CN112195129B

CN112195129B - 紫色杆菌素生物合成基因簇及其应用

Info

Publication number: CN112195129B
Application number: CN202011139097.6A
Authority: CN
Inventors: 徐娴; 储晓婷; 刘洁; 江凌; 唐苏苏; 张志东
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN112195129A

Abstract

本发明公开了一种新的菌株Janthinbacterium sp.B9‑8，并公开了来源于该菌株的紫色杆菌素生物合成相关的基因簇，所述基因序列包括五个紫色杆菌素生物合成途径基因vioA、vioB、vioC、vioD和vioE和一个SD序列，其中vioE在5’端连接一个SD序列。本发明还公开了一种工程菌，其通过将Janthinbacterium sp.B9‑8中紫色杆菌素合成途径中的基因簇构建质粒导入宿主大肠杆菌中得到的。本发明构建的工程菌可用来生产紫色杆菌素，制备紫色杆菌素。本发明发酵使用培养基成分简单，成本低廉，操作简单，产率高，最终紫色杆菌素产量达到0.13g/L，可用于工业化生产。

Description

紫色杆菌素生物合成基因簇及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术，具体涉及一种生产紫色杆菌素的工程菌构建及其应用方法。

背景技术

紫色杆菌素(violacein)是由细菌合成的一种非水溶性次级代谢产物，属于吲哚衍生物，是以色氨酸分子为前体物质氧化缩合而成。近年研究发现，紫色杆菌素不仅可用做染色剂，其还具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等多种重要生物活性，在食品、医疗和印染工业等方面有着广阔的应用前景。紫色杆菌素生物合成途径首先由Pemberton等人研究，并由Balibar和桑切斯等人完全阐明。紫色杆菌素是由两个色氨酸分子通过由一个基因簇编码的五种蛋白质氧化缩合而成，这五个蛋白质的编码基因(vioA，vioB，vioC，vioD，vioE)是在同一方向上进行转录，生物合成总共涉及六个步骤：五个酶促反应和一个非酶促氧化脱羧步骤。

目前，已有多种微生物被证实具有紫色杆菌素合成能力，包括Chromobacteriumviolaceum、Janthinobacterium lividum、Dunganella sp.、Massilia sp.和Pseudoalteromonas luteoviolacea等，它们在系统发育上是多种多样的，从海洋，冰川，河流和土壤等不同环境中筛选获得，具有独特的生存能力。已有多种紫色杆菌素生产菌株如C.violaceum、J.lividum、Pseudoalteromonas tunicata、P.luteoviolacea、Massiliasp.WG5等菌株的全基因组被测序并已在NCBI数据库中收录，不同来源的原始菌株的紫色杆菌素基因簇序列从基因组成、大小上分别存在一定程度的差异。

发明内容

发明目的：根据上述现有技术，本发明提供了一种紫色杆菌素生物合成基因簇及其应用。

技术方案：本发明提供了一种新的菌株Janthinbacterium sp.B9-8，保藏编号为CCTCC NO：M2020183。

本发明所述的紫色杆菌素生物合成基因簇，选自如下1)或2)：

1)包括五个紫色杆菌素生物合成途径基因vioA、vioB、vioC、vioD和vioE和一个核糖体结合位点SD序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，SD序列为5’-taatataagaaggagatata-3’；

2)与1)的基因簇具有80％以上同源性，且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC、VioD和VioE五种酶的基因簇。

所述紫色杆菌素生物合成基因簇来源于Janthinbacterium sp.B9-8，保藏编号为CCTCC NO：M2020183。

该菌株Janthinbacterium sp.B9-8从新疆罗布泊地区筛选获得，该菌株生长较快，在25℃下经24h能达到一个较高的生物量和紫色杆菌素产量。该菌株生产的紫色杆菌素具有广谱抗菌活性、抗肿瘤活性、抗氧化、抗病毒等强生物活性，具有较好的水溶性和有机溶性。对菌株基因组进行了全测序，并鉴定获得了紫色杆菌素的合成基因簇vioABCDE，其16S rDNA序列与标准模式菌Janthinobacterium lividum DSM 1522T(Y08846)和Janthinbacterium agaricidamnosum W1r3T(Y08845)同源性最高，相似性分别为98.6％和98.1％。Janthinobacterium sp.B9-8中紫色杆菌素合成的基因簇与其他不同来源菌株的紫色杆菌素基因簇相似性不高(64-78％)，尤其是与已知产紫色杆菌素的常用菌株C.violaceum和J.lividum相比，基因比对的覆盖率仅在14-17％。

表1：产紫色杆菌素菌株与Janthinobacterium sp.B9-8中的vio基因簇DNA序列对比

进一步的，所述基因vioA、vioB、vioC、vioD和vioE编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC、VioD和VioE五种蛋白质，所述蛋白的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：1-5所示。

具体的，所述VioA蛋白具体可如附件的序列1所示。所述VioB蛋白具体可如附件的序列2所示。所述VioC蛋白具体可如附件的序列3所示。所述VioD蛋白具体可如附件的序列4所示。所述VioE蛋白具体可如附件的序列5所示。

所述参与紫色杆菌素途径的各个蛋白的编码基因具体可如附件的序列6所示。其中，所述VioA蛋白的编码基因具体可如序列表的序列6自5’末端第1-1287位核苷酸所示。所述VioB蛋白的编码基因具体可如序列表的序列6自5’末端第1345-4368位核苷酸所示。所述VioC蛋白的编码基因具体可如序列表的序列6自5’末端第4372-5661位核苷酸所示。所述VioD蛋白的编码基因具体可如序列表的序列6自5’末端第5661-6791位核苷酸所示。所述VioE蛋白的编码基因具体可如序列表的序列6自5’末端第6793-7374位核苷酸所示。

本发明还公开了一种含有上述基因簇的重组表达载体。所述重组表达载体为在表达载体pET Duet-1和pRSF Duet-1的多克隆位点插入所述基因簇得到的重组表达载体。

本发明还公开了一种重组菌，将所述基因簇或所述重组表达载体导入宿主细胞获得。所述宿主细胞为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21(DE3)。

含有上述基因簇的表达盒或转基因细胞系也在本发明的保护范围内。

本发明还公开了所述基因簇、所述重组表达载体或重组菌在生产紫色杆菌素中的应用。

本发明还公开了一种生产紫色杆菌素的方法，包括以下步骤：

(1)将所述基因簇或所述重组表达载体导入宿主细胞大肠杆菌获得重组菌；

(2)步骤(1)所得重组菌发酵培养得到紫色杆菌素。

其中，步骤(2)中，所述发酵培养培养基包括：蛋白胨3-10g/L、酵母粉1-10g/L、葡萄糖0.5-10g/L、硫酸铵0-5g/L，氨苄青霉素0-100mg/mL和卡那霉素0-100mg/mL。其中，所述50mL液体发酵培养基添加50μL卡那霉素和50μL氨苄青霉素溶液。

优选的，所述培养基包括蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、葡萄糖1g/L、硫酸铵1g/L，氨苄青霉素100mg/mL和卡那霉素50mg/mL，pH为4。在37℃培养细胞浓度为OD600至0.8-1.0时，转为15℃发酵培养0-120h。

进一步优选的，步骤(2)中，发酵体系培养温度为15-25℃，先加入诱导剂乳糖，培养10h后加入L-色氨酸，再培养30-98h。

进一步的，所述L-色氨酸浓度为1-2mg/mL，所述乳糖浓度为40-50mg/mL，优选40mg/mL。

在所述发酵培养后，包括如下提取的步骤：将所述发酵体系离心，收集菌体；将所述菌体与无水乙醇混合，破碎菌体，离心，收集上清液，即为紫色杆菌素的提取液。上述过程中，在所述提取后，包括将所述紫色杆菌素的提取液进行高效液相色谱分离的步骤；所述高效液相色谱分离中，所用的色谱柱为Venusil XBP C18液相色谱柱，流动相为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为4∶6；流速为1.0mL/min；柱温为40℃，根据检测紫色杆菌素标准品，紫色杆菌素的保留时间为4.498min。

有益效果：本发明将合成紫色杆菌素能力较强的Janthinbacterium sp.B9-8中的紫色杆菌素合成基因簇导入大肠杆菌菌株中，使紫色杆菌素合成相关基因簇实现异源表达，构建了能高效合成紫色杆菌素的重组菌。本发明的制备紫色杆菌素的方法简单，发酵生产所使用的培养基成分简单、价格低廉。本发明方法操作简单，产率高，其产量可达到0.13g/L。因此，本发明所构建的重组菌及紫色杆菌素的生产方法具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为双酶切重组质粒琼脂糖凝胶电泳结果；

图2为重组质粒pET-AB和重组质粒pRSF-CDE、pRSF-CDE-SD的构建；

图3为紫色杆菌素拟合标准曲线；

图4为重组菌株所产紫色杆菌素提取物；

图5为诱导温度对紫色杆菌素合成的影响结果；

图6为诱导pH对紫色杆菌素合成的影响结果；

图7为不同浓度的乳糖对紫色杆菌素合成的影响结果；

图8为乳糖加入时间对紫色杆菌素合成的影响结果；

图9为L-色氨酸对紫色杆菌素合成的影响结果；

图10为摇瓶发酵试验的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请做出详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、重组菌的构建

1)制备重组菌

Janthinbacterium sp.B9-8由实验室前期筛选获得，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学，保藏日期是2020年6月8日，保藏号是CCTCC No:M 2020183。大肠杆菌BL21(DE3)购买自南京诺唯赞生物科技有限公司。pET-Duet和pRSF-Duet质粒购自Novagen公司。

将Janthinbacterium sp.B9-8转接入1/3TGY培养基(0.1％酵母粉、0.167％蛋白胨、0.06％葡萄糖)，28℃，200rpm培养36小时，按细菌基因组试剂盒提取Janthinbacteriumsp.B9-8基因组DNA。

根据Janthinbacterium sp.B9-8已测序获得的全基因组测序和注释结果，使用软件Vector NTI 9.0设计引物，扩增引物vioA-F、vioA-R、vioB-F和vioB-R、vioC-F、vioC-R、vioD-F、vioD-R、vioE-F、vioE-R、vioE-SD-F、vioE-SD-R的核苷酸序列见表1，以Janthinbacterium sp.B9-8基因组DNA为模板，扩增vioA和vioB基因构建至pET Duet-1载体上，扩增vioC，vioD，vioE以及vioE-SD基因构建至pRSF-Duet载体上。

利用高保真DNA聚合酶PCR扩增vio片段，PCR产物经PCR纯化试剂盒回收。利用限制性内切酶BglII和KpnI双酶切vioA片段和pET-Duet，片段纯化后进行连接，形成pET Duet-vioA，再用NcoI和HindIII双酶切vio-B片段和pET Duet-vioA，片段纯化后连接形成pETDuet-AB；利用NdeI和KpnI双酶切vio-C片段和pRSF-Duet，片段纯化后进行连接，形成pRSFDuet-vioC，再用NcoI和EcoRI双酶切vio-D片段和pRSF Duet-vioC，片段纯化后连接形成pRSF Duet-CD，之后利用KpnI和XhoI双酶切vio-E/vio-E-SD片段，片段纯化后连接形成pRSF Duet-CDE/pRSF Duet-CDE-SD，双酶切琼脂糖凝胶电泳结果如图1，其中，Lane 1:10000 DNA Marker；Lane 2:pET-AB质粒；Lane 3:BglII、KpnI酶切pET-AB质粒(vioA，1287bp)；Lane 4:NcoI、HindIII酶切pET-AB质粒(vioB，3024bp)；Lane 5:5000 DNAMarker；Lane 6:pRSF-CDE质粒；Lane 7:NdeI、KpnI酶切pRSF-CDE质粒(vioC，1290bp)；Lane8:NcoI、EcoRI酶切pRSF-CDE质粒(vioD，1131bp)；Lane 9:KpnI、XhoI酶切pRSF-CDE质粒(vioE，582bp)；Lane 10:NdeI、KpnI酶切pRSF-CDE-SD质粒(vioC，1290bp)；Lane 11:NcoI、EcoRI酶切pRSF-CDE-SD质粒(vioD，1131bp)；Lane 12:KpnI、XhoI酶切pRSF-CDE-SD质粒(vioE-SD，600bp)；Lane 13:pRSF-CDE-SD质粒；Lane 14:5000DNA Marker。双酶切后的片段用胶回收试剂盒回收。

表1紫色杆菌素基因扩增引物序列

将连接产物用热激法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，转化产物涂于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上，挑取转化子培养后采用质粒提取试剂盒提取质粒，筛选含插入片段的阳性克隆，经测序验证，结果插入的基因序列如序列表1-5中序列，表明插入的基因序列及方向均正确。

将重组表达载体pET Duet-AB、pRSF Duet-CDE、pRSF Duet-CDE-SD(构建过程见图2)通过酶切及测序验证后，将pET Duet-AB转化大肠杆菌BL21(DE3)中，然后将pRSF Duet-CDE、pRSF Duet-CDE-SD分别转化到含pET Duet-AB的重组菌中构建基因工程菌VioABCDE和VioABCDE-SD。转化产物涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上，挑取转化子单克隆。接种于含氨苄青霉素(100mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)的LB液体培养基中培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒，分别利用表1中引物对质粒进行PCR扩增和酶切的方法进行筛选验证，再进行测序验证。

将含有重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，记作VioABCDE和VioABCDE-SD。

含氨苄青霉素(100mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)的LB液体培养基的组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。

含氨苄青霉素(100mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)的LB平板的组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L。

实施例2、制备紫色杆菌素

一、发酵菌

种子培养基：为含氨苄青霉素和卡那霉素抗生素的LB液体培养基，组成为胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素(100mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)。

发酵培养基：为含氨苄青霉素和卡那霉素抗生素的TGY液体培养基，由胰蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖1g/L、硫酸铵1g/L，氨苄青霉素(100mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)组成。

种子培养：将VioABCDE和VioABCDE-SD单菌落接种至50mL种子培养基，37℃，200rpm振荡培养12h，得到种子培养液。

发酵培养：按4％的接种量，将种子培养液接种至发酵培养基中，37℃培养菌株OD600至0.8-1.0时，转为15℃培养90-108h，收集容器内的所有物质，将容器内的所有物质记作发酵物。

二、提取

取2mL步骤一得到的发酵物，12000rpm离心1min并收集菌体，菌体中加入无水乙醇1mL，用漩涡混合器将其混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡2h，随后将发酵物在12000rpm离心1min，收集上清液，即为紫色杆菌素的粗提液。

取上述得到的粗提液，用分光光度计测575nm处吸光值。用紫色杆菌素标准品制作标准曲线如图3，标准曲线方程为Y＝0.0292*X+0.0005，R²＝0.9996，Y代表紫色杆菌素的浓度(g/L)，X代表575nm处吸光值。

重组菌VioABCDE和VioABCDE-SD经发酵提取得到的粗提液通过旋转蒸发至干燥，得到固形物质如图4。

三、高效液相色谱分离纯化

将步骤二中获得的固形物质溶于乙醇中，进行高效液相色谱分析。

所用色谱仪为Agilent 1100型液相色谱仪；色谱柱为Venusil XBP C18液相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，孔径5μm；柱温40℃；进样量20μL；

流动相的组成为：乙腈和水的体积比为4∶6；流速为1.0mL/min；检测波长575nm；

在如上色谱条件下，紫色杆菌素标准品的出峰保留时间为4.498min。

四、紫色杆菌素产量检测

紫色杆菌素含量是通过测定其乙醇溶液在最大吸收波长575nm的吸光度值，根据标准曲线来计算，以无水乙醇作空白对照。

标准曲线：将紫色杆菌素标准品用乙醇配制成不同浓度的溶液，在575nm下检测溶液的吸光度值；以吸光度值对应紫色杆菌素浓度作标准曲线。

色素浓度标准曲线得到相对应的色素浓度值，实验重复3次，实验结果以三次实验的平均值表示。

实施例3、表达紫色杆菌素合成相关基因簇的重组菌高效生产紫色杆菌素

1)诱导温度对紫色杆菌素合成的影响

将工程菌VioABCDE和VioABCDE-SD分别接种至含相应的抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养过夜。次日按4％的接种量，接种至新鲜含相应的抗生素的发酵培养基中，37℃继续培养2-3h至OD600为0.8-1.0时，分别在15℃、20℃、25℃、30℃和37℃诱导培养48h后，离心收集菌体，提取紫色杆菌素，定量分析诱导温度对紫色杆菌素合成的影响，如图5所示。

2)诱导pH对紫色杆菌素合成的影响

将工程菌VioABCDE和VioABCDE-SD接种至含相应的抗生素的具有不同pH值(pH4、pH5、pH6、pH7和pH8)的发酵培养基中37℃培养2-3h至OD600为0.8-1.0时，在20℃诱导培养48h后，离心收集菌体，提取紫色杆菌素，定量分析诱导pH对紫色杆菌素合成的影响，如图6所示。

3)正交试验确定最佳培养条件

以诱导温度、诱导pH、诱导时间3个因素为试验因素，以紫色杆菌素产量为指标，对VioABCDE和VioABCDE-SD合成紫色杆菌素的能力进行3因子3水平的正交试验，VioABCDE和VioABCDE-SD合成紫色杆菌素能力的结果见表2和表3。

表2菌株VioABCDE关于诱导温度、诱导pH和诱导时间的正交实验直观分析表

注：因素1：温度，1234分别表示15℃、20℃、25℃、30℃

因素2：诱导pH，1234分别表示pH7、pH6、pH5、pH4

因素3：诱导时间，1234分别表示48h、96h、120h、108h

表3 VioABCDE-SD关于诱导温度、诱导pH和诱导时间的正交实验直观分析表

注：因素1：温度，1234分别表示15℃、20℃、25℃、30℃

因素2：诱导pH，1234分别表示pH7、pH6、pH5、pH4

因素3：诱导时间，1234分别表示48h、96h、120h、108h

分析得到最佳实验方案：培养基在pH4条件下，诱导温度为15℃，培养108h后紫色杆菌素得到最大产量。

将工程菌VioABCDE和VioABCDE-SD接种至含相应的抗生素的pH为4的发酵培养基中37℃培养2-3h至OD600为0.8-1.0时，在15℃诱导，离心收集菌体，提取紫色杆菌素，实验结果表明，菌株在pH4的TGY培养基中培养，诱导温度为15℃，诱导时间为108h，VioABCDE和VioABCDE-SD合成紫色杆菌素的含量最高，其中VioABCDE-SD的产量高于VioABCDE。

4)诱导剂乳糖对紫色杆菌素合成的影响

将工程菌VioABCDE和VioABCDE-SD分别接种至含相应的抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养过夜。次日按4％的接种量，接种至新鲜含相应的抗生素的发酵培养基中，37℃继续培养2-3h至OD600为0.8-1.0时，加入不同浓度(10-100mg/mL)的诱导剂乳糖，对VioABCDE-SD合成紫色杆菌素的影响如图7所示，表明加入40mg/mL乳糖时VioABCDE-SD产生最大浓度的紫色杆菌素。

将工程菌VioABCDE和VioABCDE-SD分别接种至含相应的抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养过夜。次日按4％的接种量，接种至新鲜含相应的抗生素的发酵培养基中，37℃继续培养，在接种后2、4、6、8、10、12、14h分别加入40mg/mL乳糖进行诱导，培养OD600至0.8-1.0时，将温度转为15℃继续培养108h，如图8所示，诱导2h时加入终浓度为40mg/mL的乳糖溶液时紫色杆菌素产量达到最高。

5)L-色氨酸对紫色杆菌素合成的影响

将工程菌VioABCDE和VioABCDE-SD分别接种至含相应的抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养过夜。次日按4％的接种量，接种至新鲜含相应的抗生素的发酵培养基中，37℃继续培养，在接种后2h加入40mg/mL乳糖进行诱导，培养OD600至0.8-1.0时，将温度转为15℃继续培养10h时，加入L-色氨酸使其在培养基中达到不同终浓度，继续15℃培养98h。如图9所示，加入L-色氨酸终浓度为2mg/mL时紫色杆菌素产量最高。

实施例4、摇瓶发酵实验

将实施例1制备的工程菌进行摇瓶发酵实验

摇瓶发酵实验以初始基础培养基为对照。

1)初始发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：胰蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖1g/L，硫酸铵1g/L，氨苄青霉素(100mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)，pH为7。

①将重组菌单克隆接种至250mL摇瓶(每瓶装有50mL的LB培养基)，37℃、200rpm震荡培养12小时。

②取步骤①得到的菌液，按4％的接种量接种至新的250mL摇瓶(每瓶装有50mL的发酵培养基)，37℃、200rpm震荡培养2h至OD600为0.8-1.0。

③完成步骤②后，将菌液在20℃、200rpm培养至48h。

2)优化后的发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：蛋白胨5.0g/L，酵母粉3.0g/L，葡萄糖1.0g/L，硫酸铵1g/L，氨苄青霉素(100mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)，pH为4。

②取步骤①得到的菌液，按4％的接种量接种至新的250mL摇瓶(每瓶装有50mL的TGY培养基)，37℃、200rpm震荡培养2h至OD600为0.8-1.0。

③完成步骤②后，加入终浓度为40mg/mL的诱导剂乳糖，15℃、200rpm震荡培养10h后加入终浓度为2mg/mL的L-色氨酸，之后继续培养98h。

④完成步骤③后，将整个发酵体系混匀取样，每个发酵体系取样3mL，分为两份，一份2mL，另一份1mL。

⑤取步骤④得到的2mL样本，12000rpm离心1min并收集沉淀，将沉淀加入1mL无水乙醇，用涡旋振荡器混匀后于超声清洗仪中提取2h，12000rpm离心1min并收集上清液，用分光光度计测575nm处吸光值，根据575nm处吸光值和标准曲线方程，计算步骤③得到的发酵体系中紫色杆菌浓度。

⑥取步骤④得到的1mL样本，12000rpm离心1min并收集沉淀，将沉淀加入1mL生理盐水，震荡混匀，用分光光度计测600nm处吸光值。

摇瓶发酵结果见图10，优化之后的发酵体系，每升发酵液中含有紫色杆菌素0.13g，比优化之前提高了7.5倍。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 紫色杆菌素生物合成基因簇及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 428

<212> PRT

<213> Janthinbacterium sp. B9-8

<400> 1

Val Ile Asn Asn Lys Val Ile Ser Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Leu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Leu Thr Lys Asp Tyr

20 25 30

Thr Leu Arg Val Phe Glu Asn Gly Glu Arg Ile Gly Gly Arg Ala His

35 40 45

Ser Ile Lys Val Asp Asp Phe Ser Ile Asp Leu Gly Ala Gly Arg Phe

50 55 60

Ser Pro Ala Leu His Pro Asn Val Ala Gln Leu Leu Ser Glu Leu Lys

65 70 75 80

Glu Glu Ile Glu Val Phe Pro Phe Thr Lys Ile Val Cys Pro His Pro

85 90 95

Gln His Glu Gly Leu Lys Glu Ile Leu Ala Gln Leu Lys Leu Lys Ile

100 105 110

Glu Asn Ser His Asn Glu Ser Phe Phe Gln Phe Leu Cys Gln His Met

115 120 125

Gly Asn Glu Lys Ser His Ala Ile Ile Asn Ala Leu Gly Tyr Asp Ser

130 135 140

Leu Tyr Leu Pro Gln Ile Ser Pro Lys Ile Ala Tyr Asp Ile Ile Glu

145 150 155 160

Lys His Pro Glu Ile Gln Cys Phe Ser Glu Asn Glu Gly Tyr Glu Trp

165 170 175

Phe Asn Leu Val Asp Gly Phe Ala Ala Leu Ala Lys Ser Leu Tyr Gln

180 185 190

Gln Ala Ala Lys Ser Gly Val Glu Phe Tyr Phe Glu His Gln Leu Ile

195 200 205

Asn Phe Gln Thr Lys Ser Ala Asn Thr Leu Leu Glu Phe Ala Gly Ser

210 215 220

Glu Gln Gln Glu Ile Trp His Asn Ser Ala Tyr Thr Val Leu Ala Leu

225 230 235 240

Pro Pro Thr Ala Met Ser Ser Leu Asn Ile Asp Phe Pro Asn Ser Trp

245 250 255

Ser Asp Phe Ser Tyr Gly Ser Ile Pro Leu Phe Lys Gly Phe Ile Phe

260 265 270

Phe Asp His Pro Trp Trp Lys Asp Tyr Glu Leu Glu Asn Lys Val Thr

275 280 285

Ile Val Asp Asn Pro Leu Arg Lys Ile Tyr Phe Lys Ser Glu Lys Tyr

290 295 300

Ile Phe Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Tyr Ala Asp Phe Trp Leu Glu Glu

305 310 315 320

Thr Asn Lys Ser Glu Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Val Met Gly Leu Ile

325 330 335

Ala Lys Ala Leu Asn Ile Ser Ile Lys Glu Leu Pro Arg Pro Val Ser

340 345 350

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gtgataaaca acaaagtaat ctctatagta ggtgcaggaa tatcagggct aagctgtgca 60

ttgaaactgg ctggctcaaa attaacaaaa gactacacgc ttcgtgtttt tgaaaacgga 120

gagagaattg gtggccgggc tcattcaatt aaagtggatg attttagtat tgatttagga 180

gcagggcgtt tttctcctgc cctacatcct aatgttgccc agttgcttag tgagctaaaa 240

gaggaaatag aagtatttcc ttttactaaa attgtctgtc ctcacccaca gcatgaaggc 300

ttgaaagaga tactggctca attaaagcta aaaattgaga atagccataa tgaatcattc 360

tttcaatttt tatgccagca tatgggcaat gaaaaatcgc acgcaatcat taatgcttta 420

ggctacgatt cattatatct tccgcaaatc tctcctaaga ttgcatatga tattattgaa 480

aagcatccgg aaatacagtg cttctcagaa aatgaaggct atgagtggtt taatttagtt 540

gacgggtttg ctgctttggc taaaagtcta tatcagcaag ccgctaaatc gggtgtcgag 600

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tttgcaggat cagaacagca agaaatttgg cacaatagtg cttataccgt tttagctctt 720

cctccaacag cgatgtcatc gcttaatata gattttccaa atagctggag tgatttttcc 780

tacggttcta tcccattatt taaaggtttt atatttttcg atcatccatg gtggaaagat 840

tatgagcttg aaaataaagt aaccattgtt gataacccat tacgaaaaat atattttaaa 900

agcgaaaaat atatattctt ttacactgat agcgcctatg ctgatttttg gttggaagaa 960

accaataaaa gcgaagatga atatataaat acagtgatgg gtttaattgc taaagcatta 1020

aatatatcta ttaaagaatt accacgccct gtaagcaata agttcaaata ctggcctagt 1080

ggtgtagagt ttgctttaga aacatcacca gatcaccctc ctgttttatc taaatataat 1140

ggcaaagtga ttgctacttc agatgcttat accccgcact gtggctggat ggaaggtggg 1200

attattgcgg gtaggaacgc agcagatcat atcttaaaac aattagagaa atcagatgta 1260

gaaaaagtag cggcagaaat gaattaattt ttgtttgaaa atgtaatggt tttttttcta 1320

attttaaact ggtattgatg cttaatgagt attctgaatt ttccacgtat tcactttaaa 1380

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gcaacaaaca gtgtttatca agatggcaca ttatttgatt taaaaaagca ccctagggag 1500

tttcatcagt atctaaggca attgccacca agatttaatc ttcaggggca gccagatgat 1560

gcaggtgttt ttaatcatgc ggcagggcat aactttttag ggaataatca tttttcttgg 1620

gaaaatactc agattaccgc tttgcaaata cagccgggtg ttttgctgga taacgatccg 1680

ctacttgctt gtaaagtgga attatggggg cactataatg agtatttgcg caccacattt 1740

aaccgggcaa gatgggtaga tattgatcca agccgggacg atacttcgca aatctatgcc 1800

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gattctgagc attttatttt taatcagctt tcgcttaaat cagattttat tgagtattta 2040

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ttgtggttaa agcaagatat ggctactttt gccaatgata ggattttata tcctgataat 2220

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attaccacta aagataatga cgggcagatt gccgagcata aagcggattt attgattggt 4860

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gaagacgctt atatccttaa tttattattt gaaaaacatg aagataatat tgaaaaagta 5400

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tgagccatac aaaagcttat gaagataatt tggtgctatt gggcgatgcc ttgcaaacag 6480

gccatttttc tatcgggcat ggcacaacaa tggcggtggt tgcggctcag atgttggtaa 6540

aagcattata tgagcatgca gaagtgaacc atgctttaga agattttaat caaaaggtga 6600

tgccgctgat gcaattattt agcgggcatg ccggcattag ccgcacttgg tttgaaacgg 6660

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aatcaattgc tgcgcatggt gacgggagac cctgcggtgc atgcttcaat tcgtgatttt 7320

cctaatttca ctactcatac gattccggcc gaaatatttt caagcagtat ttaa 7374

Claims

1.一种生产紫色杆菌素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以Janthinbacterium sp. B9-8基因组DNA为模板，扩增vioA和vioB基因构建至pETDuet-1载体上，扩增vioC，vioD，vioE以及vioE-SD基因构建至pRSF-Duet载体上，利用高保真DNA聚合酶PCR扩增vio片段，PCR产物经PCR纯化试剂盒回收，利用限制性内切酶BglII和KpnI双酶切vioA片段和pET-Duet，片段纯化后进行连接，形成pET Duet-vioA，再用NcoI和HindIII双酶切vio-B片段和pET Duet-vioA，片段纯化后连接形成pET Duet-AB；利用NdeI和KpnI双酶切vio-C片段和pRSF-Duet，片段纯化后进行连接，形成pRSF Duet-vioC，再用NcoI和EcoRI双酶切vio-D片段和pRSF Duet-vioC，片段纯化后连接形成pRSF Duet-CD，之后利用KpnI和XhoI双酶切vio-E/vio-E-SD片段，片段纯化后连接形成pRSF Duet-CDE/pRSF Duet-CDE-SD，将pET Duet-AB转化大肠杆菌BL21(DE3)中，然后将pRSF Duet-CDE、pRSF Duet-CDE-SD分别转化到含pET Duet-AB 的重组菌中构建基因工程菌VioABCDE和VioABCDE-SD导入宿主细胞大肠杆菌获得重组菌；所述菌株Janthinbacterium sp. B9-8的保藏编号为CCTCC NO：M2020183；所述SD序列为5’-taatataagaaggagatata-3’；

（2）步骤（1）所得重组菌发酵培养得到紫色杆菌素，发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：蛋白胨5.0g/L，酵母粉3.0g/L，葡萄糖1.0g/L，硫酸铵1g/L，氨苄青霉素 100mg/mL和卡那霉素50mg/mL，pH为4；

具体发酵包括如下步骤：

①将重组菌单克隆接种至250mL摇瓶，每瓶装有50mL的LB培养基，37℃、200rpm震荡培养12小时；

②取步骤①得到的菌液，按4-10%的接种量接种至新的250mL摇瓶，每瓶装有50mL的TGY培养基，37℃、200rpm震荡培养2h至OD600为0.8-1.0；

③完成步骤②后，加入终浓度为40mg/mL的诱导剂乳糖，15℃、200rpm震荡培养10h后加入终浓度为2 mg/mL的L-色氨酸，之后继续培养98h；

④完成步骤③后，将整个发酵体系混匀取样，每个发酵体系取样3mL，分为两份，一份2mL，另一份1mL；

⑤取步骤④得到的2mL样本，12000 rpm离心1min并收集沉淀，将沉淀加入1mL无水乙醇，用涡旋振荡器混匀后于超声清洗仪中提取2h，12000 rpm离心1 min 并收集上清液，用分光光度计测575nm处吸光值，根据575nm 处吸光值和标准曲线方程，计算步骤③得到的发酵体系中紫色杆菌浓度；

⑥取步骤④得到的1mL样本，12000 rpm离心1 min并收集沉淀，将沉淀加入1mL生理盐水，震荡混匀，用分光光度计测600nm处吸光值。