CN117844838A - 一株高产l-苯丙氨酸的菌株构建及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产L‑苯丙氨酸的菌株构建及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过分子改造获得耐受高浓度L‑苯丙氨酸的重组菌株E.coli PHE，通过向菌株E.coli JNYPQ导入两个重组质粒：pEM‑marA‑aroA‑aroD‑tyrB和pACYC177‑CI‑aroF‑pheAfbr‑yddG，既提高了L‑苯丙氨酸的产量又增强了菌体活性。经过5L发酵罐发酵48h，L‑苯丙氨酸产量可以达到89g/L，发酵终点死亡率为32％，本发明所得菌株产L‑苯丙氨酸潜力巨大，且发酵生产L‑苯丙氨酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一株高产L-苯丙氨酸的菌株构建及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)，化学式为C9H11NO2，分子量为165.19，是α-氨基酸的一种，属于芳香族氨基酸。L-苯丙氨酸是人体和动物不能靠自身自然合成的必需氨基酸之一，广泛应用于食品、医药、饲料等领域。在食品领域，苯丙氨酸可作为营养强化剂及饮料添加剂，可以合成优良甜味剂阿斯巴甜；在医药领域，主要用于氨基酸输液、综合氨基酸制剂及营养强化剂，在抗癌，降血压，消除肾与膀胱的功能性疲劳等方面有着巨大的作用；在饲料领域，作为饲用氨基酸，在水产动物饲料中补充苯丙氨酸有助于减少应激引起的骨骼畸形和死亡率，提高水产动物肠道消化酶活性。
目前，L-苯丙氨酸的工业生产方法分为直接提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法。微生物发酵法具有原料廉价易得、环境污染较小、产物纯度高、可大规模生产等优点。因此目前世界上L-苯丙氨酸的工业化生产大多采用微生物发酵法。因为大肠杆菌代谢途径明确，具有快速生长和高细胞密度等优势，成为L-苯丙氨酸发酵的常用菌株。大肠杆菌中L-苯丙氨酸的生物合成路径为：以葡萄糖为底物，经过糖酵解过程的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和戊糖磷酸糖磷酸途径的中间产物赤藓糖-4-磷酸(E4P)进行缩合，形成3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)，然后经过莽草酸途径将DAHP转化为莽草酸(SHIK)，之后再转化为分支酸(CHA)，分支酸在分支酸变位酶作用下，转变为预苯酸，经脱水、脱羧后形成苯丙酮酸，后者在转氨酶作用下，与谷氨酸进行转氨形成L-苯丙氨酸。
但在大肠杆菌发酵产L-苯丙氨酸的过程中，常存在菌体浓度达到最大值后持续降低的现象。这是由于高浓度的L-苯丙氨酸会抑制菌体的生长，使菌体浓度持续下降，继而限制产量的提升。同时，由于L-苯丙氨酸路径的代谢通量不足，使大肠杆菌利用葡萄糖发酵产生L-苯丙氨酸的产量进一步受到限制。因此，提高大肠杆菌对于高浓度L-苯丙氨酸的耐受性，合理增加苯丙氨酸的代谢通量可以协同应用于提升L-苯丙氨酸的产量。
发明内容
本发明提供一种增加菌株对高浓度L-苯丙氨酸耐受性的方法，所述方法既提升了所述构建方法的步骤为：(1)转录组学分析菌株在L-苯丙氨酸胁迫下各基因的表达情况；(2)筛选耐受靶点；(3)重组质粒pEM-marA的构建。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为在菌株中过表达DNA结合转录相关因子。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA结合转录因子包括DNA结合转录双调节因子基因marA、DNA结合转录激活因子基因mhpR或DNA结合转录抑制因子基因marR。
在本发明的一种实施方式中，所述基因marA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因mhpR的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因marR的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株以大肠杆菌为宿主细胞。
本发明还提供了一株生产L-苯丙氨酸的重组菌株，所述重组菌株耐受高浓度L-苯丙氨酸，所述重组菌株过表达DNA结合转录双调节因子基因marA。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株过表达3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因aroA，3-脱氢奎尼酸脱水酶基因aroD，酪氨酸转氨酶基因tyrB，3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因aroF，分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheAfbr，芳香族氨基酸外排蛋白基因yddG。
在本发明的一种实施方式中，所述基因aroA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因aroD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因tyrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因aroF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因pheAfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因yddG的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株利用pEM质粒携带基因marA，基因aroA，基因aroD和基因tyrB。
在本发明的一种实施方式中，利用携带有基因aroF，基因pheAfbr的质粒pACYC177-CI-aroF-pheAfbr表达基因yddG。
在本发明的一种实施方式中，所述pEM质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，公开于文献Hu,G.,Li,Z.,Ma,D.et al.Light-driven CO2 sequestration in Escherichiacoli to achieve theoretical yield ofchemicals.Nat Catal4,395–406(2021).
在本发明的一种实施方式中，所述pACYC177-CI-aroF-pheAfbr公开于公开号为CN116656581A的中国专利申请文件中。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株以大肠杆菌为宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括菌株E.coli JNYPQ。
本发明还提供一种改造L-苯丙氨酸生产菌株的方法，所述方法提高苯丙氨酸的产量，所述方法为在L-苯丙氨酸生产菌株中过表达DNA结合转录双调节因子基因marA。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将质粒pEM-marA-aroA-aroD-tyrB和质粒pACYC177-CI-aroF-pheAfbr-yddG转化至L-苯丙氨酸生产菌株中。
在本发明的一种实施方式中，所述pEM-marA-aroA-aroD-tyrB质粒为以pEM为载体，携带有基因marA，基因aroA，基因aroD和基因tyrB。
在本发明的一种实施方式中，所述pACYC177-CI-aroF-pheAfbr-yddG质粒为以pACYC177-CI-aroF-pheAfbr为载体，携带有基因yddG。
在本发明的一种实施方式中，所述L-苯丙氨酸生产菌株包括菌株E.coli JNYPQ。
本发明还提供一种生产L-苯丙氨酸的方法，将所述重组菌株加入发酵体系中进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将所述重组菌株接种到种子培养基中培养，然后再转接到发酵培养基中继续发酵培养得到含有L-苯丙氨酸的发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括K2HPO45～10g/L，酵母粉5～10g/L，柠檬酸1～5g/L，(NH4)2SO41～5g/L，FeSO4·7H2O 10～50mg/L，MnSO4·H2O 5～10mg/L，酪氨酸1～2g/L，葡萄糖10～50g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，微量元素混合液1～2ml/L，生物素1～2mg/L，VB10.1～0.5mg/L，VB30.1～0.2mg/L；
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素混合液包括钼酸钠1～5mg/L，六水合氯化铝1～5mg/L，六水合硫酸镍1～5mg/L，六水合氯化钴1～2mg/L，二水合氯化钙5～20mg/L，七水合硫酸锌0.1～0.5mg/L，二水合氯化铜0.1～0.5mg/L，硼酸0.1～0.2mg/L。
本发明还提供了所述改造L-苯丙氨酸生产菌株的方法或所述重组菌株在生产L-苯丙氨酸或含有L-苯丙氨酸的产品中的应用。
本发明的有益效果
1、本发明筛选并验证了过表达DNA结合转录双调节因子基因marA可以提高大肠杆菌在高浓度L-苯丙氨酸中的耐受性，在30g/L L-苯丙氨酸胁迫12h后死亡率最低，仅为27.96％。相比携带pEM空质粒的重组菌株PHE0(pEM)降低了64.16％，；OD600值为11.32，与PHE0相比提高44.02％。同时，本发明还筛选到DNA结合转录激活因子mhpR和DNA结合转录抑制因子marR也可以一定程度上提高大肠杆菌在高浓度L-苯丙氨酸中的耐受性，降低死亡率。
2、本发明通过在菌株E.coli JNYPQ中转入携带有基因marA，基因aroA，基因aroD和基因tyrB的质粒pEM-marA-aroA-aroD-tyrB和pACYC177-CI-aroF-pheAfbr-yddG质粒构建得到耐受高浓度L-苯丙氨酸的产L-苯丙氨酸杆菌E.coli PHE，其在发酵罐上发酵48h，L-苯丙氨酸产量可以达到89g/L，本发明所得菌株后续改造潜力巨大，且发酵生产L-苯丙氨酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。
生物材料保藏
本发明使用的初始大肠杆菌，分类命名为Escherichia coli，已于2022年1月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC NO:62245，保藏地址：中国，广东省广州市。
附图说明
图1为重组菌株在L-苯丙氨酸胁迫下死亡率情况；
图2为所述产L-苯丙氨酸大肠杆菌在发酵罐水平发酵过程曲线图。
具体实施方式
(1)培养基：
斜面培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，用NaOH调节pH，使其达到7.0。
种子培养基：NaCl 5g/L，胰蛋白胨32g/L，酵母粉20g/L，甘油5g/L。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
发酵培养基：K2HPO47 g/L，酵母粉8g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)2SO43 g/L，FeSO4·7H2O30mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，酪氨酸1.2g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，微量元素混合液1ml/L，生物素1mg/L，VB10.3 mg/L，VB30.1 mg/L；
微量元素混合液：钼酸钠2.5mg/L，六水合氯化铝2.5mg/L，六水合硫酸镍2.5mg/L，六水合氯化钴1.75mg/L，二水合氯化钙10mg/L，七水合硫酸锌0.5mg/L，二水合氯化铜0.25mg/L，硼酸0.125mg/L。
(2)菌体浓度测定
取发酵液适当稀释，使用紫外-可见分光光度计在波长为600nm下测定OD600值。
(3)菌体死亡率测定
取1mL样品，用PBS清洗两次后稀释至OD600在0.4-0.6之间。加入4μL PI染色液，避光染色15min后使用流式细胞仪检测。
(4)发酵罐发酵液中L-苯丙氨酸的测定：
发酵液预处理：取发酵液12000rpm离心10min后取上清，用0.22μm滤膜过滤。
高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中L-苯丙氨酸含量：流动相A是将3.01g无水乙酸钠，200μL三乙胺，5ml四氢呋喃溶于995mL超纯水中，用10％乙酸调pH至7.2；流动相B是将3.01g无水乙酸钠溶于200ml超纯水，用10％乙酸调pH至7.2，再加乙腈400ml，甲醇400ml。色谱柱为Aglient ZORBAX SB-Aq 250×4.6mm，5μm。利用柱前在线衍生方法，衍生剂为OPA，柱温：40℃，流速为0.8mL/min进行梯度洗脱，检测波长：UV 338nm；梯度程序如下：
表1HPLC检测梯度程序
| 时间/min | 0 | 27 | 31.5 | 34 | 35.5 |
| 流动相A/％ | 92 | 40 | 0 | 0 | 92 |
| 流动相B/％ | 8 | 60 | 100 | 100 | 8 |
实施例1：耐受靶点的筛选和构建
(1)转录组学分析
以本实验室保藏的一株产L-苯丙氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)JNYPQ为起始菌株，该菌株公开于公开号为CN116656581A的中国专利申请文件中。该菌株于2022年1月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62245。该起始菌株在摇瓶发酵48h后，L-苯丙氨酸的产量为4.12g/L；在30g/L L-苯丙氨酸胁迫12h后死亡率为75％。
将E.coli JNYPQ在LB培养基中37℃培养12h后，以起始OD为0.1转接到四瓶新鲜LB培养基中。将其分为两组，培养3h后，将两组培养基中分别加入0g/L和30g/L L-苯丙氨酸。一组培养6h，另外一组培养12h。各取5mL菌液离心后去上清，再使用PBS清洗三次。液氮冷冻菌体沉淀，送至苏州金唯智生物科技有限公司进行转录组学分析。将0g/L L-苯丙氨酸中培养6h的菌株命名为E1，在30g/L L-苯丙氨酸条件下培养6h的菌株命名为E2，0g/L L-苯丙氨酸中培养12h的菌株命名为E3，在30g/L L-苯丙氨酸条件下培养12h的菌株命名为E4。
首先，比较E2和E4分别相对于E1和E3的基因转录水平，发现有23个基因共同发生了显著上调。这些基因涉及到转录、氨基酸代谢、能量代谢和碳代谢等。选择转录功能中上调程度最高的前5个基因作为潜在耐受靶点(见表2)，分别是mhpR、marR、higA、rpoH、marA。
表2基因功能描述
| 基因 | 功能描述 |
| mhpR | DNA结合转录激活因子 |
| marR | DNA结合转录抑制因子 |
| higA | DNA结合转录抑制因子 |
| rpoH | RNA聚合酶σ因子 |
| marA | DNA结合转录双调节因子 |
(2)耐受靶点的筛选
利用基因工程对这5个基因分别过表达并验证各菌株的耐受能力。以pEM质粒(公开于文献Hu,G.,Li,Z.,Ma,D.et al.Light-driven CO2 sequestration in Escherichiacoli to achieve theoretical yield ofchemicals.Nat Catal 4,395–406(2021).)为骨架，将这5个基因分别连接在pEM质粒上，得到重组质粒pEM-mhpR、pEM-marR、pEM-higA、pEM-rpoH、pEM-marA。随后将上述重组质粒和空质粒pEM分别转化至重组菌株E.coli JNYPQ，并将它们命名为PHE0(pEM)、PHE1(mhpR)、PHE2(marR)、PHE3(higA)、PHE4(rpoH)、PHE5(marA)，具体操作如下：
以E.coli JNYPQ的基因组DNA为模板，用引物mhpR-f和引物mhpR-r进行PCR扩增，得到mhpR基因；引物marR-f和引物marR-r进行PCR扩增，得到marR基因；引物higA-f和引物higA-r进行PCR扩增，得到higA基因；引物rpoH-f和引物rpoH-r进行PCR扩增，得到rpoH基因；用引物marA-f和引物marA-r进行PCR扩增，得到marA基因。将得到的五个基因片段分别用BamHI和HindIII进行双酶切，得到能与pEM质粒连接的基因片段。同时，使用BamHI和HindIII双酶切pEM质粒，得到载体片段。将基因片段与载体片段使用T4连接酶进行连接，得到重组质粒pEM-mhpR、pEM-marR、pEM-higA、pEM-rpoH、pEM-marA。引物见下表：
表3引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| mhpR-f | CACCATCACGGATCCATGCAGAACAATGAGCAGACGG |
| mhpR-r | CCAGACTCGAGAAGCTTTCAACGTAAATGCATGCCGC |
| marR-f | CACCATCACGGATCCGTGAAAAGTACCAGCGATCTGTTC |
| marR-r | CAGACTCGAGAAGCTTTTACGGCAGGACTTTCTTAAGC |
| higA-f | CACCATCACGGATCCATGATTGCGATTGCCGACATC |
| higA-r | CCAGACTCGAGAAGCTTTTAATCAATAAACAAGGCGGGAG |
| rpoH-f | CACCATCACCATCACGGATCCATGACTGACAAAATGCAAAGTTTAGC |
| rpoH-r | CTTTACCAGACTCGAGAAGCTTTTACGCTTCAATGGCAGCAC |
| marA-f | CACCATCACCATCACGGATCCATGTCCAGACGCAATACTGACG |
| marA-r | GTTTAGGCTCGAGAAGCTTCTAGCTGTTGTAATGATTTAATG |
注：下划线所示为酶切位点
将获得的重组质粒以及pEM空质粒分别导入E.coli JNYPQ菌株中获得重组菌株PHE0(pEM)、PHE1(mhpR)、PHE2(marR)、PHE3(higA)、PHE4(rpoH)、PHE5(marA)。进一步对获得的重组菌株进行L-苯丙氨酸耐受性评价，检测了上述重组菌株与对照菌株PHE0在37℃下，30g/L L-苯丙氨酸中耐受12h的死亡率情况与生长情况(图1)。
结果如图1所示：PHE5在30g/L L-苯丙氨酸胁迫12h后死亡率最低，仅为27.96％。相比携带pEM空质粒的重组菌株株PHE0(pEM)降低了64.16％；OD600值为11.32，与PHE0相比提高44.02％；PHE1(mhpR)、PHE2(marR)也一定程度上可以有效降低死亡率。说明过表达marA、mhpR或marR可以降低菌株在高浓度苯丙氨酸中的死亡率。
死亡率：使用流式细胞仪检测样品中细胞膜破损的细胞数量百分比。
实施例2：生产L-苯丙氨酸重组菌株的构建
(1)重组质粒pEM-marA-aroA-aroD-tyrB的构建
以E.coli JNYPQ的基因组DNA为模板，用引物aroA-f和引物aroA-r进行PCR扩增，得到带有Pj23110启动子的aroA基因；用引物aroD-f和引物aroD-r进行PCR扩增，得到带有Pj23108启动子的aroD基因；用引物tyrB-f和引物tyrB-r进行PCR扩增，得到带有Pj23104启动子的tyrB基因。
以实施例1构建的重组质粒pEM-marA为模板，使用引物pEM-f1和pEM-r1进行反向PCR，获得带有同源臂的pEM-marA片段，与aroA基因片段进行同源重组，得到重组质粒pEM-marA-aroA。
以重组质粒pEM-marA-aroA为模板，使用引物pEM-f2和pEM-r2进行反向PCR，获得带有同源臂的pEM-marA-aroA片段，与aroD基因片段进行同源重组，得到重组质粒pEM-marA-aroA-aroD。
以重组质粒pEM-marA-aroA-aroD为模板，使用引物pEM-f3和pEM-r3进行反向PCR，获得带有同源臂的pEM-marA-aroA-aroD片段，与tyrB基因片段进行同源重组，得到重组质粒pEM-marA-aroA-aroD-tyrB。
(2)重组质粒pACYC177-CI-aroF-pheAfbr-yddG质粒的构建
以E.coli JNYPQ的基因组DNA为模板，用引物yddG-f和引物yddG-r进行PCR扩增，得到带有Pj23101启动子的yddG基因。
以实验室已有的重组质粒pACYC177-CI-aroF-pheAfbr(公开于公开号为CN116656581A的中国专利申请文件中，具体构建步骤也完整公开)为模板，使用引物pACYC177-f和pACYC177-r进行反向PCR，获得带有同源臂的片段，与yddG基因片段进行同源重组，得到重组质粒pACYC177-CI-aroF-pheAfbr-yddG。
(3)重组菌株的构建
先将步骤(1)制备得到的pEM-marA-aroA-aroD-tyrB质粒导入菌株E.coli JNYPQ的感受态细胞中，采用含有Amp抗性LB平板筛选得到阳性转化子。再将获得的阳性转化子制成感受态细胞，并导入重组质粒pACYC177-CI-aroF-pheAfbr-yddG，采用含有Amp抗性和Kana抗性的LB平板筛选得到阳性转化子，分别使用引物pEM-F、pEM-R和pACYC177-F、pACYC177-R，送至苏州金唯智生物科技有限公司对两个质粒进行测序。测序成功即成功构建重组菌株。将该菌株命名为E.coli PHE。
测定重组菌株E.coli PHE的L-苯丙氨酸中耐受性，该菌株在37℃下，30g/L L-苯丙氨酸中耐受12h的死亡率为29％。
表4引物序列
注：下划线所示为启动子。
实施例3：菌株发酵生产L-苯丙氨酸
(1)L-苯丙氨酸具体上罐流程：冷冻甘油管重组菌株E.coli PHE→斜面活化→摇瓶一级种子→摇瓶二级种子→发酵罐发酵。
(2)斜面培养：将甘油管中菌体在新鲜斜面培养基中划线进行活化，37℃恒温培养24h左右。
(3)一级摇瓶种子培养：用接种环在斜面挑菌，接种于装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，往复式摇床180rpm/min，33℃培养10-11h左右，OD600值在11-12之间。
(4)二级摇瓶种子培养：将一级种子取5mL接种于装有45mL种子培养基的500mL三角瓶中，往复式摇床180rpm/min，33℃恒温培养3-4h左右，OD600值在15-16之间。
(5)发酵罐发酵：将二级种子按照接种量10％(v/v)接种至含有2.8L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵初始条件：温度33℃，pH 7.0，风量1m3/h，溶氧维持在30-50％，初始转速400rpm/min。当OD600达到20后，温度提升至38℃，转速每30min提升50rpm/min，直至提升至750rpm/min。流加氨水维持pH在7.0±0.2。每4h检测一次残糖，在0-8h之间，残糖控制在1g/L以下；在8-36h之间，残糖控制在2-3g/L；在36-48h之间，残糖控制在1g/L及以下。
结果表明，采用本实施例的方法对菌株E.coli PHE发酵生产L-苯丙氨酸，经过48h，L-苯丙氨酸产量可以达到89g/L，发酵终点菌体死亡率为32％(图2)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种增加菌株对高浓度L-苯丙氨酸耐受性的方法，其特征在于，所述方法为在菌株中过表达DNA结合转录因子；所述DNA结合转录因子包括DNA结合转录双调节因子基因marA、DNA结合转录激活因子基因mhpR和DNA结合转录抑制因子基因marR。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株以大肠杆菌为宿主细胞。
3.一株生产L-苯丙氨酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株耐受高浓度L-苯丙氨酸，所述重组菌株过表达DNA结合转录双调节因子基因marA。
4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株过表达3-磷酸莽草酸-1-羧乙烯基转移酶基因aroA，3-脱氢奎尼酸脱水酶基因aroD，酪氨酸转氨酶基因tyrB，3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因aroF，分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheAfbr，芳香族氨基酸外排蛋白基因yddG。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株利用pEM质粒携带基因marA，基因aroA，基因aroD和基因tyrB。
6.根据权利要求4或5所述的重组菌株，其特征在于，利用携带有基因aroF，基因pheAfbr的质粒pACYC177-CI-aroF-pheAfbr表达基因yddG。
7.根据权利要求3～6任一所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株以大肠杆菌为宿主细胞。
8.一种改造L-苯丙氨酸生产菌株的方法，其特征在于，所述方法提高L-苯丙氨酸的产量，所述方法为在L-苯丙氨酸生产菌株中过表达DNA结合转录双调节因子基因marA；可选的，所述方法为在L-苯丙氨酸生产菌株中过表达3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因aroA，3-脱氢奎尼酸脱水酶基因aroD，酪氨酸转氨酶基因tyrB，3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因aroF，分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheAfbr，芳香族氨基酸外排蛋白基因yddG。
9.一种生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，将权利要求3～7任一所述重组菌株加入发酵体系中进行发酵。
10.权利要求3～7任一所述重组菌株或权利要求8所述方法在生产L-苯丙氨酸或含有L-苯丙氨酸的产品中的应用。
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