CN113549587B - 一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产ε‑聚赖氨酸的基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(Streptomyces diastatochromogenesΔcadA)并提高ε‑聚赖氨酸发酵水平的方法，所述高产基因工程菌株的构建步骤如下：步骤1，构建敲除赖氨酸脱羧酶基因cadA质粒pJTU 412‑ΔcadA；步骤2，缺失cadA基因菌株的获得，即高产ε‑聚赖氨酸的基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA。经过实验证实，该链霉菌基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST生产ε‑聚赖氨酸的能力显著提高了35.6％，为ε‑聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

Description

一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸 产量的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔCADA及提高ε-聚赖氨酸产量的方法。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-poly-l-lysine，ε-PL)是目前发现的两种天然氨基酸同聚物之一(另一种是γ-聚谷氨酸)，产生菌均属于链霉菌属(Streptomyces)、链轮丝菌属(Streptoverticillum)、北里孢菌属(Kitasatospora)和香柱属

。ε-聚赖氨酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及一些病毒均有抑制作用，热稳定性好，可直接加入食品一起加工。日本学者Shima和Sakai于20世纪80年代初首次将这种生物防腐剂应用于食品防腐。ε-聚赖氨酸还可作为一种食疗剂，抑制肠道中膳食脂肪的吸收，最终降低肥胖的几率。ε-聚赖氨酸也可用于防治牙周炎疾病，可抑制口腔细菌毒素的产生。除此之外，ε-聚赖氨酸可用于一次性擦布中药溶液的一种组成成分。ε-聚赖氨酸还可用作乳化剂，ε-聚赖氨酸与葡聚糖结合后所得结合物的乳化活性优于商业乳化剂。在水凝胶、生物芯片和生物电子的镀膜材料等方面也具有十分重要的用途。

正是由于ε-聚赖氨酸具有以上优良性质和广阔的市场前景，1989年日本智索股份有限公司(Chisso Corporation)首先利用微生物发酵技术工业化生产ε-聚赖氨酸。2001年，Kahar等提出采用两阶段pH控制策略来提升S.albulus S410菌株ε-聚赖氨酸的产量。随着ε-聚赖氨酸的需求量不断增大，国内外也有许多学者采用诱变育种等手段以期提高ε-聚赖氨酸的产量，Hiraki利用亚硝基胍对野生型菌株S.albulus No.346进行化学诱变，其中一株S.albulus 11011A高产突变株比出发菌株ε-聚赖氨酸产量高出约10倍。目前还未见到通过基因敲除手段，尤其是通过敲除赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase)基因cadA来提高淀粉酶产色链霉菌生产ε-聚赖氨酸的报道。

通过检索，发现如下三篇与本发明专利申请相关的公开文献：

1.一种积累高丝氨酸的ε-聚赖氨酸的发酵方法(CN 104004796 A)，采用淀粉酶产色链霉菌CGMCCNo.3145作为生产菌株，在发酵0-48h，向发酵培养基中添加终浓度为2.5-5.0g/L的L-苏氨酸。其通过抑制支路代谢改变代谢流分布来实现提高ε-聚赖氨酸产量的，是相同原料投入获得更高的产物浓度，副产物浓度降低，纯化简单。

2.毛忠贵等的文章(Differential protein expression ofa streptomycin-resistant Streptomyces albulus mutant in high yield production ofε-poly-L-lysine:a proteomics study)中，在菌株S.albulus M-Z18中过表达了ε-聚赖氨酸合成酶(pls)基因和核糖体回收因子(frr)基因，使ε-聚赖氨酸产量和每单位细胞ε-聚赖氨酸生物合成量分别增加了7.2％和20.3％。

3.徐虹等人的文章(Enhancement ofε-poly-l-lysine productionbyoverexpressing the ammonium transporter gene in Streptomyces albulus PD-1)中Streptomyces albulus PD-1过表达铵转运体基因amtB，重组菌株较原始菌株ε-聚赖氨酸发酵水平提高了57.26％。

通过对比，本发明与上述专利公开文献在菌株及高产策略上存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种构建基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA及提高ε-聚赖氨酸产量的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(Streptomycesdiastatochromogenes ΔcadA)，其构建步骤如下：

⑴提取E.coli DH5α转化子中的重组质粒pJTU 412-ΔcadA，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中得到阳性转化子菌悬液，置于冰上备用；

其中，所述卡那霉素的终浓度为50-100μg/mL、安普霉素的终浓度为50-100μg/mL和氯霉素的终浓度为25-50μg/mL；

⑵向贝纳特培养基上产孢的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomycesdiastatochromogenes TUST)菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180-200r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5-10min收集孢子，用TES缓冲液重悬得到孢子悬液备用；

⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌菌悬液和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子悬液等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为10-25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为10-25mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆得到基因工程高产菌株S.diastatochromogenesΔcadA。

进一步地，所述赖氨酸脱羧酶基因cadA重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建步骤如下：

⑴敲除组件的获得：

敲除组件包含cadA基因的等位位点，即该基因的上游同源片段及下游同源片段，以及用于替换目的基因的抗性片段即安普霉素抗性作为筛选标记；

以S.diastatochromogenes TUST的基因组为模板，根据cadA基因分别设计上下游同源片段引物序列cadA-L-F/cadA-L-R和cadA-R-F/cadA-R-R；以pSET 152质粒为模板，根据安普霉素Apr抗性基因设计引物序列cadA-apr-F/cadA-apr-R；

在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoR I的酶切位点；

引物的序列为：

cadA-L-F：SEQ No.2，即5’-cggaattcagacctacgccgacctgatgc-3’，下划线序列为EcoR I酶切位点；

cadA-L-R：SEQ No.3，即5’-gtggtttgtttgccggatcaaacctcgaacccacgaacaccac-3’；

cadA-R-F：SEQ No.5，即5’-gatcggtcttgccttgctcgtaccgtcctcgccctcttcctg-3’；

cadA-R-R：SEQ No.6，即5’-cggaattcgttcccggcctgtttgcgtct-3’，下划线序列为EcoR I酶切位点；

cadA-apr-F：SEQ No.8，即5’-gtggtgttcgtgggttcgaggtttgatccggcaaacaaaccac-3’；

cadA-apr-R：SEQ No.9，即5’-caggaagagggcgaggacggtacgagcaaggcaagaccgatc-3’；

赖氨酸脱羧酶基因cadA上游同源片段的序列为SEQ No.1，赖氨酸脱羧酶基因cadA下游同源片段的序列为SEQ No.4，安普霉素Apr抗性基因的序列为SEQ No.7；

⑵重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建：

以S.diastatochromogenes TUST的基因组为模板，分别扩增目的基因上下游片段作为同源臂，以pSET 152质粒为模板扩增安普霉素Apr片段，利用SOE-PCR将同源左臂、同源右臂以及安普霉素片段进行融合；将纯化后的融合片段和出发载体pJTU 412分别进行EcoRI单酶切，16℃条件下，在T4 DNA ligase作用下与融合片段进行过夜连接，连接产物通过化学转化的方法转入到E.coli DH5α感受态筛选转化子，保存。

进一步地，敲除的基因序列与SEQ No.13有90％以上的相似性。

进一步地，所述淀粉酶产色链霉菌S.diastatochromogenes TUST为保藏号为CGMCC No.3145的菌株。

进一步地，所述步骤⑵中每1LM3G培养基组成为：

(NH₄)₂SO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 1.36g/L，K₂HPO₄ 0.8g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水补充至1L；

或者，每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L。

如上所述的基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA在ε-聚赖氨酸生产方面中的应用。

一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，所述方法首先构建赖氨酸脱羧酶基因cadA重组质粒pJTU 412-ΔcadA，并将重组质粒pJTU 412-ΔcadA转入淀粉酶产色链霉菌TUST中，获得基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的发酵水平。

进一步地，所述发酵的生产方如下：

采用的菌株为敲除赖氨酸脱羧酶基因cadA的基因工程菌，将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生分生孢子；

然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，28-30℃，180-200r/min发酵72-80h。

进一步地，每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L。

本发明取得的优点和积极效果为：

1.本发明在一株产ε-聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌基础上，敲除了赖氨酸降解途径中关键酶-赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase)基因cadA，构建了一株基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA，通过抑制支路代谢改变代谢流分布，提高了ε-聚赖氨酸的产量，使终产物浓度增高，提升了菌株产酸效率。

2.本发明通过敲除赖氨酸脱羧酶基因cadA获得基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(Streptomyces diastatochromogenesΔcadA)，经过实验证实，该链霉菌基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST生产ε-聚赖氨酸的能力提高了35.6％，为ε-聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

3.本发明方法通过构建敲除赖氨酸脱羧酶基因cadA基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(Streptomyces diastatochromogenesΔcadA)来提高ε-聚赖氨酸发酵水平。

4.本发明通过敲除赖氨酸脱羧酶基因cadA基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(Streptomyces diastatochromogenesΔcadA)发现二氨基庚二酸途径对链霉菌生产ε-聚赖氨酸有重要影响。

附图说明

图1为本发明中以pJTU 412为基础构建pJTU 412-ΔcadA重组质粒的一种构建图；

图2为本发明中对基因敲除质粒pJTU 412-ΔcadA的单酶切验证图；其中，泳道M：10kb marker；泳道1：敲除质粒EcoR I单酶切验证；

图3为本发明中初步筛选获得基因工程菌株S.diastatochromogenesΔcadA阳性转化子提基因组，用目的基因cadA两端引物验证结合转移是否成功的验证图；其中，泳道M：2kb marker；泳道1：验证ΔcadA基因工程菌株中已敲除cadA基因；泳道2：对照TUST中存在cadA基因；

图4为本发明中菌株在24h-144h的摇瓶发酵ε-聚赖氨酸产量图；其中，TUST为出发菌株淀粉酶产色链霉菌TUST，ΔcadA为基因工程菌株S.diastatochromogenesΔcadA。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(StreptomycesdiastatochromogenesΔcadA)，构建步骤如下：

⑴提取E.coli DH5α转化子中的重组质粒pJTU 412-ΔcadA，首先将构建得到的重组质粒pJTU 412-ΔcadA转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有50-100μg/mL卡那霉素、50-100μg/mL安普霉素和25-50μg/mL氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有上述相同浓度卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中得到阳性转化子菌悬液，置于冰上备用；

⑵向贝纳特培养基上产孢良好的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomycesdiastatochromogenes TUST)菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180-200r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5-10min收集孢子，用TES缓冲液重悬得到萌发孢子悬液备用；

其中，每1LM3G培养基的组成为：

(NH₄)₂SO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 1.36g/L，K₂HPO₄ 0.8g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH 到7.2，加水定容至1L；

每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH至7.7，加水补充至1L；

⑶将步骤⑴的阳性转化子菌悬液和步骤⑵萌发的S.diastatochromogenesTUST的萌发孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基(黄豆饼粉30g/L，甘露醇20g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH调至7.2，加水定容至1L)上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为10-25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为10-25mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆得到基因工程高产菌株S.diastatochromogenesΔcadA。

较优地，所述赖氨酸脱羧酶基因ΔcadA重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建步骤如下：

⑴敲除组件的获得：敲除组件包含cadA基因的等位位点，即该基因的上游同源片段及下游同源片段，以及用于替换目的基因的抗性片段(安普霉素抗性)作为筛选标记。

以S.diastatochromogenes TUST的基因组为模板，根据cadA基因分别设计上下游同源片段引物序列cadA-L-F/cadA-L-R和cadA-R-F/cadA-R-R；以pSET 152质粒为模板，根据安普霉素(Apr)抗性基因设计引物序列cadA-apr-F/cadA-apr-R。

在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoR I的酶切位点。

所述引物的序列为：

cadA-L-F：SEQ No.2，即5’-cggaattcagacctacgccgacctgatgc-3’，下划线序列为EcoR I酶切位点；

cadA-L-R：SEQ No.3，即5’-gtggtttgtttgccggatcaaacctcgaacccacgaacaccac-3’；

cadA-R-F：SEQ No.5，即5’-gatcggtcttgccttgctcgtaccgtcctcgccctcttcctg-3’；

cadA-R-R：SEQ No.6，即5’-cggaattcgttcccggcctgtttgcgtct-3’，下划线序列为EcoR I酶切位点；

cadA-apr-F：SEQ No.8，即5’-gtggtgttcgtgggttcgaggtttgatccggcaaacaaaccac-3’；

cadA-apr-R：SEQ No.9，即5’-caggaagagggcgaggacggtacgagcaaggcaagaccgatc-3’。

所述赖氨酸脱羧酶基因cadA上游同源片段的序列为SEQ No.1，赖氨酸脱羧酶基因cadA下游同源片段的序列为SEQ No.4，安普霉素抗性基因(Apr)的序列为SEQ No.7。

⑵重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建步骤如下：

以S.diastatochromogenes TUST的基因组为模板，分别扩增目的基因上下游约1.5kb长的片段，以pSET 152质粒为模板扩增安普霉素抗性基因(Apr)片段，利用SOE-PCR将同源左臂、同源右臂以及安普霉素片段进行融合。将纯化后的融合片段和出发载体pJTU412分别进行EcoR I单酶切，16℃条件下，在T4 DNA ligase作用下与融合片段进行过夜连接，连接产物通过化学转化的方法转入到E.coli DH5α感受态筛选转化子保存。

较优地，所述淀粉酶产色链霉菌TUST为保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.3145的菌株。

一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，所述方法通过构建敲除赖氨酸脱羧酶基因ΔcadA重组质粒pJTU 412-ΔcadA，并将重组质粒pJTU 412-ΔcadA转入淀粉酶产色链霉菌TUST中，获得基因工程高产菌株S.diastatochromogenesΔCADA，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的发酵水平；

较优地，所述发酵的生产方如下：

采用的菌株为敲除赖氨酸脱羧酶基因ΔcadA的基因工程菌，将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生分生孢子；

然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在30℃，180r/min，培养30h，将培养好的种子转接到M3G培养基中进行发酵；

其中，每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L。

更为具体地，通过相关实施例来具体说明：

实施例1敲除组件的获得

以提取的S.diastatochromogenes TUST的基因组为模板，以序列表SEQ No.2和SEQ No.3为引物扩增目的基因ΔcadA上游约1.5kb长的片段，以序列表SEQ No.5和SEQNo.6为引物扩增目的基因cadA下游约1.5kb长的片段；以pSET 152质粒为模板，以序列表SEQ No.8和SEQ No.9为引物扩增安普霉素抗性基因(Apr)片段，大小约为1414bp。

所述赖氨酸脱羧酶基因cadA上游同源片段的序列为SEQ No.1，赖氨酸脱羧酶基因cadA下游同源片段的序列为SEQ No.4，安普霉素抗性基因(Apr)的序列为SEQ No.7。

利用SOE-PCR将同源左臂、同源右臂以及安普霉素抗性片段进行融合，融合片段长度为4722bp，见序列表SEQ No.10。

PCR反应体系：2×phanta max buffer 25μL，dNTP mixture(10mM)1μL，模板(20ng/ul)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，phanta max×Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，补超纯水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，50-65℃退火15s，72℃延伸1min，共循环30次，72℃延伸5min，16℃结束反应。

实施例2含有cadA基因的重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建

将纯化后的敲除组件和出发载体pJTU 412分别进行EcoR I单酶切，16℃条件下，在T4DNAligase作用下与融合片段进行过夜连接，得到连接产物重组质粒pJTU 412-ΔcadA。如图1所示。

实施例3重组质粒pJTU 412-ΔcadA的转化

取连接产物重组质粒pJTU 412-ΔcadA加入到在冰浴中已融化的含有E.coliDH5α感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有(50-100μg/mL)安普霉素的LB固体抗性平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，挑取阳性转化子，提取质粒后进行EcoR I酶切验证，酶切产物进行电泳验证，结果如图2所示，重组质粒pJTU 412-ΔcadA已成功转化到转化子中。

实施例4基因工程菌株的获得

利用结合转移的方法将质粒pJTU 412-ΔcadA整合到淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)基因组中。

首先提取大肠杆菌DH5α转化子中的pJTU 412-ΔcadA重组质粒，将重组质粒按化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，将转化子涂布于含有卡那霉素50-100μg/mL、安普霉素50-100μg/mL和氯霉素25-50μg/mL抗性的LB平板中，37℃倒置培养24h。挑选大肠杆菌阳性转化子单菌落于5mL LB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃恒温震荡过夜培养，之后按照1％的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集40mL菌液，用新鲜的LB洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mLLB中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞。向淀粉酶产色链霉菌TUST孢子生长良好的平板上加入10mLpH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mLM3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5-10min收集孢子，用TES缓冲液重悬孢子，得到萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子备用。

将处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞和萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上。30℃倒置培养。倒置培养14-18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为10-25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为10-25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天。挑取转化子接种于含有安普霉素的SFM平板上，同时接种于含有硫链丝菌素(pJTU412载体自身所带抗性)的SFM平板上，30℃培养5-7天。通过不同抗性平板的生长状况对发生单交换和双交换的转化子进行筛选。在安普霉素抗性平板上可以生长，同时在硫链丝菌素抗性平板上不能生长的转化子即为cadA基因敲除菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(Streptomyces diastatochromogenesΔcadA)。实施例5ΔcadA基因敲除菌株的验证

将筛选获得cadA基因敲除菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(S.diastatochromogenesΔcadA)进行ε-聚赖氨酸发酵培养基摇瓶发酵30h后，提取基因组，以TUST基因组为对照，用目的基因cadA两端引物对敲除菌株ΔcadA基因组进行PCR验证，上游引物cadA-F 5’-atggcaacgacgcagacgca-3’(SEQ No.11)，下游引物cadA-R 5’-ctacggcaggtcccggcgcatc-3’(SEQ No.12)，经过PCR验证，cadA基因(SEQ No.13)已成功从TUST的基因组中敲除，淀粉酶产色链霉菌ΔcadA基因组中并未获得相应条带(如图3所示)。

实施例6淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(S.diastatochromogenesΔcadA)发酵生产ε-聚赖氨酸将基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA接种在贝纳特培养平板上，在30℃培养7天左右直至产生孢子；然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在28-30℃，180-200r/min发酵30-36h。以6-10％的接种量转移到新的M3G培养基中发酵72-80h，即得ε-聚赖氨酸，产量可较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST提高30％；其中，所述贝纳特培养基1L的组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L。

M3G培养基组分为：(NH₄)₂SO₄ 10g，KH₂PO₄ 1.36g，K₂HPO₄ 0.8g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到1L。

葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 20g/L ZnSO₄·7H₂O和2ml 250g/LMgSO₄·7H₂O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min。

M3G培养基用之前，加10mL葡萄糖母液于90mLM3G培养基中。

结果如图4所示，经过72小时的摇瓶发酵，发现原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST和基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(Streptomyces diastatochromogenesΔcadA)的ε-聚赖氨酸产量都随着时间进行不断增加，但是可以明显看出，在72小时基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(Streptomyces diastatochromogenesΔcadA)的ε-聚赖氨酸产量达到顶峰，比原始菌株产量提高了35.6％。

本发明中使用到的相关基因序列可以如下：

1.SeqNo.1

赖氨酸脱羧酶cadA上游同源片段基因序列

agacctacgccgacctgatgcgccgggacctgccgtagcggcgcagccggccgagccgggctcagcttgttccttatcatcggcggtcacgccgagcgacgagagtctcggggcgtttgacggtctcgcccgcgtcgtagcgggtggcggggtgccggttcttggagccgggtggtcgtcctggccccggcggggtgggtttggctgcacgggccggactgcctaggcgggggcggatgttcctgaacccgcgccggacgcggctcggggggagcgcggtgccggggcgtgtggtcttctcccagggcctgcgctggtcggctgcgagcgggagtgcgaggcggagttgggtgtgggctgcgatgacgggccaggtccaccggtccgcagatcgcgggtcgtgtagccgggggcgggtccagcccagggactgctggaacaagcggaacgtgtgctccaggtcgaatctgcgccgagcggtgggtgagccggggatggacccggtcccaggcgcgggtctcagccctgccgtagcgaggtgtgtcggtcaccgccttgccactgaccggccacgatcaggcgctcgaccacggcccgcagctggtcggcggtgacggccgcggcgtcgtcggtgggcccgagctggaccgcgtccaggagctgggtccacaacgtgcggtccggcccgtccgccagcacactcatccccgcggccttcctcgtgatcatgaactcccctacttcttcgcggagttcaggatcacgaggaaggccgccctgatacgctgcgattactccacagagtgaccacgggaccgggcccgatgttgaggatccaactcagcgttcctgcatgttgaggtcacggacgcagaacccgtggtgttcccagtcctcattcagcaccacccgcaggcactcgaccaccggcttgccctcggcgtacggcggccagcccggtcccgcaggaacgggagcgactgcggacagctcctcgatcgtcacggtcgccagccaacgctccagcttggcggactgttcgtctctgacggccagtacctcgtcgaggtctggggtcgccgctcgatcgaggccctgttcctcctgatcgggcacgaagtcggacgccaacccgatcccagtgaagggctgggtcgatcccaggcagcagcggcgaaaccacgagtcgtgcacgaacaccaggtggcgcagggtctccaccgccgaccactcgccggcgacacgccggtgctcggagcccgcgggcatcgcgcggagccgctccaccgtcctcgcccagcattcctgtagctgtcgatgggctttccgcagatcggccgggtcatctgagcgcatcagcaaccgaactggataccgccggtcgagctcggcctccacgtaggacgtcacctccacaccgttgaccaccaggttgctgaccagcccgtcgaccacgacgtcccgcatcaccacgccggtcagccgggcgcgggtcaggtcgcactcgcgaaactcggcgtcggtcagatcctgatcttcaaagctcaccatgccgagcattgtgtaccggcgggccgacaccaggggggtgttcagaaggagatgggccatgcgcggggcgtccgaaacatcgttcgaggtcagaggttaaggaacaagctcagaagccgttgtcgtaccgatagtggtgttcgtgggttcgaggt

SEQ No.2

cadA-L-F

cggaattcagacctacgccgacctgatgc

SEQ No.3

cadA-L-R

gtggtttgtttgccggatcaaacctcgaacccacgaacaccac

SEQ No.4

赖氨酸脱羧酶cadA下游同源片段基因序列

accgtcctcgccctcttcctggcgcagccggtgcagcgcgccgcaggcgtccggcaggccgagcgactccgtcgcgtcggcgaggtgcagcagcagcaccgccagcgccatgtcctccacggtgcgtacggccggtccgcggacggccggatgccgcagcgcccgcagcgcggcgtccgcctgcgcccgcacgtcggcgatccggcccatcgactcggccgggccgccgacggcgaccacgtagtcaccggccagtggggtccgcgcgaggaagtcgcgggccagggcggcggccgactccaaggccgtggcgtgttccggaggccagccggccagtacgtacaccactccggtgcccgccaccagggccgaacgagggtgcacggcagccaggaagtactccagcgtgtccgcgaaccggcgtagcccggcggcgtccagcgcgtcggagtccgacgcgtctgatcctgtgcggccggccagccgcggggccgcggccaggacgcagaccgggccggagcccagctgcagccggctcgcctccaccggatcggccgccccgccgagtaccgcggcggccaactcgccgcgctggcggcgggcgtagctggtctccgtgcgcaggccgaccagttgcagcgcgaccaccggtgcgaattcgcgcagccgggctgtggccgcctcgtcgagcggaccggtgacggcggcccagatgtagccgaggacgtccgaaccggcccggaccgcgatggccacccttgccagctgatccgccccggtcgcctccatgtacaccggttcggtgctggcatggagccgctcgaactcctgacgctcgcgctgttcggcgagcgtccgctggtgcacggcccgccccaggatgctctcgatccgctcggagtcggtccggtcctgcccctccgaccaggcgaccagcgcggagaagcggtcctcgatggtgaccggggcgccgacggcctcatagaccgcgttcgccagggcgaacagctccgcgccgctgccggccgagcgcacgcgcgtcctcgcgtactcgagcagctgctcacggacagtcgtcgccacgtgcatccaggacgcgccctggttgacctcgatgatcgccggcctgtcgtcggccgacggcggcaccggggccttcaccgccagcacctccgcgccagcctccgacatggccgcggtcagctcgcgcagctcggcctccgtggtcacgcccacccccagcaccacgcacccgggtccgagctgtgccggcgcacccggcgcatggatggcgatgtcggtgagcggcccgccgctgccggtcccctcctggacgaggcgcagcagcgccgggccgatgttgtccacgagctgacggacgggcaggtgcccccgagcgccggactcccgcatggtgcactcccgactcgaaggattgttgtgggcgtcaagtctgggagacccgcattgacgatgtcaacgatgatccggagtgaccgtagcgggacgatggcaggagagcgggacggatcagtggcacaaggagtgcggatggcaacgacgcagacgcaaacaggccgggaac

SEQ No.5

cadA-R-F

gatcggtcttgccttgctcgtaccgtcctcgccctcttcctg

SEQ No.6

cadA-R-R

cggaattcgttcccggcctgtttgcgtct

SEQ No.7

安普霉素抗性基因片段

ttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttggttcatgtgcagctccatcagcaaaaggggatgataagtttatcaccaccgactatttgcaacagtgccgttgatcgtgctatgatcgactgatgtcatcagcggtggagtgcaatgtcgtgcaatacgaatggcgaaaagccgagctcatcggtcagcttctcaaccttggggttacccccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgtagcgtccggcccctcgaagatgggccacttggactgatcgaggccctgcgtgctgcgctgggtccgggagggacgctcgtcatgccctcgtggtcaggtctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggaccttggagttgtctctgacacattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcgcccatccatttgcctttgcggcagcggggccacaggcagagcagatcatctctgatccattgcccctgccacctcactcgcctgcaagcccggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgcatcttgccgagttgatggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatggcaagttggtacgcgtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcggacaggtggctcaaggagaagagccttcagaaggaaggtccagtcggtcatgcctttgctcggttgatccgctcccgcgacattgtggcgacagccctgggtcaactgggccgagatccgttgatcttcctgcatccgccagaggcgggatgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcgattggctgagctcatgagcggagaacgagatgacgttggaggggcaaggtcgcgctgattgctggggcaacacgtggagcggatcggggattgtctttcttcagctcgctgatgatatgctgacgctcaatgccgtttggcctccgactaacgaaaatcccgcatttggacggctgatccgattggcacggcggacggcgaatggcggagcagacgctcgtccgggggcaatgagatatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtatcgggccctggccagctagctagagtcgacctgcaggtccccggggatcggtcttgccttgctcgt

SEQ No.8

cadA-apr-F

gtggtgttcgtgggttcgaggtttgatccggcaaacaaaccac

SEQ No.9

cadA-apr-R

caggaagagggcgaggacggtacgagcaaggcaagaccgatc

SEQ No.10

赖氨酸脱羧酶cadA敲除组件融合片段

cggaattcagacctacgccgacctgatgcgccgggacctgccgtagcggcgcagccggccgagccgggctcagcttgttccttatcatcggcggtcacgccgagcgacgagagtctcggggcgtttgacggtctcgcccgcgtcgtagcgggtggcggggtgccggttcttggagccgggtggtcgtcctggccccggcggggtgggtttggctgcacgggccggactgcctaggcgggggcggatgttcctgaacccgcgccggacgcggctcggggggagcgcggtgccggggcgtgtggtcttctcccagggcctgcgctggtcggctgcgagcgggagtgcgaggcggagttgggtgtgggctgcgatgacgggccaggtccaccggtccgcagatcgcgggtcgtgtagccgggggcgggtccagcccagggactgctggaacaagcggaacgtgtgctccaggtcgaatctgcgccgagcggtgggtgagccggggatggacccggtcccaggcgcgggtctcagccctgccgtagcgaggtgtgtcggtcaccgccttgccactgaccggccacgatcaggcgctcgaccacggcccgcagctggtcggcggtgacggccgcggcgtcgtcggtgggcccgagctggaccgcgtccaggagctgggtccacaacgtgcggtccggcccgtccgccagcacactcatccccgcggccttcctcgtgatcatgaactcccctacttcttcgcggagttcaggatcacgaggaaggccgccctgatacgctgcgattactccacagagtgaccacgggaccgggcccgatgttgaggatccaactcagcgttcctgcatgttgaggtcacggacgcagaacccgtggtgttcccagtcctcattcagcaccacccgcaggcactcgaccaccggcttgccctcggcgtacggcggccagcccggtcccgcaggaacgggagcgactgcggacagctcctcgatcgtcacggtcgccagccaacgctccagcttggcggactgttcgtctctgacggccagtacctcgtcgaggtctggggtcgccgctcgatcgaggccctgttcctcctgatcgggcacgaagtcggacgccaacccgatcccagtgaagggctgggtcgatcccaggcagcagcggcgaaaccacgagtcgtgcacgaacaccaggtggcgcagggtctccaccgccgaccactcgccggcgacacgccggtgctcggagcccgcgggcatcgcgcggagccgctccaccgtcctcgcccagcattcctgtagctgtcgatgggctttccgcagatcggccgggtcatctgagcgcatcagcaaccgaactggataccgccggtcgagctcggcctccacgtaggacgtcacctccacaccgttgaccaccaggttgctgaccagcccgtcgaccacgacgtcccgcatcaccacgccggtcagccgggcgcgggtcaggtcgcactcgcgaaactcggcgtcggtcagatcctgatcttcaaagctcaccatgccgagcattgtgtaccggcgggccgacaccaggggggtgttcagaaggagatgggccatgcgcggggcgtccgaaacatcgttcgaggtcagaggttaaggaacaagctcagaagccgttgtcgtaccgatagtggtgttcgtgggttcgaggtttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttggttcatgtgcagctccatcagcaaaaggggatgataagtttatcaccaccgactatttgcaacagtgccgttgatcgtgctatgatcgactgatgtcatcagcggtggagtgcaatgtcgtgcaatacgaatggcgaaaagccgagctcatcggtcagcttctcaaccttggggttacccccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgtagcgtccggcccctcgaagatgggccacttggactgatcgaggccctgcgtgctgcgctgggtccgggagggacgctcgtcatgccctcgtggtcaggtctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggaccttggagttgtctctgacacattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcgcccatccatttgcctttgcggcagcggggccacaggcagagcagatcatctctgatccattgcccctgccacctcactcgcctgcaagcccggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgcatcttgccgagttgatggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatggcaagttggtacgcgtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcggacaggtggctcaaggagaagagccttcagaaggaaggtccagtcggtcatgcctttgctcggttgatccgctcccgcgacattgtggcgacagccctgggtcaactgggccgagatccgttgatcttcctgcatccgccagaggcgggatgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcgattggctgagctcatgagcggagaacgagatgacgttggaggggcaaggtcgcgctgattgctggggcaacacgtggagcggatcggggattgtctttcttcagctcgctgatgatatgctgacgctcaatgccgtttggcctccgactaacgaaaatcccgcatttggacggctgatccgattggcacggcggacggcgaatggcggagcagacgctcgtccgggggcaatgagatatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtatcgggccctggccagctagctagagtcgacctgcaggtccccggggatcggtcttgccttgctcgtaccgtcctcgccctcttcctggcgcagccggtgcagcgcgccgcaggcgtccggcaggccgagcgactccgtcgcgtcggcgaggtgcagcagcagcaccgccagcgccatgtcctccacggtgcgtacggccggtccgcggacggccggatgccgcagcgcccgcagcgcggcgtccgcctgcgcccgcacgtcggcgatccggcccatcgactcggccgggccgccgacggcgaccacgtagtcaccggccagtggggtccgcgcgaggaagtcgcgggccagggcggcggccgactccaaggccgtggcgtgttccggaggccagccggccagtacgtacaccactccggtgcccgccaccagggccgaacgagggtgcacggcagccaggaagtactccagcgtgtccgcgaaccggcgtagcccggcggcgtccagcgcgtcggagtccgacgcgtctgatcctgtgcggccggccagccgcggggccgcggccaggacgcagaccgggccggagcccagctgcagccggctcgcctccaccggatcggccgccccgccgagtaccgcggcggccaactcgccgcgctggcggcgggcgtagctggtctccgtgcgcaggccgaccagttgcagcgcgaccaccggtgcgaattcgcgcagccgggctgtggccgcctcgtcgagcggaccggtgacggcggcccagatgtagccgaggacgtccgaaccggcccggaccgcgatggccacccttgccagctgatccgccccggtcgcctccatgtacaccggttcggtgctggcatggagccgctcgaactcctgacgctcgcgctgttcggcgagcgtccgctggtgcacggcccgccccaggatgctctcgatccgctcggagtcggtccggtcctgcccctccgaccaggcgaccagcgcggagaagcggtcctcgatggtgaccggggcgccgacggcctcatagaccgcgttcgccagggcgaacagctccgcgccgctgccggccgagcgcacgcgcgtcctcgcgtactcgagcagctgctcacggacagtcgtcgccacgtgcatccaggacgcgccctggttgacctcgatgatcgccggcctgtcgtcggccgacggcggcaccggggccttcaccgccagcacctccgcgccagcctccgacatggccgcggtcagctcgcgcagctcggcctccgtggtcacgcccacccccagcaccacgcacccgggtccgagctgtgccggcgcacccggcgcatggatggcgatgtcggtgagcggcccgccgctgccggtcccctcctggacgaggcgcagcagcgccgggccgatgttgtccacgagctgacggacgggcaggtgcccccgagcgccggactcccgcatggtgcactcccgactcgaaggattgttgtgggcgtcaagtctgggagacccgcattgacgatgtcaacgatgatccggagtgaccgtagcgggacgatggcaggagagcgggacggatcagtggcacaaggagtgcggatggcaacgacgcagacgcaaacaggccgggaaccttaaggc

SEQ No.11

cadA-F

atggcaacgacgcagacgca

SEQ No.12

cadA-R

ctacggcaggtcccggcgcatc

SEQ No.13

cadA

atggcaacgacgcagacgcaaacaggccgggaactgctgggactgttcccgcccgggaccacccgggacgggagcggcggactggtgatcggcggcgtaccggcggccgaactcgccgagtcctacggcactcccgcgctgatcctcgacgaggcttcggtccgcgcccgcgcccgccggtacgccgacggcctggccgcccgttggccgaactcccgcaccgtcttcgcctccaaggccttcccctgcaccgccgtcatccggctgctcgcggaggagggcctcggcatcgacgtggccggcggcggcgagctgaccctcgccctcgccgcaggcgcggacccggccggcctggtcgtccacggcaacgccaagaccgaggaggaactgcgcctcgccgtcgaggccggcgccgggacgatcgtcgtcgacaacttcgacgacatcgaccggctggagaagatcctcgccgacaccgcggcggagcagggagtactggtccgggtcacccccggcatctgccccgacacccacgaggccgtgtccaccggccagaacggctccaagttcggtctgcccctgccgcaggcccgggcggcgatcgcgcggctgcgcggcagcgaccggctgcggctggacggcgtccacgtgcacgtcgggtcgcagatcctggacctcgaacccttcgcgcaggccgtcgaggcggtcgccgaactcggcgaattcgccgtctacgacctgggcggcggcctcggctcccgctacacctacgccgaccgaccgcccgcggtggaggcgtacctcgacgccgtcaccgacgtcgcccgacgcctgctgcccgctgacgcccgcatcctcatcgagccgggccgctcgatggtcgccgagtccggcgtctcgctgtaccgggtcgtctccgtcaagcgcggcggaggccacaccttcgtcgccgtcgacggcggcatgggcgacaacctcgaagtctccctgtaccagcagcgcttcgaggccgccgtcgccggccgcccgaccggcgagggcgagctgtgccgcctggtgggccggcactgcgagtccggcgacatcctcagcgccggcgtcccgctggcggacccgcgcgtcggggacctgatcgccgtgccggtcaccggcgcctacacctatgcgttgagcaacaattacaacggcgcgcgtcgcccgccggtggtcttcgtccgcgacggcgcgcaccgcgccgtggtacgccgcgagacctacgccgacctgatgcgccgggacctgccgtag

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1706

<212> DNA/RNA

<213> 赖氨酸脱羧酶cadA上游同源片段基因序列(Unknown)

<400> 1

agacctacgc cgacctgatg cgccgggacc tgccgtagcg gcgcagccgg ccgagccggg 60

ctcagcttgt tccttatcat cggcggtcac gccgagcgac gagagtctcg gggcgtttga 120

cggtctcgcc cgcgtcgtag cgggtggcgg ggtgccggtt cttggagccg ggtggtcgtc 180

ctggccccgg cggggtgggt ttggctgcac gggccggact gcctaggcgg gggcggatgt 240

tcctgaaccc gcgccggacg cggctcgggg ggagcgcggt gccggggcgt gtggtcttct 300

cccagggcct gcgctggtcg gctgcgagcg ggagtgcgag gcggagttgg gtgtgggctg 360

cgatgacggg ccaggtccac cggtccgcag atcgcgggtc gtgtagccgg gggcgggtcc 420

agcccaggga ctgctggaac aagcggaacg tgtgctccag gtcgaatctg cgccgagcgg 480

tgggtgagcc ggggatggac ccggtcccag gcgcgggtct cagccctgcc gtagcgaggt 540

gtgtcggtca ccgccttgcc actgaccggc cacgatcagg cgctcgacca cggcccgcag 600

ctggtcggcg gtgacggccg cggcgtcgtc ggtgggcccg agctggaccg cgtccaggag 660

ctgggtccac aacgtgcggt ccggcccgtc cgccagcaca ctcatccccg cggccttcct 720

cgtgatcatg aactccccta cttcttcgcg gagttcagga tcacgaggaa ggccgccctg 780

atacgctgcg attactccac agagtgacca cgggaccggg cccgatgttg aggatccaac 840

tcagcgttcc tgcatgttga ggtcacggac gcagaacccg tggtgttccc agtcctcatt 900

cagcaccacc cgcaggcact cgaccaccgg cttgccctcg gcgtacggcg gccagcccgg 960

tcccgcagga acgggagcga ctgcggacag ctcctcgatc gtcacggtcg ccagccaacg 1020

ctccagcttg gcggactgtt cgtctctgac ggccagtacc tcgtcgaggt ctggggtcgc 1080

cgctcgatcg aggccctgtt cctcctgatc gggcacgaag tcggacgcca acccgatccc 1140

agtgaagggc tgggtcgatc ccaggcagca gcggcgaaac cacgagtcgt gcacgaacac 1200

caggtggcgc agggtctcca ccgccgacca ctcgccggcg acacgccggt gctcggagcc 1260

cgcgggcatc gcgcggagcc gctccaccgt cctcgcccag cattcctgta gctgtcgatg 1320

ggctttccgc agatcggccg ggtcatctga gcgcatcagc aaccgaactg gataccgccg 1380

gtcgagctcg gcctccacgt aggacgtcac ctccacaccg ttgaccacca ggttgctgac 1440

cagcccgtcg accacgacgt cccgcatcac cacgccggtc agccgggcgc gggtcaggtc 1500

gcactcgcga aactcggcgt cggtcagatc ctgatcttca aagctcacca tgccgagcat 1560

tgtgtaccgg cgggccgaca ccaggggggt gttcagaagg agatgggcca tgcgcggggc 1620

gtccgaaaca tcgttcgagg tcagaggtta aggaacaagc tcagaagccg ttgtcgtacc 1680

gatagtggtg ttcgtgggtt cgaggt 1706

<210> 2

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> cadA-L-F(Unknown)

<400> 2

cggaattcag acctacgccg acctgatgc 29

<210> 3

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> cadA-L-R(Unknown)

<400> 3

gtggtttgtt tgccggatca aacctcgaac ccacgaacac cac 43

<210> 4

<211> 1585

<212> DNA/RNA

<213> 赖氨酸脱羧酶cadA下游同源片段基因序列(Unknown)

<400> 4

accgtcctcg ccctcttcct ggcgcagccg gtgcagcgcg ccgcaggcgt ccggcaggcc 60

gagcgactcc gtcgcgtcgg cgaggtgcag cagcagcacc gccagcgcca tgtcctccac 120

ggtgcgtacg gccggtccgc ggacggccgg atgccgcagc gcccgcagcg cggcgtccgc 180

ctgcgcccgc acgtcggcga tccggcccat cgactcggcc gggccgccga cggcgaccac 240

gtagtcaccg gccagtgggg tccgcgcgag gaagtcgcgg gccagggcgg cggccgactc 300

caaggccgtg gcgtgttccg gaggccagcc ggccagtacg tacaccactc cggtgcccgc 360

caccagggcc gaacgagggt gcacggcagc caggaagtac tccagcgtgt ccgcgaaccg 420

gcgtagcccg gcggcgtcca gcgcgtcgga gtccgacgcg tctgatcctg tgcggccggc 480

cagccgcggg gccgcggcca ggacgcagac cgggccggag cccagctgca gccggctcgc 540

ctccaccgga tcggccgccc cgccgagtac cgcggcggcc aactcgccgc gctggcggcg 600

ggcgtagctg gtctccgtgc gcaggccgac cagttgcagc gcgaccaccg gtgcgaattc 660

gcgcagccgg gctgtggccg cctcgtcgag cggaccggtg acggcggccc agatgtagcc 720

gaggacgtcc gaaccggccc ggaccgcgat ggccaccctt gccagctgat ccgccccggt 780

cgcctccatg tacaccggtt cggtgctggc atggagccgc tcgaactcct gacgctcgcg 840

ctgttcggcg agcgtccgct ggtgcacggc ccgccccagg atgctctcga tccgctcgga 900

gtcggtccgg tcctgcccct ccgaccaggc gaccagcgcg gagaagcggt cctcgatggt 960

gaccggggcg ccgacggcct catagaccgc gttcgccagg gcgaacagct ccgcgccgct 1020

gccggccgag cgcacgcgcg tcctcgcgta ctcgagcagc tgctcacgga cagtcgtcgc 1080

cacgtgcatc caggacgcgc cctggttgac ctcgatgatc gccggcctgt cgtcggccga 1140

cggcggcacc ggggccttca ccgccagcac ctccgcgcca gcctccgaca tggccgcggt 1200

cagctcgcgc agctcggcct ccgtggtcac gcccaccccc agcaccacgc acccgggtcc 1260

gagctgtgcc ggcgcacccg gcgcatggat ggcgatgtcg gtgagcggcc cgccgctgcc 1320

ggtcccctcc tggacgaggc gcagcagcgc cgggccgatg ttgtccacga gctgacggac 1380

gggcaggtgc ccccgagcgc cggactcccg catggtgcac tcccgactcg aaggattgtt 1440

gtgggcgtca agtctgggag acccgcattg acgatgtcaa cgatgatccg gagtgaccgt 1500

agcgggacga tggcaggaga gcgggacgga tcagtggcac aaggagtgcg gatggcaacg 1560

acgcagacgc aaacaggccg ggaac 1585

<210> 5

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> cadA-R-F(Unknown)

<400> 5

gatcggtctt gccttgctcg taccgtcctc gccctcttcc tg 42

<210> 6

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> cadA-R-R(Unknown)

<400> 6

cggaattcgt tcccggcctg tttgcgtct 29

<210> 7

<211> 1415

<212> DNA/RNA

<213> 安普霉素抗性基因片段(Unknown)

<400> 7

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 60

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 120

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 180

cacctagatc cttttggttc atgtgcagct ccatcagcaa aaggggatga taagtttatc 240

accaccgact atttgcaaca gtgccgttga tcgtgctatg atcgactgat gtcatcagcg 300

gtggagtgca atgtcgtgca atacgaatgg cgaaaagccg agctcatcgg tcagcttctc 360

aaccttgggg ttacccccgg cggtgtgctg ctggtccaca gctccttccg tagcgtccgg 420

cccctcgaag atgggccact tggactgatc gaggccctgc gtgctgcgct gggtccggga 480

gggacgctcg tcatgccctc gtggtcaggt ctggacgacg agccgttcga tcctgccacg 540

tcgcccgtta caccggacct tggagttgtc tctgacacat tctggcgcct gccaaatgta 600

aagcgcagcg cccatccatt tgcctttgcg gcagcggggc cacaggcaga gcagatcatc 660

tctgatccat tgcccctgcc acctcactcg cctgcaagcc cggtcgcccg tgtccatgaa 720

ctcgatgggc aggtacttct cctcggcgtg ggacacgatg ccaacacgac gctgcatctt 780

gccgagttga tggcaaaggt tccctatggg gtgccgagac actgcaccat tcttcaggat 840

ggcaagttgg tacgcgtcga ttatctcgag aatgaccact gctgtgagcg ctttgccttg 900

gcggacaggt ggctcaagga gaagagcctt cagaaggaag gtccagtcgg tcatgccttt 960

gctcggttga tccgctcccg cgacattgtg gcgacagccc tgggtcaact gggccgagat 1020

ccgttgatct tcctgcatcc gccagaggcg ggatgcgaag aatgcgatgc cgctcgccag 1080

tcgattggct gagctcatga gcggagaacg agatgacgtt ggaggggcaa ggtcgcgctg 1140

attgctgggg caacacgtgg agcggatcgg ggattgtctt tcttcagctc gctgatgata 1200

tgctgacgct caatgccgtt tggcctccga ctaacgaaaa tcccgcattt ggacggctga 1260

tccgattggc acggcggacg gcgaatggcg gagcagacgc tcgtccgggg gcaatgagat 1320

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtat cgggccctgg ccagctagct agagtcgacc 1380

tgcaggtccc cggggatcgg tcttgccttg ctcgt 1415

<210> 8

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> cadA-apr-F(Unknown)

<400> 8

gtggtgttcg tgggttcgag gtttgatccg gcaaacaaac cac 43

<210> 9

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> cadA-apr-R(Unknown)

<400> 9

caggaagagg gcgaggacgg tacgagcaag gcaagaccga tc 42

<210> 10

<211> 4722

<212> DNA/RNA

<213> 赖氨酸脱羧酶cadA敲除组件融合片段(Unknown)

<400> 10

cggaattcag acctacgccg acctgatgcg ccgggacctg ccgtagcggc gcagccggcc 60

gagccgggct cagcttgttc cttatcatcg gcggtcacgc cgagcgacga gagtctcggg 120

gcgtttgacg gtctcgcccg cgtcgtagcg ggtggcgggg tgccggttct tggagccggg 180

tggtcgtcct ggccccggcg gggtgggttt ggctgcacgg gccggactgc ctaggcgggg 240

gcggatgttc ctgaacccgc gccggacgcg gctcgggggg agcgcggtgc cggggcgtgt 300

ggtcttctcc cagggcctgc gctggtcggc tgcgagcggg agtgcgaggc ggagttgggt 360

gtgggctgcg atgacgggcc aggtccaccg gtccgcagat cgcgggtcgt gtagccgggg 420

gcgggtccag cccagggact gctggaacaa gcggaacgtg tgctccaggt cgaatctgcg 480

ccgagcggtg ggtgagccgg ggatggaccc ggtcccaggc gcgggtctca gccctgccgt 540

agcgaggtgt gtcggtcacc gccttgccac tgaccggcca cgatcaggcg ctcgaccacg 600

gcccgcagct ggtcggcggt gacggccgcg gcgtcgtcgg tgggcccgag ctggaccgcg 660

tccaggagct gggtccacaa cgtgcggtcc ggcccgtccg ccagcacact catccccgcg 720

gccttcctcg tgatcatgaa ctcccctact tcttcgcgga gttcaggatc acgaggaagg 780

ccgccctgat acgctgcgat tactccacag agtgaccacg ggaccgggcc cgatgttgag 840

gatccaactc agcgttcctg catgttgagg tcacggacgc agaacccgtg gtgttcccag 900

tcctcattca gcaccacccg caggcactcg accaccggct tgccctcggc gtacggcggc 960

cagcccggtc ccgcaggaac gggagcgact gcggacagct cctcgatcgt cacggtcgcc 1020

agccaacgct ccagcttggc ggactgttcg tctctgacgg ccagtacctc gtcgaggtct 1080

ggggtcgccg ctcgatcgag gccctgttcc tcctgatcgg gcacgaagtc ggacgccaac 1140

ccgatcccag tgaagggctg ggtcgatccc aggcagcagc ggcgaaacca cgagtcgtgc 1200

acgaacacca ggtggcgcag ggtctccacc gccgaccact cgccggcgac acgccggtgc 1260

tcggagcccg cgggcatcgc gcggagccgc tccaccgtcc tcgcccagca ttcctgtagc 1320

tgtcgatggg ctttccgcag atcggccggg tcatctgagc gcatcagcaa ccgaactgga 1380

taccgccggt cgagctcggc ctccacgtag gacgtcacct ccacaccgtt gaccaccagg 1440

ttgctgacca gcccgtcgac cacgacgtcc cgcatcacca cgccggtcag ccgggcgcgg 1500

gtcaggtcgc actcgcgaaa ctcggcgtcg gtcagatcct gatcttcaaa gctcaccatg 1560

ccgagcattg tgtaccggcg ggccgacacc aggggggtgt tcagaaggag atgggccatg 1620

cgcggggcgt ccgaaacatc gttcgaggtc agaggttaag gaacaagctc agaagccgtt 1680

gtcgtaccga tagtggtgtt cgtgggttcg aggtttgatc cggcaaacaa accaccgctg 1740

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 1800

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 1860

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg gttcatgtgc 1920

agctccatca gcaaaagggg atgataagtt tatcaccacc gactatttgc aacagtgccg 1980

ttgatcgtgc tatgatcgac tgatgtcatc agcggtggag tgcaatgtcg tgcaatacga 2040

atggcgaaaa gccgagctca tcggtcagct tctcaacctt ggggttaccc ccggcggtgt 2100

gctgctggtc cacagctcct tccgtagcgt ccggcccctc gaagatgggc cacttggact 2160

gatcgaggcc ctgcgtgctg cgctgggtcc gggagggacg ctcgtcatgc cctcgtggtc 2220

aggtctggac gacgagccgt tcgatcctgc cacgtcgccc gttacaccgg accttggagt 2280

tgtctctgac acattctggc gcctgccaaa tgtaaagcgc agcgcccatc catttgcctt 2340

tgcggcagcg gggccacagg cagagcagat catctctgat ccattgcccc tgccacctca 2400

ctcgcctgca agcccggtcg cccgtgtcca tgaactcgat gggcaggtac ttctcctcgg 2460

cgtgggacac gatgccaaca cgacgctgca tcttgccgag ttgatggcaa aggttcccta 2520

tggggtgccg agacactgca ccattcttca ggatggcaag ttggtacgcg tcgattatct 2580

cgagaatgac cactgctgtg agcgctttgc cttggcggac aggtggctca aggagaagag 2640

ccttcagaag gaaggtccag tcggtcatgc ctttgctcgg ttgatccgct cccgcgacat 2700

tgtggcgaca gccctgggtc aactgggccg agatccgttg atcttcctgc atccgccaga 2760

ggcgggatgc gaagaatgcg atgccgctcg ccagtcgatt ggctgagctc atgagcggag 2820

aacgagatga cgttggaggg gcaaggtcgc gctgattgct ggggcaacac gtggagcgga 2880

tcggggattg tctttcttca gctcgctgat gatatgctga cgctcaatgc cgtttggcct 2940

ccgactaacg aaaatcccgc atttggacgg ctgatccgat tggcacggcg gacggcgaat 3000

ggcggagcag acgctcgtcc gggggcaatg agatatgaaa aagcctgaac tcaccgcgac 3060

gtatcgggcc ctggccagct agctagagtc gacctgcagg tccccgggga tcggtcttgc 3120

cttgctcgta ccgtcctcgc cctcttcctg gcgcagccgg tgcagcgcgc cgcaggcgtc 3180

cggcaggccg agcgactccg tcgcgtcggc gaggtgcagc agcagcaccg ccagcgccat 3240

gtcctccacg gtgcgtacgg ccggtccgcg gacggccgga tgccgcagcg cccgcagcgc 3300

ggcgtccgcc tgcgcccgca cgtcggcgat ccggcccatc gactcggccg ggccgccgac 3360

ggcgaccacg tagtcaccgg ccagtggggt ccgcgcgagg aagtcgcggg ccagggcggc 3420

ggccgactcc aaggccgtgg cgtgttccgg aggccagccg gccagtacgt acaccactcc 3480

ggtgcccgcc accagggccg aacgagggtg cacggcagcc aggaagtact ccagcgtgtc 3540

cgcgaaccgg cgtagcccgg cggcgtccag cgcgtcggag tccgacgcgt ctgatcctgt 3600

gcggccggcc agccgcgggg ccgcggccag gacgcagacc gggccggagc ccagctgcag 3660

ccggctcgcc tccaccggat cggccgcccc gccgagtacc gcggcggcca actcgccgcg 3720

ctggcggcgg gcgtagctgg tctccgtgcg caggccgacc agttgcagcg cgaccaccgg 3780

tgcgaattcg cgcagccggg ctgtggccgc ctcgtcgagc ggaccggtga cggcggccca 3840

gatgtagccg aggacgtccg aaccggcccg gaccgcgatg gccacccttg ccagctgatc 3900

cgccccggtc gcctccatgt acaccggttc ggtgctggca tggagccgct cgaactcctg 3960

acgctcgcgc tgttcggcga gcgtccgctg gtgcacggcc cgccccagga tgctctcgat 4020

ccgctcggag tcggtccggt cctgcccctc cgaccaggcg accagcgcgg agaagcggtc 4080

ctcgatggtg accggggcgc cgacggcctc atagaccgcg ttcgccaggg cgaacagctc 4140

cgcgccgctg ccggccgagc gcacgcgcgt cctcgcgtac tcgagcagct gctcacggac 4200

agtcgtcgcc acgtgcatcc aggacgcgcc ctggttgacc tcgatgatcg ccggcctgtc 4260

gtcggccgac ggcggcaccg gggccttcac cgccagcacc tccgcgccag cctccgacat 4320

ggccgcggtc agctcgcgca gctcggcctc cgtggtcacg cccaccccca gcaccacgca 4380

cccgggtccg agctgtgccg gcgcacccgg cgcatggatg gcgatgtcgg tgagcggccc 4440

gccgctgccg gtcccctcct ggacgaggcg cagcagcgcc gggccgatgt tgtccacgag 4500

ctgacggacg ggcaggtgcc cccgagcgcc ggactcccgc atggtgcact cccgactcga 4560

aggattgttg tgggcgtcaa gtctgggaga cccgcattga cgatgtcaac gatgatccgg 4620

agtgaccgta gcgggacgat ggcaggagag cgggacggat cagtggcaca aggagtgcgg 4680

atggcaacga cgcagacgca aacaggccgg gaaccttaag gc 4722

<210> 11

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> cadA-F(Unknown)

<400> 11

atggcaacga cgcagacgca 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> cadA-R(Unknown)

<400> 12

ctacggcagg tcccggcgca tc 22

<210> 13

<211> 1287

<212> DNA/RNA

<213> cadA(Unknown)

<400> 13

atggcaacga cgcagacgca aacaggccgg gaactgctgg gactgttccc gcccgggacc 60

acccgggacg ggagcggcgg actggtgatc ggcggcgtac cggcggccga actcgccgag 120

tcctacggca ctcccgcgct gatcctcgac gaggcttcgg tccgcgcccg cgcccgccgg 180

tacgccgacg gcctggccgc ccgttggccg aactcccgca ccgtcttcgc ctccaaggcc 240

ttcccctgca ccgccgtcat ccggctgctc gcggaggagg gcctcggcat cgacgtggcc 300

ggcggcggcg agctgaccct cgccctcgcc gcaggcgcgg acccggccgg cctggtcgtc 360

cacggcaacg ccaagaccga ggaggaactg cgcctcgccg tcgaggccgg cgccgggacg 420

atcgtcgtcg acaacttcga cgacatcgac cggctggaga agatcctcgc cgacaccgcg 480

gcggagcagg gagtactggt ccgggtcacc cccggcatct gccccgacac ccacgaggcc 540

gtgtccaccg gccagaacgg ctccaagttc ggtctgcccc tgccgcaggc ccgggcggcg 600

atcgcgcggc tgcgcggcag cgaccggctg cggctggacg gcgtccacgt gcacgtcggg 660

tcgcagatcc tggacctcga acccttcgcg caggccgtcg aggcggtcgc cgaactcggc 720

gaattcgccg tctacgacct gggcggcggc ctcggctccc gctacaccta cgccgaccga 780

ccgcccgcgg tggaggcgta cctcgacgcc gtcaccgacg tcgcccgacg cctgctgccc 840

gctgacgccc gcatcctcat cgagccgggc cgctcgatgg tcgccgagtc cggcgtctcg 900

ctgtaccggg tcgtctccgt caagcgcggc ggaggccaca ccttcgtcgc cgtcgacggc 960

ggcatgggcg acaacctcga agtctccctg taccagcagc gcttcgaggc cgccgtcgcc 1020

ggccgcccga ccggcgaggg cgagctgtgc cgcctggtgg gccggcactg cgagtccggc 1080

gacatcctca gcgccggcgt cccgctggcg gacccgcgcg tcggggacct gatcgccgtg 1140

ccggtcaccg gcgcctacac ctatgcgttg agcaacaatt acaacggcgc gcgtcgcccg 1200

ccggtggtct tcgtccgcga cggcgcgcac cgcgccgtgg tacgccgcga gacctacgcc 1260

gacctgatgc gccgggacct gccgtag 1287

Claims (7)

1.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA（Streptomyces diastatochromogenes ΔcadA），其特征在于：其构建步骤如下：

提取E. coli DH5α转化子中的重组质粒pJTU 412-ΔcadA，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37 ℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD₆₀₀=0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中得到阳性转化子菌悬液，置于冰上备用；

其中，所述卡那霉素的终浓度为50-100 μg/mL、安普霉素的终浓度为50-100 μg/mL和氯霉素的终浓度为25-50 μg/mL；

向贝纳特培养基上产孢的淀粉酶产色链霉菌TUST（Streptomyces diastatochromogenes TUST）菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30 ℃，180-200 r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50 ℃水浴热激10 min，将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37 ℃条件下震荡培养2-3 h使孢子萌发，5000 r/min 离心5-10 min收集孢子，用TES缓冲液重悬得到孢子悬液备用；

将步骤

的阳性转化子大肠杆菌菌悬液和步骤

萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子悬液等体积混合，均匀涂布于含有5 mM MgCl₂的SFM培养基上，30 ℃倒置培养14-18 h后，用含浓度为10-25 mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为 10-25 mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆得到基因工程高产菌株S. diastatochromogenes ΔcadA；

所述赖氨酸脱羧酶基因cadA重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建步骤如下：

敲除组件的获得：

敲除组件包含cadA基因的等位位点，即该基因的上游同源片段及下游同源片段，以及用于替换目的基因的抗性片段即安普霉素抗性作为筛选标记；

以S. diastatochromogenes TUST的基因组为模板，根据cadA基因分别设计上下游同源片段引物序列cadA-L-F/cadA-L-R和cadA-R-F/cadA-R-R；以pSET 152质粒为模板，根据安普霉素Apr抗性基因设计引物序列cadA-apr-F/cadA-apr-R；

在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoR I的酶切位点；

引物的序列为：

cadA-L-F：SEQ No.2；

cadA-L-R：SEQ No.3；

cadA-R-F：SEQ No.5；

cadA-R-R：SEQ No.6；

cadA-apr-F：SEQ No.8；

cadA-apr-R：SEQ No.9；

赖氨酸脱羧酶基因cadA上游同源片段的序列为SEQ No.1，赖氨酸脱羧酶基因cadA下游同源片段的序列为SEQ No.4，安普霉素Apr抗性基因的序列为SEQ No.7；

重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建：

以S. diastatochromogenes TUST的基因组为模板，分别扩增目的基因上下游片段作为同源臂，以pSET 152质粒为模板扩增安普霉素Apr片段，利用SOE-PCR将同源左臂、同源右臂以及安普霉素片段进行融合；将纯化后的融合片段和出发载体pJTU 412分别进行EcoR I单酶切，16 ℃条件下，在T4 DNA ligase作用下与融合片段进行过夜连接，连接产物通过化学转化的方法转入到E. coli DH5α感受态筛选转化子，保存；

所述淀粉酶产色链霉菌S. diastatochromogenes TUST为保藏号为CGMCC No.3145的菌株。

2.根据权利要求1所述的基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA，其特征在于：敲除的基因序列与SEQ No.13有90%以上的相似性。

3.根据权利要求1所述的基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA，其特征在于：所述步骤

中每1 L M3G培养基组成为：

(NH₄)₂SO₄ 10 g/L，KH₂PO₄ 1.36 g/L，K₂HPO₄ 0.8 g/L，酵母提取物5 g/L，用氨水调节pH到7.2，加水补充至1 L；

或者，每1 L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 2 g/L，酵母浸粉1 g/L，牛肉膏1 g/L，琼脂 15-20 g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1 L。

4.如权利要求1至3任一项所述的基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA在ε-聚赖氨酸生产方面中的应用。

5.一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于：所述方法首先构建赖氨酸脱羧酶基因cadA重组质粒pJTU 412-ΔcadA，并将重组质粒pJTU 412-ΔcadA转入淀粉酶产色链霉菌TUST中，获得基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的发酵水平；

所述赖氨酸脱羧酶基因cadA重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建步骤如下：

敲除组件的获得：

敲除组件包含cadA基因的等位位点，即该基因的上游同源片段及下游同源片段，以及用于替换目的基因的抗性片段即安普霉素抗性作为筛选标记；

以S. diastatochromogenes TUST的基因组为模板，根据cadA基因分别设计上下游同源片段引物序列cadA-L-F/cadA-L-R和cadA-R-F/cadA-R-R；以pSET 152质粒为模板，根据安普霉素Apr抗性基因设计引物序列cadA-apr-F/cadA-apr-R；

在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoR I的酶切位点；

引物的序列为：

cadA-L-F：SEQ No.2；

cadA-L-R：SEQ No.3；

cadA-R-F：SEQ No.5；

cadA-R-R：SEQ No.6；

cadA-apr-F：SEQ No.8；

cadA-apr-R：SEQ No.9；

赖氨酸脱羧酶基因cadA上游同源片段的序列为SEQ No.1，赖氨酸脱羧酶基因cadA下游同源片段的序列为SEQ No.4，安普霉素Apr抗性基因的序列为SEQ No.7；

重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建：

以S. diastatochromogenes TUST的基因组为模板，分别扩增目的基因上下游片段作为同源臂，以pSET 152质粒为模板扩增安普霉素Apr片段，利用SOE-PCR将同源左臂、同源右臂以及安普霉素片段进行融合；将纯化后的融合片段和出发载体pJTU 412分别进行EcoR I单酶切，16 ℃条件下，在T4 DNA ligase作用下与融合片段进行过夜连接，连接产物通过化学转化的方法转入到E. coli DH5α感受态筛选转化子，保存；

所述淀粉酶产色链霉菌S. diastatochromogenes TUST为保藏号为CGMCC No.3145的菌株。

6.根据权利要求5所述的提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于：所述发酵的生产方如下：

采用的菌株为敲除赖氨酸脱羧酶基因cadA的基因工程菌，将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生分生孢子；

然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，28-30 ℃，180-200 r/min发酵72-80 h。

7.根据权利要求6所述的提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于：每1 L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 2 g/L，酵母浸粉1 g/L，牛肉膏1 g/L，琼脂 15-20 g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L。

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