发明内容
本发明提供了一种重组菌,所述的重组菌包含外源基因。
所述的外源基因包含vioA、vioB、viC、vioD或vioE中的一种或两种以上的组合。优选包含vioA、vioB、vioC、vioD和vioE的组合。
vioA、vioB、vioC、vioD或vioE分别独立的来源于色杆菌属(Chromobacterium)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、Collomonas或杜擀氏菌属(Duganella)。
其中,色杆菌属(Chromobacterium)包括但不限于紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)、蓝黑紫色杆菌(Janthinobacterium lividum)或Chromobacteriumfluviatile。假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)包括但不限于藤黄紫假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas luteoviolacea)。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的vioA的氨基酸序列可见WP_011136821,或者其核苷酸序列包含SEQ ID No.34或与SEQ ID No.34具有80%同源性且具有合成紫色杆菌素的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的vioB的氨基酸序列可见WP_011136820,或者其核苷酸序列包含SEQ ID No.35或与SEQ ID No.35具有80%同源性且具有合成紫色杆菌素的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的vioC的氨基酸序列可见WP_011136819,或者其核苷酸序列包含SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36具有80%同源性且具有合成紫色杆菌素的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的vioD的氨基酸序列可见WP_011136818,或者其核苷酸序列包含SEQ ID No.37或与SEQ ID No.37具有80%同源性且具有合成紫色杆菌素的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的vioE的氨基酸序列可见WP_011136817,或者其核苷酸序列包含SEQ ID No.38或与SEQ ID No.38具有80%同源性且具有合成紫色杆菌素的功能。
优选的,所述的重组菌中弱化表达预苯酸脱水酶(PheA)、预苯酸脱氢酶(TyrA)或分支酸裂解酶(UbiC)中的一种或两种以上的组合。
所述的弱化表达可以为基因沉默或敲除。所述的沉默可以采用干扰RNA技术,所述的敲除可以为完全基因敲除或条件型基因敲除,例如采用同源重组、组织特异性敲除或CRISPR技术等。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的重组菌中沉默或敲除预苯酸脱水酶编码基因(pheA)、预苯酸脱氢酶编码基因(tyrA)或分支酸裂解酶(ubiC)中的一种或两种以上的组合。
优选的,将重组菌中的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶和/或邻氨基苯甲酸合酶进行突变,以降低底物的负反馈作用。所述的底物可以为色氨酸。
其中,3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶编码基因为aroG;邻氨基苯甲酸合酶编码基因为trpE。
在本发明的一个具体实施方式中,可以为将突变后的aroG和/或trpE导入重组菌中。其中,所述的突变后的aroG的核苷酸序列包含SEQ ID No.39或与SEQ ID No.39具有80%同源性且具有很少甚至没有底物的负反馈作用,所述的突变后的trpE的核苷酸序列包含SEQ ID No.40或与SEQ ID No.40具有80%同源性且具有很少甚至没有底物的负反馈作用。
其中,所述的导入重组菌可以为导入重组菌的染色体基因组上,或者游离在重组菌。导入重组菌的染色体基因组上包括直接替换或插入到重组菌内源的aroG和/或trpE基因处,或者插入到非功能基因位置。
优选的,所述的外源基因还可以包括突变的aroG和/或trpE基因。
优选的,所述重组菌中过表达转酮酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和/或磷酸烯醇式丙酮酸合成酶。
所述的过表达可以采用向重组菌中导入转酮酶编码基因(tktA)、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶编码基因(pck)和/或磷酸烯醇式丙酮酸合成酶编码基因(ppsA),和/或,上调目的基因的激活型转录因子,和/或,将内源启动子替换为更强的启动子。
在本发明的一个具体实施方式中,可以导入多拷贝的转酮酶编码基因(tktA)、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶编码基因(pck)和/或磷酸烯醇式丙酮酸合成酶编码基因(ppsA)。其中,可以导入重组菌的染色体基因组上,或者游离在重组菌进行表达。
优选的,所述的外源基因还可以包括tktA、pck和/或ppsA基因。
所述的外源基因在重组菌的染色体基因组上表达或者在游离质粒上表达。
所述的重组菌为盐单胞菌属(Halomonas)。优选自Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis或Halomonas aydingkolgenesis。在本发明的一个具体实施方式中,所述的重组菌为Halomonas bluephagenesis TD1.0(CGMCC.No.4353)、Halomonascampaniensis LS21(CGMCC No.6593)或Halomonas aydingkolgenesis M1(CGMCCNO.19880)及其这些盐单胞菌的任何衍生菌,尤其是基因工程改造的和物理化学诱变的。
所述的重组菌可以产生紫色杆菌素。
本发明还提供了制备上述重组菌的载体,所述的载体包含外源基因。
所述的载体可以在微生物中复制和/或表达。优选的,所述的载体为质粒。
所述的载体包含调控元件,优选为启动子。所述的启动子可以为不同强度。其中所述的启动子调控外源基因的表达。不同外源基因可以采用相同或不同的启动子。所述的启动子可以为组成型或诱导型。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的启动子可以为MmP1、J23119(SEQ IDNo.41)、J23114(SEQ ID No.31)、J23105(SEQ ID No.32)或J23101(SEQ ID No.33)等。
本发明还提供了上述重组菌的构建方法,所述的构建方法包括将外源基因导入重组菌中。
所述的外源基因包含vioA、vioB、vioC、vioD或vioE中的一种或两种以上的组合。优选还包括突变后的aroG和/或trpE基因。优选还包括tktA、pck和/或ppsA基因。
所述的构建方法包括上述的载体将外源基因导入重组菌中。
所述的重组菌中还沉默或敲除pheA、tyrA或ubiC中的一种或两种以上的组合。
所述的重组菌为盐单胞菌属(Halomonas)。
本发明还提供了一种紫色杆菌素的生产方法,所述的生产方法包括发酵培养上述的重组菌。
所述发酵的培养基可以为液体、固体或半固体。
所述发酵的培养基可以为自然培养基、合成培养基和/或半合成培养基。优选的,所述的发酵的培养基可以采用现有技术常规的培养基,也可以采用含有营养成分的其他物质。所述的常规的培养基包含无机盐培养基(MMG)、Luria-Bertani培养基(LB)等等。
优选的,所述发酵的培养基中包含碳源、氮源、无机盐等等。所述的氮源包含无机氮源和/或有机氮源。进一步优选的,所述的发酵的培养基中还包含维生素和/或生长因子。
优选的,所述发酵的培养基中包括色氨酸、尿素和/或IPTG。
进一步优选的,色氨酸在培养基中的含量为0-2g/L中的任一数值,更优选为1-2g/L中的任一数值。例如0、0.1、0.5、0.8、1、1.1、1.2、1.5、1.8、2g/L等。
进一步优选的,尿素在培养基中的含量为2-6g/L中的任一数值,更优选为2-4g/L中的任一数值。例如2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6g/L等。
进一步优选的,IPTG在培养基中的含量为0.2-20g/L中的任一数值,更优选为2-10g/L中的任一数值。例如0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20g/L等。
在本申请的一些实施例中,所述发酵培养基包含:NaCl 50g/L;yeast 1g/L;葡萄糖30g/L;L-色氨酸1g/L;组分I 20mL/L;组分II 20mL/L;组分III10 mL/L;组分IV10 mL/L;pH为8.5。
所述发酵的温度可以为30-45℃中的任一数值,优选为35-40℃中的任一数值。例如30、31、35、37、38、39、40、41、42、43、44、45℃等。
所述发酵的时间可以为10-100h中的任一数值,优选为10-50h中的任一数值。例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100h。
所述发酵可以为摇瓶发酵、发酵罐发酵。
所述发酵可以为连续发酵、分批发酵、分批补料发酵等。
所述的发酵可以不进行灭菌。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的发酵包括菌种活化、种子发酵、发酵罐发酵。
本发明还提供了上述重组菌、上述载体或上述生产方法获得的紫色杆菌素在抑菌、抗寄生虫、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化中的应用,以及在制备抑菌、抗寄生虫、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化的药物中的应用。
所述的紫色杆菌素抑制的菌种包括细菌(包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌)和真菌等,例如,包括但不限于芽孢杆菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌菌。
所述的寄生虫包括但不限于恶性疟原虫、利什曼原虫或纤毛原生动物等。
所述的肿瘤包括但不限于白血病、肺癌或结肠癌等。
所述的病毒包括但不限于单纯疱疹病毒或脊髓灰质炎病毒等。
所述的抗氧化包括脂质膜的抗氧化能力。
所述的药物包括紫色杆菌素,其中所述的紫色杆菌素由本申请的生产方法制备获得。所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明所述的“药学上可接受的”是指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的产品的活性物质的生物学活性及特性。
本发明所述的“药学上可接受的辅料”,包括但不限于载体、赋形剂、稀释剂、润湿剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、抗氧化剂、缓冲剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、矫味剂和防腐剂等中的一种或多种。
本发明所述的药物可以采用任何合适的给药途径,例如胃肠道给药(例如口服)或非胃肠道给药(例如,静脉内、肌内、皮下、皮内、器官内、鼻内、眼内、滴注、脑内、鞘内、透皮、直肠内等)途径。
本发明所述的药物可以为任何合适的剂型,例如经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型,优选包括但不限于片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、微乳剂、混悬剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、舌下片剂、栓剂、气雾剂、泡腾片、滴丸剂、凝胶剂等等。
本发明所述药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。
本发明所述的药物可以含有重量比为0.01-99.5%(具体如,0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.5%)的所述紫色杆菌素或其药学上可接受的盐。
本发明所述的药物可以为人用药或兽用药。
本发明所述的“过表达”为将基因上调表达,高于原本天然的表达量或使得原本不表达变为表达。
本发明所述的“弱化表达”为将基因下调表达,低于原本天然的表达量,甚至不表达。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法,当用于描述蛋白质或核酸的序列时,所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成,或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸,但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
本发明所述“同源性”,是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面,本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整,使使用序列与现有技术获得的序列相比,具有(包括但不限于)1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%,12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,70%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.1%,99.2%,99.3%,99.4%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%的同一性。
本申请简写与中文名称对照见表1。
表1:简写与中文名称对照
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本发明中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以按照制造厂商所建议的条件,或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
其中,实施例中使用的底盘菌株Halomonas bluephagenesis TD1.0可参考文章:Tan D,Xue Y S,Aibaidula G,et al.Unsterile and continuous production ofpolyhydroxybutyrate by Halomonas TD01[J].Bioresource Technology:Biomass,Bioenergy,Biowastes,Conversion Technologies,Biotransformations,ProductionTechnologies,2011(17):102。
实施例1:构建生产紫色杆菌素底盘菌株
首先对引物进行设计和对质粒进行构造,通过Snapgene软件和网站NEB TmCalculator(https://tmcalculator.neb.com/)设计引物与构造质粒,并且通过一系列实验操作最终将质粒分别导入嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD1.0中,实现由发酵得到产品紫色杆菌素。
(1)紫色杆菌素合成途径的确定
在盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0中,为实现由L-色氨酸到紫色杆菌素的生物转化,异源引入合成紫色杆菌素相关的酶。
所需要的酶主要包括来自菌株Chromobacterium violaceum的vioABCDE基因簇(其中,vioA基因NCBI登记号:WP_011136821;vioB基因NCBI登记号:WP_011136820;vioC基因NCBI登记号:WP_011136819;vioD基因NCBI登记号:WP_011136818;vioE基因NCBI登记号:WP_011136817)。
(2)质粒构建
在pSEVA321骨架质粒上组装vioA、vioB、vioC、vioD和vioE构建质粒pSEVA321-MmP1-vioABCDE。紫色杆菌素合成相关基因片段以及骨架质粒片段使用Q5高保真DNA聚合酶进行扩增以及使用Golden Gate Assembly Kit(
v2)(购自New England Biolabs)进行连接从而得到目的连接产物。
1)表达载体骨架及相关基因的序列片段PCR扩增
表达载体pSEVA321骨架及vioABCDE基因PCR扩增引物序列信息,根据NCBI中Chromobacterium violaceum全基因组核苷酸序列中vioA、vioB、vioC、vioD和vioE(核苷酸序列如SEQ ID No.34-38所示)的基因序列,利用Snapgene软件进行引物设计。
表达载体pSEVA321骨架引物序列如下:
pSEVA321-MmP1-F(SEQ ID No.1):
CTAGGGTCTCACTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAAT
pSEVA321-MmP1-R(SEQ ID No.2):
CTAGGGTCTCACGCGTCGTGACTGGGAAA
vioA基因对应的引物序列如下:
vioA-F(SEQ ID No.3):
CTAGGGTCTCACTAGATGAAGCACTCTTCTGACAT
vioA-R(SEQ ID No.4):
CTAGGGTCTCAAGGCCTATCTTCTCAAAGCAGCGAT
vioB基因对应的引物序列如下:
vioB-F(SEQ ID No.5):
CTAGGGTCTCAGCCTTACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGAGCATTCTGGATTTCCC
vioB-R(SEQ ID No.6):
CTAGGGTCTCAGTGGCTATTAGGCCTCGCGG
vioC基因对应的引物序列如下:
vioC-F(SEQ ID No.7):
CTAGGGTCTCACCACTACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGAAAAGAGCTATCATCGTT GG
vioC-R(SEQ ID No.8):
CTAGGGTCTCACGGTCTAGTTAACTCTACCGATCTTGTACC
vioD基因对应的引物序列如下:
vioD-F(SEQ ID No.9):
CTAGGGTCTCAACCGTACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGAAAATCTTGGTTATCGGTGC
vioD-R(SEQ ID No.10):
CTAGGGTCTCACGAGCTATCTTTGCAAAGCGTATCTCAA
vioE基因对应的引物序列如下:
vioE-F(SEQ ID No.11):
CTAGGGTCTCACTCGTACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGGAAAACAGAGAACCACC vioE-R(SEQ ID No.12):
CTAGGGTCTCACGCGCTATCTCTTAGCAGCGAAAACAG
分别以载体pSEVA321与及Chromobacterium violaceum全基因组为模板,利用上述引物进行PCR扩增,反应体系为50μL,在0.2mL PCR管中依次加入下列成分(如表2所示):
表2:Q5高保真DNA聚合酶的PCR体系添加表
体系组分 |
反应体系 |
Forward Primer(10μmol/L) |
2.5μL |
Reverse Primer(10μmol/L) |
2.5μL |
Q5 High-Fidelity 2×Master Mix |
25μL |
Template DNA(<200ng) |
1μL |
dd H2O |
To 50μL |
配制PCR反应体系后,混匀并瞬时离心,PCR扩增条件为:98℃预变性30s;98℃变性10s,50-72℃退火30s,72℃延伸30s/kb,32个循环次数;72℃终延伸2min。使用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)回收上述载体及基因片段,按照产品说明书提供的操作步骤进行。
2)重组质粒的连接
将上述1)中得到的载体及基因连接构建重组成为一个新质粒,通过Golden GateAssembly Kit(
v2)(购自New England Biolabs)进行连接,总反应体积为10μL,在0.2mL PCR管中依次加入表3成分。
表3:Golden Gate Assembly Kit(
v2)连接时各组分添加量
在冰上进行混匀,当这6个片段组装时,37℃热浴60分钟。获得连接产物。连接之后,将样品储存在冰上或-20℃,用以后续的转化。
3)大肠杆菌s17-1化学转化感受态细胞的制备
①使用LB平板培养基,挑取大肠杆菌(-20℃甘油保藏菌株),在平板上分级划线,于37℃倒置培养14-16h。
②从LB平板上挑取活化的E.coli S17-1单菌落,接种于5mL LB液体培养基中,37℃振荡培养12h。
③将上述培养物以1%接种于100mL的LB液体培养基中,37℃振荡培养OD600达到0.5左右,放置冰上停止培养。
④取上述菌液1mL转入1.5mL离心管中,4000rpm,4℃离心10分钟,弃去上清;之后按感受态细胞制备试剂盒(Takara公司)说明书进行。
⑤冰上将感受态细胞分装成每管100μL,-80℃保存,即获得感受态细胞S17-1。
4)连接产物转化到大肠感受态细胞S17-1
①-80℃冰箱内取出100μL制备的感受态细胞S17-1,迅速插入冰盒内,使其溶解。
②加入10μL连接产物轻轻混匀,冰中放置30分钟。
③42℃水浴热激90秒,迅速放回冰中放置2分钟,注意不要晃动。添加700μL不含抗生素的无菌LB培养基,混合均匀。
④37℃振荡培养1小时(160-225rpm),吸取适量体积均匀涂布到含氯霉素抗生素的LB琼脂培养基平板中,然后倒置过夜培养。
⑤通过菌落PCR来验证阳性单克隆并送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
(3)重组质粒导入嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD1.0
将大肠杆菌S17-1(p321-MmP1-vioABCDE)接合到嗜盐菌Halomonasbluephagenesis TD1.0
①将大肠杆菌S17-1(LB+氯霉素)与Halomonas bluephagenesis TD1.0(60LB)分别培养(摇菌管4-5mL),待OD600达到0.6-0.8,各取50μL按1:1混合涂布到无抗20LB平板,6-8h;
②在含有氯霉素抗生素的平板上划线培养48h;
③最后再挑取单克隆在60LB含氯霉素抗生素平板上验证,利用PCR再次验证,保菌。
60LB培养基:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,氯化钠60g/L,水,pH为8.5。
(4)重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0产紫色杆菌素摇瓶发酵
在摇瓶中验证底盘菌株盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0产紫色杆菌素能力,具体实施方法为:
1)种子液的制备
①将重组的盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0(pSEVA321-MmP1-vioABCDE)在含氯霉素的60LB平板,37℃活化24h,待其长出单克隆。
②一级种子液:挑选上述①中单克隆接种于装有5mL种子培养基(60LB)及5μL氯霉素的摇菌管中,37℃,220rpm培养12h。
③二级种子液:取上述②中菌液,按1%接种于装有20mL种子培养基(60LB)及20μL氯霉素的150mL锥形瓶中,37℃,220rpm培养12h。
2)紫色杆菌素摇瓶发酵生产
培养基准备,①50MM培养基体系
底料(g/L):水;NaCl 50;yeast 1;
组分I(g/L):水;MgSO4 20;尿素25;
组分II(g/L)水;KH2PO4 175;
组分III(g/L):将5g/L Fe(III)-NH4-Citrate和2g/L CaCl2·2H2O及浓盐酸(12mol/L)41.7ml充分混合后定容1L;
组分IV(g/L):含ZnSO4·7H2O 0.1,MnCl2·4H2O 0.03,H3BO3 0.3,CoCl2·6H2O0.2,CuSO4·5H2O0.01,NiCl2·6H2O 0.02和NaMoO4·2H2O 0.03;
组分III&IV取100mL组分III,10mL组分IV且加入90mL去离子水混合,最后用5M的NaOH调pH值到4.5-5.5;
碳源(g/L):水;葡萄糖30,L-色氨酸2。
②60LB发酵培养体系酵母粉5g/L,胰蛋白胨10g/L,氯化钠60g/L,葡萄糖30g/L,L-色氨酸2g/L,水,pH为8.5。本批实验采用50MM培养体系,将种子液按5%接种于150mL锥形瓶(底料18ml;组分I1mL;组分II 1ml;组分III&IV 1mL;葡萄糖3mL;1‰的抗生素氯霉素;使用5M的NaOH调pH值到8.5-9.5)内,并加入0、20、200mg/L的诱导剂IPTG,置于摇床37℃、220rpm培养48h。
3)发酵结束后收集菌体进行检测OD570、OD600、细胞干重(CDW)和L-色氨酸含量
①OD570:取1mL发酵后菌液置于1.5mL EP管中,12000rpm室温下离心10min,去上清液(尽可能减少固体沉淀的损失);加入去离子水恢复原体积,重悬,保证沉淀完全消失,12000rpm室温下离心10min,去上清液;随后加入等量体积的无水乙醇,重悬菌体,使紫色杆菌素溶解于无水乙醇中,为了提高溶解效率,可将其超声60min,使紫色杆菌素完全溶解(完全提取时,沉淀没有肉眼可见的紫色);超声后再次离心,12000rpm室温下离心10min,取0.2mL上清液加入到酶标板中,置于酶标仪上检测570nm处吸光值,根据标准曲线方程计算粗紫色杆菌素(含紫色杆菌素及脱氧紫色杆菌素)含量(根据实施例2图1中标准曲线方程计算粗紫色杆菌素含量)。
②OD600:取1mL发酵后的菌液,12000rpm,离心10min,弃上清加入等量体积的去离子水,重悬菌体,使用分光光度计检测波长为600nm时吸光值(必要时对菌液进行稀释,确保使用分光光度计在波长为600nm时的读数位于为0.3-0.8范围之中)。
③L-色氨酸含量检测:L-色氨酸含量的检测利用高效液相色谱法;AgilentZORBAX SB-C18 column,4.6×250mm色谱柱;流速为0.75mL/min;柱温为35℃;检测波长284nm;流动相:A相100%色谱级乙腈;B相25mM乙酸钠缓冲溶液(pH=4.8);时间程序:0–2min,20–25% A;2–8min,25–60% A;8–10min,60–20% A。
④细胞干重(CDW):将10-15mL发酵后菌液置于50mL离心管中,8000rpm室温下离心6min,去上清液(尽可能减少固体沉淀的损失);加入去离子水恢复原体积,重悬,保证沉淀完全消失,8000rpm室温下离心6min,去上清液;封口膜封口离心管置于-80℃冰箱冻存0.5-2h;将离心管于真空冷冻干燥机内干燥12-16小时;称重,计算细胞干重。
4)发酵结果:
重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0的摇瓶发酵粗紫色杆菌素结果如表4所示。
表4:添加2g/LL-色氨酸摇瓶发酵情况
实施例2:紫色杆菌素提取及标准曲线绘制
为了对发酵产生的紫色杆菌素浓度进行计算,将实施例1所得发酵液中紫色杆菌素进行提取,随后取不同质量的紫色杆菌素粗提取物干燥粉末配置成紫色杆菌素溶液,并绘制标准曲线,见图1。具体内容如下:
将发酵后的菌液进行离心(12000rpm,10min),弃上清得到菌体沉淀,随后加入等量体积的水重悬菌体,再次离心去除上清。随后加入等量无水乙醇,涡旋震荡将其混匀,随后进行超声使其完全溶解,待完全溶解后,再次离心,取上清得到含紫色杆菌素的乙醇溶液,对其干燥,得到紫色杆菌素粗提物。随后利用分析天平称取不同质量紫色杆菌素。
实施例3:重组盐单胞菌深孔板生产紫色杆菌素
为进一步提高底盘菌株Halomonas bluephagenesis TD1.0产紫色杆菌素能力使用上述实施例1中所用质粒pSEVA321-MmP1-vioABCDE在96深孔板培养体系中探究添加不同浓度的前体物质L-色氨酸和IPTG对紫色杆菌素产量的影响,其中L-色氨酸添加量分别为0、1和2g/L,IPTG添加量分别为0、0.2、2、10、20和100mg/L,并将L-色氨酸添加浓度与IPTG添加浓度进行正交实验,在深孔板中验证发酵情况,紫色杆菌素深孔板发酵体系如下:
深孔板中每孔加入1mL实施例1中50MM培养基,添加10μL二级种子液,于THERMO-SHAKER中进行培养,37℃,1000rpm,发酵48h。
质粒接合、种子液制备、培养基制备等操作同实施例1,发酵之后的结果如表5所示。
表5:L-色氨酸及IPTG添加量对紫色杆菌素产量影响
实施例4:发酵培养基氮源优化
在摇瓶中,探究添加不同浓度氮源尿素对重组菌株产紫色杆菌素能力的影响。具体实施方法同实施例1中(4),仅改变尿素添加的浓度。在此探究当尿素终浓度为0.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g/L时粗紫色杆菌素产量。将上述pSEVA321-MmP1-vioABCDE质粒按照实施例1(3)操作接合到Halomonas bluephagenesis TD 1.0菌株中。
结果如表6所示,摇瓶发酵48h在添加3.0g/L尿素时会获得最高的粗紫色杆菌素产量为1.842±0.030。
表6:不同尿素浓度对紫色杆菌素产量影响
尿素(g/L) |
粗紫色杆菌素产量(g/L) |
CDW(g/L) |
L-色氨酸含量(g/L) |
0.5 |
0.921±0.039 |
5.99±0.333 |
1.084±0.025 |
2.0 |
1.626±0.043 |
15.256±0.469 |
0.030±0.023 |
3.0 |
1.842±0.030 |
14.493±0.229 |
0.329±0.063 |
4.0 |
1.824±0.006 |
14.046±0.739 |
0.455±0.019 |
5.0 |
1.666±0.123 |
11.033±0.652 |
0.670±0.029 |
6.0 |
1.606±0.070 |
10.900±1.492 |
0.731±0.098 |
实施例5:L-色氨酸代谢竞争途径敲除
为了进一步提高紫色杆菌素产量,本实施例利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对Halomonas bluephagenesis TD1.0基因组进行编辑以敲除pheA、tyrA和/或ubiC。
(1)pheA、tyrA和ubiC基因敲除菌株的构建
①构建敲除目的基因(pheA、tyrA和ubiC基因)重组质粒,并按照敲除基因序列设计sgRNA。
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒(含壮观霉素、卡那霉素抗性基因),sgRNA插入在启动子J23119(见SEQ ID No.41:TTGACAGCTagctcagtcctaggtataatgctagc)后,用于敲除目的基因(pheA、tyrA和ubiC基因)的同源臂(上下游同源臂简写为H1、H2)连接在sgRNA后。按照实施例1(2)中操作进行PCR扩增及对应重组质粒的构建。
用于敲除pheA基因所涉及的引物序列如下:
pheA-sgRNA-F(SEQ ID
No.13):ATCGACCAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGT
pheA-sgRNA-R(SEQ ID No.14):
ACGTTGACGTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGC
pheA-H1-F(SEQ ID No.15):
TTTTTTTGAACCCGGCATGGAGATGAGCCATCG
pheA-H1-R(SEQ ID No.16):
CAGCACACTCCGGGTGGTTAGCCTCTTCG
pheA-H2-F(SEQ ID No.17):
GGCTAACCACCCGGAGTGTGCTGTGCA
pheA-H2-R(SEQ ID No.18):
CGCGGCCGCAAGCTTAGACGACCTTGCGCC
用于敲除tyrA基因所涉及的引物序列如下:
tyrA-sgRNA-F(SEQ ID No.19):
AAACGATGAAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTA
tyrA-sgRNA-R(SEQ ID No.20):
GCGCGCAAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT
tyrA-H1-F(SEQ ID No.21):
TTTTTTTGAACCCGGAGACTCGATAGACTAGCACC
tyrA-H1-R(SEQ ID No.22):
ACGGAGTGTGCTTGTCCCTGTGCTAACGG
tyrA-H2-F(SEQ ID No.23):
AGCACAGGGACAAGCACACTCCGTCACAG
tyrA-H2-R(SEQ ID No.24):
AGGGTTTTCCCAGTCCGTCCTGAGCGAGAGG
用于敲除ubiC基因所涉及的引物序列如下:
ubiC-sgRNA-F(SEQ ID No.25):
TGGCTCATCTCCATGCCGGGTTCAAAAAAAGCACC
ubiC-sgRNA-R(SEQ ID No.26):
GGCGCAAGGTCGTCTAAGCTTGCGGCCGC
ubiC-H1-F(SEQ ID No.27):
TTTTTTTGAACCCGGGCCCCTACCGTGATAAAAAA
ubiC-H1-R(SEQ ID No.28):
TCGTCGTCATGAAGAGTGAGGCCACCG
ubiC-H2-F(SEQ ID No.29):
TGGCCTCACTCTTCATGACGACGACTACGC
ubiC-H2-R(SEQ ID No.30):
CGCGGCCGCAAGCTTTTTCACCGTGCCAAATTGT
②表达sgRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒,两种质粒通过大肠杆菌S17-1接合转化至嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0,操作同实施例1(3)。
③通过菌落PCR设计引物验证是否存在敲除目的基因的突变体(命名为:TD 1.0ΔpheA、TD 1.0ΔtyrA、TD 1.0ΔubiC、TD 1.0ΔpheAΔtyrA、TD 1.0ΔpheAΔubiC、TD 1.0ΔpheAΔtyrAΔubiC),随后对菌株进行测序。
(2)验证本实施例构建的菌株
在本实施例中,将上述pSEVA321-MmP1-vioABCDE质粒按照实施例1(3)操作接合到TD 1.0、TD 1.0ΔpheA、TD 1.0ΔtyrA、TD 1.0ΔubiC、TD 1.0ΔpheAΔtyrA、TD 1.0ΔpheAΔubiC、TD 1.0ΔpheAΔtyrAΔubiC七个底盘菌株中。
摇瓶发酵的实验流程同实施例4,将尿素浓度更换为3g/L,培养48小时,在发酵结束后测定粗紫色杆菌素产量、细胞干重及色氨酸含量,结果见表7。
表7:不同底盘菌株生产粗紫色杆菌素能力
结果显示,敲除pheA、tyrA和/或ubiC后降低或解除色氨酸反馈调节,提高色氨酸代谢通量,提高底盘菌株对前体L-色氨酸的合成,提高了粗紫色杆菌素产量。
实施例6:强化前体L-色氨酸合成途径
在本实施例中目的是强化葡萄糖到色氨酸合成能力,以此来提高葡萄糖到紫色杆菌素转化率,提高紫色杆菌素产量并降低发酵成本。
(1)消除L-色氨酸反馈抑制
3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAPG)合酶及邻氨基苯甲酸合酶会受到色氨酸的反馈抑制,当色氨酸含量过高时会抑制关键酶的表达,从而降低葡萄糖转化率。其中,DAPG合酶由aroG基因编码;邻氨基苯甲酸合酶由trpE编码。因此,为了进一步提高色氨酸代谢通量,来提高紫色杆菌素产量,决定在盐单胞菌底盘菌株中引入不受色氨酸反馈抑制的突变基因,命名为aroG*(见SEQ ID No.39)、trpE*(见SEQ ID No.40),来测试这两个基因在盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0中表达强度。
在本实施例中,利用J23101及J23105两个不同强度启动子来控制aroG*和trpE*两个基因,并对其进行随机组合。随后利用上述CRISPR-Cas9技术将TD 1.0ΔpheAΔtyrAΔubiC菌株中自身的aroG和trpE两个基因用上述aroG*和trpE*及相应启动子区域进行替换得到4个重组菌株(Vio1:aroG*(J23105)trpE*(J23105);Vio2:aroG*(J23101)trpE*(J23105);Vio3:aroG*(J23105)trpE*(J23101);Vio4:aroG*(J23101)trpE*(J23101))。
随后将上述pSEVA321-MmP1-vioABCDE质粒按照实施例1(3)操作接合到本实施例重组菌株中。摇瓶发酵的实验流程同实施例4,尿素浓度为3g/L,外源添加1g/L L-色氨酸,培养48小时,在发酵结束后测定粗紫色杆菌素产量、细胞干重及色氨酸含量,结果见表8。
表8:不同底盘菌株生产粗紫色杆菌素能力
(2)平衡中心碳代谢途径
目的是强化紫色杆菌素合成关键前体4-磷酸赤藓糖(E4P)及磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)供应,解决瓶颈问题,来提高紫色杆菌素产量。
在此,对盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0磷酸戊糖途径中转酮酶(由tktA基因编码)的表达进行强化,提高磷酸戊糖途径整体催化效率,提高前体E4P供应;同时,强化盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0自身丙酮酸到磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(由ppsA基因编码)及草酰乙酸到磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(由pck基因编码)的表达,提高另一关键前体PEP的供应。
利用J23101及J23105两个不同强度启动子来控制tktA、ppsA和pck三个基因,并对其进行随机组合。随后利用CRISPR-Cas9技术将上述重组菌Vio3中tktA、ppsA和pck基因的启动子更换为J23101/J23105启动子,得到6个重组菌株(Vio5:tktA(J23105)ppsA(J23105)pck(J23101);Vio6:tktA(J23101)ppsA(J23105)pck(J23101);Vio7:tktA(J23105)ppsA(J23101)pck(J23101);Vio8:tktA(J23105)ppsA(J23105)pck(J23105);Vio9:tktA(J23101)ppsA(J23105)pck(J23105);Vio10:tktA(J23105)ppsA(J23101)pck(J23105);Vio11:tktA(J23101)ppsA(J23101)pck(J23105);Vio12:tktA(J23101)ppsA(J23101)pck(J23101))。
随后将上述pSEVA321-MmP1-vioABCDE质粒按照实施例1(3)操作接合到以上重组菌株中。摇瓶发酵的实验流程同实施例4,尿素浓度为3g/L,外源添加1gL-色氨酸,培养48小时,在发酵结束后测定粗紫色杆菌素产量、细胞干重及色氨酸含量,结果见表9。
表9:不同底盘菌株生产粗紫色杆菌素能力
实施例7:强化紫色杆菌素合成限速步骤
在本实施例中目的是进一步提高紫色杆菌素合成,决定对色氨酸到紫色杆菌素合成路径中限速步骤进行强化,提高紫色杆菌素合成效率。
为了解决这一问题,采用如下的方法:
(1)对上述pSEVA321-MmP1-vioABCDE质粒重新构建,利用3个不同强度启动子J23114(低)、J23105(中)、J23101(高)分别控制单一的vioX基因,将vioABCDE基因簇中其余4个基因控制在Mmp1启动子下,来探究L-色氨酸到紫色杆菌素途径中限速酶,质粒构建的操作同实施例1(2),随后将质粒接合至底盘菌株Vio7中。
J23114启动子序列(SEQ ID No.31):
TTTATAGCTAGCTCAGCCCTTGGTACAATGCTAGC J23105启动子序列(SEQ ID No.32):
TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTATGCTAGC J23101启动子序列(SEQ ID No.33):
TTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATTATGCTAGC
(2)按照实施例5中培养条件,摇瓶发酵培养48h,检测粗紫色杆菌素产量、细胞干重、色氨酸含量,结果见表10。在摇瓶中发酵48h菌株Mmp1-vioBCDE,J23101-vioA有最高粗紫色杆菌素产量为3.125g/L。
表10:不同底盘菌株生产粗紫色杆菌素能力
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。