CN110129244B

CN110129244B - 链霉菌底盘菌株及其构建方法、在异源表达研究中的应用

Info

Publication number: CN110129244B
Application number: CN201910064421.3A
Authority: CN
Inventors: 王雪峰; 王绘砖; 袁昉; 李子龙; 尹守亮; 王为善; 范可强; 赵宝华
Original assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-01-23
Filing date: 2019-01-23
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2039-01-23
Also published as: CN110129244A

Abstract

本发明公开了链霉菌底盘菌株及其构建方法、在异源表达研究中的应用，属于生物技术领域。本发明以土霉素高产工业生产菌株Streptomyces rimosus 461为出发株，通过删除土霉素生物合成基因簇(otc)得到了一株链霉菌底盘菌株SR0。利用该底盘菌株，构建了金霉素合成基因簇(ctc)和ctcB基因共表达菌株SRC1，成功实现了金霉素的异源表达，产量在摇瓶水平达到了1.51g/L。通过增强ctcB基因表达和提高宿主的金霉素耐受性，构建了SRC4菌株，使金霉素异源表达产量达到了3.80g/L。本发明构建的SR0菌株为其它II型聚酮，尤其是为四环类抗生素的合成生物学研究提供了良好的生物底盘。

Description

链霉菌底盘菌株及其构建方法、在异源表达研究中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及链霉菌底盘菌株及其构建方法、在异源表达研究中的应用。

背景技术

四环素类抗生素为广谱抗生素，通常都具有氢化并四苯(菲烷)结构，如金霉素(CTC)、土霉素(OTC)、四环素(TC)、去甲金霉素(DMCTC)、去甲四环素(DMTC)、强力霉素、米诺环素、替加环素等(Nguyen F,Starosta AL,Arenz S,Sohmen D,Donhofer A,Wilson DN(2014)Tetracycline antibiotics and resistance mechanisms.Biological chemistry395(5):559-75)。它们通过防止氨基酰-tRNA附着到核糖体受体(A)位点来抑制蛋白质合成，广泛应用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、支原体、衣原体、立克次体和原生动物寄生虫引起的感染。另外，还广泛应用于动物生长促进剂(Chopra I,Roberts M(2001)Tetracycline antibiotics:mode of action,applications,molecular biology,andepidemiology of bacterial resistance.Microbiology and molecular biologyreviews65(2):232-60)。在这些抗生素中，TC、CTC、OTC和DMCTC是天然产物，OTC由S.rimosus产生，TC、CTC和DMCTC由S.aureofaciens或其突变体产生。在以往的研究过程中，通过菌株随机诱变筛选、培养基优化和工艺开发，大大提高了这些产品的产量。目前，CTC的生产水平可达23g/L，DMCTC可达10g/L，OTC可达35g/L，但这些方法很难进一步提高这些产品的产量。代谢工程和合成生物学的发展为解决这一问题提供了希望。

生物合成基因簇的异源表达已经成为天然产物发现、产物产量提高、隐性基因簇功能研究等方面的重要方法。目前，异源表达常用的链霉菌宿主主要有Streptomycescoelicolor、S.avermitillis、S.venezuelae、S.lividans、S.albus等模式底盘(Liu R,Deng Z,Liu T(2018)Streptomyces species:Ideal chassis for natural productdiscovery and overproduction.Metabolic engineering 50:74-84；Baltz RH(2016)Genetic manipulation of secondary metabolite biosynthesis for improvedproduction in Streptomyces and other actinomycetes.Journal of industrialmicrobiology&biotechnology 43(2-3):343-70)。在这些宿主中进行异源表达生物合成基因簇的产量都比较低，大多在μg/L到mg/L水平，而在工业生产宿主中的产量可达到g/L水平(如，工业链霉菌产红霉素≥10g/L，四环素≥30g/L，盐霉素≥80g/L)(Bilyk B,Horbal L,Luzhetskyy A(2017)Chromosomal position effect influences the heterologousexpression of genes and biosynthetic gene clusters in Streptomyces albusJ1074.Microbial cell factories 16(1):5)。因此，基于工业生物底盘开发的异源表达宿主可能是更优的宿主底盘。因为土霉素工业底盘生长迅速，OTC产量远高于其他四环素和其他II型聚酮抗生素，因此是最可取的潜在底盘。在龟裂链霉菌(S.rimosus)中异源合成其它四环类抗生素及其他有价值的II型聚酮既具有经济价值，又具有典型的科学意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种链霉菌底盘菌株及其构建方法，旨在提供一种最合适的底盘，提高异源合成其它四环类抗生素及其他有价值的II型聚酮的经济价值以及科学意义。

本发明所提供的技术方案为：一种链霉菌底盘菌株，所述底盘菌株名称为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)SR0，该菌株保藏在CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.17208，保藏日期为2019年01月17日。

进一步的技术方案在于链霉菌底盘菌株的构建方法，其构建步骤是：

(1)以ori18-F1和ori18-R1为引物，以pSET152为模板，扩增pUC18的复制起点，1169bp；以pTOS-F1和pTOS-R1为引物，以pTOS为模板，扩增pTOS载体序列，2378bp；两片段Gibson组装构建pTOS18G；

所述的引物序列为：

ori18-F1：CTGTGGCATCTGCGTGGCATTTCCACACAACATACGAGCCG

ori18-R1：CGATCATAGCACGATCAACGGCACTGTTGCAAATAGTCGGTG

pTOS-F1：CACCGACTATTTGCAACAGTGCCGTTGATCGTGCTATGATC

pTOS-R1：GGCTCGTATGTTGTGTGGAAATGCCACGCAGATGCCACAGG

(2)以L-F和L-R为引物，以S.rimosus 461基因组为模板，扩增含有左臂同源臂的片段，2000bp；回收产物和质粒pTOS18G用EcoRⅤ+KpnⅠ双酶切，3286bp；然后将两片段进行连接，构建pTOS18G-L；

所述的引物序列为：

L-F：5'ATAGGTACCATATCGGCACCGGCACGTAC 3'(KpnⅠ)

L-R：5'AATGATATCGGTGCTCGCCCTGCTCGTGATGC 3'(EcoRⅤ)

(3)pTOS18G-L转化E.coli ETZ，然后E.coli ETZ(pTOS18G-L)与S.rimosus 461进行属间接合转移实验，筛选pTOS18G-L整合到基因组上的单交换菌株S.rimosus461-TL；

(4)质粒pUWLDRE转化E.coli ETZ，然后E.coli ETZ(pUWLDRE)与S.rimosus461-TL进行属间接合转移实验，筛选pTOS18G-L质粒骨架环出的菌株S.rimosus 461-L菌株，并通过传代培养，丢失pUWLDRE质粒；

(5)以1132-2-F和1132-2-R为引物，以pKC1132为模板，扩增pKC1132骨架序列，3038bp；以R-F和R-R为引物，以S.rimosus 461基因组为模板，扩增含有rox位点和右臂同源臂的片段，2165bp；两片段Gibson组装构建pKC1132-R；

所述的引物序列为：

1132-2-F：CCGGCAGCTCACCCAGGAGTGGATGGTGCCTAATGAGTGAGCTAAC

1132-2-R：ACCCTAACTTTAAATAATGCCAATTATTTAAAGTTAGATATCCACGCCCTCCTACATC

R-F：TATCTAACTTTAAATAATTGGCATTATTTAAAGTTAGGGTCCGGTGGTTTCAGGTGCC

R-R：TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCATCCACTCCTGGGTGAGCTGC

(6)pKC1132-R转化E.coli ETZ，然后E.coli ETZ(pKC1132-R)与S.rimosus 461-L进行属间接合转移实验，筛选pKC1132-R整合到基因组上的单交换菌株S.rimosus 461-L-KR菌株；

(7)E.coli ETZ(pUWLDRE)与S.rimosus 461-L-KR进行属间接合转移实验，筛选pKC1132-R质粒骨架环出的菌株，并通过传代培养，丢失pUWLDRE质粒，从而得到链霉菌底盘菌株。

本发明的另一个目的在于提供链霉菌底盘菌株在异源表达研究中的应用，旨在提供链霉菌底盘菌株在异源表达的应用方法，提高研究的价值。

本发明所提供的技术方案为：链霉菌底盘菌株在异源表达研究中的应用。

链霉菌底盘菌株在异源表达研究中提升四环素类抗生素产量的方法，其特征在于，利用ctcB基因激活四环素类抗生素合成基因簇以提高其产量，所述ctcB基因序列如SEQID No.1位所示。

本发明的另一个目的在于提供异源表达金霉素的方法，旨在通过链霉菌底盘菌株异源表达金霉素，使得金霉素的生产以及产量的提高成为可能。

本发明所提供的技术方案为：一种异源表达金霉素的方法，其特征在于，在上述链霉菌底盘菌株中整合金霉素合成基因簇(ctc)载体pSET153-ctc，得到SRC0菌株，然后进一步整合ctcB基因表达载体pSOK616-PermE*-ctcB，得到金霉素生产菌株SRC1。

进一步的技术方案在于，载体pSET153-ctc含有的金霉素合成基因簇(ctc)序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的技术方案在于，所述的ctcB基因表达载体pSOK616-PermE*-ctcB，使用组成型启动子PermE*启动ctcB基因表达，所述PermE*启动子序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的技术方案在于，所述的ctcB基因表达载体构建方法为：以ctcB-s/ctcB-a为引物，以金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)基因组为模板，扩增ctcB基因，866bp；回收产物和质粒pSOK616-EotcR用NdeⅠ+SpeⅠ双酶切，6442bp；然后将两片段进行连接，构建pSOK616-PermE*-ctcB。

所述的引物序列为：

ctcB-s：ATACATATGGAGGGAAATCCGAGCGACATCGG(NdeⅠ)

ctcB-a：ATTACTAGTGACGGGCCTCAGGCCGAACGG(SpeⅠ)

进一步的技术方案在于，将上述所述一种异源表达金霉素的方法中的ctcB基因表达载体pSOK616-PermE*-ctcB的ctcB基因前启动子PermE*更换为组成型启动子Psf14或组成型启动子PkasO*。

进一步的技术方案在于，使用组成型启动子Psf14构建pSOK616-Psf14-ctcB载体，然后通过接合转移方法，得到金霉素生产菌株SRC2，所述的组成型启动子Psf14序列如SEQID No.4所示。

进一步的技术方案在于，所述的pSOK616-Psf14-ctcB载体构建方法为：利用质粒pSOK616-PermE*-ctcB，采用HindⅢ和NdeⅠ双酶切，回收7172bp片段；以Psf14-s/Psf14-a为引物，pSOK616为模板，扩增Psf14启动子序列，121bp；两片段Gibson组装构建；

所述的引物序列为：

Psf14-s：CTCATGGAGGGCGCGAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAG(HindⅢ)

Psf14-a：GCTCGGATTTCCCTCCATATGACGTGGATCCCTAATCGAGTA(NdeⅠ)

进一步的技术方案在于，使用组成型启动子PkasO*构建pSOK616-PkasO*-ctcB载体，然后通过接合转移方法，得到金霉素生产菌株SRC3，所述的启动子PkasO*序列如SEQ IDNo.5所示。

进一步的技术方案在于，所述pSOK616-PkasO*-ctcB载体的构建方法为：质粒pSOK616-PermE*-ctcB，采用HindⅢ和NdeⅠ双酶切，回收7172bp片段；以PkasO*-s/PkasO*-a为引物，pDR4-K*为模板，扩增PkasO*启动子序列，127bp；两片段Gibson组装构；

所述的引物序列为：

PkasO*-s：CTCATGGAGGGCGCGAAGCTTTGTTCACATTCGAACGGTCTC(HindⅢ)

PkasO*-a：GCTCGGATTTCCCTCCATATGAACTCCCCCAGTCCTGCACG(NdeⅠ)

本发明的另一个目的在于提供一种提高金霉素产量的方法以及方法中使用的培养基，旨在提供金霉素产量，提高实用的的价值。

本发明所提供的技术方案为：一种提高金霉素产量的方法，其特征在于，在由上述方法得到的金霉素生产菌株基础上，提高金霉素生产菌株对金霉素的耐受性。

进一步的技术方案在于，使用金霉素抗性基因ctcR和ctcC，构建融合表达载体pSOK616-ctcB-ctcR-ctcC-1，然后通过接合转移方法，构建SRC4菌株。所述ctcR基因序列如SEQ ID No.6所示，所述ctcC基因序列如SEQ ID No.7所示。

进一步的技术方案在于，所述融合表达载体pSOK616-ctcB-ctcR-ctcC-1的构建方法为：以ctcR-s1/ctcR-a为引物，pSET153-ctc为模板，扩增ctcR1片段(1664bp)，回收作为模板，以ctcR-s2和ctcR-a为引物，扩增ctcR2片段(1717bp)；以ctcC-s和ctcC-a1为引物，pSET153-ctc为模板进行PCR，扩增ctcC片段(2107bp)；片段ctcR2和ctcC为模板，ctcR-s和ctcC-a2为引物进行融合PCR，扩增ctcR-ctcC融合片段(3783bp)；pSOK616-PkasO*-ctcB用HindⅢ酶切(7276bp)，去磷酸化，回收；ctcR-ctcC融合片段用HindⅢ酶切，回收；两片段连接并转化E.coli DH5α；挑选得到pSOK616-ctcB-ctcR-ctcC-1载体。

所述的引物序列为：

ctcR-s1：TGTTGTAAAGTCGTGGCCAGGAGAATACGACAGCGTGCAGGACTGGGGGAGTTAGACCTTGTCGAATCCGGTG

ctcR-a：TGTCATATGGGTCCTCCTGTGGAGTGGTTCTGTGGAGGTCGCGCGCTCACTCCTCGTCG

ctcR-s2：ATTAAGCTTTGTTCACATTCGAACGGTCTCTGCTTTGACAACATGCTGTGCGGTGTTGTAAAGTCGTGGCCAG(HindⅢ)

ctcC-s：CGACCTCCACAGAACCACTCCACAGGAGGACCCATATGACAACCGTGAACATCGGAATC

ctcC-a1：TACAAGCTTCGACTGAGGACGGAGTGCGCCACGGCTGAGG

ctcR-s：ATTAAGCTTTGTTCACATTCGAACGGTCTCTG(HindⅢ)

ctcC-a2：TACAAGCTTCGACTGAGGACGGAGTGCGC(HindⅢ)

进一步的技术方案在于，一种用于上述方法中的培养基，其特征在于，每1000mL中，含有：淀粉150g，黄豆饼粉20g，硫酸铵14g，碳酸钙14g，氯化钠4g，玉米浆干物4g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钴10μg，淀粉酶0.1％～0.2％；培养基需在温度121℃，压强1.01×10⁵Pa条件下灭菌30min。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：构建了一株链霉菌底盘，利用该底盘菌株，通过共表达金霉素合成基因簇ctc和ctcB基因成功实现了金霉素的异源表达，产量在摇瓶水平达到了1.51g/L。通过增强ctcB基因表达和提高宿主的金霉素耐受性，使金霉素异源表达产量达到了3.80g/L。本发明构建的SR0菌株为其它II型聚酮，尤其是四环类抗生素的合成生物学研究提供了良好的生物底盘。

附图说明

图1为底盘菌株SR0构建过程示意图。

图2为SR0菌株PCR鉴定。泳道1和2：随机挑选的SR0菌株作为模板；泳道3和4：S.rimosus 461作为模板；泳道5：Trans2K DNA Ladder。

图3为SR0菌株生产OTC分析。

图4为pSET153-ctc图谱。

图5为改造菌株发酵液HPLC分析。1：CTC standard；2：SRC0菌株；3：SR0菌株；4：SRC4菌株；5：SRC3菌株；6：SRC2菌株；7：SRC1菌株。

图6为金霉素相关合成基因转录分析。a：半定量PCR；b：qRT-PCR。

图7为构建的质粒图谱。a：pSOK616-PermE*-ctcB；b：pSOK616-Psf14-ctcB；c：pSOK616-PkasO*-ctcB；d：pSOK616-ctcB-ctcR-ctcC-1。

图8为改造菌株金霉素产量变化曲线。

图9为改造菌株生物量变化曲线。

图10为菌株金霉素耐受性分析。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所说的链霉菌底盘菌株，其名称为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)SR0，该菌株保藏在CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.17208，保藏日期为2019年01月17日。

实施例1：链霉菌底盘菌株SR0构建

本发明以土霉素高产工业生产菌株Streptomyces rimosus 461为出发株，通过删除土霉素生物合成基因簇得到链霉菌底盘菌株S.rimosus SR0。本发明基于Dre/rox(Herrmann S,Siegl T,Luzhetska M,Petzke L,Jilg C,Welle E,Erb A,Leadlay PF,Bechthold A,Luzhetskyy A(2012)Site-specific recombination strategies forengineering actinomycete genomes.Applied and environmental microbiology 78(6):1804-12)系统设计实验方案，构建示意图如图1所示。

具体构建过程为：

(1)以ori18-F1和ori18-R1为引物，以pSET152为模板，扩增pUC18的复制起点，1169bp；以pTOS-F1和pTOS-R1为引物，以pTOS为模板，扩增pTOS载体序列，2378bp；两片段Gibson组装构建pTOS18G。

所述的引物序列为：

ori18-F1：CTGTGGCATCTGCGTGGCATTTCCACACAACATACGAGCCG

ori18-R1：CGATCATAGCACGATCAACGGCACTGTTGCAAATAGTCGGTG

pTOS-F1：CACCGACTATTTGCAACAGTGCCGTTGATCGTGCTATGATC

pTOS-R1：GGCTCGTATGTTGTGTGGAAATGCCACGCAGATGCCACAGG

PCR扩增体系为：

PCR扩增条件为：

PCR产物电泳检测后回收，ori pUC18片段和pTOS载体片段分别取2μL和3μL，与15μL的Gibson组装反应液(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,Smith HO(2009)Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nature methods 6(5):343-5)混匀，PCR仪50℃反应1h，然后取10μL转化E.coliDH5α。随机挑选转化平板上长出的单克隆进行菌落PCR验证(使用天根生物2×Taq PCRMasterMix，条件同说明书)，验证引物为TOS18G-u-F/TOS18G-u-R，TOS18G-d-F/TOS18G-d-R。验证正确的转化子进一步测序验证，从而筛选得到pTOS18G。

所述的引物序列为：

TOS18G-u-F：TGCGACACCCGCTTTAGGAG

TOS18G-u-R：GAGCGAGGAAGCGGAAGAGC

TOS18G-d-F：GCGAGGTATGTAGGCGGTGC

TOS18G-d-R：CGCTACGGAAGGAGCTGTGG

所述的引物序列为：

L-F：5'ATAGGTACCATATCGGCACCGGCACGTAC 3'(KpnⅠ)

L-R：5'AATGATATCGGTGCTCGCCCTGCTCGTGATGC 3'(EcoRⅤ)

PCR扩增体系为：

PCR扩增条件为：

PCR产物电泳检测后回收，连同质粒pTOS18G用EcoRⅤ+KpnⅠ双酶切，然后回收，两片段分别取4μL和13μL，在20μL体系中使用T4 DNA ligase 16℃反应过夜，然后取10μL转化E.coli DH5α。随机挑选转化子进行EcoRⅤ+KpnⅠ双酶切和BamHⅠ单酶切验证，验证正确的转化子进一步测序验证，从而筛选得到pTOS18G-L。

接合转移步骤如下：挑取E.coli ETZ(pTOS18G-L)单克隆接种于加有相应抗性的液体LB培养基中(Am 50μg/mL、Km 50μg/mL、Cm 50μg/mL)，37℃，220rpm过夜培养；以1％接种量，转接至新鲜的LB(Am 50μg/mL、Km 50μg/mL、Cm 50μg/mL)，37℃，220rpm至OD600＝0.4～0.6；取2mL培养液，分装至2个Ep管中，7000rpm离心1min，弃上清；加入等体积的LB(洗涤抗生素)，洗涤2次；将2个Ep管菌体重悬于0.5mL LB中；在洗涤大肠杆菌细胞的同时，用2×YT培养基收集链霉菌的孢子，用2×YT洗涤2次后(7000rpm，1min)，于0.5mL 2×YT培养基，50℃热激10min，室温冷却；将0.5mL洗涤好的E.coli ETZ(pTOS18G-BL)和0.5mL热激过的链霉菌孢子混匀，全部涂布于MS平板(终浓度10mM MgCl₂)；37℃培养16-20h，加入1mL用无菌水稀释的NA(终浓度25μg/mL)和其它对应浓度的抗生素(Am浓度200μg/mL)，涂布平板，继续培养5～7天。

经过接合转移和传代实验后(MS平板，Am浓度200μg/mL)，得到单克隆菌株，pTOS18G-L没有链霉菌复制原点，作为自杀载体在链霉菌中不能自主复制，只有整合到基因组上跟随链霉菌基因组复制，所以通过安普霉素抗性筛选得到的菌株，应该为pTOS18G-L通过单交换整合到了S.rimosus 461基因组上。使用ori18-F1/ori18-R1和pTOS-2-F/pTOS-2-R引物进行PCR验证(使用天根生物2×Taq PCR MasterMix，条件同说明书)，进一步筛选得到S.rimosus461-TL。

所述的引物序列为：

ori18-F1：CTGTGGCATCTGCGTGGCATTTCCACACAACATACGAGCCG

ori18-R1：CGATCATAGCACGATCAACGGCACTGTTGCAAATAGTCGGTG

pTOS-2-F：AAGCCTGAACTCACCGCGAC

pTOS-2-R：TCAACGGGAATCCTGCTCTG

接合转移平板长出的菌落传代培养后接Am抗性平板和无抗平板进行影印筛选，挑选Am敏感的菌株分别使用L-dre-2-F/L-dre-2-R、pTOS-2-F/pTOS-2-R等2对引物进行PCR验证(使用天根生物2×Taq PCRMasterMix，条件同说明书)，从而得到质粒骨架环出的菌株S.rimosus 461-L。然后将S.rimosus 461-L菌株接MS平板，37℃培养，丢失pUWLDRE质粒。菌落传代培养后接Tsr抗性平板和无抗平板进行影印筛选，挑选Tsr敏感的菌株使用L-dre-2-F/L-dre-1-R、L-dre-2-F/L-dre-2-R、pTOS-2-F/pTOS-2-R、L-dre-1-F/L-dre-1-R等4对引物进行PCR验证使用天根生物2×Taq PCR MasterMix，条件同说明书)，从而得到质粒骨架环出并丢失pUWLDRE质粒的菌株S.rimosus 461-L。

所述的引物序列为：

L-dre-2-F：TCGAGGTTGCTGACGTAGTC

L-dre-2-R：TATTGGAGCTGGATCATCTGG

pTOS-2-F：AAGCCTGAACTCACCGCGAC

pTOS-2-R：TCAACGGGAATCCTGCTCTG

L-dre-1-F：ATTTAAAGTTAGAACGGTACCTGAC

L-dre-1-R：GGTCGTCGGCCATGAAGAGG

所述的引物序列为：

1132-2-F：CCGGCAGCTCACCCAGGAGTGGATGGTGCCTAATGAGTGAGCTAAC

1132-2-R：ACCCTAACTTTAAATAATGCCAATTATTTAAAGTTAGATATCCACGCCCTCCTACATC

R-F：TATCTAACTTTAAATAATTGGCATTATTTAAAGTTAGGGTCCGGTGGTTTCAGGTGCC

R-R：TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCATCCACTCCTGGGTGAGCTGC

PCR扩增体系为：

PCR扩增条件为：

PCR产物电泳检测后回收，pKC1132载体片段和rox-right片段分别取1.5μL和3.5μL，与15μL的Gibson组装反应液混匀，PCR仪50℃反应1h，然后取10μL转化E.coli TOP10。随机挑选转化平板上长出的单克隆进行菌落PCR验证(使用天根生物2×Taq PCR MasterMix，条件同说明书)，验证引物为R-u-F/R-u-R、R-d-F/R-d-R，验证正确的转化子进一步测序验证，从而筛选得到pKC1132-R。

所述的引物序列为：

R-u-F：GTACATCACCGACGAGCAAGG

R-u-R：CTGAGCAACAGCCAGATCGC

R-d-F：ACCTCAACACCGCGGTCATC

R-d-R：CAATACGCAAACCGCCTCTC

经过接合转移和传代实验后(MS平板，Am浓度200μg/mL)，得到单克隆菌株，pKC1132-R没有链霉菌复制原点，作为自杀载体在链霉菌中不能自主复制，只有整合到基因组上跟随链霉菌基因组复制，所以通过安普霉素抗性筛选得到的菌株，应该为pKC1132-R通过单交换整合到了S.rimosus 461基因组上。使用R-u-F/R-u-R、R-d-F/R-d-R和L-dre-2-F/L-dre-2-R引物进行PCR验证(使用天根生物2×Taq PCR MasterMix，条件同说明书)，进一步筛选得到S.rimosus 461-L-KR。

(7)E.coli ETZ(pUWLDRE)与S.rimosus 461-L-KR进行属间接合转移实验，筛选pKC1132-R质粒骨架环出的菌株，并通过传代培养，丢失pUWLDRE质粒，从而得到otc genecluster删除菌株S.rimosus SR0。

接合转移平板长出的菌落传代培养后接Am抗性平板和无抗平板进行影印筛选，挑选Am敏感的菌株接MS平板，37℃培养，丢失pUWLDRE质粒。菌落传代培养后接Tsr抗性平板和无抗平板进行影印筛选，挑选Tsr敏感的菌株使用L-dre-2-F/R-u-R进行PCR(681bp)验证(使用天根生物2×Taq PCR MasterMix，条件同说明书)，结果如图2所示。从而得到otc敲除菌株，该菌株含有一个“疤痕”，即rox位点，将PCR产物(681bp)回收测序，结果表明，底盘菌株oxyDM构建成功，基因组上含有一个rox位点，序列如SEQ ID No.8中第409-440位所示。

(8)SR0菌株生产OTC分析

将SR0与S.rimosus 461接MS平板，孢子成熟后铲取约2cm²菌丝块接种至种瓶培养基：淀粉3％，黄豆饼粉0.3％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.5％，玉米浆0.4％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.015％，培养基灭菌条件：121℃，1.01×10⁵Pa灭菌30min。30℃，220r/min培养26h，然后以5％接种量接种至发酵培养基：淀粉15％，黄豆饼粉2％，硫酸铵1.4％，碳酸钙1.4％，氯化钠0.4％；玉米浆0.4％，磷酸二氢钾0.01％，氯化钴0.001％，淀粉酶0.015％，培养基灭菌条件：121℃，1.01×10⁵Pa灭菌30min。30℃，220r/min培养5d。取5mL发酵液，加9mol/L盐酸溶液酸化至pH1.5～1.7(酸化时不停涡旋振荡混匀)，室温放置5min；12000rpm，室温离心5min；0.22μm滤器过滤后，取20μl上清进行HPLC检测分析(日本岛津，LC-20AT)检测土霉素。色谱柱选择Diamonsil C18反相柱(250×4.6mm)，选择单相泵，流动相组成为60％去离子水，10％甲醇，20％乙腈和10％磷酸(2mM)，流速为1.0mL/min，检测波长为350nm，结果如图3所示，SR0菌株删除otc成功，该菌株不再产生土霉素。

实施例2：金霉素基因簇在SR0中异源表达

将含有金霉素合成基因簇(ctc)的载体pSET153-ctc，如图4所示，转入E.coli ETZ(Am 50μg/mL、Km 50μg/mL、Cm 25μg/mL)中，然后E.coli ETZ(pSET153-ctc)与S.rimosusSR0菌株进行属间接合转移实验，方法同实施例1。经过接合转移和传代实验后得到单克隆菌株，使用Test-F2/Test-R2引物进行PCR验证(使用天根生物2×Taq PCR MasterMix，条件同说明书)，筛选得到SRC0菌株。

所述的引物序列为：

Test-F2：GGCTTGAAGGGAAGGTGTTTGTGC

Test-R2：CCCAGGAGGACGACCTCCAGGTTGG

将SR0与SRC0菌株接MS平板，孢子成熟后铲取约2cm²菌丝块接种至种瓶培养基：淀粉3％，黄豆饼粉0.3％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.5％，玉米浆0.4％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.015％，培养基灭菌条件：121℃，1.01×10⁵Pa灭菌30min。30℃，220r/min培养26h，然后以5％接种量接种至发酵培养基：淀粉15％，黄豆饼粉2％，硫酸铵1.4％，碳酸钙1.4％，氯化钠0.4％；玉米浆0.4％，磷酸二氢钾0.01％，氯化钴0.001％，淀粉酶0.015％，培养基灭菌条件：121℃，1.01×10⁵Pa灭菌30min。30℃，220r/min培养5d。取5mL发酵液，使用草酸酸化至pH1.2～1.4(酸化时不停涡旋振荡混匀)，室温放置5min；12000rpm，室温离心5min；0.22μm滤器过滤后，取20μL上清进行HPLC检测分析金霉素(Waters e2695HPLC系统)。色谱柱选择ZORBAX SB-C18柱(250×4.6mm)，流动相组成为80％草酸溶液(0.1M,pH 2.2)和20％N,N-甲基甲酰胺，流速为1.0mL/min，检测波长为335nm。结果如图5所示，SRC0菌株发酵液HPLC未能检测到金霉素，提取SRC0菌株发酵液的RNA(全式金试剂盒TransZol Up Plus RNA Kit)，然后反转录合成cDNA(康为试剂盒HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit)进行半定量PCR(使用天根生物2×Taq PCRMasterMix，条件同说明书)，分析金霉素合成基因簇相关基因，使用引物如表1所示，结果如图6a所示，ctcB、ctcW、ctcH、ctcG、ctcM等基因扩增产物均未有明显条带，说明金霉素生物合成基因簇没有激活或表达很低。

表1：荧光定量PCR使用引物

为了激活金霉素合成基因簇，构建ctcB表达载体pSOK616-PermE*-ctcB，载体构建方法为：以ctcB-s/ctcB-a为引物，以金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)基因组为模板，扩增ctcB基因，866bp；回收产物和质粒pSOK616-EotcR用NdeⅠ+SpeⅠ双酶切，6442bp；然后将两片段进行连接，构建pSOK616-PermE*-ctcB。

所述的引物序列为：

ctcB-s：ATACATATGGAGGGAAATCCGAGCGACATCGG(NdeⅠ)

ctcB-a：ATTACTAGTGACGGGCCTCAGGCCGAACGG(SpeⅠ)

PCR扩增体系为：

PCR扩增条件为：

PCR产物电泳检测后回收，连同质粒pSOK616-EotcR用NdeⅠ+SpeⅠ双酶切，然后回收，两片段分别取5μL和12μL，在20μL体系中使用T4 DNA ligase 16℃反应过夜，然后取10μL转化E.coli DH5α。随机挑选转化子进行BamHⅠ+XhoⅠ双酶切和EcoRⅠ单酶切验证，验证正确的转化子进一步测序验证，从而筛选得到pSOK616-PermE*-ctcB，如图7所示。

将pSOK616-PermE*-ctcB转入E.coli ETZ中，然后E.coli ETZ(pSOK616-PermE*-ctcB)与SRC0菌株进行属间接合转移实验，方法同实施例1。经过接合转移和传代实验后得到单克隆菌株，使用616-seq-F/616-seq-R引物进行PCR验证(使用天根生物2×TaqPCRMasterMix，条件同说明书)，筛选得到SRC1菌株。

所述的引物序列为：

616-seq-F：CTTCGGTGAACTTCGGGTACGC

616-seq-R：GAATAGCCTCTCCACCCAAGC

将SRC1菌株接发酵培养，使用HPLC方法检测金霉素生产情况，方法同上，结果如图5所示，SRC1菌株能够产生金霉素，即通过在底盘菌株SR0中共表达金霉素合成基因簇(ctc)载体pSET153-ctc和ctcB基因表达载体pSOK616-PermE*-ctcB，金霉素异源表达成功，金霉素产量如图8所示，9天达到1.51g/L，为了进一步证实金霉素生物合成基因簇被成功激活，提取RNA进行了半定量PCR(方法同上)和qRT-PCR(使用诺唯赞试剂盒ChamQ UniversalSYBR qPCR Master Mix进行，体系按说明书进行，条件：95℃，30s；95℃，30s，68℃，30s，72℃，30s，40个循环；溶解曲线使用仪器默认程序)，使用引物如表1所示，结果如图6所示，结果表明金霉素生物合成基因簇被成功激活。

实施例3：通过增强ctcB基因表达提高金霉素产量

为了增强ctcB基因表达，提高金霉素产量，在pSOK616-PermE*-ctcB载体基础上，更换PermE*启动子为更强的启动子Psf14和PkasO*，构建pSOK616-Psf14-ctcB和pSOK616-PkasO*-ctcB。

载体构建过程：质粒pSOK616-PermE*-ctcB，采用HindⅢ和NdeⅠ双酶切，回收7172bp片段；

以Psf14-s/Psf14-a为引物，pSOK616为模板，扩增Psf14启动子序列，121bp；PkasO*-s/PkasO*-a为引物，pDR4-K*为模板，扩增PkasO*启动子序列，127bp；

PCR扩增体系为：

PCR扩增条件为：

pSOK616-PermE*-ctcB/HindⅢ+NdeⅠ片段与Psf14、PkasO启动子片段分别进行两片段Gibson组装，组装液取10μL转化E.coliDH5α。转化平板上长出的单克隆提质粒，使用616-ce引物测序，经过测序验证，分别筛选得到pSOK616-Psf14-ctcB和pSOK616-PkasO*-ctcB，如图7所示。

所述616-ce序列为：ACCACGGAACAGGGTGAGCAG

将pSOK616-Psf14-ctcB和pSOK616-PkasO*-ctcB分别转入E.coli ETZ中，然后与SRC0菌株进行属间接合转移实验，方法同实施例1。经过接合转移和传代实验后得到单克隆菌株，使用vwb-t3-s/vwb-t3-a引物进行PCR验证(使用天根生物2×Taq PCR MasterMix，条件同说明书)，筛选得到SRC2菌株和SRC3菌株。

所述的引物序列为：

vwb-t3-s：AGCGTTCGAACACCCTCGGT

vwb-t3-a：AAGCCTGCGCCGAAGAGCAA

将SRC2菌株和SRC3菌株接发酵培养，使用HPLC方法检测金霉素生产情况，方法同实施例2。结果如图5所示，SRC2菌株和SRC3菌株均能产生金霉素。金霉素产量如图8所示，9天分别达到2.15g/L和3.27g/L。qRT-PCR(方法同实施例2)结果如图6所示，结果表明：随着启动子强度增强，金霉素生物合成基因簇转录依次增强，合成金霉素产量也依次增高。同时采用二苯胺测定DNA方法进行了生物量的测定(Zhao Y,Xiang S,Dai X,Yang K(2013)Asimplified diphenylamine colorimetric method for growthquantification.Applied microbiology and biotechnology 97(11):5069-77)，结果如图9所示，改造菌株生长趋势基本一致，证明金霉素产量的提高是由于ctcB表达增强所致。

实施例4：通过增强宿主的金霉素耐受性提高金霉素产量

SRC0菌株、SRC3菌株和金霉素生产菌株S.aureofaciens 10接MS固体平板，孢子成熟后，收取并测定孢子悬液吸光度，根据吸光值对不同菌株的孢子悬液浓度进行归一，将归一后的孢子悬液进行梯度稀释。配制5mg/mL的金霉素母液，过滤除菌，加入到预热好的固体MS平板中，配成终浓度分别为0ug/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、175μg/mL、200μg/mL、225μg/mL的平板。取5μL不同稀释度的孢子悬液点接到含有不同抗生素浓度的固体平板中，37℃静置培养3-5天后观察各菌株不同稀释梯度菌落的生长状况，确定不同菌株对金霉素的耐受性(Luo S,Chen XA,Mao XM,Li YQ(2018)Transposon-based identification of a negative regulator for the antibiotic hyper-production in Streptomyces.Applied microbiology and biotechnology 102(15):6581-6592；Yin S,Li Z,Wang X,Wang H,Jia X,Ai G,Bai Z,Shi M,Yuan F,Liu T,WangW,Yang K(2016)Heterologous expression of oxytetracycline biosynthetic genecluster in Streptomyces venezuelae WVR2006 to improve production level and toalter fermentation process.Applied microbiology and biotechnology 100(24):10563-10572)。结果如图10所示，SRC0菌株金霉素最低抑菌浓度为25μg/mL左右，SRC3菌株金霉素最低抑菌浓度为50μg/mL左右，而金霉素生产菌株S.aureofaciens 10最低抑菌浓度为225μg/mL左右，异源底盘宿主的金霉素耐受性明显低于金霉素生产菌株S.aureofaciens10，表明金霉素耐受性较低可能是产量的限制因素。

为了提高宿主的金霉素耐受性，使用金霉素抗性基因ctcR和ctcC，构建融合表达载体pSOK616-ctcB-ctcR-ctcC-1，构建方法为：以ctcR-s1/ctcR-a为引物，pSET153-ctc为模板，扩增ctcR1片段(1664bp)，回收作为模板，以ctcR-s2和ctcR-a为引物，扩增ctcR2片段(1717bp)；以ctcC-s和ctcC-a1为引物，pSET153-ctc为模板进行PCR，扩增ctcC片段(2107bp)；片段ctcR2和ctcC为模板，ctcR-s和ctcC-a2为引物进行融合PCR，扩增ctcR-ctcC融合片段(3783bp)。

PCR扩增体系为：

PCR扩增条件为：

扩增ctcR1片段、ctcR2片段、ctcC片段，延伸1min20s，扩增ctcR-ctcC融合片段，延伸2min40s，PCR产物回收后电泳检测，pSOK616-PkasO*-ctcB用HindⅢ酶切(7276bp)，去磷酸化，回收；ctcR-ctcC融合片段用HindⅢ酶切，回收，pSOK616-PkasO*-ctcB/HindⅢ片段和ctcR-ctcC融合产物/HindⅢ分别取3μL和14μL，在20μL体系中使用T4 DNA ligase 16℃反应过夜，然后取10μL转化E.coli DH5α。随机挑选转化子进行HindⅢ和NdeⅠ酶切验证，验证正确的转化子使用引物RC-u、RC-d、u-1、u-2、u-3、u-4测序验证，从而筛选得到pSOK616-ctcB-ctcR-ctcC-1载体，如图7所示。所述引物序列为：

RC-u：CGCTCTTCGGTGAACTTCGG

RC-d：CCAGCGGACCCAGAATGTTG

u-1：TGGTGCCGCTGCTGATCGTG

u-2：TTCATGTCGGTGCTGTTCGG

u-3：AGCTCTACCCGGTGCTCTTC

u-4：TGCCGCACGCCTTCCACAAG

将pSOK616-ctcB-ctcR-ctcC-1转入E.coli ETZ中，然后与SRC0菌株进行属间接合转移实验，方法同实施例1。经过接合转移和传代实验后得到单克隆菌株，使用vwb-t3-s/vwb-t3-a引物进行PCR验证(使用天根生物2×Taq PCR MasterMix，条件同说明书)，筛选得到SRC4菌株。

将SRC4菌株接发酵培养，使用HPLC方法检测金霉素生产情况，方法同实施例2。结果如图5所示，SRC4菌株能够产生金霉素。金霉素产量如图8所示，9天达到3.80g/L。qRT-PCR(方法同实施例2)结果如图6所示，结果表明：抗性基因ctcR、ctcC和相关生物合成基因转录均增强。采用二苯胺测定DNA方法进行了生物量的测定，结果如图9所示，改造菌株生长趋势基本一致，证明金霉素产量的提高是由于ctcR、ctcC表达增强所致。同时金霉素耐受性，如图10所示，提高到100μg/mL左右。

尽管上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，依然可以对所述的实施例中的技术方案进行修改、替换、组合或简化，而这些在未背离本发明精神实质与原理下所做的改变均应视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河北圣雪大成制药有限责任公司

中国科学院微生物研究所

<120> 链霉菌底盘菌株及其构建方法、在异源表达研究中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> 金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)

<400> 1

gtgaagttca acattctggg tccgctggaa gtcctcgaca agggaattcc gtgcaccccg 60

agcgcgctga aggtccgctg gacgctggcg gtcctgctca tgaacgcgaa ccggatcgtg 120

gacctcggcc tcatcatcga ggagatctgg ggcagcagcc cgccacgcac ggtggtcacc 180

accgcgcaga cgtacatcta ccaactgcgc aagctctgcc gtccgctggg ccgcgaggtc 240

atcctcacca aggcccccgg ctacgtgctg ctgctggggg aggaggagct ggacgcccag 300

gagttcgagc ggctgcacca cgagggggac cgactgctgg tcgccggcca ccccgaggcg 360

gccgcccagc ggctgcggca ggcgctggac ctgtggcggg gcaccgccct ggcggacatc 420

ccggtgggtg ctccgctcgc cggtcacgtc gccgtcctgg aggagatgcg cctgcgcgcc 480

ctggagcacc gcatcctggc cgaccggcag ctcgggcgac accgggaact catccccgaa 540

ctgagactgt tgaccctgca ccagccgatg aacgagtggt accacgagca gctcatgctc 600

gccctggacg ccgccgggcg gcggagcgag gccctgcacg tctaccgcgt gctctaccgc 660

cgactcgacg aggacctcgg catcgccccc tcccgaccgc tgcaggagct gcacaacgac 720

ctgctcagcg gcacgtcgcc cactcggcag gagttccagg cgcttgccgc gcgggcgatg 780

gagcagggcc tgcgggcccg ttcggcctga 810

<210> 2

<211> 31565

<212> DNA

<213> 金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)

<400> 2

gcatggctgc tttccccggc cggccagagg cctcacgcca gttcacgggc gtggccgcac 60

cggcccgtgc cgcggccgcc cgatcggccg acggctccag gacagcccgg gccgtcccgg 120

cccccgcggc acggcccacc ccgcagcgac cccggcccgg ccgctccacg gcccggtccc 180

ggcccgcaca ccctccgggc cccactccga agaatcggtt ctcttgggcc cgccaccggg 240

cccggggcgt ccaccgcacc gcccgccgcg gccagcccgg atcgctccac tcatcggtca 300

ctcgcgcctg tcgccatcgg gggtcaaccg tgtcagtcgg caacaaccat ccgtcggttc 360

tcgtcgtcga ggacaacgtc ctgctgcgca cgggcctgca ggccctgctg tcggccgagc 420

ccgacctcgt cctccgcgcc gccgtcggcg gcgtggacga agcactcgcc gtcatggccg 480

ggcaccccgt ggacgtcgtg gtgtacggag cgggcgagtc ggtggccgac accgagcggg 540

gcctcgagcg cctgctcgac cggggcaccc gggtggtcgt actgagccgg cgggaccacc 600

ccggcgagat ggagacgtac ctcagcagcg gtgtgcacgc ctacctggcc gaggacgcgg 660

ccggggagtg cctcggcttg gtgatccggg gcctgacctc ggaccgggag cgggtctaca 720

tcatggcctc gcgctccggc ctcgactgga tggccggcca gcgcggcaac cgcctgtccg 780

gacgcgagcg ggaggtcatg ggcctggtcg cgaacgggct gagcaactcg gccatcgcgg 840

gccggctctg catctcgccc ggcaccgtca agcgccatct ccggaacgtg ttcgtcaagc 900

tcaacgccgt ctcccggatc gacgccgtga acaaggcccg ggccgcttcc atgctggtcc 960

cggccggccg ggcctgagcc ccgcggaccg gtccggcgcg gatccgtccg cggtgaccgg 1020

tccggcgcgg acccctgcgg ggacgacggc cccggcaggg agcggagcag ggctcggccg 1080

ggacgggcct caggccgaac gggcccgcag gccctgctcc atcgcccgcg cggcaagcgc 1140

ctggaactcc tgccgagtgg gcgacgtgcc gctgagcagg tcgttgtgca gctcctgcag 1200

cggtcgggag ggggcgatgc cgaggtcctc gtcgagtcgg cggtagagca cgcggtagac 1260

gtgcagggcc tcgctccgcc gcccggcggc gtccagggcg agcatgagct gctcgtggta 1320

ccactcgttc atcggctggt gcagggtcaa cagtctcagt tcggggatga gttcccggtg 1380

tcgcccgagc tgccggtcgg ccaggatgcg gtgctccagg gcgcgcaggc gcatctcctc 1440

caggacggcg acgtgaccgg cgagcggagc acccaccggg atgtccgcca gggcggtgcc 1500

ccgccacagg tccagcgcct gccgcagccg ctgggcggcc gcctcggggt ggccggcgac 1560

cagcagtcgg tccccctcgt ggtgcagccg ctcgaactcc tgggcgtcca gctcctcctc 1620

ccccagcagc agcacgtagc cgggggcctt ggtgaggatg acctcgcggc ccagcggacg 1680

gcagagcttg cgcagttggt agatgtacgt ctgcgcggtg gtgaccaccg tgcgtggcgg 1740

gctgctgccc cagatctcct cgatgatgag gccgaggtcc acgatccggt tcgcgttcat 1800

gagcaggacc gccagcgtcc agcggacctt cagcgcgctc ggggtgcacg gaattccctt 1860

gtcgaggact tccagcggac ccagaatgtt gaacttcacc atgcctccga tgtcgctcgg 1920

atttccctcg gccccaggta tatccgggtc cgcggacggg cctcaagagg aatccgcaca 1980

aggtggcagg cgcgcaattc caaggtggca ccgacgcatt tccagagcgg tccggctccc 2040

tgtcccgagg gaaacacccc cgccgaccga cccccgccga tcggctggcg gatcgacaag 2100

tcctgttagg ctgggggcgg ttggccccat gggccggcac cggtcacctg atacccgcga 2160

gacagagcca cgaggagaag gacgtgcccc gaaagatccg tgttgctccg gtaatccgta 2220

cgaagaccgc agaactaggg gacacacgtc ttgacaaccg tgaacatcgg aatcctggcc 2280

catgtcgacg ccggtaagac cagcctgacc gagcggctgc tgcacaccgc cggcgtcatc 2340

gaccgggtcg gcagcgtcga ccgcggcgac acccagaccg actcgcacga actcgagcgc 2400

cagcgcggca tcaccatccg gtccgcggtg gtgtccttca ccgtgggcga cgtcaaggtc 2460

aacctcatcg acacccccgg ccacccggac ttcatctccg aggtggaacg ggccctcggc 2520

gtgctcgacg gcgtggtgct ggtcatctcc gccgtggagg gcgtgcaggc ccagacccgg 2580

ctgctgatgc gcacgctggt gaaactgcgc atgccggtca tcctcttcgt caacaagatc 2640

gacaggatgg gcgcgcgcta ccacgagctc ctggacgaga tccgctccga gctcaccccg 2700

gccgtcgtcg ccctgacccg ggtcgaaggg ccgggcaccc ccggagcacg ggcgttcgcc 2760

cggaccgtcg ggaccgacga ccccgacttc gccgccgaac tggccgacat cctggccgag 2820

cacggcgacg acttcctggc ccgctacctc gaggacgaga cctccctgac cgcgcaggac 2880

tacagcgcgg aactcgcccg ccaggcggcc cggggccagc tctacccggt gctcttcggc 2940

tcggccgtgg ccggcgtcgg catcgatgcc ctggtcgacg ggatcaccag gctgtttccg 3000

gtcaatcacg gcggctccgg gggcaccctc cgcggtaccg tgttcaagat cgagcgcggg 3060

tgggcgggcg agaaggtcgc ctacgtccgg ttgcacgggg gcgagctcgg gtcgcgggag 3120

aaggtgtccg tgttccggcg cgaccagcac ggagccgtca ccgagattcc cggccgcacc 3180

acggtggtcg aggtgttcga ccggggctcg gccgtcgtcg agtcgcgggc ccgggccggg 3240

gacatcgcca aggtctgggg gctcaagggc atccggatcg gcgaccggct cggttcggcc 3300

gaggggctgg acggggagca cctgttcgcg ccgccgagcc tggagaccgt gatccgaccc 3360

tcccggccca gcgcgatgcc cgaactgtac gacgcgctgc tgcagttggc cgaccaggac 3420

ccgttcatca acgtccgcaa ggacgacgag gagcaggaga tcgccgtctc gctctacggt 3480

gaggtgcaga aggaggtcat cgcggccacc ctcgccgacg agttcaagct ggacgtggcc 3540

ttcgagggca cccggatcat ctgtgtcgag cgcccgatcg gggtcggcga gtcggtggag 3600

gagatcgact accggagcaa gaccttcttc tgggccacga tcggcctgcg ggtggaaccc 3660

ggggagccgg gatcaggggt cgtgttccgc cgctcggtgg agctcggctc gctgccgcac 3720

gccttccaca aggccgtcga ggaggccgtg cgggccaccc tgcagcaggg gctgaacggc 3780

tgggaggtgc tggacatcct ggtgaccctc acccgttccg ggttcgccag cccggtgagc 3840

gcggcgggcg acttccgcaa gctcacgccg ctcgtgctga tgaacgcgct caagcaggcg 3900

ggaacgcagg tgtacgaacc ggtcaaccgc ttcgagctgg aggtgccggg tgagaacgcc 3960

agcgccgccc tgctgagcct ggtggagtgc ggcgccaccc cggagagcac ccggggcctg 4020

ggcagcagct gcctggtgga ggggacgatc ccggcccgca cggtgcagga gttcgagcag 4080

cggctgccgg gcctgagcca gggccagggc gtgctggtca cccggttcca cagcttccag 4140

ccggtggtcg gggcggcgcc gaggcggcgg cggaccgacc tcaacccggt ggaccgctcg 4200

gagtacatgc tgcgggcctt cggccggatc tgacggggcg tcgtgaacgc tgagggcccg 4260

accaccgtga cggtggccgg gccctcagcc gtggcgcact ccgtcctcag tcgagcagcg 4320

ccaccgctcg cgtccaaccc gcccccgccc cggcgatctt gaccgggaac gcctgcacgg 4380

tgaacccggt cggcgcgggc agtgcgccca gattgctcag acgctcgatc tggcagtact 4440

cccgctgccg gcccgcgaag tgcgcgggcc acagcacgga acggtcgcgg gtgcgctgga 4500

actcggcgag catgtgcgtg aacggagcgt ccagcccgaa ggcgtccgtc ccgatgagcc 4560

gcacgccgag atcgagcaga aggttcgtcg ccgccccgtc caggcccgcg aaccgggtga 4620

agtactcggg agtcccggcg agtcgttcgg caccggtgtg cagcagcacg atctccccgg 4680

cgctcggccg gtggtcgatc tcgtcgaagg cgcgccgcag ccggtccacg ccgaccgtcc 4740

cgaccccgca gtcggtgagg tccagccgga cgcccggccc gatgaaccat tccagcggca 4800

actcgtcgat gtggcgcggc actccgtagg cggccctgct gccgtagtgg gagggtgcgt 4860

cgacgtgcgt gccggtgtgg gtggtcaggg tcagggtgtc cagcgagagc agttccccgt 4920

ccggcaggtc cgcgacgtcg aactcgaggc cgtggtcacg gagcatgccc tcggccatgt 4980

ggcgcgcgcc gtcggccggc gtcagcacct cgtggcggat gccgtccacc tcccaggcgt 5040

tggcgtcgat cgtcgaggag aggtcaatga ggcgcatgcg cggccccttc cggcagcaga 5100

gcgcagtccc gcaggacgtc gaggcagcgc tccggccccc gatcccgcgc ggcgaggtgg 5160

ccgtccggcc ggatcagcag gaactcccct ggtgccaggc cgagttcgcg gcgcagcaca 5220

cccccggggt cgggcagctc gcccggggct ccggggtcgg cgacggtacg gacggagacg 5280

gcggagccga acagccgctc cacccgggcg agcgcctccc ggtacccggt gctcccgccc 5340

tcggccgggg tggcgagcag ggtccagcgg gggtcggcga gttcggcgca gagcgcggac 5400

cagccggggt gcccggcggc cgtccgggcg tcgcagccca cccggtcccc gggcgagggc 5460

cgcccggcgc gcgagccggc cgggcgggtg agcgggctgt ccgggtaggc gagggccagt 5520

ccgcagaagc cccggatcat ccggccctcg accttgcgcc gcagcggcgt gatccggcgc 5580

agcgccgcgg tgcccacggt cagcagggcc ggggccagcg cggtgcgcag cgacaccagg 5640

gcggtggccg tgcgggtgga gcgcagcagc acggccccgg tcgggactcg ctcggcgtcg 5700

tagctgtcca gcagggcggg cccggcgtgg ccgcggatca cgtcggcgag cttccaggcg 5760

aggttgtagg cgtcctggat accgctgttc atgccctgcc cggaggccgg gctgtggacg 5820

tgggcggcat ccccggcgag gaagcagcgg ccctcgcgca tccgggtgat ctggcgttgc 5880

tggacggtga agacggagag ccaggtcggg gtgccgacct ggacggggcg cccgagcgcc 5940

cggccgatct tgtcggccag gcggcggcgg accagctcgc ggtcctcggc gccgtcggtg 6000

tccaccgtgt ccaccacgcg ccacttgccg ggctcgggga acgggacgag cagcagggtg 6060

ccgggctcgg tgtgcagcag gtggttgctg tccggcggga ggtcggcgtc gagggtgacg 6120

tcggcgttga gccagacctc ggtggagtcg ccgatcaggc gcatcccgag ctgcttgcgc 6180

acggtgctgc ggccgccgtc ggcgccgacc agccagggca cccgggtctc ctcggtgcgc 6240

ccgtcggcgt ggcggagggt gacgagcacg gagtcgggcc cggtctgcag cgcggtgagt 6300

tcgacgcccc attccacggg gacgccgagt tcggcggtgc gctcgcgcag cacctgctcg 6360

gtgaccactt gatcgaccat caggctgaac gggtaacggg tcggaagtga gcggtagttg 6420

gtgtcgaagc ggatgagggt gcggccccgg cggtgcatgg tgaagtgggt gacccgccgg 6480

ccgagcggca gcagccggtc gagggcgccc atctgctcga gcacctccat ggtccgggcg 6540

tgcaccgcca gggcccggct gctggtggcc gggccgggcg cggcgtcgac cagccggacg 6600

ggtacgccgc gcctggcgag ttcgtgggcc gtggtgaggc cgaccgggcc ggcccccgcg 6660

atcaggacgg ccggagcggg gtcagccacg gcgttcctcg gcgaagcgct tggccaggcc 6720

gagcgtggcg cggctgttgc cgccggcggc ctcgcggatg aagcggcggg cggtggcggc 6780

ggtggcgtcc gggccgagga cggtggggac cgcctcgggg ttgaggacga cggcgtgcca 6840

ggaggtgacc cgcactccgc ggtcggtcgg ctcgacggtc cagcggccgg tgtgggcggc 6900

catcatggag ggggtgcgca gctgcttgta ggcgatgccg gactccggga agcagatccg 6960

gatggactcg gtggtgtgtt cggagccgtc ggcggtgcgg gtgtccatgg acatgtgctg 7020

gatgccgccg gcctcctcgc gcaggtcgag gcgggcgacg tggggcagcc gggcgggcca 7080

ggcggcggcg tcccgcagga agtcgtagac ggcctccggg gcggcgtcga ccagcaccga 7140

gtcctcgaac tcgaactcga actcggcgag ccggttccag cgttcggcga ggtccttgat 7200

gccggcgagt tcgctgcggc tgttgcggtc cgtcgcctcg ctgatccagc gcaggccctg 7260

cgggtcgtcg tcgagcgcgc tgaactcgtg ggtgagggtg agggtggtgc cgccggggcg 7320

ctcggcgacc tgccactccc ccgccatcga ggagaccggg gccgaggagg cctcctggcg 7380

gaaacggatc cggcgcaggt cggcgtccag gtcgcggcgg gacgtccagt gcttgacctc 7440

gccgttggcc cgggcccaga tcttcaggcg ctcggcgccc ggccccagct cctcgcgctc 7500

gacgtggagg gtgggggcga agcgccgcgg ccaggccagg gcgtcggcga tgacggtgta 7560

gacgacctcg gcgggggcgt cgacgtcgat cgagtgggtg gtgtgctgga tggtgctcat 7620

gggtgggacc ggccctttcc gtcggcgggg tgaagctcgg cggggtgaag ttcggcgggg 7680

tgaagttcgg cggggtgcgt ggggtgcggc tcagtagatg ccgaggccac cgcagacgtt 7740

gatcgcctgc gcggtgaccg acgcggcgtc gggggtggtc aggtagtcga ccatgccggc 7800

gacctcctcc gcggtggagt agcggccgag cgggatcttc tgctcgaagc gtgagagcac 7860

gtcctcctcg gtggtcgccc aggtcgcggc gtacgcctgg cggacccgca cggccatcgg 7920

cgtctcgacg tagccggggc agacggcgtt gaccgtggta ccggtgtggg cgagctcctt 7980

ggccagcgcc ttggtgaagc cgatgacgcc ggccttggag gccgagtagg gggcgcccag 8040

cgggacaccc tgcttgccgc cggtggaggc gacgctgatg atccgcccgt gcccggccgc 8100

ctccatgccg ccggtggtga ggacctcgcg ggtgacgcgg aagacgctgg tgaggttggt 8160

gtcgatcacg tcctgccaca gctcgtcggt gagggtggag gtgacgccac cgccgttgcg 8220

tccggcgttg ttgaccagca cgccgatcgg gccgaagcgg tccaccgccg cccggacgac 8280

cgtgctcacg tcctgcgcgg agcggacgtc ggccgcgagg ccgtccacct ccaggccctc 8340

gccgcgcagg cgggcgaccg tctcggcgac gccctgcgcg gtgcgggcgc agatgaagac 8400

actcagcccg cgccgggcca gccgctcggc gctggccagt ccgatgccgc tggtcgcccc 8460

ggtcaccagg gcgacgtcgc cggtcgtcac ggtgctcatc gcatcgatct cctgtctcgc 8520

tcacgggtcg cgggcccggg cgggcccgcc ggtcggggcc cgcccccgcg ccccgtcggg 8580

aacccggggg gacaggcccc gggccgaccc tgcccggacg gcttcgactg cggttcgagc 8640

gcgcctcaca cgccgaccgc tccaacggga ttcgaagcgc gggtgggagc gtcggcgctg 8700

cccaaccacc gacgcaacga ggaggcccgg agcatgaccg gttcgctcta cgaggaggtc 8760

cagcacttct acgggcggca gatgcgccac ctggacgagg gtgaggtcac cgagtgggcc 8820

gcgaccttca ccgaggacgg cgtgttcgcc gccaacgccc gcccgcaccc gcaggagggt 8880

cgcgcggcga tcgagcaggg cgcccgggag gccgcccagc gcctggccga tgccggaatc 8940

cggcaccggc actggctggg gatgctggag gtcgccgcgc agccggacgg cctggtgctc 9000

gccaagacct acgcgctgat cgtcgcgacg cccaagggcg ggccggccgc cgtgcacctg 9060

agctgcagct gtgaggacca gctggtgcgc gtcgacggcg agttgaaggt ccggcaccgc 9120

caggtgcacc gggacgacct gcccgcctga gaggaggcca ccgtggacct cccacgggac 9180

agtacgacct tcggtccgcc gctggacgtg gtggcggagc tgatcggcgg gccccggatc 9240

gacgacctcg tccgccgtgc ggccgagctg acgcctcgtc atattgcttt ggtgcacggt 9300

gacctggtgc tcgaccacgc cgcgctggag gcccgggtga gcgactgcgc cgaggcgctg 9360

cgcgccgcgt tcggcggtcc cggcacggtc atcgcgatcg ccgccgagct gaccgtcgac 9420

ttcgccgtca ccttcctggg catctcccgc tccgggaaca ccagcgccat gttcaacccg 9480

ctcgtcccgg acgacaccct ggtgcacgtc ctgaactcct gcggcgcccg ggcggccgtg 9540

ctgtcgcccc ggatgcaccg ccgtgtccag gccctgcggg accggctgcc gctgctgcgg 9600

caactggtgg tgaccgccga cgcgctcgac ggcacgcccg tcctggacgc cctggagcgc 9660

accgccgtcc cggccggcga ggtggtggag accgcctgcc tgcagttcac cagcggcacc 9720

accggcgtgc cgaagaccgt ccggctcagc caccgcaacc tgctggtgaa cgcggcgcag 9780

tcggcgcacg cccaccggct gacggccgac gccgtctcgc tcaacaacct gccctccttc 9840

cacctgatgc acctgaacgc cgcgctcgcg gtcggcgcga cgcacgtgct ctgcccggag 9900

gaggaccgcg cggcgctggt gggactggcc cgtacctggc gggcctcgca cctgtacagc 9960

ctgccggtgc ggttgtcccg gctcgccggg gacgagcggc tgcccgactt ccgcatcccc 10020

tcgctacggg cggtgctgtc cggtggatcg gcgctgccgc cccggacgac gaccgtcctg 10080

caggagcact tcggggtgcc ggtcgtccag ggctacggcc tcgccgagac gtccccgtcg 10140

acgcacttcg acctgcccga ggggcccacc ctcggctcca gtgggccccc ggtcgccggg 10200

acggcctgcc ggatcgtgga cgtccgcacc ggcgcggtgc tgccggtggg cgagcgcggt 10260

gagatccagg tccggggccc gcagctgatg ctgggctacc tgggcgacgg gcccaccgac 10320

gccgtcgacg cggacggctg gttccgcacc ggtgacgtcg gccggatcga cgaggccggc 10380

cgcctgttcg tcgtcgaccg gatcaaggac gtcttcaagt gcgacaactg gctggtgtcg 10440

ccgaccgaga tcgagcgggt gctgatgcgg cacccggccg tcgccgactg cgtggtcttc 10500

gaccagcccg acgaactgag cggcgccgtc gccgtcggcc tcgtcgtgcc gcgcggcgag 10560

ggcgtcgacc cggccgccct ggccgcgttc gcgaacgccc ggctccccta ctacgagcac 10620

ctgaggcagc tgcgcctggt ggagggcatc ccgcgctccg ccacgggcaa ggtccagcgg 10680

cgcgaactcc gtgaccggct gttcggctcc ctctgacccg caccacccca cccgtccgac 10740

ccaccacagg aggaacaccg tgtacacctt catcaaccgc ttcaccgtca ccggggacgt 10800

cgccgagttc gagacgctcg tcggcgagat cagcgagttc atgagcggcc ggcccggctt 10860

ccgctcgcac cggctgtacc gctgcgccac ggacgcctcg gtgtacgtgg agaccgccga 10920

gtgggacgac gcggcctcgc accgggcggc gaccggctcg ccggagttcc gcgcccgggt 10980

cggcaaggtg atgagcctgg ccaaggccga gccggccccg ttcgacctgc tcgcgcagca 11040

cggcgcctga gagggggagc accatgacgg acaacggcga gatcattgcg cagccggtga 11100

tccagctgcg cgagctgggg ctggcggcgg ccggcgccgc cgccgtacgg gccgcggccc 11160

ggctgggcct ggctgacgcc ctgggcgagg agccggccgg cgcggccgag ctggcccggg 11220

ccgtgaacgc ggacccggac accctgcagc ggctgctgcg cgccctggcc tgctacggcg 11280

tgttcgccga gcagccggac ggtcggtacg tgcacaccgg cgcctcccgg ctgctgcgcg 11340

aggacacccc gcgcagcctg aaggacatgg tgctctgggg caccgagccg tggacctggg 11400

agctgtgggg ccacctcgac gaggcggtgc gcaccggcaa ggccgtcttc cccgagctgc 11460

acggcatgga cttcttcgac cacctgcacg cccactcccc cgagtcggcg gccgtgttcg 11520

accgggcgat gacccagtcc agtcggctct ccgcgctcgc gctggccgac cggctggacc 11580

tcggcggggt cggcacggtg gtggacatcg ccggtggcca ggggcacgtg ctggccaccc 11640

tgctggagcg caaccccggt ctgcgcggca ccctgctgga cctgcccgag gtcgtctccg 11700

gggccgacgc ccggctgcaa ccgggcggtg cgctggccgg gcgcgccacg ctgctcggcg 11760

gcgactgccg gcgggagatc ccggtgcagg ccgacgtcta cctgctgaag aacatcctgg 11820

agtgggacga cgagagcacc gtcctgacgc tgcgcaacgt cgtccgggcg gctgctccgg 11880

gcagccgggt gatcgtggtc gagaacctgg tggacggcag ccccgagctg cggttcacca 11940

cggcgatgga cctcctgctg ctgctcaacg tcggcggccg caagcacacc agggccggcc 12000

tggtctcgct gatcgaggag gcgggcctga cccgggccga ggtccgtccg gtcaactcct 12060

acctgcacct ggtggagagc gtggtgcccg aacggggctg acccgcccgc ccacggccgc 12120

cgcccccgga cccgtccggg ggcggcggcc gtgctgtccg ggggcggcgg ccctcgcact 12180

gtccggggcg gcggtgagcc ccgtcggcac ggccgacggg gctcgggggc gcaacgggaa 12240

ggggagcggg gtcagatgcc ctcggcgagc cgcttcaccg cctgctcgac ccgctcgtcg 12300

gtctcggtga cggccacccg cacgtgccgg gcggccgcgg cgccgtagaa ctcaccgggc 12360

gccaccagga tgccgcggtc ggccagcgca ccgacggtgg tccagcacgg ctcgtccctg 12420

gtcgcccaga ggaacagcgc accggccgag tgctcgatcc ggaagccggc gtccaccagc 12480

gccccgcgca gcagctcgcg ccgccgggcg tagcgccggc gctggcccgc caggtgcgcg 12540

tcgtcaccga gcgcggcgac catggcggcc tgcaccgggg cggggaccat gtggccggcg 12600

tgcttgcgca cctccagcag cgtcgcgatg acggccgggt cgccggcggc gaagcccgcc 12660

cggtagccgg ccaggttgaa gcgcttggac agcgagtgca ccgccagtac gccgtggtgg 12720

tcgccgccgg tgacctcggc gtggagcacc gagcgggtcg agcgctccca cacgtggtcc 12780

aggtagcact cgtcgttgac caccagggtg ccgcgctcgc gcgcccactc gacgaccccg 12840

cgcagttcgg cggcgtcgag cacccggccc tccgggttgg acggggagtt cagccacagc 12900

aggcgcggcg cggggccgtc gtagctcagc gggtcgtccg tccggacgaa ggtggcaccg 12960

gccagccgag cgctcacctc gtaggtgggg aaggacagtt ggggggcgag gacgacgtcc 13020

cccgggccca ggcccagcat ggtgggcagc caggcgatca gctccttggt gccgaccgcc 13080

gggatcacgg cctccggctc gacgctcacg ccctcgcggc gcagcagcca ggccgcggcg 13140

gcggcccgca gcgcgggcgt gccctcggtg gacgggtagc ccggggcgtc ggccgcggcg 13200

gccagggccg cgcgcacggc ctccggggtc gggtcgaccg ggtcaccgag cgccaggttg 13260

accaacccgt cggggtgggc ggccgcgcgc ctgcggtacg ggaacagaac gtcccagggg 13320

aacttcggca gccgctcgat catgcctgcg cccccgcccc gacgttgcgg gccagcggcg 13380

gagcctggca gtcggagtcg atgccccagg agacgatccg ctccggcgtg atccggatca 13440

gctcgtcgtc gacgtgcggc aggatctcct tgccgccggt cgccagcgcg acggcggtgc 13500

cccggatctc gatcccgcgg acgacccagc gctgcgcgtc cacgatgtcg tccaccacca 13560

gtgacacccg cggatgcccc tgcacgtggc ggtacttgag gctgcgggcc atgccgcgcc 13620

cggtcacgtc gacggtgccg agctcggcgt tgtagtggaa gcccagcggg acgacgtgcg 13680

gctgtccccg gccgtccacg gtggccaggc gggcgagcgg ctgcgaggcc aggtaggcgg 13740

cctctttcgc ggtgaatggc atggctgtcc tcggtgtctg cgggtcaggg tcggcgccca 13800

cgctaggcag cccgcttcga gcggccttgg tgccgttcgg cctgctcgcg tacccgcgct 13860

ggactccggc tcgaagtccg gctgacacgg tgaggccgtc gtaccggacc gagacgggag 13920

gtcgcgttgg actgcgatgt ggtggtggcg ggagcggggc cgaccggcct gatgctcgcc 13980

tgcgaactgg ccctgggcgg agcccgggcg gtggtggtgg aacggcgccg cgagccggag 14040

aagcactcca aggccatggg catgcagggc cgcaccgtgg aactgctcga actgcgcggg 14100

ctgctcgacc gcttcaagga gggcgcgggc gtgctgcagg gcggcaactt cgccagcctg 14160

ggcgtgccga tgcgcttcga ggagttcgac acccgccacc cgtacgtgct gctggtgccc 14220

caactgcgca ccgaggagct gctcgccgaa cgggcccgcg aactgggcgt gcggatcgtg 14280

cgcggctcgg gtgtcaccgg cttcgcccag gacgccgacg gggtcaccgt agagacggac 14340

acgggcccgc ttcgggcacg gtacctggtc ggctgcgacg gcggcggcag caccgtccgc 14400

aaggccgccg gcatcagctt caccggacag gacccgcaca tgtacgccct catcggcgac 14460

atgcgcttca gcggcgacct gccgcgcggc gagggcctcg gcccgatgcg gccggtgggc 14520

ctggtcaacc ccgccaagcg gtcctggttc ggcgccttcc agcaccagcc gggcgtctac 14580

cgggccaccg tcgcctggtt cgaccggccc ttcgccgacc gccgcgcccc ggtcaccgag 14640

gaggagatgc gcgccgcact ggtcgagcac accggcagtg accacgggat gcacgacgtc 14700

acctggctgt cccgcctcac cgacgtctcc cggctggccg actgctaccg gcagggccgg 14760

gtgctgctgg ccggcgacgc cgcgcacatc cacctgccgg ccggcggcca ggggctcaac 14820

ctgggtttcc aggacgccgt caacctcggc tggaagctgg ccgccgtggt ccgcggccac 14880

ggcaccgagg agctgctgga cagctacggc cgcgagcgtc gcccgatcgc cgacggcgtg 14940

gtgcgcaaca cccgcaccca ggccgtcctg atcgacccgg acccgcggta cgaggcactg 15000

cgccagacct tccgcgacct catggcgctg cccgacacca accgccacat cgccggcatg 15060

ctctccggct tcgacgtcgc ctacggcggc ggcgaccacc ctctggtcgg ccgccggatg 15120

ccggacgccg agctgatcac cgcggacggg ccgcggagga tcagcgattg cttcgccggg 15180

gcccgcggtc tgctgctgct ccccgaacag gccccgaccg cctcgccgct ggccgcctgg 15240

gcggaccgcg tggacaccct gaccgtcaag tcgggcggcc cggacgcgga caccgcccac 15300

ctcgtccgcc cggacggcta cgtggcctgg gccggcgaac cggcccgcac cgaggaactg 15360

caccacgccg cgaccacctg gttcggcgcg gcggcctgat ccccctcccc ctgagaaagg 15420

acgcacgatg acctcgtcca ccgacagcgc cgccgcccgc gcgcgccgga tcgtcgccct 15480

caacaccgcc tacttccagg cgaaggcgct gcagagcgcg gtcgagctcg gcctcttcga 15540

gctgctcgcc gagcgccccg ccgggctcga ccggatccgc gccgaactgg gcgtccagca 15600

ccggctgttc aaggacttcc tgaacgccct ggtcggcctc ggcctgctgg acgagcagga 15660

cggcggctac cgggcctccg agctcgcccg ggagttcctg ctccccggcc ccacgtacct 15720

cggcggcacc gcccgccagc acgcccggct gcactaccac gcctgggcgc agctgaccga 15780

cgcgctgcgc gacggcaagg ccaagtcggc cgtggccgcg cagggccagc tggcctaccc 15840

caagcagtac gaggacctgg accgcgcccg gcagatcatg ctgcacatgg acgcccacaa 15900

cggtttcacg gccgacgagt tggcgcgcgc gatcgactgg agccggtaca cctccttcgt 15960

ggacgtcggc ggcgggcgcg gcaacgtcgc ctcccggatc gtcaccgccc acccgcacct 16020

gcgcggcggg gtcttcgacc tgccggcgct gcgcccgctc ttcgaggagc tggtggtctc 16080

ggccggaacc gccgaccggg tggacttcca cggcggtgac ttcttcgcca ccgacctgcc 16140

ggaggcggac gtggtgatct tcggtcacgt cctgccggac tggccggtcg gggaccgcag 16200

ggagctgctg cgccgcgccc acaaggcggt gcgcccgggc ggcctggtgg tgctgtacga 16260

cgccatgatc gacccggagg aacgcgaccc ggaggtcctg ctgcagcgga tcaaccacac 16320

catgatccgg gacgaggccg gggcctactc gctgcaggag gcccgcgcct acctggagga 16380

ggccggcttc accgtcgacc ggatcgccgc ctccgacacc atcacccgcg accacttcgc 16440

catcggcgtc aagtcggtct gaaggaaaag gagttcgaca tgaccgacac aaccgcggat 16500

cagacgcggc acggcgaccg gccgtacgac gtcgtcatca tcggcagcgg gctgtcgggc 16560

accatgctcg gctcgatcct cgccaagcac ggcttccgga tcatgctgct ggacggtgcc 16620

caccaccccc gcttcgccgt cggcgagtcc accatcgggc agacgctggt ggtgctgcgg 16680

ctgatctcgg accggtacgg ggtgccggag atcgccaacc tggcgagctt ccaggacgtc 16740

ctcgccaacg tcagcagttc gcacgggcag aagagcaact tcggcttcat gttccaccgg 16800

gacggcgagg agccggaccc gaacgagacc agccagttcc gcatcccctc gatcgtcggc 16860

aacgcggccc actttttccg ccaggacacc gactcctaca tgttccacgc cgcggtgcgc 16920

tacggctgcg acgcccggca gtactaccgg gtggagaaca tcgagttcga cgacggcggg 16980

gtgaccgtct ccggcgcgga cggcagcacc gtccgggccc gctacctggt cgacgccagc 17040

ggcttccgct cgccgctggc aaggcagttg ggactgcggg aggagccgag ccggctcaag 17100

caccacgccc gctcgatctt cacccacatg gtcggagtgg acgcgatcga cgaccacgtg 17160

gacacgccgg ccgagcttcg cccgccggtg ccgtggaacg acgggacgat gcaccacatc 17220

ttcgagcgcg gctggatgtg gatcatcccg ttcaacaacc accccggggc caccaacccg 17280

ctgtgcagcg tcggcatcca gctcgacgag cgccgctacc ccgcccggcc ggacctgacg 17340

cccgaggagg agttctggtc ccacgtggac cgcttcccgg cggtgcagcg gcagttgaag 17400

ggcgcccgca gcgtgcgcga gtgggtgcga acggaccgca tgcagtactc ctcgagccgg 17460

acggtcggcg agcgctggtg cctgatgtcg cacgcggctg gcttcatcga cccgctcttc 17520

tcccgcggcc tgtccaacac ctgcgagatc atcaacgcgc tgtcctggcg gctgatggcc 17580

gcgctgcgcg aggacgactt cgcggtcgag cgcttcgcct acgtggagga actggagcag 17640

ggcctgctgg actggaacga caagctggtc aacaactcct tcatctcctt ctcgcactac 17700

ccgctgtgga actcggtctt ccggatctgg gcctcggcca gcgtgatcgg cggcaagcgc 17760

atcctcaacg cactgaccag gaccaaggag accggcgacg acagccactg ccaggcgctg 17820

gacgacaacc cgtacccggg cctgtggtgt ccgctggact tctacaagga ggccttcgac 17880

gagctcaccg agctgtgcga ggccgtggac gccgggcgca ccacggccga ggaggccgcg 17940

cgggtgctgg agcagcgggt ccgcgagtcg gactggatgc tgccggccct gggcttcaac 18000

gaccccgaca cccaccacat caacccgacg gcggacaaga tgatccggat cgcggagtgg 18060

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agggcggcga tgcgggtcaa gccgtagcgc gaggggcaac ggcgagcagc gtccgcggga 18180

cggctgctcc cggacgcggg cctcgccgtt cgccgcacgc gggtgggctc agccctcggc 18240

cgccagggtc agggcggccg tccgcggatc ctcctccacc ggccagcggg cgtaggagcg 18300

gcgccagtac atcagcgggc tgggcacctc gggccggggg ccgccggcca ccaccgcgcc 18360

gatcacgatg gtgtggtctc ccgcgtcgag ggccgcggcg acccggcact cggcgtgcgc 18420

gacgacgtcg gccgacatga ccggcacgcc accggcgctg cccggctccc accggacgtc 18480

ccggaagcgg tcgtccacgg gcgcggcgaa gcgcgcggac gtggactccc ctccgccgcg 18540

cagcacgttg acggcgaact cgccgcgctc caggagggcc ttcagcaccc ggctgtcgcg 18600

gttgatgcag accagcaaca ggggcggggc cttggagacg ctgcaggcgg ccgaacaggt 18660

caacccgtac ggctccccgt ccggtcccag ggtcgtcacc acggtgaccc cggtcggcag 18720

ggcgcccatg atcgacagga aggtgtctcc gtccaccagg ccgggggcca ggtccagcgg 18780

cagggacagg ggttcggggg gcatcggtcc tccactctcg gcgggtcggt gcccccatgc 18840

tcgcggggcg ccttcgagcc ggcgccgggc cgtcgtcggg ccctccgggc acgcgaacgg 18900

gcgcgcggac gggcgcgcgc gagggcgcgc ggacgcggcc ggagccggag cggaaaagcg 18960

cgtacccccg gcacgggggt gaccgggggt acgcgggttc agggggtgcg ggtgcgcgcg 19020

ctcactcctc gtcgctcagt tcccgcagcg ggaaggtgag caggaagccc accgcaagga 19080

tcaggccgcc gaccaggaac atcgtgtcga agcccgaggt gaaggcgtcg accgccgagg 19140

cgctcaggcc gccggtggag tccgggtcgg agagcgctcg gcgcacggcc tcgtccgggt 19200

cggccccgtc gagcctgccg gcggcgacgc cgaacagcac cgacatgaag acggcggcgc 19260

cgctcgtgcc gccgagctgg cggaacagac cggaggcggc gttggccacg cccagctcgg 19320

acttgggcgc cgagctctgg atcgccaggg tgatgacggt ctgggagagc ccgatgccga 19380

agcccagcca ggccgcgatc accacgatca ccgcgagcgg ggtgtccgcg cccgcggcgg 19440

agagcgacag caatgctccg gccatcgagc cgaggcccac gatcgcgggc ttcttgtagc 19500

ggttccactt cttgatgatc ttggcgcaga tcgtctggga gacgatcgcc ccggtcatca 19560

ccgggatgat caccagtccg gcgacggtgg cactgcgccc ctgcaccagc tgcaggaaca 19620

gcggcagggt ggagaccgta ccgaagatgc cgacgccgat ggtgaagttg acggccgtgg 19680

ccatcgtgat gccaccgcgc cggaacagcc gcagcgggac catcgcctcc agcccgcggg 19740

cccgctcggc gagcacgaac agcaccaggc cgatcagcga gacggcgaag agcgtcagcg 19800

aacgcgccga tccccagccc cagtcgaggc cctcctccgc cacgatcagc agcggcacca 19860

ggcagagcgc cagggtgagc gccccccgga agtcgatcgg gtggtccacc ctgcggtgcg 19920

gcaggttgag cgccttgcgc acgctgacca gcgccaccag accgagcggc acgttgatca 19980

ggaaggccca gcgccagccg gtcaccccga ggatctcgcc ggcgcccgcg aacaggcccc 20040

cgacgagcgg gccgagcaca ctggccgcca cccaggccat catcaggtac gagaagtagc 20100

gcccgcgctc gcgcaccggg gcgaggtcgg cgatgacggc cgtcggcagc gacatcagcc 20160

cggcgccgcc gaagccctgg aggacgcggg cgatcgccag cgtctccatc gagttcgcca 20220

tcgcgcaggc cgccgagccg acgatgaaga ccgcgatcgc cgccaggtag agcggcttgc 20280

ggccgtagat gtcggacagc ttgccgtaga acggcatcgc gatcgtggag ctgaccagat 20340

agccggtgat cacccaggcc tggacggtct ggccgtgcag ttggtcgccg atcgtacgca 20400

gcgcggtgga gacgatcgtc tggtcgagtg cggcgagcag cacggccaac aggagcccgg 20460

acagcgcggt gatgatctgg cggtgagtga agccggcggg gccgccggcg tcgtccgcga 20520

cggcctcgcc ggtctgcgag gtggcgttcg ccattttcgt ttctcccacc ggattcgaca 20580

aggtcttgtc gaattgagcg tagtggctac cgtggcggaa tgacaagttc ttgccgaaat 20640

cccggcccgg acgaggctag gctggccgtg gagagcctgc ggctgccccc atgaccgatc 20700

tctcccccgc ggccgagacc ttgagtgaca tcaccacgga actgttcgcc gtcaacggag 20760

ccctgctgcg cgcgggcgac gcgctgtccg cccgcttcgg gctcacctcc gcgcgctggc 20820

aggtcctcgg gctgctggcc gaggggccac agagcgccgc ccacctggcg cgcgagcgcg 20880

ggctgcgccg ccaggccgtc cagcagaccg tggtgaagct ggtcgaggag ggcctggtca 20940

gcacctcccc caacccggcc gaccggcggg ccccgctggt ctcgctgacc gccaagggca 21000

ccgacgccct cgcccggatc gaacccgccg aacgcctgtg gatggagcac ctcgcgggcg 21060

gcctggatcc ggacgacctg aaggccacgc tgcggctgct gcgtggcctt cgggcggtcc 21120

tggccgaggg cctgcccccg gcggcggtcg gcggcgcgga cgccgccgac gtcacaggtc 21180

cagcgtgacc tcgtactcgg cgagccagga gttgagccac agcaccagct ccagactgcc 21240

ccggtcgtag ggccggctca ccgccccggt cggacgggca gccgcggcca gggcccgcgc 21300

gcggtccagc agcggcagca ccggagcgtc cggatcggcg agcaccccgg ccagttcggc 21360

ccgcagggcg ccctcgtagc ccggatcctg ggtcgccggg tacggggtct tcacccgctc 21420

gaccaccgag cgcggcagca ggtcggccac cgccgcccgc agcaggctct tctcccggcc 21480

gtcgaaactc ttcatctccc agggcacgtt gaagacgtac tccacgagcc ggtggtcgca 21540

gaacggcacc cgcacctcga ggccgaccgc catgctcatc cggtccttgc ggtcgagcag 21600

ggtctgcacg aagcgggtca ggttcaggtg gccgatctcg cgcatccgcc tctcgggcgc 21660

cgactcgccc ggcagcaccg gcacttcggc gagcgcctcg gcgtaccggg ccgcccggta 21720

gccgtccagg tcgagcttgt ccagcagacc cggctggaac agcgagctgc cgccgaagta 21780

gcgcgccgaa cccggggtga gccacgggaa ggtggccgcc cgcagggcca acgggttgcg 21840

gaaccaccgg tagcccccga agagttcgtc cgcggcctcg ccggacagcg ccaccgtgac 21900

gttctcccgc accgcgcgga agaacaggta gagcgagggc cacatgtcgc cccagtacgc 21960

gggcggcagg tcggtggcgc gcagcaccgc ggaacgcacc gccgggtccg acaggccggg 22020

gctgtccagc agcacctcca ggtggtccgc tccgacgtgc cccgccagct cgcgcacgta 22080

cggcgcgtcc gcctcccgcc ggacggcgtc ggaggcgaag gcgtcggcgg cgccccggaa 22140

gtccaccgag aaggagcgca ccggcccgct gcgggcggcc agcgccgtca cggccgacga 22200

gtccaggccg ccggagagca gcgtgcccag cgggacgtcc gagaccagct gacgggtgac 22260

ggtgtcggcg agcaggtcac ggacggtgcc gatggtcgtc ggcaggtcgt cggtgtgctc 22320

gcgggcctcc agccgccagt acgtctgccg gcgcaccccg ccgcgcccca cccggacgag 22380

ctgacccgga cggacctcga cgagcccgga gaaaacggcc gcctcgggcg tcttcaccat 22440

gtccagaacc tcgcacagcc cgtccgggcc gacccggcgg ggaagggtcc ggtccgccag 22500

gacggccttg ggctccgagc cgaagcgcac gccggcggcg gtcggccagt agtagagcgg 22560

cttgacgccc atccggtcgc gggccagcag gagttcctcg ctgtgctcgt cccagacggc 22620

gaaggcgaac atcccgttga gcctctcgac cagcgcggcg ccccactgga ggtagccgcg 22680

caggacgacc tcggtgtcgc aggacgtcct gaaccggtgg ccgtgcgagg tgagttcggc 22740

gcgcagctca cggaagttgt agatctcgcc gctgaaggtg atcgccgcgc cgcggccctc 22800

gtgttccgcg gtcatcggct gccggccgtg ctcggggtcg atcaccgaca ggcgccggtg 22860

accgagcccg gccgcgcggc cgaaccaaag gccctcggcg tccggccccc ggcaggccat 22920

ggtgtcggtc atcgcctgga gcaggtcccg gcggtgttcg gccggggcgt cgtagtcgac 22980

cacccccacg attccgcaca tgctcagccg gccgtggcga gaccgaggtt gaccgcgtcc 23040

aggagcatcc gcggcgtggt ggcctccacc acggtctcgt cgggcagggt gatgccgcgc 23100

tcgcgctcga tggtgttgag ggtgttgaac agggcgagcg agtcgtagcc gaggtcggcg 23160

aaggggacgt ccaggatgtc gtcgagggcg atgccctcgt cggctccggc agcctccttc 23220

agcgcggtga tcaggtcgtc aagggtgaac tctgccatgg ctgttcctca catcggtggg 23280

tcggtccgtc aaatccggaa ggtcaggcgg gcggtcggcc ggcccggtca actggtcagt 23340

acgagagcgc tgttgaagcc gccgtggccg cgggcgagga ccagcgcgct gcccagccgg 23400

gccggcctcg gccggtcccg caccaggtcg aggtccgggt gggccggccg gccgatgtgc 23460

acggacggcg ggatcacccc gtcccgcagg gagagcagcg cggccgcgac gtccagcggg 23520

gcgccgccgg ccagcagccg gccggtcatc gtcttgggcg ccgtcaccgg caccccgcgc 23580

gggccgaaca ccgcgcccag cacctcggcc tcggcgcggt cccgctcggc cacgccgctg 23640

gcgtcggcga agaccacgtc gacgtcggag gggccgatcc cggcgtcggc gagcgccgtg 23700

tcgatcgccc ggcgcagccc gggcgggcgc ccggagccgg gtcgggggtc gaaggtggcc 23760

gcgtagccgg cgatccgccc gtagtggcgg tgctgcccgc gctcggcggc gccgtccggg 23820

gtctccagca cgagcagtgc gccgccctcg cccggcaccc cgccggaggc gtcggcgtcg 23880

aagggcagga aggcccgctg cgggtcccgc cgggggctga ccgtgccgct gcggctgagg 23940

cagagccacg accaggggca gagcgagccg tccaccgcgc cggccagcat cagcgcggtg 24000

ccctcgcgca cgtgccggcg ggccttggcc agcgcgtcca ggccgcccgc ctgctcggcc 24060

accagggccg aaccggggcc gcgcatgccg tgccggatcg agatctgccc ggtgttgacc 24120

gggtagaacc acgcgaagga ctggtaggcg ctgacgtagg ccgggccctt gctccacagc 24180

gcctggagtt ccttctggcc gaactcgaag ccgccggccg aggcggccgt cacgacgccg 24240

gcggagaagt ccggcatcgt cgtcgggtcc gcccccgcgt cggcgagcgc ctcctcggcc 24300

gcgaccaggg ccagccgcgt catgtggtcg gtctgcggca gcagtcggcc cggcaggtgt 24360

tcctccggcg tgaagttcac ctcgccggcc acgtgcgccc ggtacccggt ggagtcgaag 24420

cgggtcagcg gcccgagacc ggaccggccc gccagcgtgg cgtcccagta ctccgcaacg 24480

ccccagccgt tcggtgccac cacgccgatc ccggtcacca cgacgtcggt catccccggc 24540

tccactccgg ctcggcgagc acgatcgcgc tctggaagcc gccgaagccg ctcgccacgc 24600

tgagcaccgt gcgcacccgc tgttcccgcg ccaccagcgg cacgtagtcg aggtcgcact 24660

cgggatcggg cacgtgcagg ttggccgtgg gcggcaccac cgagtgctcg atcgccagcg 24720

cgctggcggc gaactccagg gcgcagaccg cgcccagcga gtgcccgatc atcgacttga 24780

tcgagctgac cggcacccgg taggcgtggt cgcccaggct cttcttgaac gcggcggtct 24840

cgtgccggtc gttctgcttg gtcgccgagc cgtgcgcgtt gacgtagccg atgtcctcgg 24900

ggttcatccg gctgcggtcg agcgcgaccc ggatcgcctc ggccatctcg ttcccgtcga 24960

cccgcagccc ggtcatgctg taggagttgc agcgcccggc gtagccggtg acctcggcgt 25020

agatgtgcgc gccgcgccgg atcgcgtgct cccgctcctc cagcacgaac atcgccgcgc 25080

cctcgccgag ggcgaagccg ttgcgggtca ggtcgaaggg gcgcgaggcg ctctcgggtt 25140

cgtcgttgcg cggggtggtc gccttgatcg cgtcgaagca ggccaccgtg atcggggaga 25200

tcgccgcgtc cgaggcgccg gccagcatca cgtcggccgc gtcgtcgcgg atcaggtcgc 25260

aggcgtgcgc gatcacgtcg atccccgagg tgcatccggt cgacaccacg cccaccgggc 25320

cctccgcctc gaccagccag gccagttcgg tggccatcga ggacgggacg aagtagtcgt 25380

agaggtacgg gacgccgtgc gcgtcgtcga ccagccgctc gcggccctcg tcgctcacca 25440

cggcgaactc gcggtccaga ctgatcgtca tcccacaggc ggtgccggcc atcaccccgg 25500

tgcggatcgg gtcgttgacg cccgacactc ccgagtcgtc cagcgcctcg cgcgcggcga 25560

ccaccgcgaa ctgcgcggtg cggtcccatt gacggatctg acgctgcgtc aatccagcgg 25620

cctgcgggtc gaagtcgcac tcggcggcga ccctggaccg gaacggcgag gggtcgaagg 25680

tcgagatcgt ccgggtcgcg gtccggccgg ccgtcagcag ctcccagaac gccttggtgc 25740

ccacctcgcc cggtgccacc acgccgatcc cggtgaccac cacgcgccgg cggccgtcgt 25800

caactcccac cactgctccc cctgtcgatc tccccgtgcg tgtccggcgt catgccctga 25860

cctcctgtcc gtgcgccccg tccgcgggct cgggcgggcg gggacttgag ccggaacaga 25920

tcgtcctggc aggcgttcgc ggcggcttcg agccgccgtc cacgcgcctc cggccccccg 25980

ccttcccgcc gcggcgggaa gggccgcacg cacgacggcg gcggcgccgc acccacggcg 26040

gcgggaagac gacgcgaacc ggcgtcgaag ggcgccccct agcgtctggc cgcatggaca 26100

tcgacaccga catctgcgtg gtcggcggcg gcccggccgg gctgaccctc gccctgctgc 26160

tggtccgctc gggcctgcgc gtcaccgtgc tggaacgcag ccgctccctg gaccgggcct 26220

accgcggcga gatcctccaa cccggcggcc aggccttgct ggacgagctg ggcgtgctcg 26280

gcccggcccg ggcgcacggc gccgtcgagc acgaccgctt cctgctcgag gagcacggac 26340

gcgtcctcat cgacggcgac taccggcgcc tgcccgggcc gtacaactgc ctgctgagcc 26400

tgccccagcg gcacctgctg accgaactgc tcgcggcctg cgaacgccac gaaggattcc 26460

gccagttcgc gggcaccaag gccaccgccc tgatcgagga gggcggcttc gtccgcggtg 26520

tggtcgcggg cggcgcgggc ggctcccccg accgggtggt gcgggcgcgc tgcgtcgtcg 26580

ccgcggacgg ccgcttctcc aaggtccgct cgctcgccgg gatcggctac cgtcgccagg 26640

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gacgcccgtg cgacgtccgg gtcttccggg ccggcggcaa tccggtactc agctaccgct 26760

cggtgcccga ggcgctccag ctcggctgga ccctcccgca cggcggcttc cgcaagctgg 26820

ccgaccgcgg catcggccac atcgtcgacc aactcgtcga cgccgcaccg gagtacgccg 26880

acctgatccg ccaggagatc accggcttcg gcgacgtctc cctgctggac gtcttctccg 26940

gcagcgccga gcactgggtg cgcgacggcc tgctcctgat cggcgatgcc gcccacaccc 27000

acagcccgat cggcgcccag gggatcaacc tggccgtccg cgacgccgtc gcggcccacc 27060

cggtgctggt cgaggccgtc cgcggcggcg acgccggcgc ggcccggctc gccccgtacg 27120

aacggcaacg ccgccccgaa gtggaacgga tcacccggat ccagcaggtc cagagccgca 27180

tgatgctctc caccgggcgc atctcctcca cggtgcgccc ccgggccgcg gcgctggtgt 27240

ccaggacccc gctgtacggg gccatgctgc gccggatcgc cttcggcacc gcgcccgtcc 27300

ggctgcgcgc cgatctgctc gccggggcgg ggcggtgagc ggcggggcag cgatcgccgc 27360

cggcgactcg gcgacggcga gcggggtgct cctcgccctc gccgtcgtcc tcgccagcgc 27420

gttcgtctgc ggccggatcg ccgcccgggt gcgccagccc gtcgtcatgg gggagatcgt 27480

cggcggggtg gccctcggcc ccagcctgct cgggctgctg ccggggcacc tggacgcctc 27540

actgttcccg gcggaggtcc agtcctacct gcgggtgctg tcccaactgg gcctggtgct 27600

cttcatgttc accgtcggcc tgcgcttcga cgtcggccac ctgcgcggcg ccgggcgccg 27660

ggtgacagcg gtgtcgctca gctcggtggc cctgccgttc gcgctcggcg tggggctcgc 27720

ggtgctgctc tacccctggt tcgacaaggc ccagttgagc accgacggga ggctcggccc 27780

ggccctgttc ctgggcgcgg cgatgtccat cacggccttt cccgtcctcg cccggatcat 27840

cgccgagcga cggatgcagc acgacccgct cggcagcctg tcattggcct gcgcggcctt 27900

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cctctggtcg ctgggacggc tggcgctcga cacggcggtg gtggtcctgg tgctggtcgg 28020

cgtcgtccgc ccgctcctgt cccggctgct cgcccccggc cggcgccgtc ccctcccccg 28080

gccgtggatc cacgcggtgc tcgtcaccgg caccctggtc accgcctggg tcacggccga 28140

gatcggcctg gacgcggtgt tcggggcgtt catgttcggt gcggcggtgc cccgggaccg 28200

gatcgaggcg atcgcgcccg acgtcccgga gcagatcgag cgggcgggtc tcctgctgct 28260

gccggccttc ttcgcggtga ccggcctcgc cgtcgacctc accggcctcg ggctgcgcgg 28320

cctggccgtc gtggcggcgg tgctggtggc ggcctgcgcc ggcaagttcg tcggtgcggt 28380

cgccgccgcc cgggccaccg gctcgagccg gcgcgaggcg cgggtgctcg gcatcctgct 28440

caacgcccgg ggcctgaccg agctggtcat cctcaacgtg ggccaccggc tcggggtgat 28500

cgacacccgg atgttcacgg ccatggtcgt gatggccctg gtcacgacgc tgatgacggg 28560

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tgaagcgcgg ttcgagcggt acgggagggg cgccgggcac ggcgaaggac agcccggcac 29040

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tcactggtac cggtaggtgg cggccaccgc gaggtggtcg ctgccgtccc ggggcagggt 29220

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gaacgccgcg ggccagctga agccgaagcc gtccccggcc gcgccctggg ccgagcgcat 29340

ctgcgaggtg accggtgcca ggctgcggtc gttcatggtg ccgttgaggt cgccgagcag 29400

caggaccttc ttcaccggct cggcctggat cgcgtcgccg agcgcctggg cgctgacgtc 29460

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tcagcctatg ccgggacaga cgcgcgcttc cgggaccggg ttccggcgtg gcccggtttg 30360

gtgagccagg ccacgccggg cacgaagcat gcgctccgac gcgctatggg ggttcggagg 30420

acccgtttct agcggggggc gacgccgtcg aggacggagt cgaccagttt gcgggacagc 30480

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agcaggtcgc cgagcagttc cacgtcgagg tcgtcgcgga tcacgccctc ggcgacggcc 30600

cgccggatca ggtgcagccc gacctcgcgg cgcggcctga tcacccgctc tcggtaggcg 30660

gtgtacagct cgggcagggt ctgcatctgc ccgagcgccg ccttgagcac ccagcgggtg 30720

cgcttggcga ggccgcggcg gcggatgtag tcgaccatcg cgatcaggtc ctcgcgggcg 30780

ccaccgccgg tgggggccgg gatcggctcc tccagccggc tgacgacgtc gaccagcagg 30840

gcctccttgt tgggccagcg ccggtagatg gtggccttgc cgacgccggc ggcggtggcg 30900

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agtcgactcg caggtcggtc gatccgcggg tcggacctcc gcgcgggtca ggcctccgcg 31260

gccgcggcct cccgggcccg gtcctgctgc tcgggggcac cggggccgcc cgggccggcg 31320

gccggggccg cggcgcggcg cggcagcagg aaccacgcga ccagcgcgcc gaccagcgag 31380

atgccgaccg agagcgcggc caccacgtgc atggcgtgga tgaaggcgtc gttcgccggg 31440

gcgatcagcg ccttgcccgc gccgttcggg agccggtcgg cgatggccag ggtggcctcc 31500

agcgactcgc ccgccttgtc gcgcagcccc tcgggcaggt gggtgagggt gtcggtcatc 31560

ccgtc 31565

<210> 3

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcacgcgg tcgatcttga cggctggcga gaggtgcggg gaggatctga ccgacgcggt 60

ccacacgtgg caccgcgatg ctgttgtggg cacaatcgtg ccggttggta ggatcc 116

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccttgacct tgatgaggcg gcgtgagcta caatcaatac tcgattag 48

<210> 5

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgttcacatt cgaacggtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt aaagtcgtgg 60

ccaggagaat acgacagcgt gcaggactgg gggagtt 97

<210> 6

<211> 1533

<212> DNA

<213> 金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)

<400> 6

atggcgaacg ccacctcgca gaccggcgag gccgtcgcgg acgacgccgg cggccccgcc 60

ggcttcactc accgccagat catcaccgcg ctgtccgggc tcctgttggc cgtgctgctc 120

gccgcactcg accagacgat cgtctccacc gcgctgcgta cgatcggcga ccaactgcac 180

ggccagaccg tccaggcctg ggtgatcacc ggctatctgg tcagctccac gatcgcgatg 240

ccgttctacg gcaagctgtc cgacatctac ggccgcaagc cgctctacct ggcggcgatc 300

gcggtcttca tcgtcggctc ggcggcctgc gcgatggcga actcgatgga gacgctggcg 360

atcgcccgcg tcctccaggg cttcggcggc gccgggctga tgtcgctgcc gacggccgtc 420

atcgccgacc tcgccccggt gcgcgagcgc gggcgctact tctcgtacct gatgatggcc 480

tgggtggcgg ccagtgtgct cggcccgctc gtcgggggcc tgttcgcggg cgccggcgag 540

atcctcgggg tgaccggctg gcgctgggcc ttcctgatca acgtgccgct cggtctggtg 600

gcgctggtca gcgtgcgcaa ggcgctcaac ctgccgcacc gcagggtgga ccacccgatc 660

gacttccggg gggcgctcac cctggcgctc tgcctggtgc cgctgctgat cgtggcggag 720

gagggcctcg actggggctg gggatcggcg cgttcgctga cgctcttcgc cgtctcgctg 780

atcggcctgg tgctgttcgt gctcgccgag cgggcccgcg ggctggaggc gatggtcccg 840

ctgcggctgt tccggcgcgg tggcatcacg atggccacgg ccgtcaactt caccatcggc 900

gtcggcatct tcggtacggt ctccaccctg ccgctgttcc tgcagctggt gcaggggcgc 960

agtgccaccg tcgccggact ggtgatcatc ccggtgatga ccggggcgat cgtctcccag 1020

acgatctgcg ccaagatcat caagaagtgg aaccgctaca agaagcccgc gatcgtgggc 1080

ctcggctcga tggccggagc attgctgtcg ctctccgccg cgggcgcgga caccccgctc 1140

gcggtgatcg tggtgatcgc ggcctggctg ggcttcggca tcgggctctc ccagaccgtc 1200

atcaccctgg cgatccagag ctcggcgccc aagtccgagc tgggcgtggc caacgccgcc 1260

tccggtctgt tccgccagct cggcggcacg agcggcgccg ccgtcttcat gtcggtgctg 1320

ttcggcgtcg ccgccggcag gctcgacggg gccgacccgg acgaggccgt gcgccgagcg 1380

ctctccgacc cggactccac cggcggcctg agcgcctcgg cggtcgacgc cttcacctcg 1440

ggcttcgaca cgatgttcct ggtcggcggc ctgatccttg cggtgggctt cctgctcacc 1500

ttcccgctgc gggaactgag cgacgaggag tga 1533

<210> 7

<211> 1983

<212> DNA

<213> 金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)

<400> 7

atgacaaccg tgaacatcgg aatcctggcc catgtcgacg ccggtaagac cagcctgacc 60

gagcggctgc tgcacaccgc cggcgtcatc gaccgggtcg gcagcgtcga ccgcggcgac 120

acccagaccg actcgcacga actcgagcgc cagcgcggca tcaccatccg gtccgcggtg 180

gtgtccttca ccgtgggcga cgtcaaggtc aacctcatcg acacccccgg ccacccggac 240

ttcatctccg aggtggaacg ggccctcggc gtgctcgacg gcgtggtgct ggtcatctcc 300

gccgtggagg gcgtgcaggc ccagacccgg ctgctgatgc gcacgctggt gaaactgcgc 360

atgccggtca tcctcttcgt caacaagatc gacaggatgg gcgcgcgcta ccacgagctc 420

ctggacgaga tccgctccga gctcaccccg gccgtcgtcg ccctgacccg ggtcgaaggg 480

ccgggcaccc ccggagcacg ggcgttcgcc cggaccgtcg ggaccgacga ccccgacttc 540

gccgccgaac tggccgacat cctggccgag cacggcgacg acttcctggc ccgctacctc 600

gaggacgaga cctccctgac cgcgcaggac tacagcgcgg aactcgcccg ccaggcggcc 660

cggggccagc tctacccggt gctcttcggc tcggccgtgg ccggcgtcgg catcgatgcc 720

ctggtcgacg ggatcaccag gctgtttccg gtcaatcacg gcggctccgg gggcaccctc 780

cgcggtaccg tgttcaagat cgagcgcggg tgggcgggcg agaaggtcgc ctacgtccgg 840

ttgcacgggg gcgagctcgg gtcgcgggag aaggtgtccg tgttccggcg cgaccagcac 900

ggagccgtca ccgagattcc cggccgcacc acggtggtcg aggtgttcga ccggggctcg 960

gccgtcgtcg agtcgcgggc ccgggccggg gacatcgcca aggtctgggg gctcaagggc 1020

atccggatcg gcgaccggct cggttcggcc gaggggctgg acggggagca cctgttcgcg 1080

ccgccgagcc tggagaccgt gatccgaccc tcccggccca gcgcgatgcc cgaactgtac 1140

gacgcgctgc tgcagttggc cgaccaggac ccgttcatca acgtccgcaa ggacgacgag 1200

gagcaggaga tcgccgtctc gctctacggt gaggtgcaga aggaggtcat cgcggccacc 1260

ctcgccgacg agttcaagct ggacgtggcc ttcgagggca cccggatcat ctgtgtcgag 1320

cgcccgatcg gggtcggcga gtcggtggag gagatcgact accggagcaa gaccttcttc 1380

tgggccacga tcggcctgcg ggtggaaccc ggggagccgg gatcaggggt cgtgttccgc 1440

cgctcggtgg agctcggctc gctgccgcac gccttccaca aggccgtcga ggaggccgtg 1500

cgggccaccc tgcagcaggg gctgaacggc tgggaggtgc tggacatcct ggtgaccctc 1560

acccgttccg ggttcgccag cccggtgagc gcggcgggcg acttccgcaa gctcacgccg 1620

ctcgtgctga tgaacgcgct caagcaggcg ggaacgcagg tgtacgaacc ggtcaaccgc 1680

ttcgagctgg aggtgccggg tgagaacgcc agcgccgccc tgctgagcct ggtggagtgc 1740

ggcgccaccc cggagagcac ccggggcctg ggcagcagct gcctggtgga ggggacgatc 1800

ccggcccgca cggtgcagga gttcgagcag cggctgccgg gcctgagcca gggccagggc 1860

gtgctggtca cccggttcca cagcttccag ccggtggtcg gggcggcgcc gaggcggcgg 1920

cggaccgacc tcaacccggt ggaccgctcg gagtacatgc tgcgggcctt cggccggatc 1980

tga 1983

<210> 8

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgaggttgc tgacgtagtc ccgcagcgcc cggccgcagg gcacgtcggc gaggggggtg 60

ccgcgccaca gggccagcgc ctcctcggcc caccggacgg cgccggcggc gtcgtgggcg 120

gcgtagcagg tctgggcccg gtcggccagg cgcgcgaagt ggtgggtgtc gagcgactcc 180

tcgggggtgt gcagcaggta gccgggcggc gcggtgacga tggcgcgctc ctgcgggtcc 240

acgcccagtt cctcgatgaa gtccttgcgc agctggtaga tgtaagtctg cgcggtggtg 300

accgcggtac gcggcagcgc gtcgccccac agttcgtcga ggatggactc caggctgacg 360

atctggttgg cccgcatcac gagcagggcg agcaccgata tcaagcgata actttaaata 420

attggcatta tttaaagtta gggtccggtg gtttcaggtg ccggcctgta cctggaggcg 480

gacctcaggc cgtggatacg ggctgtcctg ccgtgcgtac gggccggtgt tccgggagat 540

tccgaggatc agcatggatt tcgccttgtt cacggcatcg atccgggaaa ccgcgcccag 600

cttttcgaaa acattgctca aatggcgttt cacggtcgct tcggtgatgg tgagccgggc 660

ggcgatctgg ctgttgctca g 681

Claims

1.一种异源表达金霉素的方法，其特征在于，所述底盘菌株名称为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)SR0，该菌株保藏在CGMCC，保藏编号为CGMCCNO.17208，保藏日期为2019年01月17日，在所述链霉菌底盘菌株中整合金霉素合成基因簇载体pSET153-ctc，得到SRC0菌株，然后进一步整合ctcB基因表达载体pSOK616-PermE*-ctcB，所述的ctcB基因表达载体pSOK616-PermE*-ctcB，使用组成型启动子PermE*启动ctcB基因表达，得到金霉素生产菌株SRC1；进一步ctcB基因表达载体pSOK616-PermE*-ctcB的ctcB基因前启动子PermE*更换为组成型启动子PkasO*；使用组成型启动子PkasO*构建pSOK616-PkasO*-ctcB载体，然后通过接合转移方法，得到金霉素生产菌株SRC3；使用金霉素抗性基因ctcR和ctcC，构建融合表达载体pSOK616-PkasO*-ctcB-ctcR-ctcC-1，然后通过接合转移方法，构建SRC4菌株；所述ctcB基因序列如SEQ ID No.1所示，所述载体pSET153-ctc含有的金霉素合成基因簇(ctc)序列如SEQ ID No.2所示，所述PermE*启动子序列如SEQ ID No.3所示，所述的启动子PkasO*序列如SEQ ID No.5所示，所述ctcR基因序列如SEQ ID No.6所示，所述ctcC基因序列如SEQ ID No.7所示。

2.权利要求1所述一种异源表达金霉素的方法，其特征在于，所述的ctcB基因表达载体pSOK616-PermE*-ctcB构建方法为：以ctcB-s/ctcB-a为引物，以金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)基因组为模板，扩增ctcB基因，866bp；回收产物和质粒pSOK616-EotcR用NdeⅠ+SpeⅠ双酶切，6442bp；然后将两片段进行连接，构建pSOK616-PermE*-ctcB；

所述的引物序列为：

ctcB-s：ATACATATGGAGGGAAATCCGAGCGACATCGG

ctcB-a：ATTACTAGTGACGGGCCTCAGGCCGAACGG。

3.权利要求1所述一种异源表达金霉素的方法，其特征在于，所述pSOK616-PkasO*-ctcB载体的构建方法为：质粒pSOK616-PermE*-ctcB，采用HindⅢ和NdeⅠ双酶切，回收7172bp片段；以PkasO*-s/PkasO*-a为引物，pDR4-K*为模板，扩增PkasO*启动子序列，127bp；两片段Gibson组装构建；

所述的引物序列为：

PkasO*-s：CTCATGGAGGGCGCGAAGCTTTGTTCACATTCGAACGGTCTC

PkasO*-a：GCTCGGATTTCCCTCCATATGAACTCCCCCAGTCCTGCACG。

4.权利要求1所述一种异源表达金霉素的方法，其特征在于，所述融合表达载体pSOK616-ctcB-ctcR-ctcC-1的构建方法为：以ctcR-s1/ctcR-a为引物，pSET153-ctc为模板，扩增ctcR1片段(1664bp)，回收作为模板，以ctcR-s2和ctcR-a为引物，扩增ctcR2片段(1717bp)；以ctcC-s和ctcC-a1为引物，pSET153-ctc为模板进行PCR，扩增ctcC片段(2107bp)；片段ctcR2和ctcC为模板，ctcR-s和ctcC-a2为引物进行融合PCR，扩增ctcR-ctcC融合片段(3783bp)；pSOK616-PkasO*-ctcB用HindⅢ酶切(7276bp)，去磷酸化，回收；ctcR-ctcC融合片段用HindⅢ酶切，回收；两片段连接并转化E.coliDH5α；挑选得到pSOK616-ctcB-ctcR-ctcC-1载体；所述的引物序列为：

ctcR-s1：TGTTGTAAAGTCGTGGCCAGGAGAATACGACAGCGTGCAGGACTGGGGGAGTTAGACCTTGTCGAATCCG GTG

ctcR-a：TGTCATATGGGTCCTCCTGTGGAGTGGTTCTGTGGAGGTCGCGCGCTCACTCCTCGTCG

ctcR-s2：ATTAAGCTTTGTTCACATTCGAACGGTCTCTGCTTTGACAACATGCTGTGCGGTGTTGTAAAGTCGTGGCCA G

ctcC-s：CGACCTCCACAGAACCACTCCACAGGAGGACCCATATGACAACCGTGAACATCGGAATC

ctcC-a1：TACAAGCTTCGACTGAGGACGGAGTGCGCCACGGCTGAGG

ctcR-s：ATTAAGCTTTGTTCACATTCGAACGGTCTCTGctcC-a2：TACAAGCTTCGACTGAGGACGGAGTGCGC。