CN116515648A - 一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株、构建方法及其应用 - Google Patents

一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株、构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产ε‑聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株，所述基因工程菌株是以产ε‑聚赖氨酸链霉菌为底盘菌株，并进行如下之一改造：a)过表达二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF；b)过表达二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA。本发明通过在产ε‑聚赖氨酸链霉菌底盘菌株的基础上进行基因工程高改造，过表达影响ε‑聚赖氨酸合成的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA中的一个，获得ε‑聚赖氨酸及其盐酸盐高产链霉菌工程菌株并应用高产工程菌株发酵生产ε‑聚赖氨酸及其盐酸盐，显著降低了生产成本，为ε‑聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌种。

Description

一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株、构建方法 及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及构建基因工程菌株，尤其是一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株、构建方法及其应用。
背景技术
ε-聚赖氨酸(ε-Polylysine，ε-PL)是天然氨基酸同聚物，属于一种碱性聚酰胺，由25-35个L-赖氨酸残基通过ε-氨基和α-羧基形成酰胺键连接而成。因其具有热稳定性强及水溶性好、抑菌谱广和安全性高等优势，在食品、材料、医学等多个领域均有广泛的应用前景。
近些年，随着对于ε-聚赖氨酸应用潜能的挖掘，市场对于ε-聚赖氨酸的需求也在逐渐增大。但目前国内关于ε-聚赖氨酸生产方面的研究起步较晚，主要停留在ε-聚赖氨酸生产工艺的优化和ε-聚赖氨酸生产菌株的选育两个方面。如任喜东等建立了一种pH冲击策略发酵生产ε-聚赖氨酸，通过在发酵前期将pH控制在5.0，随后pH自然下降12h至pH 3.0左右后回调pH值为4.0左右的策略使得ε-聚赖氨酸产量达到54.7g/L(任喜东.小白链霉菌响应酸性pH高产ε-聚赖氨酸的生理解析[D].江南大学,2015.)；席志文等则通过ARTP和DES复合诱变的手段筛得了一株诱变高产菌株Streptomyces albulus AD-9，在摇瓶发酵水平AD-9较出发菌株的ε-聚赖氨酸产量提高了2.1倍(席志文,黄林娜,翟一畅,惠丰立.ARTP-DES连续诱变选育高产ε-聚赖氨酸突变株[J].食品科学,2020,41(14):131-137.)。其中，发酵工艺的优化虽提高了ε-聚赖氨酸的生产水平，但并未提高菌株自身的ε-聚赖氨酸合成能力，诱变育种则又存在着偶然性强、工作量大等问题。而对于ε-聚赖氨酸生产菌株代谢途径的定向改造则可在提高ε-聚赖氨酸生产能力的同时，又降低实验盲目性。但目前关于构建定向改造工程菌株提高ε-聚赖氨酸产量的研究则相对较少，尤其是未发现通过过表达DAP途径中关键酶提高ε-聚赖氨酸产量的相关报道。
通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的公开文献：
1、一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用(CN 105441373 A，申请日2015.12.4)，公开了一种小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD-4，它是将来源于S.albulus PD-1基因组上的铵转运蛋白基因amtB进行过量表达，通过提高氮源供给提高ε-聚赖氨酸发酵水平。
2、一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法(CN 110804572A，申请日2019.12.4)，公开了一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法，属于微生物发酵领域。它是通过对小白链霉菌(Streptomyces albulus)M-Z18进行浓度梯度的抗性筛选而产生的基因组重排菌株，发酵192h产量可达到56.3g/L，但基因组重排方法选育高产菌株存在工作量大，不确定性强的缺点。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献在工程菌株构建策略上有本质上的不同。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株、构建方法及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株，所述基因工程菌株是以产ε-聚赖氨酸链霉菌为底盘菌株，并进行如下之一改造：
a)过表达二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF；
b)过表达二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA。
进一步地，过表达的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF基因核苷酸序列与SEQID No.1具有84.4％及以上的一致性；
过表达的二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的核苷酸序列与序列SEQ ID No.3至少有83.8％以上的一致性；
或者，过表达的基因dapE、lysA是通过PCR技术扩增的，或者是直接合成的。
进一步地，所述底盘菌株为产ε-聚赖氨酸的链霉菌属菌株，包括小白链霉菌Streptomyces albulus、淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes、灰褐链霉菌Streptomycesgriseofuscus、不吸水链霉菌Streptomyces ahygroscopicus。
进一步地，优选底盘菌株为小白链霉菌Streptomyces albulus TUST2或淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 6#-7；
其中，Streptomyces albulus TUST2的保藏编号为CGMCC NO.1986，保藏日期为2007年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
Streptomyces diastatochromogenes 6#-7的保藏编号为CGMCC NO.22261，保藏日期为2021年4月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
如上所述的基因工程菌株的构建方法，所述方法采用的底盘为产生ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的链霉菌，过表达的是底盘菌株内源或外源的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA中的一个。
进一步地，所述方法在构建中使用的过表达质粒是带有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
(1)目的片段基因的获得：
根据二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF设计上下游引物序列dapF-F/dapF-R，即SEQ IDNo.5/SEQ ID No.6，以提取的S.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板，PCR扩扩增出带有同源臂dapF基因，全长879bp，dapF基因序列为SEQ ID No.1，或者根据外源龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯差向异构酶dapF基因序列即SEQ IDNo.2直接合成；
根据二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA设计上下游引物序列lysA-F/lysA-R即SEQID No.7/SEQ IDNo.8为上下游引物，以提取的S.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板，PCR扩增内源目的基因lysA，全长1143bp，lysA基因序列为序列SEQ ID No.3，或者根据外源龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯脱羧酶lysA基因序列即SEQ IDNo.4直接合成。
(2)重组质粒的构建：
将PCR扩增的或者直接合成的dapF或lysA基因片段与带有红霉素强启动子ermE*的线性质粒pIMEP进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP：：dapF或pIMEP：：lysA，利用化学法将构建好的重组载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，并通过安普霉素抗性筛选大肠杆菌DH5α阳性转化子，培养大肠杆菌DH5α阳性转化子，提取转化子中的重组质粒pIMEP：：dapF或pIMEP：：lysA，备用；
(3)工程菌株构建
重组质粒pIMEP：：dapF或pIMEP：：lysA分别转化至大肠杆菌ET12567(PUZ8002)中，涂布于含有12.5-25μg/mL卡那霉素、25-50μg/mL安普霉素和12.5-25μg/mL氯霉素的LB平板中，挑选大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温振荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600至0.4～0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；向贝纳特培养基上培养好的底盘菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下链霉菌底盘菌株孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180-200r/min振荡打断孢子链，过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下振荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集萌发孢子，用TES缓冲液重悬萌发孢子备用；
将制备的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞和萌发的链霉菌底盘菌株孢子分别等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及浓度为25mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养。
进一步地，每1L M3G培养基的组成为：
(NH4)2SO410 g，KH2PO41.36 g，K2HPO40.8 g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到900mL后121℃单独灭菌20min，每100mL M3G培养基使用前再添加10mL 10×葡萄糖母液；10×葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2mL20 g/L ZnSO4·7H2O和2mL 10g/LMgSO4·7H2O，用去蒸馏水定容至100mL后115℃单独灭菌30min。
或者，每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，加水补充至1L，NaOH调pH至7.7；
或者，每1L SFM培养基的组成为：
黄豆饼粉30g，甘露醇20g、琼脂粉20g，加水补充至1L，用NaOH调节pH 7.2～7.4；
其中，所述黄豆饼粉经过如下处理后使用：
加入900mL自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤。
一种利用如上所述的基因工程菌株发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法，包括如下步骤：
将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生孢子；然后，将孢子接种至含葡萄糖的M3G培养基摇瓶中，在28-30℃，180-220r/min，培养30h，将培养好的种子培养液转接到含葡萄糖的M3G培养基中进行发酵罐补料发酵，即获得含ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的发酵液，进而能够采用离心、吸附、洗脱、脱色、干燥进一步纯化即可得到ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐。
如上所述的基因工程菌株在发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明通过在产ε-聚赖氨酸链霉菌底盘菌株的基础上进行基因工程高改造，过表达影响ε-聚赖氨酸合成的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA中的一个，获得ε-聚赖氨酸及其盐酸盐高产链霉菌工程菌株并应用高产工程菌株发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐，显著降低了生产成本，为ε-聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌种。
2、本发明方法通过过表达关键酶二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA构建工程菌株S.diastatochromogenes dapF-1或S.diastatochromogenes lysA-1，分批补料发酵生产ε-聚赖氨酸，其ε-聚赖氨酸产量(g/L)分别为出发底盘菌株S.diastatochromogenes 6#-7的127.44％和130.38％；生产强度(g/L·h)分别为出发底盘菌株S.diastatochromogenes 6#-7的119.88％和160.47％；糖酸转化率分别为出发底盘菌株S.diastatochromogenes 6#-7的136.89％和105.51％，显著降低了生产成本，为ε-聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌种。
3、本发明方法通过过表达外源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA构建的工程菌株S.albulus dapF-2或S.albulus lysA-2，分批补料发酵生产ε-聚赖氨酸，其ε-聚赖氨酸产量(g/L)分别为出发底盘菌株Streptomycesalbulus TUST2的131.55％和136.38％；生产强度(g/L·h)分别为出发底盘菌株Streptomyces albulus TUST2的119.93％和159.29％；糖酸转化率分别为出发底盘菌株Streptomyces albulus TUST2的134.40％和103.93％，显著降低了生产成本，为ε-聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌种。
附图说明
图1中(A)为本发明中以出发菌淀粉酶产色链霉菌6#-7(Streptomycesdiastatochromogenes 6#-7)基因组为模板扩增带有同源臂的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF的PCR验证图；其中，泳道M：2Kb marker；泳道1：带同源臂的dapF基因；图1中(B)为pIMEP：：dapF质粒进行EcoR I单酶切验证图；其中，泳道M：10Kb marker；泳道1：pIMEP：：dapF质粒EcoR I单酶切验证；
图2为本发明中以质粒pIMEP为基础构建pIMEP：：dapF重组质粒的构建流程图；
图3中(A)为本发明中以出发菌淀粉酶产色链霉菌6#-7(Streptomycesdiastatochromogenes 6#-7)基因组为模板扩增带有同源臂的二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的PCR验证图；其中，泳道M：2Kb marker；泳道1：带同源臂lysA基因；图3中(B)为pIMEP：：lysA质粒进行EcoR I单酶切验证图；其中，泳道M：10Kb marker；泳道1：pIMEP：：lysA质粒EcoR I单酶切验证；
图4为本发明中以质粒pIMEP为基础构建pIMEP：：lysA重组质粒的构建流程图；
图5为本发明中以Streptomyces diastatochromogenes 6#-7作底盘构建的不同工程菌株5L发酵罐发酵生产ε-聚赖氨酸发酵参数比较图；其中，(A)为不同菌株5L发酵罐发酵生产ε-聚赖氨酸相对产量对比，(B)为不同菌株5L发酵罐发酵生产ε-聚赖氨酸的相对生产强度对比；(C)为不同菌株5L发酵罐发酵生产ε-聚赖氨酸的糖酸转化率对比；其中，6#-7为出发菌株S.diastatochromogenes 6#-7，dapF-1为采用底盘菌株Streptomycesdiastatochromogenes 6#-7过表达内源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF的高产工程菌S.diastatochromogenes dapF-1，lysA-1为采用底盘菌株Streptomycesdiastatochromogenes 6#-7过表达内源二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的高产工程菌S.diastatochromogenes lysA-1。
图6为本发明中以Streptomyces albulus TUST2作底盘构建的不同工程菌株5L发酵罐发酵生产ε-聚赖氨酸发酵参数比较图；其中，(A)为不同菌株5L发酵罐发酵生产ε-聚赖氨酸相对产量对比，(B)为不同菌株5L发酵罐发酵生产ε-聚赖氨酸相对生产强度对比，(C)为不同菌株5L发酵罐发酵生产ε-聚赖氨酸的糖酸转化率对比；其中，TUST2为出发菌株Streptomyces albulus TUST2，dapF-2为采用底盘菌株Streptomyces albulus TUST2过表达外源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF的高产工程菌S.albulus dapF-2，lysA-2为采用底盘菌株Streptomyces albulus TUST2过表达外源二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的高产工程菌S.albulus lysA-2。
具体实施方式
本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株，所述基因工程菌株是以产ε-聚赖氨酸链霉菌为底盘菌株，并进行如下之一改造：
a)过表达二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF；
b)过表达二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA。
较优地，过表达的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF基因核苷酸序列与SEQ IDNo.1具有84.4％及以上的一致性；
过表达的二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的核苷酸序列与序列SEQ ID No.3至少有83.8％以上的一致性；
或者，过表达的基因dapE、lysA是通过PCR技术扩增的，或者是直接合成的。
较优地，所述底盘菌株为产ε-聚赖氨酸的链霉菌属菌株，包括Streptomycesalbulus、Streptomyces diastatochromogenes、Streptomycesgriseofuscus、Streptomyces ahygroscopicus。
较优地，所述底盘菌株为Streptomyces albulus TUST2或Streptomycesdiastatochromogenes 6#-7；
其中，Streptomyces albulus TUST2的保藏编号为CGMCC NO.1986，保藏日期为2007年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
Streptomyces diastatochromogenes 6#-7的保藏编号为CGMCC NO.22261，保藏日期为2021年4月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
如上所述的基因工程菌株的构建方法，所述方法采用的底盘为产生ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的链霉菌，过表达的是底盘菌株内源或外源的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA中的一个。
较优地，所述方法在构建中使用的过表达质粒是带有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP。
较优地，所述方法包括如下步骤：
(1)目的片段基因的获得：
根据二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF设计上下游引物序列dapF-F/dapF-R，即SEQ IDNo.5/SEQ ID No.6，用试剂盒或常规方法提取S.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板，PCR扩扩增出带有同源臂dapF基因，全长879bp，dapF基因序列为SEQ ID No.1，或者根据外源龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯差向异构酶dapF基因序列即SEQ ID No.2(SEQ ID No.2与SEQ ID No.1具有84.4％的一致性)直接合成；
根据二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA设计引物序列lysA-F/lysA-R即SEQ IDNo.7/SEQ ID No.8为上下游引物，用试剂盒或常规方法提取S.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板，PCR扩增内源目的基因lysA,，全长1143bp，lysA基因序列为序列SEQ IDNo.3，或者根据外源龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯脱羧酶lysA基因序列即SEQ ID No.4(SEQ ID No.4与SEQ ID No.3有83.8％的一致性)直接合成；
基因序列及使用的引物序列如下：
Streptomyces diastatochromogenes内源的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF核苷酸序列为SEQ ID No.1；
Streptomyces rimosus的外源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF核苷酸序列为SEQ ID No.2；
引物dapF-F：其中下划线为EcoRΙ酶切位点，黑体为上游同源臂，SEQ ID No.5；
引物dapF-R：其中下划线为EcoRΙ酶切位点，黑体为下游同源臂，SEQ ID No.6；
Streptomyces diastatochromogenes内源二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的核苷酸序列为SEQ ID No.3；
Streptomyces rimosus外源二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA核苷酸序列为SEQID No.4；
引物lysA-F：其中下划线为EcoRΙ酶切位点，黑体为上游同源臂，SEQ ID No.7；
引物lysA-R：其中下划线为EcoRΙ酶切位点，黑体为下游同源臂，SEQ ID No.8。
(2)重组质粒的构建：
将PCR扩增的或者直接合成的dapF或lysA基因片段与带有红霉素强启动子ermE*的线性质粒pIMEP进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP：：dapF或pIMEP：：lysA，利用化学法将构建好的重组载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，并通过安普霉素抗性筛选大肠杆菌DH5α阳性转化子，培养大肠杆菌DH5α阳性转化子，提取转化子中的重组质粒pIMEP：：dapF或pIMEP：：lysA，备用。
(3)工程菌株构建：
重组质粒pIMEP：：dapF或pIMEP：：lysA分别转化至大肠杆菌ET12567(PUZ8002)中，涂布于含有12.5-25μg/mL卡那霉素、25-50μg/mL安普霉素和12.5-25μg/mL氯霉素的LB平板中，挑选大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温振荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600至0.4～0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；向贝纳特培养基上培养好的底盘菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下链霉菌底盘菌株孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180-200r/min振荡打断孢子链，过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下振荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集萌发孢子，用TES缓冲液重悬萌发孢子备用；
将制备的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞和萌发的链霉菌底盘菌株孢子分别等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含12.5-25μL浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及12.5-25μL浓度为25mg/mL的安普霉素的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养。
较优地，每1LM3G培养基的组成为：
(NH4)2SO410 g，KH2PO41.36 g，K2HPO40.8 g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到900mL后121℃单独灭菌20min，每100mL M3G培养基使用前再添加10mL 10×葡萄糖母液；10×葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2mL20 g/LZnSO4·7H2O和2mL 10g/LMgSO4·7H2O，用去蒸馏水定容至100mL后115℃单独灭菌30min。
或者，每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，加水补充至1L，NaOH调pH至7.7；
或者，每1L SFM培养基的组成为：
黄豆饼粉30g，甘露醇20g、琼脂粉20g，加水补充至1L，用NaOH调节pH 7.2～7.4；
其中，所述黄豆饼粉经过如下处理后使用：
加入900mL自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤。
一种利用如上所述的基因工程菌株发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法，包括如下步骤：
将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生孢子；然后，将孢子接种至含葡萄糖的M3G培养基摇瓶中，在28-30℃，180-220r/min，培养30h，将培养好的种子培养液转接到含葡萄糖的M3G培养基中进行发酵罐补料发酵，即获得含ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的发酵液，进而能够采用离心、吸附、洗脱、脱色、干燥进一步纯化即可得到ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐。
如上所述的基因工程菌株在发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐方面中的应用。
本发明中使用到的培养基配方可以如下：
M3G培养基：(NH4)2SO410 g，KH2PO41.36 g，K2HPO40.8 g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到900mL后121℃单独灭菌20min；10×葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2mL 20g/L ZnSO4·7H2O和2mL 10g/L MgSO4·7H2O，用去离子水定容至100mL后115℃单独灭菌30min(每100mL M3G培养基添加10mL 10×葡萄糖母液)。
贝纳特培养基：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，加水补充至1L，NaOH调pH 7.7。
SFM培养基：黄豆饼粉30g(黄豆饼粉经过如下处理后使用：加入900mL自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤)，甘露醇20g、琼脂粉20g，加水补充至1L，用NaOH调节pH 7.2～7.4。
下面结合实施例，更为具体地阐述本发明：
实施例1高产工程菌株S.diastatochromogenes dapF-1的构建。
实施例2高产工程菌株S.diastatochromogenes lysA-1的构建。
实施例3高产工程菌株S.albulus dapF-2的构建。
实施例4高产工程菌株S.albulus lysA-2的构建。
实施例5不同菌株发酵生产ε-聚赖氨酸。
采用底盘菌株Streptomyces diastatochromogenes 6#-7过表达内源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF的高产工程菌株命名为S.diastatochromogenes dapF-1；底盘菌株S.diastatochromogenes 6#-7过表达内源二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的高产工程菌株命名为S.diastatochromogenes lysA-1；底盘菌株Streptomyces albulus TUST2过表达外源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF的高产工程菌株命名为S.albulus dapF-2；底盘菌株Streptomyces albulus TUST2过表达外源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因lysA的高产工程菌株命名为S.albulus lysA-2。
实施例1高产工程菌株S.diastatochromogenes dapF-1的构建
(1)内源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF的获得
根据内源dapF基因设计引物序列dapF-F/dapF-R，采用单酶切同源重组的策略构建重组载体。在基因dapF两端均设计加入EcoRΙ的酶切位点，其中在dapF基因序列的上游引物5’端添加EcoRΙ的酶切位点和15-20个与出发载体pIMEP的EcoRΙ上游相同核苷酸，形成上游同源臂；在dapF基因核苷酸序列的下游引物5’端添加EcoRΙ的酶切位点和15-20个与出发载体pIMEP的EcoRΙ下游相同核苷酸，形成下游同源臂，上下游引物dapF-F/dapF-R详细序列分别见序列表SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；采用TaKaRa公司MiniBEST Bacteria GenomicDNA Extraction Kit Ver.3.0基因组提取试剂盒提取S.diastatochromogenes 6#-7的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增出带有同源臂S.diastatochromogenes 6#-7的dapF基因，全长879bp，详细dapF基因序列见序列表SEQ IDNo.1。得到带有同源臂的内源目的基因dapF，扩增的dapF基因经琼脂糖凝胶电泳检测大小正确，结果如图1(A)所示。
其中S.diastatochromogenes 6#-7的基因组DNA提取：S.diastatochromogenes6#-7孢子接种于M3G液体培养基中，30℃，180r/min条件下培养30h；用1.5mL离心管收集1mL的培养液，12000r/min离心2min，弃上清；加入500μL的BufferBS重悬细胞、加入50μL的Lysozyme(20mg/mL)，充分吸打混匀，于37℃水浴温育60min；12000r/min离心5min，弃上清；加入180μL的Buffer GL、20μL的Proteinase K(20mg/mL)和10μL的RNaseA(10mg/mL)，充分吸打混匀，于56℃水浴温育10min；加入200μL的Buffer GB和200μL的无水乙醇，充分混匀；将Spin Column安装在Collection Tube上，将混合溶液移至Spin Column中，12000r/min离心2min，弃滤液；将500μL的BufferWA加入至Spin Column中，12000r/min离心1min，弃滤液；将700μL的BufferWB加入至Spin Column中，12000r/min离心1min，弃滤液，重复用BufferWB洗涤一次；将Spin Column安置于Collection Tube上，12000r/min离心2min；将SpinColumn安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50～200μL的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5min，12000r/min离心2min洗脱基因组DNA。
其中PCR反应体系：2×phantamaxbuffer25μL，dNTP mixture(10mM)1μL，模板(20μg/mL)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，phantamax×Super-FidelityDNAPolymerase 1μL，补超纯水至50μL。
其中PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，55-65℃退火15s，72℃延伸30-90s，共循环25-35次，72℃彻底延伸5min，4℃结束反应。
(2)含有dapF的重组质粒pIMEP：：dapF构建
将PCR扩增的带有同源臂的dapF基因与经过EcoR I单酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的线性质粒pIMEP，利用同源重组酶进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP：：dapF。
其中，同源重组体系为：线性化载体质粒pIMEP 50-200ng，插入dapF基因片段50-200ng，5×CEⅡBuffer4μL，ExnaseⅡ2μL，补充超纯水至20μL。
同源重组条件：37℃反应30min，降至4℃。
pIMEP：：dapF重组质粒的构建示意图如图2所示。
(3)重组质粒pIMEP：：dapF的转化与验证
取连接产物重组质粒pIMEP：：dapF加入到在冰浴中的大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、100-200r/min振荡复苏45-60min。复苏后在12000r/min条件下离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有25-50μg/mL安普霉素的LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至转化子单菌落清晰可辨，挑取转化子单菌落至含有25-50μg/mL安普霉素的LB液体培养基中，37℃、180-200r/min振荡过夜，采用质粒提取试剂盒或常规碱裂解法提取转化子质粒，将提取的质粒进行EcoR I单酶切验证，经琼脂糖凝胶电泳检测大小正确，结果如图1(B)所示。对验证正确的大肠杆菌DH5α阳性转化子进行保藏。
(4)高产工程菌株S.diastatochromogenes dapF-1的获得
利用质粒接合转移的方法将重组质粒pIMEP：：dapF整合到淀粉酶产色链霉菌6#-7(S.diastatochromogenes 6#-7)基因组中。
首先采用含有25-50μg/mL安普霉素的LB液体培养基37℃过夜振荡培养大肠杆菌DH5α转化子，并采用质粒提取试剂盒或常规碱裂解质粒提取方法提取大肠杆菌DH5α转化子中的pIMEP：：dapF重组质粒，将重组质粒按化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567(PUZ8002)中，并将转化子涂布于含有12.5-25μg/mL卡那霉素、25-50μg/mL安普霉素和12.5-25μg/mL氯霉素的LB平板中，37℃倒置培养24h后得到大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子。
挑选含有重组质粒pIMEP：：dapF的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子单菌落于5mL LB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃振荡过夜培养，之后按照1％的接种量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD600＝0.4-0.6之间。取40mL菌液8000r/min离心5min，弃上清，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB液体培养基中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞悬液。向S.diastatochromogenes 6#-7孢子生长良好的平板上加入10mLpH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mL M3G液体培养基，37℃振荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子，用1mLpH 8.0TES缓冲液重悬萌发的淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子悬液备用。
将制备好的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞和萌发的S.diastatochromogenes 6#-7孢子悬液等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM固体培养基上。30℃倒置培养14-18h后，用含12.5-25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及12.5-25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1mL无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续30℃倒置培养3-5天，得到高产工程菌株S.diastatochromogenes dapF-1。
实施例2高产工程菌株S.diastatochromogenes lysA-1的构建
(1)内源二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的获得
根据内源lysA基因设计引物序列lysA-F/lysA-R，其中在lysA-F中添加EcoRΙ的酶切位点和同源臂，在lysA-R添加EcoRΙ的酶切位点同源臂，引物lysA-F/lysA-R详细序列分别见序列表SEQ ID No.7和SEQ ID No.8。以S.diastatochromogenes 6#-7基因组为模板(模板制备方法同实施例1)，用TaKaRa公司MiniBEST Bacteria Genomic DNA ExtractionKit Ver.3.0基因组提取试剂盒提取S.diastatochromogenes 6#-7的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增出带有同源臂S.diastatochromogenes 6#-7的lysA基因，全长1143bp，详细lysA基因序列见序列表SEQ ID No.3。得到带有同源臂的内源目的基因lysA，扩增的lysA基因经琼脂糖凝胶电泳检测大小正确，结果如图3(A)所示。
其中PCR反应体系：2×phantamaxbuffer 25μL，dNTP mixture(10mM)1μL，模板(20μg/mL)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，phantamax×Super-FidelityDNAPolymerase 1μL，补超纯水至50μL。
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，55-65℃退火15s，72℃延伸30-90s，共循环25-35次，72℃彻底延伸5min，4℃结束反应。
(2)重组质粒pIMEP：：lysA构建
将PCR扩增的带有同源臂的lysA基因与经过EcoRΙ单酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的线性质粒pIMEP，利用同源重组酶进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP：：lysA。
其中，同源重组体系为：线性化载体pIMEP 50-200ng，插入lysA基因片段50-200ng，5×CEⅡBuffer4μL，ExnaseⅡ2μL，补充超纯水至20μL。
同源重组条件：37℃反应30min，降至4℃。
pIMEP：：lysA重组质粒的构建示意图如图4所示。
(3)重组质粒pIMEP：：lysA的转化
取连接产物重组质粒pIMEP：：lysA加入到在冰浴中的大肠杆菌DH5α感受态细胞离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB液体培养基，吹打混匀后，37℃、100-200r/min振荡复苏45-60min。复苏后在12000r/min条件下离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有25-50μg/mL安普霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜，至转化子单菌落清晰可辨，挑取转化子单菌落至含有25-50μg/mL安普霉素的LB液体培养基中，37℃、180-200r/min振荡过夜，采用质粒提取试剂盒或常规碱裂解法提取转化子质粒，并对质粒进行EcoRⅠ单酶切验证，经琼脂糖凝胶电泳检测大小正确，结果如图3(B)所示。对验证正确的大肠杆菌DH5α阳性转化子进行保藏。
(4)高产基因工程菌株S.diastatochromogenes lysA-1的获得
利用质粒接合转移的方法将重组质粒pIMEP：：lysA整合到淀粉酶产色链霉菌6#-7(Streptomyces diastatochromogenes 6#-7)基因组中。
首先采用含有25-50μg/mL安普霉素的LB液体培养基37℃过夜振荡培养大肠杆菌DH5α阳性转化子，并采用质粒提取试剂盒或常规碱裂解质粒提取方法提取大肠杆菌DH5α阳性转化子中的pIMEP：：lysA重组质粒，将重组质粒按常规化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567(PUZ8002)中，并将转化子涂布于含有12.5-25μg/mL卡那霉素、25-50μg/mL安普霉素和12.5-25μg/mL氯霉素的LB平板中，37℃倒置培养24h后得到大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子。
挑选含有重组质粒pIMEP：：lysA的大肠杆菌T12567(PUZ8002)阳性转化子单菌落于5mLLB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃恒温振荡过夜培养，之后按照1％的接种量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD600＝0.4-0.6之间。取40mL菌液8000r/min离心5min，弃上清，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB液体培养基中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞悬液。向孢子生长良好的S.diastatochromogenes 6#-7平板上加入10mLpH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mL M3G培养基，于37℃条件下振荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子，用1mL pH 8.0TES缓冲液重悬萌发的淀粉酶产色链霉菌S.diastatochromogenes 6#-7孢子悬液备用。
将制备好的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞和萌发的S.diastatochromogenes 6#-7孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上。30℃倒置培养14-18h后，用含12.5-25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及12.5-25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1mL无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续30℃倒置培养3-5天，得到高产工程菌株S.diastatochromogenes lysA-1。
实施例3工程菌株S.albulus dapF-2的构建
(1)含有外源dapF基因的重组质粒pIMEP：：dapF-2的获得
将外源龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF核苷酸序列(SEQ ID NO.2)直接合成到pIMEP质粒上，得到构建好的重组质粒pIMEP：：dapF-2。
(2)重组质粒pIMEP：：dapF-2的转化
在冰上解冻克隆感受态细胞大肠杆菌DH5α。取10μl重组质粒pIMEP：：dapF-2加入到100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μL 37℃预热的LB培养基，37℃200r/min振荡培养1h。5000r/min离心5min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有25-50μg/mL安普霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养12-16h，得到大肠杆菌DH5α阳性转化子。
(3)高产基因工程菌株S.albulus dapF-2的获得
利用质粒接合转移的方法将重组质粒pIMEP：：dapF-2整合到小白链霉菌TUST2(Streptomyces albulus TUST2)基因组中。
首先采用含有25-50μg/mL安普霉素的LB液体培养基37℃过夜振荡培养大肠杆菌DH5α转化子，采用质粒提取试剂盒或常规碱裂解质粒提取方法提取大肠杆菌DH5α转化子中的pIMEP：：dapF-2重组质粒，将重组质粒按化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567(PUZ8002)中，并将转化子涂布于含有12.5-25μg/mL卡那霉素、25-50μg/mL安普霉素和12.5-25μg/mL氯霉素的LB平板中，37℃倒置培养24h后得到大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子。
挑选含有重组质粒pIMEP：：dapF-2的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子单菌落于5mL LB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃振荡过夜培养，之后按照1％的接种量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD600＝0.4-0.6之间。8000r/min离心5min收集40mL菌液，用新鲜的LB洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞。向S.albulus TUST2孢子生长良好的平板上加入10mLpH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，200r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mLM3G培养基，于37℃条件下振荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子，用1mLpH 8.0TES缓冲液重悬萌发的S.albulus TUST2孢子悬液备用。
将制备好的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞和萌发的S.albulusTUST2孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上。28℃倒置培养16-20h后，用含12.5-25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及12.5-25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1mL无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续28℃倒置培养3-5天，得到高产基因工程菌株S.albulus dapF-2。
实施例4高产工程菌株S.albulus lysA-2的构建
(1)含有外源lysA基因的重组质粒pIMEP：：lysA-2的获得
将Streptomyces rimosus外源二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA核苷酸序列(SEQID NO.4)直接合成到pIMEP质粒上，得到构建好的重组质粒pIMEP：：lysA-2。
(2)重组质粒pIMEP：：lysA-2的转化
在冰上解冻感受态细胞大肠杆菌DH5α。取10μl重组质粒pIMEP：：lysA-2加入到100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μL 37℃预热的LB培养基，37℃200r/min振荡培养1h。5000r/min离心5min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有25-50μg/mL安普霉素的LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至转化子单菌落清晰可辨，得到大肠杆菌DH5α阳性转化子。
(3)高产基因工程菌株S.albulus lysA-2的获得
利用质粒接合转移的方法将重组质粒pIMEP：：lysA-2整合到S.albulus TUST2基因组中。
首先采用含有25-50μg/mL安普霉素的LB液体培养基37℃过夜振荡培养大肠杆菌DH5α阳性转化子，并采用质粒提取试剂盒或常规碱裂解质粒提取方法提取大肠杆菌DH5α转化子中的pIMEP：：lysA-2重组质粒，将重组质粒按化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567(PUZ8002)中，并将转化子涂布于含有12.5-25μg/mL卡那霉素、25-50μg/mL安普霉素和12.5-25μg/mL氯霉素的LB平板中，37℃倒置培养24h后得到大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子。
挑选含有重组质粒pIMEP：：lysA的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子单菌落于5mLLB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃振荡过夜培养，之后按照1％的接种量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD600＝0.4-0.6之间。取40mL菌液8000r/min离心5min，弃上清，再用新鲜的LB洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞悬液。向孢子生长良好的S.albulus TUST2平板上加入10mLpH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，200r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mL M3G培养基，于37℃条件下振荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子，用1mLpH 8.0TES缓冲液重孢子，得到悬萌发的S.albulus TUST2孢子悬液备用。
将制备好的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞悬液和萌发的S.albulusTUST2孢子悬液等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上。28℃倒置培养16-20h后，用含12.5-25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及12.5-25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1mL无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续28℃倒置培养3-5天，得到高产基因工程菌株S.albulus lysA-2。
实施例5不同菌株发酵生产ε-聚赖氨酸
利用实施例1-4构建的高产工程菌株发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，具体步骤如下：
将不同高产工程菌株分别转接至贝纳特培养平板上，在30℃培养5-7天左右直至产生孢子；然后，刮取一环新鲜孢子接种至含有100mLM3G培养基的500mL容量摇瓶中，在30℃，180r/min条件下培养30h得到种子液。将种子液以10％(v/v)的接种量接入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，初始pH 6.8，分两阶段控制：第I阶段，pH控制在6.0以利于菌体的增殖；第II阶段，当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/L时，使pH自然降至4.0，然后自动流加浓度为12.5％的氨水使pH维持在4.0左右，同时流加葡萄糖和硫酸铵的混合液(800g/L，80g/L)，将葡萄糖浓度控制在10g/L左右，以利于产物生成；发酵过程中，温度控制在30℃，溶氧控制在30％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联。发酵过程中对pH值、发酵液残糖浓度、生物量进行测定。
pH值测定：先将pH电极按说明书操作校准，将培养一定时间的发酵液摇匀，然后将pH电极置于待测发酵液中，待稳定后读取pH数值。
葡萄糖浓度的测定：取5mL发酵液，离心后取上清液0.5mL稀释50-100倍后，使用SBA-40E生物传感分析仪测量稀释液中的葡萄糖浓度，重复3次，待读数稳定后，记录数值，经计算可得发酵液中的葡萄糖浓度。
生物量的测定：将编好号的滤纸放到95℃烘箱中烘干至重量不再变化，后称量滤纸重量。取8mL发酵液，离心弃去上清液得到菌体沉淀，用蒸馏水洗涤菌体2-3次后，冲洗至编好号的滤纸上，然后在95℃烘箱中烘干至恒重，称量烘干后带有菌体的滤纸重量，和滤纸重量之差为菌体的重量。
ε-聚赖氨酸含量的测定：采用比色法进行ε-聚赖氨酸标准曲线及摇瓶发酵液中ε-聚赖氨酸含量的测定。
ε-聚赖氨酸比色法标准曲线绘制：
(1)ε-聚赖氨酸标准溶液的稀释：将0.10g/L的ε-聚赖氨酸标准液用pH 6.6的磷酸盐缓冲液按比例分别稀释，至一系列ε-聚赖氨酸的标准浓度分别为0.01g/L、0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.10g/L；
(2)反应：分别取配制好的ε-聚赖氨酸标准系列浓度的溶液2mL，再分别加2mL 1mM甲基橙溶液，混合，30℃水浴140r/min振荡反应30min；
(3)离心、稀释：将反应完成的ε-聚赖氨酸和甲基橙混合液转至离心机内，4000r/min离心15min，取上清液用pH 6.6的磷酸盐缓冲液稀释50倍；
(4)分光光度计测定OD465：上述稀释50倍的测定液，于465nm处测定吸光度，以pH6.6的磷酸盐缓冲液为空白，记录各个浓度ε-聚赖氨酸溶液所测得的OD465值；
(5)以50倍稀释液的OD465值为横坐标，与之对应的ε-聚赖氨酸标准浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
Y＝(-0.88238X+0.1923)*0.7785R2＝0.99642
(6)ε-聚赖氨酸含量的测定：
将培养一定时间的发酵液8000×g离心5min，除去细胞，根据发酵时间对发酵上清液适当稀释制成待测样品。吸取2mL稀释液于10mL离心管中，加入2mL 1mM的甲基橙溶液，充分混匀。所得混合物于30℃、140r/min摇床中振荡反应30min，反应结束后，4000×g离心15min，除去产生的ε-聚赖氨酸-甲基橙复合物。吸取1mL上清液，用pH 6.6磷酸钠缓冲液稀释至50mL；用该缓冲液做空白对照，在465nm下测定其吸光值。根据步骤(5)中的线性回归方程计算ε-聚赖氨酸的含量。
本发明方法通过过表达S.diastatochromogenes 6#-7内源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA构建的高产工程菌株S.diastatochromogenes dapF-1和S.diastatochromogenes lysA-1，分批补料发酵生产ε-聚赖氨酸，其ε-聚赖氨酸产量(g/L)分别为出发底盘菌株S.diastatochromogenes 6#-7的127.44％和130.38％；生产强度(g/L·h)分别为出发底盘菌株S.diastatochromogenes6#-7的119.88％和160.47％；糖酸转化率分别为出发底盘菌株S.diastatochromogenes6#-7的136.89％和105.51％，结果见图5，显著降低了生产成本，为ε-聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌种。本发明方法通过过表达外源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA构建的工程菌株S.albulus dapF-2或S.albulus lysA-2，分批补料发酵生产ε-聚赖氨酸，其ε-聚赖氨酸产量(g/L)分别为出发底盘菌株Streptomycesalbulus TUST2的131.55％和136.38％；生产强度(g/L·h)分别为出发底盘菌株Streptomyces albulus TUST2的119.93％和159.29％；糖酸转化率分别为出发底盘菌株Streptomyces albulus TUST2的134.40％和103.93％，结果见图6，显著降低了生产成本，为ε-聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌种。
本发明中使用的相关基因序列如下：
1.SEQ ID No.1
二氨基庚二酸酯差向异构酶dapF基因
2.SEQ ID No.2
龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯差向异构酶dapF基因
3.SEQ ID No.3
二氨基庚二酸酯脱羧酶lysA基因
4.SEQ ID No.4
龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯脱羧酶lysA基因
5.SEQ ID No.5
dapF-F：即39其中下划线为EcoRΙ酶切位点；黑体为上游同源臂
6.SEQ ID No.6
dapF-R：即39其中下划线为EcoRΙ酶切位点；黑体为下游同源臂
7.SEQ ID No.7
lysA-F：即41其中下划线为EcoRΙ酶切位点；黑体为上游同源臂
8.SEQ ID No.8
lysA-R：43其中下划线为EcoRΙ酶切位点；黑体为下游同源臂。

Claims (10)

1.一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株是以产ε-聚赖氨酸链霉菌为底盘菌株，并进行如下之一改造：
a)过表达二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF；
b)过表达二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA。
2.根据权利要求1所述的高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株，其特征在于：过表达的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF基因核苷酸序列与SEQ ID No.1具有84.4％及以上的一致性；
过表达的二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的核苷酸序列与序列SEQ ID No.3具有83.8％及以上的一致性；
或者，过表达的基因dapE、lysA是通过PCR技术扩增的，或者是直接合成的。
3.根据权利要求1所述的高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株，其特征在于：所述底盘菌株为产ε-聚赖氨酸的链霉菌属菌株，包括小白链霉菌Streptomycesalbulus、淀粉酶产色链霉菌Streptomycesdiastatochromogenes、灰褐链霉菌Streptomycesgriseofuscus、不吸水链霉菌Streptomycesahygroscopicus。
4.根据权利要求1所述的高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株，其特征在于：所述底盘菌株为小白链霉菌StreptomycesalbulusTUST2或淀粉酶产色链霉菌Streptomycesdiastatochromogenes6#-7；
其中，StreptomycesalbulusTUST2的保藏编号为CGMCCNO.1986，保藏日期为2007年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
Streptomycesdiastatochromogenes6#-7的保藏编号为CGMCCNO.22261，保藏日期为2021年4月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
5.如权利要求1至4任一项所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于：所述方法采用的底盘为产生ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的链霉菌，过表达的是底盘菌株内源或外源的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA中的一个。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述方法在构建中使用的过表达质粒是带有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP。
7.根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)目的片段基因的获得：
根据二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF设计上下游引物序列dapF-F/dapF-R，即SEQID No.5/SEQ ID No.6，以提取的S.diastatochromogenes 6#-7基因组为模板，PCR扩扩增出带有同源臂dapF基因，全长879bp，dapF基因序列为SEQ ID No.1，或者根据外源龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯差向异构酶dapF基因序列即SEQ ID No.2直接合成；
根据二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA设计上下游引物序列lysA-F/lysA-R，即SEQ IDNo.7/SEQ ID No.8，以提取的S.diastatochromogenes 6#-7基因组为模板，PCR扩增内源目的基因lysA，全长1143bp，lysA基因序列为序列SEQ ID No.3，或者根据外源龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯脱羧酶lysA基因序列即SEQ ID No.4直接合成；
(2)重组质粒的构建：
将PCR扩增的或者直接合成的dapF或lysA基因片段与带有红霉素强启动子ermE*的线性质粒pIMEP进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP：：dapF或pIMEP：：lysA，利用化学法将构建好的重组载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，并通过安普霉素抗性筛选大肠杆菌DH5α阳性转化子，培养大肠杆菌DH5α阳性转化子，提取转化子中的重组质粒pIMEP：：dapF或pIMEP：：lysA，备用；
(3)工程菌株构建：
重组质粒pIMEP：：dapF或pIMEP：：lysA分别转化至大肠杆菌ET12567(PUZ8002)中，涂布于含有12.5-25μg/mL卡那霉素、25-50μg/mL安普霉素和12.5-25μg/mL氯霉素的LB平板中，挑选大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温振荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600至0.4～0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；向贝纳特培养基上培养好的底盘菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下链霉菌底盘菌株孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180-200r/min振荡打断孢子链，过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下振荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集萌发孢子，用TES缓冲液重悬萌发孢子备用；
将制备的大肠杆菌ET12567(PUZ8002)阳性转化子细胞和萌发的链霉菌底盘菌株孢子分别等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及浓度为25mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：每1LM3G培养基的组成为：
(NH4)2SO410g，KH2PO41.36g，K2HPO40.8g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到900mL后121℃单独灭菌20min，每100mLM3G培养基使用前再添加10mL10×葡萄糖母液；10×葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2mL20g/LZnSO4·7H2O和2mL10g/LMgSO4·7H2O，用去蒸馏水定容至100mL后115℃单独灭菌30min。
或者，每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，加水补充至1L，NaOH调pH至7.7；
或者，每1LSFM培养基的组成为：
黄豆饼粉30g，甘露醇20g、琼脂粉20g，加水补充至1L，用NaOH调节pH7.2～7.4；
其中，所述黄豆饼粉经过如下处理后使用：
加入900mL自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤。
9.一种利用如权利要求1至4任一项所述的基因工程菌株发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法，其特征在于：包括如下步骤：
将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生孢子；然后，将孢子接种至含葡萄糖的M3G培养基摇瓶中，在28-30℃，180-220r/min，培养30h，将培养好的种子培养液转接到含葡萄糖的M3G培养基中进行发酵罐补料发酵，即获得含ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的发酵液，进而能够采用离心、吸附、洗脱、脱色、干燥进一步纯化即可得到ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐。
10.如权利要求1至4任一项所述的基因工程菌株在发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐方面中的应用。
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