CN113265417A - 有机酸产量提高的菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

有机酸产量提高的菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乳清酸核苷‑5‑磷酸脱羧酶(PyrG)弱化的有机酸生产菌株。所述菌株的有机酸产量显著提高。进一步地，还可增强所述菌株中的组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP‑依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)。本发明还公开了该菌株的构建方法，以及利用该菌株生产有机酸尤其是柠檬酸的方法。

Description

有机酸产量提高的菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程和基因工程技术领域；具体地说，本发明涉及有机酸产量提高的菌株及其构建方法和应用。
背景技术
黑曲霉是柠檬酸等有机酸的主力生产菌株，生产菌株的选育是发酵行业的核心，菌株发酵性能的高低直接决定发酵的成败。以柠檬酸为例，柠檬酸是全球产量与销量最大的有机酸，已广泛应用食品、医药、化妆品等不同领域。目前，有机酸工业生产菌株多通过诱变筛选获得，往往存在有害突变与有利突变并存的现象，导致菌种在产量与转化率提升的同时，往往伴随生长减慢与发酵周期较长等问题。
随着黑曲霉基因组数据的公布与高效基因组编辑工具的开发，利用基因组编辑理性改造黑曲霉，有效提升菌株的综合发酵性能。菌株的理性设计与改造中，改造靶点的选择是关键。在现有技术中，改造靶点多集中于有机酸代谢途径相关的基因，如柠檬酸合酶等。虽然可提升有机酸的生产，但靶点选择比较局限。
因此，本领域急需对有机酸的生产菌株进行理性改造的方法，从而能够显著提高有机酸的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有机酸产量提高的菌株及其在有机酸生产中的应用。
本发明的另一目还在于提供改造有机酸的生产菌株的方法。
在第一方面，本发明提供一种有机酸生产菌株的构建方法，所述方法包括弱化菌株中的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)的步骤。
在优选的实施方式中，所述有机酸为柠檬酸、琥珀酸、苹果酸或富马酸；优选柠檬酸。
在优选的实施方式中，弱化菌株中的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)是指乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶在所述菌株的胞内不能正常发挥功能，或与自然状态下的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶活性相比，其在胞内的活性有所下降，甚至完全失活。
在优选的实施方式中，弱化菌株中的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)可以通过部分或全部敲除该酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行调控等方法或其组合来实现。
在优选的实施方式中，通过在乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因的编码序列上游插入基因表达调控系统，通过控制效应物的添加量来弱化乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶。
在优选的实施方式中，所述基因表达调控系统包括但不限于Tet-on基因表达调控系统、RNA干扰基因表达系统、小RNA调控系统。
在进一步的优选实施方式中，所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)的弱化，与野生型乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)的活性相比，所述菌株中的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)的编码基因的转录、表达降低至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，或者所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)的活性降低至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；或者所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)的编码基因被去除。
在具体的实施方式中，所述菌株是真菌；优选地，所述菌株选自黑曲霉(Aspergilus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉；更优选黑曲霉。
在具体的实施方式中，所述方法还包括增强菌株中的组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)。
在优选的实施方式中，增强菌株中的组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)是指与自然状态下的所述蛋白的活性相比，其在胞内的活性升高。
在优选的实施方式中，增强菌株中的组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)的方法包括但不限于：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性。
在优选的实施方式中，通过在组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)基因的编码序列上游插入基因表达调控系统，通过控制基因表达调控系统相应的效应物的添加量来增强组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)。
在优选的实施方式中，通过在乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶、组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)基因的编码序列上游分别插入不同的基因表达调控系统，从而通过控制不同效应物的添加量来弱化乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶，同时增强组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)。
在优选的实施方式中，与野生型菌株相比，所述菌株的有机酸产量提高至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少150％、至少200％、或至少210％。
在优选的实施方式中，所述方法还包括过表达选自以下的一种或多种基因：
1)苹果酸转运基因c4t318；
2)苹果酸脱氢酶基因mdh；
3)磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶；
4)琥珀酰辅酶A合成酶；
5)胞质延胡索酸酶基因fum；和
6)琥珀酸/延胡索酸线粒体转运蛋白基因sfc；
和/或
敲除选自以下的一种或多种基因：
1)琥珀酸脱氢酶基因sdh；
2)富马酸还原酶基因fr；
3)线粒体苹果酸转运蛋白基因moc；和
4)线粒体延胡索酸酶基因mtfum。
在第二方面，本发明提供一种有机酸的生产菌株，所述菌株中乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)弱化。
在具体的实施方式中，所述菌株是真菌；优选地，所述菌株选自黑曲霉(Aspergilus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉；更优选黑曲霉。
在优选的实施方式中，所述有机酸为柠檬酸、琥珀酸、苹果酸或富马酸；优选柠檬酸。
在具体的实施方式中，所述菌株中的组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)增强。
在具体的实施方式中，所述菌株通过第一方面所述的方法构建。
在优选的实施方式中，与野生型菌株相比，所述菌株的有机酸产量提高至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少150％、至少200％、或至少210％。
在第三方面，本发明提供第二方面所述的菌株或通过第一方面所述的方法构建的菌株的用途，用于生产有机酸。
在具体的实施方式中，所述菌株是真菌；优选地，所述菌株选自黑曲霉(Aspergilus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉；更优选黑曲霉。
在优选的实施方式中，所述有机酸为柠檬酸、琥珀酸、苹果酸或富马酸；优选柠檬酸。
在第四方面，本发明提供一种有机酸的生产方法，所述方法包括：
a.培养第二方面所述的菌株或通过第一方面所述的方法构建的菌株；和
b.任选从步骤a得到的培养体系中分离得到所产生的有机酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了pyrG基因插入失活菌株的基因组PCR验证结果；
图2显示了黑曲霉pyrG基因插入失活菌株的柠檬酸发酵结果；其中WT为黑曲霉野生型菌株D，AnP1-AnP5分别为pyrG基因插入失活菌株；
图3显示了pyrG基因表达调控菌株的基因组PCR验证结果；
图4显示了黑曲霉pyrG基因表达调控菌株的柠檬酸发酵结果；其中WT为黑曲霉野生型菌株D，AnTP1为pyrG基因表达调控菌株；
图5显示了黑曲霉pyrG单基因编辑与pyrG、pkaC双基因编辑菌株的柠檬酸发酵比较；其中WT为黑曲霉野生型菌株D，AnP1为pyrG基因失活菌株，AnTPkP1为pyrG与pkaC的双基因编辑菌株；
图6显示了黑曲霉单基因编辑与双基因编辑菌株的柠檬酸发酵比较；其中WT为黑曲霉野生型菌株D，AnP1为pyrG基因失活菌株，AnTLP1为pyrG与leaA的双基因编辑菌株；
图7显示了黑曲霉单基因编辑与双基因编辑菌株的柠檬酸发酵比较；其中WT为黑曲霉野生型菌株D，AnP1为pyrG基因失活菌株，AnTCP1为pyrG与cexA的双基因编辑菌株。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将有机酸的生产菌株中的pyrG基因弱化，可以显著促进有机酸的生产，提高菌株的产酸水平，从而为有机酸的生产菌株改造提供了全新的技术手段。在此基础上完成了本发明。
定义
本文所用的术语具有本领域技术人员常规理解的含义。为清晰起见，对其中的一些术语定义如下。
本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的编码基因，则该基因对于该菌株是“外源性”的。
本文所用的术语“野生型/内源性”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。
本发明所述“修饰”是指任何对野生型菌株或亲本菌株进行的遗传操作，包括但不限于各种分子生物学手段。
本文所用的术语“增强蛋白的活性”指的是通过修饰使得蛋白在微生物中的细胞内活性与自然状态的蛋白质活性相比有所提高。不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，而且其可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性，也可以非限制性地包括任何已知的方法，只要与内源性活性相比能够增强蛋白质的活性或增强引入蛋白质的活性。
本发明中术语“弱化蛋白”指的是通过修饰使得其在细胞中不能正常发挥功能，或其在胞内的活性与自然状态下的蛋白活性相比有所下降，甚至完全失去该活性。在具体的实施方式中，失活可以通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行调控等方法或其组合来实现，包括但不限于以上方法。
乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(Orotidine-5’-phosphate decarboxylase，pyrG)
在真菌中，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因是尿嘧啶核苷酸(UMP)从头合成中的关键酶，可催化乳清苷单磷酸脱去5-位羧基生成尿嘧啶核苷。pyrG基因敲除或失活菌株由于无法从头合成尿嘧啶核苷酸，而不能在基本培养基上生长；但当在基本培养基中添加尿嘧啶核苷(Uridine)时，菌株可通过补救合成途径合成尿嘧啶核苷酸，而得以生长。因此，该基因通常作为营养缺陷型筛选标记用于真菌的遗传操作。但目前，该基因的表达对有机酸积累的影响尚未见报道。
本文所用的“乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶”或“PyrG”，均是指能够催化乳清苷单磷酸脱去5-位羧基生成尿嘧啶核苷的酶。具体地说，本发明的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:38所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的仍然具有乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶功能的衍生蛋白或多肽。
组蛋白甲基转移酶(Methyltransferase；laeA)
本文所用的“组蛋白甲基转移酶”或“LaeA”，均是指能够催化组蛋白H3K4与H3K9等赖氨酸位点甲基化的甲基转移酶。具体地说，本发明的组蛋白甲基转移酶具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:39所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的仍然具有组蛋白甲基转移酶功能的衍生蛋白或多肽。
cAMP-依赖的蛋白激酶催化亚基(Catalytic subunit of cAMP-dependentprotein kinase；pkaC)
本文所用的“cAMP-依赖的蛋白激酶亚基”或“PkaC”，均是指能够催化cAMP/PKA信号转导通路的靶标蛋白磷酸化修改的蛋白激酶。具体地说，本发明的cAMP-依赖的蛋白激酶亚基具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:40所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的仍然具有cAMP-依赖的蛋白激酶亚基功能的衍生蛋白或多肽。
柠檬酸转运蛋白(Citrate exporter；CexA)
本文所用的“柠檬酸转运蛋白”或“CexA”，均是指能够将胞内柠檬酸转运至胞外的外排蛋白。具体地说，本发明的柠檬酸外排蛋白具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:41所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的仍然具有柠檬酸外排蛋白功能的衍生蛋白或多肽。
本发明的菌株及其构建方法
本发明提供一种有机酸生产能力提升的菌株，其通过基因编辑方法对基因pyrG进行基因编辑，获得基因pyrG突变的重组菌，或进一步对黑曲霉基因laeA进行表达调控，获得基因pyrG突变与laeA表达增强的重组菌，或进一步对黑曲霉基因pkaC进行表达调控，获得基因pyrG突变与pkaC表达增强的重组菌，或进一步对黑曲霉基因cexA进行表达调控，获得基因pyrG突变与cexA表达增强的重组菌。利用基因编辑获得的单/双基因编辑的工程菌株，有机酸合成能力得到了显著提高，从而提高了黑曲霉有机酸的生产能力。
本文所用的术语“有机酸生产菌株”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即其中乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)弱化的菌株。鉴于本发明的教导，本领域技术人员可以理解本文所述的有机酸生产菌株可以包括任何菌株，只要所述菌株中的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)弱化。所述生产菌株可以来自黑曲霉(Aspergilus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)等菌株中的任一种，优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉，最优选黑曲霉。
具体地，本发明所述的生产菌株是指能够生产有机酸的菌株，即，当细菌在培养中被培养时能够产生有机酸并且能够积累有机酸，或者能够将有机酸分泌到培养基中，也就是能够得到胞外的游离有机酸，特别是指与野生型菌株或者亲本菌株相比，能够积累更多有机酸的能力。为了赋予菌株产有机酸的能力，可以采用传统的育种方法，比如培育营养缺陷型的突变株、抗类似物的菌株，或者能够产有机酸的代谢控制突变株，以及培育氨基酸生物合成相关酶活性提高的重组菌株的方法，或者以上方法的组合。
在具体实施方式中，本发明为了显著提高黑曲霉产柠檬酸的能力，弱化了乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)，也可以进一步增强菌株中的组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)。此外，本领域技术人员在得到本发明的启示后，也可以为了提高其他有机酸的产量而进行相关的改造。如为了更显著提高黑曲霉苹果酸合成能力，还可以通过基因重组方法过表达米曲霉的苹果酸转运基因c4t318与黑曲霉苹果酸脱氢酶基因mdh。为了更显著提高黑曲霉琥珀酸合成能力，还可以通过基因重组方法过表达黑曲霉磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶与琥珀酰辅酶A合成酶和通过基因编辑方法敲除黑曲霉琥珀酸脱氢酶基因sdh。为了更显著提高黑曲霉富马酸合成能力，还可以通过基因重组方法过表达胞质延胡索酸酶基因fum与琥珀酸/延胡索酸线粒体转运蛋白基因sfc和通过基因编辑方法敲除黑曲霉富马酸还原酶基因fr、线粒体苹果酸转运蛋白基因moc与线粒体延胡索酸酶基因mtfum。
鉴于本发明的教导和本领域常规技术手段，本领域技术人员可以采用本领域已知的各种方法改造有机酸生产菌株。例如，可以通过增加编码蛋白的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白的基因以增加蛋白的活性、在染色体上编码蛋白的基因中引入修饰以增强蛋白的活性。还可以通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行调控等方法或其组合来弱化蛋白。
在具体的实施方式中，采用CRISPR/Cas9方法在乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶、cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)、组蛋白甲基转移酶(LaeA)、柠檬酸转运蛋白(CexA)的编码序列上游插入基因表达调控系统，从而能够通过控制效应物的添加量来弱化乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶，或者增强cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)、组蛋白甲基转移酶(LaeA)、柠檬酸转运蛋白(CexA)。所述基因表达调控系统包括但不限于Tet-on基因表达调控系统、RNA干扰基因表达系统、小RNA调控系统。
本领域技术人员知晓，所述Tet-on基因表达调控系统是通过效应物(如强力霉素)与调控蛋白结合后，改变调控蛋白的构象，从而实现对目标基因表达水平的调控，其中效应物包括但不限于强力霉素、四环素等等；所述RNA干扰基因表达系统是利用双链RNA(dsRNA)诱导目标基因的mRNA特异性降解，从而实现对目标基因表达水平的调控；所述小RNA调控系统是指利用如反义RNA或核糖体开关等较小的RNA调控目标基因的mRNA稳定性或翻译速度，从而实现对目标基因表达水平的调控。
在优选的实施方式中，可以在乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶、组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)基因的编码序列上游分别插入不同的基因表达调控系统，从而通过控制不同效应物的添加量来弱化乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶，同时增强组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)。
与野生型菌株相比，本发明的菌株的有机酸产量显著提高；例如提高至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少150％、至少200％、至少210％。
本发明的菌株可以用于生产有机酸，包括但不限于柠檬酸、琥珀酸、苹果酸或富马酸；优选柠檬酸。
在本发明的菌株的基础上，本发明还提供了有机酸的生产方法，包括：
a.培养本发明的菌株或通过本发明的方法构建的菌株；和
b.任选从步骤a得到的培养体系中分离得到所产生的有机酸。
本发明的优点：
1.本发明为改造有机酸生产菌株提供了全新的思路；
2.本发明的有机酸生产菌株的有机酸产量显著提高；
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例
实施例1.黑曲霉pyrG基因失活菌株的构建与柠檬酸发酵测试
1)靶序列的选择
根据CRISPR/Cas9系统基因组定位的原理，需要在基因组中寻找含有PAM(NGG)的靶位点。本发明选择PyrG编码基因的以下位点作为靶位点，用于黑曲霉pyrG基因(ID:56726)失活菌株的构建。具体序列如下：
sgRNA-pyrG1：GAAGACCAATGTGACTGTCT(SEQ ID NO:1)
2)sgRNA表达盒的构建
本发明采用黑曲霉自身的5S rRNA(可被RNA聚合酶III所识别)作为启动子，中间添加HDV为核酶完成sgRNA转录的自我加工，以此来构建sgRNA的表达盒。含有靶序列sgRNA-pyrG1的构建采用靶序列双链合成后退火磷酸化直接连接至酶切与去磷酸化处理的sgRNA表达盒克隆载体p5S-sgRNA中，获得sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-pyrG1。
sgRNA-pyrG1-F：caccGAAGACCAATGTGACTGTCT(SEQ ID NO:2)
sgRNA-pyrG1-R：aaacAGACAGTCACATTGGTCTTC(SEQ ID NO:3)
3)CRISPR/Cas9系统的黑曲霉原生质体转化
本发明采用将Cas9蛋白表达载体pCas9、sgRNA表达盒片段sgRNA-pyrG1与供体DNA片段MHi-pyrG1-hyh共转化至黑曲霉D(购买于上海工微所科技有限公司(原上海工业微生物研究所)菌种资源库，公开保藏号M202)的原生质细胞中，以构建黑曲霉pyrG插入失活的菌株。
(1)sgRNA表达盒片段sgRNA-pyrG1的制备
sgRNA-pyrG1片段采用以5S-Fm与sgRNA-Rm为引物以sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-pyrG1为模板进行PCR而获得。
5S-F：GGTTGGAGATTCCAGACTCAG(SEQ ID NO:4)
sgRNA-R：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO:5)
PCR反应体系为5×FastPfu buffer 10μL,10mM dNTPs 1μL,上游/下游引物各2.5μL，DNA模板0.5μL，FastPfu(TransGene)1.5μL,超纯水32μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(2)供体DNA片段MHi-pyrG1-hyh的制备
含超短同源臂pyrG基因的供体DNA片段MHi-pyrG1-hyh序列中，上下游同源臂位置分别紧邻靶序列sgRNA-pyrG1的上游与下游。为避免在打靶片段同源重组后，会被Cas9再次识别并切割，在下游同源臂的设计中并不包含PAM序列。供体DNA片段MHi-pyrG1-hyh的构建采用一步PCR的方法来完成，直接以MHi-pyrG1-Fm与MHi-pyrG1-Rm为引物以pSilent-1为模板进行PCR扩增，来获得供体DNA片段MHi-pyrG1-hyh。
MHi-pyrG1-Fm:ttcgagattgccgaggccaagaagaccaatgtgactgtctGACGTTAACTGATATTGAAGGAGC(SEQ ID NO:6)
MHi-pyrG1-Rm:tcagcaagatctagtagctccttagtggtggtaacgtcagAACCCAGGGGCTGGTGACGG(SEQ ID NO:7)
PCR反应体系为5×FastPfu buffer 10μL,10mM dNTPs 1μL,上游/下游引物各2.5μL，DNA模板0.5μL，FastPfu(TransGene)1.5μL,超纯水32μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环，每个循环的退火温度降1℃；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(3)PEG-介导的原生质体转化
取黑曲霉野生型D孢子悬浮于200mL CMA液体培养基(Dextrose 20g/L，DifcoBrand Malt Extract 20g/L，Bacto Peptone 1g/L)中，孢子悬液的终浓度为105/mL，在30℃、200r/min的条件培养12-16h。在无菌条件下用无菌的Micro-cloth滤布收集菌体，并用溶液A(K2HPO4 5mM,KH2PO4 5mM,MgSO4 96.312g/L,pH 5.8，过滤除菌)冲洗一次，用无菌棉签将其转移到20mL的裂解液(0.4g裂解酶于20mL溶液A)中，在37℃、75r/min条件下裂解约两个小时左右。用无菌的Micro-cloth滤布过滤上述裂解液，并用两个50mL无菌离心管收集原生质体，用溶液B(Tris-HCl 10mM,CaCl2 5.54g/L,D-Sorbitol 218.64g/L,pH 7.5，过滤除菌)冲洗定容使每管大约25mL。在2000r/min条件下离心5min弃去上清，用20mL溶液B对沉淀再重悬沉淀两次。将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，将两管合为一管并用血球计数板对原生质体计数。离心并根据计数结果加入适量溶液B重悬一次。在冰上向预先冷却的15mL离心管中加入100μL原生质体悬液、2μg pCas9、2μg sgRNA-pyrG1与2μgMHi-pyrG1-hyh，向其加入1mL溶液C(Tris-HCl 10mM,CaCl2 5.54g/L,PEG600050％(w/v),pH 7.5，过滤除菌)冰浴10min，2mL溶液B并混匀。与预热的含有潮霉素的上层培养基MMSH混匀后，再平铺至下层培养基MMSH平板上。将平板在30℃培养箱中培养3-5天直到长出转化子为止。
4)黑曲霉pyrG基因失活菌株的验证
采用天根新型植物基因组提取试剂盒DP350提取已进行二次传代分纯后转化子的基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模版，用引物pyrG1-g-F和pyrG1-g-R对转化子进行基因PCR验证。
引物序列如下：
pyrG1-g-F:CATGTGCAGCAGGGAATACGAG(SEQ ID NO:8)
pyrG1-g-R:GTTTCCGCTTCCGTATCCGTTG(SEQ ID NO:9)
PCR反应体系为：2×Taq Buffer 10μL，上游/下游引物各1μL，DNA模板1μL，去离子水7μL。
PCR反应条件为：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃10min。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(150V电压，20分钟)。
Cas9在sgRNA-pyrG1介导下对pyrG基因进行了定点切割产生DNA双链断裂，然后以供体DNA片段MHi-pyrG-hyh为修复模板通过同源重组对位点特异性DNA双链断裂进行精确修复，得到pyrG基因的插入失活突变株。如图1所示，以pyrG1-g-F和pyrG1-g-R为引物，野生型菌株中扩增出的DNA片段为1345bp，而经CRISPR/Cas9编辑后的pyrG基因失活菌株则扩增出含有供体DNA的目标片段，大小为3240bp，这表明所检测的转化子均为阳性的pyrG基因插入失活菌株，将获得的阳性突变株命名为AnP1-AnP5菌株。
5)黑曲霉pyrG基因失活菌株的有机酸发酵
将pyrG基因失活菌株与野生型菌株D分别接种于PDA培养基上30℃培养5天，然后用0.9％生理盐水收集孢子，并采用血球计数板进行孢子计数。以106/mL的接种量接种于柠檬酸发酵培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量12％)，34℃，250r/min培养96h。通过快速抽滤收集发酵上清，稀释10倍后，加热煮沸10min，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。具体检测条件为采用色谱柱Aminex HPX-87H(300mmX7.8mmX9um，BioRad)，岛津UFLC高效液相色谱仪(配有岛津LC-20AD输液泵、SPD-20A UV检测器、CTO-20A/AC柱温箱、SIL-20ACHT UFLC规格自动进样器，岛津LCsution工作站)，流动相A为超纯水，流动相B为2.75mM H2SO4，流速为0.6mL/min，进样量为10uL，柱温50℃，紫外检测波长为210nm。结果发现，本发明利用CRISPR/Cas9系统对黑曲霉pyrG进行插入失活编辑后，能显著促进柠檬酸酸的积累。如图2所示，发酵至96h时，pyrG基因插入失活菌株AnP1至AnP5的柠檬酸的产量分别达到32.8,33.6,36.9,34.5与32.7g/L，与野生菌株D的柠檬酸产量(17.0g/L)相比分别提高了93.0％,97.9％,117.5％,103.1％与92.4％。本实施例说明黑曲霉pyrG进行插入失活编辑后，能显著增强柠檬酸酸的生产。
实施例2.黑曲霉pyrG基因表达调控菌株的构建与柠檬酸发酵测试
1)靶序列的选择
根据CRISPR/Cas9系统基因组定位的原理，需要在基因组中寻找含有PAM(NGG)的靶位点。本发明人选择pyrG基因的以下位点作为靶位点，用于黑曲霉pyrG基因表达调控菌株的构建。具体序列如下：
sgRNA-pyrG2：GAGTAGTTCGAAGTTTCGAC(SEQ ID NO:10)
2)sgRNA表达盒的构建
本发明采用黑曲霉自身的5S rRNA(可被RNA聚合酶III所识别)作为启动子，中间添加HDV为核酶完成sgRNA转录的自我加工，以此来构建sgRNA的表达盒。含有靶序列sgRNA-pyrG2的构建采用靶序列双链合成后退火磷酸化直接连接至酶切与去磷酸化处理的sgRNA表达盒克隆载体p5S-sgRNA中，获得sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-pyrG2。
sgRNA-pyrG2-F：caccGAGTAGTTCGAAGTTTCGAC(SEQ ID NO:11)
sgRNA-pyrG2-R：aaacGTCGAAACTTCGAACTACTC(SEQ ID NO:12)
3)CRISPR/Cas9系统的黑曲霉原生质体转化
本发明采用将Cas9蛋白表达载体pCas9、sgRNA表达盒片段sgRNA-pyrG2与供体DNA片段MHi-pyrG2-Tet-on:hyh共转化至黑曲霉D的原生质细胞中，以构建黑曲霉pyrG基因表达调控菌株。
(1)sgRNA表达盒片段sgRNA-pyrG2的制备
sgRNA-pyrG2片段采用以5S-Fm与sgRNA-Rm为引物以sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-pyrG2为模板进行PCR而获得。
5S-F：GGTTGGAGATTCCAGACTCAG(SEQ ID NO:4)
sgRNA-R：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO:5)
PCR的反应体系和反应条件如实施例1所述。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(2)供体DNA片段MHi-pyrG2-Tet-on:hyh的制备
含超短同源臂pyrG基因的供体DNA片段MHi-pyrG2-Tet-on:hyh序列中，上游同源臂位置分别紧邻靶序列sgRNA-pyrG2的上游，下游同源臂为含有ATG在内的40bp编码序列。供体DNA片段MHi-pyrG2-Tet-on:hyh的构建采用一步PCR的方法来完成，直接以MHi-pyrG2-Fm与MHi-pyrG2-Rm为引物以pTC1.13为模板进行PCR扩增，来获得供体DNA片段MHi-pyrG2-Tet-on:hyh。
MHi-pyrG2-Fm:gtatccgcgcacgtctctggatttacgaatcagggtccaGACGTTAACTGATATTGAAG(SEQ ID NO:13)
MHi-pyrG2-Rm:ggcacgggcagtgtaggtcaatcgcgacttggaggacatGGTGTTTAAACGGTGATGTC(SEQ ID NO:14)
PCR的反应体系和反应条件如实施1所述。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(3)PEG-介导的原生质体转化
如实施例1中的操作方法，Cas9蛋白表达质粒pCas9、sgRNA表达盒片段sgRNA-pyrG2与供体DNA片段MHi-pyrG2-Tet-on:hyh以等比例混合后共转化进入黑曲霉野生型菌株D的原生质体细胞。Cas9在sgRNA-pyrG2介导下在pyrG基因的启动子下游进行了定点切割，产生DNA双链断裂，然后以供体DNA片段MHi-pyrG2-Tet-on:hyh为修复模板通过同源重组对位点特异性DNA双链断裂进行精确修复，从而将Tet-on基因表达调控系统定点插入至pyrG基因的编码序列上游，从而获得可采用效应物强力霉素来严谨调控pyrG表达水平的突变株。
4)黑曲霉pyrG基因表达调控菌株的验证
采用天根新型植物基因组提取试剂盒DP350提取已进行二次传代分纯后转化子的基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模版，用引物pyrG1-g-F和pyrG1-g-R对转化子进行基因PCR验证。
引物序列如下：
PyrG2-g-F:GTCGGAGGCGGAGCAATCCAC(SEQ ID NO:15)
pyrG2-g-R:AGCTTATCTCCCTTGGAAGA(SEQ ID NO:16)
PCR的反应体系和反应条件如实施例1所述。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(150V电压，20分钟)。
如图3所示，以pyrG2-g-F和pyrG2-g-R为引物，野生型菌株中扩增出的DNA片段为1004bp，而经CRISPR/Cas9编辑后的pyrG基因表达调控菌株则扩增出含有供体DNA的目标片段，大小为5424bp，这表明所检测的菌株均为阳性的pyrG基因表达调控菌株，将获得的阳性突变株命名为AnTP1-AnTP6菌株。
5)黑曲霉pyrG基因表达调控菌株的有机酸发酵
将pyrG基因表达调控菌株AnTP1与野生型菌株D分别接种于PDA培养基上30℃培养5天，然后用0.9％生理盐水收集孢子，并采用血球计数板进行孢子计数。以106/mL的接种量接种于含有不同效应物强力霉素的柠檬酸发酵培养基，34℃，250r/min培养96h。通过快速抽滤收集发酵上清，稀释10倍后，加热煮沸10min，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量，具体检测条件如实施例1所示。
结果发现，本发明利用CRISPR/Cas9系统将黑曲霉pyrG基因的启动子插入替换为Tet-on基因表达调控启动子系统，由于该系统的严谨性，可效应物强力霉素添加量与基因表达呈正相关。通过效果物的添加与pyrG基因表达水平的相关性分析发现，效果物添加越少则pyrG基因的弱化水平越高，在10μg/ml至5μg/ml、5μg/ml至2μg/ml、2μg/ml至1μg/ml与1μg/ml至0μg/ml的强力霉素浓度范围下，pyrG基因表达调控菌株AnTP1的pyrG基因的弱化水平分别达到10-50％，50-70％、70-80％、80-90％与90-100％。如图4所示，发酵至96h时，随效应物强力霉素的降低，柠檬酸产量逐渐增加。在5、2、1与0μg/ml的强力霉素浓度下，柠檬酸产量分别达到21.2、23.5、27.5与32.8g/L，与野生菌株D的柠檬酸产量(约17.0g/L)相比分别提高了20.7％、26.9％、55.8％与88.3％。本实施例说明黑曲霉pyrG基因表达水平的下调有助于显著增强柠檬酸酸的生产。
实施例3.黑曲霉pyrG基因与pkaC基因双基因编辑菌株的构建与柠檬酸发酵测试
1)靶序列的选择
根据CRISPR/Cas9系统基因组定位的原理，需要在基因组中寻找含有PAM(NGG)的靶位点。本发明人选择序列3所示的PkaC蛋白的编码基因(ID:36874)的以下位点作为靶位点，用于黑曲霉pkaC基因表达调控与pyrG失活的双基因编辑菌株的构建。具体序列如下：
sgRNA-pkaC：GCATGGAGAACACGCTGCTG(SEQ ID NO:17)
2)sgRNA表达盒的构建
本发明采用黑曲霉自身的5S rRNA(可被RNA聚合酶III所识别)作为启动子，中间添加HDV为核酶完成sgRNA转录的自我加工，以此来构建sgRNA的表达盒。含有靶序列sgRNA-pkaC的构建采用靶序列双链合成后退火磷酸化直接连接至酶切与去磷酸化处理的sgRNA表达盒克隆载体p5S-sgRNA中，获得sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-pkaC。
sgRNA-pkaC-F：caccGCATGGAGAACACGCTGCTG(SEQ ID NO:18)
sgRNA-pkaC-R：aaacCAGCAGCGTGTTCTCCATGC(SEQ ID NO:19)
3)CRISPR/Cas9系统的黑曲霉原生质体转化
本发明采用将Cas9蛋白表达载体pCas9-pyrG、sgRNA表达盒片段sgRNA-pkaC与供体DNA片段MHi-pkaC-Tet-on:DR-pyrG共转化至黑曲霉AnP1的原生质细胞中，以构建黑曲霉pkaC基因表达调控菌株。
(1)sgRNA表达盒片段sgRNA-pkaC的制备
sgRNA-pkaC片段采用以5S-Fm与sgRNA-Rm为引物以sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-pkaC为模板进行PCR而获得。
5S-F：GGTTGGAGATTCCAGACTCAG(SEQ ID NO:4)
sgRNA-R：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO:5)
PCR的反应体系和反应条件如实施例1所述。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(2)供体DNA片段MHi-pkaC-Tet-on:DR-pyrG的制备
含超短同源臂pkaC基因的供体DNA片段MHi-pkaC-Tet-on:DR-pyrG序列中，上游同源臂位置分别紧邻靶序列sgRNA-pkaC的上游，下游同源臂为含有ATG在内的40bp编码序列。供体DNA片段MHi-pkaC-Tet-on:DR-pyrG的构建采用一步PCR的方法来完成，直接以MHi-pkaC-Fm与MHi-pkaC-Rm为引物以pTet-on:DR-pyrG为模板进行PCR扩增，来获得供体DNA片段MHi-pkaC-Tet-on:DR-pyrG。
MHi-pyrG2-Fm:ataccatcgtgggctgctctatcattttaattttactgcGACGTTAACTGATATTGAAG(SEQ ID NO:20)
MHi-pyrG2-Rm:cgttcgccgtttcttcagcaaacctcctaaactaggcatGGTGTTTAAACGGTGATGTC(SEQ ID NO:21)
PCR的反应体系和反应条件如实施1所述。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(3)PEG-介导的原生质体转化
如实施例1中的操作方法，Cas9蛋白表达质粒pCas9、sgRNA表达盒片段sgRNA-pkaC与供体DNA片段MHi-pkaC-Tet-on:DR-pyrG以等比例混合后共转化进入黑曲霉AnP1的原生质细胞。Cas9在sgRNA-pkaC介导下在pkaC基因的启动子下游进行了定点切割，产生DNA双链断裂，然后以供体DNA片段MHi-pkaC-Tet-on:DR-pyrG为修复模板通过同源重组对位点特异性DNA双链断裂进行精确修复，从而将Tet-on基因表达调控系统定点插入至pkaC基因的编码序列上游，从而获得可采用效应物强力霉素来严谨调控pkaC表达水平的突变株。
4)黑曲霉pkaC基因表达调控菌株的验证
采用天根新型植物基因组提取试剂盒DP350提取已进行二次传代分纯后转化子的基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模版，用引物pkaC-g-F和pkaC-g-R对转化子进行基因PCR验证。
引物序列如下：
pkaC-g-F:TTTCCGTTGACCGCCGTTC(SEQ ID NO:22)
pkaC-g-R:GCTCTACGTCAAAGGTAGCCA(SEQ ID NO:23)
PCR的反应体系和反应条件如实施例1所述。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(150V电压，20分钟)。结果表明，以pkaC-g-F和pkaC-g-R为引物，野生型菌株中扩增出的DNA片段为1004bp，而经CRISPR/Cas9编辑后的pkaC基因表达调控菌株则扩增出含有供体DNA的目标片段，大小为5424bp，这表明所检测的转化子均为阳性的pkaC基因表达调控菌株，将获得的阳性突变株命名为AnTPk1菌株。为进一步在AnTPk1菌株的基础上，将AnTPk1菌株的孢子在含有5-氟乳清酸与尿嘧啶的基本培养基上进行反向筛选，利用pyrG基因上下游所带的200bp同向重复序列，发生自我重组而进一步获得pyrG失活菌株，将pkaC基因表达调控与pyrG失活的双基因突变菌株命名为AnTPkP1。
5)黑曲霉pyrG基因与pkaC基因双突变菌株的有机酸发酵
将pkaC基因与pyrG基因双突变菌株AnTPkP1与pyrG失活菌株AnP1分别接种于PDA培养基上30℃培养5天，然后用0.9％生理盐水收集孢子，并采用血球计数板进行孢子计数。以106/mL的接种量接种于含有20μg/mL效应物强力霉素的柠檬酸发酵培养基，34℃，250r/min培养96h。通过快速抽滤收集发酵上清，稀释10倍后，加热煮沸10min，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量，具体检测条件如实施例1所示。
结果发现，本发明中对黑曲霉pyrG基因失活与pkaC基因表达调控同时进行编辑后，当pyrG基因失活与pkaC过表达时，能显著促进柠檬酸的生产，发酵至96h时，双基因突变菌株AnTPkP1的柠檬酸产量为38.9g/L，与野生型菌株D以及pyrG基因失活菌株AnP1相比分别提高了123.2％和31.1％(如图5)。本实施例说明黑曲霉pyrG基因失活与pkaC基因表达调控同时编辑有助于显著增强柠檬酸酸的生产。
实施例4.黑曲霉pyrG基因与laeA基因双基因编辑菌株的构建与柠檬酸发酵测试
1)靶序列的选择
根据CRISPR/Cas9系统基因组定位的原理，需要在基因组中寻找含有PAM(NGG)的靶位点。本发明人选择LaeA蛋白的编码基因(ID:170198)的以下位点作为靶位点，用于黑曲霉laeA基因表达调控与pyrG失活的双基因编辑菌株的构建。
具体序列如下：
sgRNA-laeA：GAGTAGTTCGAAGTTTCGAC(SEQ ID NO:24)
2)sgRNA表达盒的构建
本发明采用黑曲霉自身的5S rRNA(可被RNA聚合酶III所识别)作为启动子，中间添加HDV为核酶完成sgRNA转录的自我加工，以此来构建sgRNA的表达盒。含有靶序列sgRNA-laeA的构建采用靶序列双链合成后退火磷酸化直接连接至酶切与去磷酸化处理的sgRNA表达盒克隆载体p5S-sgRNA中，获得sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-laeA。
sgRNA-laeA-F：caccAAGTCGGCTGATTTCAAACA(SEQ ID NO:25)
sgRNA-laeA-R：aaacTGTTTGAAATCAGCCGACTT(SEQ ID NO:26)
3)CRISPR/Cas9系统的黑曲霉原生质体转化
本发明采用将Cas9蛋白表达载体pCas9-pyrG、sgRNA表达盒片段sgRNA-laeA与供体DNA片段MHi-laeA-Tet-on:DR-pyrG共转化至黑曲霉AnP1的原生质细胞中，以构建黑曲霉laeA基因表达调控菌株。
(1)sgRNA表达盒片段sgRNA-laeA的制备
sgRNA-laeA片段采用以5S-Fm与sgRNA-Rm为引物以sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-laeA为模板进行PCR而获得。
5S-F：GGTTGGAGATTCCAGACTCAG(SEQ ID NO:4)
sgRNA-R：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO:5)
PCR的反应体系和反应条件如实施例1所述。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(2)供体DNA片段MHi-laeA-Tet-on:DR-pyrG的制备
含超短同源臂laeA基因的供体DNA片段MHi-laeA-Tet-on:DR-pyrG序列中，上游同源臂位置分别紧邻靶序列sgRNA-laeA的上游，下游同源臂为含有ATG在内的40bp编码序列。供体DNA片段MHi-laeA-Tet-on:DR-pyrG的构建采用一步PCR的方法来完成，直接以MHi-laeA-Fm与MHi-laeA-Rm为引物以pTet-on:DR-pyrG为模板进行PCR扩增，来获得供体DNA片段MHi-laeA-Tet-on:DR-pyrG。
MHi-laeA-Fm:aatctcttcccagcgaaccgatccttggacttcagggttGACGTTAACTGATATTGAAG(SEQ ID NO:27)
MHi-laeA-Rm:agtaattggctgatgcaaaagtcggctgatttcaaacatGGTGTTTAAACGGTGATGTC(SEQ ID NO:28)
PCR的反应体系和反应条件如实施1所述。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(3)PEG-介导的原生质体转化
如实施例1中的操作方法，Cas9蛋白表达质粒pCas9、sgRNA表达盒片段sgRNA-laeA与供体DNA片段MHi-laeA-Tet-on:DR-pyrG以等比例混合后共转化进入黑曲霉AnP1的原生质细胞。Cas9在sgRNA-laeA介导下在laeA基因的启动子下游进行了定点切割，产生DNA双链断裂，然后以供体DNA片段MHi-laeA-Tet-on:DR-pyrG为修复模板通过同源重组对位点特异性DNA双链断裂进行精确修复，从而将Tet-on基因表达调控系统定点插入至laeA基因的编码序列上游，从而获得可采用效应物强力霉素来严谨调控laeA表达水平的突变株。
4)黑曲霉laeA基因表达调控菌株的验证
采用天根新型植物基因组提取试剂盒DP350提取已进行二次传代分纯后转化子的基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模版，用引物laeA-g-F和laeA-g-R对转化子进行基因PCR验证。
引物序列如下：
laeA-g-F:GTTGTTGCCGTCTTTTCGTC(SEQ ID NO:29)
laeA-g-R:GCCTAGATTAAACGAACAACGGA(SEQ ID NO:30)
PCR的反应体系和反应条件如实施例1所述。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(150V电压，20分钟)。结果表明，以laeA-g-F和laeA-g-R为引物，野生型菌株中扩增出的DNA片段为1000bp，而经CRISPR/Cas9编辑后的laeA基因表达调控菌株则扩增出含有供体DNA的目标片段，大小为5420bp，这表明所检测的转化子均为阳性的laeA基因表达调控菌株，将获得的阳性突变株命名为AnTL1菌株。为进一步在AnTL1菌株的基础上，将AnTL1菌株的孢子在含有5-氟乳清酸与尿嘧啶的基本培养基上进行反向筛选，利用pyrG基因上下游所带的200bp同向重复序列，发生自我重组而进一步获得pyrG失活菌株，将pyrG失活与laeA基因表达调控的双基因突变菌株命名为AnTLP1。
5)黑曲霉pyrG基因与laeA基因双突变菌株的有机酸发酵
将pyrG基因与laeA基因双突变菌株AnTLP1与pyrG失活菌株AnP1分别接种于PDA培养基上30℃培养5天，然后用0.9％生理盐水收集孢子，并采用血球计数板进行孢子计数。以106/mL的接种量接种于含有20μg/mL效应物强力霉素的柠檬酸发酵培养基，34℃，250r/min培养96h。通过快速抽滤收集发酵上清，稀释10倍后，加热煮沸10min，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量，具体检测条件如实施例1所示。
本发明中对黑曲霉pyrG基因失活与laeA基因表达调控同时进行编辑后，当pyrG基因失活与laeA过表达时，能显著促进柠檬酸的生产，发酵至96h时，双基因突变菌株AnTLP1的柠檬酸产量为50.9g/L，与野生型菌株D以及pyrG基因失活菌株AnP1相比分别提高了206.1％和62.9％(如图6)。本实施例说明黑曲霉pyrG基因失活与laeA基因表达调控同时编辑有助于显著增强柠檬酸酸的生产。
实施例4.黑曲霉pyrG基因与cexA基因双基因编辑菌株的构建与柠檬酸发酵测试
1)靶序列的选择
根据CRISPR/Cas9系统基因组定位的原理，需要在基因组中寻找含有PAM(NGG)的靶位点。本发明人选择CexA蛋白的编码基因(ID:121799)的以下位点作为靶位点，用于黑曲霉cexA基因表达调控与pyrG失活的双基因编辑菌株的构建。具体序列如下：
sgRNA-cexA：CATGATTGTGGATATGACTCGGG(SEQ ID NO:31)
2)sgRNA表达盒的构建
本发明采用黑曲霉自身的5S rRNA(可被RNA聚合酶III所识别)作为启动子，中间添加HDV为核酶完成sgRNA转录的自我加工，以此来构建sgRNA的表达盒。含有靶序列sgRNA-cexA的构建采用靶序列双链合成后退火磷酸化直接连接至酶切与去磷酸化处理的sgRNA表达盒克隆载体p5S-sgRNA中，获得sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-cexA。
sgRNA-cexA-F：caccCATGATTGTGGATATGACTC(SEQ ID NO:32)
sgRNA-cexA-R：aaacGAGTCATATCCACAATCATG(SEQ ID NO:33)
3)CRISPR/Cas9系统的黑曲霉原生质体转化
本发明采用将Cas9蛋白表达载体pCas9-pyrG、sgRNA表达盒片段sgRNA-cexA与供体DNA片段MHi-cexA-Tet-on:DR-pyrG共转化至黑曲霉AnP1的原生质细胞中，以构建黑曲霉cexA基因表达调控菌株。
(1)sgRNA表达盒片段sgRNA-cexA的制备
sgRNA-cexA片段采用以5S-Fm与sgRNA-Rm为引物以sgRNA表达质粒p5S-sgRNA-cexA为模板进行PCR而获得。
5S-F：GGTTGGAGATTCCAGACTCAG(SEQ ID NO:4)
sgRNA-R：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO:5)
PCR的反应体系和反应条件如实施例1所述。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(2)供体DNA片段MHi-cexA-Tet-on:DR-pyrG的制备
含超短同源臂cexA基因的供体DNA片段MHi-cexA-Tet-on:DR-pyrG序列中，上游同源臂位置分别紧邻靶序列sgRNA-cexA的上游，下游同源臂为含有ATG在内的40bp编码序列。供体DNA片段MHi-cexA-Tet-on:DR-pyrG的构建采用一步PCR的方法来完成，直接以MHi-cexA-Fm与MHi-cexA-Rm为引物以pTet-on:DR-pyrG为模板进行PCR扩增，来获得供体DNA片段MHi-cexA-Tet-on:DR-pyrG。
MHi-cexA-Fm:aggtggttcacagattgccaacgtgcttcgaggctggccGACGTTAACTGATATTGAAG(SEQ ID NO:34)
MHi-cexA-Rm:ttcaaggtctgatcttgatgaagacgtggttgaagacatGGTGTTTAAACGGTGATGTC(SEQ ID NO:35)
PCR的反应体系和反应条件如实施1所述。PCR产物进行PCR产物纯化后进行PEG-介导的原生质体转化。
(3)PEG-介导的原生质体转化
如实施例1中的操作方法，Cas9蛋白表达质粒pCas9、sgRNA表达盒片段sgRNA-cexA与供体DNA片段MHi-cexA-Tet-on:DR-pyrG以等比例混合后共转化进入黑曲霉AnP1的原生质细胞。Cas9在sgRNA-cexA介导下在cexA基因的启动子下游进行了定点切割，产生DNA双链断裂，然后以供体DNA片段MHi-cexA-Tet-on:DR-pyrG为修复模板通过同源重组对位点特异性DNA双链断裂进行精确修复，从而将Tet-on基因表达调控系统定点插入至cexA基因的编码序列上游，从而获得可采用效应物强力霉素来严谨调控cexA表达水平的突变株。
4)黑曲霉cexA基因表达调控菌株的验证
采用天根新型植物基因组提取试剂盒DP350提取已进行二次传代分纯后转化子的基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模版，用引物cexA-g-F和cexA-g-R对转化子进行基因PCR验证。
引物序列如下：
cexA-g-F:GCCGAAGAGAAACTCCTAAAC(SEQ ID NO:36)
cexA-g-R:CGGTGGCTTCTCGGATGACT(SEQ ID NO:37)
PCR的反应体系和反应条件如实施例1所述。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(150V电压，20分钟)。结果表明，以cexA-g-F和cexA-g-R为引物，野生型菌株中扩增出的DNA片段为482bp，而经CRISPR/Cas9编辑后的cexA基因表达调控菌株则扩增出含有供体DNA的目标片段，大小为4902bp，这表明所检测的转化子均为阳性的cexA基因表达调控菌株，将获得的阳性突变株命名为AnTC1菌株。为进一步在AnTC1菌株的基础上，将AnTC1菌株的孢子在含有5-氟乳清酸与尿嘧啶的基本培养基上进行反向筛选，利用pyrG基因上下游所带的200bp同向重复序列，发生自我重组而进一步获得pyrG失活菌株，将pyrG失活与cexA基因表达调控的双基因突变菌株命名为AnTCP1。
5)黑曲霉pyrG基因与cexA基因双突变菌株的有机酸发酵
将pyrG基因与cexA基因双突变菌株AnTCP1与pyrG失活菌株AnP1分别接种于PDA培养基上30℃培养5天，然后用0.9％生理盐水收集孢子，并采用血球计数板进行孢子计数。以106/mL的接种量接种于含有20μg/mL效应物强力霉素的柠檬酸发酵培养基，34℃，250r/min培养96h。通过快速抽滤收集发酵上清，稀释10倍后，加热煮沸10min，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量，具体检测条件如实施例1所示。
本发明中对黑曲霉pyrG基因失活与cexA基因表达调控同时进行编辑后，当pyrG基因失活与cexA过表达时，能显著促进柠檬酸的生产，发酵至96h时，双基因突变菌株AnTCP1的柠檬酸产量为48.2g/L，与野生型菌株D以及pyrG基因失活菌株AnP1相比分别提高了192.2％和51.6％(如图7)。本实施例说明黑曲霉pyrG基因失活与cexA基因过表达同时编辑有助于显著增强柠檬酸酸的生产。
本发明所用的pyrG、LaeA、PkaC和CexA的氨基酸序列如下所示：
pyrG：MSSKSRLTYTARASKHPNALAKRLFEIAEAKKTNVTVSADVTTTKELLDLADRLGPYIAVIKTHIDILSDFSNETIEGLKALAQKHNFLIFEDRKFIDIGNTVQKQYHGGTLRISEWAHIINCSILPGEGIVEALAQTASAPDFAYGPERGLLILAEMTSKGSLATGQYTTSSVDYARKYKNFVMGFVSTRALGEVQSEVSSPSDEEDFVVFTTGVNISSKGDKLGQQYQTPGSAIGRGADFIIAGRGIYAAPDPVQAAQQYQKEGWEAYLARVGGKLIL(SEQ ID NO:38)
LaeA：MFEISRLLHQPITMASPNRNNYSYQGIESYDSGRSRQNSDAMDIHVITAQEPPREPPDNNDPYDGHGGPAGTSHYSKPPNRWLFYEENGRTYHGYRRGVYPLPCDEQEQDRLDIFHKLFTVARMSESLIYAPHPPNGRFLDLGCGTGIWAIDVAHKYPNAFVAGVDLAPIQPPNHPDNCEFYAPFDFEAPWTLGENSWDLIHLQMGCGSVLGWQNLYKRILRHLQPGAWFEQVEIDFEPRCDDRSLNGLALREWYQYLKQATQDTMRPIAHSSRDTIRHLEEAGFTQIDHQMVGLPLNPWHRDEHEQKVARWYNLAISESIETLSLAPFSRIFHWDLDRIRQITAEVKSQAFNKEIHAYNILHIYQARKPGGPSL(SEQ ID NO:39)
PkaC：MPSLGGLLKKRRTKDSQTLSKELEAGSAQTQTSPNAAEDHHNHNHHQHHHHLFHHHHQPQPATNSGSAANTPSQPQDSVPQQSNRSSGAEKSSDGQVASMQSAVTQASPSAHHTSGLPQPNANAASIQNIINPSQQGAMHSASSGQTQSHHAGRSDARTTKGKYSLDDFSLQRTLGTGSFGRVHLVQSKHNHRFYAVKVLKKAQVVKMKQIEHTNDERRMLNRVRHPFLITLWGTWQDSRNLYMVMDFVEGGELFSLLRKSQRFPNPVAKFYAAEVTLALEYLHTQNIIYRDLKPENLLLDRHGHLKITDFGFAKEVPDITWTLCGTPDYLAPEVVSSKGYNKSVDWWSLGILIFEMLCGFTPFWDSGSPVKIYENILRGRVKYPPYLHPDAVDLLSQLITADLTKRLGNLHGGSDDVKNHPWFAEVTWDRLARKDIDAPYVPPIRGGQGDASQYDRYPEETEQYGMAGEDPHGHLFPDF(SEQ ID NO:40)
CexA：MSSTTSSSRSDLEKVPVPQVIPRDSDSDKGSLSPEPSTLEAQSSEKPPHHIFTRSRKLQMVCIVSLAAIFSPLSSNIYFPALDDVSKSLNISMSLATLTITVYMIVQGLAPSFWGSMSDATGRRPVFIGTFIVYLVANIALAESKNYGELMAFRALQAAGSAATISIGAGVIGDITNSEERGSLVGIFGGVRMLGQGIGPVFGGIFTQYLGYRSIFWFLTIAGGVSLLSILVLLPETLRPIAGNGTVKLNGIHKPFIYTITGQTGVVEGAQPEAKKTKTSWKSVFAPLTFLVEKDVFITLFFGSIVYTVWSMVTSSTTDLFSEVYGLSSLDIGLTFLGNGFGCMSGSYLVGYLMDYNHRLTEREYCEKHGYPAGTRVNLKSHPDFPIEVARMRNTWWVIAIFIVTVALYGVSLRTHLAVPIILQYFIAFCSTGLFTINSALVIDLYPGASASATAVNNLMRCLLGAGGVAIVQPILDALKPDYTFLLLAGITLVMTPLLYVEDRWGPGWRHARERRLKAKANGN(SEQ ID NO:41)
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 有机酸产量提高的菌株及其构建方法和应用
<130> P2019-2325
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gaagaccaat gtgactgtct 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
caccgaagac caatgtgact gtct 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
aaacagacag tcacattggt cttc 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggttggagat tccagactca g 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
aaaaaagcac cgactcggtg ccac 24
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ttcgagattg ccgaggccaa gaagaccaat gtgactgtct gacgttaact gatattgaag 60
gagc 64
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
tcagcaagat ctagtagctc cttagtggtg gtaacgtcag aacccagggg ctggtgacgg 60
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
catgtgcagc agggaatacg ag 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gtttccgctt ccgtatccgt tg 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
gagtagttcg aagtttcgac 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
caccgagtag ttcgaagttt cgac 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
aaacgtcgaa acttcgaact actc 24
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
gtatccgcgc acgtctctgg atttacgaat cagggtccag acgttaactg atattgaag 59
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
ggcacgggca gtgtaggtca atcgcgactt ggaggacatg gtgtttaaac ggtgatgtc 59
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
gtcggaggcg gagcaatcca c 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
agcttatctc ccttggaaga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
gcatggagaa cacgctgctg 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
caccgcatgg agaacacgct gctg 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
aaaccagcag cgtgttctcc atgc 24
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
ataccatcgt gggctgctct atcattttaa ttttactgcg acgttaactg atattgaag 59
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
cgttcgccgt ttcttcagca aacctcctaa actaggcatg gtgtttaaac ggtgatgtc 59
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
tttccgttga ccgccgttc 19
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
gctctacgtc aaaggtagcc a 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
gagtagttcg aagtttcgac 20
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
caccaagtcg gctgatttca aaca 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
aaactgtttg aaatcagccg actt 24
<210> 27
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
aatctcttcc cagcgaaccg atccttggac ttcagggttg acgttaactg atattgaag 59
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
agtaattggc tgatgcaaaa gtcggctgat ttcaaacatg gtgtttaaac ggtgatgtc 59
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
gttgttgccg tcttttcgtc 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
gcctagatta aacgaacaac gga 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
catgattgtg gatatgactc ggg 23
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
cacccatgat tgtggatatg actc 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
aaacgagtca tatccacaat catg 24
<210> 34
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
aggtggttca cagattgcca acgtgcttcg aggctggccg acgttaactg atattgaag 59
<210> 35
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
ttcaaggtct gatcttgatg aagacgtggt tgaagacatg gtgtttaaac ggtgatgtc 59
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
gccgaagaga aactcctaaa c 21
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
cggtggcttc tcggatgact 20
<210> 38
<211> 280
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 38
Met Ser Ser Lys Ser Arg Leu Thr Tyr Thr Ala Arg Ala Ser Lys His
1 5 10 15
Pro Asn Ala Leu Ala Lys Arg Leu Phe Glu Ile Ala Glu Ala Lys Lys
20 25 30
Thr Asn Val Thr Val Ser Ala Asp Val Thr Thr Thr Lys Glu Leu Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Asp Arg Leu Gly Pro Tyr Ile Ala Val Ile Lys Thr His
50 55 60
Ile Asp Ile Leu Ser Asp Phe Ser Asn Glu Thr Ile Glu Gly Leu Lys
65 70 75 80
Ala Leu Ala Gln Lys His Asn Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe
85 90 95
Ile Asp Ile Gly Asn Thr Val Gln Lys Gln Tyr His Gly Gly Thr Leu
100 105 110
Arg Ile Ser Glu Trp Ala His Ile Ile Asn Cys Ser Ile Leu Pro Gly
115 120 125
Glu Gly Ile Val Glu Ala Leu Ala Gln Thr Ala Ser Ala Pro Asp Phe
130 135 140
Ala Tyr Gly Pro Glu Arg Gly Leu Leu Ile Leu Ala Glu Met Thr Ser
145 150 155 160
Lys Gly Ser Leu Ala Thr Gly Gln Tyr Thr Thr Ser Ser Val Asp Tyr
165 170 175
Ala Arg Lys Tyr Lys Asn Phe Val Met Gly Phe Val Ser Thr Arg Ala
180 185 190
Leu Gly Glu Val Gln Ser Glu Val Ser Ser Pro Ser Asp Glu Glu Asp
195 200 205
Phe Val Val Phe Thr Thr Gly Val Asn Ile Ser Ser Lys Gly Asp Lys
210 215 220
Leu Gly Gln Gln Tyr Gln Thr Pro Gly Ser Ala Ile Gly Arg Gly Ala
225 230 235 240
Asp Phe Ile Ile Ala Gly Arg Gly Ile Tyr Ala Ala Pro Asp Pro Val
245 250 255
Gln Ala Ala Gln Gln Tyr Gln Lys Glu Gly Trp Glu Ala Tyr Leu Ala
260 265 270
Arg Val Gly Gly Lys Leu Ile Leu
275 280
<210> 39
<211> 375
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 39
Met Phe Glu Ile Ser Arg Leu Leu His Gln Pro Ile Thr Met Ala Ser
1 5 10 15
Pro Asn Arg Asn Asn Tyr Ser Tyr Gln Gly Ile Glu Ser Tyr Asp Ser
20 25 30
Gly Arg Ser Arg Gln Asn Ser Asp Ala Met Asp Ile His Val Ile Thr
35 40 45
Ala Gln Glu Pro Pro Arg Glu Pro Pro Asp Asn Asn Asp Pro Tyr Asp
50 55 60
Gly His Gly Gly Pro Ala Gly Thr Ser His Tyr Ser Lys Pro Pro Asn
65 70 75 80
Arg Trp Leu Phe Tyr Glu Glu Asn Gly Arg Thr Tyr His Gly Tyr Arg
85 90 95
Arg Gly Val Tyr Pro Leu Pro Cys Asp Glu Gln Glu Gln Asp Arg Leu
100 105 110
Asp Ile Phe His Lys Leu Phe Thr Val Ala Arg Met Ser Glu Ser Leu
115 120 125
Ile Tyr Ala Pro His Pro Pro Asn Gly Arg Phe Leu Asp Leu Gly Cys
130 135 140
Gly Thr Gly Ile Trp Ala Ile Asp Val Ala His Lys Tyr Pro Asn Ala
145 150 155 160
Phe Val Ala Gly Val Asp Leu Ala Pro Ile Gln Pro Pro Asn His Pro
165 170 175
Asp Asn Cys Glu Phe Tyr Ala Pro Phe Asp Phe Glu Ala Pro Trp Thr
180 185 190
Leu Gly Glu Asn Ser Trp Asp Leu Ile His Leu Gln Met Gly Cys Gly
195 200 205
Ser Val Leu Gly Trp Gln Asn Leu Tyr Lys Arg Ile Leu Arg His Leu
210 215 220
Gln Pro Gly Ala Trp Phe Glu Gln Val Glu Ile Asp Phe Glu Pro Arg
225 230 235 240
Cys Asp Asp Arg Ser Leu Asn Gly Leu Ala Leu Arg Glu Trp Tyr Gln
245 250 255
Tyr Leu Lys Gln Ala Thr Gln Asp Thr Met Arg Pro Ile Ala His Ser
260 265 270
Ser Arg Asp Thr Ile Arg His Leu Glu Glu Ala Gly Phe Thr Gln Ile
275 280 285
Asp His Gln Met Val Gly Leu Pro Leu Asn Pro Trp His Arg Asp Glu
290 295 300
His Glu Gln Lys Val Ala Arg Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Ser Glu Ser
305 310 315 320
Ile Glu Thr Leu Ser Leu Ala Pro Phe Ser Arg Ile Phe His Trp Asp
325 330 335
Leu Asp Arg Ile Arg Gln Ile Thr Ala Glu Val Lys Ser Gln Ala Phe
340 345 350
Asn Lys Glu Ile His Ala Tyr Asn Ile Leu His Ile Tyr Gln Ala Arg
355 360 365
Lys Pro Gly Gly Pro Ser Leu
370 375
<210> 40
<211> 480
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 40
Met Pro Ser Leu Gly Gly Leu Leu Lys Lys Arg Arg Thr Lys Asp Ser
1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Lys Glu Leu Glu Ala Gly Ser Ala Gln Thr Gln Thr
20 25 30
Ser Pro Asn Ala Ala Glu Asp His His Asn His Asn His His Gln His
35 40 45
His His His Leu Phe His His His His Gln Pro Gln Pro Ala Thr Asn
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Ala Asn Thr Pro Ser Gln Pro Gln Asp Ser Val Pro
65 70 75 80
Gln Gln Ser Asn Arg Ser Ser Gly Ala Glu Lys Ser Ser Asp Gly Gln
85 90 95
Val Ala Ser Met Gln Ser Ala Val Thr Gln Ala Ser Pro Ser Ala His
100 105 110
His Thr Ser Gly Leu Pro Gln Pro Asn Ala Asn Ala Ala Ser Ile Gln
115 120 125
Asn Ile Ile Asn Pro Ser Gln Gln Gly Ala Met His Ser Ala Ser Ser
130 135 140
Gly Gln Thr Gln Ser His His Ala Gly Arg Ser Asp Ala Arg Thr Thr
145 150 155 160
Lys Gly Lys Tyr Ser Leu Asp Asp Phe Ser Leu Gln Arg Thr Leu Gly
165 170 175
Thr Gly Ser Phe Gly Arg Val His Leu Val Gln Ser Lys His Asn His
180 185 190
Arg Phe Tyr Ala Val Lys Val Leu Lys Lys Ala Gln Val Val Lys Met
195 200 205
Lys Gln Ile Glu His Thr Asn Asp Glu Arg Arg Met Leu Asn Arg Val
210 215 220
Arg His Pro Phe Leu Ile Thr Leu Trp Gly Thr Trp Gln Asp Ser Arg
225 230 235 240
Asn Leu Tyr Met Val Met Asp Phe Val Glu Gly Gly Glu Leu Phe Ser
245 250 255
Leu Leu Arg Lys Ser Gln Arg Phe Pro Asn Pro Val Ala Lys Phe Tyr
260 265 270
Ala Ala Glu Val Thr Leu Ala Leu Glu Tyr Leu His Thr Gln Asn Ile
275 280 285
Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Arg His Gly
290 295 300
His Leu Lys Ile Thr Asp Phe Gly Phe Ala Lys Glu Val Pro Asp Ile
305 310 315 320
Thr Trp Thr Leu Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Leu Ala Pro Glu Val Val
325 330 335
Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Lys Ser Val Asp Trp Trp Ser Leu Gly Ile
340 345 350
Leu Ile Phe Glu Met Leu Cys Gly Phe Thr Pro Phe Trp Asp Ser Gly
355 360 365
Ser Pro Val Lys Ile Tyr Glu Asn Ile Leu Arg Gly Arg Val Lys Tyr
370 375 380
Pro Pro Tyr Leu His Pro Asp Ala Val Asp Leu Leu Ser Gln Leu Ile
385 390 395 400
Thr Ala Asp Leu Thr Lys Arg Leu Gly Asn Leu His Gly Gly Ser Asp
405 410 415
Asp Val Lys Asn His Pro Trp Phe Ala Glu Val Thr Trp Asp Arg Leu
420 425 430
Ala Arg Lys Asp Ile Asp Ala Pro Tyr Val Pro Pro Ile Arg Gly Gly
435 440 445
Gln Gly Asp Ala Ser Gln Tyr Asp Arg Tyr Pro Glu Glu Thr Glu Gln
450 455 460
Tyr Gly Met Ala Gly Glu Asp Pro His Gly His Leu Phe Pro Asp Phe
465 470 475 480
<210> 41
<211> 524
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 41
Met Ser Ser Thr Thr Ser Ser Ser Arg Ser Asp Leu Glu Lys Val Pro
1 5 10 15
Val Pro Gln Val Ile Pro Arg Asp Ser Asp Ser Asp Lys Gly Ser Leu
20 25 30
Ser Pro Glu Pro Ser Thr Leu Glu Ala Gln Ser Ser Glu Lys Pro Pro
35 40 45
His His Ile Phe Thr Arg Ser Arg Lys Leu Gln Met Val Cys Ile Val
50 55 60
Ser Leu Ala Ala Ile Phe Ser Pro Leu Ser Ser Asn Ile Tyr Phe Pro
65 70 75 80
Ala Leu Asp Asp Val Ser Lys Ser Leu Asn Ile Ser Met Ser Leu Ala
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Thr Val Tyr Met Ile Val Gln Gly Leu Ala Pro Ser
100 105 110
Phe Trp Gly Ser Met Ser Asp Ala Thr Gly Arg Arg Pro Val Phe Ile
115 120 125
Gly Thr Phe Ile Val Tyr Leu Val Ala Asn Ile Ala Leu Ala Glu Ser
130 135 140
Lys Asn Tyr Gly Glu Leu Met Ala Phe Arg Ala Leu Gln Ala Ala Gly
145 150 155 160
Ser Ala Ala Thr Ile Ser Ile Gly Ala Gly Val Ile Gly Asp Ile Thr
165 170 175
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180 185 190
Met Leu Gly Gln Gly Ile Gly Pro Val Phe Gly Gly Ile Phe Thr Gln
195 200 205
Tyr Leu Gly Tyr Arg Ser Ile Phe Trp Phe Leu Thr Ile Ala Gly Gly
210 215 220
Val Ser Leu Leu Ser Ile Leu Val Leu Leu Pro Glu Thr Leu Arg Pro
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Leu Ala Val Pro Ile Ile Leu Gln Tyr Phe Ile Ala Phe Cys Ser Thr
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435 440 445
Ala Ser Ala Ser Ala Thr Ala Val Asn Asn Leu Met Arg Cys Leu Leu
450 455 460
Gly Ala Gly Gly Val Ala Ile Val Gln Pro Ile Leu Asp Ala Leu Lys
465 470 475 480
Pro Asp Tyr Thr Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Thr Leu Val Met Thr
485 490 495
Pro Leu Leu Tyr Val Glu Asp Arg Trp Gly Pro Gly Trp Arg His Ala
500 505 510
Arg Glu Arg Arg Leu Lys Ala Lys Ala Asn Gly Asn
515 520

Claims (10)

1.一种有机酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括弱化菌株中的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)的步骤。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述菌株是真菌；优选地，所述菌株选自黑曲霉(Aspergilus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉；更优选黑曲霉。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述方法还包括增强菌株中的组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)。
4.一种有机酸的生产菌株，其特征在于，所述菌株中乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(PyrG)弱化。
5.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述菌株是真菌；优选地，所述菌株选自黑曲霉(Aspergilus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉；更优选黑曲霉。
6.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述菌株中的组蛋白甲基转移酶(LaeA)和/或cAMP-依赖的蛋白激酶亚基(PkaC)和/或柠檬酸转运蛋白(CexA)增强。
7.如权利要求4-6中任一项所述的菌株，其特征在于，所述菌株通过权利要求1-3中任一项所述的方法构建。
8.权利要求4-7中任一项所述的菌株或通过权利要求1-3中任一项所述的方法构建的菌株的用途，用于生产有机酸。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述菌株是真菌；优选地，所述菌株选自黑曲霉(Aspergilus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉；更优选黑曲霉。
10.一种有机酸的生产方法，所述方法包括：
a.培养权利要求4-7中任一项所述的菌株或通过权利要求1-3中任一项所述的方法构建的菌株；和
b.任选从步骤a得到的培养体系中分离得到所产生的有机酸。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040191864A1 (en) * 2003-03-31 2004-09-30 Novozymes Biotech, Inc. Methods for producing biological substances in enzyme-deficient mutants of Aspergillus
EP1867727A1 (en) * 2006-06-15 2007-12-19 Danmarks Tekniske Universitet Enhanced citrate production
US20130137150A1 (en) * 2011-11-30 2013-05-30 Battelle Memorial Institute Enhanced citric acid production in aspergillus with inactivated asparagine-linked glycosylation protein 3 (alg3), and/or increased laea expression
WO2018172155A1 (en) * 2017-03-23 2018-09-27 Novozymes A/S Improved filamentous fungal host cells
CN109207383A (zh) * 2018-08-28 2019-01-15 天津科技大学 一种高产l-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及其构建与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040191864A1 (en) * 2003-03-31 2004-09-30 Novozymes Biotech, Inc. Methods for producing biological substances in enzyme-deficient mutants of Aspergillus
EP1867727A1 (en) * 2006-06-15 2007-12-19 Danmarks Tekniske Universitet Enhanced citrate production
US20130137150A1 (en) * 2011-11-30 2013-05-30 Battelle Memorial Institute Enhanced citric acid production in aspergillus with inactivated asparagine-linked glycosylation protein 3 (alg3), and/or increased laea expression
WO2018172155A1 (en) * 2017-03-23 2018-09-27 Novozymes A/S Improved filamentous fungal host cells
CN109207383A (zh) * 2018-08-28 2019-01-15 天津科技大学 一种高产l-苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及其构建与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIHUI ZHANG等: "Disruption or reduced expression of the orotidine‑5′‑decarboxylase gene pyrG increases citric acid production: a new discovery during recyclable genome editing in Aspergillus niger", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》, vol. 19, no. 1, 24 March 2020 (2020-03-24) *
PARVEEN SARKARI: "An efficient tool for metabolic pathway construction and gene integration for Aspergillus niger", pages 1327 - 1333 *
欧阳平凯: "《植物纤维素原料水解的理论与应用》", 30 June 1995, 中国科学技术出版社, pages: 161 *

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