JP4083455B2 - 酢酸菌のアコニターゼ遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 - Google Patents
酢酸菌のアコニターゼ遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物に由来するアコニターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む微生物、特にアセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００３】
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００４】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.），１７２巻，２０９６頁，１９９０年）。
この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（J. Ferment. Bioeng.），７６巻，２７０頁，１９９３年）。
【０００５】
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（特開平３−２１９８７８号公報）。
【０００６】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が特開平２−２３６４号公報に開示されている。しかし、ＡＬＤＨはアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００７】
このような実情から、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性能を有するタンパク質の遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【０００８】
【発明が解決するための課題】
本発明は、酢酸菌に属する微生物由来の酢酸耐性に関与する新規なアコニターゼ遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の酢酸耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する食酢の効率的な製造法を開発することが可能になると考えた。
【００１０】
従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。
しかし、このような方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、鋭意検討した結果、本発明者らは、酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を見出す方法として、酢酸の存在下で特異的に発現しているタンパク質を検索し、そのタンパク質をコードする遺伝子を取得するといった、従来全く行われていなかった方法を開発した。
【００１１】
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているアセトバクター属とグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上させる機能を有する新規な酢酸耐性能を有するタンパク質の遺伝子をクローニングすることに成功した。
【００１２】
得られたこの遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋの検索の結果、大腸菌などで見出されている、アコニターゼaconitase（アコニット酸ヒドラターゼaconitate hydratase）と称される一群のタンパク質のアミノ酸配列と相同性を示す部分があるところから、酢酸菌のアコニターゼ（アコニット酸ヒドラターゼ）をコードする遺伝子（アコニターゼ遺伝子）であると推定された。
【００１３】
しかし、取得された酢酸菌のアコニターゼ遺伝子は、大腸菌などの他の微生物で見出されている既知のアコニターゼ遺伝子とは相同性がきわめて低くかったことから、他のアコニターゼ遺伝子と似ているものの該アコニターゼ遺伝子は酢酸菌に特異的な新規タンパク質をコードする新規遺伝子であることが判った。
一方、今回取得したアセトバクター属に属する酢酸菌とグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌のアコニターゼ遺伝子について相同性を比較したところ、両者の相同性は約７０％であり、酢酸菌間での相同性は高かった。
【００１４】
また、該遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換し、コピー数を増幅させた形質転換株においては、アコニット酸ヒドラターゼ活性が約２倍増大し、該遺伝子が酢酸菌のアコニターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが確認されると同時に、顕著に酢酸耐性が向上することが確認された。
さらに、エタノール存在下で該形質転換株を通気培養した場合には、増殖速度が向上する上に、生酸速度が向上し、さらに最終到達酢酸濃度が顕著に向上することなども見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（６）からなるものである。
（１） 下記の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（２） 下記の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（３） 下記の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（４） 下記の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（５）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５４〜３０６５の塩基配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（６）配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８９〜３１７９の塩基配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００１６】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸に対する耐性を付与し、増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、酢酸に対する耐性が顕著に向上し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、アコニターゼ（アコニット酸ヒドラターゼ）活性を有し、且つ酢酸耐性を向上させる機能を有する配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を包含し、該塩基配列の調整要素、及び該遺伝子の構造部分を含むものである。
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列表配列番号１の塩基番号３５４〜３０６５又は配列表配列番号３の４８９〜３１７９からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１８】
配列番号1又は３に示す塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、アミノ酸配列レベルで大腸菌（Escherichia coli）のＡｃｎＡ遺伝子と５５．１％、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）のＡｃｎ遺伝子とも５６．１％の相同性を示すことが分かったが、いずれも５０％台の低い相同性であり、これらのタンパク質をコードする遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。なお、上記のＡｃｎＡ遺伝子やＡｃｎ遺伝子などのアコニターゼ遺伝子が酢酸耐性と関係していることは全く知られていない。
【００１９】
本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかとなったので、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマー１（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）を用い、酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023;FERM BP-2287)のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）（トレンズ・オブ・ジェネティックス（Trends Genet. ）５巻，１８５頁，１９８９年）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ゲノムＤＮＡライブラリーを用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ２４００などを用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用して、定法に従って行なうことができる。
【００２０】
本発明のアコニターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質のアコニターゼ活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。
【００２１】
このようなアコニターゼ活性を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換又は付加されるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００２２】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００２３】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属するの酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号３５４〜３０６５からなる塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアコニターゼ（アコニット酸ヒドラターゼ）活性を有し、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００２４】
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００２５】
（２）本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の細菌をさし、酢酸耐性が増強されたアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属、または酢酸耐性が低下したアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属である。
【００２６】
アセトバクター属細菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）が例示される。
【００２７】
また、グルコンアセトバクター属細菌としては、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、アセトバクター属よりグルコンアセトバクター属へ変更になった、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託）が例示される。
酢酸耐性の増強は、例えばアコニターゼ遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換することによって増強することができる。
【００２８】
また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２８９（宝酒造社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても、酢酸耐性を増強することができる。
【００２９】
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
【００３０】
マルチコピーベクターとしては、ｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）やｐＴＡ５００１(a)、ｐＴＡ５００１(b)（特開昭６０−９４８８号公報）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）５２巻，３１２５頁，１９８８年）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００３１】
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）４９巻，p.２０９１，１９８５年）やエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７４頁、１９９４年）等によって行なうことができる。
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
【００３２】
（３）食酢製造法
上記のようにして、アコニターゼ遺伝子のコピー数が増幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌であって、アルコール酸化能を有するものをアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造することができる。
【００３３】
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００３４】
また、培養は、静置培養法、振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００３５】
【実施例】
（実施例１）アセトバクター・アセチのアコニターゼ遺伝子のクローニングと該遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）アコニターゼ遺伝子のクローニング
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）を１％の酢酸を含むＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）を用いて、３０℃で２４時間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）して菌体を得た。また、酢酸を含まないＹＰＧ培地でも、同様にして培養して、菌体を得た。
得られたこれらの菌体を、それぞれソニケーションにより破砕し、その菌体破砕液を遠心分離（１２，０００×g、１０分間）して得られた上澄み液を、さらに超遠心分離（４００，０００×ｇ、１時間）を行なうことによって上澄み液（可溶性蛋白質）を得た。
【００３６】
この上澄み液を２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液（０．１２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、４％ＳＤＳ、１０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．００４％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ）に１：１の比率で混合し、沸騰水浴中で３分間加熱処理した。このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した後、ＣＢＢ染色し、１％の酢酸を含むＹＰＧ培地で生育したものと、酢酸を含まないＹＰＧ培地で生育したものとを比較しところ、分子量約９０ｋＤａのバンドが１％酢酸を含む培地で生育したもので発現が増幅しているのが確認された。
【００３７】
このように発現が増幅していたバンドをＰＶＤＦ膜に転写し、アミノ末端のアミノ酸配列をプロテインシークエンサーにて決定した。決定したアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇであった。
【００３８】
上記のアミノ酸配列を基にしてオリゴヌクレオチドを合成し、これをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株から定法により染色体ＤＮＡを抽出し制限酵素ＳｐｈＩ（宝酒造社製）で完全分解したものに対して、サザンハイブリダイゼーションを行なった。
【００３９】
その結果、約４．６ｋｂｐの位置にポジティブなバンドを確認した。このバンドをアガロースゲルより抽出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９の制限酵素ＳｐｈＩ切断部位にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、１００μg／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選択した。出現したコロニーをサザンハイブリダイゼーションで用いたものと同じオリゴヌクレオチドをプローブとし、コロニーハイブリダイゼーションを行ない、ポジティブな形質転換体を単離した。その後、プラスミドＤＮＡをこれらのポジティブな形質転換体より分離し、挿入断片の構造を制限酵素マッピングにより解析し、その結果、図1に示した約３．６ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＸｂａＩ断片を確認した。
【００４０】
（２）クローン化された遺伝子断片の塩基配列の決定
上記挿入断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。塩基配列の決定は、両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。その内、決定した３０７３塩基の塩基配列を、配列番号1に示した。
【００４１】
配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号３５４から塩基番号３０６５にかけて、配列番号２に記載したような９０４個のアミノ酸をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。配列番号２に記載されたタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇであり、先に決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と完全に一致することが確認された。
【００４２】
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイからのアコニターゼ遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振盪培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００４３】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩで切断し、その後ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造社製）処理を行なった。また、大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４を、制限酵素ＳｍａＩで切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2，宝酒造社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００４４】
（２）アコニターゼ遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Biosci. Biotech. Biochem.),58巻、９７４頁，１９９４年）で形質転換し、２％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０℃で４日間培養した。
【００４５】
生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、約５ｋｂｐのＳｐｈＩ断片がクローン化されており、このプラスミドをｐＳ１と命名した。クローン化されたＤＮＡ断片のうち、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸を含むＹＰＧ培地で生育可能にする断片は、図２に示した約３．５ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＸｂａＩ断片であった。
このようにして通常は酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸含有培地でも増殖可能にする酢酸耐性遺伝子断片を取得した。
【００４６】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例１と同様に、アコニターゼ遺伝子を含有する断片について、塩基配列をサンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した。その結果、配列番号３に記載した塩基配列が決定された。アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株の場合と同様に、配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。このうち、決定した３３４８塩基の塩基配列について、配列番号３に記載した。
配列番号３記載の塩基配列中には、塩基番号４８９から塩基番号３１７９にかけて、配列番号４に記載したような８９７個のアミノ酸をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。
【００４７】
（実施例３）アセトバクター・アセチ由来のアコニターゼ遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株由来のアコニターゼ遺伝子を含む断片（配列表の配列番号１の塩基番号１〜３０７３）をＰＣＲ法により増幅し、この増幅断片を、酢酸菌―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＡＣＯ１を作製した。なお、作製したプラスミドｐＡＣＯ１の挿入断片の塩基配列に変異がないことはシークエンスすることで確認した。
【００４８】
このｐＡＣＯ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７４頁、１９９４年）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、アコニターゼ遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００４９】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＣＯ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００５０】
具体的には、酢酸０％あるいは３％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を５５０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００５１】
その結果、図３に示すように、３％エタノールのみを添加した培地では、形質転換株、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株で生育に差は見られなかったが、３％酢酸と３％エタノールを添加した培地では形質転換株は増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では増殖できなかったことが確認でき、酢酸菌のアコニターゼ遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００５２】
（３）形質転換株と元株の各種酵素活性
プラスミドｐＡＣＯ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株と、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株でアコニット酸ヒドラターゼ活性（アコニターゼ活性）をメソッド・オブ・エンザイモロジー（（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.），１３巻，２６頁，１９６９年）の方法に、アルコール脱水素酵素を酢酸菌の方法（メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.），８９巻，４５０頁，１９８２年）、アルデヒド脱水素酵素活性を酢酸菌の方法（メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.）８９巻，４９１頁，１９８２年）にそれぞれ準じて測定した。その結果を表1に示した。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表１の結果より、形質転換株はアルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素の活性は元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と同レベルであったが、アコニット酸ヒドラターゼ活性については形質転換株が約２倍高く、クローニングされた遺伝子はアコニット酸ヒドラターゼ（アコニターゼ）をコードしていることが確認された。
【００５５】
（実施例４）アセトバクター・アセチ由来のアコニターゼ遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
実施例３で得られたプラスミドｐＡＣＯ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを有する元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と酢酸醗酵能を比較した。
【００５６】
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、酢酸１％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５ＬのＹＰＧ培地にて、３０℃、４００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度３％まで発酵させた。この培養液７００ｍＬにエタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１．８ＬのＹＰＧ培地を添加し、培地中のエタノール濃度を１％に制御し、同じ条件下で通気攪拌培養を行ない、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表２にまとめた。
【００５７】
【表２】
【００５８】
表２の結果から、形質転換株の方が、最終到達酢酸濃度、比増殖速度、生酸速度の何れにおいても、顕著に優れていることが確認できた。
【００５９】
（実施例５）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のアコニターゼ遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
グルコンアセトバクター・エンタニイの1菌株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株由来のアコニターゼ遺伝子を含む断片（配列表の配列番号１の塩基番号３０７〜３２３９）をＰＣＲ法により増幅し、その結果得られた増幅断片をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、この断片を酢酸菌―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＡＣＯ１１を作製した。
【００６０】
このｐＡＣＯ１１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.），５８巻，９７４頁，１９９４年）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００６１】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＣＯ１１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００６２】
具体的には、酢酸３％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００６３】
その結果、図４に示すように、３％酢酸と３％エタノールを添加した培地では形質転換株は増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では増殖できなかったことが確認でき、酢酸菌のアコニターゼ遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００６４】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規なアコニターゼ遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法が提供できた。
【００６５】
【配列表】
【００６６】
【配列表のフリーテキスト】
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｐｈＩを用いてクローニングされたアセトバクター・アセチ由来の遺伝子断片の制限酵素地図とアコニターゼ遺伝子の位置、及びｐＡＣＯ１への挿入断片の概略図。
【図２】ＳｐｈＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図とアコニターゼ遺伝子の位置、及びｐＡＣＯ１１への挿入断片の概略図。
【図３】アセトバクター・アセチ由来のアコニターゼ遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図面。
【図４】グルコンアセトバクター・アンタニイ由来のアコニターゼ遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸含有培地での培養経過を示す図面。
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物に由来するアコニターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む微生物、特にアセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００３】
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００４】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.），１７２巻，２０９６頁，１９９０年）。
この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（J. Ferment. Bioeng.），７６巻，２７０頁，１９９３年）。
【０００５】
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（特開平３−２１９８７８号公報）。
【０００６】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が特開平２−２３６４号公報に開示されている。しかし、ＡＬＤＨはアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００７】
このような実情から、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性能を有するタンパク質の遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【０００８】
【発明が解決するための課題】
本発明は、酢酸菌に属する微生物由来の酢酸耐性に関与する新規なアコニターゼ遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の酢酸耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する食酢の効率的な製造法を開発することが可能になると考えた。
【００１０】
従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。
しかし、このような方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、鋭意検討した結果、本発明者らは、酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を見出す方法として、酢酸の存在下で特異的に発現しているタンパク質を検索し、そのタンパク質をコードする遺伝子を取得するといった、従来全く行われていなかった方法を開発した。
【００１１】
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているアセトバクター属とグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上させる機能を有する新規な酢酸耐性能を有するタンパク質の遺伝子をクローニングすることに成功した。
【００１２】
得られたこの遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋの検索の結果、大腸菌などで見出されている、アコニターゼaconitase（アコニット酸ヒドラターゼaconitate hydratase）と称される一群のタンパク質のアミノ酸配列と相同性を示す部分があるところから、酢酸菌のアコニターゼ（アコニット酸ヒドラターゼ）をコードする遺伝子（アコニターゼ遺伝子）であると推定された。
【００１３】
しかし、取得された酢酸菌のアコニターゼ遺伝子は、大腸菌などの他の微生物で見出されている既知のアコニターゼ遺伝子とは相同性がきわめて低くかったことから、他のアコニターゼ遺伝子と似ているものの該アコニターゼ遺伝子は酢酸菌に特異的な新規タンパク質をコードする新規遺伝子であることが判った。
一方、今回取得したアセトバクター属に属する酢酸菌とグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌のアコニターゼ遺伝子について相同性を比較したところ、両者の相同性は約７０％であり、酢酸菌間での相同性は高かった。
【００１４】
また、該遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換し、コピー数を増幅させた形質転換株においては、アコニット酸ヒドラターゼ活性が約２倍増大し、該遺伝子が酢酸菌のアコニターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが確認されると同時に、顕著に酢酸耐性が向上することが確認された。
さらに、エタノール存在下で該形質転換株を通気培養した場合には、増殖速度が向上する上に、生酸速度が向上し、さらに最終到達酢酸濃度が顕著に向上することなども見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（６）からなるものである。
（１） 下記の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（２） 下記の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（３） 下記の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（４） 下記の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（５）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５４〜３０６５の塩基配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（６）配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８９〜３１７９の塩基配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００１６】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸に対する耐性を付与し、増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、酢酸に対する耐性が顕著に向上し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、アコニターゼ（アコニット酸ヒドラターゼ）活性を有し、且つ酢酸耐性を向上させる機能を有する配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を包含し、該塩基配列の調整要素、及び該遺伝子の構造部分を含むものである。
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列表配列番号１の塩基番号３５４〜３０６５又は配列表配列番号３の４８９〜３１７９からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１８】
配列番号1又は３に示す塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、アミノ酸配列レベルで大腸菌（Escherichia coli）のＡｃｎＡ遺伝子と５５．１％、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）のＡｃｎ遺伝子とも５６．１％の相同性を示すことが分かったが、いずれも５０％台の低い相同性であり、これらのタンパク質をコードする遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。なお、上記のＡｃｎＡ遺伝子やＡｃｎ遺伝子などのアコニターゼ遺伝子が酢酸耐性と関係していることは全く知られていない。
【００１９】
本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかとなったので、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマー１（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）を用い、酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023;FERM BP-2287)のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）（トレンズ・オブ・ジェネティックス（Trends Genet. ）５巻，１８５頁，１９８９年）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ゲノムＤＮＡライブラリーを用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ２４００などを用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用して、定法に従って行なうことができる。
【００２０】
本発明のアコニターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質のアコニターゼ活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。
【００２１】
このようなアコニターゼ活性を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換又は付加されるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００２２】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００２３】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属するの酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号３５４〜３０６５からなる塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアコニターゼ（アコニット酸ヒドラターゼ）活性を有し、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００２４】
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００２５】
（２）本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の細菌をさし、酢酸耐性が増強されたアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属、または酢酸耐性が低下したアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属である。
【００２６】
アセトバクター属細菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）が例示される。
【００２７】
また、グルコンアセトバクター属細菌としては、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、アセトバクター属よりグルコンアセトバクター属へ変更になった、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託）が例示される。
酢酸耐性の増強は、例えばアコニターゼ遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換することによって増強することができる。
【００２８】
また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２８９（宝酒造社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても、酢酸耐性を増強することができる。
【００２９】
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
【００３０】
マルチコピーベクターとしては、ｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）やｐＴＡ５００１(a)、ｐＴＡ５００１(b)（特開昭６０−９４８８号公報）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）５２巻，３１２５頁，１９８８年）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００３１】
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）４９巻，p.２０９１，１９８５年）やエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７４頁、１９９４年）等によって行なうことができる。
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
【００３２】
（３）食酢製造法
上記のようにして、アコニターゼ遺伝子のコピー数が増幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌であって、アルコール酸化能を有するものをアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造することができる。
【００３３】
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００３４】
また、培養は、静置培養法、振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００３５】
【実施例】
（実施例１）アセトバクター・アセチのアコニターゼ遺伝子のクローニングと該遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）アコニターゼ遺伝子のクローニング
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）を１％の酢酸を含むＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）を用いて、３０℃で２４時間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）して菌体を得た。また、酢酸を含まないＹＰＧ培地でも、同様にして培養して、菌体を得た。
得られたこれらの菌体を、それぞれソニケーションにより破砕し、その菌体破砕液を遠心分離（１２，０００×g、１０分間）して得られた上澄み液を、さらに超遠心分離（４００，０００×ｇ、１時間）を行なうことによって上澄み液（可溶性蛋白質）を得た。
【００３６】
この上澄み液を２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液（０．１２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、４％ＳＤＳ、１０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．００４％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ）に１：１の比率で混合し、沸騰水浴中で３分間加熱処理した。このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した後、ＣＢＢ染色し、１％の酢酸を含むＹＰＧ培地で生育したものと、酢酸を含まないＹＰＧ培地で生育したものとを比較しところ、分子量約９０ｋＤａのバンドが１％酢酸を含む培地で生育したもので発現が増幅しているのが確認された。
【００３７】
このように発現が増幅していたバンドをＰＶＤＦ膜に転写し、アミノ末端のアミノ酸配列をプロテインシークエンサーにて決定した。決定したアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇであった。
【００３８】
上記のアミノ酸配列を基にしてオリゴヌクレオチドを合成し、これをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株から定法により染色体ＤＮＡを抽出し制限酵素ＳｐｈＩ（宝酒造社製）で完全分解したものに対して、サザンハイブリダイゼーションを行なった。
【００３９】
その結果、約４．６ｋｂｐの位置にポジティブなバンドを確認した。このバンドをアガロースゲルより抽出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９の制限酵素ＳｐｈＩ切断部位にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、１００μg／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選択した。出現したコロニーをサザンハイブリダイゼーションで用いたものと同じオリゴヌクレオチドをプローブとし、コロニーハイブリダイゼーションを行ない、ポジティブな形質転換体を単離した。その後、プラスミドＤＮＡをこれらのポジティブな形質転換体より分離し、挿入断片の構造を制限酵素マッピングにより解析し、その結果、図1に示した約３．６ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＸｂａＩ断片を確認した。
【００４０】
（２）クローン化された遺伝子断片の塩基配列の決定
上記挿入断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。塩基配列の決定は、両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。その内、決定した３０７３塩基の塩基配列を、配列番号1に示した。
【００４１】
配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号３５４から塩基番号３０６５にかけて、配列番号２に記載したような９０４個のアミノ酸をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。配列番号２に記載されたタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇであり、先に決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と完全に一致することが確認された。
【００４２】
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイからのアコニターゼ遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振盪培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００４３】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩで切断し、その後ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造社製）処理を行なった。また、大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４を、制限酵素ＳｍａＩで切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2，宝酒造社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００４４】
（２）アコニターゼ遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Biosci. Biotech. Biochem.),58巻、９７４頁，１９９４年）で形質転換し、２％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０℃で４日間培養した。
【００４５】
生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、約５ｋｂｐのＳｐｈＩ断片がクローン化されており、このプラスミドをｐＳ１と命名した。クローン化されたＤＮＡ断片のうち、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸を含むＹＰＧ培地で生育可能にする断片は、図２に示した約３．５ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＸｂａＩ断片であった。
このようにして通常は酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸含有培地でも増殖可能にする酢酸耐性遺伝子断片を取得した。
【００４６】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例１と同様に、アコニターゼ遺伝子を含有する断片について、塩基配列をサンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した。その結果、配列番号３に記載した塩基配列が決定された。アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株の場合と同様に、配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。このうち、決定した３３４８塩基の塩基配列について、配列番号３に記載した。
配列番号３記載の塩基配列中には、塩基番号４８９から塩基番号３１７９にかけて、配列番号４に記載したような８９７個のアミノ酸をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。
【００４７】
（実施例３）アセトバクター・アセチ由来のアコニターゼ遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株由来のアコニターゼ遺伝子を含む断片（配列表の配列番号１の塩基番号１〜３０７３）をＰＣＲ法により増幅し、この増幅断片を、酢酸菌―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＡＣＯ１を作製した。なお、作製したプラスミドｐＡＣＯ１の挿入断片の塩基配列に変異がないことはシークエンスすることで確認した。
【００４８】
このｐＡＣＯ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７４頁、１９９４年）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、アコニターゼ遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００４９】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＣＯ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００５０】
具体的には、酢酸０％あるいは３％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を５５０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００５１】
その結果、図３に示すように、３％エタノールのみを添加した培地では、形質転換株、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株で生育に差は見られなかったが、３％酢酸と３％エタノールを添加した培地では形質転換株は増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では増殖できなかったことが確認でき、酢酸菌のアコニターゼ遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００５２】
（３）形質転換株と元株の各種酵素活性
プラスミドｐＡＣＯ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株と、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株でアコニット酸ヒドラターゼ活性（アコニターゼ活性）をメソッド・オブ・エンザイモロジー（（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.），１３巻，２６頁，１９６９年）の方法に、アルコール脱水素酵素を酢酸菌の方法（メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.），８９巻，４５０頁，１９８２年）、アルデヒド脱水素酵素活性を酢酸菌の方法（メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.）８９巻，４９１頁，１９８２年）にそれぞれ準じて測定した。その結果を表1に示した。
【００５３】
【表１】
表１の結果より、形質転換株はアルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素の活性は元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と同レベルであったが、アコニット酸ヒドラターゼ活性については形質転換株が約２倍高く、クローニングされた遺伝子はアコニット酸ヒドラターゼ（アコニターゼ）をコードしていることが確認された。
【００５５】
（実施例４）アセトバクター・アセチ由来のアコニターゼ遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
実施例３で得られたプラスミドｐＡＣＯ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを有する元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と酢酸醗酵能を比較した。
【００５６】
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、酢酸１％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５ＬのＹＰＧ培地にて、３０℃、４００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度３％まで発酵させた。この培養液７００ｍＬにエタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１．８ＬのＹＰＧ培地を添加し、培地中のエタノール濃度を１％に制御し、同じ条件下で通気攪拌培養を行ない、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表２にまとめた。
【００５７】
【表２】
表２の結果から、形質転換株の方が、最終到達酢酸濃度、比増殖速度、生酸速度の何れにおいても、顕著に優れていることが確認できた。
【００５９】
（実施例５）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のアコニターゼ遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
グルコンアセトバクター・エンタニイの1菌株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株由来のアコニターゼ遺伝子を含む断片（配列表の配列番号１の塩基番号３０７〜３２３９）をＰＣＲ法により増幅し、その結果得られた増幅断片をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、この断片を酢酸菌―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＡＣＯ１１を作製した。
【００６０】
このｐＡＣＯ１１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.），５８巻，９７４頁，１９９４年）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００６１】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＣＯ１１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００６２】
具体的には、酢酸３％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００６３】
その結果、図４に示すように、３％酢酸と３％エタノールを添加した培地では形質転換株は増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では増殖できなかったことが確認でき、酢酸菌のアコニターゼ遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００６４】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規なアコニターゼ遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法が提供できた。
【００６５】
【配列表】
【配列表のフリーテキスト】
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｐｈＩを用いてクローニングされたアセトバクター・アセチ由来の遺伝子断片の制限酵素地図とアコニターゼ遺伝子の位置、及びｐＡＣＯ１への挿入断片の概略図。
【図２】ＳｐｈＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図とアコニターゼ遺伝子の位置、及びｐＡＣＯ１１への挿入断片の概略図。
【図３】アセトバクター・アセチ由来のアコニターゼ遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図面。
【図４】グルコンアセトバクター・アンタニイ由来のアコニターゼ遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸含有培地での培養経過を示す図面。
Claims (6)
- 下記の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。 - 下記の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。 - 下記の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。 - 下記の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(b)配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。 - 配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５４〜３０６５の塩基配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８９〜３１７９の塩基配列からなるアコニターゼ活性及び酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
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