KR101197956B1

KR101197956B1 - ＴｏｆＩ 변형 단백질 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101197956B1
Application number: KR20100092657A
Authority: KR
Inventors: 이상기; 정지웅; 유상헌
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-09-20
Filing date: 2010-09-20
Publication date: 2012-11-05
Also published as: WO2012039559A2; KR20120030289A; WO2012039559A3

Abstract

본 발명은 TofI 변형 단백질에 관한 것으로서, 구체적으로 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손된 TofI 변형 단백질, 상기 TofI 변형 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기의 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 TofI 변형 단백질을 결정화시키는 방법 및 상기 TofI 변형 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＴｏｆＩ 변형 단백질 및 이의 제조방법{Modified TofI protein and method for producing the same}

박테리아는 주위에 존재하는 자신의 세포를 인식하는데 쿼럼 센싱(quorum sensing)이라는 독특한 방법을 사용한다. 이 쿼럼 센싱은 박테리아에서 생합성된 자기유도인자(autoinducer)나 페로몬(pheromone)과 같은 저분자의 신호전달물질들을 세포 외부에 축적하여 활발한 증식을 유도하고 일정한 정족수(Quorum)를 채워 유전자 발현을 유도하는 일련의 생물현상으로서, 특정 신호전달물질을 이용한 세균들 사이의 의사소통 메커니즘을 의미한다. 박테리아 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)와 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia)에 의한 쿼럼 센싱이 알려진 이래로, 박테리아 쿼럼 센싱은 많은 박테리아 종의 세포간 신호전달기작(bacterial cell-to-cell communication)의 일반적 모델로 인식되어 왔다. 쿼럼 센싱의 결과로 박테리아의 밀도증가와 비례적으로 자기유도인자의 농도가 증가하여 특정농도(threshold concentration)에 도달하면, 박테리아는 이 신호전달물질을 인식함으로써 박테리아 운동성, 병원성, 독성 등을 나타내는 유전자의 발현이 조절된다(C.T. Parker, V. Sperandio, Cell. Microbiol. 11, 363 (2009), M. Schuster, E. P. Greenberg, Int. J. Med. Microbiol. 296, 73 (2006)). 따라서 쿼럼 센싱에 의한 유전자 발현 조절은 박테리아의 세포밀도 변화에 따른 대사의 전이조절, 특히 병원성 유전자의 발현에 중심 역할을 담당하고 있다.

현재까지 박테리아의 서로 다른 종에서 생합성 되는 자기유도인자는 네 가지 그룹이 알려져 있으며, 이들의 화학적 구조는 서로 다른 것으로 확인되었다. 이들 중 병원성세균의 많은 부분을 차지하는 그람음성세균에서는 AHL(N-acylhomoserine lactone)이 자기유도인자로써 생산되고 있으며, 생합성된 자기유도인자는 자체의 단백질이 감지(recognition)하여 유전자 발현 조절을 하는 것으로 알려졌다. 이 과정에서 AHL 합성효소는 AHL 생합성을 담당하며, AHL 수용체는 AHL의 감지의 역할을 담당한다. 즉, 쿼럼 센싱은 신호물질인 자기유도인자를 합성하는 단백질과 그 신호물질과 결합하여 유전자의 발현을 조절하는 전사조절 단백질에 의해 이루어진다. 특히, AHL 합성효소는 SAM(S-adenosyl-L-methionine)과 아실-ACP(acylated acyl-carrier protein)을 기질로 사용하여 아실화(acylation) 및 락톤화(lactonization) 과정을 거쳐 AHL을 합성하고, 부산물로서는 holo-ACP와 MTA(5'-methylthioadenosine)를 만들어 낸다(도 1)(A. L. Schaefer, D. L. Val, B. L. Hanzelka, J. E. Cronan Jr., E. P. Greenberg, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93, 9505 (1996), M. I. More et al., Science 272, 1655 (1996)). 특히, 그람음성세균에서 생산되는 모든 AHL은 호모세린 락톤 고리(homoserine lactone ring)를 공통적으로 공유하지만, 호모세린 락톤 고리에 아마이드 결합을 통하여 연결된 아실기의 길이, 아실기 3번 탄소의 산화여부, 또는 아실기의 포화 정도가 박테리아 종에 따라 다양하기 때문에 AHL의 구조는 종 특이적인 특성을 갖고 있다. 이에 반하여, 자기유도인자의 감지를 담당하는 AHL 수용체는 DNA 결합 도메인과 AHL 결합 도메인을 가지고 있는 유전자 전사조절인자(transcriptional factor)로서 종 특이적인 AHL을 인식하여 표적 유전자의 발현을 조절하여, 쿼럼 센싱에 의한 유전자 발현 조절에 직접 관여하고 있다.

한편, 현재 사용되고 있는 항생제들은 박테리아의 생존에 필수적인 인자를 표적으로 하고 있기에 이는 박테리아의 습득저항성(acquired resistance)을 유발하여 기존 항생제에 저항성을 보이는 슈퍼-박테리아(super-bacteria)의 생성을 초래하고, 결국에는 기존의 항생제로는 이러한 슈퍼-박테리아 감염을 치료할 수 없다는 단점이 있다. 이와 대조적으로 쿼럼 센싱은 일반적으로 박테리아 생존의 필수 요건이 아니기에 이러한 쿼럼 센싱을 저해하는 약물의 개발은 박테리아 저항성을 유발하는 기존 항생제의 문제점을 극복하면서, 병원세균의 생장을 저해하여 발병을 억제할 수 있다는 장점으로 차세대 항생제의 표적으로 제안되었다. 그러나, 지금까지 쿼럼 센싱 저해제(inhibitor)의 개발은 AHL 수용체를 주된 표적으로 국한되었으며(G. D. Geske, J. C. O'Neil, H. E. Blackwell, Chem. Soc. Rev. 37, 1432 (2008), D. A. Rasko, V. Sperandio, Nat. Rev. Drug Discov. 9, 117 (2010), Y. Zou, S. K. Nair, Chem. Biol. 16, 961 (2009)), 최근에는 AHL 합성효소의 반응결과로 생성되는 MTA를 SAM으로 재활용하는 SAM 경로에 관련된 효소(J. A. Gutierrez et al., Nat. Chem. Biol. 5, 251 (2009))를 표적으로 하는 저해제의 개발이 국제적으로 진행되고 있다.

상기에서 언급한 AHL 수용체 및 SAM 경로에 관련된 효소를 제외하고, 쿼럼 센싱의 자기유도인자 생합성을 주관하는 AHL 합성효소는 이와 같은 쿼럼 센싱 저해제 개발을 위한 주된 표적이 될 수 있다. 특히, 최근까지 두 가지의 다른 AHL 합성효소의 단백질 3차 구조 정보가 알려져 있기에 단백질구조기반 신약개발(protein structure-based drug design)의 출발점을 제공할 수 있을 것으로 기대를 모으고 있다. 하지만 이러한 기대와는 달리, 자기유도인자로써 3-oxo-C12-HSL(3-oxo-C12-homoserine lactone)를 합성하는 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 AHL 합성효소 LasI(T. A. Gould, H. P. Schweizer, M. E. Churchill, Mol. Microbiol. 53, 1135 (2004)) 및 3-oxo-C6-HSL(3-oxo-C6-homoserine lactone)를 합성하는 팬토스트 워티(Pantoeaste wartii)의 AHL 합성효소 EsaI(W. T. Watson, T. D. Minogue, D. L. Val, S. B. von Bodman, M. E. Churchill, Mol. Cell 9, 685 (2002)), 모두 기질(substrate) 혹은 반응산물(reaction by-product)이 결합된 단백질 3차 구조에 대한 정보가 없어서 AHL 합성효소의 기작 규명에 어려움이 있으며, 이에 따라 쿼럼 센싱의 저해를 위한 상기 효소의 저해제 개발에 한계가 있어 왔다. 이와 같이 자기유도인자를 신호물질로 합성하는 병원세균의 AHL 합성효소가 쿼럼 센싱 저해제 개발의 직접적인 주된 표적분자임에도 불구하고, 현재 병원세균의 AHL 합성효소를 대상으로 하는 단백질구조기반 신약개발 연구가 국제적으로 미진한 것은 이러한 AHL 합성효소의 수용성화(solubilization) 및 단백질 3차 구조 연구를 위한 단백질 결정화(protein crystallization)가 어렵기 때문에, 그 결과로 기질 혹은 반응산물이 결합된 단백질 3차 구조에 대한 정보가 없는데 기인하고 있다.

또한 최근 들어, NMR (Nuclear magnetic resonance spectroscopy)을 사용하여 신약을 개발하고자 하는 시도가 늘고 있으나 (P. J. Hajduk, J. Greer, Nat. Rev. Drug Discovery 6, 211 (2007)), 불용성 단백질의 경우에는 단백질의 수용성화가 선행되어야하므로 NMR을 사용한 분석이 용이하지 않아 신약 개발에 있어 어려움이 드러나고 있다. AHL 합성효소의 경우에도 단백질의 수용성화가 선행되어야 NMR을 이용한 신약개발이 가능하나 AHL 합성효소의 수용성화에 대한 연구에 대한 결과보고가 미미한 상황이다.

이러한 배경 하에서 본 발명자들은 차세대 항생제의 표적인 쿼럼 센싱의 단백질구조기반 저해제 개발을 위하여, 표적 단백질인 AHL 합성효소의 특성을 단백질공학(protein engineering) 방법을 통하여 변형하여 기질유사체(substrate analog) 및 반응산물이 결합된 단백질 3차 구조 분석에 적합한 결정성을 갖는 효소 및 MNR 등을 이용하여 신약 개발의 표적으로 이용할 수 있는 수용성을 갖는 효소를 제조하기 위해 예의 노력한 결과, 그람음성세균인 식물성 세균의 하나인 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae) 유래의 AHL 합성효소인 TofI을 변형한 TofI 변형 단백질이 수용성, 또는 수용성 및 결정성을 갖는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손된 TofI 변형 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 TofI 변형 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 또는 상기의 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 중 어느 하나 이상의 아미노산을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 TofI 변형 단백질을 결정화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손된 TofI 변형 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손된 TofI 변형 단백질에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "TofI 단백질"이란 그람음성세균인 식물병원세균 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에서 유래한 AHL(N-acylhomoserine lactone) 합성효소로서, C8-HSL(C8-homoserine lactone)을 자기유도인자로 합성하는 효소이다. 상기의 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)는 식물독소인 톡소플라빈(toxoflavin)을 생산하여 벼의 알마름병을 유발하는 식물병원세균으로, 식물독소인 톡소플라빈의 생합성과 세포 밖으로의 이동(transport)이 쿼럼 센싱에 의한 유전자 발현과 관련되어 있다는 것이 최근 연구에 의하여 밝혀졌다(J. Kim et al., J. Bacteriol. 191, 4870 (2009)). 상기의 AHL은 그람음성세균에서 쿼럼 센싱의 신호 전달 물질인 자기유도인자를 의미한다. AHL을 매개로 하는 쿼럼 센싱은 많은 병원성 세균에 광범위하게 존재하며 그 기작이 매우 유사하여 새로운 항-감염요법의 대상이 된다.

본 발명에서 용어, "AHL(N-acylhomoserine lactone)"은 그람음성세균의 쿼럼센싱의 신호전달 물질인 일반적 호모세린 락톤 고리 구조를 공유하는 화합물 그룹을 의미하며, 그 예로, 옥소 헥사노일 호모세린 락톤(N-β-oxo-hexanoyl-L-homoserine lactone), 옥소 옥타노일 호모세린 락톤(N-β-oxo-octanoyl-Lhomoserine lactone), 옥소 데카노일 호모세린 락톤(N-β-oxo-decanoyl-Lhomoserine lactone), 헥사노일 호모세린 락톤(N-hexanoyl-L-homoserine lactone), 부타노일 호모세린 락톤(N-butanoyl-homoserine lactone), 옥소 도데카노일 호모세린 락톤(N-β-oxo-dodecanoyl-L-homoserine lactone) 등이 포함되나, 상기 예에 의해 아실 호모세린 락톤의 종류가 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 본 발명의 TofI이 합성하는 AHL은 옥타노일 호모세린 락톤으로, C8-HSL(C8-homoserine lactone)이다.

본 발명에서 용어, "TofI 변형 단백질"은 "TofI 변형체"와 혼용될 수 있으며, 수용성, 또는 수용성 및 결정성을 가질 수 있는 TofI 변형 단백질은 제한 없이 포함되나, 바람직하게는 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손된 TofI 변형 단백질일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 TofI 변형 단백질일 수 있다. 또한 추가적으로 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu)을 메티오닌(Met)으로 치환된 TofI 변형 단백질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 TofI 변형 단백질일 수 있다.

바람직하게 상기 TofI 변형 단백질은 수용성 형태로 발현된다.

본 발명에서 용어, "수용성" 형태로 발현한다는 것은 단백질을 물에 잘 녹지 않는 불용성 형태에서 물에 잘 녹는 수용성 형태로 바꾸어 준다는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열번호 1의 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손된 TofI 변형 단백질의 경우 수용성 형태로 발현되며, 단백질 효소활성에 영향이 없는 것을 확인하였다.

이와 같이 수용성 형태의 발현은 신약 개발의 NMR 분석을 위해 선행되어야 하는 조건이다. 또한 단백질은 수용성 상태에서만 구조 결정을 할 수 있기 때문에 추후 결정화시키는 단계를 위해 선행되어야 하는 조건이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 서열번호 1의 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손되지 않은 TofI 변형 단백질(TofI(3M))은 서열번호 1의 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 다른 TofI 변형 단백질(TofI(Δ), TofI(3MΔ), TofI(F42MΔ))과 달리 결정화가 이루어지 않았으며(실시예 1), 결정화는 수용성이 선행되어야 이루어지므로, 상기 결과는 서열번호 1의 91번째 및 92번째 아미노산의 결손이 TofI 변형 단백질의 수용성 발현에 중요하다는 것을 시사하는 것이다.

바람직하게 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 중 어느 하나 이상의 아미노산을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 TofI 변형 단백질은 결정화를 이룰 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 TofI 변형 단백질일 수 있다.

본 발명에서 용어, "결정화"를 이룰 수 있게 한다는 것 또는 "결정성"을 갖는다는 것은 단백질을 X-선 단백질 3차 구조 분석을 위한 적합한 상태로 만들어주기 위해 단백질 분자에 변이를 도입하여 균일한 액상으로부터 일정한 모양과 크기를 갖는 고체입자를 형성하게 하거나 단백질의 결정 상태를 더욱 안정하게 하는 것을 말한다. 단백질의 3차원 구조는 단백질의 생체 내 작용을 이해하고, 치료 약물을 개발하는 데 매우 중요하다. 즉, 고분자인 단백질을 구성하는 원자의 배열과 3차원 구조를 안다면, AHL 합성효소와 기질 유사체(substrate analog) 및 반응산물이 결합된 단백질 3차 구조 분석이 가능하며 AHL 합성효소 활성을 저해하는 신약개발의 기반을 마련할 수 있으므로 생물 및 의학 분야에서 공통된 과제이나, 현재까지 기질, 혹은 반응산물에 결합된 단백질 3차 구조 정보를 제공할 수 있는 AHL 합성효소의 정보가 거의 없다. 3차 구조 분석을 위해서는 단백질을 결정체로 만들어 분석하여야 하며, 결정체로 만들기 위해서는 우선적으로 수용성을 가져야 한다. 이러한 단백질을 얻기 위해 본 발명자는 TofI의 돌연변이를 통해 수용성 및 결정성을 갖는 단백질을 확인하였다.

구체적인 일 구현예에 따르면, TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손시킨 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 TofI 변형체를 "TofI(Δ)"라고 명명하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu)을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 TofI 변형체를 "TofI(3MΔ)"라고 명명하였으며, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe)을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 TofI 변형체는 "TofI(F42MΔ)"라고 명명하였다. 상기 돌연변이를 가한 TofI 변형체들이 TofI 효소 활성을 유지하는 것을 확인하였고(도 4), 상기의 변형체 중에 TofI(Δ), TofI(3MΔ) 또는 TofI(F42MΔ)이 NMR을 이용한 신약개발 연구에 적합한 수용성의 형태로 발현됨을 확인하였으며, TofI(3MΔ) 또는 TofI(F42MΔ)가 X-선 단백질 3차 구조 분석에 적합한 안정적인 단백질 결정을 형성함을 확인하였다. 이와 같이 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시켜도 효소 활성에 변화가 없음을 확인하였을 뿐만 아니라, 불용성 형태의 TofI 단백질을 수용성 형태로 발현시키기 위해 결손이 필요한 아미노산 위치임을 확인하였다.

또한 추가로 서열번호 2의 TofI 변형 단백질 중 42번째, 149번째 및 152번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산을 메티오닌으로 치환할 경우, TofI(3MΔ) 또는 TofI(F42MΔ)가 결정화를 이룰 수 있는 것을 확인하였다(도 5).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 TofI 변형 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

상기 핵산은 상기 TofI 변형 단백질을 코딩하는 핵산을 제한 없이 포함하나, 바람직하게는 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손된 TofI 변형 단백질을 코딩하는 핵산이다, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 TofI(Δ), 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 TofI(3MΔ) 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 TofI(F42MΔ)을 코딩하는 핵산일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 TofI(Δ)을 코딩하는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 핵산, TofI(3MΔ)을 코딩하는 서열번호 6 또는 TofI(F42MΔ)을 코딩하는 서열번호 7의 염기서열을 가지는 핵산일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게 본 발명에서는 pET-28 벡터를 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "형질전환"이란 외래 DNA의 도입에 의해 개체 또는 숙주세포의 형질을 유전적으로 변화시키는 것을 말한다. 이러한 형질전환은 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 하나한(Hanahan) 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococus)와 같은 원핵 숙주세포, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스포리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)) 등과 같은 하등 진핵세포, 곤충세포, 식물세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 바람직하게는 숙주세포는 대장균일 수 있다.

본 발명에서 용어, "형질전환체"는 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포로 본 발명의 수용성, 또는 수용성 및 결정성을 갖는 TofI 변형 단백질을 다량으로 생산할 수 있는 형질전환체를 의미하며, 또한 상기 TofI 변형 단백질이 도입되어 NMR을 통한 신약개발 후보물질을 스크리닝할 수 있는 형질전환체 또는 기질 유사체 및 반응산물에 결합시킨 후 AHL 합성효소의 활성을 저해하는 신약개발의 후보 물질을 스크리닝할 수 있는 형질전환체를 의미한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 중 어느 하나 이상의 아미노산을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 TofI 변형 단백질을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 TofI 변형 단백질을 결정화시키는 단계를 포함하는, TofI 변형 단백질을 결정화시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 (b) 단계에서 결정화는 방울 혼합 증기 평형법(Hanging-dorp vapor diffusion method)을 통해 수행될 수 있다.

본 발명에서 용어, "방울 혼합 증기 평형법(Hanging-dorp vapor diffusion method)"이란 단백질 구조 분석 방법인 X-선 결정법을 수행하기 위해서 필수적인 단백질의 결정화에 가장 많이 쓰이고 있는 것으로, 단백질 구조를 분석하기에 충분한 크기의 결정을 제공하는 방법이다. 방울 혼합 증기 평형법은 샘플이 포함된 시약과 액체 상태의 순수한 시약을 증기 평형 상태에 있는 용기 상단에 부착한다. 용기에 비해 시약의 함량이 적은 샘플이 평형에 도달하기 위해서, 샘플에 포함된 물이 용기로 떨어지게 하므로 액체 상태의 시약과 농도가 같아질 때까지 샘플에 함유된 물이 제거되고, 결과적으로 평형 상태에 도달한 단백질 결정을 얻을 수 있다. 이러한 방울 혼합 증기 평형법은 가격이 저렴하며 결정화도 쉽게 진행되고, 단일 실험으로 많은 결정을 얻을 수 있는 장점이 있다.

상기 결정화 방법에 의해 얻어진 수용성 및 결정성을 갖는 TofI 변형 단백질은 제한 없이 포함되나, 바람직하게는 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시키고, 추가적으로 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu)을 메티오닌(Met)으로 치환한 TofI 변형 단백질일 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 TofI 변형 단백질일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 TofI 변형 단백질을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 TofI 변형 단백질을 수용성 형태로 발현시키는 단계를 포함하는, TofI 변형 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계의 TofI 변형 단백질의 제조 단계는 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시키고, 추가적으로 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu)을 메티오닌(Met)으로 치환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (a) 단계의 TofI 변형 단백질의 제조 단계는 i) TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 중 어느 하나 이상의 아미노산을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 수용성을 갖는 TofI 변형 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 준비하는 단계; ii) 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; iii) 상기 벡터를 형질전환시킨 형질전환체를 제조하는 단계; 및 iv) 상기 형질전환체로부터 상기 핵산을 발현시키는 단계를 통해 제조할 수 있다.

본 발명에서 TofI 변형 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 벡터 제조시 필요에 따라 다른 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 추가적으로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온-5-트랜스퍼라제, 말토스 결합 단백질, FLGA 및 6XHis(Hexahistidine) 등이 있으나, 상기 예들에 의해 정제를 위해 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다. 상기 융합 서열에 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 경우, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 클루타티온-5-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6XHis이 이용된 경우에는 Ni-NTA His 결합 레진 컬럼을 이용하여 TofI 변형 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 TofI 변형 단백질은 분리 태그가 없는 벡터를 이용하여 이온교환 크로마토그래피 및 크기배제 크로마토그래피를 순차적으로 이용하여 TofI 변형 단백질을 분리하였다.

분리된 TofI 변형 단백질들은 바람직하게 수용성 형태로 발현시켜서 NMR을 통한 신약개발에 이용할 수 있는 효소로 제공될 수 있으며, 또는 분리된 TofI 변형 단백질이 결정성을 갖는지 확인 후, 기질 유사체 및 반응 산물에 결합된 단백질 3차 구조 분석에 이용하여, AHL 합성효소 활성을 저해하는 신약 개발에 이용할 수 있는 효소로서 제공할 수 있다.

구체적인 일 구현예에 따르면, 서열번호 1의 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu)을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 TofI 변형체인 TofI(3MΔ)와 서열번호 1의 TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe)을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 TofI(F42MΔ)를 제조하였고(도 2), 이들 변형 단백질들이 C8-HSL을 생합성하여 효소 활성을 유지함을 확인하였다(도 4). 또한, 방울 혼합 증기 평형법에 의해 TofI(3MΔ) 및 TofI(F42MΔ)가 단백질 결정화를 이루는 것을 확인하였다(도 5).

아울러 구체적인 일 구현예에 따르면, 자기유도인자 유사체인 C8J8(분자량 237.34) 및 반응 부산물인 MTA를 TofI(3MΔ) 단백질 용액에 첨가하고, 방울 혼합 증기 평형법에 의해 TofI(3MΔ)-C8J8-MTA 가 복합체 단백질 결정을 형성하는 것을 확인하여 본 발명의 수용성 및 결정성을 갖는 TofI 변형 단백질이 기질 유사체 및 반응 부산물과 결합한 3차 구조의 분석에 이용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 AHL 합성효소 TofI 단백질을 단백질공학(protein engineering) 방법을 통하여 변형하여 NMR을 이용한 신약 개발에 효과적인 수용성의 형태로 발현되는 TofI 변형 단백질을 제공하였다. 또한 AHL 합성효소 TofI 단백질을 변형하여 수용성뿐만 아니라 결정성을 갖는 TofI 변형 단백질을 제공하였으며, 기질 유사체(substrate analog) 및 반응산물 또는 반응 부산물이 결합된 단백질 3차 구조의 분석을 가능하게 하여 AHL 합성효소 활성을 저해하는 신약개발의 플랫폼을 제공할 수 있다.

도 1은 그람음성세균 AHL 합성효소에 의한 자기유도인자인 AHL 합성을 나타낸 도이다. 그람음성세균인 식물병원세균 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에서 유래한 AHL 합성효소 TofI은 기질인 아실-ACP 및 SAM을 사용하여 자기유도인자인 C8-HSL(C8-homoserine lactone)을 합성하였다.
도 2는 TofI의 야생형(서열번호 1), TofI(Δ)변형체(서열번호 2), TofI(3MΔ)변형체(서열번호 3), 및 TofI(F42MΔ)변형체(서열번호 4)의 아미노산의 서열을 나타낸 도이다. 변형된 부분을 별표로, 결손된 부분을 삼각형으로 표시하였다. 서열번호 5, 6 및 7은 서열번호 2, 3 및 4의 각각의 염기서열이다. 차이가 나는 염기서열 부분은 별표로 표시하였다.
도 3은 X-선 단백질 결정학의 연구순서를 나타낸 도이다. X-선 단백질 결정학은 대상 표적단백질의 유전자(DNA)를 클로닝 한 후, 표적단백질을 발현, 분리, 정제한 후에, 정제된 단백질을 대상으로 다양한 방법으로 단백질의 결정(crystal)을 획득하였다. 획득된 단백질 결정은 X-선에 조사하여 데이터를 얻은 후, 단백질의 3차 구조를 분석하여, 구조를 규명하였다. 본 발명에서 제안한 방법으로 제조된 TofI(3MΔ) 변형 단백질은 X-선 단백질 결정학의 실험적 난제인 표적 단백질의 결정화(crystallization)를 좌우할 수 있다.
도 4는 박막크로마토그래피(thin-layer chromatography)를 사용한 TofI 변형체들의 자기유도인자의 생합성 확인을 보여주는 도이다. 박막크로마토그래피를 사용하여 제조된 TofI 변형체 및 야생형 TofI들이 자기유도인자인 C8-HSL(C8-homoserine lactone)을 생합성 하는 지를 검정하였다. 실험군(Standard)은 화학적으로 합성된 C8-HSL 이며, 대조군(control)은 효소를 넣지 않는 대조구이다. 모든 TofI 변형체는 정도에 차이는 있지만 자기유도인자인 C8-HSL를 생합성하였다.
도 5는 자기유도인자 유사체인 C8J8과 효소 반응 부산물인 MTA 분자가 결합된 TofI(3MΔ)의 단백질의 결정(protein crystal)을 나타낸 도이다.
도 6은 자기유도인자 유사체인 C8J8과 효소 반응 부산물인 MTA 분자가 결합된 TofI(3MΔ) 단백질의 3차 구조를 나타낸 도이다. 본 발명에서 제안한 방법으로 제조된 TofI(3MΔ) 단백질은 X-선 단백질 결정학 과정 중 가장 어려운 부분인 표적단백질의 결정화(crystallization)를 형성하였다. 이러한 TofI(3MΔ)를 사용하여 자기유도인자 유사체인 C8J8과 효소 반응 부산물인 MTA 분자가 결합된 TofI(3MΔ) 단백질 복합체의 3차 구조를 보이고 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: TofI 변형체 설계

DNA 염기서열 특이적 프라이머를 이용한 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통하여 TofI 유전자(GeneBank Accession No. NC_012721)를 증폭하였다. 증폭된 PCR 생성물과 pET-28 벡터(Novagen)를 제한효소 NdeI과 XhoI을 이용하여 처리한 후, T4 DNA 리가아제(Promega)를 이용하여 라이게이션(ligation)을 수행하였다. 이렇게 설계된 재조합 플라스미드를 대장균 DH10b(Novagen)로 도입시킨 후, 단일 콜로니를 확보하고 플라스미드 mini-prep kit(Qiagen)를 이용하여 재조합 플라스미드를 얻었다.

DNA 염기서열분석을 통하여 확인된 플라스미드를 주형으로 TofI 단백질의 Phe⁴², Ile¹⁴⁹, Leu¹⁵²을 암호화하는 코돈을 QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit(Stratagene)을 이용하여 아미노산인 메티오닌(methionine)을 암호화하는 코돈으로 변이시켰다. 올바르게 변이된 플라스미드는 DNA 염기서열분석을 통해서 변이를 확인하고 이 변이 플라스미드에 의하여 발현되는 단백질을 TofI(3M)으로 명명하였다. 이 변이 단백질 TofI(3M)은 야생형 단백질보다 안정성이 크게 증대되었으나, 단백질구조기반 저해제 개발을 위한 단백질의 결정화(crystallization)에는 실패하였다.

TofI 단백질의 결정(crystal)을 얻기 위해서 단백질 3차 구조가 알려진 슈도모나스 에어루기노사 AHL 합성효소 LasI(GeneBank Accession No. AM778435), 팬토스트 워티 AHL 합성효소 EsaI(GeneBank Accession No. L32183)와 TofI의 아미노산 서열을 비교하여, 단백질의 표면에 위치하여 단백질의 안정성에 관여하고 또한 단백질의 이차구조를 형성하지 않을 것으로 추측되는 잔기 His⁹¹과 Pro⁹²를 암호화하는 코돈을 위에서 언급한 QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit을 이용하여 제거하였다. 이 플라스미드에 의해서 발현되는 단백질을 TofI(3MΔ)라고 명명하였고, 이 단백질은 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 잔기가 아미노산 메티오닌으로 치환되었으며, 잔기 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손된 변형체이다. 이 TofI(3MΔ)는 안정성이 뛰어나고 단백질의 결정을 형성하여, 단백질구조기반 저해제 개발을 위한 단백질 3차 구조를 가능케 하였다. TofI(3MΔ)의 아미노산 서열을 서열번호 3으로 나타냈다.

상술한 TofI(3M) 및 TofI(3MΔ) 변형체 외에 잔기 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 제거한 TofI(Δ), 42번째 페닐알라닌(Phe) 잔기를 아미노산 메티오닌으로 치환하고 잔기 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 제거한 TofI(F42MΔ)을 제조하였다. TofI(Δ)의 아미노산 서열을 서열번호 2로, TofI(F42MΔ)의 아미노산 서열을 서열번호 4로 나타내었다.

도 2에 TofI의 야생형 및 변형체(TofI(Δ), TofI(3MΔ) 및 TofI(F42MΔ))의 아미노산을 서열 1, 2, 3 및 4로 나타냈으며, 변형된 부분을 별표로, 결손된 부분을 삼각형으로 표시하였다.

실시예 2: TofI 변형체의 발현, 분리정제 및 활성조사

<2-1> TofI 변형 단백질의 발현, 분리 및 정제

단백질 분리 태그(tag)가 없는 TofI(3MΔ) 유전자를 지닌 플라스미드를 발현 호스트인 대장균 BL21(DE3)pLysS(Novagen)에 도입하여 자란 단일 콜로니를 Luria-Bertani 액체 배지에서 37℃에서 약 6시간 키운 후, 대장균의 광학밀도가 600nm에서 0.7에 도달하면 세포배양의 생장온도를 28℃로 낮추고 1mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 넣어서 4시간 동안 표적 단백질인 TofI(3MΔ)를 과발현시켰다. 과발현된 단백질을 원심분리의 방법으로 수확하고, 50mM 트리스(Tris)와 5%(v/v) 글리세롤(glycerol)을 포함하는 pH 8.0의 완충용액(완충용액 A)으로 현탁시킨 후 초음파처리(sonication)로 세포막을 분해하고 원심분리를 통해서 표적 단백질이 녹아있는 상등액을 분리하였다.

표적 단백질 TofI(3MΔ)의 정제는 첫 번째로 HiTrap Q HP 이온교환컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 수행하였다. 완충용액 A에 1M NaCl을 첨가한 완충용액 B를 선형 그라디언트(linear gradient)로 컬럼에 흘려주어서 150~250mM NaCl과 함께 용리되는 단백질을 모았다. 이와 같은 방법으로 얻은 TofI(3MΔ) 단백질을 두 번째 방법으로서 Superdex 200 컬럼(GE Healthcare)을 이용한 크기배제 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질의 용리를 위하여 사용하는 완충용액은 50 mM 트리스를 포함하는 pH 8.0의 용액이다.

TofI(3MΔ) 외에 상기 실시예 1에서 제조한 TofI(3M), TofI(Δ), TofI(F42MΔ) 변형체들도 상기의 방법과 동일한 방법으로 발현 및 정제하였다.

<2-2> TofI 변형체의 활성 조사

상기 <2-1>에서 제조한 TofI 변형체들이 자기유도인자를 합성하는 효소의 활성을 나타내는지 확인하기 위해, 박막 크로마토그래피를 사용하여 제조된 TofI 변형 단백질 및 야생형 TofI들이 자기유도인자인 C8-HSL(N-octanoyl-homoserine lactone)을 생합성하는 지를 검정하였다.

TofI 변형체의 활성 조사를 위한 자기유도인자 합성은 야생형 TofI가 제거된 버크홀데리아 글루메의 변이체 BGS2(tofI::Ω)(J. Kim et al., Mol. Microbiol. 54, 921(2004))의 세포 용해물 100μL(6.9μg μL¹)과 100μM SAM, 그리고 분리된 1μM TofI 변형체를 반응시켜서 알 수 있었다. 반응은 37℃에서 한 시간 동안 수행되며 두 배 용량의 초산에틸을 첨가하여 반응을 중단시키고 진공에서 증발시켰다. 반응 생산물에 20μL 메탄올을 첨가하고 그것의 1-4 μL 샘플을 박막 크로마토그래피 판에 점적하였다. 메탄올과 물의 혼합물 (60:40, v/v)로 박막 크로마토그래피를 전개하였으며, 전개액을 증발시킨 후 플라스틱 컨테이너 안에서 아크로박테리움(Agrobacterium) 지시약(indicator)를 포함하는 아가(agar)를 박막 크로마토그래피 판에 부은 후 28℃에서 밤새 숙성하였다. 생산된 자기유도인자는 파랗게 염색되므로 TofI 변형체의 활성을 조사 할 수 있었다. 실험군(Standard)은 화학적으로 합성된 C8-HSL이며, 대조군(Control)은 효소를 넣지 않는 것이다.

그 결과, 모든 TofI 변형 단백질은 정도에 차이는 있지만 자기유도인자인 C8-HSL를 생합성하였다(도 4). 이는 돌연변이를 포함하여도 효소 활성에 차이가 없는 결과를 나타내며, 본 발명의 돌연변이 위치가 효소 활성에는 중요한 영향을 미치지 않음을 시사하는 결과이다.

실시예 3: TofI 변형체의 결정화 및 단백질 3차 구조 규명

상기 실시예 2에서 효소의 활성을 나타내는 네 종류의 TofI 변형체를 대상으로 X-선 단백질 3차 구조 분석을 위해 단백질 결정화를 시도하였다.

정제한 TofI(3MΔ) 단백질은 Centriprep(Millipore)을 이용하여 7~10 mg/ml으로 농축하였다. 단백질의 농도는 280nm에서의 흡광도를 측정하여 계산하였다. TofI(3MΔ) 단백질은 4℃ 이상에서 보관하면 결정화가 잘 되지 않기 때문에 정제하는 즉시 분주한 후 액체질소를 이용하여 급속 냉동시켜서 -70℃에서 보관하고, 필요시 4℃에서 완전히 녹인 후 사용하였다.

단백질의 결정화는 방울 혼합 증기 평형법(hanging-drop vapor diffusion method)으로 수행하였다. 자기유도인자 유사체인 C8J8(분자량 237.34)은 HPLC용 100% 메탄올에 20mM 농도가 되게 녹여서 준비하고 효소의 반응 부산물인 MTA(5'-methylthioadenosine, 분자량 313.3)는 분자 생물학 용 DMF(N,N-dimethylformamide)에 100mM 농도가 되도록 녹여서 준비하였다. TofI(3MΔ) 단백질 용액에 20mM C8J8을 최종 농도가 2mM이 되도록 첨가하고 MTA는 최종 농도가 4mM이 되도록 첨가하였다. TofI(3MΔ) 단백질과 C8J8 및 MTA의 혼합물 2μl를 커버글라스위에 떨어뜨리고, 0.1M HEPES, 20mM MgCl2, 21-24%(w/v) 폴리아크릴산 5100을 포함하는 pH 7.5의 결정화 용액 2μl를 혼합물 방울(drop) 위에 떨어뜨렸다. 300μl의 결정화 용액이 담겨져 있는 저장조(reservoir)에 방울이 저장조의 안쪽으로 위치하도록 커버글라스를 뒤집어서 덮은 후 글라스와 저장조 사이를 바세린 젤리를 이용하여 공기가 통하지 않게 잘 막고 22℃에 보관하였으며, TofI(3MΔ)-C8J8-MTA 복합체 단백질 결정은 1~2일 후 형성되는 것으로 관찰되었다(도 5).

TofI(3MΔ)-C8J8-MTA 복합체 단백질 결정은 한국의 포항에 위치한 포항가속기연구소의 빔라인(beamline) 4A와 6C에서 단일-파장 데이타(single-wavelength data)를 수집하였다. 데이터를 수집하는 동안에 결정이 상하지 않도록 결정을 20% 글리세롤을 포함하는 결정화 용액에 1분 이상 담근 후에 사용하였다. 수집한 데이터는 HKL2000 프로그람을 사용하여 프로세싱하고, CNS 프로그람을 사용하여 분자 치환(molecular replacement) 방법으로 단백질 구조를 규명하였다.

구조 분석 결과 TofI(3MΔ) 단백질은 자기유도인자 유사체인 C8J8과 효소 반응 부산물인 MTA 분자와 결합하는 것을 관찰하였다(도 6).

도 6은 자기유도인자 유사체인 C8J8과 효소 반응 부산물인 MTA 분자가 결합된 TofI(3MΔ) 단백질의 3차 구조에 관한 것으로, 본 발명에 의해 제조된 TofI(3MΔ) 단백질은 X-선 단백질 결정학 과정 중 가장 어려운 부분인 표적단백질의 결정화(crystallization)를 형성하였다. 이러한 TofI(3MΔ)를 사용하여 자기유도인자 유사체인 C8J8과 효소 반응 부산물인 MTA 분자가 결합된 TofI(3MΔ) 단백질 복합체의 3차 구조를 얻었다.

한편, TofI(3MΔ) 외에 실시예 1에서 제조한 TofI(3M), TofI(Δ), TofI(F42MΔ) 변형체들도 X-선 단백질 3차 구조 분석을 위한 단백질 결정화를 시도해 본 결과, TofI(F42MΔ) 변형체가 분석에 적합한 단백질 결정을 형성하였다. 따라서, 서열번호 1의 TofI 변형 단백질 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 중 하나 이상의 아미노산을 메티오닌으로 치환시 결정을 형성한다는 것을 알 수 있었다.

이와 같이 자기유도인자 유사체 C8J8과 반응 부산물 MTA가 결합된 AHL 합성효소 TofI 변형체 단백질 3차 구조는 AHL 합성효소의 효소 활성을 저해하여 궁극적으로 쿼럼 센싱을 방해하는 항세균제의 개발을 촉진할 수 있을 것이다. 구체적으로 아실기의 길이를 다양화한 C8J8의 모방 화합물은 AHL 합성효소 종 특이적인 항세균제가 될 수 있고, 또한 모든 AHL 합성효소의 공통 부산물인 MTA는 AHL 합성효소에 의해서 진행되는 효소반응의 저해제로 알려졌기에(M. R. Parsek, D. L. Val, B. L. Hanzelka, J. E. Cronan Jr., E. P. Greenberg, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96, 4360 (1999)), 그 유사체는 항생제로서 광범위하게 사용될 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)이 결손된 TofI 변형 단백질.
제1항에 있어서, 상기 TofI 변형 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 TofI 변형 단백질.
제1항에 있어서, 추가로 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 중 어느 하나 이상의 아미노산이 메티오닌(Met)으로 치환된 TofI 변형 단백질.
제3항에 있어서, 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 가지는 TofI 변형 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TofI 변형 단백질은 수용성
형태로 발현되는 것인 TofI 변형 단백질.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TofI 변형 단백질은 결정화를 이룰 수 있는 것인 TofI 변형 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 TofI 변형 단백질을 코딩하는 핵산.
제7항에 있어서, 서열번호 5, 6 또는 7의 염기서열을 가지는 핵산.
제7항의 핵산을 포함하는 벡터.
제9항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제10항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 형질전환체.
(a) TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 중 어느 하나 이상의 아미노산을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 TofI 변형 단백질을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 제조한 TofI 변형 단백질을 결정화시키는 단계를 포함하는, TofI 변형 단백질의 결정화시키는 방법.
제12항에 있어서, 상기 (b) 단계는 방울 혼합 증기 평형법(hanging-drop vapor diffusion method)를 이용하여 결정화시키는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 TofI 변형 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것인 방법.
(a) TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 TofI 변형 단백질을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 제조한 TofI 변형 단백질을 수용성 형태로 발현시키는 단계를 포함하는, TofI 변형 단백질의 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 (a) 단계의 TofI 변형 단백질의 제조 단계는, TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 중 어느 하나 이상의 아미노산을 메티오닌(Met)으로 치환하는 단계를 추가로 포함하는 것인, TofI 변형 단백질의 제조 방법.
제16항에 있어서, 상기 (a) 단계의 TofI 변형 단백질의 제조 단계는,
i) TofI 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 42번째 페닐알라닌(Phe), 149번째 이소루이신(Ile) 및 152번째 루이신(Leu) 중 어느 하나 이상의 아미노산을 메티오닌(Met)으로 치환하고, 91번째 히스티딘(His) 및 92번째 프롤린(Pro)을 결손시킨 TofI 변형 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 준비하는 단계;
ii) 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
iii) 상기 벡터를 형질전환시킨 형질전환체를 제조하는 단계; 및
iv) 상기 형질전환체로부터 상기 핵산을 발현시켜 TofI 변형 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 것인 방법.