JP2000350580A - Ｌ−アミノ酸の製法 - Google Patents

Ｌ−アミノ酸の製法

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JP2000350580A JP2000153549A JP2000153549A JP2000350580A JP 2000350580 A JP2000350580 A JP 2000350580A JP 2000153549 A JP2000153549 A JP 2000153549A JP 2000153549 A JP2000153549 A JP 2000153549A JP 2000350580 A JP2000350580 A JP 2000350580A
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ティルク イヴォンネ
Bernd Eikmanns
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ザーム ヘルマン
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メッケル ベッティーナ
Walter Dr Pfefferle
プフェッファーレ ヴァルター
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Forschungszentrum Juelich GmbH
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 改良されたコリネフォルム細菌を使用するＬ
−アミノ酸の発酵的製法。 【解決手段】 コリネフォルム細菌の使用下にＬ−アミ
ノ酸を発酵的に製造する方法において、このコリネフォ
ルム細菌中で酵素アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ
の、ビオチン−カルボキシル−キャリヤータンパク質−
ドメインおよびビオチン−カルボキシラーゼ−ドメイン
を有するサブユニットをコードするヌクレオチド配列
（ａｃｃＢＣ）が強化され、特に過剰発現される製法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の課題はａｃｃＢＣ−
遺伝子が強化されたコリネフォルム細菌の使用下にＬ−
アミノ酸、特にＬ−リシンを発酵的に製造する方法であ
る。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンは動物飼
料中、ヒト医学および医薬産業に適用を見いだす。
【０００３】これらのアミノ酸をコリネフォルム細菌
株、特にコリネバクテリウム・グルタミクムの発酵によ
り、アミノ酸を製造することは、公知である。その重要
性のために、その製法は常に改良されている。方法の改
良は、発酵技術上の措置、例えば攪拌および酸素の供
給、または培地の組成、例えば発酵の間の糖濃度、また
は生成物の形への処理、例えばイオン交換クロマトグラ
フィーによる処理、または微生物自体の本来の能力特性
に関する。
【０００４】この微生物の能力特性の改良のためには突
然変異誘発、選択および突然変異体選択の方法が適用さ
れる。この方法により、代謝拮抗物質、例えばリシン−
アナログであるＳ−（２−アミノエチル）−システイン
に対して耐性であるか、または制御に重要なアミノ酸に
関して栄養要求性であり、かつＬ−アミノ酸を生産する
菌株が得られる。
【０００５】ここ数年、コリネバクテリウム・グルタミ
クムのＬ−アミノ酸生産性菌株を菌株改良するための組
み換えＤＮＡ−技術の方法も同様に使用され、その際個
々のアミノ酸−生合成遺伝子を増幅し、かつＬ−アミノ
酸生産に対する効果を調べた。これに関する概要を示す
文献は、特にキノシタ（“Glutamic Acid Bacteria”,i
n:Biology of Industrial Microorganisms, Demain and
Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 19
85, 115-142）、ヒリガー（Hilliger; BioTec2, 40-44
(1991)）、エッゲリング（Eggeling; Amino Acids 6, 2
61-272 (1994)）、ジェッテンおよびシンスキー（Jette
n and Sinskey; Critical Reviews inBiotecnology 15,
73-103 (1995)）およびザーム等（Sahm et al. ; Annu
als ofthe New York Academy of Science 782, 25-39
(1996)）に記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、Ｌ−
アミノ酸、特にＬ−リシンの発酵による製造を改善する
ための新規手段を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−
リシンは動物飼料、ヒト医学および医薬産業に使用され
る。従って、この化合物を製造するための新規改善され
た方法を確立することは一般的に興味が持たれている。
【０００８】以下に、Ｌ−リシンまたはリシンという記
載がある場合は、これは塩基だけを表すのではなく、例
えばリシン−モノ塩酸塩またはリシン−硫酸塩の様な塩
をも表す。
【０００９】本発明の課題は、コリネフォルム細菌の使
用下にＬ−アミノ酸、特にＬ−リシンを発酵的に製造す
る方法であり、このコリネフォルム細菌は所望のアミノ
酸をすでに生産し、その中で酵素アセチル−ＣｏＡカル
ボキシラーゼの、ビオチン−カルボキシル−キャリヤー
タンパク質−ドメインおよびビオチン−カルボキシラー
ゼ−ドメインを有するサブユニットをコードするヌクレ
オチド配列（ａｃｃＢＣ）が強化され、特に過剰発現さ
れる。
【００１０】有利な実施形は請求の範囲に記載されてい
る。
【００１１】概念“強化”とはここでは、例えば１つま
たは複数の遺伝子のコピー数を上昇させるか、強力なプ
ロモーターを使用するか、または高い活性を有する相応
する酵素をコードする遺伝子を使用するか、または場合
によりこれらの処置を組み合わせることにより、微生物
中の相応するＤＮＡをコードする１種以上の酵素の細胞
内活性の上昇を記載している。
【００１２】本発明の課題である微生物は、Ｌ−アミノ
酸、特にＬ−リシンをグルコース、サッカロース、ラク
トース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、
セルロースから、またはグリセリンおよびエタノールか
ら製造することができる。代表的なものはコリネフォル
ム細菌、特にコリネバクテリウム属の細菌である。コリ
ネバクテリウム属においては、特に該分野においてＬ−
アミノ酸を生産することが知られている、コリネバクテ
リウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）
種を挙げることができる。
【００１３】コリネバクテリウム属の好適な菌株、特に
コリネバクテリウム・グルタミクム種の菌株は、公知野
生菌株 コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Corynebact
erium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム（Brevibac
terium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９および ブレビバクテリウム・ディバリカツム（Brevibacterium
divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０ およびこれらから製造した、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リ
シンを生産する突然変異体もしくは菌株、例えば コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ１７
０９ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ１７１２ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ６４６３
および ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ６４６４ である。
【００１４】ａｃｃＢＣ−遺伝子はビオチン−カルボキ
シル−キャリヤー蛋白質−ドメインおよびビオチン−カ
ルボキシラーゼ−ドメインを有する、アセチル−ＣｏＡ
カルボキシラーゼのサブユニットをコードする。コリネ
バクテリウム・グルタミクムのａｃｃＢＣ−遺伝子のヌ
クレオチド配列はイェーガー等（Jaeger et al. ; Arch
ives of Microbiology 166, 76-82 (1996)）により決定
され、かつＥＭＢＬ（European Molecular Biology Lab
oratories; Heidelberg, Deutschland）のデータバンク
において、アクセスナンバーＵ３５０２３で一般に入手
可能である。
【００１５】イェーガー等（Jaeger et al. ; Archives
of Microbiology 166, 76-82 (1996)）により記載され
たＣ.グルタミクムからのａｃｃＢＣ−遺伝子を本発明
において使用することができる。さらにａｃｃＢＣ−遺
伝子の対立遺伝子を使用することもでき、これは遺伝子
コードの同義性からまたは機能的に中性のセンス突然変
異により生じる。
【００１６】過剰発現の達成のためには、相応する遺伝
子のコピー数を上昇させるか、または構造遺伝子の上流
に存在するプロモーター領域および制御領域またはリボ
ソーム結合位を突然変異させることができる。同様にし
て構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットに作用
する。誘導可能なプロモーターにより、付加的に発酵的
Ｌ−リシン−生産の過程において発現を上昇させること
も可能である。ｍ−ＲＮＡの寿命を長くする処置によっ
ても同様に発現は改善する。さらに、酵素タンパク質の
分解を阻止することにより同様に酵素活性は強化され
る。遺伝子または遺伝子構成体はプラスミド中に異なる
コピー数で存在するか、または染色体中に組み込まれ、
かつ増幅されていてよい。さらに、該当する遺伝子の過
剰発現は培地の組成および培養操作の変更により達成す
ることもできる。
【００１７】これに関する教示は、特にマルチン等（Ma
rtin et al.; Bio/Technology 5, 137-146 (1987)）に
より、グエレロ等（Guerrero et al.; Gene 138, 35-41
(1994)）により、ツチヤおよびモリナガ（Bio/Technol
ogy 6, 428-430 (1988)）により、エイクマンズ等（Eik
manns et al. Gene 102, 93-98(1991)）により、ヨーロ
パ特許明細書ＥＰ−Ｂ−０４７２８６９号中に、米国特
許第４６０１８９３号明細書中に、シュバルツアーおよ
びピューラー（Schwarzer and Puehler; Bio/Technolog
y 9, 84-87 (1991)）により、ラインシャイド等（Reins
cheid et al.;Applied and Environmental Microbiolog
y 60, 126-132(1994)）により、ラバレ等（Labarre et
al.; Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(199
3)）により、特許出願ＷＯ９６／１５２４６中に、マル
ンブレス等（Malumbres et al.; Gene 134, 15-24 (199
3)）により、特開平１０−２２９８９１号公報中に、ヤ
ンセンおよびハマー（Jansen and Hammer ;Biotechnolo
gy and Bioengineering 58,191-195 (1998)）により、
マクリデス（Makrides; Microbiological Reviews 60:
512-538 (1996)）により、および遺伝子学および分子生
物学の公知教科書中に、記載されている。
【００１８】ａｃｃＢＣ−遺伝子を過剰発現するために
用いるプラスミドの例は、ｐＺ１ａｃｃＢＣ（図１）で
あり、これは菌株ＭＨ２０−２２Ｂ／ｐＺ１ａｃｃＢＣ
中に含有されている。プラスミドｐＺ１ａｃｃＢＣはプ
ラスミドｐＺ１（Menkel etal., Applied and Environm
ental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)）を基礎と
する、ａｃｃＢＣ−遺伝子を有するＥ.コリ−Ｃ.グルタ
ミクムシャトルベクターである。
【００１９】さらに、ａｃｃＢＣの他に相応する生合成
経路の１種以上の酵素を過剰発現することも、Ｌ−アミ
ノ酸の生産のために有利である。従って、例えばＬ−リ
シンの製造の際には、 ・ジヒドロジピコリネートシンターゼをコードするｄａ
ｐＡ−遺伝子を同時に過剰発現する（ＥＰ−Ｂ−０１９
７３３５）、または ・Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン−耐性を仲介
するＤＮＡ−フラグメントを同時に増幅する（ＥＰ−Ａ
−００８８１６６）、ことができる。
【００２０】さらに、ａｃｃＢＣ−遺伝子の過剰発現と
ともに、不所望な副反応を排除することも、Ｌ−アミノ
酸の生産に有利であろう（ナカヤマ：“Breeding of Am
inoAcid Producing Micro-organisms”, in: Overprodu
stion of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta,Ve
nek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982）。
【００２１】本発明により製造した微生物は、Ｌ−アミ
ノ酸の生産のために、バッチでの連続的にまたは非連続
的方法で（バッチ法培養）または供給バッチ法（供給
法）または繰り返し供給バッチ法（繰り返し供給法）で
培養することができる。公知培養法に関する概要は、ク
ミールの教科書（Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfu
ehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1991)）またはストルハスの教科
書（Storhas: Bioraktoren und periphere Einrichtung
en (Vieweg Verlag, Braunsheweig/Wiesbaden, 1994)）
に記載されている。
【００２２】使用されるべき培地は、それぞれの菌株の
要求を好適な方法で満たさなければならない。種々の微
生物の培地に関しては参考書“Manual of Methods for
General Bacteriology”（American Sodiety for Bacte
riology (Washington D.C. ,USA, 1981)）に記載されて
いる。炭素源としては糖および炭水化物、例えばグルコ
ース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マル
トース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油脂、例え
ば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびやし油、および
脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノ
ール酸、アルコール、例えばグリセリンおよびエタノー
ルおよび有機酸、例えば酢酸を使用することができる。
これらの物質は個々にまたは混合物として使用すること
ができる。窒素源としては有機窒素含有化合物、例えば
ペプトン、酵母エキス、肉汁エキス、麦芽エキス、トウ
モロコシ膨潤水、大豆粉および尿素または有機化合物、
例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム
を使用することができる。この窒素源を個別にまたは混
合物として使用することができる。燐源としては、リン
酸二水素カリウムまたはリン酸一水素二カリウムまたは
これに相当するナトリウム含有塩を使用することができ
る。さらに、培地は成長に必要な金属の塩、例えば硫酸
マグネシウムまたは硫酸鉄を含有しなければならない。
最後に、必須の生長物質、例えばアミノ酸およびビタミ
ンを前記物質に加えて使用することができる。さらに、
これに加えて好適な前駆物質を培地に添加することがで
きる。前記添加物質は一回の配合物の形で添加すること
も、または好適な方法で培養の間供給することもでき
る。
【００２３】培地のｐＨ−制御のために、塩基性化合
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアまたは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸を好適
な方法で使用する。泡形成の制御のために、消泡剤、例
えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することもで
きる。プラスミドの安定化の維持のためにも、培地に好
適な選択的に作用する物質、例えば抗生物質を添加する
ことができる。好気的条件を維持するためには、酸素ま
たは酸素含有混合物、例えば空気を培地中に導入する。
培地の温度は通常２０〜４５℃であり、有利に２５〜４
０℃である。培養は、所望のＬ−アミノ酸の最大量が形
成されるまで続ける。この目的は通常１０〜１６０時間
で達成される。
【００２４】Ｌ−アミノ酸の分析は、アニオン交換クロ
マトグラフィー、および引き続きニンヒドリンでの誘導
体化により行われ、この方法はスパックマン等により
（Spackman et al. : Analytical Chemistry, 30, (195
8), 1190）記載されているように実施することができ
る。
【００２５】コリネバクテリウム・グルタミクム菌株Ｄ
ＳＭ５７１５／ｐＺ１ａｃｃＢＣは寄託番号ＤＳＭ１２
７８６で、ドイツ微生物および培養保存機関（Deutsche
n Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen :
Braunschweig, Deutschland）にブタペスト条約に基づ
いて寄託されている。
【００２６】本発明による方法は、コリネフォルム細菌
を用いてＬ−アミノ酸、特にＬ−アスパラギン酸、Ｌ−
アスパラギン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−
イソロイシンおよびＬ−メチオニンの、特にＬ−リシン
の、発酵による製造に使用される。
【００２７】
【実施例】次に、本発明を実施例につき詳細に説明す
る。
【００２８】この目的のために、Ｌ−リシンを生産する
菌株ＤＳＭ５７１５（ＥＰ−Ｂ−０４３５１３２）を用
いて実験を実施し、請求した方法が優れていることを示
す： 実施例１ 発現プラスミドｐＺ１ａｃｃＢＣおよび菌株ＤＳＭ５７
１５／ｐＺ１ａｃｃＢＣの製造 発現プラスミドｐＺ１ａｃｃＢＣの製造のためには、ａ
ｃｃＢＣ−遺伝子を含有するプラスミドｐＷＪ７１（Ja
eger et al., Archives of Microbiology (1996) 166 :
76-82）を制限酵素ＰvｕＩおよびＮａｅＩで消化し、
引き続きクレノウ−ポリメラーゼおよびアルカリ性ホス
ファターゼで処理した。アガロースゲルから、サムブル
ック等（Sambrook et al. : Molecular Cloning a Labo
ratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laborator
ies）により記載されているように、大きさ２.１ｋbｐ
のａｃｃＢＣ−遺伝子を有するＤＮＡ−フラグメントを
調製的単離により単離した。ａｃｃＢＣ−遺伝子の製造
に平行して、プラスミドｐＺ１（Menkel et al. , Appl
ied and Environmental Microbiology 55 (3), 684-688
(1989)）を制限酵素ＳｃａＩで消化し、かつ引き続き
同様にクレノウ−ポリメラーゼおよびアルカリ性ホスフ
ァターゼで処理した。調製したａｃｃＢＣ−遺伝子およ
び前記のように処理したベクターｐＺ１を連結し、菌株
ＤＳＭ５７１５をリーベル等（Liebl et al.: FEMS Mic
robiology Letters 65, 299-304 (1989)）により記載さ
れているように連結反応混合物で形質転換した。形質転
換体の選択は、カナマイシン５０ｍｇ／ｌを添加したメ
ルク社（Darmstadt, Deutschland）の脳−心臓−寒天上
で行った。選択された形質転換体は菌株ＤＳＭ５７１５
／ｐＺ１ａｃｃＢＣと命名された。発現プラスミドｐＺ
１ａｃｃＢＣの制限地図を図１中に示した。
【００２９】実施例２ Ｌ−リシンの製造 菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＺ１ａｃｃＢＣを、カナマイシ
ン５０μｇ／ｍｌを添加した完全培地ＣｇＩＩＩ（Kase
& Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry
36 (9) 1611-1621 (1972)）中で予備培養した。このた
めにはじゃま板４枚を有する１００ｍｌ三角フラスコ中
に含有された、培地ＣｇＩＩＩ １０ｍｌをこの菌株の
接種物で接種し、この培養物を２４０ｒｐｍおよび３０
℃で１６時間培養した。
【００３０】じゃま板４枚を備える１００ｍｌ三角フラ
スコ中に含有された、生産培地１０ｍｌを接種するため
に、予備培地のＯＤ（６６０ｎｍ）を測定した。生産培
地を含有する主培養をＯＤ０.１に接種した。生産培地
としてはカイルハウアー等（Keilhauer et al.）により
記載された培地ＣｇＸＩＩを使用した（Journal of Bac
teriology 175: 5595-5603 (1993)）。グルコース４％
および硫酸カナマイシン５０ｍｇ／ｌを添加した。細胞
を３３℃、２５０ｒｐｍおよび８０％空中湿度で４８時
間恒温保持した。
【００３１】菌株ＤＳＭ５７１５を用いる方法において
は、相応する培地は全くカナマイシンを含有しない。
【００３２】引き続き、６６０ｎｍの光学密度および生
じたＬ−リシンの濃度をEppendorf-BioTronik社（Hambu
rg, Deutschland）のアミノ酸分析機でイオン交換クロ
マトグラフィーおよびカラム後反応によりニンヒドリン
検出で測定した。表１中には実験の結果を示す。
【００３３】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＺ１ａｃｃＢＣの制限地図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｅ 13/08 13/08 Ａ Ｃ 13/12 13/12 Ａ 13/20 13/20 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:15） (71)出願人 599000142 フォルシュングスツェントルム ユーリッ ヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレン クテル ハフツング ドイツ連邦共和国ユーリッヒ （番地な し) (72)発明者 イヴォンネ ティルク ドイツ連邦共和国 メットマン ハイデヴ ェーク 17 (72)発明者 ベルント アイクマンス ドイツ連邦共和国 ウルム グライセルシ ュテッテン 49 (72)発明者 ローター エッゲリング ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ エルゼン カンプ ６ (72)発明者 ヘルマン ザーム ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ヴェンデ リヌスシュトラーセ 71 (72)発明者 ベッティーナ メッケル ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト ミッ テルシュトラーセ 15 (72)発明者 ヴァルター プフェッファーレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 コリネフォルム細菌の発酵によりＬ−ア
    ミノ酸を製造する方法において、ａｃｃＢＣ−遺伝子を
    コードするかまたはこれを有するヌクレオチド配列をそ
    の中で強化した、特に過剰発現する細菌を使用すること
    を特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製法。
  2. 【請求項２】 所望のＬ−アミノ酸の生合成経路のその
    他の遺伝子をさらにその中で強化した細菌を使用する、
    請求項１記載の製法。
  3. 【請求項３】 所望のＬ−アミノ酸の形成を低下させる
    代謝経路がその中で少なくとも部分的に遮断されている
    細菌を使用する、請求項１記載の製法。
  4. 【請求項４】 プラスミドベクターで形質転換した菌株
    を使用し、かつこのプラスミドベクターがａｃｃＢＣ−
    遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項
    １から３までのいずれか１項記載の製法。
  5. 【請求項５】 コリネバクテリウム・グルタミクム中
    で、寄託番号ＤＳＭ１２７８６で寄託され、図１に示し
    たプラスミドベクターｐＺ１ａｃｃＢＣで形質転換した
    細菌を使用する、請求項４記載の製法。
  6. 【請求項６】 Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギ
    ン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシ
    ンまたはＬ−メチオニンを製造するコリネフォルム細菌
    を使用する、請求項１から５までのいずれか１項記載の
    製法。
  7. 【請求項７】 Ｌ−リシンを製造するコリネフォルム細
    菌を使用する、請求項１から５までのいずれか１項記載
    の製法。
  8. 【請求項８】 ジヒドロジピコリネートシンターゼをコ
    ードするｄａｐＡ−遺伝子を同時に過剰発現する、請求
    項７記載の製法。
  9. 【請求項９】 Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン
    −耐性を仲介するＤＮＡ−フラグメントを同時に増幅す
    る、請求項７記載の製法。
  10. 【請求項１０】 次の工程：ａ）少なくともａｃｃＢＣ
    −遺伝子がその中で強化されている、所望のＬ−アミノ
    酸を生産する細菌の発酵、 ｂ）培地中または細菌の細胞中でのＬ−アミノ酸の富
    化、および ｃ）生産したＬ−アミノ酸の単離 を実施する、請求項１から９までのいずれか１項記載の
    Ｌ−アミノ酸の発酵的製法。
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