JPS58126789A - レースレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子のｗｒ規形質発現方法に関する。

さらに詳細には本発明は少なくとも一種の遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターＤ）ＪＡとの組換え体で、かつ絢
ＤＮＡの少なくとも一方が宿主菌株に対して外来性であ
る組換え体ＤＮＡを用いコリネバタテリウム属またはプ
レビパクテリクム属ＫｊＫする微生物から選ばれる宿主
菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地に培養し
、腋遺伝子の形質を発現せしめることを％黴とする遺伝
子の形質発現方法に関する。

組みかえ遺伝子技法は大腸菌を宿主として確立され、現
在までにソマトスタチン、インシュリン、ヒト生長ホル
モン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロ
ン−β、口蹄病ワクチンなどのベプタイドやワタテンな
どの製造が可能であることが示された。生部活性０Ｉｌ
ｉいこれらペプタイドやワクチンの発現の１主として大
腸菌は多くの場合十分であると考えられるが、畜らＫＡ
い主意性、１体外への分添、ダリコシル化を求めあるい
祉曹体内毒素ＯＳ人を避けるため、酵母中枯草菌など４
１１主として一発畜れて自ている。

ベプタイド、蛋白質などｏＭＥｓ＠性物質を生物質る場
合は、上記のごとく既に組換えＤＮ人技法が確立されて
いるか、その基礎が整っている菌株を利用すればよいが
、アミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物質などの物質の工
業的生産性の向上を組換えＤＮ人技法により行う場合に
は、同技法ｔ−従来使用されているそれぞれの生ｗｉｌ
ＩＩＫ適用する工夫が必要である。

コリネパタテリウム・グルタミタムは微生物によるアミ
ノ酸の工業的製造に最初に用いられ九黴生物で、以後コ
リネバタテリウム属を含むコリネ７オルムバクテリアに
よるグルタミ／ｌｌｌ、リジン、アラニン、ヒスデジ／
、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニ／、スレ
オニン、インロイシン、バリン、ロイシン、ダルタｉン
、グロリン、アルギニノなどのアミノ＠０工業的生童が
開発され、今日では殆んどのアミノｗｔＦ′ｉ微生物に
より生産されるに全りている。

従ってこれら微生物におけ６組換えＤＮ人技法Ｏ１［立
は、４ｒ後アミノ酸生童の向上のために極めて１賛であ
ると考えられゐ。

組換えＤＮＡ技法は、例えば （１）制限−素による目的遺伝子を含むＤＮＡの断片化 （２）−一制一陣素によるベクターＤＮＡの単一切断に
よる直鎖状化 （３）　　上記ｆｉＬ　ｉ−の生成物の混合によるアニ
ーリングとＤＮＡリガーゼを用いる連結による組換えＤ
ＮＡの作成 （４）上記組換えＤＮＡ０宿主曹株への導入（形質転換
） 俸）目的遺伝子を含む組換え体の選択とｉｓ！Ｐされた
タローンの純化 の各段階よシなる。かくして得られる組換え株の造成Ｏ
効率は、上記各段階の積ともいうべきもので各段階を検
証する手段を準備し、各段階の効率を知多これを向上す
ることなしには目的遺伝子の発現可能な形質転換株を得
ることができない、を九このようにして目的遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを有する形質転換株が得られたとして
も、該遺伝子が瘤主曹株に対して外来性である場合にｔ
ｊ咳遺伝子の発現に際し檜々Ｏ＃壁があることが知られ
ておや〔１化学と生物。

１Ｂ、１１０〜１ｉ８（１９７Ｂ）］その発楓を行わせ
ることは非常に困−である。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主として用い、これに骸宿主に対して外
来性であるところの目的遺伝子またはベクターを挿入し
て該目的遺伝子の形Ｊｘを発現させた例は今まで全く知
られていない。

コリネバクテリウムｈＩ４ｔたはブレビバクテリウム属
に属する微生物を宿主とする組換え技法においても、こ
れら微生物中で自律複製し、選択可能な表現型を有し、
多くの遺伝子のクローニングに用いうるベクター系の造
成と、効率Ｏよい形質転換系の確立が必要である。さら
に上記したごとき障壁の解消方法の確立が必要である。

本発明者らは先にコリネバクテリウム１１４ｔたけブレ
ビバクテリウム属に属する微生物中で自律Ｉｌ［製し、
選択可能な１１８１Ｍと適当なりｐ−ニング郁位を有す
るプラスンドベクターを造成する一方効率の高い形質転
換系を開発し特許出願を行なっ友Ｃ特願昭ｌｌ−６８１
１１＠、同１６−１８１８７、同５４１５７７７）、そ
コーｔ’本発明看らは鋏グ２スｉドベタ！−に既に知ら
れているインビトロにおけるＤＮＡ組換え技法（Ｕ、　
８．　Ｐｉｔｓｎｔ　４１＄７，２１４　）を用い、ア
（）酸Ｏ生金＊Ｋｌｉ与する外来性遺伝子を含むＤＮＡ
断片を連結し、開発した形質転換系を用いてコリネバク
テリウム・グルタにクムＬ−２８株家良はそＯｉＩ導株
を形質転換したところ、該外来性遺伝子が諌書生中で形
質を発現され、アンノ酸等有用物質の生＊Ｏ増大に利用
することがで龜ることを見出し本発明を完成するに麺っ
九。

以下本発明を詳ｍＫ説−する。

本発明は少なくとも一種の遺伝子を會むＤＮＡ断片とベ
タターＤＮＡと０組換え体で、かつ両ＤＮＡ０少なくと
も一方が宿主菌株に対して外米性である組換え体ＤＮＡ
を用いコリネバクテリウム属を友はブレビバクテリウム
楓に属する微生物から選ばれる禰主−株を形質転換して
得られる形質転換株を培地に培養し、該遺伝子の形質を
発現せしめる方法を提供する。

本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片とし２ては、真
被生物、原核生物、ウィルス、バクテリオ７アージまた
はプラスミドに由来し少なくとも一種の完全な遺伝子を
含むＤＮＡ断片があげられる。真被生物に由来する遺伝
子としては哺乳類と〈Ｋヒトのインターフェロン、イン
シユリン、主義ホルモンなどのベプタイドをコードする
遺伝子などがあげられゐ、原核生物に由来する遺伝子と
しては細菌とくにエツシエリヒア属、コリネバクテリウ
ム属、ブレビバクテリウム属、バチルスｍ壕九はスタフ
ィロコッカス属に属する細菌０１株に由来する遺伝子で
、細胞の代＊１友は合成活性に関与する遺伝子などがあ
げられる。細胞の代謝壕九は合成活性とは、アミノ酸、
ビタンン、横酸を九は抗生物質などＯ合成ならびにその
合成に関与する代Ｗ系を意昧し、本発明においてはアミ
ノ酸とくにグルタ建ン酸、リジ／ま九はスレオニンの生
合成の活性か好適にあげられる。

壕え目的とするペプタイド、蛋白質などＯアミノ酸組威
が知られていると魯は、相当するＤＮＡを合成して用い
ることもできる。ＤＮＡ合成方法は九とえば、Ｋ、　Ｉ
ｔａｋｕｒａ　ａｔ　ａｌ　＋　８０１（ＬＯ＠ｌ・畠
、ＩＯＩ＠（１１７７）に記＠０方法に従って行なうこ
とができる。

本発明に用いるベクターとしては、宿主菌と和会性（ｃ
ｏｍｐａｔｉｂｌ・贈自律増殖できるものでなくてはな
らない、具体例としては本発明者らがコリネバクテリウ
ム属に属する被生物から採堆し丸、ま喪は鋒取し九−の
を紳尋して造成し九］；ＩｃＧＩ（％ＭＩ紹５６−１畠
１０１）、ｐＣＧ２（ＩＶｉＪＩ１１昭５６−１８３５
６７）、ｐＣ（）４（特願賭ｂ・−１１１易・）、ｐｃ
ＩＣＩｎ、ｐｃｉ！５４、ｐｃ０１１％　ｐｃＢｌｏｌ
。

ｐ　Ｂ　ｔｈｒ　１　　などがあげられる・これらプラ
スミドを保有する一株はそれぞれ下記の寄託番号で工業
技術院微生物工業技術研究所ならびに米国アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。

プラスミド　　　ＦＩＲＭ−Ｆ　　　ＡＴＣＣｐＣＧ　
１　　　　　５８６５　　　３１１１０８ｐＣＧ　２　
　　　５９５４　　　８１４１３２ｐＣ０４５９３９３
１５１３０ ｐｃｇ　５４　　　　　　　　　　３９０１９ｐＣＧ　
１１　　　　　　　　　　３９０２１ｐＣＢ　１０１　
　　　　　　　　３９０２０ｐＲｔｈｒ　１　　　　　
−　　　　３１１（Ｈ１好適にはｐｃＧｌｌ、ｐｃｇ＆
４が用いられる。

ｐｃＧｌｌは本発明者らが先に発明し特許出願（％願昭
Ｓ・−１８１０１）ｌ、九プラスミドで、コリネバクテ
リウム・グルタ７タム２２５−５７（ＡＴＣＣ３１８３
０、ＦＩＲＭ−Ｐｉ８＠５）から分離され大プラスミド
ｐｃＧ１における制限＃嵩Ｂｆｊ　Ｉのたボ一つの切断
部位に、コリネバクテリウム・グルタミクＡ　２　Ｍ　
Ｓ　−２８０（ＡＴＣＣ３１８３０、ｙｎＲＭ−ｐａｓ
ｓｓ）から分ｍされ大プラスミドｐＣＧ４　のストレプ
トマイシンおよび／またはスベクチノマイシン耐性遺伝
子を含むＢａｍＨｌ断片を両１１０１ＷＪ−接着末端を
利用して結合ぜしめ大プラスミドである。

ｐｃＧｌ　１は、分子量約龜Ｉ　Ｋｋｌ　のプラスミド
で単一な制＠部位としてＢｒＪ　Ｉ、Ｐａｔ　ｌを有し
８♂／８ｐｅｃ１１のａｍ蓋を与エル。

ｐｃｇＩ４は次ＯようＫして作成することがで寝る。ｔ
ず、ｐｃＧｌをそＯ保有曹コリネバクテリウム・グルタ
ミクム！２５−２１８株（ＦＩＲＭ−Ｐｉｌｉ４、人Ｔ
ｃｃｓｌｓｓｚ）Ｏ培養画体から前記０＠許出ｓ＃４細
畳に開示し友方法で、ｐＧ人２ｚをそＯ保有太ｗｊｊ■
の培養筒体から通常用いられる方法で一一単離する０両
プラスミドＤＮＡを各分子中１箇所Ｏ切断点を一つ鯛除
酵素九とえばＰｓｔ　ｌで完全消化して直鎖状化し死後
、グラスミド分子Ｏ−ｍＫ単鎖として突自出九−−接着
末端で崗ＤＮＡ分子Ｏ連結した和合分子を生成させる喪
め＜’ｉ″４７アージＤＮＡリガーゼを作用させる。こ
のＤＮＡｆｉ成物中からの肉プラスンド分子の和合連結
し丸紐換え体プラスミドの取得は、一旦、ｐＧＡ２２に
由来す４Ｊ桑剤耐性で選択されるコリネノくタテリウム
属あるい唸ブレビバクテリウム属曹植の形質転換株を分
離し、これら形質転換株の保育するプラスミドを解析す
ゐことによって達成される。

ＤＮＡ混成−による形質転換は、本発明者らが先に特許
出願し九コリネバクテリウム属およびプレビバタテリウ
ム属１種のプロトプラストを使用する形質転換法（特許
１１８５・−５ｓｉａｙおよび轡験紹３＠−１５７７７
）により実施することができる。選択に用いる楽薊はｐ
Ｇ人２２に由来する薬削耐性遺伝子のうち、ｐＧＡｊｉ
２との連結部位となる丸め挿入不活化されるアンピシリ
ン耐性遺伝子を除い大輪の耐性遺伝子に対応するテトラ
サイクリン（’ｒｔ二）、クロラムフェニコール（Ｃｍ
　”）あるいはカナマイ７ン（Ｋｍ）を使用すればよい
、形質転換株はＤＮＡ＃添加系で受容曹グロトプラスト
が正常細胞へ復帰増殖できない鎖度の薬剤（通常、テト
ラ賃イクリンα４−ｘａｐｔ／ｗ、フロツム７　ｘ　＝
　：ｆｆ　−ｋ　ｌ　Ｉｓ　−５声ｆ／−およびカナマ
イシン１００−８００／ｉｆ看）を含む為！１ｌＩｌｌ
天培地上で復帰するコロニーを分離するか、あるいは、
一旦非選択的に再生培地上で正常＃ｌ飽に復帰増殖させ
死後にかき集め、とＯ再Ｓ淘液を受容菌正常細胞が生育
できない＊ｔｏ薬剤（通常、ナト２サシ−リンαシー４
声シー、タロラムフェニコール２−ＩＳμυ−およびカ
ナマイシフト１ｓ声か−）をｔｔｒ瞭天培地上で生育す
るコロニーを分離することＫよって得られゐ、テトラす
イクリン、タロラムフェニコールあるいはカナマイシフ
耐性により選択され友形質転換株の中には、ｐＧＡ！！
由来の他ＯＩｋ剤耐性形質をも同時に獲得しているもの
がある。

ζうして得られる形質転換株の保有するプラスきドＤＮ
Ａは、本発明者らが％Ｍ昭易・−１１１１ＱＩおよび特
願ｉ１８ＪＩｇ−＠ＳＳ７７７Ｋ示した方法で培養筒体
から単離棺製でき、さらに各種制−酵素で消化して生成
するＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析する常
法により構造を知ることができる。形質転換株の一株か
ら分離され九プラスミドがｐｃｔｌ　ｋ　４である。

ｐＣＢ５４は大きさ約１４Ｌ５卸のプラスｉドで、単一
制限部位としてＫＣＯＲｌ　％８ａｌ　ｌ　、８ｍａ　
Ｉ。

Ｘｈｏｌ　などを有し、Ｔｃ”、Ｃｍ”、Ｋ♂の表ａｍ
を与える＠　Ｘ　ｈｏ　ｌはに♂遺伝子中にあり、いわ
ゆゐ挿入不活化（ＤｋＪ人断片の挿入によ）当＃表現蓋
Ｏ発舅が妨げられる現象）Ｋよる選択も可能である。

プ２スンド保有口株からのプラスミドの採取は、たとえ
ば特願昭５　＃　−１８１０１、同ＳＳ−暴畠１ｓ藝お
よび同６１−１３３＆５７ｇ記載の方法に従って行なえ
ばよい。

遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組み換え
体の作製は、公知の試験管内組み換えＤＮＡ技法を駆使
することによシＶ＆麹できる。

試験管内のＤＮＡ組み換えは、通常、目的の遺伝子を含
む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と再結合によシ
行われる。ＤＮＡの切断は、制＠酵素を用いれば容１に
できる。試験管内組み換えに使われる制謙酵嵩紘生物種
を問わずすべての２本鎖ＤＮＡ上で特定の塩基配列部分
をｍ１ｌｌｉ切断する。そＯ塩基配列は、制臓−嵩Ｏ穏
１１により＾りていゐ、徹って適！Ｉｌ＆な制繊酵嵩を
使用することにより目的Ｏ遺伝子は脅浪−能を損うこと
なく一つ０ＤＮＡ切断片として切や出される。Ｐｉｌ−
制限酵素により切断され九供与体ＤＮＡとベクターＤ）
ＪＡの切断片の末端構造は同一構造をもち、ある種の制
ｖＩｋｒ！＃素の場合には１本鎖が集き出走接着木端を
与え、別０１１１１＊―嵩では、平滑末端を与える。い
ずれの末端であれ一−ｍ−酵素で切断する限り供与体Ｄ
ＮＡの＠断片とベクターＤＭＡの切断熱は、Ｔ４ファー
ジＤＮＡリガーゼによシ連絡することができる。

両ＤＮＡを異なる制限−嵩で切断し九場合も、例えば、
接着末端をＤＮＡボリメツーゼで修復して３本鎖として
、平滑末端になおしてから結合し友）、ターミナルトラ
ンスフェラーゼで相補的なホモポリマーを付与して接着
末端としてから結合したシ、或いは、ある種の制限ｔ＃
嵩切断部位を含んに合成オリゴヌクレオチドリンカーを
連結させてから、その内部を切断して１ｊＩｋ着末端を
作ってから結合賂ゼることができる。これらの連結法に
よ多目的の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＬ）ＮＡ
切断片Ｏ組み換え体が生成する。

リガーゼ反応により目的の組み換え体板外に他の組み換
え体も生成するが、目的の組み換え体を載置するにはこ
のＤＮＮ人混液液用いてコリネバクテリウムＸｔたはブ
レビバクテリウムｌ５ＩＩＩＩ槍を直ＩＩ！杉實転候し
、目的の遺伝子の遺伝情報に由来する遺伝形質を付与さ
れた形質転換株を選択分騙し、その培ｓｍ体から抽出単
離することによって達成できる。コリネバクテリウム属
ま九はブレビバクテリウム１／ｓ′＃ｉ！ＩＩを直装形
質転換しないで例えば大ｗｋＩｖＩのような他の微生物
の宿主ベクター系にて１的の遺伝子を−Ｈクロー／化し
、しかる後にコリネバクテリウム属を友はブレビバクテ
リウム属−樵のベクター・との組み換え体を試験管内で
作製してからコリネバクテリウム１ＩＩ４家丸はブレビ
バクテリウム属曹樵を形質転換し前記と同様に形質転換
株を選択分−しても組み換え体を装置できる。

組み換え体製造の丸めには下記文献の記載が広く応用で
きる。

８、Ｎ、　Ｃｏｈ＠ｎ　＋　ａｔ　ａｌ＋　Ｕ、８．Ｐ
ａｔ＠ｎｔ　４４８７，２！４遺伝遺伝子実験法〔為木
康敬纏著、購談社すイエンティフィツタ（１９８０）’
）、Ｍ＠ｔｈｏｄｉｎ　Ｋｎｉｃｙｍｏｌｏｇｙ　ＩＬ
　Ｒａｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮ人ｅｄｉｔｅｄｂｙ　
Ｒａｙ　ｗｕ　＋　Ａｃａｔｉｅｍｉｃ　Ｐｒｅａｔｉ
　１１１７９本発明の宿主微生物としては、コリネバク
テリウム属ｔ＆はブレビバクテリウム属に属しＤＮ人ｊ
ｋＪ込み能を有する菌株ならばいかなる一株を用いても
よい、好適には本発明者らが先に発明し特ｊ１１１＠Ｉ
ｓ＠−１８１４４１４にオイテ開示し九リゾチーム感受
性微生物を用いる。具体的な１株の一偽としては次の菌
株があげられる。

ｗｈｏ　　号 コリネバクテリウム・グルタミクム　　Ｌ−１５５９４
４１３１０４コリネバクテリウム・ノ→ユリス　　Ｌ−
１０３５９４７３１８＠＠ブレビバクテリウム・ディバ
リカラム　Ｌ−２０４５９４８８１８６７プレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＬ−３１２８９４９３０
１１８本発＆ＩＡ実施例においては組み換えＤＮＡ央験
指針に従う丸め、科♀技術庁によシ軒町畜れているコリ
ネバクテリウム・ダルタンクムＬ−２２株ならびにその
誘導株を用いる。

楢主黴生物の組換え体ＤＮＡによる形質転換はｌ）培養
細胞からのプロトプラストの１１１１製、２）プロトプ
ラストの組換え体Ｌ）ＮＡＫよる形質転換処塩、３）プ
ロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換株の選
択、からなる工程にて行われる。具体的方法の例を以下
に示す。

１）培養細胞からのプロトプラストのｌｌ１ｌＩｌｌ製
プロトツラスト形成は、微生物を細胞ｉｕｉ解酵嵩リゾ
チームに感受性にする条件下で増殖させ、この培養ａｍ
を高張液中でリゾチーム作用さゼ細胞檄を溶解除去する
ことによって行われる。微生物をリゾデーム感受性型細
胞にするには各種細ｊｌＩｉＩｌ１合成阻害剤が用いら
れる６例えば、微生物培養の対数増殖期の中途で生育を
抑制しないかあゐいは半抑制するＩＩｋ直のペニシリン
を編加し、さらに数世代増殖させることによって微生物
細胞をリゾチーム感受性にすることができる・ このと１使用する培地は微生物が増殖できる培地であれ
ばよく、例えば栄養培地ＮＢ（粉末ブイ曹ン１０Ｆ％酵
母エキスｉｆを純水１１に書み、Ｐ　Ｈ７，２に調整し
た培地）あるいは半合Ｉｉｔ培地ＳＳＭ（ダにコ−Ｊ　
１０　ｆ、　ＮＨ，Ｃｍ　４　Ｆ。

［１２？１ｍ母Ｚｄｔス１ｆ、ＫＨ，ＰＯ，ｉｆ　　％
に、ＨＰｏ、　３　ｆ、　ＭｆＣＩ、−・Ｈ，Ｏ１２ｆ
　％ＦｍＢＯ４・７Ｈ，０１０ｍｌ、Ｍｎ８０４−４〜
＠ＪＯ０，２曙、Ｚｎ８０４４ＪＯ昧ＩＮ、Ｃｕ５Ｏ，
・５Ｈ，Ｏ１２−１ＮａＩＢ４０．・ＩＯＨ，Ｏα０９
哩、（ＮＨ，）＠Ｍｏ、Ｏ□・４Ｈ２０Ｑ、０４Ｎ、ビ
オチン３０１Ａｆ、サイアミン塩蒙塩１時を水ｌＩＫ含
み、Ｐ　Ｈ７，意に調整し九培地〕などが用いられる。

この培地に微生物を一株し７、振盪ｊ＠餐する。

比色計によって６６０　ｎｍにおける吸光Ｉｔ（０１）
）をＩＩＩ定し対数増殖期の初期（ＯＤ−αｌ−０，４
）に培養液中Ｑ、１−２θ単１−１ＩｊｌＩ）磯度にな
るようにペニシリンＧなどのペニシリン類を添加する。

培養をさらに続けて、ＯＤが０，３〜α５に増加し九と
ころでＩＪＡＩＩｉｉを集菌し５５Ｍｍ地で洗滌する１
次いで細胞を適轟な高価培地、例えばＰｒＭＭｔ地（８
８Ｍ２倍希釈液中にショ糖α４にＭｔＣｌ、・・Ｈ，Ｏ
αＯＩＭを含み、ｐＨ７，０〜＆ｂに調整し九培地）あ
るいはＲＣＧ培地〔グルコースｉｆ、カゼイン加水分解
物５ｆ、＃母エキス２５　ｆ、　Ｋ、ＨＰＯ４１５１％
１Ｇ（、ＰＯ，Ｌ、Ｓ　Ｆ。

ＭｆＣｊｍ　・６Ｈ＊ＯＯ，４１ｆ　、　Ｆｅ３Ｏ４・
７ｎ、ｏ　１０　Ｑ、ｋｌｎＢＯａ　・４〜６）１．０
２＃、Ｚｎ８０．４ｉ１ｓＯα９＃、Ｃｕ８０．４Ｈ２
０α４啼、Ｈａ！Ｂ４０．−１０Ｈ，００，０９Ｗ４Ｉ
ｓ　（冊、）、ｙｏ、ｏ、、−４Ｈ，ＯＯ，０４＃、ビ
オチン３０１４ｆ、サイアミン堪酸塩２１１．コハク酸
二ナトリウム１３ＳＦを水ｌｌＫ含み、ｐ　Ｈ７，０〜
ａｉＫｌｉｇｌｌした培地〕に再１ＩＩｊＡ陶する。こ
の細脳懸濁液に最終濃度α２〜１０１−となるようにリ
ゾチームを加え３０〜３７℃で反応する。プロトゲラス
ト化は反応れるＫｌ！する時間は、ａ胤培％時の銅塊ペ
ニシリン濃度および用いるリゾチームの濃度によって変
わるが、ＩＩＩ紀◆件にて３〜２４時間である。

生成し九プロトプラストは低張条件で砿慣死するので、
プロトプラストの形成度は低張条件で生残する正常細胞
の残存度で間接的に知ることができる０通常、正常細胞
はりゾチーム九理供試正當ｌＡ胤の約１Ｏ−４の残存度
に抑えることができる。

このようにしてｗ４製したプロトプラストは適幽なｌｌ
１Ｉｌ＆ｇｋ蜂大培地上でコロニー彫成ｍ（再生能）を
有する。この鎌大培地としては栄１１１鳩地、半合成培
地あるいは数種類のアミノ酸を補充した合成培地に０．
３〜（Ｌ８Ｍコハク識二ナトリウムおよび０．５〜・−
ポリビニルピロリドン（分子′ｔ１へ０００あるいは４
仏０００）を含南せしめたものが好適に用いられる。

通常、半合成培地ＲＣＧＰ培地（ＲＣＧ培地に３憾のポ
リビニルピロリドン（分子１ｉ１Ｇ、００Ｇ）と１．４
ＵＤ１４ＩＩ大を添加Ｌ＊Ｊ＠Ｍ、ｐＨ７，２〕を用い
ることができる。ｊ＠黄は２５〜３５℃で行うのが好ま
しい、再生コロニーの出現が鉋められるＯに要する培養
日数は一抹によシ差があるが、釣１できるまでの大きさ
になるのは１０〜１４日である。

ＲＣＧＰ培地でのゾロドプラストの再生は１種、培養中
途ペニシリン添加ｌａ度およびリゾチーム旭履一度によ
って異なるが、リゾチーム処理供試正常ｍ胞あ九りｌ　
Ｏ−”〜１０−’の効率である。

２）プロトプラストへの組換え体ＤＮ人による形質転換 プロトプラストへの組換え体ＤＮＡ０ｊｌｊり込みはｍ
Ｍがプロトゲラスト状−を保持できる＾張液中でプロト
ゲラストと組換え体ＤＮＡとを滉合し、これＫＤＮＡ４
１り込み媒介作用のるるポリエチレングリコール（ｐｉ
Ｇ、平均分子量１．５４０〜ａ、ｏｏｏ）あるいはポリ
ビニルアルコール（ｐｖｈ、重合ｇＢ　００〜１，６０
０　）と二価金属陽イオンを加えて処理することによっ
て行われる。４張条件を与える安定化剤としては、微生
物のゾロドプラストの保持に一般に使われるものでよく
、例えばシＷＩＩ＋コハク酸二ナトリウムを用いること
ができる。ＰＩＧおよび２７人の使用可能なＩＪＩ＆度
範囲は最終濃度で各々５〜６０慢、１−１０−である、
二価金属陽イオンは最終濃度１〜１Ｇ（ｌｕＭのＣａ＋
＋、Ｍ７”、　Ｍ式Ｂａ＋１％８ｒ”などが効果的で単
独あるいは併用することができる。処理の１１度は０〜
２５℃が好適である。

ａ）プロトプラストの正常細胞への４１婦再生と形質転
換株の選択 組換え体Ｉ）ＮＡで形買転換処理したプロトプラストの
再生は、前記のプロトゲラストの再生と同様に、コハク
酸二ナトリウムとポリピロリドンを含有する＾張寒天培
地（例えばＲＣＧＰ培地）上にプロトプラストを塗布し
、正常＃ｌ胞が生育できる温度一般に２５〜３５’Ｃで
培養するととによって行われる。形質転換株は供与ＤＮ
ＡＫ由来する遺伝子が藺に付与する形質について選択す
ることによって＊得できる。この４Ｉ値的形質獲得に基
づく選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行ってもよ
く、あるいは一旦非選択的に再生させてから丹生正常ｍ
胞を集め普通の低張寒天培地上で行ってもよい。

本発明における具体的に好適な宿主菌株として示したり
ゾデーム感受性劇株を用いる場合には形質転換は上記工
種ｆｌ）におけるペニシリン処理を行なわずに単に培養
増殖させた細麺を直接リゾチーム処理する以外１ま上記
工種ｔ１）〜（粉と同様に行なえばよい。リゾチーム感
受性徴生物を用いる場合の形質転換株は再生ｆＩＭあ九
シ１０−４〜１　Ｇ−’の＾Ｓ嵐で得られる。

形質転換株は通常の栄養培地に培饗することＫより挿入
した組換え体ＤＮ人の形質をＪｊ８現させることができ
る０組換え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮ
Ａ由来の性質が付与されている場合は、その性質におわ
せて培地に薬剤を補給すると龜４ｈある。

本発明の形質発現方法により生産されるアミノ酸等の有
用物質の採取は、発酵液からのこれらの＊＊を採取する
常法により行なわれる。

本発明によシコリネパクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属黴生物におけるアミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物
質、＃巣、ベグタイド、蛋白實の生産性の増大または航
たな生型性の付与が可能となった。を九黴生物の代ＩＩ
Ｍ活性を強化し、基質の利用能を増大させ、ｗＴ九な代
−油性を与え、新しい基質の利用性を与えるなどの製造
法の改ＪＬも可能になつ九。

さらに本発明における％ｍｔは、異攬遺伝子あるいは外
米性の組換えＤ　ＩＪ　Ａ全コリネノ（クテリウム属ま
たはブレビバクテリウムｍ＊生物において発現させるの
に成功し九点にある。すなわち、実施例に示すごとく大
腸−のスレオニンオペロン、ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ（ｐｐｃ　）遺伝子、枯阜鉋およびブ
ドウ状球−で発現する遺伝子ｐ　ＵＢ　１１０　（Ｋａ
ｇｇｉｕｓＫ、Ｍ、　＋　ａｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ１＋＾ｃａｄ、８　ｃ　ｉ　、ｌ　Ｕ、　Ｓ
　、　Ａ。

７１１．１４２３（１９７Ｂ）辺カナマイシン耐性遺伝
子、コリネバクテリウム・グルタミクムのリジン生合成
に関与する遺伝子、ブレビバクテリウム・７ラブムのア
ンスラニレート合成酵素遺伝子がコリネバクテリウム属
−において発現し丸。

例示し丸いずれの遺伝子も単にコリネバクゾリウム・グ
ルタミクムのプラスミツドに連結し九触で導入されてお
り、コリネバクテリウム・グルタミクムで発現させるた
めの特殊な操作は總していない、壇九、遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を、コリネバクテリウム・グルタミクムのプラ
スミドに対して、いずれの向きに連結しても、コリネバ
クゾリウム・グルタミクム内で発現することから、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムは、導入され九遺伝子の
転写・翻訳の開始点を正確に１繊し、転写・翻訳を遂行
できる機能上もつことが明白である。ｍ知のように全て
の遺伝子は、正ｉＩＫ転写・翻訳が一始される丸めに必
要な塩基配列のレベルで類似性のある部位を有している
ことを考慮すると、コリネＩ（クテリウム・グルタミク
ムは、例示し九遺伝子以外の遺伝子の転写・翻訳開始点
を４＆ｉ鐵して発現しうることが害鳥に推察される。

グルタミン１ｓｔ＾生童能を有するいわゆるグルタミン
酸生産舊は、主な菌学的性質を同じくしているにもかか
わらず、産業上の重要性から各研究者によ）、種々の１
名が付されており属名鷹でもコリネバクテリウム属ある
いはプレビバタテリウム属などさまざ遣であ４．Ｌかし
ながら、これらの菌群は、細胞−のアミノ酸構成やＤＮ
Ａの塩基組成が画一的であることから、同一の菌種であ
ることが指摘されていた。さらに、蝋近、これらの一種
間にＬ１７０〜８０慢以上のＤＮＡの相同性があること
が明らかにされ、非常に近縁な稙生物であることが明白
である。

（ｉｃｏｍａｔｓｕ＋　Ｙ、　：　Ｒ＠ｐｏｒｔ　ｏｒ
　ｔ、ｈ＠ｉｉ’＠ｒｇｓｎｔａｔｉｖｓＲ＠５ｅａｒ
ｃｈ　Ｉｎａｔｌｔｕｔｅ　１．４５Ｌ　ｔ　（ｌｅｇ
ｏ　）、および、８ｕｇｕｋｉ、　Ｋ、　Ｋａｎ＊ｋｏ
　ｒ　Ｔ、＋　ａｎｄ　ＫＯｍａｇａｔａ＋　ｘ、　：
Ｉｎｔ、Ｊ、８ｙｉ＋ｔ、　Ｂａｃｔ＠ｒｉｏ１．３１
１　１３１　（Ｈ？８１　）参照３６本明細書では組み
換えＤＮＡ夷験に使用できる宿主がｇＬ制されている丸
め、本発明の有用性はコリネバクゾリウム・グルタミク
ムＬ−２８の誘導株を宿主として示したが上記の事実を
踏まえれば、グルタミン酸生産−全般にそのまま適用で
きることが容易に類推される０組み換えＤＮＡがこれら
菌株において安定に保持され、発現される丸めにはＤＮ
Ａの相同性など宿主菌の性質における若干の相違は問題
でなく、これら−樵が当該プラスミドの自律複製と導入
遺伝子の発現を可能ならしめる砿能を有していればよい
、しかるに、これらの−檀がこの両機能を共有している
ことは、本発明膚らが、先に特許出願（特頴噛５４１−
５８１８１）ｌ、九プリネバクテリクム・グルタミクム
２２＆−２５０から分離され、ストレプトマイシンおよ
び／ま九はスペクデノマイシン耐性遺伝子鵞有するプラ
スミドｐＣＧ４　がコリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属菌株など、グルタミン酸生産曹内で閣じ
〈複製でき、を九、その耐性遺伝子が発現される（特Ｍ
紹５６−５８１１７）ことから明らかである。従って、
本発明を適用し得る宿主−としては、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムに限らず、コリネバクテリウム属およ
びブレビバクテリウム属１ｌｌｌ檜をきむグルタミン酸
生重Ｍ＃してが包括される。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１　リジン生産−コリネバクテリウム・グルタミ
クムＡＴＣＣ２１８４３のリジン生合成に関与する遺伝
子のコリネバクテリウム・グルタミクムでのクローン化
と、その遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム・
グルタミクムによるリジンの生］１： ＋１）　　コリネバクテリウム・グルタミクムムＴｃｃ
！１ｉ４ｙ１染色体ＤＮ人とベクターｐｃＧ１１の調ｌ
ｌ１ｉ： コリネバクテリウム・グルタにクム人ＴＣＣ１３０３２
からり導され、リジンアナログである５−（２−アミノ
エチル）〜システィン（以下ＡｇＣと略す）に耐性を有
するリジン生産性変異株コリネバクテリウム・グルタミ
クムＡＴＣ０２１５４３の染色体ＤＮＡを次のようＫし
て抽出単離する。

４ＱＯｄ半合成培地８８Ｍ（グルコース２０　ｙ、　　
（ＮＨ４）、８０．１０　ｔ、　Ｈ素３ｔ、障母！＋、
（１ｔ、　Ｋ）Ｉ、Ｐｏ、　１　ｆ％ＭｆＣｊ２−６Ｈ
２００、４Ｖ　、　Ｆｅ８０．−７Ｈ，０１０＃、Ｍｎ
８０４−４−４Ｈ２０α２噌、Ｚｎ８０４　・７Ｈ，Ｏ
Ｏ，９ｗｅ、Ｃｕ８０４４Ｈ，０α４Ｍ＃、サイアミン
塙ｆ！Ｉ＆塩ｌ−を水１ノに含みｐ　Ｈ７，２に調整し
た培地〕にスレオニンを１００．４１１７１となるよう
に補っ九培地に種培養を接種して３０℃でＩＩ徽種培養
る。東京光電比色針で６６０ｎｍｌ（ｊｒける吸光ｆ（
ＯＤ）を測定し、ＯＤα２になり九時点で培養液中α蕃
単位／ｗＪ　（０９度となるようにペニシリンＧを冷加
する。さらに培養を継続しＯＤ約ＱＪＫなるまで生育さ
せ石。

培養液から菌体を集菌し、ＴＥ８緩衝液〔α０１Ｍ）リ
ス（ヒドロキシメチル）アンツメタン（以下トリスと略
す）　、Ｑ、００５ＭＩＤＴＡ、αＯｉＭＮａＣｊ：ｐ
Ｈ龜０〕で洗浄後、リゾチーム液（！Ｉｌシｉｉ軸、Ｑ
、　Ｉ　Ｍ　）ｉａｃｊ、α０５Ｍ）リス、ａ−−リゾ
チーム：ｐＨＬＯ以下同じ）で１０−に懸濁し３１℃で
４時間反応させゐ、集菌した一体から斉藤らの方法（８
ａ１ｔＯＩ　Ｈ，Ｉｔ　Ｋｌ　：Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ。

人ｃｔａ＋７１　６１９（１９１１３ｋ）］に従ッテ鳥
分子染色体ＤＮＡを単離する。

一方、ベクターグラスミドとして用いるｐＣＧ　１１は
、コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−２２株の誘導
Ｊ＃ＬＡ１０３のｐｃＧｌｌ保有株ＬＡＩ　０３／ｐｃ
ｅ　１１（ム’ｒＣＣｇｏｏ　ｚｚ）から次のようにし
て単一する。

４００ｍ）ｉＢ培地（粉末ブイｉｉ　ン２０　ｆ　ｓ陣
母エキスＳｔを水ｌｌに含みｐ　Ｈ７，２に脚肇し九培
地）で８０℃で掘ａｍ養しＯＤ約０．７になるまで生育
させる０ｍ１体を一＠ｌ、、Ｔ、１８緩術液で洗浄鎌、
リゾチーム液１０−にＭ瀾し、ｓ７℃で２時間反応させ
る０反応液にＳ　Ｍ　ＮａＣｊλ４　ａＪ、　（ＩＬ　
６　Ｍ　ｇＤＴＡ（ｐＨ＆Ｓ）α６−１４憾ラウリル峡
ナトリウムとα７　Ｍ　ＮａＣＪからなる溶液本４ａＪ
を順次１加し、緩やかに混和してから氷水中に１５時間
置く。

＃ｌ１ｌｌｉ物全体を遠心管に移し４℃で＠Ｏ分間遠Ｑ
、４００Ｘｆの遠心分離にかけ上澄液を回収する。これ
に重量百分＄１１０１ＧＮのポリエチレングリコール（
ＰＩＧ　）　ａ、０００　（牛丼化学薬品社製）を加え
、静かに混和して溶解後、氷水中に置（，１０時間ｉｔ
、５００Ｘｆで１０分間遠心分廟してペレツトを回収す
る。

１１Ｂ緩Ｉｌｉ液５−を加えてベレットを靜かに！４ｆ
ｌｉ解してから１．　！ｌ　ＩＩＩＦ／　ａｄエチンウ
ムプロマイドＬＱＩＩＪｔ画加し、これに塩化セシウム
を加えて静かに浴解し密縦をｉ、　ｓ　ｉ　ｏに合わせ
る。この溶液を１０４０００Ｘｆ、１８℃で４１時間超
遠心分庫にかける。ζｏｗｅ勾配達心により共有結合で
閉じられ九積状のＤＮＡけ紫外線照射することによって
遠心チューブ中下方ｑ）Ｉ！Ｆ度の高いバンドとして見
出される。

こｏ／（ンドを注射器で遠心チューブのＩＩ幽から抜書
とるととによってｐｃＧｌｌＤＮＡが分離される０次い
で分−液を等容量のイングロビルアルーール液〔容量百
分率９ｅ−イングロビルアルコール、１０慢ＴＷ８緩術
液（この温液中に飽和溶Ｎ菫の塩化セシウムを含む）〕
でｉ闘Ｊ６Ｊｉ１ｉｌＮシてエチジウムブロマイドを抽
出除去し、しかる後にＴｍ８緩衝液に対して透析する。

＋２１　　コリネバクテリウム・グルタミクムムＴＣＣ
２１Ｍ４３のリジン生合成に関与する遺伝子のクローン
化 上記で１１ｍ１ＥしたｐｃＧｌ　１グラスミドＤＮ人３
声２を會む鯛＠酵素ＢｆＪｌ　ｌ用反応液（１０ｘＭト
リス塩綬、７ｍＭ　　Ｍ＋ＰＣｊ、、ｌｉｌＯｍＭＩＪ
ｉｃＪ　、　７ｗｎＭ　２−メルカグトエタノール、ｐ
Ｈ７、ＩＩ）６０μノに・単位の針１　ｌ（宝浦造社製
）を鶴加し、ｓ７℃で藝ｅ分間反反応後ｓ℃で１０分間
加温して反応を停止する。−力コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＡＴＣＣ２１ｊｉ４３の染色体ＤＮＡ８μｆ
を含む制＠＃素Ｂａｍ［１反応液（１０ｍＭ）リス１４
ｅｌ、　　７１１１ＭＭｆＣＩＢ　、１００　ｍＭ　Ｎ
ａＣｊ　、　２ｍＭ２−メルカグトエタノール、α（１
１嚢ウシ血清アルブＺン、ｐＨ＆ｏ）１４０声１１１Ｃ
４単位のＢａｍ）ＩＩを添加し、３７℃で６０分間反応
後％６５℃で１０分間加温して反応を停止させる。

画情化物と混合し、Ｔ４リガーゼ用緩衝液（トリス６４
ｉ　０　ｍＭ　、　Ｍｊ’ＣＪ＊　６　ｇ　ｍＭ−ジチ
オスレイトール１００ｍＭ％ｐＨ７，６）４０ｄ１人Ｔ
ｐ（ｓｍＭ）ｉｏ、ｓＪ％で４１）ｉ−ゼ（宝―造社製
、１単位／声ｊ）Ｑ、３μｌおよびＨ，０１２（ｌｊを
加え、１２℃で１６時間反応させる。この混合物をＴＥ
Ｂ緩価液で飽和したフェノール４００声１−（：　２圓
抽出し、Ｔ１８緩備液に対して透析してフェノールを除
外する。

このリガーゼ反応混合物を、コリネバクテリウム・グル
タミクムＬ−２！株から鋳導され九ムＩＩＣ感受性のＬ
Ｐ４株の形質転換に供する。形質転換はＬＰ４株のプロ
トグツストを用いて行なう、ＬＰ４株の種培養をＮＢ培
地に植麿し３・℃で娠盪培豐する。０Ｄ１６になった時
点で集蓄し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔グルコース！１ｆ
１カザミノ酸ｉｆ、ｉｌ母工中ｘｚｓ　ｙ、ｘ、ｎｐｏ
、　ｉｓ　ｙ、　ｍ、ｐｏ。

１、　ｍ　ｆ　％ＭＰＣＩ、−６１（，０α４１　ｆ％
Ｆ＠８０４・７Ｈｎ０１１ｗ、　　Ｍｎ３Ｏ４・４〜−
６Ｈ，０２１１１Ｆ、　　Ｚａ８０４−７Ｈ２０ＱＩ　
　膳す、　　（ＮＨａ）＠ＭｕｙＯ□・４Ｈ１０α　０
４１１、ビオチン５ｏｓｔ、サイアミン塙瞭塙！噌、コ
ハク酸二ナトリウム１ｌｉｆ、ポリビニルピロリドン（
分子量１０００＠）３０　ｆを水ＩＩＫ含むｊ＠地〕に
１曙、肩のリゾチームを倉む液（ｐＨ７，ｓ）Ｋ＃！ｊ
ｘｏ”＠１處／−となるように懸濁し、Ｌ［試験管に移
して３０℃で５時間緩やかＫｌｌｆｉ反応してノートプ
ラスト化する。

このプロトプラスト−液α５ｌＩＪを小試験管にとり２
ＳＯＯＸｆで５分間遠心分離しＴ８ＭＣ緩嚢液（ｌｏｍ
Ｍ−化マグイシウム、ａ　Ｏ１０Ｍ塩化カルシウム、５
０３１１Ｍ　トリス、４０６ｍＭ７ｉ＋＋＠、ｐＨ７，
！　）１ｍＫ再騙濁して遠心洗浄後、Ｔ８ＭＣ緩ＩＩ液
Ｑ、１１１ＪＫ再Ｍ濁する。こ〇−液に２倍＾績寂のＴ
８ＭＯ緩衝液と上記リガーゼ反応ＤＮＡｆｉ合物の１対
ｌ混合液１００声ｊ會加えて混和し、次いでＴ８ＭＣ緩
衡液中にｚｏ嚢ｐｇｏａ、ｏｏｏを含む液Ｏ，Ｓ−を摩
加して混合する。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐ）ｉ７゜２
）２ｓＩｊを添加し、ス５００Ｘｆで２分間遠心分離に
かけて上澄み液を除去し、沈降したプロトグツストを１
−のＲＣＧＰ培地にｊｌ＃してからα２ｍをスペクチノ
マイシン４００　ｆｉｆ／ｗＪを含むＲＣ’ＧＰ寒天培
地（ＲＣＧＰ培地に１．４−庫天を含む培地、ｐＨ７１
）に塗床し、３０℃で７日間培養する。

鎌大培地上に生育した一全ｉｌ全かき集め生塩食塩水で
洗浄後、Ｉｙｄの生塩食塩水にＳ満する、この１１液を
スレオニン２−１人ＩＥｃ２＃／ＷＪおよびストレプト
マイシンｌλ５μｂ−相轟を含有する最小筆太培地−Ｌ
〔グルｗ−ｘ　１０　ｆ％ＭＷ、Ｈ，ＰＯ，ｌ　ｆ、　
　ＫＣＩ　（Ｌ　２ｆ　％ＭＰ８０４４ＨｔＯ（Ｌ　２
　ｆ　％Ｆ＠８０４４Ｈｓ　０１０噌、ＭｎＳＯ４−４
〜ｆＪＨ，ＯＯ，２Ｎ、ｚｎ８ｏ４・７Ｈ１０α９＃、
Ｃｕ８０．−５Ｈ，Ｏα４＃、Ｎａ１Ｂ４０７　・ＩＯ
Ｈ，Ｏ（ＬＯ９＃、（ＮＨ４）、ｌＪｏ、Ｏ，、−４Ｈ
，Ｏｏ。Ｑ４＠、ビオチン５ＯＮ、ｐ−アミノ安息香＃
　ｚ　ｈ　＃、サイアミン塩績虐１吋、庫大ｌ＠ｆを１
ｊ＃ＰＫ含みｐｌｉ７゜雪に調整し九培地〕上に再塗布
して３０’Ｃで３日培養する。出横したコルニーの中か
らＡｇＣ，スベクチノマイシンおよびストレプトマイシ
ンに耐性の株妙１得られる。

これらの形質転換株の保有するプ９スミとは、前記ノｐ
　Ｃ０１１ｋ＊１Ｉ４１．ｒ（ＤトｒＭＪ様ｔＤ方法で
単離される。これらのグラスンドＤＮＡ１ｆｉｔを用い
、ｐｃＧＩｌ上に切ｗｆｒＩ１１位のある制限酵素１ｉ
ｉ００ＲＩで５！全消化後、アガロースゲ泳動気泳勧で
解析し、生成断片の和から分子量を同足した０分子量は
同一アガロースゲル上で同時に泳動したラムダ７アージ
ＤＮ人の制限＃素旧ｎｄｆｌ消化で生成する分子量祇知
の各断片の泳動距離で描かれる標準−縁に基づいて算定
する。形質転換株の一株から得られ九グラスミドｐ人・
３Ｃ５は分子量ｌα７１ｂでｐ　ＣＧ　１１　（１）　
＠１Ｂｒｊ　Ｉ切断部位にｌＬ＠ｘｂのＤＮｋ＠片が挿
入された組み換え体プラスミドである。

ｐＡｅｃＳＤｔＪ人を用い、上記と同様な方法でＬＰ４
株のプロトプラストを形質転換しスペクチノマイシン耐
性で選択される形質転換株は同時にＡＥＣ耐性形質を付
与され九ｇｃｏＲＩの切断様式で判定されるｐ人ｅｃ５
と同一のプラスｉＦ′を保有している。即ちｐＡｅｃ５
にコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１１４
ＢのＡｇＣ耐性形質を支配する遺伝子がクローン化され
ていることが明らかである。

ｐＡ＠ａ　５保有醒株は米国アメリカン・タイプ・カル
チャー　・’Ｊ　Ｌ／クションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｌｃｕｍ　Ｋ　１７　人ＴＣＣ
３９０３２として嵜旺されている。

１３１　　ｐＡｅｃ５保有株によるリジンの生産コリネ
バクテリウム・グルタンクムＬ−２２株から−４された
ＬＰ４抹のｐムθＣ５保有株（人Ｔｃｃａｓｏ３ｇ）　
と非保有株のリジン生産試験金材なう、ＮＢｆｉ大培地
上で生育せしめた菌を１白金耳ずつ５ａｊの生産培地Ｐ
１〔グルコース１００　ｆ、　　（ＮＨ４）ｍｓ０４２
４ＳＦ。

１ｃ）（、ｐｏ４ｉ　ｒ、Ｍｆ８０．・７Ｍ２００．４
　ｆ、　Ｆｅ８０４−７）１，０ＩＯＱＩ、Ｍｎ８０４
−４〜６　Ｈ，０１０ｍ９．　　ビオチン５０声？、ナ
イアイ／塩咳塩２００声ｖ１ハントテン盾カルシウム６
００声り、ニコチン酸５００声２、大豆加水分解物１０
Ｆ、炭酸カルシウム３０Ｆを水１ｊＫｔみｐＨ７，２に
祠贅し九培地〕の入り九試験管に種菌し３０℃で７１時
間振盪培養する。培養後、培地中のＬ　＋　リジン生成
量を酸性−銅二ンヒドリン反応を用いる比色法によりて
画定し九結Ｊ！Ｊ、を第１ｆＩ＆に示す。

第　　　１　　　表 ＬＰ−４９ Ｌ　Ｐ　−４／ｐＡ＠ｃ　５　　　　　　　７．２実施
例２　大ｐＩｋｍのスレオニン生・＆成に関与する遺伝
子のクロー７化とその遺伝子の発現を利用したコリネバ
クテリウム・グルタミクムによるスレオニンの生産： ｉｌｌ　　大＠１ｍスレオニンオペロン＋＊有スるＤＮ
人断片のクローン化とコリネバクテリウム・グルタミク
ムへの４人： クローン化は大腸−の宿主ベクター系にて実施する。ベ
クターとして用いたｐ（）Ａ２２は本プラスミド葡作製
したア／らが用い一〇いる方法（Ａｎ、　Ｇ、　ａｔ　
ｍｌ　：Ｊ、　ＢａｃｔａｒｉｏＬ＋　ｌ　４（１＋　
４００（ｘ９７＊））Ｋ便い１．＋／ラプスドｆｔ保有
する大ｈｉ１１ｆｉ＜−ｘ２株亜休体培祷鰯体がら単緒
すゐ、供与Ｄ　′、Ｊ　Ａとなる高分子染色体Ｄ　ｈＪ
　Ａは大腸曹［１１株（ムｒｃｃｚｓ７４ｏ′１Ｄｊｌ
！ｉ養曹体からスイスの７エノール抽出法〔細１ｔｈ、
Ｍ、Ｇ、：Ｍ−ｔｈｏｄ　　ｉｎ　’Ｉｋ１Ｍ７Ｍ１０
１０ｇ７＋　　１２＋　　ｐＪＬｒ　ｔ　人、易４５（
１９１→〕Ｋ従って単離す為。

ｐＧＡ！！プラスンドＤ）ｉＡ　４　ｆｉｆを會む制限
酵素Ｈ１ｎ１厘反応液（１・ｍＭ）９ス塩績、７　ｄ　
ＭＷ　　０７．、　１　ｅ　Ｍ　Ｎａ０１％　襲■７．
易　）６・声４−二〇、４単位のｕｔｎａｌ（宝鳩造社
製６単位／μＪ）を添加し１１℃で１０分間反応後６ｓ
℃で１０分間加温して反応を停止する。ｐＧＡｌ！！に
は２ヶ所ＯＨ１已厘切断部位が存在するが、同一条件で
Ｋｉｎｄ　Ｉ消化し九賦科をアガロースゲル電気＃勅で
調べ友結果、−断片に切断されていることが確認される
。別に１染色体ＤＮ人８μＩｆ會む鯛＠酵嵩Ｈ１ｎｄ厘
反応液１４０μノに４単位Ｏ）ｉｉｎｄ厘′に＃＆加し
８７℃で６０分分間応優・Ｓ℃で１０分間加温して反応
を停止させる。

画情化物を負合し、Ｔ４リガーゼ用緩衝液４０ｆｉｌ、
人’ｌ’Ｐ（５ｍＭ　）　４０μｊ１で纏りガーゼα３
Ｎおよび）１，０１２０１４４を加え、１２℃で１＠時
間反応させる。この混合物をＴｌ１８緩衝液で飽和した
フェノール４００声ノで２−抽出し％ＴＲ８緩衝液に対
して透析してフェノールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌！−１雪株亜株Ｇτ−
ｓ　（Ｊ、　Ｂａｃｔ＠ｒｉｏ１．１１７．１３ト１４
３（１９７４））（ホモセリンおよびジアミノピメリン
酸賛求性）の形質転換に供する。

ＧＴ−３株のコンビテン１セル（ＤＮＡ取ｐ込み能を有
する一株）はダジエルトらの方法［Ｄａｇ＠ｒｔ、Ｍ、
＋懸ａｌ　：　（）ｅｎｄ、　６．２３（１９７９））
でｌＩＩ顧する。即ち１００声に−となるようにジアミ
ノピメリン酸を補ったＬ培地（バクトドリグトン１０　
ｆ、酵母エキス５ｆを水１４に含みｐ　Ｈ７，２に１１
＋１餐し九培地）５Ｇ−に植１し、ＯＤ　Ｏ，６になる
まで３７℃で培養する。

培養液を氷水で１０分間冷却してから遠心集−する。冷
却した０、　１　Ｍ塩化カルシウム２０−に再Ｓ濁し、
０℃に２０分間璽〈、細胞を再遠心し、１１Ｍ塩化カル
シウムα１ｌｌＪＫＩＩ濁し０℃で１１時間置く。

塩化カルシウムＩＪ＆場し九曹液４００声４　に前記リ
ガーゼ反応混食−２００声４を添加混食し、Ｏ″”ＣＫ
ＩＯ分関置い装から３１℃で番号間加温すゐ０次いでＬ
培地９−を添加し、Ｓ７℃で鵞時間ＪＩＩＩｌｓｉ餐す
ゐ、生態食塩水でＳ−達心洗Ｓ後、１１暴声Ｖ−椙轟の
カナマイシンを添加したＭ會最小庫天培地（ブドウ輪重
ｆ％）Ｉｌｉ４Ｃ７１ｆ、嵐、ＭＰｏ、６Ｆ　、　３０
１．ん。

８　ｆ、　Ｍｆ１０４４１１，０１１　ｆ％Ｃ＆ＣＪ、
　−ｕ＠０１　暴啼、ナイア建ン塩酸塙４＃および重大
１１Ｆを水１１に含率、ｐｇｔ、５ＫＩＩＩＩｌ友培地
）に塗布し２丁℃でＳμ培養すみ、出現しえ、九に１　
ツ（Ｄ　：ＩＥｌ　ｘ−は、アンビシリ／　ｘ　ｓ　Ｉ
＃Ｉｔ／ｗＪ、タロツムフェニゴール２ｉμＶ讐あるい
はカナマイシン１ｓ声Ｖ−を含むＬｌｌｌｌ天上地上生
育することが確１ｉ１−！れる。

この形質転換株Ｏ培養画体から上記（１）でｐＧｎｓｓ
を単離し友のと同一の方法によりプクスミドＤＮＡを単
離する。この７′ツスｉドＤ１人を用い制限―嵩消化と
アガロースゲル電気泳動で解析し九結果、第１図にｐＧ
Ｈ１として示し九構造を有している。ｐＧＡｌｌに挿入
され九ＤＮＡ断片は既にクローン化され丸大腸曹オペロ
ン含有ＤＮＡ断片（Ｃｏｇｓａｒ％Ｐ、ｅ　ａｔ　ａｌ
　：　ＭＱｌｓｃ　、　Ｇ＠ｎｓ　Ｇ＠ｎ＠ｔ−＊　１
７６　＊　ａｓ（１９７會）参照〕と閤−の１１１Ｉ＠
酵素切断部位を有していることからｐＧＨ２がスレオニ
ンオペロンを含有することが確認される。

次Ｋ　Ｉ＞ＣＧＩ　１とｐ（）Ｈ！の組み換え体を作製
する。ｔず、ｐｃＧｌｌとｐＧＨ！を各々Ｂｆｌ　Ｉ　
、および−ｍｌ■で適正条件下完全消化すす、各プラス
ンドＤＮＡＩ声Ｖを含む消化物を温合し、線容量２００
声１に対してＴ４リガーゼ用緩術濱４０μｊ１人ＴＰ（
ＩｉｍＭ）４０μｊ％で４リガーゼ（Ｌ２μｊおよびＨ
，０１！ＯＩ＃４を加え１２℃で１６時間反応させる。

この混合物をＴｌＢ緩衝液で飽和し九フェノール４００
声）で２回抽出しＴＫ８緩衝液に対して透析してフェノ
−羨を除去する。続いて１倍高一度ＯＴ８Ｍ（：緩衝液
と前記りガーゼ反応渦金物０１対ｉ＠會液１００μ）を
供与ＤＮ人として用い、実施例１（１）と同様な方法で
コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ２・１株（Ｌム
１０１の鱒導株、ホ毫竜リン、ロイシンｌｌ！求株）の
プロトプラストを形質転換し友後、ＲＣＧＰ晦天培地に
Ｉｌｋ沫し、３０℃で６日間培養して再生増殖さぜる。

寒天埼地上会画に生育しえ曹をか１集め、車通食塩水で
遠心洗滌後、ロイシンｓＯμｙ／ｓＩｊを補充し九最小
庫天培地Ｍｌ上に再塗布して、１０℃で３日間培養する
。出現したコロニーの中からカナ１イシン１１ｓ声ｙ７
ｆｄおよびスペタチノマイシン１００声ｆＡＬｌを含む
ＮＢＪＩ天培地上で生育で自る株が得られる。

これらＯ形質転換株から実施例１（ｌ）記載のエチジウ
ムプロライド、セシウムタａフィト壷置匈配達心により
プラスミドを単一する。

これらのプラス建ドＤＮＡαＩ声ｆを用い４）種制限酵
素による単独消化および二１１−の制ａ１１嵩による二
重消化で生成するＤＮ人断片をアガロースゲル電気泳動
で解析し、分子量およびプラスミド分子中の各制限酵素
切断１１位を固定する。−株から得られ九グツスミドを
ｐｌｔｈｒ　１と命名し、ＩＩ［酵素Ｐｓｔｌｂ１００
Ｒ１％およびＸｈｏｌの切断部位で特徴づけられる構造
を嬉２図に示す、　ｐｉｌｔｈｒ　１はｐｃＧ１１ｆＣ
ｐＧＨ２のスレオ二ンオヘロンヲ含む、１ｌａｄｌ　　
切断片を結合し九構造を有することが判明し丸。

ｐｌｔｈｒＩＤＮＡを用いて、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＬＡ１０３株を前記と同様に再形質転換し友
結果、ホ毫セリン非要求性とカナマイシンおよびスペク
チノマイシン耐性形質が連関して導入され、それらの形
質転換株は、各種制限酵素切断様式で特徴づけられるｐ
ｌｔｈｒｌと同一のプラスミドを保有している。ホモセ
リンデヒドロゲナーゼの欠失に起因するＬｉ２Ｏ２株の
ホモセリン要求性がｐｉｌｔｈｒ　１によりホモセリン
非要求性に復帰するのは、大腸菌スレオニンオペロン上
にあるホ篭竜りンデヒドロゲナーぞが発現している九め
Ｋほかならない。

ｆＷ　　ｐｌｔｈｒｌ保有株によゐスレオニンの生部コ
リネバクテリウム・グルタミクムＬ−ｆＡＺ株よシ誘導
し九スレオニン生産曹、コリネノ（クテリウム・グルタ
ミクムＬＡ−１ｏ　ｓ　（メチオニン要求性、人ｇＣ耐
性、α−アイノーβ−ヒドロキシ盲草酸耐性）のｐｌｔ
ｈｒ　１保有株は、Ｌ人−１（ｌのプロトプラストをｐ
ｌｃｔｈｒｌで形質転換することによって得られる。

プロトプラストはＬ人−１０６株を半合成培地８８Ｍに
１００μｍ−相幽のメチオニンを補った培地で培養し、
ＯＤ約０．６壕で生育塙せた細胞を実施例１（−と同様
なニーで処理することにより調製する。形質転換も実施
例１（−と同様に行ないスペクチノマイシン４００とｙ
ＡＩを含むＲＣＧＰ寒天培地上で選択して形質転換株を
取得する。　ｐｇｔｈｒ　１保有曹株は米国アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクシヨンにＣｏｒｙｎａｂ
ａｃｔ＠ｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ　１９Ａ
ＴＣＣ３９０３４として寄託されている。

（（転）　ｐｉｔｈｒ　ｌ保有株によるスレオニンの生
首上記のととく得７’ｊＬ人−１０６株のｐＫｔｈｒｌ
保有株（ＡＴＣＣａ９０３４　）と非保有株のスレオニ
ン生産試験を行なう。ＮＢ庫大培地上で生育せしめ７’
ｔｍｔ−１白金耳ずつ５−の学童培地Ｐ２（グルコース
ｔｏｏｆ、（冊、）、８０４２０ｆ、　ＫＨ，ＰＯ４０
，５ｆ％に！ＨＰＯ４０，ｉ　ｆ、　ＭｆＦ３０．・１
ｋｉｓ０１　ｆ　−Ｆｅ８０．−７）（、Ｏｉ　Ｏ＃、
Ｍｎ８０．　・４〜６１（，０１０畔、ビオチン１００
μｆ１炭酸カルシウム２０１．メチオニン１００４を水
１４に含みＰＨ７，！に調整した培地〕の入っ九試験管
に植−Ｌ３０℃で７５時間ａｍ培養する。

培養後、培養Ｐ液をペーパークロマトグラフィーにかけ
ニンヒドリン発色恢、比色定量してＬ−スレオニン生成
量を欄定し丸。

結果を第２表に示す。

第　　　２　　　表 ＬＡ−１０＠　　　　　　　　　　　　　　ａ、ＩＬ人
−１ｏｇ／ｐｍｔｈｒｔ　　　　　　ｌ＆４夷Ｊ１１ｉ
ｆｉ１１１ 大ｋｋ＃の７オスホエノールビルビン酸（ｐｉｐ　）カ
ルボ命シラーゼ（ｒｐｃ　）遺伝子を含む組換え体プラ
スミドを保有するコリネバクテリウム・グルタミクムに
よるグルタミン酸の生ｊ１：（１）　　大腸菌のｐｉｃ
ｐカルボキシッーゼ遺伝子（本遺伝子は大腸菌でＧｌｕ
をＧｌｕ＋にする仁とが知られているグルタミン酸生合
成に関与する遺伝子である）を含有するＤＮＡ断片のク
ローン化とコリネバクテリウム・グルタミクムへの４入
： クローン化は大腸−の宿主・ベクター系にて実施する。

ベタターとして用いたｐＢＲ３２ｍは実施例１（１）で
ｐｏ人２２を調製したのと同一の方法で大腸菌に一１２
株亜株の培養画体から単一する。供与ＤＮＡとなる高分
子染色体ＤＮＡは夷ｆｉｆｉ　２　＋ｌ）テ大腸−に−
１２９（ＡＴＣＣ！３７４０）から調製したものを使用
する。

ｐＢＲ３２２グラスミドＤＮ入３μｆおよび染色体ＤＮ
Ａ９μＦを含む制限酵素”ＢＩＬｌ　ｌ用反応液（１０
ｍｌｊ）リス塩酸、７　ｍＭＭｆｃＪ、、１００　ｍＭ
Ｎａｃｊ　、　７　ｍＭ２−メルカグトエタノール、α
０１％ウシ血清アルブミン、ｐｎ７．５）２００μｌ６
ｃｔ　Ｏ単位の５ａｘｌ（宝繰造社製）を鍋加し、３７
℃で６０分間反反応液６５℃で１０分間加温して反応を
停止させる。この拠金消化物にＴ　４　リガーゼ用緩債
液４０声ノ５人Ｔｐ（ｓｍｕ）４ｏμｍ、Ｔ４リオーゼ
α４μｍおよび水１２０μＪｔ７ＪＩえ、１ｊｌ’Ｃで
１６時間反応させる。この混合＠′ｋＴｇ８緩衝液で電
相し九フェノール４００声ノで２１ｇ１抽出し、’ｒｇ
ｓ緩衡液に対して透析しフェノールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を大ＪＩｉｌ１ＭＫ−１２株亜
株ｐ　ｐ　ｃ　ｚ　（Ｇｌａｎｓｄｏｒｆｆ　ｌ　Ｎ、
ｌ　ｏｅｎｅｚｉｃｓ　。

Ｓｉｔ　ｔｓｙ（ｔｓｓｓ））（ａｒｇ−、ｔｈｒ−＊
１＊ｕ″′Ｉｈｉｍ−，Ｔｈ１−　Ｉ　ＰＰＣ−、ＢＴ
”　）の形質転換に供する。

ＰＰＣ２株Ｃ）コンピテント・セルは！噌廓のグルタミ
ン酸を補っ九Ｌｊ４ｊ地で培養し、実施例！（１）でＧ
Ｔ−３株のコンピテント・セルを得九のと同様に調製す
る。形質転換は前記リガーゼ反応混合物２００μｊを使
用し、夷繍例トｌ）と同ＩＩＫ行う、Ｌ培地９ｄを添加
し、３７℃で３時間振盪培養して形質脅現せしめる０次
いで生態食塩水で！回達心洗浄後、アルギニン、スレオ
ニン、ロイン／、ヒステジ／各１０声ｆ／ｗＪを補なっ
九Ｍ９最小庫天培地に麿有し、ｓ１℃で１日間培養する
。出現し九コロニー會アンピシリンｘ　ｓ　ｐｙ／ｗＪ
あるいはテトラナイタリン２ｓ声ｆ／―を會むＬ庫天培
地上にレプリｐし、１７℃で２４時間培養してアンビ７
りン耐性でテトラナイフリン感受性のもｏｔ選び出す。

これらの形質転換株ａＳ養曹菌体ら前記と同様の方法で
プラスミドＤｕＡｆ単一する。

形質転換株の一株から祷られ九ノフスミドｐＰｃ１ｔ−
制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結果
、ｐＢＲ３２２の８ａｌ　ｌ切断部位に表４　ｘｂのＤ
ＮＡ断片が仲人されたゲノムナイズ＆８Ｋｂの組換え体
シラスミドであることが判明した。

このｐＰＣ１プシスミドを用いてｐｐｃ２株を前記と一
様な方法で形質転換し、アンピシリン耐性で選択される
形質転換株は全てグルタミン酸非要求性で、制＠＃嵩切
断様式で特徴づけられるｐＰｃ　１と同−補遺のプラス
ミドを保有している。このことはｐＰｃｉプラスミド上
に大ＩｊｋｗｉのＰＥＰカルボキシラーゼ遺伝子がクロ
ーン化されていることを示す。

クローン化されたＰＥＰカルボキシラーゼ遺伝子をコリ
ネバクテリウム・グルタミクムに導入するために、ｐＣ
Ｇｌｌとｐｐｃ　１の組換え体を禰主大腸−で調製する
ｅｐｃＧｌｌおよびｐＰｃｌプラスばドＬ）ＮＡ　ｔ−
各々２μＶ含む制限障嵩Ｐａｔ　ｌ用反応緩ＩＩＩＩ液
（２０ｍｌｊ　トリス塩酸、１０　ｍＭ　ＨＦＯ４，、
５０ｍＭ（ＮＨ，）、Ｓｏイα０１％ウシ血清アルプン
ン、ｐＨ７，Ｉ）２００　ＩＩＩに４単位１）　Ｐｓｔ
　Ｉ（ｉｓ造社製）を添加し％３０℃で６０分間尺応後
、６Ｓ”Ｃで１０分量論温して反応を停止させる。この
反応混合物にＴ４リガーゼ用緩衝液４０ｆｉｌ。

Ａでｐ（ｓｍＭ）ｎｏｎ、Ｔ４リガーゼＱ、２７４４お
よび水１２０）４１を加え、１１ｔテｌ　８時間反応さ
せる。前記と同様にフェノール抽出後、透析してフェノ
ールを除去する。このリガーゼ反応混合物４００μＩｔ
−使用し、前記と同様ＫＰＰ０２株を形質転換した。

生じたコロニーから前記の方法でグラスミドを分離し、
その大きさをアガロースゲル電気泳動で−ベ九。

その人龜さが約１８〜１８に’ｖのグラスミドをもつ株
を選択し、そのグ２スンドで再度ＰＰＣ２株を形質転換
しＰＰＣの存在を確−し走。先の形質転換株の一株から
得られたプラスミドｐＥｐｐｃ　ｌを制＠酵素消化とア
ガロースゲル電気泳動で解析し九結来、ｐｃＧｌｌとｐ
Ｐｃｌが両省のＰθｔｌ切断部位で和合連結し九ゲノム
ナイズＩＬ６Ｋｋ＋の組換え体グラスミドであることが
明示され九、こうして大ＩｊＪＩ＃Ｉｉで＃４Ｉｌｌさ
れ九Ｉ”ＰＰＯｌグラスミドＤＮＡを用い、コリネバク
テリウム・グルＩｔクムＬ−２２株から鱒導されたＬＰ
４株を形質転換する。形質転換は実施例１（２１と同機
に行い、形質転換株はスベクチノマイシン４００μＶ讐
を含むＲＣ（）Ｐ寒天培地上で生育するコロニーの中か
ら取得される。これらの形質転換株から単一されるプラ
スミドを制限＃嵩８１１１あるいはＰａｔ　ｌの単独消
化または両省の！菖消化し、アガロースゲル電気泳動で
解析する仁とによりｐＲｐｐｃ　１を保有していること
が確認される。

ｐ麓ｐｐｃ１保有ｌｌｌｉｌｌＩ１ｇは米−アメリカン
・り（７’・カルチャー・コレクシコンに Ｃｏｒｙｎ＠ｂａｃｔｅｒｕｉｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍ　Ｋ−１１４ＡＴＣＣ３９（４３として寄託されてい
る。

（２：Ｊ　ｐｍｐｐｃ　ｌ保有株によるゲルタイ／酸の
生産： コリネバクテリウム・グルタミクムＬｌ！株から鱒導さ
れたＬＰ４株のｐｉｃｐｐｃ　ｌ保有株（人ＴＣＣ３・
０ＳＳ）と非保有株のグルメンノ酸生産試験を行っ九、
ＮＢ寒寒天−地上生育せしめた曹をか亀集め、生理食塩
水で洗浄後、Ｓ−の生産培地Ｐ３（グにコース＠Ｑｆ、
（”４）　ｓＢＪ　３　ｆ　ｓ尿素３ｆ％藷、ｐｏ４α
！１ｔ１に、ＨＦＯ２αＳ　ｆ、　Ｍｆ８０．−７）（
、Ｏα５　ｆ、　Ｆｅ１２．・７Ｈ，０１０Ｎ、Ｍｎ８
０４−４〜４１Ｈ！０１０１１．ビオチンａμｖ１ナイ
アンン塩酸塩ｉ００μｆ１フェノールレッド１０ｓｐｔ
Ｍ水１　ｊＫ會−＋、ｐｋ１７．２にＩＩＩＩＩＬ九培
地〕の入った試験管に植菌し、３０℃で振盪培養する。

培養中、２０％尿素液を（Ｌ２ｍ１Ｊずつ３−−加し、
４０時間培養する。培養後、培養Ｖ液をペーパークロマ
トグツフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量し
てＬ−グルタミン酸の生成量を一定した。

結果を第３表に示す。

第３表 ＬＰ−４１αＩ Ｌ　Ｐ　−４／ｐＥｐｐｃ　ｌ　　　　　　１　！Ｌ８
実施例４　ブレビバクナリウム・フラブム人ＴＣＣ１４
０６７のアンスラニル酸合成酵素遺伝子のコリネバクテ
リウム・グルタミクムでのクローン化と発現 ブレビバクブリラム・フラブム人ＴＣ０１４０６７の染
色体ＤＮＡを実施例１（１）と同様の方法で頗する。ベ
クターとして用いるｐｃＥ６３は実施例１（１）でｐｃ
ｏｌｌを単層したのと同様の方法でその保有株コリネバ
クテリウム・グルタミクムシー２２株の培養一体から単
一する。　ｐｃｋＡｓ３は本発明考らが先に時軒出顧し
たコリネバクテリウム・グルタミクムのグラスミドｐｃ
Ｇ１　（特願昭５６−１８１０１）と大腸劇のプラスミ
ドｐＧＡ２１　（Ａｒ、　Ｇ、　Ｉｔ　１１　：　Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｍｌ、）１４０．１ｏｏ（ｌｏｙ會）
参照〕を和合連結ぜしめ友グツスイドである。詳しくは
ｐＣＧ　ｌ上に１ケ所しかない肝ｊ１切断部位とｐＧ人
８！上に１ケ所あるｋｒｎＨｌ切断部位のうちテトラナ
イフリン耐性遺伝子内でないＢａｍＨｌ切断部位とで、
両制限酵素の同一接着末端を有用して適結し丸ものであ
る。ｐｃｍｈｓはｐＧＡ２！由来のカナマイシン耐性遺
伝子などの選択マーカーを有し、制限酵素５ａｌｌＫ対
する切断部位は１ケ所である。

上記で１ｌｌｌｌｉしたｐｃｍｓａグラスミドＤＮＡ−
μＶおよび染色体ＤＮＡＱ声ｆを含む制限酵素８ａｌ　
１反応液２００声１に１９単位の８ａｌ　ｌを鋼線し、
ｓ１℃で＠Ｏ分間反応後、６５℃で１０分間加温して反
応を停止させる。この混合消化物にＴ　４　ｉ）ガーゼ
用緩衝液４０ｆｉｌ。

Ａ　Ｔ　Ｐ　（１＄　ＩＩＭ　）　４０　ｓｌ、Ｔ４リ
ガーセ叡４μノおよびＨ，０１２０μノを加え、１２℃
で１６時間反応させる。この混合物をＴＫ８緩衝液で飽
和し九フェノール４００　ｆｉｇで抽出し、Ｔ１８緩伽
液に対して透析し、フェノールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。

形質転換する受容劇としてコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＬ−２２株から鍔導され九アンスツニル＊要求ｉ
変異株ＬＡ１０５（アンスラニル酸合成酵素欠損変異株
）を用いる。アンスラニル酸要求性変異株は、常法の変
異処理により、Ｍｌ寒天培地上で生育できず、アンスラ
ニル酸（ｇｏ声に一相当）を補ったＭ１９天培地上で生
育で亀る曹を選択することによって取得される。ＬＡ１
０５株のプロトプラストのｉｍｇおよび形質転換株、生
育培地ＮＢに１００声ｆ／−相当のアンスラニル＃Ｉを
禰っ九培地を使用する以外はｖ４施例１１２Ｊと同様に
行う、形質転換株は、カナマイ７ノ２００μＬ−相当を
含むＲＣ’ＧＰＪＩ天培地上で生天才地上ロニーとして
選択される。

出現し九コロニーの中からＭＩＪ＠４天培地上で生育て
自る形質転換株が得られる。

これらの形質転換株の培養画体から前記と同様にプラス
ミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得られた
プラスにドｐＴｒｐ　２−３を各種制限酵素消化とアガ
ロースゲル電気泳動で解析し九結果、ｐｃｇ５３の唯一
の８ａｌ　ｌ切断部位に７．１　Ｉｔ）の８ａｌ　ｌ　
ＤＮＡ切断片が挿入され九プラスきドであることがわか
り九。

ｐＴｒｐ　　２−３′に用い、ｔｌ［な方法でＬＡ１０
１株を再形質４ｉ換したところ、トリプトファン１００
μに−およびカナマイシン４００μに−を含むＲＣＧＰ
寒天培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニル
酸非要求性とな９、それらは、Ｓａｌ　Ｉの切断様式で
判定される。ｐ″ｒｒｐ２−３と同一のプラスオドｔ−
保有している。

以上の結電は、クローン化された？、　Ｉ　Ｋｂの８ａ
ｌ　Ｉ　ＤＮＡ切断片にはブレビバクテリウム・フラブ
ムＡＴＣＣ１４０６７のア／スラニル酸金成酵素をコー
ドする遺伝子が存在し、それがコリネバクテリウム・グ
ルタミクムＬＡ１０１株中で発現していることを示す２ ｐＴｒｐ２−３保有−抹は米国アメリカン・タイグーカ
ルチャー　・コレクシ−／にＣｏｒｙｎ・ｂａｃｔ＊ｒ
１圓ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ　２０　　ＡＴＣＣ３９
０３５として寄託されている。

実施例Ｓ　　ｐｃＢｌｏｌの作製 （１１ｐｃＧｌｌとｐＵＢｉｌＧの分離ｐｃＧ１１は、
本プラスミドを保有するコリネバクテリウム・グルタミ
クムＬ　Ａ　１０　！／’ｐ　ＣＧ　１１（ＡＴＣＣｓ
ｅｏｚｚ　）を４００１１７ＮＢ培地でＯＤ約Ｑｌにな
る壕で生育させ、その培養細胞から、実施例１（１）で
ｐＣＧ２を単騙し九のと側御の方法で単一する。

ｐＵＢｌｌｏは、グリタザンらの方法（Ｇｒｙｃｍｎ。

Ｔ、　Ｊ、　ａｔ　ａｌ　、　：　Ｊ、Ｂａｃｔ＠ｒｉ
ｏ１，１３４　＋　３１８−一１１−号側御１−―−―
―−−―響−１曜閤■―（１９７８）参照〕により、本
プラスミドを保有スルハデルス・サチルスＢＲ１１７ｐ
υＢ１１０（Ｒｏａ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、８ｃＬ　
ＵＳＡ、　７８　、１４２３（１９７８））の培養厘体
から単一する。

１１　　ｐｃＧｌｌとｐＵＢｌｌｏの試験管内組み換え
上記で調製したｐｃＧｌｌプラスミドＤＮＡ２μｍを含
む制隈酵＠Ｂｆｊ１反応緩衝液（１０ｍＭ　）リス塩酸
、７　ｍＭＭｆｃＩ、、　６０ｍＭＮａｃＪ　。

７ｒｎＭ２−メルカグトエタノール、ｐａｙ、５）１０
０声ノに２単位のＢｆＪＩ（宝酒造社製、６単位／声り
を添加し、３７℃でＩＯ分間反応させる。また、ｐＵＢ
１１０プラスミドＤＮＡ２声Ｖを含む制＠酵素ＢａｍＨ
１反応緩衝液（１０−トリス塩酸、７１１Ｍ　ＭｔＩＣ
Ｉ！、１００　ｍＭ　ＮａＣｊ。

２ｍＭメルカプトエタノール、αＧ１１ｌウシ血清アル
ブミン、ｐＨ＆０）１００．＃１ｊＫ２単位ＯＢａｍＨ
Ｉ　（宝虐遺社製、ａｊＩＬｖμ））を添加し、３７℃
で６０分間反応させる。

両制＠酵素消化物を混合し、Ｔ４９ガーゼ緩衝液４（ｌ
Ｉｊ％ＡＴＰ（ＩｍＭ）４Ｇ、ｓｊ。

Ｔ４リガー４ｔＣＬ２ｆｉｌオよびＨ，０１１０４４を
加え、１２℃で１６時間反応させる。この混合物を、Ｔ
Ｊ１Ｂ緩衝液で飽和したフェノール４００μ４で２（９
）抽出し、Ｔ］１８緩嘴液に対して透析し九フェノール
を除外する。

（ａｔ　　ｐｃＢｌｏｌの取得 ２倍Ａｍ腿のＴ８ＭＣ緩貴液と上記リガーゼ反応混−＆
瞼の１対１７１ｍ、合液ｉｏｏμｍを供与ＤＮＡとして
用い、実施例１（３）と同様な方法で、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムＬＡ１０１を形質転換し、カナマイ
７ン耐性株を選択する。出境したコロニーをカナマイシ
ン１１５μｔ／Ｊおよびスベクチノマイシン１００声ｆ
／ｘＪを含むＮＢ寒天培地上にレプリカし、３０℃で２
日培養して生育した二車耐性形質転換株３株を任意に選
び、四−蜂大培地上で純化する。この３株を４００μｊ
ＮＢ＠地で、ＯＤ約０．８になるまで生育させ、果−彼
、その＠養細胞から実施例１（１）１躯のエチジウムブ
ロマイド−セシウムクロライド１ａｆｆ勾配達心により
プラスミドを単離する。いずれの形質転換株からも、１
０〜３５μｍ０グツスミドＤＮＡが得られる。

これらのプラスミドＤＮＡを実施例１（（支）と同じよ
うに制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析し、
分子層と制限酵素ＰｓｔＬｋｌｃｏＲＩ　＋　ｌ１ｉｎ
ｃ　ＩおよびＢｆ１ＭＯ切断点を同定スる。３株のプラ
スミドは全てｐＣＧ　１１とｐＵＢｌｌＧが和合連結し
た構造を有し、そのうち二種は第２図にｐｃＢｌｏｌで
示し九構造でああが、他の一種は結合南きが逆向−であ
る。

いずれのプラスミドを有する形質転換株もｐｃＧ１１由
来のスベタチノマイシン耐性形質とｐＵＢｌ　１０山来
のカナマイシン耐性形質を有している。

これらのプラスミドＤ）ｉＡを用い、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬＡＩＱ３株を再形質転換し九結果得
られ九カナマイシン耐性形質転換株は、スペクデノマイ
シ／耐性形質を同時に獲得しており、各種制限酵素切断
様式で％機付けられる供与プラスイドと同一のプラスミ
ドを保有している− ４、ｗＪｒｋｉＯ簡単す説明 第１図はプラスミドｐＧＨ２の制限酵素地図を示す、第
２図はプラスずドｐｃＢ１Ｇ１ｏｗ隈酵素地図を示す。

特許出願人　（１０２）協和ＩＩＩＩ＃工業株式会社巣
　１１齢 第　２１ 手鏡補装置（方式） ％式％ 遺伝子の形質発現方法 龜補正をすみ考 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　　東東部千代田区大手町−丁目１４　＠　１号
堪称　（１０１）％和峻酵工Ｊ１１株式命社（ｒｍＬ：
ｏｘ−ｇｏｌ−ｙｚｏ内線！７１１）昭和ｓ１年４月９
Ｅｉ（Ｎａ日：Ｍｉｙ年４月２７Ｅｌ）＆補正の対象 明細書全文（タイプ浄書、内容に変更なし）亀補正の内
容 別紙の過多。

手続補装置 昭和５′８年　７月／７日 １、事件の表示 昭和５６年％詐願第２１１９０８号 ２発明の名称 遺伝子の形質発現方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社明細書の発明の詳細な
説明の欄および特許請求の範囲の欄 ５、補正の内容 （１）明細書（昭和５７年５月２１　ＥＩ４−正置で提
出した明細書、以下同じ）第１０頁１７行目 「代謝または合成活性」を「代謝、とくに合成活性」に
訂正する。

（２）明細書第５１頁１５行目 「連絡」を「連結」に訂正する。

（３）明細書簡３２頁１２行目の「０．４■、」の後に ｒ　Ｎａ、Ｂ、Ｏ，−１０Ｈ２０ｏ、　０９　Ｍｌ　（
ＮＨ４）、ＭＯ，Ｏ，、−４Ｈ，ＯＯ，０４＋１１９．
ビオチン３０μ２．」を加入する。

（４）明細書第５１頁１４行目 「および」を「あるいは」に訂正する。

（５）明細書簡４８頁５行目 「固定する。」を「同定する。」に訂正する。

（６）明細書第５１頁５行目 ｒ　ｐＥｔｈｒ　１保有株によるスレオニンの生産１を
ｒ　ｐＥｔｈｒ　１保有株の造成」に訂正する。

（７）明細書第５１頁下から１４行行 目（ＰＥＰ　）Ｊを削除する。

（８）明細書第５１真下から１０行目、同５４頁書で提
出した明細書、以下同じ）第１０３Ｎ１７行目 「代謝または合成活性」を「代謝、とくに合成活性」に
訂正する。

（２）　　明細書第１７頁１５行目 「連絡」を「連結」に訂正する。

（３）明細書簡３２頁１２行目の「０．４哩、」の後に 「Ｎａ、Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２００，０９１１＋　’（Ｎ
Ｈ４）ｇＭＯｙＯｚ＜　’４）Ｉ、００．０４譜、ビオ
チン３０μ２．」を加入する。

（４）明細書第４７頁１４行目 「および」を「あるいは」に訂正する。

（５）　　明細書簡４８頁５行目 「固定する。」を「同定する。」に訂正する。

（６）明細書第４９頁５行目 ｒ　ｐＥｔｈｒ　１保有株によるスレオニンの生産１を
ｒ　ｐＥｔｈｒ　１保有株の造成」に訂正する。

（７）明細書第５１真下から１４行行 目（ＰＥＰ　）Ｊを削除する。

（８）明細書第５１真下から１０行目、同５４頁１４行
目および同５４頁１６行目 ｒｐｇｐカルボキシラーゼ」をｒｐＰＣＪに訂正する。

（９）明細書簡５５頁１９行目 ｒＰＰｃＪの後に「遺伝子」を加入する。

ａＳ　　明細書の特許請求の範囲を別紙のとおシ釘正す
る。

０　明細書第４ｓ頁８行目の「第２図」を「第３図」に
訂正する。

ａｌｌ！細書第−５頁２０行目の後に 「第３図はプラスミドｐＲｔｈｒ　１の造成のフローチ
ャートを示す。」 を加入する。

ａｓ　　ｉｊ！ｎ書第８　＠ｊ［１３行目ｒｙｄＪ　ｋ
　ｒｓｌ　ＪＫ訂正する。

復◆　明細書に別添第３図を追加する。

亀添付書類の＠鍮 図　　面　　　　　１遍 特許請求の範囲 １１）　　少なくとも一種の遺伝子を含むＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡとの組換え体で、かつ両ＤＮ人の少なく
とも一方が宿主菌株に対して外来性である組換え体ＤＮ
Ａを用いコリネバクテリウムｍｔ九はブレビバクテリウ
ム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換し
て得られる形質転換株を培地に培養し、該遺伝子の形質
を発現せしめることを特徴とする遺伝子の形質発現方法
。

（２）　　咳遺伝子を含むＤＮＡ断片が真核生物、原職
生愉、ウィルス、バクテリオファージｔたはプラスミド
由来であることを１！＃似とする％詐請求の範囲第１項
記載の方法。

（８）諌真核生物が哺乳類に属することを特徴とする特
許請求の範囲第２項記載の方法。

（４）咳原植生物が細菌であることを峙愼とする峙１’
ＦｌｌＩ求の範囲第２項記載の方法。

（６）　　該細菌がエッシエリヒア属、コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属およびスタ
フィロコッカス属から選ばれることを特徴とする特許請
求の範囲第４項記載の方法。

（樹　皺遺伝子が酵素、蛋白質ｉ九はベプタイドをコー
ドする遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲第
１−５項記載の方法。

（７）峡遺伝子が細胞の代謝、とくに合成活性に関与す
る遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲第１〜
５項記載の方法。

（８）峡遺伝子がアミノ酸、ビタミン、砿酸または抗生
物質の生成に関与する遺伝子であることを特徴とする特
許−求の範囲第７項記載の方法。

（９）＃アミノ酸がグルタミン酸、リジンまたはスレオ
ニンで１りることを特徴とする特許請求の範囲′＠８項
記載の方法。

０１　　皺ベクターがコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物由来のプラスミド、フ
ァージま九はその誘導体であることを％似とする特許請
求の範囲第１項記載の方法。

α層　該プラスミドおよびその誘導体がコリネバクテリ
ウム属に属する微生物由来のｐｃＧｌ、ｐＣＧ２、ｐＣ
（）４、ｐｃｇｓａ、ｐｃｇ５４、ｐｃＧｌｌ。

１）ＣＢＩＯＩ　ｔたはｐＥｔｈｒｌと名付けたプラス
ミドであることを特徴とする特昨請求の範囲第１０項記
載の方法。

α１　＃宿主菌株がコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属し、かつリゾチーム感受性であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。

ａｌ　　該宿主菌株がコリネバクテリウム・グルタミク
ムし−２２またけその誘導株であることを特徴とする特
＊＋ｎｙ求の範囲第１２項記載の方法。

ａ４　　少なくとも一檜の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベ
クターＤＮＡとの組換え体で、かつ両ＤＮＡの少なくと
も一方が宿主菌株に対して外来性である組換え体ＤＮＡ
ｔ−用いコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に鵬する黴生智から遇ばれる宿主菌株を形質転換し
て得られる菌株を培地に培養し、該遺伝子が関与する代
謝物質をｊ＠＊＊中に生成蓄積せしめ、該培養物から皺
物實を採取することを特徴とする物質の製造法。

α場　該物質が蛋白質、酵素、ベプタイド、アミノ酸、
ビタｉン、核酸および抗生物質から選ばれることを特徴
とする＊ｅ’！Ｆｔ＊求の範囲第１４項記載の方法。

α・　咳アンノ酸がグルタミン酸、リジンま九はスレオ
ニンであることを特徴とする特杵請求の範囲第１ｓ項記
載の方法。

手続補装置（自発） 昭和５０年２月７７日 １、事件の表示 昭和５６年特許顧第２１１９０８号 ２、発明の名称 遺伝子の形質発現方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称
　　（１０２）協和醗酵工業株式会社明細書の発明の詳
細な説明および特許請求の範囲の欄 ５、補正の内容 ＋１１　　明細書（昭和５７年５月２１日付手続捕正書
で提出した明細書、以下同じ）第６２頁４行目の後に次
の記載を加入する。フイ、７７．１「　プラスミドｐｃ
Ｅ５２を用いて上記と同様の処理を行い、ブレビバクテ
リウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７のアンスラニル酸
合成酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドｐＴｒ
ｐ４−３を得る。

ｐＣＥ５２は本発明者らが先に特許出願したコリネバク
テリウム・グルタミクムのプラスミドｐＣＧＩ　　（特
開昭５７−１３４５００）と大腸菌のプラスミドＰ　Ｇ
Ａ　２２　　［Ａｎ、　Ｇ、　ｅＬ　ａｌ：　Ｊ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ。

１４０、４００　（１９７９）参照］を和合連結せしめ
たプラスミドである。詳しくはｐｃＧｌ上に１カ所しか
ないＢｇｊ！ｎ切断部位とｐＧＡ２２上に２カ所あるＢ
ａｍＨＩ切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内
のＢａｍＨ１切断部位とで２両制限酵素の同一接着末端
を利用して連結したものである。

ｐｃＥ５２はｐＧＡ２２由来のカナマイシン耐性遺伝子
などの選択マーカーを有し、Ｗ限酵素Ｓａｔ■に対する
切断部位は１カ所である。

ｐＣＥ５２は実施例１（１）でｐｃＧｌｌを単離したの
と同様の方法でｐｃＥ５２保有株コリネバクテリウム・
グルタミクムし一２２株の培養画体から単離する。

上記と同様にトリプトファン生産性のコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬＡＲ−１株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６９
０８）をｐＴｒｐ４−３で形質転換する。得られた形質
転換株は米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
シ騨ンにＣｏｒｙｎｅｂａｃ　ｔｅｒ　ｌｕｓ＋ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍＫ　３１＋Ａ　Ｔ　ＣＣ３９２８０とし
て寄託されている。

ｐＴｒｐ２−３保有株コリネバクテリウム・グルタミク
ムに２０．ＡＴＣＣ３９０３５およびｐＴｒｐ４−３保
有株同に３１．ＡＴＣＣ３９２８０によるＬ−）リプト
ファン生度試験を下記のとおり行う。

菌株をＮＢ液体培地中で３０℃、１６時間振盪培養した
菌液０．５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ４（廃糖密１００
ｇ／ｊ！、（ＮＨａ）２３０４２０ｇ／ｉ。

ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ／Ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ／ｊ
、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２５ｇ／に。

ＣａＣＯ３２０ｇ／ｌ、ｐＨ７，２３の入った試験管に
植菌し、３０℃で９６時間振盪培養する。

培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定置して。

Ｌｌリプトファンの生成量を測定する。

対照として、ＬＡ−１０５株およびＬＡＲ−１株を同様
に処理する。

結果を第４表に示す。

第４表 （２）明細書第６５頁１７行の後に次の実施例６を加入
する。

［実施例６゜ コリネバクテリウム・グルタミクム０１５６株のし一ヒ
スチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化および該
遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム・グルタミ
クム、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバク
テリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムによるし一ヒスチジンの生Ｗｉ： ＋１１　　コリネバクテリウム・グルタミクム０１５６
株の染色体ＤＮＡとプラスミドｐｃＧ１１の調ｍ：１．
２．４−）リアゾール−３−アラニン耐性でヒスチジン
生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムＣｌ
５６株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６９１０）の染色体ＤＮＡを
実施９１１　ｆｉ＋と同様の方法で調製する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるｐＣＧｌｌは、
コリネバクテリウム・グルタミクムし−２２株の誘導味
ＬＡ１０３のｐｃＧ１１保有株ＬＡ１０３／ｐｃＧ１１
　（ＡＴＣＣ３９０２２）から実施例１（１）と同様に
して単離する。

（２）　　コリネバクテリウム・グルタミクム０１５６
株のヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化： 上記で調製したｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡ３μｇおよ
び上記染色体ＤＮＡ９μｇを含む制御Ｉ！酵素Ｂｇｊｆ
ｆ用反応液（１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）。

７ｍＭＭｇｃｚ２＋　　６０ｍＭＮａＣ１，７ｍＭ２−
メルカグトエタノール）２００μｌに１０単位のＢｇｌ
ｍ　（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６０分間反応後
、６５℃で１０分間加温して反応を停止させる。この混
合消化物にＴ４リガーゼ用緩衝液（トリス２００ｍＭ、
　ＭｇＣ４２６６ｍＭ、ジチオスレイトール１００ｍＭ
、ｐＨ７，６）４０ｔｔｌ。

５ｍＭＡＴＰ溶液４０ｐＨ，Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製
、１単位／μｆｆ１）０．３μ！および水１２０μｌを
加え、１２℃で１６時間反応させる。

Ｔ４リガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＬＨ３３株（ヒスチジン要求性。

リゾチーム感受性）の形質転換に供する。

形質転換はＬＨ３３株のプロトプラストを用いて行う、
プロトプラストの調製は実施例１（２）と同様に行う。

プロトプラスト懸濁１０．５＋ｅｌを小試験管にとり２
５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝１（１０
ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウム、５０
ｍＭトリス、４００ｍＭシー糖。

ｐＨ７，５）１ｍｌに再＠濁して速心洗浄後、ＴＳＭＣ
緩衝液０．１　ｍｌに再ｓ＋＋ｉする。この懸濁液に２
倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合
物の１対１混合液１００．１７ｊ！を加えて混和し。

次いでＴＳＭＣ＊衡液中に２０％ＰＥＧ６，０００を含
む液０．８１１を添加して混合する。、３分後、ＲＣＧ
Ｐ培地（ｐ　Ｈ７，２）２ｍｌを添加し、２．５００×
ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除去し。

沈降したプロトプラストを１１のＲＣＧＰ培地に懸濁し
てから０．２１をスペクチノマイシン４００μｇ／ｍｌ
を含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天
を含む培地、ｐＨ７，２）に塗抹し。

３０℃で７日間培養する。

選択プレート上に生育したスペクチノマイシン耐性コロ
ニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗今後、
スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含む最小寒天培
地Ｍ１に塗布して３０℃で２日間培養し、スペクチノマ
イシン耐性でかつヒスチジン非要求性となった形質転換
株を選択する。

形質転換株の１株から上記第（’１１項記戦のエチジウ
ムブロマイド・セシウムクロライド密度匂配遠心により
プラスミドを単離する。各種制限酵素による単独消化お
よび２＠頬の制限酵素による二重消化で生成するＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動で解析し、このプラスミ
ドＤＮＡの刺ｌｉｔ酵素切断様式を同定する。このプラ
スミドをｐＰＨ８と命名した。ｐＰＨ８はｐｃＧＩ　１
（ＤＢｇ１ｍ切断部位に約ｌ０１６ＫｂのＤＮＡ断片が
挿入された構造である。

さらにｐＰＨ８ＤＮＡを用いてＨ２Ｓ株（ＬＨ３３株の
親株（ヒスチジン要求性、リゾチーム耐性）：ＦＥＲＭ
　　Ｐ−６９０９）を再形質転換したところスペクチノ
マイシン耐性株として選択される形質転換体のすべてが
ヒスチジン非要求性となっていた。これらのことより、
ヒスチジン生産菌Ｃ１５６株のヒスチジン生合成に関与
する遺伝子がクローン化されていることが明白である。

ヒスチジン生成に関与する遺伝子のクローニングは最初
からＨ２Ｓ株を宿主菌株として用いて行うことも！きる
。

（３１ｐＰＨ８を保育するコリネバクテリウム・グルタ
ミクム菌株によるし一ヒスチジンの生産：コリネバクテ
リウム・グルタミクムＬＡ−１０３株（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−５９４７，ＡＴＣＣ３１８６６）＊ｐＰＨ８ＤＮＡで
形質転換し、スペクチノマイシン４００μｇ／ｍｌを含
むＲＣＧＰ寒天培地上で同薬剤耐性の形質転換株を選択
する。得られた形質転換株を純化後、上記と同様にプラ
スミド単離。

構造解析を行って、ｐＰＨ８と同じ構造のプラスミドで
あることを確認した。

ｐＰＨ８保有株コリネバクテリウム・グルタミクＡＬＡ
１０３／ｐＰＩ−１８は米国アメリカン・タイプ・カル
チ（−−コレクシーンにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｓｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＫ　３２　、　ＡＴＣＣ３９２
８１として寄託されている。

コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ１０３／ｐｃＧ
１１　　（ＡＴＣＣ３９０２２）および同ＬＡ１０３／
ｐＰＨ８（ＡＴＣＣ３９２８１）のＬ〜ヒスチジン生産
試験を以下のとおり行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養した上記の菌をそれぞ
れ１白金耳ずつ２００μｇ／■１のアルギニンおよびメ
チオニンを補った５ｍｌの生産培地Ｐ５　〔糖蜜１２％
（糖としテ）　、　　ＫＨ２ＰＯ４０，２％、に２ＨＰ
Ｏ４０，１％、Ｍｇ５Ｏａ　・７Ｈ２００，０５％、Ｎ
ａＣ１０，２５％、　　（ＮＨ４）２ＳＯ４２，３％、
尿素０．２％、ＣａＣＯ３２％、ｐＨ７，４（アンモニ
アでｍ整）〕に植薗する。３．０’Ｃで７５時間培養後
、培地中のし一ヒスチジン生成量をスルフ１ニル酸（ポ
ーリー）試薬を用いる比色法（Ｈ９Ｐａｕｌｙ、　Ｈｏ
ｐｐｅ−３ａｙｌｅｒｓ；　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏ、Ｃ
ｈｅｓ、。

４２、５０８　　（１９０４）　、同９４．２８４　　
（１９１５）　）　！：よって定量した。結果を第５表
に示す。

第　　　５　　　表 （４１ｐＰＨ８を保有するコリネバクテリウム・ハーキ
エリス、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムによるし一ヒスチジ
ンの生ｊ１： コリネバクテリウム・ハーキユリスＡＴＣＣ１３８６８
、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７お
よびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９にプラスミドｐＰＨ８を保有せしめるため
に、各菌株を受容菌として形質転換を行う。

各１株を５５Ｍ培地で増殖させ、０Ｄ６６０ｎ−が０．
２になったときにペニシリンＧを０．３単位／−１とな
るように添加する。培養を続け、０Ｄ６６０が０．６ま
で増加したところで集■し、１■／ｍｌリゾチームを含
むＲＣＧＰ培地中培土中の記載と同様にプロトプラスト
を形成させる。ｐＰＨ８を用い、上記の方法に従い形質
転換を行い、形質転換株をスペクチノマイシン４００μ
ｇ／■１を含むＲＣＧＰ寒天培地上で生育するコロニー
として選択する。

純化したスペクチノマイシン耐性形質転換株の培養菌体
よりプラスミドＤＮＡを特開昭５７−１８３７９９、同
５７−１３４５００の記載に従って調製し、これらがｐ
ｐＨｓと同じ構造を有することがＩ４順酵素切断様式よ
り確認される。以上のことから、プラスミドｐｃＧ１１
の誘導体であるプラスミドｐＰＨ８はコリネバクテリム
・ハーキエリス、ブレビバクテリウム・フラバムおよび
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム中でも複製
可能であり、プラスミドｐｃＧ１１が広くこれら菌種の
細菌で使用可能であることがわかる。

ｐＰＨ８保有株であるコリネバクテリウム・ハーキユリ
スに３３．ブレビバクテリウム・フラバムに３４．およ
びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに３５は
それぞれ米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
シーンにＡＴＣＣ３９２８２，３９２８３および３９２
８４として寄託されている。

これら菌株によるし一ヒスチジン生塵試験を次のように
行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養させたｐＰＨ８保有株
およびそれらの親株をそれぞれｌ白金耳ずつ５１の生産
培地Ｐ５に植菌する。３０℃で７５時間振盪培養後、培
地中のし一ヒスチジン生度量をポーソー法によって比色
定置する。結果を第６表に示す。

以上より、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のヒ
スチジン生成に関与する遺伝子がコリネバクテリウム・
グルタミクム以外にコリネバクテリウム・ハーキエリス
、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムの緒薗種において発現し、ヒス
チジンの生産に寄与していることが明らかであった。」
（３）　　明細書第６頁６行目の「ベクターを挿入」を
［ベクターを含む組み換え体ＤＮＡを導入」に訂正する
。

（４）　　明細書第６頁６行目の「組換え技法」を「組
換えＤＮＡ技法」に訂正する。

（５）　　明細書第６１頁６行目の［スペクチノマイシ
ン耐性」の後にｒ　（ＳｍＲ／５ｐｅｃＲ）Ｊを加入す
る。

（６）明細書第６１頁６行目の「カナマイシン耐性」の
後にｒ　（Ｔｃ　Ｒ，ＣｍＲ，ＫｍＲとそれぞれいう）
」を加入する。

（７）　　明細書第６１頁６行目の「ラウリル酸ナトリ
ウム」を「ラウリル硫酸ナトリウム」に訂正すする。

（８）　　明細書第６１頁行目の「トリス」を「トリス
塩酸」に訂正する。

（９）　　明細書簡３９頁３行目の［最小寒天培地ＭＬ
Ｊを［最小寒天培地ＭＩＪに訂正する。

（至）明細書第６１頁６行および１５行目の［７，ＩＫ
ｂＪを［約７．　Ｉ　Ｋ　ｂ　Ｊに訂正する。

（６）明細書第６１頁６行目の「および」を「あるいは
」に訂正する。

ω　明細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。

６、添付書類の目録 微生物受託証　　１通 特許請求の範囲 （１）少なくとも一種の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベク
ターＤＮＡとの組換え体で、かつ１ｉｌｉＤＮＡの少な
くとも一方が宿主菌株に対して外来性である組換え体Ｄ
ＮＡを用いコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換
して得られる形質転換株を培地に培養し、該遺伝子の形
質を発現せしめることを特徴とする遺伝子の形質発現方
法。

（２）該遺伝子を含むＤＮＡ断片が真核生物、原核生物
、ウィルス、穴クテリオファージまたはプラスミド由来
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記戦の方
法。

（３）　　該真核生物が哺乳類に属することを特徴とす
る特許請求の１ｉｌｆｌｌ　２項記戦の方法。

（４１ｔｌｉＭ植生物が細菌であることを特徴とする特
許請求の範囲５１４２項記載の方法。

＋５）　　該細菌がエソシエリヒア属２　コリネバクテ
リウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属。

スタフィロコッカス属およびセラチア属から選ばれるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方法。

（６）該遺伝子が酵素、蛋白質またはペプタイドをコー
ドする遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲第
１〜５項記戦の方法。

（７）　　該遺伝子が細胞の代謝、とくに合成活性に関
与する遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲第
１〜５項記載の方法。

＋８）　　ＩＮ遺伝子がアミノ酸、ビタミン、核酸また
は抗生物質の生成に関与する遺伝子であることを特徴と
する特許請求の範囲第７項記戦の方法。

（９）　　該アミノ酸がグルタミン酸、リジン、スレオ
ニン、トリプトファンまたはヒスチジンであることを特
徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法。

ｃＩＩ該ベクターがコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属する微生物由来の１ラスミド、ファ
ージまたはその誘導体であることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の方法。

０　該プラスミドおよびその誘導体がコリネバクテリウ
ム属に属する微生物由来のｐｃＧ］。

ｐＣＧ２．ｐＣＧ４．ｐＣＥ５２．ｐｃＥ５３゜ｐＣＥ
５４．ｐｃＧｌｌ、ｐｃＢｌｏｌまたはｐＥｔｈｒｌと
名付けたプラスミドであることを特徴とする特許請求の
範囲第１０項記載の方法。

■　該宿主菌株がコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属し、かつリゾチーム感受性であること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記戦の方法。

■　該宿主菌株がコリネバクテリウム・グルタミクムし
−２２またはその誘導株であることを特徴とする特許請
求の範囲第１２項記載の方法。

（至）少なくとも一種の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベク
ターＤＮＡとの組換え体で、かつ両ＤＮＡの少なくとも
一方が宿主１株に対して外来性である組換え体ＤＮＡを
用いコリネバクテリウム属またはブレヒ゛バクテリウム
属に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して
得られる菌株を培地に培養し、該遺伝子が関与する代謝
物質を培養物中に生成蓄積せしめ、該培養物から該物質
を採取することを特徴とする物質の製造法。

■　該物質が蛋白質、酵ｓ５ベプタイド、　アミノ酸、
ビタミン、核酸および抗生物質から選ばれることを特徴
とする特許請求の範囲第１４４項記の方法。

ｆ＋６１　１ｍアミノ酸がグルタミン酸、リジン、スＩ
／オニン、トリプトファンまたはヒスチジンであること
を特徴とする特許請求の範囲第１５項記載の方法。

０７）　　該細菌がヒスチジンアナログに耐性であるこ
法。

の方法。

ＡＴＣＣ３９０３５゜ 体）　コリネバクテリウム・グルタミクムに３１゜ＡＴ
ＣＣ３９２８５゜ 手続補装置（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和器６都特許願第２１０ｉｏｎ号 １発明の名称 遺伝子の形質発現方法 龜補正をする看 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　　東京都千代田区大手町−丁目６査１号名称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置：０８−２０１−
７２１１内＠［２７６１）昭和ｓ８年８月１５日（発送
日：同５１１年３月２８日）＆補正の対象 昭和５８年ｌＡ１７日付提出の手続補装置の〆どｍ−、
〜 差出書の補正の対象の欄　　　　　　／’ｓ＋ｊ；　１
／＋’　Ｉ’ｊ・＼ａ補正の内容 別紙のとおり 手続補装置 昭和ｓ８年　１月　７７日 特許庁長官　殿 り事件の表示 昭和ｉ６年特許願第２１目■８号 ２発明の名称 遺伝子の形質発現方法 龜補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　Ｚｏ。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも一種の遺伝子を含むＤＮ人断片とベク
   ターＤＮＡとの組換え体で、かつ両ＤＮ人の少なくとも
   一方が宿主菌株に対して外来性である組換え体ＤＮＡを
   用いコリネバクテリウム属ま九はブレビパフチリウム属
   に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得
   られる形質転換株を培地に培養し、咳遺伝子の形質を発
   現せしめることを特徴とする遺伝子の形質発現方法・
2. （２）骸遺伝子を含むＤＮ人断片が真被生物、原核生物
   、ウィルス、バクテリオファージまたはプラス之ド由来
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. （３）　　咳真核生物が哺乳類に属することを特徴とす
   る特許請求の範囲第型項記載の方法。
4. （４）＃原核生愉が細菌であることを４１Ｉ徴とする特
   許請求の範囲第２項記載の方法。
5. （５）　　該細菌がエッシエリヒア属、コリネバクテリ
   ウム属、ブレビバクテリウム属、バチルスｊｊＰよびス
   タフィロコッカス属から選ばれることを特徴とする特許
   請求の範囲第４項記載の方法。 （四　該遺伝子が酵素、蛋白質またはペブタイドを；１
   −ドする遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲
   １８１〜５項記載の方法。 （７３＠遺伝子が細胞の代紺または合成活性に関与する
   遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲第１〜Ｓ
   項記載の方法。 ｔｅｌ　　誼遺伝子がアミノ酸、ビタンン、核ｗＩまた
   は抗生物質の生成に関与する遺伝子であることを特徴と
   する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ＋９１　　骸アンノ酸がグルタンン酸、リジンまたはス
   レオニンであることを特徴とする特許請求の範囲第８項
   記載の方法。 鯖　皺ベクターがコリネバクテリクム属またはブレビバ
   クテリウムｊｌＩＫ−する微生物由来のブツスミド、フ
   ァージ壕九はそ０１ｌｌ導体であゐことを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載ｏ′ｙＪ法。 ｉ１農　腋プ２スンドおよびその誘導体がコリネバクテ
   リクム属に属する微生物由来のｐｃＧｌ、ｐｃＧｚ、ｐ
   Ｃ’Ｇ４、ｐｃｍｓ１％ｐｃｌｉ４、ｐｃＧｌｌ、ｐｃ
   Ｂｌｏｌ　を友はｐＨｔｈｒ　１と名付は九グツスイド
   であることを＊＊とすゐ特許請求Ｏ１［１１！１ｊｉＥ
   Ｉ　ＯＩＪ記ｍ４Ｄ方法。 Ｕ　＃蜜主曹株がコリネパクテリク五真オ九はプレビバ
   クテリウ五属に属し、かつリゾチーム感受性であること
   ｔ％蒙とする＊ｔｔＭ求の範−ｍｉｌｌｉ記載の方法。 輪　皺宿主曹株がスリネパクテリクム・グルタミタムＬ
   −！２まえはその誘導体であることを特徴とする特許請
   求ｏｉ＋ｉ−継１８項継部８項記載 ■　少なくと４−ｓｏ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクタ
   ーＤＮＡとの組換え体で、かつ内９８人の少なくとも一
   方が宿主−株に対して外来性である組換え体ＤＮＡを用
   いコリネバタテリクム属またはブレビバクテリウム−［
   ｊｌする微生物から選ばれる宿主−株を形質転換して得
   られる菌株を培地に培養し、該遺伝子が関与する代鮒物
   實を培養物中に生成蓄積せしめ、該培養物から該物質を
   線順することをＩｆＩＩ敏とする１實の製造法。 ｌＩ　　該物質が蛋白質、酵素、ベプタイド、アミノ酸
   、ビタミン、核酸および抗生物質から遇ばれることｔ籍
   蘇とする特許請求の範囲第１４積記載の方法。 輸　骸アンノ酸がグルタオン酸、リジンを九はスレオニ
   ンであることを特徴とする特許請求０＠−幕１６項紀叡
   の方法。