiento para la preparación de ácido D pantoténico por medio de la fermentación de bacteria coryneformes, caracterizado porque se utilizan bacterias en la cuales se refuerza en especial se sobre-expresa la secuenci nucleótida (gen pyc) que codifica a la enzima carboxilasa d piruvirato (número EC 6.4.1.1).
2. 2.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales s refuerzan otros genes de la vía biosintética del ácido D pantoténico.
3. 3.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque se utilizan bacterias, en las cuales se evitan cuando menos parcialmente las vías metabólicas qu reducen la formación de ácido D-pantoténico.
4. 4.- Procedimiento de acuerdo con una o varias de la reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque se utiliz una cepa transformada con un vector de plasmido, y el vector d plasmido porta la secuencia nucleótida que codifica carboxilasa de piruvirato.
5. 5.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con e plasmido pVWExlpyc .
6. 6. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque simultáneamente se refuerza el gen panD qu codifica a la decarboxilasa de aspartato.
7. 7.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque simultáneamente se refuerza el gen panB qu codifica a la hidroximetiltransferasa de cetopantoato.
8. 8.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque simultáneamente se refuerza el gen panC qu codifica a la sintetasa de pantotenato.
9. 9.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque simultáneamente se refuerza el gen ilvD qu codifica a la dihidratasa de ácido dihidroxi .
10. 10. - Procedimiento de acuerdo con una o varias de la reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los gene mencionados se refuerzan en bacterias corineformes que y producen el ácido D-pantoténico.
11. 11. - Procedimiento para la preparación por fermentación d ácido D-pantoténico de acuerdo con una o varias de la reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, se realiza los siguientes pasos: a) fermentación de las bacterias que producen ácido D pantoténico, en las cuales cuando menos se refuerza un ge codificante a la carboxilasa de piruvirato; b) enriquecimiento del ácido D-pantoténico en el medio o e las células de las bacterias y c) aislado del ácido D-pantoténico producido.
12. 12.- Bacterias corineformes, caracterizadas porque en ella se refuerza en especial se sobre-expresa la secuenci nucleótida (gen pyc) que codifica a la enzima carboxilasa d piruvirato (número EC 6.4.1.1).
13. 13.- Corynebacterium glutamicum DG 52-5/pVWExlpy depositado bajo el número DSM 12893 en la Colección Alemana d Microorganismos y Cultivos Celulares en Braunschweig, Alemania.