JP2001112489A - コリネフォルム細菌を使用するｄ−パントテン酸の発酵的製法 - Google Patents
コリネフォルム細菌を使用するｄ−パントテン酸の発酵的製法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 コリネフォルム細菌を用いてパントテン酸を
発酵的に製造するための改良された方法の作成。 【解決手段】 コリネフォルム細菌を使用するＤ−パン
トテン酸の発酵的製法において、ピルビン酸カルボキシ
ラーゼ（ＥＣ番号６.４.１.１.）をコードするヌクレオ
チド配列（ｐｙｃ−遺伝子）を強化し、特に過剰発現す
る細菌を使用することにより解決する。
発酵的に製造するための改良された方法の作成。 【解決手段】 コリネフォルム細菌を使用するＤ−パン
トテン酸の発酵的製法において、ピルビン酸カルボキシ
ラーゼ（ＥＣ番号６.４.１.１.）をコードするヌクレオ
チド配列（ｐｙｃ−遺伝子）を強化し、特に過剰発現す
る細菌を使用することにより解決する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は少なくともｐｙｃ−
遺伝子が強化されている、コリネフォルム細菌の使用下
に、Ｄ−パントテン酸を発酵的に製造する方法に関す
る。
遺伝子が強化されている、コリネフォルム細菌の使用下
に、Ｄ−パントテン酸を発酵的に製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】パントテン酸は化粧品、医薬品、ヒト食
品および動物飼料に適用される商業上重要なビタミンで
ある。
品および動物飼料に適用される商業上重要なビタミンで
ある。
【０００３】パントテン酸は化学的合成によりまたは好
適な培養液中で好適な微生物を発酵させるバイオテクノ
ロジーにより製造することができる。化学的合成におい
てはＤＬ−パントラクトンは重要な中間物質である。こ
の物質はホルムアルデヒド、イソブチルアルデヒドおよ
びシアニドから多工程法により製造される。その後の工
程においてこのラセミ混合物を分離し、Ｄ−パントラク
トンをβ−アラニンと縮合させ、こうして所望のＤ−パ
ントテン酸を獲得する。
適な培養液中で好適な微生物を発酵させるバイオテクノ
ロジーにより製造することができる。化学的合成におい
てはＤＬ−パントラクトンは重要な中間物質である。こ
の物質はホルムアルデヒド、イソブチルアルデヒドおよ
びシアニドから多工程法により製造される。その後の工
程においてこのラセミ混合物を分離し、Ｄ−パントラク
トンをβ−アラニンと縮合させ、こうして所望のＤ−パ
ントテン酸を獲得する。
【０００４】微生物による発酵的な製造の利点は、Ｌ−
パントテン酸不含の所望の立体異性体Ｄ−型の直接的な
形成にある。
パントテン酸不含の所望の立体異性体Ｄ−型の直接的な
形成にある。
【０００５】種々の細菌、例えばエシェリキア・コリ
（Escherichia coli）アルスロバクター・ウレアファシ
エンス（Arthrobacter ureafaciens）、コリネバクテリ
ウム・エリスロゲネス（Corynebacterium erythrogene
s）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Breviba
cterium ammoniagenes）および酵母、例えばデバロマイ
セス・カステリイ（Debaromyces castellii）は、ＥＰ
−Ａ−０４９３０６０中に示すように、グルコース、Ｄ
Ｌ−パントイン酸およびβ−アラニンを含有する培養液
中でＤ−パントテン酸を生産することができる。ＥＰ−
Ａ−０４９３０６０は更に、エシェリキア・コリにおい
てプラスミドｐＦＶ３およびｐＦＶ５上に含有されてい
る、エシェリキア・コリからのパントテン酸−生合成遺
伝子を、グルコース、ＤＬ−パントイン酸およびβ−ア
ラニンを含有する培養液中で増幅することにより、Ｄ−
パントテン酸の形成が改良されることを記載している。
（Escherichia coli）アルスロバクター・ウレアファシ
エンス（Arthrobacter ureafaciens）、コリネバクテリ
ウム・エリスロゲネス（Corynebacterium erythrogene
s）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Breviba
cterium ammoniagenes）および酵母、例えばデバロマイ
セス・カステリイ（Debaromyces castellii）は、ＥＰ
−Ａ−０４９３０６０中に示すように、グルコース、Ｄ
Ｌ−パントイン酸およびβ−アラニンを含有する培養液
中でＤ−パントテン酸を生産することができる。ＥＰ−
Ａ−０４９３０６０は更に、エシェリキア・コリにおい
てプラスミドｐＦＶ３およびｐＦＶ５上に含有されてい
る、エシェリキア・コリからのパントテン酸−生合成遺
伝子を、グルコース、ＤＬ−パントイン酸およびβ−ア
ラニンを含有する培養液中で増幅することにより、Ｄ−
パントテン酸の形成が改良されることを記載している。
【０００６】ＥＰ−Ａ−０５９０８５７およびＵＳ−特
許５５１８９０６号明細書は、エシェリキア・コリ株Ｉ
ＦＯ３５４７から誘導された突然変異体、例えば種々の
代謝拮抗物質、例えばサリチル酸、α−ケト酪酸、β−
ヒドロキシアスパラギン酸、Ｏ−メチルトレオニンおよ
びα−ケトイソ吉草酸に対する耐性を有する、ＦＶ５７
１４、ＦＶ５２５、ＦＶ８１４、ＦＶ５２１、ＦＶ２２
１、ＦＶ６０５１およびＦＶ５０６９を記載している。
これらはグルコースを含有する培養液中でパントイン酸
を生産し、かつグルコース−およびβ−アラニン−含有
培養液中でＤ−パントテン酸を生産する。更に、ＥＰ−
Ａ−０５９０８５７およびＵＳ−特許５５１８９０６号
明細書中には、プラスミドｐＦＶ３１上に含有されてい
るパントテン酸−生合成遺伝子の増幅により、前記菌株
中でグルコース含有培養液においてはＤ−パントイン酸
の生産が、グルコースおよびβ−アラニンを含有する培
養液においてはＤ−パントテン酸の生産が改良されるこ
とが記載されている。
許５５１８９０６号明細書は、エシェリキア・コリ株Ｉ
ＦＯ３５４７から誘導された突然変異体、例えば種々の
代謝拮抗物質、例えばサリチル酸、α−ケト酪酸、β−
ヒドロキシアスパラギン酸、Ｏ−メチルトレオニンおよ
びα−ケトイソ吉草酸に対する耐性を有する、ＦＶ５７
１４、ＦＶ５２５、ＦＶ８１４、ＦＶ５２１、ＦＶ２２
１、ＦＶ６０５１およびＦＶ５０６９を記載している。
これらはグルコースを含有する培養液中でパントイン酸
を生産し、かつグルコース−およびβ−アラニン−含有
培養液中でＤ−パントテン酸を生産する。更に、ＥＰ−
Ａ−０５９０８５７およびＵＳ−特許５５１８９０６号
明細書中には、プラスミドｐＦＶ３１上に含有されてい
るパントテン酸−生合成遺伝子の増幅により、前記菌株
中でグルコース含有培養液においてはＤ−パントイン酸
の生産が、グルコースおよびβ−アラニンを含有する培
養液においてはＤ−パントテン酸の生産が改良されるこ
とが記載されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題はコリネ
フォルム細菌を用いてパントテン酸を発酵的に製造する
ための改良された方法を作成することである。
フォルム細菌を用いてパントテン酸を発酵的に製造する
ための改良された方法を作成することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】ビタミンであるパントテ
ン酸は化粧品、医薬品、ヒト食品および動物飼料に適用
される商業上重要な製品である。パントテン酸を製造す
るための改良された方法を作成することへの普遍的な興
味が存在する。
ン酸は化粧品、医薬品、ヒト食品および動物飼料に適用
される商業上重要な製品である。パントテン酸を製造す
るための改良された方法を作成することへの普遍的な興
味が存在する。
【０００９】以下にＤ−パントテン酸またはパントテン
酸またはパントテネートと記載する際には、遊離の酸だ
けを意味するのではなく、例えばカルシウム塩、ナトリ
ウム塩、アンモニウム塩またはカリウム塩のようなＤ−
パントテン酸の塩をも意味する。
酸またはパントテネートと記載する際には、遊離の酸だ
けを意味するのではなく、例えばカルシウム塩、ナトリ
ウム塩、アンモニウム塩またはカリウム塩のようなＤ−
パントテン酸の塩をも意味する。
【００１０】本発明の課題は、酵素であるピルビン酸カ
ルボキシラーゼ（ＥＣ番号６.４.１.１.）をコードする
ヌクレオチド配列（ｐｙｃ−遺伝子）が強化され、特に
過剰発現される、コリネフォルム細菌の使用下にＤ−パ
ントテン酸を発酵的に製造するための方法に関する。
ルボキシラーゼ（ＥＣ番号６.４.１.１.）をコードする
ヌクレオチド配列（ｐｙｃ−遺伝子）が強化され、特に
過剰発現される、コリネフォルム細菌の使用下にＤ−パ
ントテン酸を発酵的に製造するための方法に関する。
【００１１】使用する菌株は場合によりｐｙｃ−遺伝子
の強化の前に、すでにＤ−パントテン酸を生産する。
の強化の前に、すでにＤ−パントテン酸を生産する。
【００１２】有利な実施形は請求項中に記載されてい
る。
る。
【００１３】“強化”の概念とは、本願明細書におい
て、例えば１種または複数の遺伝子のコピー数を高める
か、強いプロモータを使用するか又は高い活性を有する
相当する酵素をコードする遺伝子を使用することによ
り、及び場合によりこれらの手法を組み合わせることに
より、微生物中で相当するＤＮＡによりコードされる１
種以上の酵素の細胞内活性を高めることを意味する。
て、例えば１種または複数の遺伝子のコピー数を高める
か、強いプロモータを使用するか又は高い活性を有する
相当する酵素をコードする遺伝子を使用することによ
り、及び場合によりこれらの手法を組み合わせることに
より、微生物中で相当するＤＮＡによりコードされる１
種以上の酵素の細胞内活性を高めることを意味する。
【００１４】本発明の対象である微生物は、グルコー
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリン
とエタノールとから、Ｄ−パントテン酸を製造できる。
これはコリネフォルム細菌であり、特にコリネバクテリ
ウム属のものである。コリネバクテリウム属においては
特にコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacter
ium glutamicum）の種が挙げられ、これはこの専門分野
においてそのＬ−アミノ酸を産生する能力が公知であ
る。
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリン
とエタノールとから、Ｄ−パントテン酸を製造できる。
これはコリネフォルム細菌であり、特にコリネバクテリ
ウム属のものである。コリネバクテリウム属においては
特にコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacter
ium glutamicum）の種が挙げられ、これはこの専門分野
においてそのＬ−アミノ酸を産生する能力が公知であ
る。
【００１５】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミクム種の好適な菌株は例えば公知の野
生型株の、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣ
Ｃ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミク
ム（Corynebacterium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１
５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
（Corynebacterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３
８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Co
rynebacterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−
１５３９、ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacte
rium flavum） ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンツム（Brevibacterium lactofe
rmentum） ＡＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリ
ウム・ジバリカツム（Brevibacterium divaricatum）
ＡＴＣＣ１４０２０、およびこれらから製造された、Ｄ
−パントテン酸生産性突然変異体である。
リウム・グルタミクム種の好適な菌株は例えば公知の野
生型株の、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣ
Ｃ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミク
ム（Corynebacterium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１
５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
（Corynebacterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３
８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Co
rynebacterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−
１５３９、ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacte
rium flavum） ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンツム（Brevibacterium lactofe
rmentum） ＡＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリ
ウム・ジバリカツム（Brevibacterium divaricatum）
ＡＴＣＣ１４０２０、およびこれらから製造された、Ｄ
−パントテン酸生産性突然変異体である。
【００１６】コリネフォルム細菌がピルビン酸カルボキ
シラーゼ（ＥＣ番号６.４.１.１.）をコードするｐｙｃ
−遺伝子の過剰発現により、改良された方法でパントテ
ン酸を生産することが見いだされた。
シラーゼ（ＥＣ番号６.４.１.１.）をコードするｐｙｃ
−遺伝子の過剰発現により、改良された方法でパントテ
ン酸を生産することが見いだされた。
【００１７】ｐｙｃ−遺伝子はピルビン酸のオキサル酢
酸へのカルボキシル化を触媒する酵素であるピルビン酸
カルボキシラーゼ（ＥＣ番号６.４.１.１.）をコードす
る。ｐｙｃ−遺伝子のヌクレオチド配列はＤＥ−Ａ−１
９８３１６０９中で開示されており、同様にコファス等
（Koffas et al. : Applied Microbiology and Biotech
nology 50, 346-352 (1998)）およびペータース・ウェ
ンディッシュ等（Peters-Wendisch et al. : Microbiol
ogy 144, 915-927 (1998)）により記載されている。こ
のｐｙｃ−遺伝子はＮＣＢＩ（National Center for Bi
otechnology Information, Bethesda, MD, USA）のヌク
レオチド配列データ−バンクにおいて登録番号Ｙ０９５
４８で一般的に入手可能である。記載したテキスト位置
に記載されたｐｙｃ−遺伝子を本発明においては使用す
ることができる。更に、遺伝学的コードの縮重でまたは
機能中立センス突然変異により生じる、ｐｙｃ−遺伝子
の対立遺伝子を使用することができる。
酸へのカルボキシル化を触媒する酵素であるピルビン酸
カルボキシラーゼ（ＥＣ番号６.４.１.１.）をコードす
る。ｐｙｃ−遺伝子のヌクレオチド配列はＤＥ−Ａ−１
９８３１６０９中で開示されており、同様にコファス等
（Koffas et al. : Applied Microbiology and Biotech
nology 50, 346-352 (1998)）およびペータース・ウェ
ンディッシュ等（Peters-Wendisch et al. : Microbiol
ogy 144, 915-927 (1998)）により記載されている。こ
のｐｙｃ−遺伝子はＮＣＢＩ（National Center for Bi
otechnology Information, Bethesda, MD, USA）のヌク
レオチド配列データ−バンクにおいて登録番号Ｙ０９５
４８で一般的に入手可能である。記載したテキスト位置
に記載されたｐｙｃ−遺伝子を本発明においては使用す
ることができる。更に、遺伝学的コードの縮重でまたは
機能中立センス突然変異により生じる、ｐｙｃ−遺伝子
の対立遺伝子を使用することができる。
【００１８】強化（例えば、過剰発現）を達成するため
に、例えば相当する遺伝子のコピー数を上昇させるか、
または構造遺伝子の上流に存在するプロモータ領域およ
び制御領域またはリボソーム結合位を突然変異させる。
同様にして、構造遺伝子の上流に組み込まれる、発現カ
セットに作用する。誘発可能なプロモータにより、発酵
的パントテン酸形成の経過における発現を上昇させるこ
とも更に可能である。ｍ−ＲＮＡの生存期間を延長させ
るための処置により、同様に発現は改良される。更に、
酵素タンパク質の分解の阻止により同様に酵素活性は強
化される。この際、遺伝子または遺伝子構造体は異なる
コピー数でプラスミド中に存在するか、または染色体中
に組み込まれて増幅される。更に、選択的に該当する遺
伝子の過剰発現は培地組成および培養法の変更により達
成することができる。
に、例えば相当する遺伝子のコピー数を上昇させるか、
または構造遺伝子の上流に存在するプロモータ領域およ
び制御領域またはリボソーム結合位を突然変異させる。
同様にして、構造遺伝子の上流に組み込まれる、発現カ
セットに作用する。誘発可能なプロモータにより、発酵
的パントテン酸形成の経過における発現を上昇させるこ
とも更に可能である。ｍ−ＲＮＡの生存期間を延長させ
るための処置により、同様に発現は改良される。更に、
酵素タンパク質の分解の阻止により同様に酵素活性は強
化される。この際、遺伝子または遺伝子構造体は異なる
コピー数でプラスミド中に存在するか、または染色体中
に組み込まれて増幅される。更に、選択的に該当する遺
伝子の過剰発現は培地組成および培養法の変更により達
成することができる。
【００１９】このための方法の教示は、当業者には特に
Martin et al.(Bio/Technology 5,137-146(1987)), Gue
rrero et al. (Gene 138, 35-41(1994)), Tsuthiya and
Morinaga(Bio/Technology 6, 428-430(1988)), Eikman
ns et al.(Gene 102, 93-98(1991)),ヨーロッパ特許明
細書EPS 0472869,米国特許4601893, Schwarzer und Pue
hler (Bio/Technology 9, 84-87(1991)), Reinscheid e
t al. (Applied and Environmental Microbiology 60,
126-132(1994)), LaBarre et al. (Journal ofBacterio
logy 175, 1001-1007(1993)), 特許出願 ＷＯ96/1524
6, Malumberes et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), 特
開平10-229891, Jensen und Hammer (Biotechnology an
d Bioengineering 58, 191-195(1998))および遺伝学及
び分子生物学の公知の教書に見ることができる。
Martin et al.(Bio/Technology 5,137-146(1987)), Gue
rrero et al. (Gene 138, 35-41(1994)), Tsuthiya and
Morinaga(Bio/Technology 6, 428-430(1988)), Eikman
ns et al.(Gene 102, 93-98(1991)),ヨーロッパ特許明
細書EPS 0472869,米国特許4601893, Schwarzer und Pue
hler (Bio/Technology 9, 84-87(1991)), Reinscheid e
t al. (Applied and Environmental Microbiology 60,
126-132(1994)), LaBarre et al. (Journal ofBacterio
logy 175, 1001-1007(1993)), 特許出願 ＷＯ96/1524
6, Malumberes et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), 特
開平10-229891, Jensen und Hammer (Biotechnology an
d Bioengineering 58, 191-195(1998))および遺伝学及
び分子生物学の公知の教書に見ることができる。
【００２０】ピルビン酸カルボキシラーゼを過剰発現す
る際に用いるプラスミドの例は、ＤＥ−Ａ−１９８３１
６０９中に開示されており、出発ベクターｐＶＷＥｘ１
に起因するプラスミドｐＶＷＥｘ１ｐｃｙである。プラ
スミドｐＶＷＥｘ１は構成分として特にプラスミドｐＢ
Ｌ１の配列、ｔａｃ−プロモータおよびｌａｃＩq−対
立遺伝子を含有する。コリネバクテリウム・グルタミク
ム中で複製可能な他のプラスミドベクター、例えば、ｐ
ＥＫＥｘ１（Eikmanns te al., Gene 102 : 93-98 (199
1)）またはｐＺ８−１（ヨーロッパ特許第０３７５８８
９号明細書）も、同様にして使用することができる。
る際に用いるプラスミドの例は、ＤＥ−Ａ−１９８３１
６０９中に開示されており、出発ベクターｐＶＷＥｘ１
に起因するプラスミドｐＶＷＥｘ１ｐｃｙである。プラ
スミドｐＶＷＥｘ１は構成分として特にプラスミドｐＢ
Ｌ１の配列、ｔａｃ−プロモータおよびｌａｃＩq−対
立遺伝子を含有する。コリネバクテリウム・グルタミク
ム中で複製可能な他のプラスミドベクター、例えば、ｐ
ＥＫＥｘ１（Eikmanns te al., Gene 102 : 93-98 (199
1)）またはｐＺ８−１（ヨーロッパ特許第０３７５８８
９号明細書）も、同様にして使用することができる。
【００２１】更に、ピルビン酸カルボキシラーゼをコー
ドする遺伝子と共に、パントテン酸−生合成経路のまた
はケトイソ吉草酸−生合成経路の酵素をコードするその
他の遺伝子、例えば ・アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードするｐａ
ｎＤ−遺伝子（Dusch etal., Applied and Environment
al Microbiology 65, 1530-1539 (1999)）または ・ケトパントテン酸ヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼをコードするｐａｎＢ−遺伝子（Sahm et al., Appli
ed and Environmental Microbiology 65, 1973-1979 (1
999)）または ・パントテン酸シンテターゼをコードするｐａｎＣ−遺
伝子（Sahm et al., Applied and Environmental Micro
biology, 65, 1973-1979 (1999)）または ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ
−遺伝子、１種以上を強化、特に過剰発現することがパ
ントテン酸の生産のために有利である。
ドする遺伝子と共に、パントテン酸−生合成経路のまた
はケトイソ吉草酸−生合成経路の酵素をコードするその
他の遺伝子、例えば ・アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードするｐａ
ｎＤ−遺伝子（Dusch etal., Applied and Environment
al Microbiology 65, 1530-1539 (1999)）または ・ケトパントテン酸ヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼをコードするｐａｎＢ−遺伝子（Sahm et al., Appli
ed and Environmental Microbiology 65, 1973-1979 (1
999)）または ・パントテン酸シンテターゼをコードするｐａｎＣ−遺
伝子（Sahm et al., Applied and Environmental Micro
biology, 65, 1973-1979 (1999)）または ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ
−遺伝子、１種以上を強化、特に過剰発現することがパ
ントテン酸の生産のために有利である。
【００２２】更に、パントテン酸の生産のために、ピル
ビン酸カルボキシラーゼの過剰発現と共に、不所望な副
反応を遮断することも有利である（ナカヤマ：“Breedi
ng of Amino Acid Producing Microorganisms”, in: O
verproduction of MicrobialProducts, Krumphanzl, Si
kyta,Vanek (eds.) , Academic Press, London, UK,198
2）。
ビン酸カルボキシラーゼの過剰発現と共に、不所望な副
反応を遮断することも有利である（ナカヤマ：“Breedi
ng of Amino Acid Producing Microorganisms”, in: O
verproduction of MicrobialProducts, Krumphanzl, Si
kyta,Vanek (eds.) , Academic Press, London, UK,198
2）。
【００２３】本発明により製造した微生物は連続的また
は不連続的に、バッチ法（Satzkultivierung）又はフィ
ードバッチ法（fed batch; Zulaufverfahren）又は繰り
返しフィードバッチ法（repeated fed batch;repetitiv
es Zulaufverfahren）でパントテン酸−産生の目的で培
養することができる。公知の培養法に関する概要はChmi
el (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Biover
fahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991))の教書又はStorhas (Bioreaktoren undperiphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesba
den, 1994))の教書に記載されている。
は不連続的に、バッチ法（Satzkultivierung）又はフィ
ードバッチ法（fed batch; Zulaufverfahren）又は繰り
返しフィードバッチ法（repeated fed batch;repetitiv
es Zulaufverfahren）でパントテン酸−産生の目的で培
養することができる。公知の培養法に関する概要はChmi
el (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Biover
fahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991))の教書又はStorhas (Bioreaktoren undperiphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesba
den, 1994))の教書に記載されている。
【００２４】使用すべき培地は適当な方法でそれぞれの
微生物の要求を満たさなければならない。多様な微生物
の培地の記載は、ハンドブック"Manual of Methods for
General Bacteriology", American Society for Bacte
riology (Washington D.C.,USA, 1981)になされてい
る。炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコー
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例
えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ脂
肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリ
ノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノー
ル及び有機酸、例えば酢酸が使用される。この材料は単
独で又は混合物として使用することができる。窒素源と
して、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出
物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ膨潤水、ダイ
ズ粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アン
モニウム及び硝酸アンモニウムが使用される。この窒素
源は単独で又は混合物として使用することができる。リ
ン源として、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カ
リウム又は相応するナトリウム含有塩を使用することが
できる。この培地は、さらに成長に必要な金属塩、例え
ば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければならな
い。最後に、必須の成長物質、例えばアミノ酸及びビタ
ミンを前記の物質に対して付加的に使用することができ
る。この培養基に更にパントテン酸生産をより上昇する
ためにパントテン酸の前駆体、例えばアスパルテート、
β−アラニン、ケトイソバレレート、ケトパントイン酸
またはパントイン酸及び場合によりこれらの塩を添加す
ることができる。前記の添加物質は培養へ１回のバッチ
の形で添加するか、又は適当な手法で培養の間に供給す
ることができる。
微生物の要求を満たさなければならない。多様な微生物
の培地の記載は、ハンドブック"Manual of Methods for
General Bacteriology", American Society for Bacte
riology (Washington D.C.,USA, 1981)になされてい
る。炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコー
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例
えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ脂
肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリ
ノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノー
ル及び有機酸、例えば酢酸が使用される。この材料は単
独で又は混合物として使用することができる。窒素源と
して、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出
物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ膨潤水、ダイ
ズ粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アン
モニウム及び硝酸アンモニウムが使用される。この窒素
源は単独で又は混合物として使用することができる。リ
ン源として、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カ
リウム又は相応するナトリウム含有塩を使用することが
できる。この培地は、さらに成長に必要な金属塩、例え
ば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければならな
い。最後に、必須の成長物質、例えばアミノ酸及びビタ
ミンを前記の物質に対して付加的に使用することができ
る。この培養基に更にパントテン酸生産をより上昇する
ためにパントテン酸の前駆体、例えばアスパルテート、
β−アラニン、ケトイソバレレート、ケトパントイン酸
またはパントイン酸及び場合によりこれらの塩を添加す
ることができる。前記の添加物質は培養へ１回のバッチ
の形で添加するか、又は適当な手法で培養の間に供給す
ることができる。
【００２５】培地のｐＨ−コントロールのために、塩基
性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
アンモニア、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が
適当な手法で使用される。泡形成を制御するために、消
泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用する
ことができる。プラスミドの安定を維持するために、培
地に適当な選択作用をする物質、例えば抗生物質を添加
することができる。好気性条件を維持するために、酸素
又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培地中へ導入す
る。培地の温度は通常２０℃〜４５℃、有利に２５℃〜
４０℃である。パントテン酸の最大量が生成されるまで
培養は継続される。この目的は通常１０時間〜１６０時
間の間に達成される。
性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
アンモニア、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が
適当な手法で使用される。泡形成を制御するために、消
泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用する
ことができる。プラスミドの安定を維持するために、培
地に適当な選択作用をする物質、例えば抗生物質を添加
することができる。好気性条件を維持するために、酸素
又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培地中へ導入す
る。培地の温度は通常２０℃〜４５℃、有利に２５℃〜
４０℃である。パントテン酸の最大量が生成されるまで
培養は継続される。この目的は通常１０時間〜１６０時
間の間に達成される。
【００２６】生成されたパントテン酸の濃度は、公知の
方法（Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560
(1992)）で測定することができる。
方法（Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560
(1992)）で測定することができる。
【００２７】次の微生物をブタペスト条約に従ってDSMZ
(Deutsche Sammlung fuer Mikrorganismen und Zellku
lturen, Braunschweig, Deutschland)に１９９９年７月
１日付で寄託した：ＤＳＭ１２８９３としてコリネバク
テリウム・グルタミクム ＤＧ５２−５／ｐＶＷＥｘ１
ｐｙｃ。
(Deutsche Sammlung fuer Mikrorganismen und Zellku
lturen, Braunschweig, Deutschland)に１９９９年７月
１日付で寄託した：ＤＳＭ１２８９３としてコリネバク
テリウム・グルタミクム ＤＧ５２−５／ｐＶＷＥｘ１
ｐｙｃ。
【００２８】
【実施例】次に、実施例につき本願をより詳細に説明す
る。
る。
【００２９】この目的のためには、Deutsche Sammlung
fuer Mikrorganismen und Zellkulturen（Braunschwei
g, Deutschland在）にＤＳＭ１２４５５としてブタペス
ト条約により寄託された、イソロイシン要求性菌株ＡＴ
ＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡを用いて実施した。
fuer Mikrorganismen und Zellkulturen（Braunschwei
g, Deutschland在）にＤＳＭ１２４５５としてブタペス
ト条約により寄託された、イソロイシン要求性菌株ＡＴ
ＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡを用いて実施した。
【００３０】実施例１ 菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＶＷＥｘ１ｐｙ
ｃの製造 コリネバクテリウム・グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０
３２ΔｉｌｖＡ中にプラスミドｐＶＷＥｘ１ｐｙｃ（Ｄ
Ｅ−Ａ−１９８３１６０９）をエレクトロポレーション
し（Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Lette
rs, 123: 343-347）、かつＬＢ−寒天培地（Lennox, 19
55, Virology, 1: 190-206）＋カナマイシン２５μｇ／
ｍl上で選択することにより、菌株ＡＴＣＣ１３０３２
ΔｉｌｖＡ／ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃを獲得する。
ｃの製造 コリネバクテリウム・グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０
３２ΔｉｌｖＡ中にプラスミドｐＶＷＥｘ１ｐｙｃ（Ｄ
Ｅ−Ａ−１９８３１６０９）をエレクトロポレーション
し（Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Lette
rs, 123: 343-347）、かつＬＢ−寒天培地（Lennox, 19
55, Virology, 1: 190-206）＋カナマイシン２５μｇ／
ｍl上で選択することにより、菌株ＡＴＣＣ１３０３２
ΔｉｌｖＡ／ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃを獲得する。
【００３１】実施例２ パントテン酸の製造 コリネバクテリウム・グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０
３２ΔｉｌｖＡおよびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／
ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃによるパントテネートの形成をカナ
マイシン２５μｇ／ｍｌおよびイソロイシン２５μｇ／
ｍｌを補充された培地ＣＧＸＩＩ（Keilhauer et al.,
1993, Journal of Bacteriology, 175:5595-5603; 表
４）中で試験した。この培地を以降Ｃ・グルタミクム−
テスト培地と称する。新たに配合したＣ・グルタミクム
−テスト培地各５０ｍｌを同じ培地の１６時間経過の予
培地から、培養懸濁液の光学密度（ＯＤ580）がインキ
ュベーション開始時に０.１となるように接種した。３
０℃および１７５ｒｐｍで２４時間のインキュベーショ
ンの後、培地の光学密度（ＯＤ580）を測定し、かつ引
き続き細胞を５０００ｇで１０分間遠心分離することに
より除去し、上澄みを滅菌濾過した。
３２ΔｉｌｖＡおよびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／
ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃによるパントテネートの形成をカナ
マイシン２５μｇ／ｍｌおよびイソロイシン２５μｇ／
ｍｌを補充された培地ＣＧＸＩＩ（Keilhauer et al.,
1993, Journal of Bacteriology, 175:5595-5603; 表
４）中で試験した。この培地を以降Ｃ・グルタミクム−
テスト培地と称する。新たに配合したＣ・グルタミクム
−テスト培地各５０ｍｌを同じ培地の１６時間経過の予
培地から、培養懸濁液の光学密度（ＯＤ580）がインキ
ュベーション開始時に０.１となるように接種した。３
０℃および１７５ｒｐｍで２４時間のインキュベーショ
ンの後、培地の光学密度（ＯＤ580）を測定し、かつ引
き続き細胞を５０００ｇで１０分間遠心分離することに
より除去し、上澄みを滅菌濾過した。
【００３２】光学密度を測定するためには、ファルマシ
ア社（Firma Pharmacia: Freiburg,Deutschland）のＮ
ｏｖａｓｐｅｃＩＩフォトメータを測定波長５８０ｎｍ
で使用した。
ア社（Firma Pharmacia: Freiburg,Deutschland）のＮ
ｏｖａｓｐｅｃＩＩフォトメータを測定波長５８０ｎｍ
で使用した。
【００３３】培養上澄み中のＤ−パントテネートの定量
は、ディフコ社（DIFCO MANUAL, 10th Edition, 1100-1
102; Michigan, USA）のハンドブックの記載に従って、
ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus planta
rum）ＡＴＣＣ８０１４を用いて行われた。検定のため
にはシグマ社（Firma Sigma: Deisenhofen, Deutschlan
d）のパントテネートのヘミカルシウム塩を使用した。
は、ディフコ社（DIFCO MANUAL, 10th Edition, 1100-1
102; Michigan, USA）のハンドブックの記載に従って、
ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus planta
rum）ＡＴＣＣ８０１４を用いて行われた。検定のため
にはシグマ社（Firma Sigma: Deisenhofen, Deutschlan
d）のパントテネートのヘミカルシウム塩を使用した。
【００３４】菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡおよび
ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃに
よるパントテネート生産の結果を表１にまとめた。
ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃに
よるパントテネート生産の結果を表１にまとめた。
【００３５】
【表１】
【００３６】実施例３ プラスミドｐＸＴ−ｐａｎＤの製造 ３.１ Ｅ．コリ−Ｃ．グルタミクム−シャトルベクタ
ーｐＥＣ−ＸＴ９９Ａの製造 Ｅ．コリ−Ｃ．グルタミクム−シャトル発現ベクターｐ
ＥＣ−ＸＴ９９Ａの構成のための出発ベクターとして、
Ｅ．コリ−発現ベクターｐＴＲＣ９９Ａ（Amann et al.
1988, Gene 69: 301-315）を使用した。ＢｓｐＨＩ−
制限切断（RocheDiagnostics GmbH, Mannheim, Deutsch
land, 製品名 BspHI, 製品番号1467123）および引き続
きクレノウ処理（Amersham Pharmacia Biotech, Freibu
rg, Deutschland, 製品名 Klenow Fragment of DNA Pol
ymerase I, 製品番号27-0928-01;Sambrook et al., 198
9, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Sp
ring Harbor による方法）を実施した後、アンピシリン
耐性遺伝子（ｂｌａ）をＣ．グルタミクムプラスミドｐ
ＡＧ１のテトラサイクリン耐性遺伝子（ジーンバンク、
登録番号AF121000）と交換した。このためには耐性遺伝
子を有する領域をＡｌｕＩ−フラグメント（Amersham P
harmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名 Al
uI, 製品番号27-0884-01）として線状化Ｅ．コリ−発現
ベクターｐＴＲＣ９９Ａ中でクローン化した。ライゲー
ションをサンブルーク等（Sambrooket al., 1989, Mole
cular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor）により記載されたように実施し、この際ＤＮＡ−
混合物をＴ４−リガーゼ（Amersham Pharmacia Biotec
h, Freiburg, Deutschland, 製品名 T4-DNA-Ligase,製
品番号27-0870-04）と共に一夜インキュベートした。引
き続き、このライゲーション混合物をＥ．コリ−株ＤＨ
５αｍｃｒ（Grant, 1990, Proceedings of the Nation
al Academy of Sciences USA, 87: 4645-4649）中にエ
レクトロポレーションした（Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiology Letters, 123: 343-7）。この構成された
Ｅ．コリ−発現ベクターをｐＸＴ９９Ａと命名した。
ーｐＥＣ−ＸＴ９９Ａの製造 Ｅ．コリ−Ｃ．グルタミクム−シャトル発現ベクターｐ
ＥＣ−ＸＴ９９Ａの構成のための出発ベクターとして、
Ｅ．コリ−発現ベクターｐＴＲＣ９９Ａ（Amann et al.
1988, Gene 69: 301-315）を使用した。ＢｓｐＨＩ−
制限切断（RocheDiagnostics GmbH, Mannheim, Deutsch
land, 製品名 BspHI, 製品番号1467123）および引き続
きクレノウ処理（Amersham Pharmacia Biotech, Freibu
rg, Deutschland, 製品名 Klenow Fragment of DNA Pol
ymerase I, 製品番号27-0928-01;Sambrook et al., 198
9, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Sp
ring Harbor による方法）を実施した後、アンピシリン
耐性遺伝子（ｂｌａ）をＣ．グルタミクムプラスミドｐ
ＡＧ１のテトラサイクリン耐性遺伝子（ジーンバンク、
登録番号AF121000）と交換した。このためには耐性遺伝
子を有する領域をＡｌｕＩ−フラグメント（Amersham P
harmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名 Al
uI, 製品番号27-0884-01）として線状化Ｅ．コリ−発現
ベクターｐＴＲＣ９９Ａ中でクローン化した。ライゲー
ションをサンブルーク等（Sambrooket al., 1989, Mole
cular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor）により記載されたように実施し、この際ＤＮＡ−
混合物をＴ４−リガーゼ（Amersham Pharmacia Biotec
h, Freiburg, Deutschland, 製品名 T4-DNA-Ligase,製
品番号27-0870-04）と共に一夜インキュベートした。引
き続き、このライゲーション混合物をＥ．コリ−株ＤＨ
５αｍｃｒ（Grant, 1990, Proceedings of the Nation
al Academy of Sciences USA, 87: 4645-4649）中にエ
レクトロポレーションした（Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiology Letters, 123: 343-7）。この構成された
Ｅ．コリ−発現ベクターをｐＸＴ９９Ａと命名した。
【００３７】コリネバクテリウム・グルタミクムからの
最小レプリコンのクローニングのためのベースとしてプ
ラスミドｐＧＡ１（Sonnen et al. 1991, Gene, 107: 6
9-74）を使用した。ベクターｐＧＡ１のＢａｌＩ／Ｐｓ
ｔＩ−制限切断（Promega GmbH, Mannheim, Deutschlan
d, 製品名 BalI, 製品番号R6691; Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名 PstI, 製品
番号27-0967-01）により、大きさ３４８４ｂｐのフラグ
メントをＳｍａＩおよびＰｓｔＩ（Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名 SmaI, 製品
番号27-0942-02, 製品名 PstI, 製品番号27-0976-01）
で断片化したベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（Tauch et a
l., 1998, Archives of Microbiology 169: 303-312）
中でクローン化することができた。ＢａｍＨＩ／Ｘｈｏ
Ｉ−制限切断（Amersham PharmaciaBiotech, Freiburg,
Deutschland, 製品名 ＢａｍＨI, 製品番号27-086803,
製品名 XhoI, 製品番号27-0950-01）および引き続きク
レノウ処理（Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,
Deutschland, 製品名 Klenow Fragment of DNA Polymer
ase I, 製品番号27-0928-01; Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor による方法）を用いて、８３９ｂｐの大きさの
フラグメントを欠失させた。Ｔ４−リガーゼ（Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名
T4-DNA-Ligase, 製品番号27-0870-04）で再ライゲーシ
ョンした構造体から、Ｃ．グルタミクム最小レプリコン
を２６４５ｂｐの大きさのフラグメントとしてＥ．コリ
−発現ベクターｐＸＴ９９Ａ中でクローン化することが
できた。このためには、最小レプリコンを有する構造体
のＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ（Amersham Pharmacia Bio
tech, Freiburg, Deutschland, 製品名 ＫｐｎＩ, 製品
番号27-0908-01）およびＰｓｔＩ（Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名 ＰｓｔＩ,
製品番号27-0886-03）で切断し、引き続きクレノウポリ
メラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg, Deu
tschland, 製品名 Klenow Fragment of DNA Polymerase
I, 製品番号27-0928-01）を用いて、３′−５′−エキ
ソヌクレアーゼ処理（Sambrook et al., 1989, Molecul
ar Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r）を実施する。
最小レプリコンのクローニングのためのベースとしてプ
ラスミドｐＧＡ１（Sonnen et al. 1991, Gene, 107: 6
9-74）を使用した。ベクターｐＧＡ１のＢａｌＩ／Ｐｓ
ｔＩ−制限切断（Promega GmbH, Mannheim, Deutschlan
d, 製品名 BalI, 製品番号R6691; Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名 PstI, 製品
番号27-0967-01）により、大きさ３４８４ｂｐのフラグ
メントをＳｍａＩおよびＰｓｔＩ（Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名 SmaI, 製品
番号27-0942-02, 製品名 PstI, 製品番号27-0976-01）
で断片化したベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（Tauch et a
l., 1998, Archives of Microbiology 169: 303-312）
中でクローン化することができた。ＢａｍＨＩ／Ｘｈｏ
Ｉ−制限切断（Amersham PharmaciaBiotech, Freiburg,
Deutschland, 製品名 ＢａｍＨI, 製品番号27-086803,
製品名 XhoI, 製品番号27-0950-01）および引き続きク
レノウ処理（Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,
Deutschland, 製品名 Klenow Fragment of DNA Polymer
ase I, 製品番号27-0928-01; Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor による方法）を用いて、８３９ｂｐの大きさの
フラグメントを欠失させた。Ｔ４−リガーゼ（Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名
T4-DNA-Ligase, 製品番号27-0870-04）で再ライゲーシ
ョンした構造体から、Ｃ．グルタミクム最小レプリコン
を２６４５ｂｐの大きさのフラグメントとしてＥ．コリ
−発現ベクターｐＸＴ９９Ａ中でクローン化することが
できた。このためには、最小レプリコンを有する構造体
のＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ（Amersham Pharmacia Bio
tech, Freiburg, Deutschland, 製品名 ＫｐｎＩ, 製品
番号27-0908-01）およびＰｓｔＩ（Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland, 製品名 ＰｓｔＩ,
製品番号27-0886-03）で切断し、引き続きクレノウポリ
メラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg, Deu
tschland, 製品名 Klenow Fragment of DNA Polymerase
I, 製品番号27-0928-01）を用いて、３′−５′−エキ
ソヌクレアーゼ処理（Sambrook et al., 1989, Molecul
ar Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r）を実施する。
【００３８】並行する配合物中でＥ．コリ−発現ベクタ
ーｐＸＴ９９Ａを制限酵素ＲｓｒＩＩ（Roche Diagnost
ics, Mannheim, Deutschland, 製品名 ＲｓｒＩＩ, 製
品番号129258）で切断し、クレノウ−ポリメラーゼ（Am
ersham Pharmacia Biotech,Freiburg, Deutschland, Kl
enow Fragment of DNA Polymerase I, 製品番号27-0928
-01）でライゲーションのために準備した。最小レプリ
コンとベクター構造体ｐＸＴ９９Ａとのライゲーション
はサンブルーク等（Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r）により記載されたように実施し、この際ＤＮＡ−混
合物をＴ４−リガーゼ（Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Deutschland, 製品名 T4-DNA-Ligase, 製品
番号27-0870-04）と共に一夜インキュベートした。
ーｐＸＴ９９Ａを制限酵素ＲｓｒＩＩ（Roche Diagnost
ics, Mannheim, Deutschland, 製品名 ＲｓｒＩＩ, 製
品番号129258）で切断し、クレノウ−ポリメラーゼ（Am
ersham Pharmacia Biotech,Freiburg, Deutschland, Kl
enow Fragment of DNA Polymerase I, 製品番号27-0928
-01）でライゲーションのために準備した。最小レプリ
コンとベクター構造体ｐＸＴ９９Ａとのライゲーション
はサンブルーク等（Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r）により記載されたように実施し、この際ＤＮＡ−混
合物をＴ４−リガーゼ（Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Deutschland, 製品名 T4-DNA-Ligase, 製品
番号27-0870-04）と共に一夜インキュベートした。
【００３９】このように構成されたＥ．コリ−Ｃ．グル
タミクム−シャトル−発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
をエレクトロポレーション（Liebl et al., 1989, FEMS
Microbiology Letters, 53: 299-303）により、Ｃ．グ
ルタミクムＤＳＭ５７１５中に形質転換した。形質転換
体の選択は脳−心臓浸出物ブイヨン１８.５ｇ／ｌ、ソ
ルビトール０.５Ｍ、バクト−トリプトン５ｇ／ｌ、バ
クト−イースト−抽出物２.５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／
ｌおよびバクト−寒天１８ｇ／ｌからなり、テトラサイ
クリン５ｍｇ／ｌを補充された、ＬＢＨＩＳ寒天培地上
で行われた。インキュベーションは３３℃で２日間行っ
た。
タミクム−シャトル−発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
をエレクトロポレーション（Liebl et al., 1989, FEMS
Microbiology Letters, 53: 299-303）により、Ｃ．グ
ルタミクムＤＳＭ５７１５中に形質転換した。形質転換
体の選択は脳−心臓浸出物ブイヨン１８.５ｇ／ｌ、ソ
ルビトール０.５Ｍ、バクト−トリプトン５ｇ／ｌ、バ
クト−イースト−抽出物２.５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／
ｌおよびバクト−寒天１８ｇ／ｌからなり、テトラサイ
クリン５ｍｇ／ｌを補充された、ＬＢＨＩＳ寒天培地上
で行われた。インキュベーションは３３℃で２日間行っ
た。
【００４０】プラスミドＤＮＡを形質転換体から常法で
単離し（Peters-Wendisch et al.,1998, Microbiology,
144, 915-927）、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断し、プラスミドをアガロースゲル−電気泳動
により検査した。
単離し（Peters-Wendisch et al.,1998, Microbiology,
144, 915-927）、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断し、プラスミドをアガロースゲル−電気泳動
により検査した。
【００４１】そのように得られたプラスミド構造体をｐ
ＥＣ−ＸＴ９９Ａと命名し、図１に示した。コリネバク
テリウム・グルタミクム株ＤＳＭ５７１５中へのプラス
ミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａのエレクトロポレーションによ
り得られた菌株をＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
と命名し、ブタペスト条約に従ってDeutsche Sammlung
fuer Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Brauns
chweig, Deutschland)にＤＳＭ１２９６７として寄託し
た。
ＥＣ−ＸＴ９９Ａと命名し、図１に示した。コリネバク
テリウム・グルタミクム株ＤＳＭ５７１５中へのプラス
ミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａのエレクトロポレーションによ
り得られた菌株をＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
と命名し、ブタペスト条約に従ってDeutsche Sammlung
fuer Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Brauns
chweig, Deutschland)にＤＳＭ１２９６７として寄託し
た。
【００４２】３.２ プラスミドｐＸＴ−ｐａｎＤの製
造 Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のパントテネート
生合成遺伝子ｐａｎＤのヌクレオチド配列（Dusch et a
l., (Applied and Environmental Microbiology 65
(4), 1530-1539 (1999))およびＤＥ19855313.7）から出
発し、ＰＣＲ−プライマーを増幅したフラグメントがそ
の天然リボソーム−結合位を有する遺伝子を含有するよ
うに選択した。ＰＣＲ−プライマーｐａｎＤ−Ｃｇ１：
造 Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のパントテネート
生合成遺伝子ｐａｎＤのヌクレオチド配列（Dusch et a
l., (Applied and Environmental Microbiology 65
(4), 1530-1539 (1999))およびＤＥ19855313.7）から出
発し、ＰＣＲ−プライマーを増幅したフラグメントがそ
の天然リボソーム−結合位を有する遺伝子を含有するよ
うに選択した。ＰＣＲ−プライマーｐａｎＤ−Ｃｇ１：
【００４３】
【外１】
【００４４】およびｐａｎＤ−Ｃｇ２：
【００４５】
【外２】
【００４６】で増幅された４０５ｂｐの大きさのフラグ
メントをベクターｐＣＲ(R)２.１（Original TA Clonin
g Kit, Invitrogene (Leek, Niederlande), 製品名 Ori
ginalTA Cloning(R)Kit, Cat. no. KNM2030-01）中に製
造者の記載に従ってライゲーションし、引き続きＥ．コ
リ株ＴＯＰ１０Ｆ′（Firma Invitrogenのカタログ“In
vitrogen 2000”, Groningen, Niederlande）中に形質
転換する。形質転換体に関する選択はアンピシリン１０
０μｇ／ｍｌおよびＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ
／ｍｌを有するＬＢ−寒天プレート上で３７℃で２４時
間インキュベーションすることで行われた。
メントをベクターｐＣＲ(R)２.１（Original TA Clonin
g Kit, Invitrogene (Leek, Niederlande), 製品名 Ori
ginalTA Cloning(R)Kit, Cat. no. KNM2030-01）中に製
造者の記載に従ってライゲーションし、引き続きＥ．コ
リ株ＴＯＰ１０Ｆ′（Firma Invitrogenのカタログ“In
vitrogen 2000”, Groningen, Niederlande）中に形質
転換する。形質転換体に関する選択はアンピシリン１０
０μｇ／ｍｌおよびＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ
／ｍｌを有するＬＢ−寒天プレート上で３７℃で２４時
間インキュベーションすることで行われた。
【００４７】このように構成されたプラスミドｐＣＲ−
Ｄ２のＤＮＡは形質転換体から常法により単離され、制
限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化さ
れ、かつ同様に切断されたベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
中にライゲーションされた。ｐａｎＤコード領域中に存
在する第二のＸｂａＩ−切断位はＥ．コリ宿主Ｔｏｐ１
０Ｆ′中でメチル化されて存在するので、この切断位は
切断されず、従って、この遺伝子は無傷で、側面に位置
するＳａｃＩおよびＸｂａＩによりプラスミドｐＣＲ-
Ｄ２から切断される。ライゲーションの後、この配合物
を、菌株Ｅ．コリＤＨ５αｍｃｒ中にエレクトロポレー
ションした。選択はカナマイシン５０μｇ／ｍｌを有す
るＬＢ−寒天培地上で行った。このようにして得られた
形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、制限エンド
ヌクレアーゼＳａｃＩおよびＸｂａＩで切断し、引き続
き、このフラグメントをアガロースゲル電気泳動により
検査した。このように構成されたプラスミドをｐＸＴ−
ｐａｎＤと命名し、図２中に示した。
Ｄ２のＤＮＡは形質転換体から常法により単離され、制
限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化さ
れ、かつ同様に切断されたベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
中にライゲーションされた。ｐａｎＤコード領域中に存
在する第二のＸｂａＩ−切断位はＥ．コリ宿主Ｔｏｐ１
０Ｆ′中でメチル化されて存在するので、この切断位は
切断されず、従って、この遺伝子は無傷で、側面に位置
するＳａｃＩおよびＸｂａＩによりプラスミドｐＣＲ-
Ｄ２から切断される。ライゲーションの後、この配合物
を、菌株Ｅ．コリＤＨ５αｍｃｒ中にエレクトロポレー
ションした。選択はカナマイシン５０μｇ／ｍｌを有す
るＬＢ−寒天培地上で行った。このようにして得られた
形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、制限エンド
ヌクレアーゼＳａｃＩおよびＸｂａＩで切断し、引き続
き、このフラグメントをアガロースゲル電気泳動により
検査した。このように構成されたプラスミドをｐＸＴ−
ｐａｎＤと命名し、図２中に示した。
【００４８】実施例４ パントテン酸−生産性ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／
ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃ、ｐＸＴ−ｐａｎＤの製造 実施例３中に記載したプラスミドｐＸＴ−ｐａｎＤを
Ｃ．グルタミクム株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐ
ＶＷＥｘ１ｐｙｃ中にエレクトロポレーションした。テ
トラサイクリン１０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５
μｇ／ｍｌを補充されたＬＢ−寒天培地上で３０℃で２
日間の選択後に、菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／
ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃ、ｐＸＴ−ｐａｎＤが得られた。
ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃ、ｐＸＴ−ｐａｎＤの製造 実施例３中に記載したプラスミドｐＸＴ−ｐａｎＤを
Ｃ．グルタミクム株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐ
ＶＷＥｘ１ｐｙｃ中にエレクトロポレーションした。テ
トラサイクリン１０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５
μｇ／ｍｌを補充されたＬＢ−寒天培地上で３０℃で２
日間の選択後に、菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／
ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃ、ｐＸＴ−ｐａｎＤが得られた。
【００４９】実施例５ パントテン酸の製造 Ｃ．グルタミクム株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐ
ＶＷＥｘ１ｐｙｃ、ｐＸＴ−ｐａｎＤおよびＡＴＣＣ１
３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＸＴ−ｐａｎＤによるパントテ
ネートの製造を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、イ
ソロイシン２ｍＭおよび菌株ＡＴＣＣ１３０３２Δｉｌ
ｖＡ／ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃ、ｐＸＴ−ｐａｎＤの場合は
付加的にカナマイシン２５μｇ／ｍｌが補充されてい
る、培地ＣＧＸＩＩ（Keilhauer et al., 1993, Journa
l of Bacteriology, 175: 5595-5603; 表 2）中で試験
した。
ＶＷＥｘ１ｐｙｃ、ｐＸＴ−ｐａｎＤおよびＡＴＣＣ１
３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＸＴ−ｐａｎＤによるパントテ
ネートの製造を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、イ
ソロイシン２ｍＭおよび菌株ＡＴＣＣ１３０３２Δｉｌ
ｖＡ／ｐＶＷＥｘ１ｐｙｃ、ｐＸＴ−ｐａｎＤの場合は
付加的にカナマイシン２５μｇ／ｍｌが補充されてい
る、培地ＣＧＸＩＩ（Keilhauer et al., 1993, Journa
l of Bacteriology, 175: 5595-5603; 表 2）中で試験
した。
【００５０】この培地を、以降Ｃ．グルタミクムテスト
培地と命名する。新たに配合したＣ．グルタミクムテス
ト培地それぞれ５０ｍｌに同じ培地で１６時間経過した
予培地を、培養懸濁液の光学密度（ＯＤ580）がインキ
ュベーション開始時に０.１であるように接種した。こ
の培地を３０℃で１３０ｒｐｍで培養した。５時間のイ
ンキュベーションの後ＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ
−チオガラクトシド）を最終濃度が１ｍＭとなるように
添加した。４８時間のインキュベーションの後、培地の
光学密度（ＯＤ580）を測定し、かつ引き続き細胞を５
０００ｇで１０分間遠心分離することにより除去し、上
澄みを滅菌濾過した。
培地と命名する。新たに配合したＣ．グルタミクムテス
ト培地それぞれ５０ｍｌに同じ培地で１６時間経過した
予培地を、培養懸濁液の光学密度（ＯＤ580）がインキ
ュベーション開始時に０.１であるように接種した。こ
の培地を３０℃で１３０ｒｐｍで培養した。５時間のイ
ンキュベーションの後ＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ
−チオガラクトシド）を最終濃度が１ｍＭとなるように
添加した。４８時間のインキュベーションの後、培地の
光学密度（ＯＤ580）を測定し、かつ引き続き細胞を５
０００ｇで１０分間遠心分離することにより除去し、上
澄みを滅菌濾過した。
【００５１】光学密度を測定するためには、ファルマシ
ア社（Firma Pharmacia: Freiburg,Deutschland）のＮ
ｏｖａｓｐｅｃＩＩフォトメータを測定波長５８０ｎｍ
で使用した。
ア社（Firma Pharmacia: Freiburg,Deutschland）のＮ
ｏｖａｓｐｅｃＩＩフォトメータを測定波長５８０ｎｍ
で使用した。
【００５２】培養上澄み中のＤ−パントテネートの定量
は、ディフコ社（DIFCO MANUAL, 10th Edition, 1100-1
102; Michigan, USA）のハンドブックの記載に従って、
ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus planta
rum）ＡＴＣＣ８０１４を用いて行われた。検定のため
にはシグマ社（Firma Sigma: Deisenhofen, Deutschlan
d）のパントテネートのヘミカルシウム塩を使用した。
は、ディフコ社（DIFCO MANUAL, 10th Edition, 1100-1
102; Michigan, USA）のハンドブックの記載に従って、
ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus planta
rum）ＡＴＣＣ８０１４を用いて行われた。検定のため
にはシグマ社（Firma Sigma: Deisenhofen, Deutschlan
d）のパントテネートのヘミカルシウム塩を使用した。
【００５３】結果を表３に示した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
【表３】
【図１】プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａの制限地図を示
す図。塩基対数の記載は、再現性の範囲において得られ
る概略値である。
す図。塩基対数の記載は、再現性の範囲において得られ
る概略値である。
【図２】プラスミドｐＸＴ−ｐａｎＤの制限地図を示す
図。塩基対数の記載は、再現性の範囲において得られる
概略値である。
図。塩基対数の記載は、再現性の範囲において得られる
概略値である。
使用した省略形および記号は以下の意味を示す： ′ｌａｃｚ ｌａｃＺα遺伝子フラグメントの３′−末
端 ｌａｃＩｑ ｌａｃリプレッサー遺伝子のｌａｃＩｑ対
立遺伝子 ｌａｃＺ′ ｌａｃＺα遺伝子フラグメントの５′−末
端 ｏｒｉＶ 複製起点Ｖ ｐａｎＤ アスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子 ｐｅｒ コピー数を制御する遺伝子 Ｐｔｒｃ ｔｒｃプロモータ ｒｅｐ Ｃ．グルタミクムの複製領域 Ｔ１ 転写ターミネーターＴ１ Ｔ２ 転写ターミネーターＴ２ Ｔｅｔ テトラサイクリン耐性遺伝子 ＢａｍＨＩ 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位 ＤｒａＩ 制限酵素ＤｒａＩの切断部位 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 ＥｃｏＲＶ 制限酵素ＥｃｏＲＶの切断部位 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位 ＫｐｎＩ 制限酵素ＫｐｎＩの切断部位 ＮｄｅＩ 制限酵素ＮｄｅＩの切断部位 ＮｏｔＩ 制限酵素ＮｏｔＩの切断部位 ＮｒｕＩ 制限酵素ＮｒｕＩの切断部位 ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩの切断部位 ＳａｃＩ 制限酵素ＳａｃＩの切断部位 ＳａｌＩ 制限酵素ＳａｌＩの切断部位 ＳｍａＩ 制限酵素ＳｍａＩの切断部位 ＸｂａＩ＊＊ メチル化された切断部位ＸｂａＩ ＸｂａＩ 制限酵素ＸｂａＩの切断部位
端 ｌａｃＩｑ ｌａｃリプレッサー遺伝子のｌａｃＩｑ対
立遺伝子 ｌａｃＺ′ ｌａｃＺα遺伝子フラグメントの５′−末
端 ｏｒｉＶ 複製起点Ｖ ｐａｎＤ アスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子 ｐｅｒ コピー数を制御する遺伝子 Ｐｔｒｃ ｔｒｃプロモータ ｒｅｐ Ｃ．グルタミクムの複製領域 Ｔ１ 転写ターミネーターＴ１ Ｔ２ 転写ターミネーターＴ２ Ｔｅｔ テトラサイクリン耐性遺伝子 ＢａｍＨＩ 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位 ＤｒａＩ 制限酵素ＤｒａＩの切断部位 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 ＥｃｏＲＶ 制限酵素ＥｃｏＲＶの切断部位 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位 ＫｐｎＩ 制限酵素ＫｐｎＩの切断部位 ＮｄｅＩ 制限酵素ＮｄｅＩの切断部位 ＮｏｔＩ 制限酵素ＮｏｔＩの切断部位 ＮｒｕＩ 制限酵素ＮｒｕＩの切断部位 ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩの切断部位 ＳａｃＩ 制限酵素ＳａｃＩの切断部位 ＳａｌＩ 制限酵素ＳａｌＩの切断部位 ＳｍａＩ 制限酵素ＳｍａＩの切断部位 ＸｂａＩ＊＊ メチル化された切断部位ＸｂａＩ ＸｂａＩ 制限酵素ＸｂａＩの切断部位
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (71)出願人 500417627 インスティトゥート フュア イノヴェイ ションズトランスファー アン デア ウ ニヴェルジテート ビーレフェルト ゲゼ ルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト ウニ ヴェルジテーツシュトラーセ 25 (72)発明者 ニコレ ドゥーシュ ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アム ポッゲンポール 38 (72)発明者 ゲオルク ティーアバッハ ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト グン ストシュトラーセ 21
Claims (13)
- 【請求項１】 ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ番号
６.４.１.１.）をコードするヌクレオチド配列（ｐｙｃ
−遺伝子）が強化されている、特に過剰発現されてい
る、細菌を使用することを特徴とする、コリネフォルム
細菌の発酵によるＤ−パントテン酸の製法。 - 【請求項２】 Ｄ−パントテン酸の生合成経路の他の遺
伝子が付加的に強化される細菌を使用する、請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 Ｄ−パントテン酸の形成を減少させる代
謝経路が少なくとも部分的に遮断されている細菌を使用
する、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 プラスミドベクターで形質転換した菌株
を使用し、かつこのプラスミドベクターがピルビン酸カ
ルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を有す
る、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 プラスミドｐＶＷＥｘ１ｐｙｃで形質転
換した細菌を使用する、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコ
ードするｐａｎＤ−遺伝子を同時に強化する、請求項１
記載の方法。 - 【請求項７】 ケトパントテン酸ヒドロキシメチルトラ
ンスフェラーゼをコードするｐａｎＢ−遺伝子を同時に
強化する、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 パントテン酸シンテターゼをコードする
ｐａｎＣ−遺伝子を同時に強化する、請求項１記載の方
法。 - 【請求項９】 ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコード
するｉｌｖＤ−遺伝子を同時に強化する、請求項１記載
の方法。 - 【請求項１０】 すでにＤ−パントテン酸を生産するコ
リネフォルム細菌中で前記遺伝子を強化する、請求項１
から９までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】 次の工程： ａ）少なくともピルビン酸カルボキシラーゼをコードす
る遺伝子がその中で強化される、Ｄ−パントテン酸を生
産する細菌の発酵、 ｂ）培地中または細菌の細胞中でのＤ−パントテン酸の
富化、および ｃ）生産したＤ−パントテン酸の単離、 を実施する、請求項１から１０項までのいずれか１項記
載のＤ−パントテン酸の発酵的製法。 - 【請求項１２】 ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ番
号６.４.１.１.）をコードするヌクレオチド配列（ｐｙ
ｃ−遺伝子）が強化されている、特に過剰発現されてい
る、コリネフォルム細菌。 - 【請求項１３】 ＤＳＭＺ（ブラウンシュバイク在）に
寄託番号ＤＳＭ１２８９３で寄託されたコリネバクテリ
ウム・グルタミクムＤＧ５２−５／ｐＶＷＥｘ１ｐｙ
ｃ。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19943055.1 | 1999-09-09 | ||
| DE19943055 | 1999-09-09 | ||
| DE10031999.8 | 2000-06-30 | ||
| DE10031999A DE10031999A1 (de) | 1999-09-09 | 2000-06-30 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001112489A true JP2001112489A (ja) | 2001-04-24 |
Family
ID=26006246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000270569A Pending JP2001112489A (ja) | 1999-09-09 | 2000-09-06 | コリネフォルム細菌を使用するｄ−パントテン酸の発酵的製法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1083225A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001112489A (ja) |
| KR (1) | KR20010050399A (ja) |
| CN (1) | CN1288061A (ja) |
| BR (1) | BR0004000A (ja) |
| HU (1) | HUP0003550A2 (ja) |
| ID (1) | ID27240A (ja) |
| IL (1) | IL138316A0 (ja) |
| MX (1) | MXPA00008822A (ja) |
| SK (1) | SK13202000A3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004325688A (ja) * | 2003-04-23 | 2004-11-18 | Toyota Motor Corp | 音声認識システム |
Families Citing this family (6)
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|---|---|---|---|---|
| DE19855313A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen |
| DE19855314A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentiven Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE10026758A1 (de) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung corymeformer Bakterien |
| DE102005048818A1 (de) * | 2005-10-10 | 2007-04-12 | Degussa Ag | Mikrobiologische Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure |
| DE102010032484A1 (de) | 2010-07-28 | 2012-02-02 | Evonik Goldschmidt Gmbh | Zellen und Verfahren zur Herstellung von Rhamnolipiden |
| KR20240118943A (ko) * | 2023-01-27 | 2024-08-06 | 씨제이제일제당 (주) | 글루타미시박터 할로피토콜라 유래 판토에이트-베타-알라닌 리가아제의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19831609B4 (de) * | 1997-10-04 | 2009-11-12 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel |
-
2000
- 2000-09-01 EP EP00118935A patent/EP1083225A1/de not_active Withdrawn
- 2000-09-04 SK SK1320-2000A patent/SK13202000A3/sk unknown
- 2000-09-05 BR BR0004000-2A patent/BR0004000A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-09-06 JP JP2000270569A patent/JP2001112489A/ja active Pending
- 2000-09-07 IL IL13831600A patent/IL138316A0/xx unknown
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- 2000-09-08 KR KR1020000053400A patent/KR20010050399A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-09-08 ID IDP20000765D patent/ID27240A/id unknown
- 2000-09-08 HU HU0003550A patent/HUP0003550A2/hu unknown
- 2000-09-08 MX MXPA00008822A patent/MXPA00008822A/es unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004325688A (ja) * | 2003-04-23 | 2004-11-18 | Toyota Motor Corp | 音声認識システム |
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| IL138316A0 (en) | 2001-10-31 |
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