JP4616296B2 - 酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子、該遺伝子を修飾して育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 - Google Patents

酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子、該遺伝子を修飾して育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子に関し、さらにクオラムセンシングシステム関与する遺伝子がコードする一つ又は二つ以上のタンパク質の機能を低下ないしは欠損させて、より高い酢酸濃度でも増殖能力や酢酸生産能が低下せずに酢酸発酵を行える性能（以下、酢酸発酵能と称する場合もある）を増強させた酢酸菌、該酢酸菌を用いた食酢の製造方法、及び該製造方法により製造される食酢に関する。
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や酢酸生産能は次第に低下する。
そのため、より高い酢酸濃度でも増殖能力や酢酸生産能が低下せずに酢酸発酵を行うことができる酢酸菌、すなわち、より優れた酢酸発酵能を有する酢酸菌を開発することが求められている。
このような酢酸発酵能の優れた酢酸菌を開発する試みとして、例えばアセトバクター属の酢酸菌を変異させて酢酸感受性にした株を元に回復させることのできる酢酸菌由来のクラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）を増幅した形質転換株（例えば、特許文献１参照）、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入した例（例えば、特許文献２参照）、酢酸菌由来のアコニターゼ遺伝子を過剰発現させた例（例えば、特許文献３参照）など多くが開示されている。
しかし、いずれも十分な酢酸発酵能を付与することには成功していないのが現状であり、高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く生産できる酢酸発酵能が増強された酢酸菌の取得が望まれていた。
一方、近年、多くの細菌で細胞密度に依存して特定の遺伝子の転写が制御される細胞間情報伝達機構の存在が明らかになっている。この情報伝達機構はクオラムセンシングシステム（quorum sensing system）（集団密度感知制御系）とよばれ、生物発光、菌体外酵素の生産、病原性の発現、バイオフィルムの形成、抗生物質生産など、様々な機能の発現制御に関わっている。
なお、ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）等の多くのグラム陰性細菌で見出されているクオラムセンシングシステムには２つのタンパク質が関与している（例えば、非特許文献１参照）。すなわち、細胞間の情報伝達物質であるアシルホモセリンラクトンを合成するアシルホモセリンラクトン合成酵素、アシルホモセリンラクトンの受容体であり転写因子としても機能するアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子である。菌体内でアシルホモセリンラクトン合成酵素によって生産されたアシルホモセリンラクトンは、菌体内外に拡散する。そして、その濃度の増加に伴い、菌体内でアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子と複合体を形成し、遺伝子の転写を制御する。
クオラムセンシングシステムは上記のような重要な機能を有しているにも関わらず、酢酸菌におけるクオラムセンシングシステムの解析は全く行なわれておらず、その存在及び機能は不明であった。また、従来、クオラムセンシングシステムが酢酸発酵能に関与するということは全く知られていなかった。
特開平３−２１９８７８号公報 特開平２−２３６４号公報 特開２００３−２８９８６７号公報 バイオサイエンスとインダストリー、６０巻、４号、２１９〜２２４頁、２００２年
本発明は、酢酸発酵能に関与する遺伝子を取得し、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることによる酢酸菌の酢酸発酵能を向上させる方法、さらに、該方法により酢酸発酵能が向上した酢酸菌を用いることによる高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く製造する方法、及び該製造方法により製造される食酢を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行い、酢酸菌にクオラムセンシングシステムが存在するかどうか不明の状況にあったが、クオラムセンシングシステムに関与する遺伝子に注目した。そこで、従来から知られているクオラムセンシングシステム遺伝子のゲノムサザンやその配列情報に基づいて作製した縮重プライマーを用いたＰＣＲ法などによって、酢酸菌のクオラムセンシングシステム遺伝子を取得しようと多くの実験を行ったが、成功しなかった。（クローニング後に、酢酸菌のクオラムセンシングシステム遺伝子の配列解析をして、はじめて、相同性が低いことが成功しなかった原因であることが判明した。）そこで、レポーター株を指標にクオラムセンシングシステム遺伝子をクローニングする方法について検討することにした。レポーター株を用いたアッセイにおいては、ショットガンクローニングで作製したライブラリーについて、数千コロニーについて試行したが、どのレポーター株でもうまくいく訳ではなく、最初クオラムセンシングシステム遺伝子のクローニングに成功しなかった。数種類目のレポーター株として、アグロバクテリウム・チュメファシエンス ＮＴＬ４（ｐＺＬＲ４）株を選択したアッセイにおいて、ショットガンクローニングで作製したライブラリーについて、数千コロニーについて試行してようやく酢酸菌のクオラムセンシングシステム遺伝子のクローニングに成功した。このようにして酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する２つのタンパク質をコードする遺伝子、すなわち、アシルホモセリンラクトン合成酵素とアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子を酢酸菌において初めて見出した。そして、これらのアシルホモセリンラクトン合成酵素とアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子を修飾して、これらのタンパク質の機能を低下ないし欠損させることによって、意外にも酢酸菌の酢酸発酵能が顕著に増強されることを確認し、さらに、このようにして酢酸発酵能が顕著に増強された酢酸菌を用いて酢酸発酵を行うことによって、高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く製造できることを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質
（２）以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質
（３）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質
（５）以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質
（６）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（７）酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与するアシルホモセリンラクトン合成酵素の遺伝子がコードする請求項１に記載のタンパク質、及び／又は、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子の遺伝子がコードする請求項４に記載のタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることを特徴とする酢酸発酵能が増強した酢酸菌の生産方法。
（８）上記（７）に記載の酢酸発酵能が増強した酢酸菌の生産方法により酢酸発酵能が増強されたことを特徴とする酢酸菌。
（９）上記（８）に記載の酢酸菌を、アルコールを含む培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
本発明によれば、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子並びに該遺伝子がコードするタンパク質が提供される。より具体的には、酢酸菌のアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子と該酵素タンパク質、及びアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子と該転写因子タンパク質などが提供される。また、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることによる酢酸菌の酢酸発酵能を顕著に増強させる方法が提供される。さらに、酢酸発酵能を顕著に増加させて高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率的に製造する方法が提供され、また該製造方法によって製造された高濃度の酢酸を含有する食酢が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質としては、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子がコードするタンパク質である。具体的には、配列表の配列番号２（図３）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列表の配列番号２（図３）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質があげられ、さらに配列表の配列番号２（図３）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質に関する。
さらに、本発明のタンパク質としては、配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質があげられ、さらに配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質に関する。
ここで、アシルホモセリンラクトン合成酵素とはアシルホモセリンラクトンの生合成を触媒するタンパク質であり、本発明において「アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質」とは、配列番号２（図３）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の有するアシルホモセリンラクトン合成酵素活性の２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上の酵素活性を有するタンパク質をいう。また、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子とはアシルホモセリンラクトンと複合体を形成することによって、遺伝子の転写を制御することができる機能を有するタンパク質であり、本発明において「アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質」とは、配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の有する各種遺伝子の転写を制御することができる機能の２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上の機能を有するタンパク質をいう。
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて本発明のタンパク質を取得することができる。
化学合成により本発明のタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。
また、遺伝子組換え技術により本発明のタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
なお、遺伝子組換え技術によって本発明のタンパク質を調製する場合に、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出を行った後、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法が用いられ、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。
特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。
さらに、配列表の配列番号２（図３）あるいは配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列表の配列番号２（図３）あるいは配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列表の配列番号２（図３）あるいは配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示した配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。
例えば、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、あるいは該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌、あるいはそれら以外の酢酸菌より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製のサーマルサイクラーGene Amp PCR System 2400を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やKOD-Plus-（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行うことができる。
さらに、上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させて融合タンパク質とすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号２（図３）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号２（図３）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号２（図３）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列からなるＤＮＡ、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列の一部から作製したプライマー対又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
さらに本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加とされたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列からなるＤＮＡ、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列の一部から作製したプライマー対又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
このように、本発明のアシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質やアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたタンパク質をコードするものであってもよい。
このようなアシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質やアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。さらに、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
上記「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を意味する。
例えば、これら１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、上記のように、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤を接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版（Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989）やカレントプロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
上記「配列表の配列番号２（図３）又は配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列表の配列番号２（図３）又は配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列との相同性が８５％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であることを意味する。
上記「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０％以上、好ましくは７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版（Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列情報又は配列表の配列番号２（図３）や配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子ＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子ＤＮＡを取得することができる。また、これらの酢酸菌からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子ＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
具体的には、本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５1（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照）に開示された方法により取得できる。得られた染色体ＤＮＡから、アシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々のＤＮＡ断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えばＰｓｔＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
次いで、切断された染色体ＤＮＡを、大腸菌内で自立複製可能、かつ抗生物質耐性マーカー遺伝子を有するベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製する。
具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素ＰｓｔＩを温度３７℃、酵素濃度１〜１００ユニット/ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、染色体ＤＮＡ断片混合物を切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
得られた組換えＤＮＡを用いて、大腸菌を形質転換する。形質転換株はベクターに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を添加したＬＢ寒天培地で選択する。上記選択培地で生育した抗生物質耐性の形質転換株を１０の３乗個〜５乗個得る。これを染色体ＤＮＡライブラリーとして使用する。
この染色体ＤＮＡライブラリーから、以下の方法でアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子を有する断片を持つ株を選択する。具体的にはアシルホモセリンラクトン存在下で色素を生産するレポーター株（例えば、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカルメソッズ（Journal of Microbiological Methods）、４４巻、２３９〜２５１頁、２００１年参照）を植菌した培地に、染色体ＤＮＡライブラリーの株を植菌し、その後、レポーター株の色素生産を誘導した株を選択すればよい。このようにして選択した株からプラスミドを回収することでアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子が得られる。
また、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子は多くの場合、アシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子と隣接して存在することから、以下の方法でアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子を取得することが可能である。
すなわち、上記のようにして得られたアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子の前後の塩基配列を決定し、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲによるホモロジー検索やＮＣＢＩのドメイン検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/cdd.shtml）を使用したモチーフ検索を行なうことにより、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子を取得することができる。なお、アシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子の前後の配列が短い場合には、この配列をもとにしてプローブを作製し、ハイブリダイゼーションによって、前後の配列を取得すればよい。
また本発明のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・インターメディウスのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報）に開示された方法により取得できる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製のサーマルサイクラーGene Amp PCR System 2400を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やKOD-Plus-（東洋紡績社製）などを使用して常法に従って行なうことができる。
本発明のＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されるように塩基配列を改変することによって取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１（図２）に記載の塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８、もしくは８４９〜１５５９からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アシルホモセリンラクトン合成酵素やアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
また、上記配列表の配列番号２（図３）もしくは配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２（図３）又は配列表の配列番号３（図４）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質もしくはアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどからなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列表の配列番号１（図２）に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の酢酸菌等から、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１に示される塩基配列、又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アシルホモセリンラクトン合成酵素やアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得ることができる。
本発明の酢酸菌には特に制限はなく、例えば、アルコール酸化能を有するアセトバクター属（Acetobacter）やグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）などの細菌があげられるが、本発明の酢酸菌は上記の如くクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能が低下ないしは欠損するように改変されたことを特徴とするものであり、以下のものが例示される。
すなわち、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・インターメディウス（Gluconacetobacter intermedius）、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）などがあげられ、さらに具体的には、グルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス ＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス ＡＴＣＣ４９０３７（Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037）株、アセトバクター・アルトアセチゲネス ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６７）株などがあげられる。
また、アセトバクター属（Acetobacter）に属する酢酸菌としては、例えば、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）があげられ、さらに具体的には、アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株、アセトバクター・アセチ ＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株などがあげられる。
本発明の酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子がコードする一つ又は二つ以上のタンパク質の機能を低下ないしは欠損させる酢酸菌の酢酸発酵能が増強した酢酸菌の生産方法としては、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子の発現や、該遺伝子がコードするタンパク質の活性が阻害を受けるような物質を培地中に添加して培養する方法などを挙げることができる。このような物質の一つとしては、ＤＨＣＰ（４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン）などの抗菌物質があげられ、該抗菌物質を適当量添加して培養することにより酢酸発酵能が増強した酢酸菌を得ることができる。
また、本発明の酢酸発酵能が増強した酢酸菌の生産方法として、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子を修飾して、機能を低下ないし欠損させる方法も有効である。また、これらの遺伝子の発現を制御するように当該遺伝子の発現に関与する遺伝子部分に突然変異を誘導することも有効である。なお、遺伝子を修飾する方法としては、物理的処理や化学的変異剤を用いて当該遺伝子に突然変異を誘導する方法が有効であり、これらの突然変異を誘導する方法としては、従来、酢酸菌で実施されてきた方法が有効である。例えば、酢酸菌を紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、突然変異を誘発させる方法があげられる。
このようにして突然変異によりアシルホモセリンラクトン合成酵素の機能が低下、又は欠損した株は、アシルホモセリンラクトンの生産が低下、又は停止する。また、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子はアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子の転写を活性化することから、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子の機能が低下、又は欠損した株においても、アシルホモセリンラクトンの生産が低下、又は停止する。
このことから、突然変異を誘導した酢酸菌から目的とする酢酸菌を選択するには、アシルホモセリンラクトンの生産が低下、又は停止した株を選択すればよい。例えば、バイオアッセイなどにより、アシルホモセリンラクトンを検出する方法が利用できる。具体的にはアシルホモセリンラクトン存在下で色素を生産するレポーター株（例えば、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカルメソッズ（Journal of Microbiological Methods）、４４巻、２３９〜２５１頁、２００１年参照）を植菌した培地に、突然変異株を植菌し、培養する。そして、レポーター株の色素生産量を確認し、野生株と比較して、色素生産を誘導しない突然変異株、即ちアシルホモセリンラクトンの生産が低下又は停止した突然変異株を選択すればよい。
なお、酢酸菌は自然に変異を起こしやすい細菌として知られていることから、自然界から、上記酵素の発現や機能に自然に変異をおこした遺伝子を有する酢酸菌を分離することによっても酢酸発酵能が増強した酢酸菌を得ることができる。このような自然変異株の分離は、上記の突然変異株と同様にして、アシルホモセリンラクトンの生産を検出する方法を利用して実施することができる。
また、既にこれらの遺伝子が取得され、塩基配列も明らかとなっているので、これらの遺伝子を組換えることによって変異を導入した遺伝子を元の酢酸菌中に導入し、相同組換えなどを利用して元の酢酸菌の当該遺伝子の機能を低下ないし欠損させることにより、本発明の酢酸発酵能が増強した酢酸菌を生産することができる。例えば、アシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子の部分配列を欠失させる、又は、該遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどして正常に機能するアシルホモセリンラクトン合成酵素を産生しないように修飾した遺伝子を含むＤＮＡで酢酸菌を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することなどの方法が有効である。同様に、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子遺伝子が破壊され、酢酸発酵能が増強した酢酸菌を得ることもできる。
１つの菌株において本発明のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子がコードするタンパク質のうち１つの機能を低下ないしは欠損させることもできるし、２つ以上のタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることもできる。２つ以上の発現を抑える場合には、まず、上記の突然変異や相同組換えなどを利用して、クオラムセンシングシステムに関与する遺伝子がコードするタンパク質のうち１つの機能を低下ないし欠損させた株（一重欠損株と呼ぶ）を作製する。そして、クオラムセンシングシステムに関与する２つめの遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどして正常に機能するアシルホモセリンラクトン合成酵素を産生しないように修飾した遺伝子を含むＤＮＡで一重欠損株を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することなどの方法が有効である。なお、一重欠損株を作製する際に薬剤耐性遺伝子を使用している場合には、形質転換体を効率よく選択するため、別の薬剤耐性遺伝子を使用すればよい。
なお、酢酸菌の形質転換は、塩化カルシュウム法（例えば、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、４９巻、２０９１頁、１９８５年参照）やエレクトロポレーション法（例えば、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７４頁、１９９４年参照）等によって行うことができる。
このようにして、アルコール酸化能を有するアセトバクター属（Acetobacter）やグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）の酢酸菌において、上記のようにしてクオラムセンシングシステムの機能を低下ないしは欠損させて正常に機能しないように改変することにより、酢酸発酵能を向上させることができる。
その他、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子がコードする一つ又は二つ以上のタンパク質の機能を低下ないしは欠損させて、酢酸菌の酢酸発酵能を増強する方法としては、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子の発現や、該遺伝子がコードするタンパク質の活性が阻害を受けるような物理的条件下で、該酢酸菌を培養する方法があり、このような条件としては、例えば比較的低温度で培養することなどが挙げられる。
本発明の食酢の製造方法は、酢酸菌のクオラムセンシングシステムの機能を低下ないしは欠損させて正常に機能しないようにして、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめること以外は、従来公知の方法が採用される。すなわち、クオラムセンシングシステムの機能を低下ないしは欠損させて正常に機能しないようにした酢酸菌の培養は、基本的には酢酸発酵が可能な条件で行えば良く、具体的には、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行えば良い。
また、アルコールを含有する培地としては酢酸発酵に使用する培地であれば良く、エタノールなどのアルコール成分の他、炭素源、窒素源、無機物等を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものを用いることができる。培地は、合成培地でも天然培地でも良い。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
また、培養条件は、静置培養法、振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は２５〜３５℃、通常３０℃とする。培地のｐＨは、通常は２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することができる。通常１〜２１日間培養することによって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
このような本発明の食酢の製造方法により、高酸度の食酢をより効率良く製造することができる。本発明はまた、アシルホモセリンラクトンの含量が減少した、本発明の食酢の製造方法により得られる食酢に関する。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが,本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［酢酸菌株由来のアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子の取得］
酢酸菌のアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子を単離するため、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６７としてブダペスト条約に基づき寄託されているグルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株（以下、野生株と称する場合もある）を用い、この野生株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
染色体ＤＮＡは、GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit(Amersham Biosciences製)を用いて抽出した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Pst I（タカラバイオ製）で３７℃、１時間処理した。
次いで、切断した染色体ＤＮＡ断片を、pUC19に連結し、組換えＤＮＡを作製した。
具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Pst Iを３７℃、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたpUC19を混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを１６℃、６時間作用させて組換えＤＮＡを得た。
得られた組換えＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株にエレクトロポレーション法（例えば、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci.Biotech.Biochem.）、５８巻、９７４頁、１９９４年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌの抗生物質を添加したＬＢ寒天培地で選択する。上記選択培地で生育したアンピシリン耐性の形質転換株を染色体ＤＮＡライブラリーとして使用した。
このライブラリーから、以下の方法でアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子を有する断片を選択した。具体的には、アシルホモセリンラクトン存在下で色素を生産するレポーター株であるアグロバクテリウム・チュメファシエンス ＮＴＬ４（ｐＺＬＲ４）（Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)）株（例えば、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、１８５巻、１９号、５６６５〜５６７２頁参照）を植菌した５０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に、レポーター株と隣接するように染色体ライブラリーの株を植菌した。３０℃で２日間培養し、レポーター株の色素生産を誘導した株を選択した。このようにして選択した株からプラスミドを回収し、塩基配列を決定した。その結果、図２及び配列表の配列番号１の塩基番号１〜２３３３に相当する塩基配列が決定された。
その結果、ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）のアシルホモセリンラクトン合成酵素とわずかに２１．２％の相同性を有するタンパク質（以下、Ｏｒｆ１と称する場合もある）をコードするＯＲＦ（以下、ｏｒｆ１と称する場合もある）（図２及び配列表の配列番号１の塩基番号１６３９〜２２６８）を含むＤＮＡ断片を取得した。
［アシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子の破壊株の作製］
実施例１で取得したｏｒｆ１の塩基配列に基づいて、プライマー１（図５及び配列表の配列番号４参照）及びプライマー２（図６及び配列表の配列番号５参照）を合成し、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法によりｏｒｆ１の上流配列と５’側配列を増幅し、該増幅産物を制限酵素EcoR IとKpn I（タカラバイオ製）で処理してＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片１）を調製した。
同様にして、プライマー３（図７及び配列表の配列番号６参照）及びプライマー４（図８及び配列表の配列番号７参照）を合成し、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法によりｏｒｆ１の構造遺伝子の３’側配列と構造遺伝子の下流配列を増幅し、該増幅産物を制限酵素Hind III（タカラバイオ製）で処理してＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片２）を調製した。
また、大腸菌トランスポゾンＴｎ５を鋳型にして、プライマー５（図９及び配列表の配列番号８参照）及びプライマー６（図１０及び配列表の配列番号９）を使用して、ＰＣＲ法によりカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、該増幅産物を制限酵素Sma I（タカラバイオ製）で処理してＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片３）を調製した。
染色体ＤＮＡはGenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit（Amersham Biosciences製）を用いて抽出した。また、ＰＣＲ反応はPyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ製）を用い、変性９４℃、３０秒、会合５５℃、３０秒、伸長、７２℃、１分の条件で３０サイクル行なった。
次にＤＮＡ断片３をpUC18のSma Iサイトに連結した。このようにして調製したＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７４頁、１９９４年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、常法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このようにして得たプラスミドＤＮＡのEcoR I、Kpn IサイトにＤＮＡ断片１を、Hind IIIサイトにＤＮＡ断片２を同様にして連結し、大腸菌を形質転換して、ｏｒｆ１破壊用プラスミドpUCΔorf1を調製した。
このようにして得たｏｒｆ１破壊用プラスミドpUCΔorf1を用いて、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１株（以下、野生株と称する場合もある。）をエレクトロポレーション法（プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、８７巻、８１３０〜８１３４頁、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％ポリペプトン）で選択した。選択培地上で生育したカナマイシン耐性の形質転換株は、染色体ＤＮＡを抽出し、サザンハイブリダイゼーションにより、ｏｒｆ１遺伝子中にカナマイシン耐性遺伝子が挿入され、ｏｒｆ１遺伝子が破壊されていることを確認した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１Δｏｒｆ１株（以下、ｏｒｆ１破壊株と称する場合もある）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にブダペスト条約に基づき寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６８である。
［Ｏｒｆ１の機能解析］
野生株とｏｒｆ１破壊株のアシルホモセリンラクトン合成酵素活性を測定した。
アシルホモセリンラクトン合成酵素活性は、バイオアッセイ法（例えば、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、１８８巻、５号、１９４３〜１９４９頁、２００６年参照）によって検出した。
まず、野生株とｏｒｆ１破壊株を２％のエタノールと１％のセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）を含むＹＰＧ培地で培養し、経時的にサンプリングした。この培養液を０．２２μｍのフィルターでろ過し、培養上清を得た。この培養上清に等量の酢酸エチルを加え、良く攪拌した後、酢酸エチル層を回収した。水層に等量の酢酸エチルを再度加え、酢酸エチル層を回収した。
このようにして回収した酢酸エチル層をまとめて、遠心エバポレーターで酢酸エチルを除去した後、生じた沈殿をジメチルスルホキシドに溶解し、バイオアッセイ用サンプルを調製した。
次に、アシルホモセリンラクトンを検出するためのレポーター株であるアグロバクテリウム・チュメファシエンス ＮＴＬ４（ｐＺＬＲ４）（Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)）株（例えば、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、１８５巻、１９号、５６６５〜５６７２頁参照）をＡ培地（０．２％グルコース、０．１％酵母エキス、０．３％リン酸水素二カリウム、０．１％リン酸二水素ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０３％硫酸マグネシウム７水和物、０．０１５％塩化カリウム、０．００１％塩化カルシウム２水和物、０．０００２５％硫酸鉄７水和物、５μｇ／μｌゲンタマイシン）で、３０℃、１２時間培養し、前培養液とした。この前培養液を植菌したＡ培地に、上記の培養上清から調製したバイオアッセイ用サンプルを添加し、３０℃で６時間培養した。
このようにして作製した培養液のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性の測定は常法（例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、第２版、１７.３５頁、１９８９年参照）により行なった。
以上のようにして、野生株とｏｒｆ１破壊株の培養液中のアシルホモセリンラクトンの濃度を調べた。その結果を図１に示した。
図１から明らかなように、野生株ではアシルホモセリンラクトンが検出されたが、ｏｒｆ１破壊株では検出されなかった。この結果から、ｏｒｆ１によってコードされるタンパク質Ｏｒｆ１がアシルホモセリンラクトン合成酵素であることが確認できた。
［ｏｒｆ１破壊株の酢酸発酵試験］
実施例２で得られたｏｒｆ１遺伝子が破壊されたｏｒｆ１破壊株について、野生株と酢酸発酵能を比較した。具体的には、３リッターのミニジャー（丸菱バイオエンジ製、Bioneer３００型 ３Ｌ）を用いて、エタノール３％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％、消泡剤０．０１％を含む１．５リッターの培地にて、３０℃、５００ｒｐｍ、１リッター／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。発酵中は培地中のエタノール濃度を２％に制御した。発酵成績を表１にまとめた。
Figure 0004616296
表１から明らかなように、ｏｒｆ１破壊株は、野生株と比較して、培養２４時間の平均生産速度は約１．５倍早く、発酵時間の短縮が可能であることが明らかとなった。更に、培養液の酢酸濃度は、野生株の３．３０％に対して、ｏｒｆ1破壊株では４．６８％と約１．４倍に増加していたことから、ｏｒｆ１破壊株はより高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造することが可能であることが明らかとなった。
この結果から、アシルホモセリンラクトン合成酵素をコードするｏｒｆ１を破壊することにより、酢酸菌の酢酸発酵能が増強され、高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く生産することができることが示された。
［酢酸菌由来のアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子の取得］
実施例１で得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した結果、アシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子の上流にビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）のアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子とわずかに２６．２％の相同性を有するタンパク質（以下、Ｏｒｆ２と称する場合もある）をコードするＯＲＦ（以下、ｏｒｆ２と称する場合もある）（図２及び配列表の配列番号１の塩基番号８４９〜１５５９）を含むＤＮＡ断片を取得した。
［アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子の破壊株の作製］
実施例５のｏｒｆ２の塩基配列に基づいて、プライマー７（図１１及び配列表の配列番号１０参照）及びプライマー８（図１２及び配列表の配列番号１１参照）を合成し、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法によりｏｒｆ２を含む配列を増幅し、該増幅産物を制限酵素EcoR IとSma I（タカラバイオ製）で処理してＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片４）を調製した。
また、大腸菌トランスポゾンＴｎ５を鋳型にして、プライマー５（図９及び配列表の配列番号８参照）とプライマー６（図１０及び配列表の配列番号９参照）を使用して、ＰＣＲ法によりカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、該増幅産物を制限酵素Sma I（タカラバイオ製）で処理してＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片５）を調製した。
染色体ＤＮＡはGenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit(Amersham Biosciences製）を用いて行なった。また、ＰＣＲ反応はPyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ製）を用い、変性９４℃、３０秒、会合５５℃、３０秒、伸長、７２℃、１分の条件で３０サイクル行なった。
次にＰＣＲ産物４をpUC19のEcoR I、Sma Iサイトに連結した。このようにして調製したＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株にエレクトロポレーション法（例えば、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７４頁、１９９４年参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、常法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドをEcoR V（タカラバイオ製）で処理することにより、ｏｒｆ２の内部で切断し、ＤＮＡ断片５を連結した。
このようにして調製したＤＮＡで上述のように大腸菌を形質転換し、常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、ｏｒｆ２破壊用プラスミドpUCΔorf2を得た。
このようにして得たｏｒｆ２破壊用プラスミドpUCΔorf2を用いて、野生株をエレクトロポレーション法（例えば、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A.）、８７巻、８１３０〜８１３４頁、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％ポリペプトン）で選択した。選択培地上で生育したカナマイシン耐性の形質転換株は、染色体ＤＮＡを抽出し、サザンハイブリダイゼーションにより、ｏｒｆ２遺伝子中にカナマイシン耐性遺伝子が挿入され、ｏｒｆ２遺伝子が破壊されていることを確認した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１Δｏｒｆ２株（以下、ｏｒｆ２破壊株と称する場合もある）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にブダペスト条約に基づき寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６９である。
［Ｏｒｆ２の機能解析］
アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子はアシルホモセリンラクトンと複合体を形成して、特異的な遺伝子の転写を制御する。このようにアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子−アシルホモセリンラクトン複合体によって制御される遺伝子の１つとしてアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子が挙げられる。上記の複合体はこの遺伝子の上流に結合して、その転写を活性化することが知られていた（例えば、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、１８５巻、１９号、５６６５〜５６７２頁、２００４年参照)。そこで、本発明者はタンパク質のモチーフ検索による機能推定、ゲルシフトアッセイによるＤＮＡ結合能、ｏｒｆ１の転写解析を行い、Ｏｒｆ２がアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子であることを推定した。
ＮＣＢＩのドメイン検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/cdd
.shtml）を使用したモチーフ検索により、Ｏｒｆ２のＮ末側にアシルホモセリンラクトン受容体ドメイン（ｐｆａｍ０３４７２．１０）、Ｃ末側にヘリックスターンへリックスＤＮＡ結合モチーフ（Ｓｍａｒｔ００４２１．１１）が存在することを見出した。
次に、Ｕｒｂａｎｏｗｓｋｉらの方法（例えば、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、１８５巻、１９号、５６６５〜５６７２頁、２００４年参照）に従って、ゲルシフトアッセイを行った。大腸菌で高発現したＯｒｆ２組換えタンパク質を用い、ｏｒｆ１遺伝子の上流配列を(配列表の配列番号１の１３４９〜１７４９)をプローブとした。その結果、Ｏｒｆ２はアシルホモセリンラクトン存在下でｏｒｆ１遺伝子の上流に結合することが示唆された。
さらに、野生株とｏｒｆ２破壊株からＲＮＡを抽出し、ノザンハイブリダイゼーションにより、ｏｒｆ１の転写解析を行なった。
ＲＮＡは２％のエタノールと１％のセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）を含むＹＰＧ培地で８時間培養した菌体から、ホットフェノール法により抽出した。その結果、野生株ではｏｒｆ１の転写が見られたが、ｏｒｆ２破壊株ではｏｒｆ１の転写は見られなかった。
以上の結果から、Ｏｒｆ２はアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子として機能していることが確認できた。
［グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１Δｏｒｆ２株の酢酸発酵試験］
実施例３で得られたｏｒｆ２破壊株について、野生株と酢酸発酵能を比較した。具体的には、３リッターのミニジャー（丸菱バイオエンジ製、Ｂｉｏｎｅｅｒ３００型 ３Ｌ）を用いて、エタノール３％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、アンピシリン１００ μｇ／ｍｌ、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％、消泡剤０．０１％を含む１．５リッターの培地にて、３０℃、５００ｒｐｍ、１．０リッター／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。発酵中は培地中のエタノール濃度を２％に制御した。発酵成績を表２にまとめた。
Figure 0004616296
表２から明らかなように、ｏｒｆ２破壊株は、野生株と比較して、培養２４時間の平均生産速度は約１．４倍早く、発酵時間の短縮が可能であることも明らかとなった。更に、培養液の酢酸濃度は、野生株の３．３０％に対して、ｏｒｆ２破壊株では４．６８％と約１．６倍に増加していたことから、形質転換株は、より高酸度の食酢の製造に利用可能であることが明らかとなった。
この結果から、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードするｏｒｆ２を破壊することにより、酢酸菌の酢酸発酵能が増強され、高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く生産することができることが示された。
本発明によれば、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子ならびに該遺伝子がコードするタンパク質が提供され、さらに酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させることによる酢酸菌の酢酸発酵能を顕著に増強させ方法が提供されるので、該方法により酢酸菌を用いた高濃度の酢酸を含有する食酢のより効率的な製造を行うことができるようになる。
アシルホモセリンラクトン合成酵素遺伝子を破壊した株の培養液中のアシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）濃度と生育（ＯＤ６６０）を示した図である。 アシルホモセリンラクトン合成酵素及びアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子の遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号１）を示した図である。 アシルホモセリンラクトン合成酵素のアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。 アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子のアミノ酸配列（配列番号３）を示した図である。 プライマー１の塩基配列（配列番号４）を示した図である。 プライマー２の塩基配列（配列番号５）を示した図である。 プライマー３の塩基配列（配列番号６）を示した図である。 プライマー４の塩基配列（配列番号７）を示した図である。 プライマー５の塩基配列（配列番号８）を示した図である。 プライマー６の塩基配列（配列番号９）を示した図である。 プライマー７の塩基配列（配列番号１０）を示した図である。 プライマー８の塩基配列（配列番号１１）を示した図である。

Claims (9)

  1. 以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質。
    （Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質
  2. 以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質
  3. 以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるＤＮＡ。
    （Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列からなるＤＮＡ
    （Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    （Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１６３９〜２２６８の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
  4. 以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質。
    （Ａ）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質
  5. 以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （Ａ）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質
  6. 以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるＤＮＡ。
    （Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列からなるＤＮＡ
    （Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    （Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４９〜１５５９の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
  7. 酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与するアシルホモセリンラクトン合成酵素の遺伝子がコードする請求項１に記載のタンパク質、及び／又は、アシルホモセリンラクトン受容体型転写因子の遺伝子がコードする請求項４に記載のタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることを特徴とする酢酸発酵能が増強した酢酸菌の生産方法。
  8. 請求項７に記載の酢酸発酵能が増強した酢酸菌の生産方法により酢酸発酵能が増強されたことを特徴とする酢酸菌。
  9. 請求項８に記載の酢酸菌を、アルコールを含む培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
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