CN114438004B

CN114438004B - 一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株及其构建方法与应用

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Publication number: CN114438004B
Application number: CN202111528866.6A
Authority: CN
Inventors: 夏立秋; 胡金娟; 何昊城; 丁学知
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2041-12-14
Also published as: CN114438004A

Abstract

一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株及其构建方法与应用，该菌株为须糖多孢菌S.pogona‑pII，于2021年6月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC M 2021706 PII。其构建方法为，在野生型须糖多孢菌的基础上，构建pOJ260‑PkasO‑pII重组质粒，利用接合转移的方法将重组质粒导入须糖多孢菌中。将该须糖多孢菌S.pogona‑pII用于合成丁烯基多杀菌素，其产量明显高于野生型菌株，为野生型菌株丁烯基多杀菌素产量的245%。

Description

一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一株须糖多孢菌工程菌株及其构建方法与应用，尤其涉及一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术

我国是一个农业大国，农业发展粮食增产是关乎民生的大事，但农业生产常遭受到各种农业病害虫的干扰。使用化学杀虫剂减小农业病害虫是常用的农场作业手段，然而，持续性使用化学杀虫剂会使害虫产生抗药性，残留的化学农药也会导致环境污染。

氮源是一种对微生物的生长发育至关重要的营养成分，如何吸收和有效利用氮源对微生物来说非常重要。不同来源的氮源经同化作用形成了谷氨酰胺和谷氨酸这两种重要的氨基酸。放线菌的营养生长也需要氮源。氮源不仅是大分子物质（如蛋白质、核酸和细胞壁成分）合成的基础，并且在许多抗生素的分子结构中都存在氮原子，它们通常都是由含氮的初级代谢产物衍生而来，表明氮源在菌株生长稳定期时，也参与了多种次级代谢产物的生物合成。

PII信号转导蛋白由pII基因编码，其广泛存在于自然界的细菌以及绿色植物叶绿体中，并且在氮调节中发挥核心作用，是自然界中最大的信号蛋白家族之一，具有极高的序列保守性。PII蛋白在许多细菌中随着氮同化步骤的变化会表现出不同的转录水平。PII蛋白家族中的GlnK不但是天蓝色链霉菌中重要的氮水平传感器，也是细胞形态分化和次生代谢产物的调节剂，它的缺失会对气生菌丝和孢子的形成产生影响，并造成抗生素产量下降。PII蛋白与其他蛋白质的相互作用经常需要T环的参与，由于环是可变的，因此它可以在不同条件下与不同的靶蛋白相互作用。PII蛋白可以通过共价修饰传递细胞谷氨酰胺状态的信号并调节谷氨酰胺合成酶的活性和合成。PII蛋白还可以感知ATP/ADP和ɑ-酮戊二酸等细胞指示剂的浓度变化，从而协调细胞碳/氮平衡，并与代谢途径中的许多关键蛋白相互作用。因此，PII蛋白在细胞代谢的全局调控中起着至关重要的作用。

丁烯基多杀菌素是由须糖多孢菌经好氧发酵产生的一种兼具化学农药高效性和生物农药安全性的新型杀虫剂，其见光易分解，对生态环境具有保护作用，同时还可用于粮食储藏。但是野生型须糖多孢菌存在发酵周期长，丁烯基多杀菌素产量低且发酵液中副产物多的问题，极大的限制了丁烯基多杀菌素的大规模工业生产，推迟了其在农业生产上的推广应用。因此选择合适的靶基因或基因簇，对须糖多孢菌基因组进行定向改造，提高丁烯基多杀菌素的产量，研发出高效价的丁烯基多杀菌素杀虫剂，是当前亟需攻克的难题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株丁烯基多杀菌素产量高的pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株。

本发明进一步要解决的技术问题是，提供一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株的构建方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株，为须糖多孢菌S. pogona-pII（Saccharopolyspora pogona-pII），2021年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2021706 PII。

进一步，所述pII基因，克隆自须糖多孢菌基因组，其序列如下：

ATGAAACTGG TGACCGCGAT CGTTCAACCG TCCAAACTGG ACGACGTGAA 50

GGACGCGCTG GAGCGGCTCG GGGTGCTGGG CATGACCGTC AGCCAGACGC 100

AGGGCTACGG CCGCCAGAAG GGCCACACGG AGGTGTACCG GGGCGCCGAG 150

TACGCGGTGG ACTTCATCGA GAAGCTGCGG GTCGAGGTCC TCGTCGACGA 200

GTCCAACGTG GACAAGGTGG TCGACGGGAT CGTTACCGCC GCGCGCACCG 250

GCCGGGTCGG CGACGGCAAG GTCTGGGTGA CCTCGGTGGA CACCGTGGTC 300

CGGGTGCGCA CCGGAGAAAC CGGGGTCGAG GCGATCTGA 339

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株的构建方法，通过构建pOJ260-P _kasO-pII重组质粒，利用接合转移的方法将重组质粒导入须糖多孢菌中，即获得一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株。

进一步，所述pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株的构建方法，包括下列步骤：

（1）以野生型须糖多孢菌NRRL 30141基因组为模板，扩增pII基因，得pII基因片段；

（2）通过重叠延伸PCR将P _kasO启动子和步骤（1）所得的pII基因片段进行融合，再将P _kasO -pII融合片段和pOJ260质粒进行酶连，得重组质粒pOJ260-P _kasO -pII；

（3）将步骤（2）所得的重组质粒pOJ260-P _kasO -pII导入须糖多孢菌中，即得pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株。

进一步，步骤（3）中，在获得所述pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株（须糖多孢菌S. pogona-pII）后，进行PCR鉴定，表型分析及对丁烯基多杀菌素合成的影响，通过质谱鉴定工程菌株的差异蛋白，绘制pII基因参与须糖多孢菌生长发育调控的代谢途径。

进一步，所述野生型须糖多孢菌NRRL 30141基因组的序列已上传NCBI，序列号为MF179666。

进一步，所述pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明使用的菌株、质粒和引物的进一步详细描述见表1。

将所述pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株用于合成丁烯基多杀菌素，研究发现，其产量明显高于野生型菌株，为野生型菌株丁烯基多杀菌素产量的245 %。

本发明原理：PII蛋白可以感知α-酮戊二酸的浓度变化，进而调控相关氨基酸的代谢，本发明在野生型须糖多孢菌的基础上，通过构建pOJ260-P _kasO -pII重组质粒，利用接合转移的方法将重组质粒导入须糖多孢菌中，在本发明须糖多孢菌S. pogona-pII菌株中实现PII蛋白超量表达，引起谷氨酸代谢相关酶水平提高，促进了α-酮戊二酸、谷氨酸和谷氨酰胺之间的转换合成，使得细胞内氨基酸水平提高以及积累了更多前体物质，进一步影响菌体生长发育、孢子萌发及丁烯基多杀菌素的合成，因此其丁烯基多杀菌素产量大幅提升。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明在野生型须糖多孢菌的基础上，通过构建pOJ260-P _kasO -pII重组质粒，利用接合转移的方法将重组质粒导入须糖多孢菌中，获得了一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株S. pogona-pII，将其进行PCR鉴定，结果表明，须糖多孢菌工程菌株S. pogona-pII（以下简称为“S. pogona-pII”）构建成功；

（2）通过高效液相色谱仪检测发现，本发明菌株S. pogona-pII中的丁烯基多杀菌素产量明显高于野生型菌株，为野生型菌株丁烯基多杀菌素产量的245 %，同时使用工程菌株S. pogona-pII的发酵液处理棉铃虫，结果表明，棉铃虫的存活率下降，对棉铃虫的半致死天数较野生型菌株的发酵液缩短了0.65天；

（3）通过实时荧光定量PCR，结果显示，本发明S. pogona-pII中丁烯基多杀菌素生物合成基因簇上bus类基因的表达量显著上调；通过表型分析发现，本发明工程菌株S. pogona-pII的生物量略有增高，总体生长趋势及葡萄糖消耗能力与野生型菌株一致；通过扫描电子显微镜观察菌丝体的形态图显示，本发明工程菌株S. pogona-pII的菌丝体表面光滑，呈细长的分支链状；通过提取本发明工程菌株S. pogona-pII和野生型菌株的全蛋白进行差异蛋白分析，发现pII基因通过影响菌体中氨同化途径中关键酶的表达量，影响菌体内氨基酸循环以及前体物质的积累，从而进一步影响菌体的生长发育和丁烯基多杀菌素的合成水平。

微生物菌种保藏情况说明

本发明pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株，即须糖多孢菌S. pogona-pII，拉丁学名：Saccharopolyspora pogona-pII，于2021年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学)，菌种保藏号为CCTCC M 2021706 PII。

附图说明

图1为本发明重组质粒pOJ260-PkasO-pII的构建示意图。

图2 为本发明重组质粒pOJ260-PkasO-pII的构建验证图

图3为本发明工程菌株S. pogona-pII的构建示意图。

图4为本发明工程菌株S. pogona-pII的构建验证图。

图5为Western Blot检测菌株S. pogona和本发明菌株S. pogona-pII中PII蛋白表达图，图中：M：预染蛋白Marker；1：S. pogona；2：S. pogona-pII；3：S. pogona-ΔpII。

图6为菌株S. pogona和本发明菌株S. pogona-pII的生长曲线图。

图7为菌株S. pogona和本发明菌株S. pogona-pII的葡萄糖消耗曲线图。

图8为菌株S. pogona和本发明菌株S. pogona-pII菌丝体的扫描电镜观察图，图中：A.野生型菌株；D. S. pogona-pII过表达菌株。

图9为高效液相色谱13 min洗脱液的LC-MS/MS分析图。

图10为菌株S. pogona和本发明菌株S. pogona-pII丁烯基多杀菌素累积图。

图11为菌株S. pogona和本发明菌株S. pogona-pII丁烯基多杀菌素产量比较图。

图12为菌株S. pogona和本发明菌株S. pogona-pII中bus类基因转录水平图。

图13为菌株S. pogona和本发明菌株S. pogona-pII菌株发酵液处理下的棉铃虫生存曲线图。

图14为本发明菌株S. pogona-pII中pII基因参与的代谢网络调控图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明具体实施方式中使用的菌株、质粒和引物的相关描述及序列见表1。

（一）培养基配方及菌株培养条件

（1）LB培养基（100 mL）：将Yeast extract 0.5 g，Tryptone 1 g和NaCl 1 g混合，用超纯水定容至100 mL，调节溶液pH 值为7.0，固体培养基中则加入1.6 g琼脂粉，在121℃高压蒸汽灭菌20 min，备用；

（2）CSM链霉菌活化培养基（100 mL）：将TSB 4.5 g，Glucose 1 g，Yeast extract0.9 g和MgSO₄•7H₂O 0.22 g混合，用超纯水定容至100 mL，固体培养基中则加入1.6 g琼脂粉，115℃高压蒸汽灭菌30 min，备用；

（3）TSB培养基（100 mL）：Tryptic Soy Broth 3 g，用超纯水定容至100 mL，固体培养基中则加入1.6 g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20 min，备用；

（4）BHI固体培养基（100 mL）：将Brain Heart Infusion 3.7 g和琼脂粉1.6 g混合，用超纯水定容至100 mL，121℃高压蒸汽灭菌20 min，备用；

（5）接合转移采用R6培养基（1 L）：将Sucrose 200 g，BHI 26 g，Dextrin 10 g，Casamino acid 1 g，K₂SO₄0.1 g，FeSO₄•7H₂O 0.1 g，MgSO₄•7H₂O 0.05 g，MnCl₂•4H₂O0.001 g，ZnSO₄•7H₂O 0.001 g和琼脂粉1.6 g混合，用超纯水定容，按100 mL/瓶分装到三角瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30 min，备用；使用时在超净工作台中加入过滤除菌的1 mol/LMOPS溶液 1 mL、5 mol/L CaCl₂ 溶液1 mL和3.25 mol/L L-Sodium Glutamate 溶液2 mL；

（6）合成发酵培养基（1 L）：将Glucose 20 g，Tryptone 4 g，Yeast extract 4 g，KNO₃ 1 g，MgSO₄•7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄•3H₂O 0.5 g和FeSO₄ 0.01 g混合，用超纯水定容至1L，调节溶液pH 值为7.2，按50 mL/瓶分装到三角瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30 min，备用。

大肠杆菌（Escherichia coli）的培养方式：将菌种保藏液从-80℃超低温冰箱取出，在冰上化冻，在超净工作台内取10 μL菌液在LB培养基上进行划线培养过夜，挑取单个菌落接种到20 mL LB液体培养基中进行培养，转速为240 r/min，培养时间、添加抗生素种类和培养温度依据导入载体的类型所定。

须糖多孢菌（Saccharopolyspora pogona）的培养方式：将菌种保藏液从-80℃低温冰箱取出在冰上化冻，在超净工作台内取10 μL菌液在CSM固体培养基上进行划线，30℃培养两天，挑取单菌落至CSM液体培养基中，转速为280 r/min，30℃培养2天。

（二）重组质粒pOJ260-PkasO-pII的构建

（1）以野生型须糖多孢菌基因组为模板，设计引物对pII-F/pII-R，利用PCR扩增pII基因片段，同时以pOJ260-P _kasO质粒为模板，设计引物对PkasO-F/PkasO-R，利用PCR扩增P _kasO启动子，引物序列见表1；

（2）通过重叠延伸PCR将启动子和pII基因片段进行融合，得到融合片段P _kasO -pII；

（3）用Hind III/EcoR I快切酶分别将pOJ260-P _kasO质粒和融合片段进行双酶切，纯化回收目的片段用T4 DNA连接酶将质粒和融合片段按比例酶连过夜；

（4）将酶连产物加入到E. coli DH5α感受态中进行热激转化，选取抗性板上的转化子扩大培养，提取质粒进行单、双酶切和PCR验证及测序，得含有重组质粒pOJ260-P _kasO - pII的E. coli DH5α（参见图1和图2）；

（5）通过电击转化的方式，将重组质粒导入到E. coli S17中，选取抗性板上的转化子进行单、双酶切和PCR验证，得到含有重组质粒pOJ260-P _kasO -pII的E. coli S17。

PCR扩增方法为降落PCR（Touch down PCR），扩增程序为：95℃预变性 5 min，95℃变性30 s，TM+5℃开始退火30 s，72℃延伸（酶的扩增效率为1 kb/1 min），10个循环，每循环一次退火温度就下降1℃；循环结束后，开始常规扩增95℃变性 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸（时间同上），20个循环；最后72℃延伸10 min。

（三）须糖多孢菌S. pogona-pII的构建

须糖多孢菌和大肠杆菌的属间接合转移：

（1）第1天：将野生型须糖多孢菌进行活化；

（2）第3天：取含有重组质粒的E. coli S17菌株菌保按1 %的接种量接种于LB 液体培养基中，220 r/min，振荡培养过夜；

（3）第4天：取200 μL E. coli S17菌液转接到20 mL LB液体培养基中，取4 mL须糖多孢菌菌液转接到20 mL TSB液体培养基中；两种菌株同时培养6 h，使其生长水平均达到对数期，将两种菌液分别倒入50 mL离心管中，9000 r/min离心10 min，弃上清液；用20mL TSB培养基悬浮清洗菌体2遍后，用少量的TSB培养基重悬菌体，按照E. coli S17：须糖多孢菌为1:3的比例均匀混合菌液，涂布于不添加任何抗生素的R6固体培养基上，待菌液吹干后，将平板于30℃恒温培养基倒置培养16 h；

（4）第5天：将10 μL阿泊拉霉素和20 μL萘啶酮酸加入1 mL无菌水中，吹打混匀后覆盖于R6固体培养基上，在超净工作台内吹干液体后，将平板于30℃恒温培养箱倒置培养10天，等待板上长出白色的接合子。

工程菌株的验证：

将pOJ260-P _kasO -pII过表达质粒通过电击转化的方式导入到E. coli S17菌株中，作为接合转移的供体菌与野生型须糖多孢菌进行属间接合转移实验。根据同源重组的原理，将质粒整合到野生型须糖多孢菌基因组上，对平板上的转化子进行扩大培养并提取基因组（参见图3）。以野生型菌株和转化子基因组为模板，设计引物对PkasO-F/pII-R进行PCR验证。跑胶结果如图4所示，以野生型菌株基因组为模板的泳道无任何条带，以转化子基因组为模板的泳道成功扩增出约900 bp的融合片段，表明须糖多孢菌S. pogona-pII过表达菌株构建成功。

（四）Western Blot进一步检测工程菌株的验证：

首先构建了PII蛋白的异源表达载体；然后利用IPTG对目的蛋白进行诱导表达，经过SDS-PAGE检测发现，目的蛋白在上清液中表达；接着使用含有不同浓度咪唑的缓冲液对蛋白样品进行纯化，收集洗脱液进行SDS-PAGE检测后，发现当缓冲液中咪唑浓度为250 mM时样品中无明显杂蛋白，纯化效果最好；最后使用纯化蛋白样品免疫小鼠，制备抗体，通过WB检测，发现在过表达菌株中，目的蛋白表达量有不同程度的上调，这进一步验证了工程菌株的构建（参见图5）。

（五）pII基因加倍对S. pogona生长发育的影响

（1）对菌株生长曲线的影响

为了分析工程菌株的生长周期与野生型须糖多孢菌的异同，将S. pogona-pII工程菌株和野生型须糖多孢菌进行活化和发酵。每隔24 h取一次发酵液，利用分光光度计测定发酵液OD₆₀₀的吸光值，绘制菌株的生长曲线图。如图6所示，过表达工程菌株S. pogona- pII的生物量略有增加，但总体生长趋势与野生型菌株一致。

（2）对菌株在合成发酵培养基中对葡萄糖利用能力的影响

为了探究工程菌株S. pogona-pII与野生型菌株消耗葡萄糖能力的差别，通过3,5-二硝基水杨酸比色法测定发酵液中的葡萄糖含量，将野生型菌株和S. pogona-pII工程菌株进行活化和发酵。每隔24 h取一次发酵液，利用紫外分光光度计测定发酵液OD540的吸光值，绘制菌株的葡萄糖消耗图。如图7所示，研究发现，在0-48 h时，S. pogona-pII菌株消耗葡萄糖的能力比野生型菌株较弱，但是在48-96 h时，S. pogona-pII菌株消耗葡萄糖的速率明显加快，培养基中葡萄糖被大量利用。

（3）pII基因对菌丝体形态的影响

收集菌株发酵培养第2天的菌体沉淀，用超纯水洗涤菌体沉淀15次，加入600 μL2.5 %戊二醛固定液悬浮菌体沉淀，然后将混合液避光放置于4℃冰箱过夜。继续收集菌体沉淀，将沉淀依次用30 %、50 %、70 %乙醇溶液进行脱水处理，每个浓度处理时间为2 min，用70 %乙醇溶液悬浮菌体；最后利用扫描电子显微镜观察不同菌株的形态差异。如图8所示，研究发现，须糖多孢菌S. pogona-pII过表达菌株菌丝体发育状态良好，菌丝体表面光滑，呈细长的分支链状。

（六）pII基因加倍对丁烯基多杀菌素生物合成的影响

（1）pII基因对丁烯基多杀菌素产量的影响

取工程菌株1-10天的发酵液各1 mL，加入等体积乙酸乙酯充分混匀，将混合液在65℃水浴锅中放置1 h，15000 r/min离心5 min，吸取750 μL上清液至新的EP管中，冷冻离心干燥后加入50 μL甲醇充分溶解管底沉淀，15000 r/min 离心5 min，取35 μL上清进行色谱分析。用相同的处理方法处理野生型菌株的发酵液作为原始对照。每个样品进行三次平行试验，收集目的峰进行质谱鉴定。

检测参数：利用Agilent 1290高效液相色谱仪检测发酵液中丁烯基多杀菌素的产量，色谱柱ZORBOX SB-C18，填料粒度5μm，柱内径4.6 mm，柱长150 mm；柱温40℃。将色谱级乙腈和超纯水混合制成流动相A（乙腈：水为10：90），流动相B（乙腈：水为90：10），流速1 mL/min；检测波长为250 nm；进样体积为20μL。

质谱结果显示，保留时间为13 min的特征峰，含有分子量为632[M+H]+（m/z）的MS母离子峰，二级质谱中包括分子量为189 [M+H]+（m/z）的三甲基鼠李糖特征碎片离子峰（丁烯基多杀菌素特征离子）,由此可确定该物质为丁烯基多杀菌素，根据文献内容进行比对，最终确认该物质为spinosyn β（参见图9）。

绘制累积曲线如图10所示，须糖多孢菌S. pogona-pII过表达菌株丁烯基多杀菌素的合成水平大幅提高，在第3天时，就开始积累丁烯基多杀菌素，在第5天时，丁烯基多杀菌素就开始大量累积，其产量是野生型菌株的245%（参见图11），说明增加pII基因拷贝数可以提高工程菌株中丁烯基多杀菌素的生物合成水平，同时缩短发酵周期。

（2）基于实时荧光定量PCR检测基因转录水平的表达

收集工程菌株和野生型菌株沉淀提取RNA，通过逆转录得到cDNA作为模板，以16SrRNA基因作为内参，每个样品设置4个重复。设计引物对进行qRT-PCR实验检测不同菌株中bus类基因的转录水平。如图12所示，在须糖多孢菌S. pogona-pII过表达菌株中，bus类基因的表达量明显上调，说明pII基因可以通过影响有关丁烯基多杀菌素生物合成基因簇上相关基因的转录水平来直接影响丁烯基多杀菌素的合成。

（3）须糖多孢菌S. pogona-pII工程菌株杀虫活性测定

将工程菌株和野生型菌株在半合成发酵培养基中发酵第10天的菌液与棉铃虫饲料进行搅拌，均匀地添加到24孔板中，并在每一个孔中添加一条棉铃虫。以不添加任何发酵液的饲料作为空白对照，每个处理设置三组平行，观测棉铃虫每天的存活率绘制生存曲线并计算棉铃虫半致死天数（LT₅₀）。结果显示，在整个生存测试验过程中，在棉铃虫生长前期野生型菌株和工程菌株处理组中棉铃虫存活状况相似，但在第2天之后，S. pogona-pII过表达菌株发酵液处理组棉铃虫的存活率显著下降，并且对照组棉铃虫生长情况良好（参见图13）。与野生型菌株相比，须糖多孢菌S. pogona-pII过表达菌株的LT₅₀值0.65天（参见表2）。由此可见，增加pII基因的拷贝数可以缩短棉铃虫死亡的半致死天数，并提高工程菌株发酵液的杀虫活性。

（七）须糖多孢菌S. pogona-pII工程菌株差异蛋白分析

收集第4天野生型菌株和pII基因工程菌株发酵的菌液进行菌体全蛋白提取，定量后进行SDS-PAGE检测，挖取表达差异明显的条带进行LC-MS/MS鉴定后，进行KEGG、Uniprot等数据库进行功能分析，发现了包括谷氨酰胺合成酶腺苷酸转移酶（GlnE），多核苷酸磷酸化酶（Pnp），谷氨酰胺合成酶（GlnA），分子伴侣蛋白GroEL（GroEL）和铁存储蛋白（BfrB）在内的五个具有明确功能的蛋白（参见表3）。

谷氨酰胺合成酶GS（GlnA）是生物氮同化的关键酶之一，能够催化谷氨酸生成谷氨酰胺；同时谷氨酰胺合成酶腺苷酸转移酶（GlnE）的调节区可以和PII信号转导蛋白相结合，通过PII指示细胞的氮水平，参与谷氨酰胺合成酶活性的调控。当细胞氮水平较高时，通过将腺苷基转移到谷氨酰胺合成酶上降低其活性。相反，当细胞氮含量较低时，就会通过水解腺苷酸基团来提高谷氨酰胺合成酶的活性。

bfrB基因编码细菌铁蛋白，具有铁氧化酶活性，能催化Fe²⁺离子氧化为Fe³⁺离子。由于PII蛋白可以感知α-酮戊二酸的浓度变化，在本发明须糖多孢菌S. pogona-pII菌株中PII蛋白超量表达，引起谷氨酸代谢相关酶水平提高，促进了α-酮戊二酸、谷氨酸和谷氨酰胺之间的转换合成，使得细胞内氨基酸水平提高以及积累了更多前体物质，因此其丁烯基多杀菌素产量大幅提升。分子伴侣蛋白（GroEL）是一类伴侣蛋白，可以促进蛋白质进行正确折叠，并且促使未折叠的多肽进行重新折叠。pnp基因编码多核苷酸磷酸化酶，可以催化ADP等转化为ATP为细胞的生长提供能量。

综上所述，pII基因通过影响须糖多孢菌S. pogona-pII氨同化途径中关键酶的表达量，从而影响菌体内氨基酸循环以及前体物质的积累，进一步影响菌体生长发育、孢子萌发及丁烯基多杀菌素的合成。同时，本发明初步构建了pII基因参与须糖多孢菌生长发育及丁烯基生物合成的代谢调控网络图（参见图14）。

表1 本发明所用菌株、质粒和引物的相关描述

表2 S. pogona和须糖多孢菌S. pogona-pII菌株发酵液对棉铃虫杀虫活性测定

表3 S. pogona和须糖多孢菌S. pogona-pII菌株差异蛋白质谱鉴定

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株及其构建方法与应用

<141> 2021-12-14

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 339

<212> DNA

<213> 须糖多孢菌(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 1

atgaaactgg tgaccgcgat cgttcaaccg tccaaactgg acgacgtgaa ggacgcgctg 60

gagcggctcg gggtgctggg catgaccgtc agccagacgc agggctacgg ccgccagaag 120

ggccacacgg aggtgtaccg gggcgccgag tacgcggtgg acttcatcga gaagctgcgg 180

gtcgaggtcc tcgtcgacga gtccaacgtg gacaaggtgg tcgacgggat cgttaccgcc 240

gcgcgcaccg gccgggtcgg cgacggcaag gtctgggtga cctcggtgga caccgtggtc 300

cgggtgcgca ccggagaaac cggggtcgag gcgatctga 339

Claims

1.一株pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株，其特征在于，为须糖多孢菌S. pogona- pII（Saccharopolyspora pogona-pII），于2021年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2021706。

2.一种如权利要求1所述的pII基因加倍的须糖多孢菌工程菌株在合成丁烯基多杀菌素中的应用。