CN111117942A

CN111117942A - 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用

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Publication number: CN111117942A
Application number: CN202010049041.5A
Authority: CN
Inventors: 吴海珍; 叶江; 张惠展; 侯兵兵; 王瑞达
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111117942B

Abstract

本发明公开了一种产林可霉素的基因工程菌，其是将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因敲除和将编码RNA酶的基因敲除并过表达林肯链霉菌的编码Xre家族蛋白的基因构建获得。本发明还公开了一种产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因敲除和将编码RNA酶的基因敲除并过表达林肯链霉菌的编码Xre家族蛋白的基因构建获得产林可霉素的基因工程菌。本发明的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其操作简便，构建获得的基因工程菌可以提高林可霉素的产量，具有良好的应用前景。

Description

一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

林可霉素(lincomycin)是由林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)产生的一种具有广泛临床药用价值的林可酰胺类抗生素。林可霉素及其衍生物(如氯代衍生物克林霉素)对于厌氧型革兰氏阳性菌，以及原生动物具有抑制作用。林可霉素通过与核糖体50s亚基中的23s rRNA的中心环疏水性结合，抑制蛋白质翻译过程中的多肽链转移，从而发挥抑菌功能。林可霉素与大多数药用抗生素都不存在交叉抗性，临床上广泛用于治疗呼吸道、泌尿系统、皮肤及软组织感染，慢性骨髓炎，脑膜炎，中耳炎和眼科疾病等，特别适用于对内酰胺类抗生素有抗性的细菌感染患者。

过去几十年的生产实践中，林可霉素工业菌株的获取主要依靠物理或化学方法诱变，不但耗时，且随机性较大，无法对育种提供理论性指导。林可霉素的发酵生产水平与其他大宗抗生素相比仍存在较大差距，亟需通过新的技术手段获得优良的高产菌株，以满足工业生产的需求。

TPR(Tetratricopeptide repeat)是一个含34个氨基酸的蛋白重复序列，编码一个α螺旋-转角-α螺旋的二级结构片段，通常以前后串连的形式重复出现在蛋白结构中。前后相连的TPR折叠形成一个介导蛋白之间相互作用的结构域。含TPR结构域的蛋白广泛分布于原核和真核生物中，在细胞中行使各种各样的功能(细胞循环调节、转录调控、蛋白折叠与分泌)。目前已有多个含TPR结构域的蛋白质被发现在链霉菌中发挥抗生素合成调控的功能。目前尚无在林肯链霉菌中发现TPR调控林可霉素合成的案例报道。

RNA酶通过在细胞内对RNA加工或降解，在转录后水平调控基因表达量，进而广泛影响包括细胞生长、形态分化、核糖体组装及次级代谢等在内的细胞过程。早期研究发现，Rnase J是一种同时具有核酸外切和内切活性的RNA酶，在天蓝色链霉菌和委内瑞拉链霉菌体内影响多种抗生素的生物合成。但目前尚无RNA酶调控林可霉素合成的案例被报道。

Xre(xenobiotic response element)家族蛋白质是一类于真核生物、细菌和古细菌都广泛存在的转录调控因子。其结构上包含N末端的发挥NDA结合功能的HTH(螺旋-转角-螺旋)结构域，以及C末端的配体结合结构域。该家族成员已知的生物学功能包括噬菌体的转录调控，细菌质粒拷贝数的控制等。编码Xre家族蛋白的基因广泛存在于链霉菌基因组，但生物学功能被解析的只有极少数。目前尚无通过改造Xre家族基因提高林可霉素产量的案例。

发明内容

本发明致力于通过基因工程手段定向改造基因，以获得用于林可霉素及其药用衍生物工业生产的高产菌株。为此，本发明通过研究，在林肯链霉菌野生菌株NRRL 2936的基因组中发现了多个编码含TPR结构域蛋白质的基因，并从中选取了三个基因(slinc566、slinc4481、slinc6027)进行了基因敲除尝试。其中缺失slinc4481基因后，林肯链霉菌NRRL2936中林可霉素产量提高了18.7倍，说明SLINC4481是一个参与林可霉素合成过程的负调控因子。

同时，本发明经过序列同源分析，林肯链霉菌NRRL 2936基因组上的slinc6156基因被发现编码Rnase J。缺失slinc6156基因后，林可霉素产量较出发菌株提高了22.4倍，说明SLINC6156是一个参与林可霉素生物合成过程的负调控因子。

同时，本发明在在林肯链霉菌野生菌株NRRL 2936的基因组中选取了两个编码Xre家族蛋白质的基因(slinc348与slinc4742)进行了基因敲除尝试。其中缺失slinc348基因后，林肯链霉菌NRRL 2936中林可霉素产量检测不到，说明SLINC348是一个参与林可霉素合成过程的正调控因子。但缺失slinc4742基因对于林可霉素产量几乎无影响。在林肯链霉菌中过表达slinc348后，林可霉素产量提高7.8倍。

因此，本发明的第一个目的是提供一种产林可霉素的基因工程菌，以解决现有的林肯链霉菌的林可霉素产量低的问题。本发明的第二个目的是提供一种产林可霉素的基因工程菌的构建方法，以构建一种新的可以提高林可霉素产量的基因工程菌。本发明的第三个目的是提供一种产林可霉素的基因工程菌在发酵生产林可霉素中的应用。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种产林可霉素的基因工程菌，其是将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因敲除和将编码RNA酶的基因敲除并过表达林肯链霉菌的编码Xre家族蛋白的基因构建获得。

根据本发明，所述编码含TPR结构域蛋白质的基因为slinc4481基因；所述编码RNA酶的基因为slinc6156基因；所述编码Xre家族蛋白的基因为slinc348基因。

根据本发明，所述林肯链霉菌为林肯链霉菌NRRL 2936。

作为本发明的第二个方面，一种上述所述的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因和编码RNA酶的基因敲除，并过表达编码Xre家族蛋白，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

进一步的，所述的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的slinc4481基因和slinc6156基因敲除，并过表达slinc348基因，构建获得产林可霉素的基因工程菌Δ4481Δ6156::348。

根据本发明，所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、构建基因工程菌Δ4481

以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的slinc4481基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌Δ4481；

步骤二、构建基因工程菌Δ4481Δ6156

以基因工程菌Δ4481为出发菌株，将基因工程菌Δ4481的slinc6156基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌Δ4481Δ6156；

步骤三、构建基因工程菌Δ4481Δ6156::348

以基因工程菌Δ4481Δ6156为出发菌株，过表达slinc348基因，构建获得产林可霉素的基因工程菌Δ4481Δ6156::348。

根据本发明，根据本发明，PCR反应条件为：98℃，10分钟；98℃，40秒；64℃，30秒；72℃，80秒，30个循环；72℃，10分钟；25℃，2分钟。

步骤一、(1)构建slinc4481敲除载体

A、以u4481-F/R和d4481-F/R为引物，林肯链霉菌基因组为模板，进行PCR扩增，获得slinc4481上下游同源臂，所述u4481-F/R和d4481-F/R的引物序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示；

B、以slinc4481上下游同源臂片段为模板，以sg4481/u4481-R为引物，进行PCR扩增，获得以添加特异性识别slinc4481基因内序列的sgRNA序列；sg4481的引物序列如SEQID NO：8所示；

C、将步骤B的sgRNA序列克隆接入经SpeI/HindIII双酶切pKCcas9dO线性载体，获得pKCcas9d4881敲除载体；

(2)构建Δ4481突变株

将pKCcas9d4881质粒转入大肠杆菌S17-1，获得pKCcas9d4881/S17-1，将培养后的pKCcas9d4881/S17-1与林肯链霉菌进行接合转移；通过含阿普拉霉素培养基筛选到转化子，转化子培养获得Δ4481突变株；

(3)构建产林可霉素的基因工程菌Δ4481

将Δ4481突变株通过不含抗生素的培养基和含阿普拉霉素培养基进行培养和筛选进行培养和筛选获得基因工程菌Δ4481，该基因工程菌Δ4481通过发酵生产可以获得高产量的林可霉素；

步骤二、(1)构建slinc6156敲除载体

A、以u6156-F/R和d6156-F/R为引物，林肯链霉菌基因组为模板，进行PCR扩增，获得slinc6156上下游同源臂，所述u6156-F/R和d6156-F/R的引物序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26所示；

B、以slinc6156上下游同源臂片段为模板，以sg6156/u6156-R为引物，进行PCR扩增，获得以添加特异性识别slinc6156基因内序列的sgRNA序列；sg6156的引物序列如SEQID NO：22所示；

C、将步骤B的sgRNA序列克隆接入经SpeI/HindIII双酶切pKCcas9dO线性载体，获得pKCcas9d6156敲除载体；

(2)构建Δ4481Δ6156突变株

将pKCcas9d6156质粒转入大肠杆菌S17-1，获得pKCcas9d6156/S17-1，将培养后的pKCcas9d6156/S17-1与基因工程菌Δ4481进行接合转移；通过含阿普拉霉素培养基筛选到转化子，转化子培养获得Δ4481Δ6156突变株；

(3)构建基因工程菌Δ4481Δ6156

Δ4481Δ6156突变株通过不含抗生素的培养基和含阿普拉霉素培养基进行培养和筛选获得基因工程菌Δ4481Δ6156，该基因工程菌Δ4481Δ6156通过发酵生产可以获得高产量的林可霉素；

步骤三、(1)构建pIB348重组质粒

分别以348-F/R和348-F/R为引物，林肯链霉菌基因组为模板，PCR扩增slinc348完整基因阅读框；纯化后的PCR产物与pIB139质粒分别用限制性内切酶XbaI和EcoRI酶切；将纯化的外源和载体使用T4连接酶链接成环，得到pIB348重组质粒；

(2)构建Δ4481Δ6156::348突变株

将pIB348重组质粒转入大肠杆菌S17-1，并培养；接着，与基因工程菌Δ4481Δ6156进行接合转移；通过含阿普拉霉素培养基筛选到转化子，转化子培养获得Δ4481Δ6156::348突变株；

(3)构建基因工程菌Δ4481Δ6156::348

Δ4481Δ6156::348突变株通过不含抗生素的培养基和含阿普拉霉素培养基进行培养和筛选获得Δ4481Δ6156::348，该基因工程菌Δ4481Δ6156::348通过发酵生产可以获得高产量的林可霉素。

根据本发明，步骤一和步骤二的PCR反应条件为：98℃，10分钟；98℃，40秒；64℃，30秒；72℃，80秒，30个循环；72℃，10分钟；25℃，2分钟；

步骤三的PCR反应条件为：所述PCR反应条件为：98℃，10分钟；98℃，40秒；64℃，30秒；72℃，140秒，30个循环；72℃，10分钟；25℃，2分钟。

作为本发明的第三个方面，一种产林可霉素的基因工程菌，其是将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因和编码RNA酶的基因敲除构建获得。

根据本发明，所述编码含TPR结构域蛋白质的基因为slinc4481基因；所述编码RNA酶的基因为slinc6156基因。

根据本发明，所述林肯链霉菌为林肯链霉菌NRRL 2936。

作为本发明的第四个方面，一种上述所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因和编码RNA酶的基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

进一步的，所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的slinc4481基因和slinc6156敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌Δ4481Δ6156。

根据本发明，所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、构建基因工程菌Δ4481

步骤二、构建基因工程菌Δ4481Δ6156

以基因工程菌Δ4481为出发菌株，将基因工程菌Δ4481的slinc6156基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌Δ4481Δ6156。

根据本发明，PCR反应条件为：98℃，10分钟；98℃，40秒；64℃，30秒；72℃，80秒，30个循环；72℃，10分钟；25℃，2分钟。

作为本发明的第五个方面，一种产林可霉素的基因工程菌，其是将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因敲除构建获得。

根据本发明，所述编码含TPR结构域蛋白质的基因为slinc4481基因。

根据本发明，所述林肯链霉菌为林肯链霉菌NRRL 2936。

作为本发明的第六个方面，一种上述所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

进一步的，所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的slinc4481基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌Δ4481。

作为本发明的第七个方面，一种产林可霉素的基因工程菌，其是将林肯链霉菌的编码RNA酶的基因敲除构建获得。

根据本发明，所述编码RNA酶的基因为slinc6156基因。

根据本发明，所述林肯链霉菌为林肯链霉菌NRRL 2936。

作为本发明的第八个方面，一种上述所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的编码RNA酶的基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

进一步的，所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的slinc6156基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌Δ6156。

步骤一、构建slinc6156敲除载体

步骤二、构建Δ6156突变株

将pKCcas9d6156质粒转入大肠杆菌S17-1，获得pKCcas9d6156S17-1，将培养后的pKCcas9d6156/S17-1与林肯链霉菌离心并进行接合转移；通过含阿普拉霉素培养基筛选到转化子，转化子培养获得Δ6156突变株；

步骤三、构建产林可霉素的基因工程菌Δ6156

将Δ6156突变株通过不含抗生素的培养基和含阿普拉霉素培养基进行培养和筛选获得基因工程菌Δ6156，该基因工程菌Δ6156通过发酵生产可以获得高产量的林可霉素。

作为本发明的第九个方面，一种产林可霉素的基因工程菌，其是通过过表达林肯链霉菌的编码Xre家族蛋白的基因构建获得。

根据本发明，所述编码Xre家族蛋白的基因为slinc348基因。

作为本发明的第十个方面，一种上述所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，过表达林肯链霉菌的编码Xre家族蛋白的基因，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

进一步的，所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其是以林肯链霉菌为出发菌株，过表达林肯链霉菌的slinc348基因，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

作为本发明的第十一个方面，一种上述所述的产林可霉素的基因工程菌在发酵生产林可霉素中的应用。

本发明的产林可霉素的基因工程菌及其构建方法，其有益效果：其构建方法简便，通过敲除菌株NRRL 2936的slinc6156基因、slinc6156基因、同时敲除slinc6156基因和slinc6156基因、或者同时敲除slinc6156基因和slinc6156基因并过表达slinc348基因，构建获得的林可霉素的基因工程菌Δ4481Δ6156::348、基因工程菌Δ4481、基因工程菌Δ6156以及基因工程菌Δ4481Δ6156，均可以提高林可霉素的工业产量，具有良好的工业应用价值。

附图说明

图1为slinc566基因敲除质粒的图谱。

图2为slinc4481基因敲除质粒的图谱。

图3为slinc6027基因敲除质粒的图谱。

图4为slinc6156基因敲除质粒的图谱。

图5为slinc348基因敲除质粒的图谱。

图6为slinc4742基因敲除质粒的图谱。

图7为slinc566基因敲除突变株构建示意图。

图8为slinc4481基因敲除突变株构建示意图。

图9为slinc6027基因敲除突变株构建示意图。

图10为slinc6156基因敲除突变株构建示意图。

图11为slin348基因敲除突变株构建示意图。

图12为slinc4742基因敲除突变株构建示意图。

图13为NRRL 2936中slinc566、slinc4481、slinc6027、slinc6156、slinc348、slinc4742基因敲除突变株PCR鉴定电泳图。

图14为NRRL 2936中slinc4481与slinc6156基因联合敲除突变株PCR鉴定电泳图。

图15为NRRL 2936与Δ4481Δ6156中过表达slinc348突变株PCR鉴定电泳图。

图16为Δ566、Δ4481、Δ6027、Δ6156、Δ348、Δ4742突变株发酵液生物效价图。

图17为Δ4481Δ6156突变株发酵液生物效价图。

图18为O348突变株发酵液生物效价图。

图19为Δ4481Δ6156::348基因联合敲除突变株发酵液生物效价图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

1、本发明所用的引物序列见表1。

表1本发明研究中所用的引物序列

备注：斜体代表sgRNA特异性识别靶基因的序列；加粗代表与相应同源臂重叠的序列；加粗并斜体代表与pKCcas9dO重叠的序列；划横线代表酶切位点。

2、本发明所用的培养基见表2

表2本发明研究中所用的培养基

3、本发明涉及的菌株和质粒：

(1)林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)：NRRL 2936；

(2)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)：CGMCC 28001，林可霉素生物效价指示菌。

(3)大肠杆菌DH5α、大肠杆菌S17-1为市售产品；

(4)质粒pKCcas9dO购自于Addgene(http://www.addgene.org/62552/)。

(5)质粒pIB139：链霉菌整合质粒，可购自北京华越洋生物(http://www.huayueyang.com.cn/product/277434631)。

4、本发明的用于质粒克隆的大肠杆菌DH5α和用于接合转移的大肠杆菌S17-1在28℃的LB固体(含1.8％琼脂)培养基或LB液体培养基培养。林肯链霉菌及其衍生株在28℃的MS固体培养基或YEME液体培养基培养。

5、slinc566、slinc4481、slinc6027、slinc6156、slinc348、slinc4742的序列分别如SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ IDNO：52所示。

6、PCR反应体系：taq酶mixture，5μL；模板1μL；引物各1μL；水；2μL。

实施例1 slinc566、slinc4481、slinc6027、slinc6156、slinc348、slinc4742敲除载体的构建

本实施例中的基因敲除方案是基于CRISPR/Cas9技术。

本实施例的PCR反应条件为：98℃，10分钟；(98℃，40秒；64℃，30秒；72℃，80秒)×30个循环；72℃，10分钟；25℃，2分钟。

1、slinc566敲除载体的构建

步骤一、以u566-F/R和d566-F/R为引物，林肯链霉菌NRRL 2936基因组为模板，PCR扩增slinc566上下游同源臂。经1％琼脂糖凝胶电泳检测，将1.1kb处的目标条带切胶回收纯化。

步骤二、将上一步PCR反应得到的上下游同源臂片段作为模板，以sg566/u566-R为引物，PCR扩增以添加特异性识别slinc566基因内序列的sgRNA序列。经1％琼脂糖凝胶电泳检测，将1.1kb处的目标条带切胶回收纯化。

步骤三、将上述得到的带有sgRNA序列的上游同源臂、下游同源臂，通过in-fusion克隆连接入经SpeI/HindIII酶切的pKCcas9dO线性载体，构建得到pKCcas9d566敲除载体。pKCcas9d566序列图谱如图1所示。

2、slinc4481敲除载体的构建

slinc4481敲除载体的构建的步骤与slinc566的步骤大致相同，区别是引物序列对不同。区别为：步骤一是以u4481-F/R和d4481-F/R为引物，PCR扩增slinc4481上下游同源臂；步骤二是以sg4481/u4481-R为引物，以slinc4481上下游同源臂片段为模板PCR扩增以添加特异性识别slinc4481基因内序列的sgRNA序列。步骤三构建获得的pKCcas9d4481的序列图谱如图2所示。

3、slinc6027敲除载体的构建

slinc6027敲除载体的构建的步骤与slinc566的步骤大致相同，区别是引物序列对不同。区别为：步骤一是以u6027-F/R和d6027-F/R为引物，PCR扩增slinc6027上下游同源臂；步骤二是以sg6027/u6027-R为引物，以slinc6027上下游同源臂片段为模板，PCR扩增以添加特异性识别slinc6027基因内序列的sgRNA序列。步骤三构建获得的pKCcas9d6027的序列图谱如图3所示。

4、slinc6156敲除载体的构建

slinc6156敲除载体的构建的步骤与slinc566的步骤大致相同，区别的地方是引物序列对不同。具体区别为：步骤一是以u6156-F/R和d6156-F/R为引物，PCR扩增slinc6156上下游同源臂；步骤二是以sg6156/u6156-R为引物，以slinc6156上下游同源臂片段为模板，PCR扩增以添加特异性识别slinc6156基因内序列的sgRNA序列。步骤三构建获得的pKCcas9d6156的序列图谱如图4所示。

5、slinc348敲除载体的构建

slinc348敲除载体的构建的步骤与slinc566的步骤大致相同，区别的地方是引物序列对不同。具体区别为：步骤一是以u348-F/R和d348-F/R为引物，PCR扩增slinc348上下游同源臂；步骤二是以sg348/u348-R为引物，以slinc348上下游同源臂片段为模板，PCR扩增以添加特异性识别slinc348基因内序列的sgRNA序列。步骤三构建获得的pKCcas9d4742的序列图谱如图5所示。

6、slinc4742敲除载体的构建

slinc4742敲除载体的构建的步骤与slinc566的步骤大致相同，区别的地方是引物序列对不同。具体区别为：步骤一是以u4742-F/R和d4742-F/R为引物，PCR扩增slinc4742上下游同源臂；步骤二是以sg4742/u4742-R为引物，以slinc4742上下游同源臂片段为模板，PCR扩增以添加特异性识别slinc4742基因内序列的sgRNA序列。步骤三构建获得的pKCcas9d4742的序列图谱如图6所示。

实施例2 slinc566、slinc4481、slinc6027、slinc6156、slinc348、slinc4742基因敲除。

1、本发明的slinc566基因敲除原理如图7所示。

步骤一、将pKCcas9d566质粒转入大肠杆菌S17-1。经LB培养基液体培养至OD₆₀₀＝0.4的pKCcas9d566/S17-1与经YEME培养基液体培养至菌丝均匀浓密的林肯链霉菌NRRL2936，离心收集清洗后，用2×YT培养基重悬，共同涂布于ISP4培养基，28℃培养，进行接合转移。涂板18h后，覆盖含阿普拉霉素(Apramycin，20μg/mL)与萘啶酮酸(Nalidixic acid，25μg/mL)的1mL无菌水溶液进行筛选。28℃继续培养4-7天后，可长出转化子菌落。挑取10个转化子菌丝体转接至含20μg/μL阿普拉霉素的MS培养基，28℃继续培养3-5天后，接种至YEME培养基28℃培养3天，抽提染色体，以JD566-F/R为引物，PCR鉴定阳性克隆，得到Δ566突变株。引物验证结果如图13所示。

步骤二、将Δ566突变株接种于YEME培养基，37℃培养2天后，按4％比例翻至新的YEME培养基，重复两次后，取菌液稀释1000倍后涂布于不含抗生素的MS培养基，28℃继续培养3-5天待长出单克隆后，挑20个单克隆分别转接至含20μg/μL阿普拉霉素与不含抗生素的MS培养基相同位置。培养3-5天后，若不含抗生素的MS培养基上长出克隆，而含阿普拉霉素的平板对应位置无克隆长出，则质粒顺利消除，得到无痕敲除株Δ566(基因工程菌Δ566)。

2、本发明的slinc4481基因敲除原理如图8所示。

敲除slinc4481基因的步骤与敲除slinc566基因的步骤大致相同，区别是引物序列对不同。区别为：步骤一将pKCcas9d4481质粒转入大肠杆菌S17-1。经LB培养基液体培养至OD₆₀₀＝0.4的pKCcas9d4481/S17-1与经YEME培养基液体培养至菌丝均匀浓密的林肯链霉菌NRRL 2936；另外，步骤一是以JD4481-F/R为引物，PCR鉴定阳性克隆，得到Δ4881突变株。引物验证结果如图13所示。

步骤二是将Δ4881突变株接种于YEME培养基。

3、本发明的slinc6027基因敲除原理如图9所示。

敲除slinc6027基因的步骤与敲除slinc566基因的步骤大致相同，区别是引物序列对不同。区别为：步骤一将pKCcas9d6027质粒转入大肠杆菌S17-1。经LB培养基液体培养至OD₆₀₀＝0.4的pKCcas9d6027/S17-1与经YEME培养基液体培养至菌丝均匀浓密的林肯链霉菌NRRL 2936；另外，步骤一是以JD6027-F/R为引物，PCR鉴定阳性克隆，得到Δ6027突变株。引物验证结果如图13所示。

步骤二是将Δ6027突变株接种于YEME培养基。

4、本发明的slinc6156基因敲除原理如图10所示。

敲除slinc6156基因的步骤与敲除slinc566基因的步骤大致相同，区别是引物序列对不同。区别为：步骤一将pKCcas9d6156质粒转入大肠杆菌S17-1。经LB培养基液体培养至OD₆₀₀＝0.4的pKCcas9d6156/S17-1与经YEME培养基液体培养至菌丝均匀浓密的林肯链霉菌NRRL 2936；另外，步骤一是以JD6156-F/R为引物，PCR鉴定阳性克隆，得到Δ6156突变株。引物验证结果如图13所示。

步骤二是将Δ6156突变株接种于YEME培养基。

5、本发明的slinc348基因敲除原理如图11所示。

敲除slinc348基因的步骤与敲除slinc566基因的步骤大致相同，区别是引物序列对不同。区别为：步骤一将pKCcas9d348质粒转入大肠杆菌S17-1。经LB培养基液体培养至OD₆₀₀＝0.4的pKCcas9d348/S17-1与经YEME培养基液体培养至菌丝均匀浓密的林肯链霉菌NRRL 2936；另外，步骤一是以JD348-F/R为引物，PCR鉴定阳性克隆，得到Δ348突变株。引物验证结果如图13所示。

步骤二是将Δ348突变株接种于YEME培养基。

6、本发明的slinc4742基因敲除原理如图12所示。

敲除slinc4742基因的步骤与敲除slinc566基因的步骤大致相同，区别是引物序列对不同。区别为：步骤一将pKCcas9d4742质粒转入大肠杆菌S17-1。经LB培养基液体培养至OD₆₀₀＝0.4的pKCcas9d4742/S17-1与经YEME培养基液体培养至菌丝均匀浓密的林肯链霉菌NRRL 2936；另外，步骤一是以JD4742-F/R为引物，PCR鉴定阳性克隆，得到Δ4742突变株。引物验证结果如图13所示。

步骤二是将Δ4742突变株接种于YEME培养基。

实施例3 基因工程菌Δ4481Δ6156的构建

本实施例的PCR反应条件与实施例2相同。

步骤一、将pKCcas9d6156质粒转入大肠杆菌S17-1。经LB培养基液体培养至OD₆₀₀＝0.4的pKCcas9d6156/S17-1与经YEME培养基液体培养至菌丝均匀浓密的基因工程菌株Δ4481，离心收集清洗后，用2×YT培养基重悬，共同涂布于ISP4培养基，28℃培养，进行接合转移。涂板18h后，覆盖含阿普拉霉素(Apramycin，20μg/mL)与萘啶酮酸(Nalidixic acid，25μg/mL)的1mL无菌水溶液进行筛选。28℃继续培养4-7天后，可长出转化子菌落。挑取10个转化子菌丝体转接至含20μg/μL阿普拉霉素的MS培养基，28℃继续培养3-5天后，接种至YEME培养基28℃培养3天，抽提染色体，以JD6156-F/R为引物，PCR鉴定阳性克隆，得到Δ4481Δ6156突变株。引物验证结果如图14所示。

步骤二、将Δ4481Δ6156联合敲除突变株接种于YEME培养基，37℃培养2天后，按4％比例翻至新的YEME培养基，重复两次后，取菌液稀释1000倍后涂布于不含抗生素的MS培养基，28℃继续培养3-5天待长出单克隆后，挑20个单克隆分别转接至含20μg/μL阿普拉霉素与不含抗生素的MS培养基相同位置。培养3-5天后，若不含抗生素的MS培养基上长出克隆，而含阿普拉霉素的平板对应位置无克隆长出，则质粒顺利消除，得到无痕联合敲除株Δ4481Δ6156(基因工程菌株Δ4481Δ6156)。

实施例4 slinc348过表达菌株的构建

分别以348-F/R和348-F/R为引物，林肯链霉菌NRRL 2936基因组为模板，PCR扩增slinc348完整基因阅读框。PCR反应条件为：98℃，10分钟；(98℃，40秒；64℃，30秒；72℃，140秒)×30个循环；72℃，10分钟；25℃，2分钟。经1％琼脂糖凝胶电泳检测，将2.3kb处的目标条带切胶回收纯化。纯化后的PCR产物与pIB139质粒分别用限制性内切酶XbaI和EcoRI酶切(37℃，1小时)。经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收对应大小条带后，将纯化的外源和载体使用T4连接酶链接成环(22℃，1小时)，得到pIB348重组质粒。

将pIB348质粒转入大肠杆菌S17-1后按实施例2中的步骤转入野生株NRRL 2936，得到O348突变株，引物对824F/R用于PCR鉴定。引物验证结果如图15所示。

将pIB348质粒转入大肠杆菌S17-1后按实施例2中的步骤转入突变株Δ4481Δ6156，得到Δ4481Δ6156::348突变株，引物对824F/R用于PCR鉴定。引物验证结果如图15所示。

实施例5基因工程菌Δ566、基因工程菌Δ4481、基因工程菌Δ6027、基因工程菌Δ6156、基因工程菌Δ348、基因工程菌Δ4742、基因工程菌O348、基因工程菌Δ4481Δ6156、基因工程菌Δ4481Δ6156::348的摇瓶发酵及效价检测。

分别用无菌牙签挖取约1.5厘米×1.5厘米的MS培养基上生长4-5天的基因工程菌Δ566、Δ4481、Δ6027、Δ6156、Δ4481Δ6156、Δ4481Δ6156::348，接种于含25mL SFPI培养基的一级摇瓶，28℃培养(200转/秒)4天后，取1mL接种于含25mL SFPII培养基的二级摇瓶，28℃培养(200转/秒)6天。取1mL发酵结束的样品于1.5mL离心管，12000转/秒离心10分钟后将上清转移，保存待测。

本发明中的效价检测采用管碟法，以藤黄微球菌(Micrococcus luteus 28001)作为指示菌株(涂布于培养基III培养20小时后，用无菌的0.9％NaCl溶液将菌苔洗下备用)，利用林可霉素在琼脂培养基中的扩散作用，绘制标准品扩散曲线，并将待测品与之比较，从而测定待测品效价。

将15mL培养基III下层固体培养基均匀摊铺于培养皿中，待其冷却凝固后，取200μL指示菌悬液与5mL融化且温度适宜的培养基III上层培养基均匀混合后倒在下层培养基上面，凝固后放置灭菌牛津杯。

向牛津杯中加入200μL浓度为2、4、6、8、10、12mg/L的标准品及待检测发酵上清，于37℃恒温培养箱正置培养20小时后，用游标卡尺准确量取所产生抑菌圈的直径。以标准品浓度值的自然对数为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标绘制标准曲线。将发酵液上清抑菌圈直径代入标准曲线，计算可得林可霉素浓度。结果如图16-19所示。

图16-19的结果显示，

(1)突变株Δ566、突变株Δ6027以及突变株Δ4742的林可霉素产量与出发菌株NRRL 2936的林可霉素产量几乎一致。说明敲除slinc566基因、敲除slinc6027基因或slinc4742基因获得的突变株的产林可霉素的能力几乎不变。

(2)突变株Δ4481的林可霉素产量达到1.55g/L，为出发菌株NRRL 2936的18.7倍。说明突变株Δ4481产林可霉素的能力大幅度提升，有助于提高林可霉素的产量。

(3)突变株Δ6156的林可霉素产量达到1.89g/L，为出发菌株NRRL 2936的22.4倍。说明突变株Δ6156产林可霉素的能力大幅度提升，有助于提高林可霉素的产量。

(4)突变株Δ4481Δ6156的林可霉素产量达到2.74g/L，为出发菌株NRRL 2936的32.4倍。说明突变株Δ4481Δ6156产林可霉素的能力大幅度提升，有助于提高林可霉素的产量。

(5)突变株Δ348的林可霉素的产量检测不到，说明slinc348基因是一个参与林可霉素合成过程的正调控因子。

(6)突变株O348的林可霉素的产量可达到0.57g/L。说明突变株O348产林可霉素的能力大幅度提升，有助于提高林可霉素的产量。

(7)突变株Δ4481Δ6156::348的林可霉素产量达到3.58g/L，为出发菌株NRRL2936的42.4倍。说明突变株Δ4481Δ6156::348产林可霉素的能力大幅度提升，有助于提高林可霉素的产量。

结论：敲除slinc4481基因、敲除slinc6156基因、过表达slinc348基因、同时敲除slinc4481基因与slinc6156基因的方法、或者同时敲除slinc4481与slinc6156并过表达slinc348的方法均可以应用于林可霉素高产菌株的构建方法中，以提高林可霉素的产量。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用

<141> 2020-01-16

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtcctagg tataatacta ggctgcaacg caaggcggtc ggttttagag ctagaaatag 60

caagttaaaa taaggctagt ccgttatc 88

<210> 2

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 60

cgatgccgtg cagcagttt 79

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcctgccgg ttgacca 17

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcgaggctg gtcaaccggc aggcgctggc gctgatgtcg atgg 44

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgacggcca gtgccaagct ggacggtgca catgatggg 39

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtgtcgtgc atcgaacgc 19

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttcgtcctc ggcaggg 17

<210> 8

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagtcctagg tataatacta gccacgacct cgcgttactg agttttagag ctagaaatag 60

caagttaaaa taaggctagt ccgttatc 88

<210> 9

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 60

ccgtcctctc ctcggctc 78

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgggccacgg tgtccat 17

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgcggatcat ggacaccgtg gcccgggcac gctgtctgga atggc 45

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgacggcca gtgccaagct cagacgcgac gacgttg 37

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtgtccggt cggtcgaa 18

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgctggtgtc cgtctcc 17

<210> 15

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagtcctagg tataatacta gcgacggcga tgttccgcca ggttttagag ctagaaatag 60

caagttaaaa taaggctagt ccgttatc 88

<210> 16

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 60

cttggtcgcc gtgtccagg 79

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagctcgccc ttggaccag 19

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agcggctggt ccaagggcga gctgatgcag atcgccaaga aggtcc 46

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acgacggcca gtgccaagct ccaggaaccg gcgttgaagc 40

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctcggcgta ccggtca 17

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccatggcgca caggacac 18

<210> 22

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cagtcctagg tataatacta ggaaggtccc accgggtctg ggttttagag ctagaaatag 60

caagttaaaa taaggctagt ccgttatc 88

<210> 23

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 60

gtcctcaccg ccatggtca 79

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaccgccgta ctcgaagacc 20

<210> 25

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gaaacatgac ggtcttcgag tacggcggtc gtggtcgaac cccaccag 48

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgacggcca gtgccaagct ccaataattc cggacaacgc ttg 43

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agcgcgagat cgagatggt 19

<210> 28

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gccccgctcc aggttg 16

<210> 29

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cagtcctagg tataatacta gcacccgcac gccagttgtt cgttttagag ctagaaatag 60

caagttaaaa taaggctagt ccgttatc 88

<210> 30

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 60

cttcgctccg ggtgtactg 79

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gcccagcgcg tccgatt 17

<210> 32

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cggtccgcaa tcggacgcgc tgggccgcgc cctggagttc gac 43

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acgacggcca gtgccaagct tccaggtctc ggcggtca 38

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gaagtcgtgg atgatgccct 20

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tccctgcccc ggtgaag 17

<210> 36

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cagtcctagg tataatacta gaggccaatg tggcgggctg ggttttagag ctagaaatag 60

caagttaaaa taaggctagt ccgttatc 88

<210> 37

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 60

aggtcccgcg ctcgtctaca cc 82

<210> 38

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ccgcgcctca cgcagtc 17

<210> 39

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ctgcgtgagg cgcggggtgc cttcacgatc ctgtcc 36

<210> 40

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

acgacggcca gtgccaagct tgttgccgcc cagttcgag 39

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cgcccgccca agctgta 17

<210> 42

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

acctggccct ggtggac 17

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ggaacgtcta gacgtggtcg gtccgcaatc 30

<210> 44

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gtcccggaat tctcagtcgt gtgttccggg c 31

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

agtgtccgtt cgagtggcgg cttg 24

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gcaccccagg ctttacactt tatgcttc 28

<210> 47

<211> 1485

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gtgagcggtc aacccaacac ccgtctgacg gacctgttcg gcctggccgg ctggtccaag 60

ggcgaactcg cgaggctggt caaccggcag gcggcggcca tgggccaccc tcagctggcg 120

accgacacct cccgggtgcg gcggtggatc gacatgggag agatcccacg cgatccggtg 180

ccgcgggtgc tggcggccct gttcaccgag cgtctcggcc gtgtcgtgac catcgaggac 240

ctcggtctgg tccggcacgg gcgtacgggg aaacggccac gcgacgggag tgcggaacat 300

cccgacggtg tgccgtgggc gcccgagcgg actgctgcgg tcctcaccga attcacggga 360

atggacctca tgctcaaccg acgcggcttg gtgggcgcgg gtgccgcgct cgccgcggga 420

tcagccctca gcagtgccat gtacgactgg ctgcacaccg atccgaccct gaccgccgac 480

gctccccggt tcgacgaccc cctgcatgcc gaccccgctg ggttcgaccg ctacgaggcc 540

gcccccatcg ggtcgcagga gatcgaggaa ctggaacgct ccgtcgaagt gttccgggcc 600

tgggacgcgg cccgcggcgg cgggctgcaa cgcaaggcgg tcgtgggcca actcaacgag 660

gtgggcggca tgctcgccta ccgacacccc gaccatctcc agcggcgcct gtggggcgtc 720

gccgccaacc tcgccgtcct cgcgggctgg atgtcgcacg acgtcggtct cgaacccacg 780

gcccagaagt acttcgtcat cgccgcccat gccgccagag agggcggcga ccggccccgc 840

gccggggagg cgctctcccg agcggctcgc cagatggtgc accttggccg gcccgacgac 900

gcgctcgacc tgatgaacct cgcccagtcc ggctccggcg aacaggtgct gccccgcacc 960

cgggcgatgc tccacaccat cgaggcctgg gcacaggcct cgatgggcaa gggccaggcc 1020

atgcgccgca ccctcggagt ggcggaggac ctcttcgtct ccgacaaggg cgacgtgccg 1080

ccgccgagct ggatgcagac cttcagggag gaggacctgt acggcatgca ggccctggcc 1140

taccgcacgc tggccgagtt cgagcccggc gcggccgcgc acgcccagca ctacgcggag 1200

aaggccctgg ccctgcgggt cgacggacgg cagcggtcga agatcttcga cttcctgtcc 1260

atggcgtcgg cctgcttcat cgccgacgac cccgaacagg ccgaccggta cgcacgcctg 1320

gcgctgatgt cgatgggctc caactcctcc caccgcacct gggaccggct gcgtcagatg 1380

taccggctca ccgccgagta ctccggctat ccgaagatca gcgaactgcg ggaggagatc 1440

aggctggccc tgccgaggac gaagggcagc tcggtcagga cgtga 1485

<210> 48

<211> 2448

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gtgcgtgctt cctccccgga cggaccggag gcgttgctgt cggccctggc cacctgcggc 60

gccgacccgg attcccccgc atggcgcgac ctgacgcgga tcatggacac cgtggcccgc 120

gcggatccgg cggtgtcccg gttctggccc ccacatgtga cgggggggca tcccgccgag 180

ccgacgcact ggcgggaact ggcccgggaa ctccacgtcc tggcgtcgcg tgacgcggcg 240

gcacgccagg ccctgaccga gtgggtgcgt caccaccccg gcgccgcccg tacgccgtcc 300

ggtccggcgc cctcggcgac ggccaatgtc atcagcggcg actccgtgct ccacggcccc 360

agcgtgcaag cccgggacat ccacggcggc atccacttcc acccgtcctc cccgccacca 420

cgggcgggcc tccccgtgcc ccgccaactg cctccggtga ccgcacggtt cgtcgaccgg 480

gaggacgacc gacgggccct ggacgccctg cgtgcccggc gcgcgccgca cgcacctcag 540

gtcctggtgg tcagcgggct cccgggcgtc ggaaagacca ccttcgccac ccactggctg 600

catgagcacg ccgaaagttt ccccgacggc cagctctacg ccgacctcgg cggacgggcc 660

accgacgagg gcgacggacc tgtgtccccc gccgccgtac tggaagcctt cctggtcgca 720

ctcggcgcgt cctcggtacc gcccggtagc gctcaacgga gcgcgctgtg gcgttcgatg 780

acctcaggtc tacgactggc gctgctcctg gacagcgcgt tcacggctgc gcaggtacgc 840

ccgctcctgc ccggcacacc gaccggcctc accgtggtga ccagcacaag catgctgacc 900

ggactccaca tcgacggcgc gtccgtacac cggctggagg ggctccccgc cgaatcggcc 960

gtcgaactcc tcgccttcgg cggtgggacg cgcgtggcac gggagccgac cgccgcgcgt 1020

gaagtggtca gactctgcgg ccatctgcct ctggcggtgg ctctggcctc tgcccagctc 1080

gccctgcgtc ctcaccgttc cgtgtccgcc ctggtcgaca gcctgggtcg tcgaagcccc 1140

gtcgagacgc tgcacgtcga aggggaggcc gtgatgcgta cggcactcga caggacgtac 1200

gacgttctcc cggacaacag ccgtgtcctc taccgccgga tgggacttct gcccgcggat 1260

cgccacgacc tcgcgttact gacggccctc gcgggcaacg aggaggacac gcgcgacacc 1320

gggcaggctg ccgacatcgc cgtccatgct ctggtggagg cgaacctcct gcaggagacg 1380

ggcccgggga cctatcgctt ccacgacctc gtccagccgc acgcccgtcg actcggcgag 1440

gagctggagg acgccgaccg gcaggagcgc acactgcgct gcttcgtgga ctggtgcctg 1500

tccaccgcgg cttcggcgga gaccctcctc acccccagcc accggctgcc cgggcacgac 1560

ctctccgcgt gcaccgtgcc tccgaccccg ctcacgggtc ccgaggaagc cctcgcctgg 1620

ctggacacgt accgcaacgg cctgatgggg gcggtacggc actcggcccg ggtcggctgg 1680

gactccttct gctggcgcct ggtggacctc atatggcccc ttttcctgcg attacgtccg 1740

tccgagatgt ggatcgaggc gcatcgactc ggtctcgacg cggcgcgccg atgccgttcg 1800

cggcagggcg agggccgcat gctcacctcc ggcgcgatcg gcttgcggaa cgcgggccgg 1860

tactcggagg cggcggactg gtaccggcag gcactggagc aggctgcggc cgacgacgac 1920

gtacgccaac aggcacaagc cgtcagcggg ctgggccatg tgagcctcct ggcccaccgg 1980

ctcgacgagg cacgcggcca cttcgaacac gcgctgcgtc tgagggaggc gatcggctac 2040

cgacgcggag ccgccctctc ccggcggcgt ctcggcgaaa ccgctctggc cggcggcgac 2100

ctggccacgg ccaccgaaca actgcgccgt gccggcaccg aactggactc actgggcgag 2160

acatacgagg cgacccgcgt cctggctctt ctcggccatg tcctggaccg cagcggggac 2220

ggtgagggag gcgcgcgccg actgcgtgag gctctcgcgc gattccgaac gggcggcacc 2280

cggtccgagc actgggaggc acgctgtctg gaatggctcg gccaggccgc ggagtcgctt 2340

ggtgatcatg atgaatcgat acgccactac gaggccgccc gggaactctt ccgacgcctg 2400

aaccccgagg acgcgcaacg cctggacggt cggctgcggc ggtcatga 2448

<210> 49

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gtgagcggca acggcgatgg cggtacgaac gcgacgaatg ccggcaccac ggacaagcgc 60

cccaacgagc tgctcacttc atggttcgtg cgcagcggct ggtccaaggg cgagctggcc 120

cgccaggtca accggcgggc ccgccagctg ggggccaacc acatctccac cgacacctcg 180

cgcgtgcgcc gctggctgga cggtgagaat ccccgcgaac ccatccccag gatcctgtcc 240

gagctgttct cggagcggtt cggctgtgtc gtctccgtcg aggatctcgg actgcgcgcc 300

gcccgccagt caccctccgc gaccggtgtc gacctgccct ggacgggccc gcagacggtg 360

gccctgctca gcgagttctc gcgcagcgac ctgatgctgg cgcggcgcgg cttcctcgga 420

acctcgctgg tcctgtccgc gggcccgtcc ctcatcgagc ccatgcagcg ctggctggtg 480

ccggcgccct ccgtcccgcg gcacgagccc gagccggctc cgtcgtcggc ccgccgcggc 540

cggctctcca agcccgagct ggacctcctg gagtcgacga cggcgatgtt ccgccagtgg 600

gacgcccagt gcggcggcgg tctgcgccgc aaggcggtcg tcggccagct gcacgaggtg 660

accgacctgc tccaggagcc gcagcccgag gccaccaccc gcaagctgtt caaggtcgcc 720

gccgagctcg ccgaactggc cggctggatg tcgtacgacg tcgggctcca gcccaccgcg 780

cagaagtact tcgtcctcgc cctgcacgcg gccaaggaag ccggggacaa gccgctcggc 840

tcctatgtcc tgtccagcat gagccgccag atgatccacc tcgggcggcc cgaggacgcg 900

ctggagctga tccacctcgc gcagtacggc agccgcgact gcgcgagccc gcgcacccag 960

tcgatgctgt atgcgatgga ggcccgcgcc tacgccaaca tgggccagcc cggtaagtgc 1020

aagcgggcgg tccggatggc cgaggacacc ttcggtgagg ccgacgagtg ggacgagccc 1080

gaccccgact ggatccgctt cttctccgag gccgagctct acggcgagaa ctcccactcc 1140

taccgcgacc tcgcctatgt cgccggtcgc agccccacct acgcctccct ggccgagccc 1200

ctgatgcagc gggccgtcga gctcttcgcc aaggacgacg aacaccagcg gtcgtacgca 1260

ctgaacctga tcggcatggc cacggtgcac ctgctgcggc gcgagcccga acagagcacc 1320

gtgctggccg ccgaggccat gcagatcgcc aagaaggtcc gctccgagcg ggtcaacact 1380

cgtatccgaa agacggtcga cacggccgta cgcgatttcg gtgacctcgc cgaggtcatc 1440

cacctcaccg accagctcgc catcgagctg cccgagaccg cggaggcggt ctga 1494

<210> 50

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

ttgagtcatc cgcatcctga actcggcacg cccccgccgc tgcccgaggg cggcctccgg 60

gtcaccccac tgggcggcct cggcgaaatc ggccgaaaca tgacggtctt cgagtacggc 120

ggtcgcctgc tgatcgtcga ctgcggcgtg ctcttcccgg aggaggagca gcccggaatc 180

gatctgatcc tgccggactt ctcgtccatc agggaccgcc tcgacgacat cgagggcatc 240

gtcctcaccc atggccacga ggaccacatc ggcggcgtcc ccttcctcct gcgcgagaag 300

ccggacatcc cgctgatcgg ctccaagctg accctcgccc tgatcgaggc caagctccag 360

gagcaccgga tccgcccgta caccctggag gtggcggagg ggcaccgcga gcgcgtcggc 420

cccttcgact gcgagttcgt cgcggtcaac cactccatcc cggacgccct ggccgtggcc 480

atccgcaccc ccgccggcat ggtggtgcac acgggcgact tcaagatgga ccagctcccg 540

ctggacaacc gcctcaccga tctgcacgcg ttcgcccggc tgagcgagga agggatcgac 600

ctcctcctct ccgactctac gaacgccgag gtccccgggt tcgtcccgcc ggagcgggac 660

atctccaacg tcctgcgtca ggtcttcggc aacgcccgca agcggatcat cgtggcgagc 720

ttcgccagcc acgtccaccg catccagcag atcctggacg ccgcccacga gtacggccgc 780

agggtcgcct tcgtcggccg ctcgatggtc cgcaacatgg gcatcgcgcg cgacctgggc 840

tacctgaagg tcccaccggg tctggtggtc gacgtcaaga cactcgacga cctccccgac 900

cacgaggtgg tcctggtctg cacgggctcc cagggcgaac cgatggccgc cctctcccgc 960

atggccaacc gggaccacca gatccggatc gtcaacggcg acacggtgat cctggcgtcg 1020

tccctgatcc ccggcaacga gaacgcggtc taccgcgtga tcaacggcct gacccgctgg 1080

ggcgccaacg tcgtccacaa gggcaacgcc aaggtccatg tctccggcca cgcgtccgcg 1140

ggcgagttgc tgtacttcta caacatctgc cgcccgaaga acctgatgcc ggtccacggc 1200

gaatggcgcc acctccgggc caacgccgaa ctgggcgccc tcaccggcgt cccgcacgac 1260

cggatcgtca tcgcggagga cggcgtcgtc gtcgacctcg tcgagggcaa ggccaagatc 1320

tccggcaagg tccaggcggg ctacgtgtac gtcgacggcc tctcggtcgg agatgtcggt 1380

gagccggcgc tcaaggaccg caagatcctc ggcgacgagg gcatcatctc ggtcttcgtg 1440

gtcatcgacg cctccaccgg caagatcaca ggtggtccgc atatccaggc ccgcggctcg 1500

ggcatcgagg actccgcctt cgccgacgtc atcccgaggg tcaccgaagt cctggagcgt 1560

tcggcccagg acggcgtggt cgaaccccac cagctccagc agctggtgcg gcgaaccctc 1620

ggcaagtggg tctcggacac ctatcggcgc aggccgatga tcctgcctgt cgtggtggag 1680

gtctga 1686

<210> 51

<211> 2334

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gtggtcggtc cgcaatcgga cgcgctgggc cccttgctgc gcggccacag acacgcggcg 60

gggatgaccc tggaggaact cgccctcgcc tccggtgtca gcgaccgcgc catcggcgac 120

atggaacgcg gccgcagccg aggaccccag gcccgcaccg tccaggccct cgccaccgcc 180

ctccgcctgc cccgggagga caccgaccgc ctgctcaccg ccgcgcgcga cgggcgccgc 240

cgaacccgcc gaacccggcg ccccccgcac ggcctgtgcg atcttccccc ggccgtaccg 300

gacttcgccg ggcgcgacga ggagatccgc cggctcgacg cggccgggac gccgggaacc 360

gccgcgatcc cggtgatcgt cagcggcgcc cccggcctgg ggaagacgac actggtcgtc 420

caggccgcgc accggcaggc ggcgcgctac gacgacggat gcctgttcct caacctgcgc 480

ggcctggacg aggaacccct cgacccgcac gacgcgctgg cccgcctgct caaggcactc 540

ggagtgcccg aacacgacct gcccgcggac ctggaggagc gccaggtgct ccatcgacgc 600

gtcgtccggg acaagaacgt cctggtcatc ctcgacaacg ccgccgacga ggcccaactg 660

cgccccctgc tgccgggcga cgggaagtgc gtgttctggg tcaccagccg ccgcgcgctg 720

accggcatcg agcacgcccg ccgactcgtg ccgaccccgc tcccggccca cgcggccacc 780

accctgctgg agacgatcac cgccgaccgc acggaccggc aggacaccgc gtccctacga 840

cgcatcgccg acctctgcgg cggcctgccc ctcgccctgc gcatcgcagg caaccgcctg 900

gtgagccgcc cggcctggag cgcgaccggc ctcgccgacc ggctcgcggc cgaggacctg 960

cgcctggacc ggctcaccgc cggagacctg aaggtgaaat ccgccttcac tctctcctac 1020

gagcaactca ccgcacccgc acgccagttg ttccggcgcc tctccctcgt ccagggcccc 1080

gacttctcgc ccgcccacgg cgcggcgctc acctcgttca cgccggcacg cgtcgagcgg 1140

atgaccgacg aactcatcga actcggcctg ctgaacgccg ccggcggcga ccgggtctcc 1200

ttccacgacc tggtccggct gtacgcccac cagcgcctgc gtgacgagga gacacccgag 1260

gaacgcgagg ccgcccgagc gcggttggac ggctggctcc tggacaccgc ccgcgccgcc 1320

ggacagtggt tcgaacccgg cgacgacccg cggccggtcc ccggtccgcc ggccgacggc 1380

cacgacccgg cctccgcgca gcgctggctc cagacggaga gcgcccactg gttcgccgcc 1440

ctgcgggccg cggcggcggc cggccaccac cggcgggtcg tcgacgtcgc ggagtccatg 1500

cactggttct ccgaccgctg gtcccactgg gggcactggc acactgtctt cgccctgtcg 1560

cgggccgccg ctcacgcgct cggtgacccc ggactcgaag cgacccacgc caactacctg 1620

tcctgggcgg tcgcccaatg cctcgaccgc ccggccgagg gcatggcgat cgcgctggag 1680

gccgcggaac tggcccggcg cgcgcacgac ccggttcagg aggcatggtc cctgacgtac 1740

gccgcctatg ccgcccggga ttcgggggag ttcacgtccg ccgtggagca gacccggcgg 1800

gcggccgaac tgttcgccgc cgcgggcgac aaggaggggc acccgcaggc gctgctgggc 1860

ctcgccctca acctgcgcgc cgtgggccgg ctggaggagg cggccgacgc cttcgacgcc 1920

gccgtggcac gggtgagcga tccgcgtacc gccccggcac cgcacatcgc cgacttcacg 1980

gcgatgaacg ccctcagcgg caaggcgcga gtactcctgg acctggagga ctgggaggcc 2040

gcgcacgcgg tctgcgaccg cgccctggag ttcgacgccc gggtcggggt cgccctgaac 2100

cgcggagtgc cgacgatgcg caaggcccag gccctgtggg cgctgggccg gcgaccggag 2160

gcactcgcgg cgctggagga cgccctgcgc tgcttcaccg gggcagggag cgaccgatgg 2220

ctggacgagg cgaggaacct gcaccagcag tggaccgcgc ccgaccacag gccagggccg 2280

cctcctgcca ctcccggggc gccaggccgt acgcggcccg gaacacacga ctga 2334

<210> 52

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

atgctgctcg gctcgcaact caggcgactg cgtgaggcgc ggggcatcac gcgtgaggcg 60

gcgggctact cgatccgcgc gtccgagtcg aagatcagcc ggatggagtt gggccgggtg 120

agcttcaaga cacgggacgt cgaggatctg ctgacgctgt acggcatcac ggacgagcag 180

gagcgcacgt cactcctctc tctcgcccgg gaggccaatg tggcgggctg gtggcacagt 240

tactcggacg tcctgccgag ctggttcccc acctatgtgg gcctggaggg cgcggccgcc 300

ctgatccggg cctacgaggt gcagttcgtg cacggtctgc tccagaccga ggcgtacgcg 360

cgcgcggtcg tgcggcgcgg tatgaagggc gcgagcgagg ccgacgtcga acgccgggtg 420

ggggtgcgcc tggagcggca gaagtacctg gtcgacgaga acgcgccgga cgtccacatc 480

gtcctggacg aggccgcgct gcgccggccc tacggcgacc gcgaggtgat gcggggtcag 540

ctccagcatc tgatcgagat ctccgagcgg cccaatgtgc gccttcagat catgccgttc 600

ggcttcggcg ggcactccgg cgagagcggt gccttcacga tcctgtcctt cccggactcc 660

gacctgtcgg atgtcgtgta cctggagcag ctcaccagcg cgctgtacct cgacaagcgc 720

gaggacgtca cgcagtacga gaaggcgctc aaggagctcc agcaggacag cccggggccg 780

gacgagagcc gtgatcttct gcgcggtctc ctccaactct cctag 825

Claims

1.一种产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，其是将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因敲除和将编码RNA酶的基因敲除并过表达林肯链霉菌的编码Xre家族蛋白的基因构建获得。

2.如权利要求1所述的产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，所述编码含TPR结构域蛋白质的基因为slinc4481基因；所述编码RNA酶的基因为slinc6156基因；所述编码Xre家族蛋白的基因为slinc348基因。

3.一种如权利要求1或2所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因和编码RNA酶的基因敲除，并过表达编码Xre家族蛋白，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

4.一种产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，其是将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因和编码RNA酶的基因敲除构建获得。

5.如权利要求4所述的产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，所述编码含TPR结构域蛋白质的基因为slinc4481基因；所述编码RNA酶的基因为slinc6156基因。

6.一种如权利要求4或5所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因和编码RNA酶的基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

7.一种产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，其是将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因敲除构建获得。

8.如权利要求7所述的产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，所述编码含TPR结构域蛋白质的基因为slinc4481基因。

9.一种如权利要求7或8所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的编码含TPR结构域蛋白质的基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

10.一种产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，其是将林肯链霉菌的编码RNA酶的基因敲除构建获得。

11.如权利要求10所述的产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，所述编码RNA酶的基因为slinc6156基因。

12.一种如权利要求10或11所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，其是以林肯链霉菌为出发菌株，将林肯链霉菌的编码RNA酶的基因敲除，构建获得产林可霉素的基因工程菌。

13.一种产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，其是通过过表达林肯链霉菌的编码Xre家族蛋白的基因构建获得。

14.如权利要求13所述的产林可霉素的基因工程菌，其特征在于，所述编码Xre家族蛋白的基因为slinc348基因。

15.一种如权利要求13或14所述的产林可霉素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，其是以林肯链霉菌为出发菌株，过表达林肯链霉菌的编码Xre家族蛋白的基因，构建获得产林可霉素的基因工程菌。