KR101786642B1 - 변형된 미세소관 절단 단백질 카타닌 Kp60, 그의 제조 방법 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수용성 및 결정성인 변형된 미세소관 절단 단백질 (microtubule-severing protein)인 카타닌 중 p60 (Katanin p60, 이하 'Kp60') 단백질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질은 AAA ATPase 도메인은 보존되면서 N 말단 부분에서 변형되고 소정의 결정화 과정을 거침으로써 3차원 구조 분석에 있어서 보다 용이한 수용성 및 결정성 구조를 갖는 것을 특징으로 하며, 야생형 Kp60 단백질과 비교하여 보다 효과적으로 다양한 암 및 알츠하이머병의 신경질환의 치료의 표적 단백질로서의 역할을 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질은 세포 골격에 이상 발생하는 질병으로 암 및 알츠하이머병과 같은 신경질환의 진단 및 치료를 위한 표적 단백질의 개발에 매우 유용하다.

Description

변형된 미세소관 절단 단백질 카타닌 Kp60, 그의 제조 방법 및 그의 용도{MODIFIED MICROTUBULE SEVERING ENZYME KATANIN_P60, METHOD FOR PREPARING THE SAME, AND USE THEREOF}

본 발명은 인간 유전자로부터 유래하는 수용성 및 결정화성인 변형된 미세소관 절단효소(microtubule severing enzyme)인 Katanin p60 (이하, Kp60이라고 함) 단백질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질은 미세소관 절단 활성을 가지는 AAA ATPase 도메인은 보존되면서 N 말단 부위에서 변형되고 소정의 결정화 과정을 거침으로써 3차 구조 분석에 있어서 보다 용이한 수용성 및 결정성 구조를 갖는 것을 특징으로 하며, 야생형 Kp60 단백질과 비교하여 보다 효과적으로 다양한 암 및 치매 등의 뇌질환 치료 가능 표적 단백질로서의 역할을 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질은 항암 및 신경퇴행성 질환을 위한 표적 단백질의 개발에 있어서 매우 유용하다.

세포 골격(cytoskeleton) 은 미세섬유 (microfilament), 중간섬유 (intermediate filament)와 미세소관 (microtubule, 마이크로튜블)과 같은 단백질 섬유로 이루어져 있는데 이들은 특징적인 네트웍을 형성하여 세포를 지지하거나, 모양을 유지하는 역할을 하며, 세포 소기관의 위치 유지 및 이동에 관여한다. 세포벽이 없는 동물세포에서는 이들의 역할이 더욱 중요하게 작용한다 할 수 있다. 이들 중 미세소관(microtubule)은 α-tubulin과 β-tubulin의 이성체 (heterodimer) 13개가 나선형을 이루면서 연속적으로 배열되어 외벽은 약 24 nm 내벽은 약 12 nm 의 지름의 속이 빈 관 모양으로 길게는 50 mm까지도 관찰되지만 평균 25 mm의 길이를 가지고 있다. 미세소관은 centrosome이나 basal body에서 microtubule organizing centre (MTOCs)를 중심으로 시작하여 끊임없는 성장(polymerization)과 해리(depolymerization) 과정을 반복하게 되며 튜블린은 재활용되게 된다. 미세소관의 이런 역동성은 결합단백질 등에 의해 조절된다.

미세소관은 모든 진핵세포에 절대적으로 필요하며 크게 세가지 역할을 수행한다. 첫째는, 다른 세포골격 단백질들과 같이 세포의 형태를 유지해 외부로부터의 물리적 자극에 대응하는 것으로 세포 골격의 유지에 절대로 필요하며, 만약 파괴되면 세포는 정상적인 형태를 잃게 된다. 둘째는, 세포 분열 시 염색체를 양쪽 끝으로 잡아당기는 방추사(spindle fiber)를 구성하는데 세포 양극에서 자라난 미세소관이 염색체를 중앙에서 양쪽 끝으로 끌고 간다. 셋째는 물질 수송인데 특히 신경세포의 축색돌기, 엑손 (axon)에서 이 역할은 두드러진다. 미세소관은 motor 단백질들과 함께 세포체와 축색 간 mRNA, 단백질, vesicle, 소기관 등의 이동에 결정적 역할을 담당한다. 이 외에도 섬모 (cilia) 와 편모 (flagella)의 내부구조를 형성하기도 한다.

세포분열 시 미세소관의 결정적인 역할 때문에 항암제 표적단백질로 많은 연구가 되어오고 있다. 미세소관을 표적으로 하는 약물로는 크게 미세소관을 안정시키는 역할을 하는 약물과 미세소관을 불안정하게 만드는 약물 두 가지 그룹으로 나눌 수 있다. 우선 미세소관 안정제로는 탁산(taxanes), 파클리탁셀(paclitaxel, Taxol), 도세탁셀(docetaxel, Taxotere) 등이 대표적이라 할 수 있으며 탁솔(taxol)의 항암효과는 1967년에 태평양 주목(yew tree)의 껍질에서 처음 분리되었으며, 현재는 합성되어 이용되고 있다. 1993년에 난소암 치료제로 처음 허가를 받았고, 현재는 폐암, 유방암, 두경부암 및 다른 암 치료에도 이용되고 있다. 파클리탁셀은 혈구수 감소, 빈혈, 탈모, 근육통 등 여러 부작용이 보고되고 있지만, 미국에서만도 연 15억 달러의 매출을 기록하고 있다. 상기 약제 들은 미세소관이 탈중합되는 것을 막고 중합을 강화시키는 작용을 한다. 대부분의 미세소관 안정 물질들은 탁산(taxanes) 결합 부위 또는 a/b -튜불린의 결합에 있어서 b-튜불린이 위치하는 부위에 결합한다. 미세소관 탈안정제로는 콜키친(colchicine), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 등이 있는데, 콜키친 결합 부위나 빈카(vinca) 결합 부위에 결합한다. 위의 두 가지의 그룹 모두 결과적으로 세포 유사분열을 저해한다는 점은 동일하다.

미세소관은 다양한 암뿐 아니라 최근 치매 (Alzheimer's diseases), 파킨슨씨병 (Parkinson's diseases), 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 등과 같은 퇴행성 뇌질환(Brunden KR. 등, Bioorg Med Chem., 22(18), 5040-5049, 2014) 은 물론 유전성 강직성 대마비(hereditary spastic paraplegia, HSP), polycystic kidney disease, Bardet-Biedl syndrome 등과 같은 광범위한 다른 질환에서도 병인으로 밝혀지고 있어, 이들 화합물들의 치료제로서의 가능성이 검토되고 있다. 또한, 현재까지 사용되고 있는 튜블린 저해제들의 약물 내성을 극복하기 위해 신개념 작용점을 표적으로 하는 치료제 개발이 진행되고 있으며 주로 튜불린의 절단을 포함해 성장과 해리를 조절하는 단백질들의 기작이 새로이 조명되고 있다.

미세소관의 절단(severing)은 1991년 Vale에 의해 처음 관찰되었으며, 1993년에 McNally와 Vale에 의해서, 성게알 추출액(sea urchin eggs)으로부터 미세소관 절단활성을 갖고 있는 단백질을 추출했으며 이를 일본 무사의 칼을 일컫는 카타닌(Katanin)이라고 명명했다. 카타닌은 분자량이 60kDa인 Katanin p60 (이하 Kp60이라고 함)과 분자량이 80kDa인 Katanin p80 (이하 Kp80이라고 함)의 이성체로 (heterodimer) 구성되어 있으며, Kp60이 미세소관의 절단 활성을 가지며 Kp80은 조절 기능을 가지는 것으로 보고되었다. Kp60 N-말단에는 미세소관과 결합하는 MIT라 불리는 도메인을 포함하고 있으며 ATPase 활성을 가지는 AAA ATPase 도메인은 C-말단에 위치한다. 현재까지 밝혀진 바에 의하면, Kp60은 C-말단의 AAA ATPase domain을 통하여 p60은 단량체(monomer)로부터 육량체(hexamer)를 형성하게 되고, 이 육량체가 미세소관 튜불린의 C-말단을 인지해 절단을 한다 (McNally, F. J. 등, Cell, 75(3), 419-429, 1993,: Hartman, J. J.등, Science, 286(5440), 782-785, 1999). 하지만, 구체적인 기전은 아직 밝혀진 바가 없다.

카타닌은 식물과 동물을 포함한 진핵세포에 존재하며 아미노산 서열이 잘 보존되어있다. 카타닌은 ⅰ) 세포분화에 있어서, 세포의 초기 분화과정 시 중심체(centrosome)안에 있는 중심립(centriole)에서 미세소관을 절단하여 새로운 방추사 형성을 할 수 있도록 하며, 카타닌에 의해 절단된 미세소관의 튜불린은 방추사 신장 시 재사용되어 지속적인 방추사 형성에 관여한다. 나아가, 세포분화 말기에 카타닌은 미세소관의 양성 말단(plus ends)에 결합하여 염색체를 붙잡고 방추체극(Spindle pole)로 염색체가 움직일 수 있도록 유지한다. ⅱ) 신경(neuron) 발달에 있어 긴 미세소관이 카타닌에 의해서 절단이 되면 그 길이가 짧아지고, 길이가 짧아진 미세소관은 보다 쉽게 물질을 수송할 수 있는 형태로 변환할 수 있게 도움을 준다. 이와 같은 미세소관을 절단하는 기능은 Kp60에 의해서 발생되며 Kp80은 Kp60의 미세소관 절단기능을 보조해 주는 역할을 하고 있다. 따라서 간접적으로 세포 분화와 신경 발달에 역할을 조절하는 Kp60을 항암제나 신경퇴행성 질환에 대한 표적단백질로 이용할 수 있으며 직접적으로는 전립선암(prostate cancer), 뼈 전이 세포(Bone metastatic cell)에 Kp60이 과발현됨이 관찰되며, 알츠하이머와 같은 질병에서 카타닌이 과발현하여 미세소관에 결합되어 있는 타우 단백질(Tau protein)과 분리되고 그로 인해 인산화된 타우 단백질로 인해 미세소관끼리의 결합을 어렵게 만든다.

이와 같이 Kp60 단백질은 미세소관을 절단하여 세포 분화 및 신경 발달 등의 역할을 수행하는데, 지금까지 보고된 Kp60 단백질에 대한 연구 결과에도 불구하고 많은 부분이 실험적으로 증명되지 않았고 직접적으로 미세소관에 어느 부분과 결합하는지에 대한 추정만 가능할 뿐 매커니즘 측면이나 항암제 및 신경질환 치료제로서의 연구는 미미하다고 할 수 있다. 현재까지 거의 규명되지 않은 Kp60 단백질의 저해화를 유발하는 신호 전달 체계의 연구와 Kp60 저해 인자의 탐색은 항암 및 신경질환 치료제 개발을 위하여 수행되어야 할 과제라고 생각된다.

단백질의 3차원 구조는 단백질의 기능과 밀접한 관계가 있어 확보 시 기작 및 기능을 원자수준에서의 이해를 가능하게 한다. 뿐만 아니라 이를 조절할 수 있는 물질 개발에도 활용이 가능하며, 현재 많은 제약회사에서 이런 구조 기반 물질 발국 또는 최적화를 활용하고 있다. 카타닌의 경우도 구조 및 기작 이해는 카타닌의 작동 기전을 이해하는데 필수라 할 수 있으며 특히 Kp60의 경우는 활성부위를 겨냥한 신개념 저해제 개발도 가능하게 하는 플랫폼이 될 수 있어 그 가치는 상당하다 할 수 있다. 구조 연구는 물론 기작 이해를 위해서는 수용성 고순도 단백질의 대량 확보가 기본이라 할 수 있는데 카타닌의 경우 그 중요성에도 불구하고 현재까지 구조와 기작 연구가 되지 않고 있는 것은 단백질 확보에 문제가 있어서 그렇기 때문이다. 그러므로 일차적으로 수용성 단백질의 대량 발현 및 정제 시스템의 구축이 필요하다.

이와 같은 요구에 부응하기 위하여 예의 연구한 결과, 본 발명자는 Kp60 단백질의 AAA ATPase 도메인을 포함하는 소정의 부분을 클로닝하여 수용성 단백질을 확보하였고, 이러한 수용성 및 결정성 Kp60 단백질이 3차원적 구조의 규명이 용이하여 새로운 개념의 항암 및 신경 질환의 표적 단백질로서 유용할 것임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항암 및 신경 질환 표적 단백질로서 유용한 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질 및 이를 암호화하는 유전자, 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 변형된 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 사용하고 결정화 방법을 사용하여 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질을 표적단백질로서 함유하는 암 및 신경 질환 치료제 탐색용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 수용성 및 결정성의 변경된 Kp60 단백질을 이용한 암 또는 신경질환 저해제 탐색 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 수용성 및 결정성인 변형된 미세소관 절단 효소 Kp60 (Microtubule-severing enzyme Katanin p60, 이하 'Kp60'라고 함) 단백질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

본 명세서에 있어서, 특별한 언급이 없는 한, "변형된 Kp60 단백질" 또는 "재조합 Kp60 단백질"이란 용어는 야생형 Kp60 단백질(서열번호 1; 이하'Kp6O T1'라고 함)에 수용성을 부여하기 위하여 Kp60의 N 말단을 부분적으로 결실시킨 형태의 Kp60 단백질을 의미한다. 본 발명에서는 N 말단을 제거하기 위하여, 단백질의 2차 구조와 Expasy, NCBI 등의 데이터베이스에서 얻은 자료를 토대로 실험을 수행하였다.

상기 야생형의 Kp60 단백질은 491개의 아미노산(서열번호 1)으로 이루어진 단백질로서, 아미노산 서열 220번부터 서열 491번까지의 272개의 아미노산 서열로 된 AAA ATPase 도메인을 포함한다. 본 발명은 이러한 Kp60의 보존된 활성 부위인 AAA ATPase 도메인을 포함하면서 N 말단으로부터 일부 아미노산이 부분적으로 결실되고, 소정의 결정화 과정을 거친 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 야생형 Kp60 단백질의 상기 AAA ATPase 도메인을 포함하고, N 말단 쪽에서부터 182개 아미노산 서열로 이루어진 하나의 폴리펩타이드 분자가 결실되고, 소정의 결정화 과정을 거친 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질을 제공한다. 추가적인 일 양태로서, 본 발명에 따른 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질은, 야생형 Kp60 단백질을 기준으로 활성 잔기인 아미노산 서열의 309번 위치의 글루탐산(Glu)을 글루타민(Gln)으로 변형할 수 있다. 상기 부분이 추가로 변형되는 경우 비활성의 단백질이 생성되어 좀 더 안정화시킬 수 있다. 바람직하게 상기 Kp60 단백질은 인간으로부터 유래한 것이다.

Kp60 단백질은 미세소관을 절단하는 단백질로써 직·간접적으로 다양한 암과 신경질환에 표적 단백질로 사용이 가능하고 현재 미세소관의 안정화 또는 불안정화시키는 항암제들에 대한 내성에 대한 새로운 대안이 되는 치료제로써의 새로운 항암제 및 신경질환 치료제 개발에 있어서 표적 단백질로서 매우 유용한데, 특히, 야생형의 Kp60 단백질은 거의 불용성인데 반해, 본 발명의 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질은, Kp60 단백질의 고유한 3차원 구조와 기능에 손상을 주지 않는 범위에서 단백질의 N 말단 부위를 일부 제거하고, 소정의 결정화 과정을 수행함으로써, 3차 구조 분석에 있어서 보다 용이한 수용성 및 결정성 구조를 가져, 본 발명의 단백질은 야생형 Kp60 단백질과 비교하여 보다 효과적인 항암 및 신경질환의 표적 단백질로서의 역할을 할 수 있는바, 야생형의 Kp60 단백질에 비해 더욱 탁월한 유용성을 가진다.

바람직한 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 수용성, 결정성의 변형된 Kp60 단백질은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 가지며, 도 2a에 본 발명에 따른 Kp60의 변이체인 Katanin p60 Trunction T2 (Kp60 T2)의 아미노산 서열과, 도 2b는 본 발명에 따른 Kp60의 변이체인 Katanin p60 Trunction T3 (Kp60 T3)의 아미노산 서열을 도시하였다. 야생형 Kp60 단백질을 기준으로 활성 잔기인 아미노산 서열의 309번 위치에서, 서열번호 2을 갖는 변형된 Kp60 단백질은 글루탐산(Glu)을 포함하며, 서열번호 3을 갖는 변형된 Kp60 단백질은 글루타민을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 변형된 Kp60 단백질을 암호화하는 염기 서열 및 상기 염기 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 변형된 Kp60 단백질의 발현벡터를 제공한다. 또한 본 발명은 상기와 같은 변형된 Kp60 단백질의 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 나아가, 본 발명은 상기 변형된 Kp60 단백질의 발현벡터를 사용하여 숙주를 형질전환시켜 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제작하고, 상기 제작된 형질전환체를 배양하여 변형된 Kp60 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 수용성, 결정성의 변형된 Kp60 단백질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 변형된 Kp60 단백질의 발현 벡터를 제조하기 위한 벡터는 전사 및 번역 종결(terminator), 전사 및 번역 개시(initiator) 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유하는 벡터로서 원핵생물, 진핵생물, 또는 양자 모두에 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균에서 발현 가능한 프로모터를 갖는 벡터일 수 있다. 나아가, 상기 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환체를 제조할 수 있으며, 형질전환의 대상이 되는 숙주는 다양한 원핵 생물 또는 진핵생물일수 있고, 바람직하게는 대장균일 수 있다. 상기 발현벡터로 형질전환시키기 위한 방법은 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기천 공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 이와 같이 제조된 형질전환체를 배양하여 세포를 수확하고, 파쇄하여 생성된 Kp 60 단백질을 수득할 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 일 구현 예에 따라, 상기 신호펩티드가 치환된 재조합 인간성장호르몬 단백질 발현벡터를 제조하는 단계, 및 상기 제조된 발현벡터를 미생물에 도입하여 형질전환시키는 단계를 포함하는 변형된 Kp60 단백질의 제조방법이 제공된다. 바람직하게는 상기 형질전환 단계 이후에 상기 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 바람직하게는 LB 배지, SOB 배지 혹 은 TB 배지가 될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태로서, 변형된 Kp60 단백질의 제조 방법은 다음과 같다. 우선, 인간 Kp60 cDNA로부터 Kp60 단백질을 암호화하는 유전자를 증폭하기 위하여 Kp60 단백질을 코딩하는 유전자의 5'-말단과 3'-말단에 대응하는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR이라 함)용 프라이머를 고안하여 합성한다. 유전자의 5'-말단에 대응하는 프라이머는 대장균 발현 벡터로 클로닝이 용이하도록 제한 효소 인지 부위가 존재하고, 3'-말단에 대응하는 프라이머에는 제한효소 인지 부위와 종료 코돈을 만들어 단백질 합성이 인위적으로 종료하도록 만든다. 이때 5'-말단에 대응하는 프라이머는 N-말단의 아미노산을 원하는 수만큼 제거하도록 제조한다. 인간 cDNA(pynomics)를 주형으로 하고, 상기와 같이 제조된 프라이머를 사용하여 PCR반응을 수행하여 재조합 Kp60 유전자를 증폭한다. 증폭된 유전자를 적절한 제한 효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 적절한 대장균 발현 벡터에 삽입한다. 상기 발현 벡터는 엠피실린 저항 유전자, 테트라사이클린 저항 유전자, 카나마이신 저항 유전자, 클로람페니콜 저항 유전자 등과 같은 통상의 선별 마커를 포함할 수 있다. 이와 같이 제조된 재조합 벡터로 대장균을 형질전환 시킨 후 유전자의 발현에 적당한 조건에서 대장균을 배양한다. 단백질의 생성여부는 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 또는 웨스턴블롯팅 방법 등과 같은 통상적인 방법으로 확인할 수 있다. 재조합 Kp60 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 대장균을 엠피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 클로람페니콜 등 선별 마커에 대응하는 항생제가 함유된 배지(예컨대, 루리아 배지) 에서 진탕 배양하여 일정한 세포 농도(예컨대, 600nm에서의 흡광도가 0.5 내지 0.7)에 다다랐을 때, IPTG (Isopropyl-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 재조합 Kp60 발현을 유도한다. 상기 배양액을 원심 분리하여 대장균 세포를 침전 시킨 후, 대장균을 적당한 완충 용액에 현탁한 후 파쇄한다. 상기 파쇄 물을 원심 분리하여, 단백질이 녹아 있는 상층액을 분리한 후, 이온 교환 수지, 친화성 결합 수지, 사이징(sizing) 등을 이용하여 생성된 재조합 Kp60 단백질을 분리 및 정제한다. 이 때, 상기 재조합 Kp60 단백질은, 정제의 용이성을 위하여, 히스-택 융합 단백질(His-tag fusion protein)의 형태로 생산될 수 있다. 일반적으로, 재조합 Kp60 단백질에 융합된 히스- 택 은 결정 형성에 영향을 줄 것으로 추정되므로, 고해상도의 결정을 얻기 위해서는 정제한 융합 단백질에서 히스-택 부분을 제거하는 것이 바람직하며 발현 벡터에 존재하는 에스-택(S-tag)을 제거하기 위해서 인간 유래 트롬빈(thrombin)과 TEV(Tobacco Etch Virus nuclear inclusion a endopeptidase)를 이용하여 Kp60 단백질에 융합된 히스-택, 에스-택 을 제거하였다.

한편, 새로운 치료제의 개발을 위한 표적 단백질의 3차원 구조를 규명하기 위하여, 표적 단백질은 상기와 같은 수용성 이외에도 결정성을 갖는 것이 중요하다. 표적 단백질의 3차원 구조 규명에 있어서, 일반적으로 X-선 결정화법(x-ray crystallography)이 사용되며, 이러한 X-선 결정화법을 사용하기 위한 전처리 단계로서 여러 가지 결정화 방법이 수행되어야 한다.

따라서, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 이와 같은 결정화 방법으로서 방울 혼합 증기 평형법(sitting- or hanging-drop vapour diffusion method: Jancarik J. 등, J. Appl. Cryst., 24, 409-411, 1991; 본 명세서에 참조로서 포함됨)을 사용하는 상기 변형된 카타닌 p60 단백질의 결정화 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 방울 혼합 증기 평형법의 결정화 원리와 과정은 다음과 같다. 밀폐된 공간에 모액의 작은 방울과 이보다 훨씬 큰 규모의 저수조(reservoir) 용액이 분리된 채 공존할 때, 이들 사이에서 물 또는 다른 휘발성 물질의 이동이 일어나게 된다. 한편, 단백질의 용액 조건 중 열역학적으로 준안정 상태인 과포화 상태에서 침전제의 변화에 따라 단백질의 침전이 일어나며, 침전 속도가 느리게 진행되면서 안정된 결정화 상태가 된다. 여기에 사용 가능한 침전제는 잘 알려져 있으며, 이들은 농축 상태의 단백질 용액의 용해도를 줄여주는 역할을 하게 된다. 이 때, 단백질 분자 주위의 상대적인 흡착층을 감소시키기 위하여, 단백질 분자들이 서로 응집하여 결정을 형성하게 된다. 따라서, 저수조 용액은 이와 같은 침전제를 비롯하여, 완충액, 염, 세정제(detergent) 등이 다양한 농도로 섞여 있게 되는데, 단백질 용액과 이런 다양한 조건의 저수조 용액이 보통의 경우 약 1:1의 비율로 섞여서 방울을 형성하게 된다. 이렇게 얻어진 방울을 실리콘으로 코팅된 유리 슬라이드에 얹어 뒤집은 상태로 준비된 플레이트에 얹어 밀봉한다. 초기에는 방울 중의 단백질의 농도가 저수조 용액의 농도와 차이가 있어서 단백질이 결정 상태로 존재하지 않지만, 밀봉된 상태로 놓아두면 서서히 평형이 이루어지게 되는데, 이때 상기에서 설명한 원리에 의하여 특정 상태의 조건에서 결정이 형성되는 것이다. 이와 같은 방울 혼합 증기 평형법에서 저수조 용액 중의 침전제뿐만 아니라 염, 완충액 및 세정제의 종류와 적정 농도, 용액의 pH 및 실험온도는 단백질의 종류에 따라 달리 선택되고, 경우에 따라서는 단백질의 결정 형성에 있어서 아주 중요한 요소가 된다.

본 발명에서 수용성화된 변형된 Kp60 단백질을 결정화시키기 위하여 저수조 용액을 이용한 방울 혼합 증기 평형법을 사용하는 경우, 저수조 용액에 포함된 침전제로서 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) (중량평균분자량 2000 내지 8,000), 시트르산삼나트륨(Tri-sodium citrate) 및 시트르산삼리튬(Tri-lithium citrate)로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 물질을 사용할 수 있으며, PEG 및 시트르산삼리튬을 함께 사용하는 것이 바람직하다.

전체 저수조 용액 내에서의 침전제의 농도는 사용되는 침전제의 종류에 따라서 달라지며, 일반적으로는 0.05 내지 2.5 M 범위인 것이 바람직하다. 예컨대, 시트르산삼리튬의 경우에는 전체 저수조 용액 내에서의 농도가 0.1 내지 1 M인 것이 바람직하고, 0.3 M인 것이 보다 바람직하다. 시트르산삼리튬의 저수조 용액 내 농도가 상기 범위보다 높으면 단백질이 침전되는 현상이 생길 수 있고, 상기 범위보다 낮으면 결정이 생기지 않게 되어 바람직하지 않다. 상기 저수조 용액은 상기 침전제 외에도 통상적으로 사용 가능한 염, 완충액 및 세정제 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 방울 혼합 증기 평형법은 pH 6.0 내지 6.5 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 범위는 실험적으로 결정된 것이며, 상기 범위의 pH 조건에서 반응 시 가장 우수한 결정을 얻을 수 있다.

방울 혼합 증기 평형법에 의한 결정 형성반응의 반응 온도는 4 내지 26 ℃인 것이 바람직하고, 약 18~22 ℃인 것이 보다 바람직하며, 반응 기간은 1 일 내지 20일인 것이 바람직하고, 1 주 내지 2 주인 것이 보다 바람직하다.

제조된 결정성 Kp60 단백질의 구조를 분석하기 위해서는 X-선 분석을 이용할 수 있다. 그러나 단백질 결정이 X-선의 높은 에너지에 노출되면, 그 수명이 짧아지고, 데이터의 강도도 약해져서, 구조 분석에 좋지 않은 결과가 발생한다. 이러한 결점을 방지하기 위하여, X-선 분석 전에 Kp60 결정을 고속으로 질소 냉각하는 고속 질소 냉각법을 수행하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 Kp60의 결정화 방법은 추가적으로 고속 질소 냉각법을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.

고속 질소 냉각 시, 효과적인 Kp60 단백질 결정 보호를 위하여, 캡스 완충액, 황산암모늄 및 글리세롤을 포함하는 고속 냉각용 용액을 사용할 수 있다. 상기 고속 냉각용 용액에 있어서, 초산암모늄의 농도는 2.5 내지 3.4 M, 바람직하게는 3.0 내지 3.4 M 이이며, 글리세롤의 농도는 20 내지 35 부피%, 바람직하게는 25 내지 30 부피%가 보다 바람직하다. 상기 농도는 고속 냉각용 용액 내에서의 각 성분의 농도를 나타낸 것이다. 또한, 상기 고속 질소 냉각법의 수행 온도는 50 내지 200 K, 바람직하게는 80 내지 120 K에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 농도 및 온도 범위에서 Kp60 단백질이 그 결정성에 영향 없이 질소 스트림에 잘 견딜 수 있고 고속 질소 내에서 보관이 용이하다는 장점을 갖는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 변형된 Kp60 단백질을 표적 단백질로서 사용하는 것을 특징으로 하는, 항암제 또는 신경질환 치료제 탐색용 조성물 및, 항암제 또는 신경질환 치료제 탐색 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 신경질환은 알츠하이머병일 수 있다.

구체적인 양태로서, 상기 항암제 또는 신경질환 치료제 탐색용 조성물은, 종래 통상적으로 사용되는 첨가제 또는 부형제를 포함할 수 있다.

한편, 상기 항암제 또는 신경질환 치료제 탐색 방법은 구체적으로 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다.

i) 본 발명에 따른 변형된 Kp60 단백질을 제조하는 단계;

ii) 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 시트르산삼나트륨(Tri-sodium citrate) 및 시트르산삼리튬(Tri-lithium citrate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 침전제를 포함하는 저수조 용액을 사용하는 방울 혼합 증기 평형법을 수행하여 상기 제조된 변형된 Kp60 단백질을 결정화시켜 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질을 제조하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 제조된 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질에 X-선 분석을 수행하여 3차원 구조를 분석하는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)에서 3차원 구조가 분석된 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질을 표적 단백질로 사용하여 항암제 또는 신경질환 치료제를 탐색하는 단계.

나아가, 추가적인 양태로서, 상기 치료제 탐색 방법은 상기 단계 ii)의 방울 혼합 증기 평형법 수행 단계와 단계 iii)의 X-선 분석 단계 사이에 고속 질소 냉각법을 수행하는 단계를 추가로 포함하여 수행될 수 있다.

구체적인 일 양태로서, 본 발명에 따라 생성된 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질은 하기와 같은 특성을 갖는다:

결정의 공간군: 정방정계 공간군(Tetragonal P4₃)

격자 단위: a=97.691, b= 97.691, c= 72.677 Å, α= β= γ = 90°

형태: 소단위 격자안에 2개의 Kp60 단백질이 들어 있음 [다이머(dimer) 구조]

본 발명에 따라 생성된 수용성 및 결정성의 변형된 Kp60 단백질은 그 3차원적 구조 분석이 용이한 형태를 갖기 때문에, 항암 및 신경질환 치료제개발을 위한 새로운 표적 단백질로서 유용하다.

본 발명의 방법에 의해 생성된 수용성 및 결정성의 변형된 Kataninp p60 단백질은 X-선 분석이 용이하고, 결정화도가 우수하므로 신규 항암 및 신경질환 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 미세소관 절단 단백질인 카타닌 p60의 전장 단백질(Microtubule severing enzyme Katanin p60 Full length protein; 이하, 'Kp60 T1')의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명에 따른 Kp60의 변이체인 Katanin p60 Trunction T2 (이하, 'Kp60 T2')의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명에 따른 Kp60의 변이체인 Katanin p60 Trunction T3 (이하, 'Kp60 T3')의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 Kp60 T2 및 Kp60 T1 단백질의 코딩 유전자를 각각 대장균 발현 벡터 pET32a와 pGEX4T-1에 클로닝 하는 과정을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 Kp60 T2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터 pET32a로 형질 전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 Kp60 T1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터 pGEX4T-1으로 형질 전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 7c는 본 발명에서 얻어진 Kp60 T2 단백질을 정제 후 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 한 결과를 보여주는 사진으로서, 7a는 니켈 컬럼을 이용한 전기 영동 사진이고, 7b는 Thrombin을 이용하여 발현 tag을 절한 사진이고, 7c는 사이징 컬럼을 이용한 전기 영동 사진이다.
도 8a 내지 8c는 본 발명에서 얻어진 Kp60 T1 단백질을 정제 후 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 한 결과를 보여주는 사진으로서, 8a는 GST 컬럼을 이용한 전기영동 사진이고, 8b는 thrombin을 이용하여 발현 tag을 절한 사진이고, 8c는 사이징 컬럼을 이용한 전기영동 사진이다.
도 9은 정제된 Kp60 T2 단백질의 결정을 보여주는 사진이다.
도 10는 정제된 Kp60 T2의 309번 위치의 글루탐산을 글루타민으로 변형 시킨 단백질의 결정을 보여주는 사진이다.

이하 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 위한 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 Kp60 T1 유전자의 증폭 및 발현

단계 1: 재조합 Kp60 T1 유전자의 증폭

SEQ ID: NO. 1에 기재된 바와 같이, 1번 메티오닌 말단(N-말단)으로부터 491번의 아미노산인 시스테인(Cys)까지의 아미노산 서열을 갖는 Human Kp60 단백질의 코딩 염기 서열을 이용하고, 생산된 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, N-말단에 Glutathione S-transferases 단백질을 결합시켜서 사용할 수 있다. 유전자의 합성 및 증폭을 위하여, 핵산 합성기를 이용하여 합성된 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.

정방향 프라이머: 5'-caccggatccatgagtcttcttatgattagtgagaatgta-3' (SEQ ID NO: 4)

역방향 프라이머 1: 5'-ccgctcgagttagcatgatccaaactcaaatat-3' (SEQ ID NO: 5)

상기 정방향 프라이머는 BamH1 제한효소 인지부위(SEQ ID NO: 4의 밑줄 부분)에 해당하는 염기서열을 포함하고, 역방향 프라이머는 XhoI 제한효소 인지부위(SEQ ID NO: 4의 밑줄 부분)에 해당하는 염기서열을 포함한다. Human Katanin cDNA 를 주형으로 하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 상기 Human Katanin 전장 cDNA 1㎕, 2.5 mM dNTP 8 ㎕, 각 100 pmol 정방향 프라이머 3 (SEQ ID NO: 4) 및 역방향 프라이머 4 (SEQ ID NO: 4)를 각 1㎕, PfuTaq DNA 중합효소 (5 U/㎕, Stratagene사, 미국) 1 ㎕ 및 PCR 완충용액 (Stratagene사) 10 ㎕의 혼합 용액에 79 ㎕의 증류수를 넣어 반응 용액을 제조한 후 상기 반응액을 82 °C에서 2 분, 94 °C에서 1 분, 94 °C에서 30초, 58 °C 에서 1분, 및 72 °C 에서 4분 30초의 반응을 30회 반복하였다. 상기 반응용액을 0.8% 아가로즈 젤에서 전기 영동법으로 분리하여 유전자를 용출하였다. 얻어진 용출액 16㎕에 10 배의 제한효소 반응 완충용액 2㎕와 제한효소 BamH1 (NEB(New England Biolabs, 미국) 과 Xho I(NEB, 미국)을 각각 1㎕씩 첨가하여 37 °C 에서 16시간 동안 반응시켰다. 얻어진 반응 용액을 0.8% 아가로즈 젤에서 전기영동 법으로 분리하여 원하는 재조합 Kataninp60 단백질 코딩 DNA 절편을 추출한 후, 50ul의 증류수 용액에 용존시켰다.

단계 2: 재조합 Kp60 T1 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조

GE Healthcare 에서 구입한 플라스미드 pEGX 4T-1을 제한효소 BamH1 과 Xho I를 처리하여 완전히 절단하고 0.8% 아가로즈 젤 상에서 분리하였다. 상기 단계 1에서 얻어진 Kp60 T1 DNA 절편 (Kp60 T1 PCR product) B/X 5㎍을 위의 플라스미드 벡터 pEGX 4T-1 B/X 2.5㎍과 함께 반응튜브에 넣은 후, 2㎕의 10배 연결반응용액 (500mM 트리스-염산, pH 7.8, 100mM 염화마그네슘, 100mM DTT, 10mM ATP), 10U의 T4 DNA 리가아제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음, 16 °C에서 18시간 동안 반응시켰다. 이 반응 용액을 대장균 Rosetta(DE3)(Novagen Inc., 미국) 컴피턴트(competent) 세포에 첨가하여 형질 전환시킨 다음, 50 ㎍/ml의 LB를 포함하는 암피실린 배지에 평판하여 대장균 형질 전환체를 선별하였다. 이들로부터 플라스미드를 추출하고 제한효소 및 염기서열 분석에 의해 플라스미드 pGEX 4T-1에 단계 1에서 제조된 Kp60 T1 DNA 단편이 연결된 pGEX 4T-1-Kp60 T1를 얻은 것을 확인하였다. 상기의 발현 벡터의 제작 과정을 도 4에 도시하였다.

단계 3: 대장균에서의 재조합 Kp60 의 발현

상기 단계 2에서 얻은 발현 벡터 pGEX 4T-1-Kataninp60 T1로 발현 숙주인 대장균 Rosetta(DE3)(Novagen Inc., 미국)을 통상적인 방법으로 형질 전환시켰다. 형질 전환된 대장균 균주를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 12시간 동안 진탕 배양한 후, 1 ㎖을 취하여 100 ㎖의 LB 배지(100 ㎍/㎖의 암피실린 함유)에 가하고, 600 nm에서 배양액의 흡광도가 약 0.6가 될 때까지 37 ℃에서 배양하였다. 그리고 나서, 배양 온도를 18 ℃로 낮추고, IPTG (isopropyl-β-D-galactopyranoside)를 최종농도가 0.5 mM이 되도록 첨가하였다. IPTG를 첨가하기 전과 첨가하고 16 시간 후의 배양액을 각각 1 ㎖씩 취하고, 10,000 g에서 2분 동안 원심 분리하여 각각의 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 침전물을 15 % SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기 영동시킨 후, 쿠마시블루 (Coomasie Brilliant Blue, Bio-Rad 161-0400)로 단백질 (Kp60 T1)을 염색하여 분석하였다. 얻어진 단백질 Kp60 T1에 대한 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기 영동 결과를 도 6에 나타내었다.

실시예 2: 재조합 Kp60 T2 유전자의 증폭 및 발현

유전자의 합성 및 증폭을 위하여, 핵산 합성기를 이용하여 합성된 다음과 같은 프라이머를 사용하고는 것을 제외하고 상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 Kp60 T2 DNA 단편을 제작하였다:

정방향 프라이머 1: 5'-caccggatccatggatagtaccggatatga-3' (SEQ ID NO: 6)

역방향 프라이머 1: 5'-ccgctcgagttagcatgatccaaactcaaatat-3' (SEQ ID NO: 5)

또한, 다음과 같은 프라이머를 사용하여, 발현 벡터에서 유래 되는 에스텍을 절단하기 위한 TEV (Tobacco Etch Virus nuclear inclusion a endopeptidase)가 인지하는 염기서열을 포함하는 Kp60 T2 DNA 단편을 제작하였다.

정방향 프라이머 2: 5' caccggatcc atggagaatctttattttcagggcgatagtaccggatatga 3`(SEQ ID NO: 7)

역방향 프라이머: 5' ccgctcgagttagcatgatccaaactcaaatat3' (SEQ ID NO: 5)

나아가, 다음과 같은 프라이머를 사용하여, Kp60의 309번 위치의 글루탐산이 글루타민으로 치환된(E309Q) Kp60 T2 E309Q 돌연변이체인 Kp60 T3의 DNA 단편을 제작하였다.

정방향 프라이머 3: 5`-gccaccatatttattgatcagatagactccatctgtagt-3`(SEQ ID NO: 8)

역방향 프라이머 2: 5`-actacagatggagtctatctgatcaataaaataggtggc-3` (SEQ ID NO: 9)

상기 정방향 프라이머 서열 중 밑줄 그은 부분은 BanH I 제한효소 인지부위를, 역방향 프라이머의 서열 중 밑줄 그은 부분은 XhoI 제한효소 인지부위를 나타낸다.

Novagen에서 구입한 플라스미드 pET32a를 이용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 Kp60 T2 DNA 단편을 포함하는 pET32b-Kp60 T2 벡터를 제조하였다.

얻어진 pET32b-Kp60 T2 벡터를 사용하여 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 단백질(Kp60 T2)을 발현시키고, SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기 영동을 수행하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

실시예 3: Kp60 단백질의 정제

단계 1: 대장균 세포의 배양 및 파쇄

실시예 1 및 2과 같은 방법으로, Kp60 단백질 (Kp60 T1 및 Kp60 T2)을 발현하는 대장균 세포들을 4 ℓ 양으로 배양한 후, 원심분리기를 이용하여 3,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하고, 20 mM Hepes-염산완충액(pH 7.2), 5 mM 마그네슘클로라이드, 300 mM 염화나트륨 및 1 mM TECP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]조성의 완충용액에 현탁시킨 다음, 얼음 중탕에서 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator, Fisher, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 얻어진 용액을 원심 분리기로 16,000 rpm에서 30분 동안 원심 분리하여 상층액을 얻었다.

단계 2: 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제

상기 단계 1에서 얻은 상층액을 상기의 완충용액으로 미리 평형된 니켈-니트릴로트리아세트 산(Ni-NTA) 칼럼 (GE Healthcare Lif eSciences, 미국), GST 컬럼(GE Healthcare Life Sciences, 미국), 및 사이징 컬럼(GE Healthcare Life Sciences, 미국)에 결합시킨 후, 상기와 동일한 완충액을 용출액으로 하고, 0-1 M 이미다졸 농도구배를 이용하여 용출한 후, SDS-PAGE로 실시예 1 및 2의 Kp60 단백질을 함유하는 분획을 각각 확인한 후 그 분획을 모았다. 상기 과정에서 얻은 Kp60 단백질 분획을 각각 20 mM 이미다졸이 제외된 동일한 완충용액으로 평형된 음이온 교환수지(Resource Q, GE Healthcare Life Sciences, 미국)에 주입시킨 후, 0-1 M 염화나트륨 농도구배를 이용하여 용출하고, SDS-PAGE를 수행하여 상기 실시예 1 및 실시예 2의 변형된 Kp60 단백질을 함유하는 분획을 각각 확인하고 수집하였다. 수집된 단백질에 thrombin과 TEV를 단백질 1mg당 1unit으로 처리 후 25℃에서 16시간 반응을 시킨 후 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기 영동을 수행하였으며, 그 결과를 도 7b, 8b에 나타내었다. 단백질 용액을 10 ㎖ 정도로 농축하여 상기와 동일한 완충용액으로 미리 평형된 젤 투과 칼럼(Superdex 200, 26/60, GE Healthcare Life Sciences, 미국)에 주입하여 상기 완충액으로 용출시켜 단백질의 분자량에 의해 분리하였다. SDS-PAGE를 수행하여 상기 실시예 1 및 실시예 2의 Kp60 단백질을 함유하는 분획을 각각 확인하고 수집하였다. 상기 실시예 1의 Kp60 단백질에 대하여 정제 및 수집된 단백질을 Kp60 Truncation T1 (이하 "Kp60 T1")으로 명명하였다. 또한, 상기 실시예 2의 변형된 Kp60 단백질에 대하여 정제 및 수집된 단백질을 Kp60 Truncation T2 (이하 "Kp60 T2")으로 명명하였다.

상기에서 얻어진 Kp60 T1 단백질 및 Kp60 T2 단백질의 ⅰ) 니켈 컬럼, 니켈 컬럼 후 사이징 컬럼과 ⅱ) GST컬럼 후 사이징 컬럼을 이용한 전기 영동 결과를 각각 도 7a 내지 도 7c (Kp60 T2) 및 도 8a 내지 도 8c (Kp60 T1)에 나타내었다.

실시예 4: 방울 혼합 증기 평형법에 의한 변형된 KP60 단백질의 결정화

상기 실시예 3에서 얻은 변형된 Kp60 단백질의 Kp60 T2를 다음과 같은 방울 혼합 증기 평형법에 의해 결정화하였다.

20 mM Hepes-염산완충액(pH 7.2), 5 mM 마그네슘클로라이드, 300 mM 염화나트륨 및 1 mM TECP로 구성된 용액에 본 발명의 Kp60 T2 단백질을 넣고, 포함된 단백질의 농도를 15 ㎎/㎖로 조절하여 Kp60 T2 단백질 용액을 제조하였다. 상기 최종 단백질 농도는 브래드포드 방법에 의해 결정하였다. 얻어진 최종 단백질 용액과 초기 스크린 용액 (Hampton research Inc., 미국)으로 단계별로 결정 조건을 검색한 결과, 20 %(v/v) PEG 3350, 1.6M 시트르산삼나트륨 (Tri-sodium citrate) 저수조 용액을 사용한 조건에서 가장 좋은 결정을 얻었다. 구체적으로는, 실리콘으로 코팅된 유리 슬라이드 표면에 본 발명의 Kp60 T2 단백질 용액 1 ㎕와 저수조 용액 1 ㎕과 혼합한 혼합용액을 접촉시키고, 이 슬라이드를 저수조 용액 0.5 ㎖가 들어있는 플레이트 위에 덮어 22 ℃ 항온 상태에서 보관하였다. 2 일 후에 시드(seed) 결정이 생기고 열흘 후에 그 결정의 크기가 Kp60 결정크기가 0.1 X 0.1 X 0.2 mm이었으며, 모양은 정사면체 모양으로 공간군이 정방정계 공간군을 나타내었다. Kp60 T2 단백질 및 Kp60 T2 E309Q 돌연변이인 Kp60 T3로부터 얻어진 결정을 카메라로 찍은 사진을 각각 도 9 및 도 10에 나타내었다. 도 9 및 도 10로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의하는 경우, 뚜렷한 결정을 갖는 결정성 단백질을 얻을 수 있었다.

실시예 5: 질소 고속 냉각법을 추가로 수행한 Kp60 단백질의 결정화

상기 실시예 4에서 얻은 Kp60 단백질 결정을 직접 고에너지의 X-선에 노출시키는 경우 파생되는 문제점을 해결하기 위하여, 얻어진 Kp60 T2 단백질 결정 및 Kp60 T2 E309Q 돌연변이 단백질인 Kp60 T3 단백질 결정의 X-선 분석 전에, 다음과 같은 고속 질소 냉각법에 의한 냉각을 수행하였다.

고속질소 냉각법의 조건으로서, 2.5 내지 3.4 M의 농도를 갖는 초산암모늄, 30 부피% 글라이세롤를 포함하는 구성된 고속 냉각용 용액을 사용하는 경우가 Kp60 결정성에 해로운 영향 없이 100 K의 액체 질소 스트림에서 잘 견디게 해주는 것으로 나타났다. 또한 실험 도중에 자주 발생되는 고속질소 냉각이 완전하지 않은 경우에 물이 얼어서 나타나는 현상인 물링(water ring) 현상도 나타나지 않았다.

실시예 6: 방사광 가속기를 이용한 Kp60 단백질 결정의 X-선 분석 데이터 수집 및 분석

포항가속기연구소의 방사광 가속기 단백질 빔라인을 (Macromolecular Beam Line PL-5C) 이용하여 상기 실시예 4에서 얻어진 Kp60 T2 단백질 결정 및 Kp60 T2 E309Q 돌연변이 단백질인 Kp60 T3 단백질 결정의 X-선 분석 데이터를 수집하였다. 방사광 가속기의 검출기를 이용한 결정의 회절 한계는 3.2 Å이었다.

그 결과, 본 발명의 Kp60 T2 E309Q 돌연변이 단백질인 Kp60 T3 단백질 결정의 공간군은(space group) 정방정계 공간군이고 결정의 격자 단위는 a=97.691, b= 97.691, c= 72.677 Å, α= β= γ = 90°로 나타났다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> MODIFIED MICROTUBULE SEVERING ENZYME KATANIN_P60, METHOD FOR PREPARING THE SAME, AND USE THEREOF <130> DPP20147169KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 491 <212> PRT <213> Homo sapiens wild-type Microtubule-severing enzyme Katanin p60 <400> 1 Met Ser Leu Leu Met Ile Ser Glu Asn Val Lys Leu Ala Arg Glu Tyr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Asn Tyr Asp Ser Ala Met Val Tyr Tyr Gln Gly Val 20 25 30 Leu Asp Gln Met Asn Lys Tyr Leu Tyr Ser Val Lys Asp Thr Tyr Leu 35 40 45 Gln Gln Lys Trp Gln Gln Val Trp Gln Glu Ile Asn Val Glu Ala Lys 50 55 60 His Val Lys Asp Ile Met Lys Thr Leu Glu Ser Phe Lys Leu Asp Ser 65 70 75 80 Thr Pro Leu Lys Ala Ala Gln His Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Glu 85 90 95 Val Trp Ser Met Pro Val Pro Val Glu Arg Arg Pro Ser Pro Gly Pro 100 105 110 Arg Lys Arg Gln Ser Ser Gln Tyr Ser Asp Pro Lys Ser His Gly Asn 115 120 125 Arg Pro Ser Thr Thr Val Arg Val His Arg Ser Ser Ala Gln Asn Val 130 135 140 His Asn Asp Arg Gly Lys Ala Val Arg Cys Arg Glu Lys Lys Glu Gln 145 150 155 160 Asn Lys Gly Arg Glu Glu Lys Asn Lys Ser Pro Ala Ala Val Thr Glu 165 170 175 Pro Glu Thr Asn Lys Phe Asp Ser Thr Gly Tyr Asp Lys Asp Leu Val 180 185 190 Glu Ala Leu Glu Arg Asp Ile Ile Ser Gln Asn Pro Asn Val Arg Trp 195 200 205 Asp Asp Ile Ala Asp Leu Val Glu Ala Lys Lys Leu Leu Lys Glu Ala 210 215 220 Val Val Leu Pro Met Trp Met Pro Glu Phe Phe Lys Gly Ile Arg Arg 225 230 235 240 Pro Trp Lys Gly Val Leu Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr 245 250 255 Leu Leu Ala Lys Ala Val Ala Thr Glu Cys Lys Thr Thr Phe Phe Asn 260 265 270 Val Ser Ser Ser Thr Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu Lys 275 280 285 Leu Val Arg Leu Leu Phe Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ser Pro Ala Thr 290 295 300 Ile Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr Ser 305 310 315 320 Glu Glu His Glu Ala Ser Arg Arg Val Lys Ala Glu Leu Leu Val Gln 325 330 335 Met Asp Gly Val Gly Gly Thr Ser Glu Asn Asp Asp Pro Ser Lys Met 340 345 350 Val Met Val Leu Ala Ala Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp Glu Ala 355 360 365 Leu Arg Arg Arg Leu Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Ser Ala 370 375 380 Lys Gly Arg Glu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Arg Glu Leu Glu Leu 385 390 395 400 Ala Asp Asp Val Asp Leu Ala Ser Ile Ala Glu Asn Met Glu Gly Tyr 405 410 415 Ser Gly Ala Asp Ile Thr Asn Val Cys Arg Asp Ala Ser Leu Met Ala 420 425 430 Met Arg Arg Arg Ile Glu Gly Leu Thr Pro Glu Glu Ile Arg Asn Leu 435 440 445 Ser Lys Glu Glu Met His Met Pro Thr Thr Met Glu Asp Phe Glu Met 450 455 460 Ala Leu Lys Lys Val Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala Asp Ile Glu Arg 465 470 475 480 Tyr Glu Lys Trp Ile Phe Glu Phe Gly Ser Cys 485 490 <210> 2 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Katanin p60 T2 <400> 2 Asp Ser Thr Gly Tyr Asp Lys Asp Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Asp 1 5 10 15 Ile Ile Ser Gln Asn Pro Asn Val Arg Trp Asp Asp Ile Ala Asp Leu 20 25 30 Val Glu Ala Lys Lys Leu Leu Lys Glu Ala Val Val Leu Pro Met Trp 35 40 45 Met Pro Glu Phe Phe Lys Gly Ile Arg Arg Pro Trp Lys Gly Val Leu 50 55 60 Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Leu Ala Lys Ala Val 65 70 75 80 Ala Thr Glu Cys Lys Thr Thr Phe Phe Asn Val Ser Ser Ser Thr Leu 85 90 95 Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu Lys Leu Val Arg Leu Leu Phe 100 105 110 Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ser Pro Ala Thr Ile Phe Ile Asp Glu Ile 115 120 125 Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr Ser Glu Glu His Glu Ala Ser 130 135 140 Arg Arg Val Lys Ala Glu Leu Leu Val Gln Met Asp Gly Val Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ser Glu Asn Asp Asp Pro Ser Lys Met Val Met Val Leu Ala Ala 165 170 175 Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp Glu Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu 180 185 190 Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Ser Ala Lys Gly Arg Glu Glu Leu 195 200 205 Leu Arg Ile Ser Leu Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Asp Val Asp Leu 210 215 220 Ala Ser Ile Ala Glu Asn Met Glu Gly Tyr Ser Gly Ala Asp Ile Thr 225 230 235 240 Asn Val Cys Arg Asp Ala Ser Leu Met Ala Met Arg Arg Arg Ile Glu 245 250 255 Gly Leu Thr Pro Glu Glu Ile Arg Asn Leu Ser Lys Glu Glu Met His 260 265 270 Met Pro Thr Thr Met Glu Asp Phe Glu Met Ala Leu Lys Lys Val Ser 275 280 285 Lys Ser Val Ser Ala Ala Asp Ile Glu Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Phe 290 295 300 Glu Phe Gly Ser Cys 305 <210> 3 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Katanin p60 T3 <400> 3 Asp Ser Thr Gly Tyr Asp Lys Asp Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Asp 1 5 10 15 Ile Ile Ser Gln Asn Pro Asn Val Arg Trp Asp Asp Ile Ala Asp Leu 20 25 30 Val Glu Ala Lys Lys Leu Leu Lys Glu Ala Val Val Leu Pro Met Trp 35 40 45 Met Pro Glu Phe Phe Lys Gly Ile Arg Arg Pro Trp Lys Gly Val Leu 50 55 60 Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Leu Ala Lys Ala Val 65 70 75 80 Ala Thr Glu Cys Lys Thr Thr Phe Phe Asn Val Ser Ser Ser Thr Leu 85 90 95 Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu Lys Leu Val Arg Leu Leu Phe 100 105 110 Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ser Pro Ala Thr Ile Phe Ile Asp Gln Ile 115 120 125 Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr Ser Glu Glu His Glu Ala Ser 130 135 140 Arg Arg Val Lys Ala Glu Leu Leu Val Gln Met Asp Gly Val Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ser Glu Asn Asp Asp Pro Ser Lys Met Val Met Val Leu Ala Ala 165 170 175 Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp Glu Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu 180 185 190 Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Ser Ala Lys Gly Arg Glu Glu Leu 195 200 205 Leu Arg Ile Ser Leu Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Asp Val Asp Leu 210 215 220 Ala Ser Ile Ala Glu Asn Met Glu Gly Tyr Ser Gly Ala Asp Ile Thr 225 230 235 240 Asn Val Cys Arg Asp Ala Ser Leu Met Ala Met Arg Arg Arg Ile Glu 245 250 255 Gly Leu Thr Pro Glu Glu Ile Arg Asn Leu Ser Lys Glu Glu Met His 260 265 270 Met Pro Thr Thr Met Glu Asp Phe Glu Met Ala Leu Lys Lys Val Ser 275 280 285 Lys Ser Val Ser Ala Ala Asp Ile Glu Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Phe 290 295 300 Glu Phe Gly Ser Cys 305 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primder for amplifying Kp60 T1 <400> 4 caccggatcc atgagtcttc ttatgattag tgagaatgta 40 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primder 1 for amplifying Kp60 T1 and Kp60 T2 <400> 5 ccgctcgagt tagcatgatc caaactcaaa tat 33 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primder 1 for amplifying Kp60 T2 <400> 6 caccggatcc atggatagta ccggatatga 30 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primder 2 for amplifying Kp60 T2 <400> 7 caccggatcc atggagaatc tttattttca gggcgatagt accggatatg a 51 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primder 3 for amplifying Kp60 T2 <400> 8 gccaccatat ttattgatca gatagactcc atctgtagt 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primder 2 for amplifying Kp60 T2 <400> 9 actacagatg gagtctatct gatcaataaa ataggtggc 39

Claims (25)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 이의 N 말단으로부터 182개 아미노산 서열이 결실된 아미노산 서열로 이루어진, 변형된 카타닌 p60 (Kp60) 단백질.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 309번에 위치한 글루탐산이 글루타민으로 더 치환된, 변형된 Kp60 단백질.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 변형된 Kp60 단백질을 코딩하는 핵산.
6. 제5항에 따른 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터와 터미네이터를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
7. 제6항에 있어서, 대장균에서 발현 가능한 재조합 발현 벡터.
8. 제6항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
9. 제6항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 배양하여 변형된 Kp60 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 변형된 Kp60 단백질의 제조 방법.
10. 제1항 또는 제2항에 따른 변형된 Kp60 단백질을 침전제를 포함하는 저수조 용액과 접촉시켜 방울 혼합 증기 평형법으로 결정화하는 단계를 포함하는,
    변형된 Kp60 단백질의 결정화 방법.
11. 제10항에 있어서, 변형된 Kp60 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 침전제는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 시트르산삼나트륨(Tri-sodium citrate), 시트르산삼리튬(Tri-lithium citrate), 시트르산삼칼륨(Tri-potassium citrate), 및 구연산알루미늄(Aluminum citrate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상인, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 시트르산삼리튬은 농도가 0.1 내지 0.8 M 범위이고, 상기 시트르산삼칼륨은 농도가 0.1 내지 0.5 M 범위인 것인, 방법.
14. 제10항에 있어서, 상기 방울 혼합 증기 평형법은 4 내지 26 ℃의 온도에서 수행되는 것인, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 방울 혼합 증기 평형법은 1일 내지 30일의 반응기간의 반응 조건하에서 수행하는 것인, 방법.
16. 제10항에 있어서, 상기 방울 혼합 증기 평형법 수행 후 고속 질소 냉각법을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 고속 질소 냉각법은 50 내지 200 K의 온도 범위에서 수행되는 것인, 방법.
18. 제10항에 따른 변형된 Kp60 단백질의 결정화 방법에 의하여 제조되며, 하기 X-선 회절 패턴 데이터를 나타내는, 변형된 Kp60 단백질 결정체:
    결정의 공간군: P4₃ 정방 정계
    격자단위: a=97.691Å, b=97.691Å, c=72.677Å, α=β=γ=90 ° 및
    데이터 해상도:3.2 Å.
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