KR102341951B1

KR102341951B1 - 형광세기가 증진된 적색형광단백질 변이체

Info

Publication number: KR102341951B1
Application number: KR1020180164123A
Authority: KR
Inventors: 박정희; 김다솜; 주호종; 김강민
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2021-12-22
Also published as: KR20200075975A

Abstract

본 발명은 형광세기가 증진된 적색형광단백질 변이체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 야생형의 mCherry 유전자의 N-말단에 28개의 아미노산이 추가되어 이루어짐으로써, 종래 mCherry보다 빠른 시간 내에 안정적인 구조를 형성하여 강한 형광을 나타내어 선명도를 향상시킬 수 있는 적색형광단백질 변이체에 관한 것이다.

Description

형광세기가 증진된 적색형광단백질 변이체 {Red Fluorescence Protein Variants for Enhancing Fluorescent Intensity}

본 발명은 야생형의 mCherry 단백질의 N-말단에 28개의 아미노산 추가되어, 형광세기가 증진된 적색형광단백질 변이체에 관한 것이다.

형광단백질은 생물을 연구함에 있어 여러 분야에서 다양한 기술적 도구로서 이용되어 왔다. 그 예로 단백질-단백질 상호 작용, 단백질 및 세포의 추적 등이 있는데 최초로 발견된 녹색형광단백질이 이러한 기능을 담당하였다. 그러나 녹색형광단백질은 여기에 필요한 파장이 자외선 영역이어서 살아있는 세포에 조사하기에는 상당한 위험성을 안고 있다. 따라서 최근에는 여기 시킬 파장이 가시광선 영역의 파장이고 맨눈으로도 직접 확인이 가능한 적색형광단백질이 각광을 받고 있다.

적색형광단백질은 녹색형광단백질(GFP)보다 형광을 내기 위한 광 흡수 파장 대역이 긴 저 에너지 빛이고 빛의 산란이 GFP보다 적고 세포나 조직의 파괴가 적다는 장점이 있어 다양한 분야에 적용되고 있다.

적색형광단백질 중 DsRed계열은 세포내 영상 분석에 적합하여 가장 널리 사용되고 있다. 이러한 DsRed는 자연계 상에 사량체(tetramer)로 존재하여 표적 단백질에 형광단백질을 융합시키기에는 어려움이 많아 단백질 공학을 이용한 단량체(monomer) 형태의 적색형광단백질을 개발하였다. 그러나 이 단량체는 사량체의 형광단백질(DsRed)보다 형광세기가 저감되는 단점이 있다. 이를 개선하기 위하여 유전자를 이용한 돌연변이체 생성 방법을 통해 tdTomato(일령이합체), mRFP(단량체), mTangerine(단량체), mBanana(단량체), mHoneydew(단량체), mCherry(단량체), mOrrange(단량체) 및 mStrawberry(단량체) 등과 같은 다양한 적색계열의 단량체 형광단백질들을 제조하고, 상기 제조된 적색계열의 단량체 형광단백질의 형광세기를 증가시키기 위한 다양한 노력이 시도되고 있는 실정이다.

Shaner NC et al. 2004, Nat.Biotechnol.; Campbell RE et. al. 2002, Proc Natl Acad Sci U S A. Sambrook, Joseph, Fritsch, Maniatis. Molecular Cloning 2nd Edition

본 발명자은 상기와 같은 문제점을 개선하기 위한 것으로, 안정하고 빠르며 세기가 증진된 형광이 유도되는 신규의 적색형광단백질 변이체를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 신규의 적색형광단백질 변이체를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 상기 신규의 적색형광단백질 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 바이오센서를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 달성을 위하여, 야생형의 mCherry 단백질의 N-말단에 아미노산이 추가되어 이루어지는 신규의 적색형광단백질 변이체를 제공한다.

본 발명에 따른 적색형광단백질 변이체는 mCherry의 단점을 보완한 것으로, 그보다 빠른 시간 내에 안정적인 구조를 형성하여 강한 형광을 나타내어 선명도를 향상시킬 수 있다는 이점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 적색형광단백질 변이체의 아미노산서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따라 N-terminus extended mCherry(28aa-mCherry) 단백질 발현을 위한 재조합 플라스미드 구성을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 N-terminus extended mCherry의 제조를 위한 DNA 재조합 과정의 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 종래 mCherry 단백질과 본 발명에 따른 N-terminus extended mCherry(28aa-mCherry) 단백질의 최종 정제 후 SDS PAGE를 통해 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 종래 mCherry 단백질과 본 발명에 따른 N-terminus extended mCherry(28aa-mCherry) 단백질의 형광 강도를 측정한 것이다.
도 6은 종래 mCherry 단백질과 본 발명에 따른 N-terminus extended mCherry(28aa-mCherry) 단백질의 광냉광도 측정한 것이다.

이하, 본 발명에 따른 바람직한 실시 형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다. 첨부된 도면과 함께 이하에 개시될 상세한 설명은 본 발명의 예시적인 실시형태를 설명하고자 하는 것이며, 본 발명이 실시될 수 있는 유일한 실시형태를 나타내고자 하는 것이 아니다. 이하의 상세한 설명은 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해서 구체적 세부사항을 포함한다. 그러나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 이러한 구체적 세부사항 없이도 실시될 수 있음을 안다.

몇몇 경우, 본 발명의 개념이 모호해지는 것을 피하기 위하여 공지의 구조 및 장치는 생략되거나, 각 구조 및 장치의 핵심기능을 중심으로 한 블록도 형식으로 도시될 수 있다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함(comprising 또는 including)"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 "…부"의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미한다.

또한, "일(a 또는 an)", "하나(one)", "그(the)" 및 유사 관련어는 본 발명을 기술하는 문맥에 있어서(특히, 이하의 청구항의 문맥에서) 본 명세서에 달리 지시되거나 문맥에 의해 분명하게 반박되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 실시예들을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명의 실시예에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

본 발명은 야생형의 mCherry 단백질의 N-말단에 아미노산 28개가 추가되어 생산되는 신규 적색형광단백질 변이체에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명의 적색형광단백질 변이체는 야생형의 mCherry 단백질의 N-말단에 메티오닌(Methionine), 세린(Serine), 글루탐산(Glutamic acid), 아스파트산(Aspartic acid), 트레오닌(Threonine), 라이신(Lysine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 라이신(Lysine), 라이신(Lysine), 라이신(Lysine), 세린(Serine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아이소루신(Isoleucine), 아르지닌(Arginine), 알라닌(Alanine), 아스파라진(Asparagine), 아르기닌(Arginine), 류신(Leucine), 알라닌(Alanine), 히스티딘(Histidine), 메티오닌(Methionine), Glycine, 세린(Serine), 알라닌(Alanine), 트레오닌(Threonine) 및 히스티딘(Histidine)의 순으로 이루어진 28개의 아미노산이 추가되어 이루어진다.

바람직하기로 상기 아미노산은 N-말단의 시작코돈(Met) 뒤에 추가되며, 상기와 같이 MSEDTKSPKKKSSPIRANRLAHMGSATH순으로 추가된다.

상기 본 발명에 따른 적색형광단백질 변이체의 아미노산서열은 도 1과 같다.

RFP는 인체에 위해한 자외선에 의해 여기되는 다른 형광단백질과 달리 가시광선에 의해 여기되며 방출하는 파장이 길어 조직의 투과성이 우수하므로 인체 질병의 진단에 가장 이상적인 형광단백질로 알려져 있다. mCherry는 그 중 최적화되어 있는 RFP 변이체로서 널리 이용되고 있으나, 형광이 늦게 발현되고 안정성이 낮은 단점이 있다.

본 발명자들은 돌연변이 mCherry 단백질의 제작과 생산을 위해 유전자 재조합 기법을 이용하여 대장균에서 다량의 단백질 생산 및 순수 분리 정제 후 형광강도 증가와 광냉강도 증가를 확인하였다.

돌연변이 mCherry(N-terminus extended mCherry, 28aa-mCherry)와 야생형 mCherry를 같은 조건하에 대장균에서 과발현하였으며, 동일한 농도의 단백질을 기준으로 비교하기 위해 분리 정제하였다.

본 발명은 또한 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제공한다. 이때, 상기 미생물로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 대장균, 효모, 바실러스 등을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 대장균, 더욱 바람직하게는 E.coli BL21(DE3)를 사용할 수 있다.

위에서 살펴보았듯이 본 발명이 제공하는 RFP 변이체는 mCherry 보다 빠르고 강한 형광이 유도되면서도 안정한 단백질이므로, 리포터, 융합태그 또는 탐침자로서, 생체 내 이미지화 또는 다양한 질환 진단 등에 유용하게 활용할 수 있다.

따라서 본 발명은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 상기한 적색형광단백질 변이체를 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.

또한 본 발명은 리포터 또는 융합 태그로서 상기한 적색형광단백질 변이체를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.

재료 및 방법

1. 숙주 및 플라스미드

본 실험에서는 형질전환 및 발현숙주로 Escherichia coli BL21(DE3)을 사용하였다.

새로운 변이 단백질의 제작을 위한 주형으로는 Discosoma sp. red fluorescent protein(DsRed) 유래의 mCherry 유전자를 이용하였다. 또한 상기 mCherry 유전자를 기초로 유전자 재조합 기법을 이용하여 N-말단에 28개의 아미노산 서열을 추가하고자 하였다. 염기서열 분석결과 야생형의 mCherry와 비교하여 N-말단에 서열번호 2번이 추가된 변이체임을 확인하였다.

이때, 변이체 제작과 발현에는 pET-21a plasmid(Novagen)를 이용하였다. 클로닝을 위한 숙주로는 E.coli BL21(DE3)를 사용하였다.

상기 본 발명에 따른 N-terminus extended mCherry 단백질 발현을 위한 재조합 플라스미드 구성은 하기 도 2와 같이 나타낼 수 있다.

2. 돌연변이 도입을 위한 유전자 증폭과 클로닝

pET21b plasmid에 우선적으로 28개의 아미노산을 삽입하고 야생형 mCherry 유전자를 삽입하였다. 돌연변이 제작을 위하여 주형가닥을 제작하였다. 이 주형가닥은 pET21b plasmid 상의 T7 promoter, lac operator 및 XbaI 제한효소 자리를 포함하는 유전자 서열 다음에 Met 이후 28개의 아미노산을 생산하는 아미노산서열 자리를 배치하여 구성하였다.

주형 가닥은 XbaI_28aa-과 28aa_NdeI-R Primer를 이용하여 PCR하여 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장, 35 사이클로 하였다. 증폭한 유전자는 제한효소 XbaI과 NdeI으로 처리하여 같은 제한효소로 처리한 pET21b plasmid에 ligation 하였다. 28개의 아미노산을 발현하는 DNA 염기서열이 삽입되었는지 확인 후 야생형 mCherry을 도입한다.

야생형 mCherry는 NdeI_mCherry-F와 XhoI-mCherry-R primer를 이용하여 PCR하여 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 신장, 35 사이클로 하였다. 증폭한 유전자는 제한효소 NdeI과 XhoI으로 처리하여 같은 제한효소로 처리한 28개의 아미노산이 발현되는 유전자가 삽입된 pET21b plasmid와 기존의 pET21b plasmid에 ligation 하였다. 28개의 아미노산 직후 mCherry가 발현되는 DNA 염기서열이 삽입되었는지 확인 후 발현 및 정제 한다.

하기 표 1은 야생형 mCherry의 돌연변이에 사용된 프라이머 서열을 나타낸 것이다.

Primer 이름	Primer 서열 (5‘→3’)
XbaI_28aa-F	5‘-TTCCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATA CACATGAGTGAGGACACAAAATC-3’
28aa_NdeI-R	5‘-GCACTCCATATGGGTGGCGGATCCCATG-3’
NdeI_mCherry-F	5‘-GCACTCCATATGGTGAGCAAGGGCGAG-3
XhoI-mCherry-R	5‘-CTCGAGCTTGTACAGCTCGTCC-3’

도 3은 본 발명에 따른 N-terminus extended mCherry의 제조를 위한 DNA 재조합 과정의 결과를 나타낸 것이다. (a)는 최초의 PCR을 통해 증폭된 유전자로 PCR 후 agaorse gel에서 확인했다. (b)는 28aa 유전자가 포함된 pET21b vector와의 연결을 위해 vector와 PCR로 증폭된 유전자를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 자른 후 agarose gel에서 확인 한 것이다. (c)는 pET21b vector와 연결한 28aa-mCherry의 플라스미드 제작을 확인하기 위해 제한효소 처리하여 확인한 것이다. 이후, 정확한 DNA 염기서열을 sequencing을 통해 확인했다.

3. 배지, 배양, 과발현 조건

E. coli 형질전환체는 100 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)이 첨가된 고체배지인 Luria-Bertani(LB, 1% of Bacto-tryptone, 0.5% of Bacto-yeast extract, 1% of NaCl per liter, Agar 1.5%) 배지에서 37℃, 16 내지 18시간 배양한 후 50 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 액체 LB(10% of Bacto-tryptone, 5% of Bacto-yeast extract, 5% of NaCl) 배지에서 배양하였다. 배양은 37℃에서 vigorous shaking(200 rpm in a rotary shaker)으로 16 내지 18시간 배양시켰다. 배양액의 10㎖를 1L의 50 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃의 진탕 배양기(shaking incubator)에서 A600이 0.4 내지 0.5에 달할 때까지 배양시켰다. IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)의 최종농도가 0.02%가 되도록 넣고 진탕 배양기의 설정을 30℃, 170RPM으로 변경하여 약 4 내지 6시간 더 배양한다. 이후 배양액을 4,000rpm 으로 20분간 원심분리하여 배양액과 대장균을 분리하고, 바닥에 가라앉은 대장균만을 -80℃의 냉동고에 보관 후 정제에 사용한다.

4. Competent cell의 제조 및 형질전환

E. coli BL-21(DE3)의 형질전환은 CaCl₂를 이용한 Heat Shock Method의 방법으로 실험하였다. E. coli BL-21(DE3)의 단일 콜로니는 50㎍/㎖의 암피실린이 포함된 LB 플레이트에서 37℃, 16시간 동안 자란 것을 멸균된 팁으로 찍어 50㎍/㎖의 암피실린이 포함된 6㎖의 LB broth에 접종하였다. 배양은 37℃에서 진탕 배양기(200 rpm in a rotary shaker)로 16 내지 18 시간 배양시켰다. 800㎕의 배양액과 200㎕의 100% glycerol을 Cryovial에 넣고 천천히 섞어준 뒤 -80℃의 냉동고에 보관한다.

5. 야생형과 돌연변이 단백질의 정제

냉동고에 보관한 과발현된 대장균을 A buffer 15㎖를 첨가하여 vortexing 한다. 가라앉은 대장균이 덩어리지지 않은 것을 확인 한 후 50㎖ 튜브에 옮겨 담는다. A buffer에 풀린 대장균을 sonicator를 이용하여 파쇄한다. Sonicator는 AMPL 30%, Pulse on/off 4sec/4sec로 설정하여 2분간 작동시킨다. 대장균 파쇄 용액은 12,000rmp으로 약 20분간 원심분리하여 상층액과 가라앉은 불순물을 분리한다. 분리된 상층액은 0.45㎛ pore size의 syringe filter를 이용하여 여과한다.

여과된 파쇄 용액은 A buffer로 채워진 5㎖ HisTrap FF column에 1㎖/min의 속도로 흘려주어 column에 충진된 Ni-NTA resin에 부착시킨다. 이후 B buffer의 농도를 점차 높여가며 column으로부터 나오는 용액을 1㎖씩 나누어 획득한다. B buffer의 비율이 100%가 될 때까지 약 80㎖를 80개의 fraction에 획득한다.

각 fraction은 SDS PAGE를 통해 야생형 또는 돌연변이형의 mCherry 단백질이 포함되었는지를 확인한다. mCherry 단백질이 포함된 fraction의 용액을 Dialysis tubing cellulose membrane에 모아 위와 아래를 밀봉한다. 2ℓ의 C buffer에 넣고 천천히 교반하며 약 3시간 동안 냉장실에서 buffer change 하며 총 2회 실시한다.

buffer change한 단백질 용액은 C buffer로 채워진 5㎖ HiTrap Q FF column에 1㎖/min의 속도로 흘려주어 column에 충진된 Q resin에 부착시킨다. 이후 D buffer의 농도를 점차 높여가며 column으로부터 나오는 용액을 1㎖씩 나누어 획득한다. B buffer의 비율이 100%가 될 때까지 약 80㎖를 80개의 fraction에 획득한다.

SDS PAGE를 통해 야생형 또는 돌연변이형 mCherry 단백질만이 존재하는 fraction을 선별한다. 선별한 fraction의 단백질 용액은 Amicon Ultra Centrifugal Filters와 3,800rmp의 원심분리기를 이용하여 농축한다. 농축된 단백질은 약 3회에 걸쳐 A buffer로 풀어주었다고 재농축한다.

하기 표 2는 버퍼용액의 조성을 나타낸 것이다.

용액의 이름	조성
A buffer	10mM Tris, 0.1M NaCl, pH 7.0
B buffer	10mM Tris, 0.1M NaCl, 0.5M Imidazole, pH 7.0
C buffer	10mM Tris, pH 7.0
D buffer	10mM Tris, 0.5M NaCl, pH 7.0

도 4은 종래 mCherry 단백질과 본 발명에 따른 N-terminus extended mCherry(28aa-mCherry) 단백질의 최종 정제 후 SDS PAGE를 통해 얻은 결과를 나타낸 것이다. (a)는 SDS PAGE를 통해 크기와 임의 적인 순도 확인 결과이다. (b)는 Western blot을 이용한 단백질 검출을 하는 과정 중 membrane에 부착된 형광 단백질의 사진으로, 색상을 통해 단백질의 크기에 따른 위치를 파악할 수 있다. (c)는 Anti-His probe를 이용한 Western blot의 결과로 필름에 현상하여 얻어진 결과이다.

6. 형광강도 측정

야생형 또는 돌연변이형 단백질을 약 1㎎/㎖의 농도로 맞춘다. 각 단백질은 96 well plate(SPL)에 3 세트로 10㎕씩 분주하여 Fluorometer(TECAN, infinite M200 PRO)으로 여기파장 540㎚, 발광파장 580㎚에서 700㎚까지 형광강도를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

형광 강도 측정 시, 540nm의 파장을 갖는 빛을 조사하여 580nm부터 700nm사이의 10nm 마다의 emission 파장을 측정하였고, 기존의 mCherry 단백질에 비해 N-terminus extended mCherry 단백질의 형광 강도가 약 50% (1.5배) 증가하였음을 확인하였다.

7. 광냉광도 측정

야생형 또는 돌연변이형 단백질을 약 1㎎/㎖의 농도로 맞춘다. 각 단백질은 약 20㎕를 슬라이드 글라스 위에 올리고 Photoluminescence(Accent Opt. Tech., RPM 2000)로 여기파장 532㎚, 발광파장 530㎚부터 약 700㎚까지의 광냉광도를 측정한다. 액체 상태인 시료의 특성상 여기파장을 위한 레이저 조사 시, 표면의 각도에 따를 차이를 줄이기 위해 다른 위치에서 3회 조사하여 자료를 수집한다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

광냉광도 측정 시, 532nm의 강한 빛을 이용하여 측정하였으며 약 30% (1.3배)의 광냉광도가 증가함을 하였다.

<110> JBNU University-Industry Cooperation <120> Red Fluorescence Protein Variants for Enhancing Fluorescent Intensity <130> A18-362 <140> 10-2018-0164123 <141> 2018-12-18 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an Artificially synthesized protein sequence <400> 1 Met Ser Glu Asp Thr Lys Ser Pro Lys Lys Lys Ser Ser Pro Ile Arg 1 5 10 15 Ala Asn Arg Leu Ala His Met Gly Ser Ala Thr His Met Val Ser Lys 20 25 30 Gly Glu Glu Asp Gln Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys 35 40 45 Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly 50 55 60 Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys 65 70 75 80 Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro 85 90 95 Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile 100 105 110 Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg 115 120 125 Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser 130 135 140 Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr 145 150 155 160 Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp 165 170 175 Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly 180 185 190 Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala 195 200 205 Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly 210 215 220 Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp 225 230 235 240 Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr 245 250 255 Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Glu His His His His His His 260 265 270 <210> 2 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 2 ttcccctcta gaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacacatg agtgaggaca 60 caaaatc 67 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 3 gcactccata tgggtggcgg atcccatg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 4 gcactccata tggtgagcaa gggcgag 27 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 5 ctcgagcttg tacagctcgt cc 22

Claims

야생형의 mCherry 단백질의 N-말단에 메티오닌(Methionine), 세린(Serine), 글루탐산(Glutamic acid), 아스파트산(Aspartic acid), 트레오닌(Threonine), 라이신(Lysine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 라이신(Lysine), 라이신(Lysine), 라이신(Lysine), 세린(Serine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아이소루신(Isoleucine), 아르지닌(Arginine), 알라닌(Alanine), 아스파라진(Asparagine), 아르기닌(Arginine), 류신(Leucine), 알라닌(Alanine), 히스티딘(Histidine), 메티오닌(Methionine), Glycine, 세린(Serine), 알라닌(Alanine), 트레오닌(Threonine) 및 히스티딘(Histidine)의 순으로 이뤄진 아미노산이 N-말단에 추가되어 이루어진 것을 특징으로 하는 적색형광단백질 변이체.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 아미노산은 N-말단의 뒤에 추가되는 것을 특징으로 하는 적색형광단백질 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 적색형광단백질 변이체는 하기의 아미노산서열을 갖는 것을 특징으로 하는 적색형광단백질 변이체:
MSEDTKSPKKKSSPIRANRLAHMGSATHMVSKGEEDQMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKLEHHHHHH
청구항 4에 따른 적색형광단백질 변이체 아미노산서열을 발현하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
청구항 5의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물.
청구항 6에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서, 청구항 4에 따른 적색형광단백질 변이체 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서, 청구항 4에 따른 적색형광단백질 변이체 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.