JP6051438B2

JP6051438B2 - 赤色蛍光蛋白質を用いたカルシウムセンサー蛋白質

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Publication number: JP6051438B2
Application number: JP2012137434A
Authority: JP
Inventors: 正道大倉; 中井　淳一; 淳一中井
Original assignee: Saitama University NUC
Current assignee: Saitama University NUC
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2016-12-27
Anticipated expiration: 2032-06-19
Also published as: JP2014001161A

Description

本発明は、特定部位のアミノ酸を置換した赤色蛍光蛋白質（以下、ＲＦＰ）、又はそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質に関する。より具体的には、従来の赤色蛍光カルシウムセンサー蛋白質よりも更に反応性に優れた、かつ細胞内で発現後に細胞質から核内への移行を示さない、カルシウムセンサー蛋白質、及び前記カルシウムセンサー蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子に関する。

カルシウムは生体にとって、構造の維持に必須である骨の主要な構成成分であると同時に、筋肉の収縮、神経興奮性やホルモン分泌、酵素活性の変化などの各種の細胞機能の調節因子として、生体機能の維持および調節に不可欠な役割を担っている。このため、生体内（細胞外及び細胞内）のカルシウム変動を探知し、カルシウム濃度を測定するのに用いられるカルシウムセンサーの重要性が高まっている。
カルシウムセンサーは大きく分けて4種類のものがこれまでに開発されている。以下にその概要を示す。

１）カルシウム感受性の合成色素：カルシウムに感受性のある化学合成された色素であり、現在一般によく使用されている。細胞内において使用する場合は、外部から細胞に取り込ませる必要があるが、特定の細胞のみに色素を取り込ませることは難しく、ガラス針等により細胞に該色素を注入しなければならないという問題点を有する。

２）エクオリン：カルシウムに反応して発光する蛋白質であり、細胞に直接注入するか、該蛋白質を産生する遺伝子を細胞に導入して使用する。細胞内で機能するためには細胞に補酵素を供給する必要があり、また発光が極めて微弱であるという問題点を有する。

３）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を応用したカルシウム感受性蛋白質：カルシウムに感受性のあるカルモジュリン（ＣａＭ）とそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼの一部の配列、二つの色の異なるＧＦＰ又はそのホモログを結合した蛋白質であり、カルシウムがＣａＭに結合するとその構造が変化し、ＦＲＥＴを起こして二つのＧＦＰまたはそのホモログの発する蛍光強度が変化することを利用している。該蛋白質は、細胞に直接注入するか、該蛋白質をコードする遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。ＦＲＥＴにおる蛍光変化は軽微であり、さらに一般的に用いられているアルゴンレーザーを搭載したレーザー顕微鏡により測定することが出来ないという問題点がある。

４）一つのＧＦＰ又はＲＦＰからなるカルシウム感受性蛋白質：ＧＦＰ又はＲＦＰ、好ましくはｍＡｐｐｌｅ、の改変体にＣａＭとミオシン軽鎖キナーゼの一部の配列を結合したカルシウム感受性蛋白質であり、カルシウムがＣａＭに結合すると蛋白質の構造が変化し、ＧＦＰ又はＲＦＰの発する蛍光強度が変化することを利用している。該蛋白質も、細胞に直接注入するか、その他遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。一般にカルシウムに対する感度が低く、実際の細胞では信号／雑音比が低いため、測定が困難であるという問題点を有する。また従来のｍＡｐｐｌｅからなるカルシウム感受性蛋白質（R-GECO1：非特許文献１）は細胞内での発現部位が細胞質と核内であるため、該蛋白質を用いた測定では同一細胞の細胞質と核において異なるタイミングで蛍光変化が生じる場合があるという問題点がある。

本発明者らは、上記４）の応用として、ＧＦＰの蛍光特性を制御することが可能なカルシウムセンサー蛋白質を作成する方法、並びに該方法により作成されるカルシウムセンサー蛋白質、および該カルシウムセンサー蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子を提供し（特許文献１）、カルシウムに対する感度が従来のカルシウムセンサーに比して高く、かつ特定細胞への取り込みが容易であり、更に測定に特別な装置及び補酵素等を必要としないカルシウムセンサー蛋白質の作成に成功している（特許文献２、特許文献３）。
しかし、近年、生体内でのカルシウムの微少な変動を感知する必要性が以前にも増して高まっており、上記特許文献１、特許文献２及び特許文献３のカルシウムセンサー蛋白質をもってしても、十分な成果が上げられない状況となっている。

また近年、光刺激で細胞機能を操作し、同時に蛍光カルシウムイメージングで細胞機能を測定するという実験の要求が高まってきた。蛍光カルシウムイメージングに応用される赤色蛍光カルシウムセンサー蛋白質は、その励起波長が細胞機能操作を目的として汎用される光刺激プローブＣｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２（非特許文献２）の活性化波長と重複しないため、Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２との併用が可能である。つまり赤色蛍光カルシウムセンサー蛋白質によって細胞機能操作と細胞機能測定を同時に行う実験が可能となる。そのためＣｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２と併用可能な赤色蛍光カルシウムセンサー蛋白質の開発が強く望まれている状況である。

特開２００２−１５３２７９特開２０１１−１２５３１８特開２０１２−８５５４２

Ｚｈａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３３：１８８８−１８９１，２０１１Ｎａｇｅｌら，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃaｄＳｃｉＵＳＡ１００：１３９４０−１３９４５，２００３Ｎａｇａｉら，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９８：３１９７−３２０２，２００１Ｔｉａｎら，ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ６：８７５−８８１，２００９Ｍａｏら，ＰＬｏＳＯｎｅ３：ｅ１７９６，２００８

上記事情に鑑み、本発明は、従来の赤色蛍光カルシウムセンサーよりも、さらに、反応性に優れ、かつ細胞内で発現後に細胞質から核内への移行を示さない、カルシウムセンサー蛋白質、及び、該蛋白質をコードする遺伝子の提供を目的とする。

発明者らは、既存の赤色蛍光カルシウムセンサーであるＲ−ＧＥＣＯ１よりも高い蛍光反応性を示すセンサーの開発を目的として鋭意研究を行ったところ、まず、Ｒ−ＧＥＣＯ１よりも約１．４倍の高い蛍光反応性を示すセンター、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１を完成させた。しかし、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１は、Ｒ−ＧＥＣＯ１と同様に発現後に核内にも局在するものであった。細胞質カルシウム測定を目的とした研究において、この局在パターンは好ましいものではない。その理由としては、１）細胞質と核内ではカルシウム濃度変化に時差があり（非特許文献３）、細胞質と核での蛍光シグナルを分離して検出する必要がある、２）カルシウムセンサーの分解産物が核内に局在した細胞では通常の細胞質カルシウム応答パターンに異変が見られたという報告（非特許文献４）から、核内局在による細胞機能への悪影響が考えられる、等が挙げられる。
そこで、発明者らは、カルシウムセンサーとしての性能はセンサーのＮ末端やＣ末端へのペプチド付加によって修飾を受けるとの知見に基づき（非特許文献５）、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１の更なる改良を目的として、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１へ種々様々なペプチドを付加した改変体を作製し、その機能を検討した。その結果、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１のＣ末端に１５アミノ酸のリンカーと２２アミノ酸からなるペプチド（配列番号１２）を付加した改変体（以下、Ｒ−ＣａＭＰ１．０７と称する）は、核内への局在を示さず、かつＲ−ＣａＭＰ１．０１よりもさらに高い蛍光反応性を示すことを見出した。
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）下記（ａ）〜（ｋ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）３つのアミノ酸からなる配列Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（ここでＸａａ１及びＸａａ２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＡ）（配列番号２）；
（ｃ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、又はカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列；
（ｄ）前記（ｃ）の配列と後記（ｅ）の配列とを連結する、Ｉｓｏ−Ｉｓｏ、Ｉｓｏ−Ｌｅｕ、Ｉｓｏ−Ｍｅｔ、Ｉｓｏ−Ｐｒｏ、Ｉｓｏ−Ｖａｌ、Ｉｓｏ−Ｇｌｙ、Ｉｓｏ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｉｓｏ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｍｅｔ−Ｉｓｏ、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ、Ｍｅｔ−Ｖａｌ、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｉｓｏ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｍｅｔ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｉｓｏ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｍｅｔ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｉｓｏ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｍｅｔ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｉｓｏ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｇｌｙ及びＡｌａ−Ａｌａからなる群より選択される何れか一のアミノ酸配列（リンカーＢ）；
（ｅ）配列番号３で示される配列のＸ番目〜２３６番目までのアミノ酸配列であって、１５１番目及び／又は１５２番目及び／又は１６９番目及び／又は１７１番目及び／又は２１９番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したもの（ここで、Ｘは１５１〜１５３の任意の位置である）；
（ｆ）前記（ｅ）の配列と後記（ｇ）の配列を連結する、６つのアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ６（ここでＸａａ５及びＸａａ６はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（配列番号４）；
（ｇ）配列番号３で示される配列の１番目〜Ｙ番目までのアミノ酸配列であって、
１番目及び／又は８番目及び／又は５２番目及び／又は５４番目及び／又は７６番目及び／又は１３６番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列（ここで、Ｙは１４４〜１５０の任意の位置である）；
（ｈ）前記（ｇ）の配列と後記（ｉ）の配列とを連結するアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｔｙｒ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ又はＴｈｒ（リンカーＣ）；
（ｉ）配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目までのアミノ酸配列であって、６３番目及び／又は７７番目及び／又は１０１番目及び／又は１１１番目及び／又は１２７番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列；
（ｊ）前記（ｉ）の配列と後記（ｋ）の配列とを連結する、１５個のアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０（ここでＸａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９及びＸａａ１０はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＤ）（配列番号１０）；
（ｋ）Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１２）、Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１３）、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１４）又はＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１５）のいずれかのアミノ酸配列。

（２）前記（ａ）の配列の５番目から１０番目に存在するＨｉｓの数が０〜５であり、及び／又は前記（ａ）の配列の２番目のＡｒｇが欠失し、及び／又は前記（ｅ）の配列の１５１番目のアミノ酸がＩｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｅ）の配列の１５２番目のアミノ酸がＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｅ）の配列の１６９番目のアミノ酸がＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｅ）の配列の１７１番目のアミノ酸がＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｅ）の配列の２１９番目のアミノ酸がＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｇ）の配列の１番目のアミノ酸がＩｓｏ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｇ）の配列の８番目のアミノ酸がＧｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｇ）の配列の５２番目のアミノ酸がＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｇ）の配列の５４番目のアミノ酸がＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｇ）の配列の７６番目のアミノ酸がＩｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｇ）の配列の１３６番目のアミノ酸がＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の６３番目のアミノ酸がＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の７７番目のアミノ酸がＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の１０１番目のアミノ酸がＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の１１１番目のアミノ酸がＧｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の１２７番目のアミノ酸がＡｓｐ、Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換されることを特徴とする上記（１）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。

（３）前記（ｅ）の配列が配列番号３で示される配列の１５１番目〜２３６番目までのアミノ酸配列であり、前記（ｇ）の配列が配列番号３で示される配列の１番目〜１５０番目までのアミノ酸配列であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。

（４）前記（ｂ）の配列が配列番号５若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は前記（ｃ）の配列が配列番号７で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は前記（ｆ）の配列が配列番号８で示されるアミノ酸配列であることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のカルシウムセンサー蛋白質。

（５）前記（ｂ）の配列が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、前記（ｄ）の配列がＰｒｏ−Ｖａｌであり、前記（ｈ）の配列がＴｈｒ−Ａｒｇであることを特徴とする上記（４）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。

（６）前記（ｅ）の配列がアミノ酸の置換を含まない配列番号３で示される配列の１５１番目〜２３６番目までのアミノ酸配列であり、前記（ｇ）の配列がアミノ酸の置換を含まない配列番号３で示される配列の１番目〜１５０番目であり、前記（ｉ）の配列がアミノ酸の置換を含まない配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目であることを特徴とする上記（５）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。

（７）前記（ｅ）の配列が配列番号３で示される配列の１５１番目〜２３６番目であって、１５１番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、１５２番目のアミノ酸がＳｅｒに置換され、１６９番目のアミノ酸がＧｌｙに置換され、１７１番目のアミノ酸がＡｒｇに置換され、２１９番目のアミノ酸がＣｙｓに置換され、前記（ｇ）の配列が配列番号３で示される配列の１番目〜１５０番目までのアミノ酸配列であり、１番目のアミノ酸がＬｅｕに置換され、８番目のアミノ酸がＡｓｐに置換され、５２番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、５４番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、７６番目のアミノ酸がＡｌａに置換され、１３６番目のアミノ酸がＰｒｏに置換され、前記（ｉ）の配列が配列番号９で示される配列の６３番目のアミノ酸がＰｈｅに置換され、７７番目のアミノ酸がＡｓｎに置換され、１０１番目のアミノ酸がＧｌｙに置換され、１１１番目のアミノ酸がＡｓｐに置換され、１２７番目のアミノ酸がＶａｌに置換されていることを特徴とする上記（５）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。

（８）前記（ｊ）の配列が配列番号１０で示される配列であることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずれかに記載のカルシウムセンサー蛋白質。

（９）前記（ｋ）の配列が配列番号１２で示される配列であることを特徴とする上記（１）乃至（８）のいずれかに記載のカルシウムセンサー蛋白質。

（１０）上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子。

本発明により、従来の赤色蛍光カルシウムセンサーに比べ、更に反応性に優れ、かつ細胞内で発現後に細胞質から核内への移行を示さない、カルシウムセンサー蛋白質の提供が可能となる。

図１は、カルシウムセンサー蛋白質（Ｒ−ＧＥＣＯ１、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１又はＲ−ＣａＭＰ１．０７）のＤＮＡをトランスフェクション法により導入し発現させたヒト子宮癌由来株化細胞（ＨｅＬａ細胞）の画像図である。図２は、ＡＴＰに対して、ＨｅＬａ細胞に発現したカルシウムセンサー蛋白質（Ｒ−ＧＥＣＯ１、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１又はＲ−ＣａＭＰ１．０７）の蛍光強度が変化する様子を示すグラフ図である。図３は、本発明のカルシウムセンサー蛋白質（Ｒ−ＣａＭＰ１．０７）又はその前駆体（Ｒ−ＣａＭＰ１．０１）又は従来のカルシウムセンサー蛋白質（Ｒ−ＧＥＣＯ１）を発現させたＨｅＬａ細胞へのＡＴＰ処理に対する蛍光強度変化量を比較したグラフ図である。図４は、精製したカルシウムセンサー蛋白質（Ｒ−ＧＥＣＯ１、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１又はＲ−ＣａＭＰ１．０７）のカルシウム濃度と蛍光量との関係を示すグラフ図である。

本発明のカルシウムセンサー蛋白質は、下記（ａ）〜（ｋ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とする蛋白質である：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）３つのアミノ酸からなる配列Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（ここでＸａａ１及びＸａａ２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＡ）（配列番号２）；
（ｃ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、又はカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列；
（ｄ）前記（ｃ）の配列と後記（ｅ）の配列とを連結する、Ｉｓｏ−Ｉｓｏ、Ｉｓｏ−Ｌｅｕ、Ｉｓｏ−Ｍｅｔ、Ｉｓｏ−Ｐｒｏ、Ｉｓｏ−Ｖａｌ、Ｉｓｏ−Ｇｌｙ、Ｉｓｏ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｉｓｏ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｍｅｔ−Ｉｓｏ、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ、Ｍｅｔ−Ｖａｌ、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｉｓｏ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｍｅｔ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｉｓｏ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｍｅｔ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｉｓｏ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｍｅｔ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｉｓｏ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｇｌｙ及びＡｌａ−Ａｌａからなる群より選択される何れか一のアミノ酸配列（リンカーＢ）；
（ｅ）配列番号３で示される配列のＸ番目〜２３６番目までのアミノ酸配列であって、１５１番目及び／又は１５２番目及び／又は１６９番目及び／又は１７１番目及び／又は２１９番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したもの（ここで、Ｘは１５１〜１５３の任意の位置である）；
（ｆ）前記（ｅ）の配列と後記（ｇ）の配列を連結する、６つのアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ６（ここでＸａａ５及びＸａａ６はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（配列番号４）；
（ｇ）配列番号３で示される配列の１番目〜Ｙ番目までのアミノ酸配列であって、
１番目及び／又は８番目及び／又は５２番目及び／又は５４番目及び／又は７６番目及び／又は１３６番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列（ここで、Ｙは１４４〜１５０の任意の位置である）；
（ｈ）前記（ｇ）の配列と後記（ｉ）の配列とを連結するアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｔｙｒ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ又はＴｈｒ（リンカーＣ）；
（ｉ）配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目までのアミノ酸配列であって、６３番目及び／又は７７番目及び／又は１０１番目及び／又は１１１番目及び／又は１２７番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列；
（ｊ）前記（ｉ）の配列と後記（ｋ）の配列とを連結する、１５個のアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０（ここでＸａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９及びＸａａ１０はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＤ）（配列番号１０）；
（ｋ）Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１２）、Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１３）、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１４）又はＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１５）のいずれかのアミノ酸配列。

ここで、配列（ａ）（配列番号１で示されるアミノ酸配列）は、５番目から１０番目がＨｉｓで構成されているが、このＨｉｓの数は、０〜６の間のいずれであってもよく、好ましくは６である。また、２番目のＡｒｇは存在していても、欠失していてもよい。
また、上記配列（ｅ）、（ｇ）及び（ｉ）は、少なくとも１の配列（（ｅ）、（ｇ）又は（ｉ））に上述のアミノ酸置換が含まれていればよく、例えば、配列（ｅ）の１５２番目と１６９番目のアミノ酸のみが置換され、配列（ｇ）が配列番号３で示される配列の１番目〜Ｙ番目までのアミノ酸配列であってアミノ酸の置換を含まず（ここで、Ｙは１４１〜１４８の任意の位置である）、配列（ｉ）が配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目までのアミノ酸配列であってアミノ酸の置換を含まないものであってもよい。

上記配列（ｋ）は、本発明のカルシウムセンサー蛋白質が核へ移行しないという性質を付与する働きをする。配列（ｋ）は、Ｌｅｕ−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１４−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２２）からなる配列をコンセンサス配列として含むものが望ましく、Ｘａａ１１はＫ又はＬ、Ｘａａ１２はＬ、Ｔ又はＱ、Ｘａａ１３はＡ又はＣ、Ｘａａ１４はＳ又はＥであることが好ましく、配列（ｋ）としては、例えば、配列番号１２〜１５に示される配列が好ましく、配列番号１２で示される配列が特に好ましい。

上記のカルシウムセンサー蛋白質は、主として、改変ｍＡｐｐｌｅ（ｅ及びｇが該当）、（２）機能性分子（ｃ及びｉが該当）、（３）リンカー（ｂ、ｄ、ｆ及びｈ）、（４）カルシウムセンサー蛋白質の核移行を抑制するペプチド（ｋが該当）から構成されている。

改変ｍＡｐｐｌｅとは、蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基の近傍でｍＡｐｐｌｅのアミノ酸配列を切断して該蛋白質の構造を改変し、さらに特定部位のアミノ酸残基を置換したものである。

本発明のｍＡｐｐｌｅは、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。また、本発明のｍＡｐｐｌｅのホモログとは、配列番号３で示されるアミノ酸と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質のことである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」とは、配列番号３で示されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、蛍光を発する蛋白質のことであり、例えば、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＰｌｕｍ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等のｍＡｐｐｌｅホモログがあげられる。

あるいは、配列番号３で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号３で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、蛍光を発する蛋白質のことである。

本発明において、ｍＡｐｐｌｅの蛍光特性に影響を及ぼす「ホットスポットアミノ酸残基」とは、改変ｍＡｐｐｌｅを作成する際に、その改変位置の指標となるｍＡｐｐｌｅ上のアミノ酸残基であり、該アミノ酸残基の近傍でｍＡｐｐｌｅの構造を改変することにより、所望の改変ｍＡｐｐｌｅを作成することを可能とするものである。本発明において推定されるｍＡｐｐｌｅのホットスポットアミノ酸残基は、配列番号３で示されるＧＦＰのアミノ酸配列中、第１５１番目のアミノ酸である。

ｍＡｐｐｌｅの構造を改変するとは、好ましくは、推定されるホットスポットアミノ酸残基の近傍（好ましくは、ホットスポットアミノ酸残基の前後５アミノ酸の範囲内の各位置）でｍＡｐｐｌｅを切断し、さらに切断部位から適切な数のアミノ酸（好ましくは１−１０個のアミノ酸）を除去し、必要に応じてｍＡｐｐｌｅ本来のＮ末端と本来のＣ末端とを適切なアミノ酸配列で連結することをいう。

特定部位のアミノ酸残基を置換した改変ｍＡｐｐｌｅとは、配列番号３で示されるｍＡｐｐｌｅのアミノ酸配列上、特定部位のアミノ酸残基（好ましくは１番目及び／又は８番目及び／又は５２番目及び／又は５４番目及び／又は７６番目及び／又は１３６番目及び／又は１５１番目及び／又は１５２番目及び／又は１６９番目及び／又は１７１番目及び／又は２１９番目のアミノ酸残基）を、いずれかのアミノ酸に置換（例えば、１番目のアミノ酸をＩｓｏ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＬｅｕに置換し、８番目のアミノ酸をＧｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＡｓｐに置換し、５２番目のアミノ酸をＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくは、Ｖａｌに置換し、５４番目のアミノ酸をＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＶａｌに置換し、７６番目のアミノ酸をＩｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＰｒｏＧｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＡｌａに置換し、１３６番目のアミノ酸をＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＰｒｏに置換し、１５１番目のアミノ酸をＩｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＶａｌに置換し、１５２番目のアミノ酸をＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＳｅｒに置換し、１６９番目のアミノ酸をＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＧｌｙに置換し、１７１番目のアミノ酸をＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＡｒｇに置換し、２１９番目のアミノ酸をＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ、特に好ましくはＣｙｓに置換）したｍＡｐｐｌｅを用いて、上記にあるように構造を改変したｍＡｐｐｌｅをいう。

改変ｍＡｐｐｌｅの特に好ましい例としては、配列番号３で示される配列の１５１番目〜２３６番目までのアミノ酸配列であって、１５１番目のアミノ酸をＶａｌに置換し、１５２番目のアミノ酸をＳｅｒに置換し、１６９番目のアミノ酸をＧｌｙに置換し、１７１番目のアミノ酸をＡｒｇに置換し、２１９番目のアミノ酸をＣｙｓに置換したアミノ酸配列をＮ末端側とし、配列番号３で示される配列の１番目〜１５０番目までのアミノ酸であって、１番目のアミノ酸をＬｅｕに置換し、８番目のアミノ酸をＡｓｐに置換し、５２番目のアミノ酸をＶａｌに置換し、５４番目のアミノ酸をＶａｌに置換し、７６番目のアミノ酸をＡｌａに置換し、１３６番目のアミノ酸をＰｒｏに置換したアミノ酸をＣ末端側として、適切なアミノ酸配列により連結したものが挙げられる。
なお、配列番号３において、５２番目と５４番目のアミノ酸置換については、本発明において初めて見出されたものである。他の位置のアミノ酸置換については、Zhao et al., Science 333:1888-1891 2011（非特許文献１）を参照した。

機能性分子とは、機能性分子自身が、該分子に作用する因子の結合等の作用により、立体構造に変化を起こし得る分子であって、改変ｍＡｐｐｌｅに連結することで、自身の立体構造の変化を該改変ｍＡｐｐｌｅに伝え得る分子のことである。この際、該機能性分子は、自身の立体構造の変化を前記改変ｍＡｐｐｌｅに伝えることにより、前記改変ｍＡｐｐｌｅの立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する。

従って、機能性分子は、自身の立体構造の変化を改変ｍＡｐｐｌｅに伝達し改変ｍＡｐｐｌｅの構造に変化を及ぼし得る位置で、改変ｍＡｐｐｌｅに連結されている必要がある。従って機能性分子は、本来のｍＡｐｐｌｅ構造を改変した部分に近接して連結されていることが好ましい。具体的には、ｍＡｐｐｌｅを切断した位置にリンカー分子を介して連結されていることが好ましい。

このような機能性分子は、一分子であってもよいし、二分子以上であってもよい。二分子の場合、機能性分子に作用する因子は、まず一方の機能性分子の立体構造に変化を及ぼし、次いでその立体構造が改変ｍＡｐｐｌｅの立体構造に変化を起こさせる。本発明における機能性分子としては、カルモジュリン蛋白質とミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質との組み合わせが挙げられる。

また、改変ｍＡｐｐｌｅに連結する機能性分子は、その機能性分子が生体内で発現している通りの全構造を有する必要はなく、機能性分子に作用する因子が結合する部位のみを有する一部構造であってもよい。本発明における好ましい例としては、カルモジュリン蛋白質、及び配列番号７に示すカルモジュリン結合機能を有するミオシン軽鎖キナーゼの一部を機能性分子として挙げることができる。このような機能性分子を改変ｍＡｐｐｌｅに適式に連結することで、該融合蛋白質はカルシウムセンサーとして機能し得る。

ここで機能性分子として使用したラットカルモジュリン蛋白質の１番目のアミノ酸から１４８番目のアミノ酸配列を配列番号９に示す。この機能性分子においても、特定の部位のアミノ酸残基が置換されていることが望ましい。例えば、配列番号９で示される配列中、６３番目及び／又は７７番目及び／又は１０１番目及び／又は１１１番目及び／又は１２７番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列などを好ましいアミノ酸置換の例として挙げることができる。
なお、ここで示すアミノ酸の好ましい位置については、Zhao et al., Science 333:1888-1891 2011（非特許文献１）を参照した。

リンカーとは、上記改変ｍＡｐｐｌｅの切断部位、該改変ｍＡｐｐｌｅと上記機能性分子間の連結部位、及び改変ｍＡｐｐｌｅと機能性分子を連結してなる蛋白質とそのＮ末端側にあるアミノ酸配列（本発明においては配列番号１で示されるアミノ酸配列）との連結部位に位置する数残基のアミノ酸からなるペプチドである。各リンカー分子を区別するべく、以下のような名称を付している。

改変ｍＡｐｐｌｅと機能性分子からなる融合蛋白質全体のＮ末端に存在する配列番号１で示されるアミノ酸配列（上記配列（ａ））とミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質又はカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列とを連結するリンカーをリンカーＡと称する。リンカーＡは、Ｍｅｔを含む任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは１〜１０残基のアミノ酸ペプチドであり、より好ましくは、３つのアミノ酸からなる配列Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（ここでＸａａ１及びＸａａ２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である；配列番号２）、さらに好ましくは、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号５）またはＭｅｔ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号６）である。

改変ｍＡｐｐｌｅのＮ末端側と機能性分子を連結するリンカーはリンカーＢと称し、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０残基のアミノ酸ペプチドであり、より好ましくは、２つのアミノ酸からなる配列Ｘａａ３−Ｘａａ４（ここでＸａａ３およびＸａａ４はいずれもＩｓｏ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、ＧｌｙおよびＡｌａからなる群から選択される何れか一のアミノ酸である）、さらに好ましくは、Ｐｒｏ−Ｖａｌである。

改変ｍＡｐｐｌｅのＣ末端側と機能性分子を連結するリンカーはリンカーＣと称し、Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｔｙｒ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ又はＴｈｒであり、特に好ましくはＴｈｒ−Ａｒｇである。

機能性分子のＣ末端側に連結するリンカーはリンカーＤと称し、１５個のアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０（ここでＸａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９及びＸａａ１０はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（配列番号１０）であり、特に好ましい例としては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（配列番号１１）が挙げられる。

なお、ｍＡｐｐｌｅの本来のＮ末端とＣ末端とを連結するアミノ酸ペプチドもリンカーであり、好ましくは、アミノ酸２〜１０残基からなるペプチドであり、Ｇｌｙを多く含むものが好ましく、さらに好ましくは、６つのアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ６（ここでＸａａ５及びＸａａ６はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である；配列番号４）であり、特に好ましい例としては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号８）が挙げられる。

本発明でのカルシウムセンサー蛋白質とは、当該蛋白質に含まれる機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子であるカルシウムを作用させることで該機能性分子の立体構造に影響を与え、該立体構造の変化がカルシウムセンサー蛋白質に含まれる改変ｍＡｐｐｌｅの立体構造に影響を与えることで、該改変ｍＡｐｐｌｅの蛍光特性を可逆的に変化させる蛋白質をいう。この変化は、蛍光顕微鏡若しくはレーザー顕微鏡等で捉えることが出来る程度の変化をいい、好ましくは肉眼で捉えることが出来る程度の変化をいう。蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ／Ｆが、好ましくは、少なくとも０．１以上変化すること、より好ましくは１以上の範囲で変化することをいう。

本発明において蛍光特性とは、蛍光強度、蛍光波長、蛍光強度比、吸光度、吸光波長などの蛍光特性を指す。本発明では蛍光特性の一例として、蛍光強度を使用する。

本発明において、蛍光特性が蛍光強度である場合、カルシウムセンサー蛋白質は、蛍光を発する状態と蛍光を発しない状態の臨界状態にある。この臨界状態においてカルシウムセンサー蛋白質は、蛍光を発しない状態にあってもよいし、蛍光強度の低い状態にあってもよい。あるいは蛍光強度の高い状態にあってもよい。ここで、蛍光を発しないとは、光学機器を使用して蛍光を確認できないことをいう。蛍光強度が低いとは、カルシウムの存在により、上記の変化量（ΔＦ／Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が高い状態に変化し得る程度に低いことをいう。同様に、蛍光強度が高いとは、カルシウムの存在により、上記の変化量（ΔＦ／Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が低い状態に変化し得る程度に高いことをいう。

本発明におけるカルシウムセンサー蛋白質は、従来のカルシウムセンサー蛋白質に比べ、上記のように配列（ａ）、改変ｍＡｐｐｌｅ及びラットカルモジュリンの特定部位のアミノ酸残基を置換し、上記のような特定のリンカーを用いることにより、カルシウム作用時に、より大きな蛍光特性の変化を引き起こすことを特徴とする。ここでより大きな蛍光特性変化とは、蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ／Ｆが、従来のカルシウムセンサー蛋白質よりも大きく、好ましくは、２倍以上増強されることをいう。

融合蛋白質の作成は、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。例えば、融合したい各蛋白質部分をコードする遺伝子（即ち、特定アミノ酸部位の弛緩を伴う改変ｍＡｐｐｌｅ及び機能性分子をコードする遺伝子）の断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、これら断片を繋ぎ合わせることにより融合遺伝子を作成し、次いで、該融合遺伝子を含むプラスミドを所望の細胞に導入して発現させることにより、融合蛋白質は作られる。

また、本発明においてカルシウムセンサー遺伝子は、本発明のカルシウムセンサー蛋白質をコードする遺伝子のことをいう。該カルシウムセンサー遺伝子は、上記にあるように、作成したいカルシウムセンサー蛋白質を構成する各構成部分をコードする遺伝子断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、次いで、これら各遺伝子断片を連結させることにより、融合遺伝子の形で作成され得る。

本発明において作成されたカルシウムセンサー蛋白質は、細胞内及び細胞外でカルシウム濃度をより安定に、かつ高感度に測定することが出来る。

例えば、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を大腸菌などに導入して予め産生されたカルシウムセンサー蛋白質と検体とを混合することによりカルシウム濃度を測定することが可能である。また、大腸菌などを使用して産生させた蛋白質を、カルシウム濃度を測定したい細胞に直接注入することにより、細胞内のカルシウム濃度を測定することも可能である。あるいは、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を、カルシウム濃度を測定したい細胞に導入して細胞に蛋白質を産生させることにより、細胞内のカルシウム濃度を測定することも可能である。

カルシウム濃度の測定は、ある特定の波長の光（例えば、５６８ｎｍの励起光）をカルシウムセンサー蛋白質に当てることにより、該蛋白質の発する蛍光特性を光学機器（例えば、レーザー顕微鏡）で検出することにより行う。なお、濃度測定に使用するカルシウムセンサー蛋白質が、どのくらいのカルシウム濃度でどのような蛍光特性を示すのか、予め調べておくことが必要である。具体的には、例えば、大腸菌により産生したカルシウムセンサー蛋白質により、蛍光分光光度計を用いて種々のカルシウム濃度に対する蛍光強度変化を測定しておくことが必要である（例えば、図４を参照のこと）。本測定により、Ｋｄ１７４ｎＭ、Ｈｉｌｌ係数１．５８、最大蛍光変化量２８．７という結果を得た。

以下に本発明の実施例を示すが、これらの実施例はあくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

本発明のカルシウムセンサー蛋白質であるＲ−ＣａＭＰ１．０７の特性
本発明のカルシウムセンサー蛋白質であるＲ−ＣａＭＰ１．０７、その前駆体であるＲ−ＣａＭＰ１．０１および従来のカルシウムセンサー蛋白質であるＲ−ＧＥＣＯ１について、これらの蛋白質をコードする遺伝子をヒト子宮癌由来株化細胞であるＨｅＬａ細胞に導入して、カルシウムセンサーとしての性能を評価した。まず細胞内局在部位について検討した結果、Ｒ−ＧＥＣＯ１およびＲ−ＣａＭＰ１．０１はいずれも細胞質と核内への局在を示したのに対し、Ｒ−ＣａＭＰ１．０７は細胞質には局在するが核内には局在しないことがわかった（図１）。

次いでＲ−ＧＥＣＯ１、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１およびＲ−ＣａＭＰ１．０７を発現させたＨｅＬａ細胞に、該細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を増大させることが既知である、ＡＴＰ（０．１ｍＭ）を作用させた。その時の反応例を図２に示す。従来のカルシウムセンサー蛋白質Ｒ−ＧＥＣＯ１よりも本発明のカルシウムセンサー蛋白質であるＲ−ＣａＭＰ１．０７およびその前駆体であるＲ−ＣａＭＰ１．０１の方が、大きな蛍光強度の上昇を示すことがわかった。

本発明のカルシウムセンサー蛋白質Ｒ−ＣａＭＰ１．０７およびその前駆体であるＲ−ＣａＭＰ１．０１を発現させたＨｅＬａ細胞でのＡＴＰに対する蛍光強度の変化量は、従来のカルシウムセンサー蛋白質Ｒ−ＧＥＣＯ１のそれに比して両者とも約１．７倍大きいことを確認した。（図３）。
さらに、本発明のカルシウムセンサー蛋白質Ｒ−ＣａＭＰ１．０７およびその前駆体Ｒ−ＣａＭＰ１．０１の精製蛋白質溶液、およびＲ−ＧＥＣＯ１を含む細胞破砕液を用いて試験管レベルでカルシウム濃度と蛍光量との関係を検討した結果、Ｒ−ＣａＭＰ１．０７およびＲ−ＣａＭＰ１．０１は、Ｒ−ＧＥＣＯ１と比較すると、カルシウムイオンの有無での蛍光強度変化量が各々約２倍および約１．４倍大きい（カルシウムイオンの有無での蛍光強度の比率を求めると、Ｒ−ＣａＭＰ１．０７は２８．７倍でありＲ−ＣａＭＰ１．０１は２０．３倍であるのに対し、Ｒ−ＧＥＣＯ１は１４．２倍である）ことを確認した（図４）。
このように本発明のカルシウムセンサー蛋白質Ｒ−ＣａＭＰ１．０７およびその前駆体Ｒ−ＣａＭＰ１．０１は、従来のカルシウムセンサー蛋白質Ｒ−ＧＥＣＯ１に比して、より高い蛍光反応性を示すことが証明されている。またＲ−ＣａＭＰ１．０７は、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１およびＲ−ＧＥＣＯ１と異なり、細胞に発現させた場合に細胞質には局在するが核内には局在しないという、細胞質カルシウム濃度測定に適した局在パターンを示すことが証明されている。

カルシウムセンサー蛋白質Ｒ−ＣａＭＰ１．０７の製法及び測定法
（Ａ）Ｒ−ＣａＭＰ１．０７の製法
（Ａ−１）細菌発現用および哺乳動物発現用のプラスミド構築
Ｒ−ＣａＭＰ１．０７の細菌発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ_Ｂ−Ｒ−ＣａＭＰ１．０７及び哺乳動物発現用プラスミドであるｐＮ１−Ｒ−ＣａＭＰ１．０７は、非特許文献１（Science 333(6051):1888-1891,2011）に記載のＲ−ＧＥＣＯ１（配列番号２４）をコードするｃＤＮＡ（配列番号２５）を用いて後述のように構築した。
すなわち、まずＲ−ＧＥＣＯ１をコードするｃＤＮＡを化学的な遺伝子合成により構築し、そのｃＤＮＡを用いてＲ−ＧＥＣＯ１の細菌発現用プラスミドｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｒ−ＧＥＣＯ１および哺乳動物発現用プラスミドｐＮ１―Ｒ−ＧＥＣＯ１を構築した。次にＲ−ＧＥＣＯ１の蛋白質精製を可能にするため、Ｒ−ＧＥＣＯ１のＮ末端にＲＳＥＴタグ（蛋白質精製用のＨｉｓ6タグを含む）（配列番号２３）を付加したクローンであるｄＲＧｅｃの細菌発現用プラスミドｐＲＳＥＴ_Ｂ―ｄＲＧｅｃを構築した。さらに蛍光変化量の大きいｄＲＧｅｃの変異体の開発を目指して、ｐＲＳＥＴ_Ｂ―ｄＲＧｅｃをテンプレートとしたランダムＰＣＲによりｄＲＧｅｃの改変ｍＡｐｐｌｅ部分にさまざまな変異を導入した変異体を作製した。このＰＣＲ産物で大腸菌ＫＲＸを形質転換して明るく赤色蛍光を発し、かつカルシウムの有無での明るさの差が大きいｄＲＧｅｃの変異体クローンをスクリーニングした結果、ｄＲＧｅｃ（Ｋ５２Ｖ／Ｔ５４Ｖ）を発見した。このクローンをＲ−ＣａＭＰ１．０１（配列番号１６（アミノ酸配列）、配列番号１７（核酸配列））と命名した。次にＲ−ＣａＭＰ１．０１の細菌発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｒ−ＣａＭＰ１．０１を用い、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１の哺乳動物発現用プラスミドであるｐＮ１―Ｒ−ＣａＭＰ１．０１を構築した。

次に、カルシウムセンサー蛋白質の構造は一般的に非常に繊細であり、その性能がＮ末端やＣ末端へのペプチド融合により修飾されることが知られていることから、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１の改良の一環として、該センサー蛋白質へのＮ末端やＣ末端へのペプチド融合を検討した。ここではＲ−ＣａＭＰ１．０１のC末端への１５アミノ酸のリンカー配列（配列番号１１）およびＦ２Ａ配列（配列番号１２）で構成されるペプチドを融合させた実施例を述べる。１５アミノ酸のリンカー配列（配列番号１１）およびＦ２Ａ配列（配列番号１２）をＣ末端に付加させたＲ−ＣａＭＰ１．０１改変体をＲ−ＣａＭＰ１．０７（配列番号１８（アミノ酸配列）、配列番号１９（核酸配列））と命名し、その細菌発現用プラスミドｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｒ−ＣａＭＰ１．０７および哺乳動物発現用プラスミドｐＮ１―Ｒ−ＣａＭＰ１．０７を構築した。

より具体的には、１番目にまずＲ−ＧＥＣＯ１のｃＤＮＡを化学合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）し、これをＮｄｅＩ−ＮｏｔＩで消化した１．２６ｋｂの断片をｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｇ−ＣａＭＰ６（特許文献３）をＮｄｅＩ−ＮｏｔＩで消化した２．７７ｋｂの断片とライゲーションさせてＲ−ＧＥＣＯ１の細菌発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｒ−ＧＥＣＯ１を構築した。またｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｒ−ＧＥＣＯ１をＳａｌＩ−ＮｏｔＩで消化した１．２５ｋｂの断片をｐＮ１―Ｇ−ＣａＭＰ（特許文献１）をＳａｌＩ−ＮｏｔＩで消化した３．９６ｋｂの断片とライゲーションさせてＲ−ＧＥＣＯ１の哺乳動物発現用プラスミドであるｐＮ１―Ｒ−ＧＥＣＯ１を構築した。次にｐＮ１―Ｒ−ＧＥＣＯ１をＳａｌＩ−ＮｏｔＩで消化した１．２５ｋｂの断片をｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｇ−ＣａＭＰ６（特開２０１２−８５５４２）をＳａｌＩ−ＮｏｔＩで消化した２．８８ｋｂの断片とライゲーションさせてＲ−ＧＥＣＯ１のＮ末端にＲＳＥＴタグ（配列番号２３）を付加したクローンであるｄＲＧｅｃの細菌発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ_Ｂ―ｄＲＧｅｃを構築した。

２番目に、ｐＲＳＥＴ_Ｂ―ｄＲＧｅｃをテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−AGCTATAGGTCGGCTGAGCTCA−３’（Ｍ１３（Ｓａｃａ））（配列番号２０）
５’−CTTCAGTCAGTTGGTCACGCGT−３’（ｒＣａＭ（Ｍｌｕ））（配列番号２１）
を用いてＰＣＲによるランダム変異導入を後述の方法で行った。このＰＣＲ産物をＳａｃＩとＭｌｕＩで消化した０．７４ｋｂの断片をＳａｃＩとＭｌｕＩで消化したｐＲＳＥＴ_Ｂ―ｄＲＧｅｃの３．３９ｋｂの断片とライゲーションさせてｐＲＳＥＴ_Ｂ―ｄＲＧｅｃ（ｒａｎｄｏｍ）を構築した。ｐＲＳＥＴ_Ｂ―ｄＲＧｅｃ（ｒａｎｄｏｍ）で大腸菌ＫＲＸを形質転換して明るく赤色蛍光を発し、かつカルシウムの有無での明るさの差が大きいｄＲＧｅｃの変異体クローンをスクリーニングした結果、ｄＲＧｅｃの改良体であるｄＲＧｅｃ（Ｋ５２Ｖ／Ｔ５４Ｖ）を発見した。このクローンをＲ−ＣａＭＰ１．０１（配列番号１６（アミノ酸配列）、配列番号１７（核酸配列））と命名した。Ｒ−ＣａＭＰ１．０１の細菌発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｒ−ＣａＭＰ１．０１をＳａｌＩとＮｏｔＩで消化した１．２５ｋｂの断片をｐＮ１―Ｇ−ＣａＭＰ６（特許文献３）をＳａｌＩとＮｏｔＩで消化した４．０６ｋｂの断片とライゲーションさせてＲ−ＣａＭＰ１．０１の哺乳動物発現用プラスミドであるｐＮ１−Ｒ−ＣａＭＰ１．０１を構築した。

３番目に、カルモジュリンのＣ末端部分（１２９〜１４８番目のアミノ酸を含む）、１５アミノ酸のリンカー配列（配列番号１１）およびＦ２Ａ配列（配列番号１２）を含むｃＤＮＡを化学合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）し、これをＣｌａＩ−ＮｏｔＩで消化した０．１７ｋｂの断片をｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｒ−ＣａＭＰ１．０１をＣｌａＩ−ＮｏｔＩで消化した４．０７ｋｂの断片とライゲーションさせて１５アミノ酸のリンカー配列およびＦ２Ａ配列をＣ末端に付加させたＲ−ＣａＭＰ１．０１改変体であるＲ−ＣａＭＰ１．０７の細菌発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｒ−ＣａＭＰ１．０７を構築した。ｐＲＳＥＴ_Ｂ―Ｒ−ＣａＭＰ１．０７をＳａｌＩとＮｏｔＩで消化した１．３６ｋｂの断片をｐＮ１―Ｇ−ＣａＭＰ６（特許文献３）をＳａｌＩとＮｏｔＩで消化した４．０６ｋｂの断片とライゲーションさせてＲ−ＣａＭＰ１．０７の哺乳動物発現用プラスミドであるｐＮ１−Ｒ−ＣａＭＰ１．０７を構築した。

ＰＣＲによるランダム変異導入は以下のように行った。すなわち詳細には、まずテンプレートのプラスミドを１μｇ、１０ｘバッファーを５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ、１０μＭのフォワードプライマー（配列番号２０）を１μｌ、１０μＭのリバースプライマー（配列番号２１）を１μｌ、５ｍMのＭｎＣｌ₂を１．５μｌ、ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を１μｌ、水を加えて全量を４７μｌとした混合液を４つ用意した。４つの混合液にはさらに各々１）１０ｍＭのｄＴＴＰを１μｌ、１０ｍＭのｄＧＴＰを１μｌ、１０ｍＭのｄＣＴＰを１μｌ、または２）１０ｍＭのｄＡＴＰを１μｌ、１０ｍＭのｄＧＴＰを１μｌ、１０ｍＭのｄＣＴＰを１μｌ、または３）１０ｍＭのｄＡＴＰを１μｌ、１０ｍＭのｄＴＴＰを１μｌ、１０ｍＭのｄＣＴＰを１μｌ、または４）１０ｍＭのｄＡＴＰを１μｌ、１０ｍＭのｄＴＴＰを１μｌ、１０ｍＭのｄＧＴＰを１μｌ、を加えて各々全量を５０μｌとし、下記の条件に付した。

ステップ１
摂氏９４度２分
ステップ２
摂氏９４度３０秒
摂氏５５度３０秒
摂氏６８度３０秒
上記を３８サイクル
ステップ３
摂氏６８度１分
上記の４つの混合液から各々２．５μｌずつを取って混合した１０μｌを下記の方法でアガロース電気泳動に付し、ＰＣＲ産物の確認を行った。

制限酵素によるＤＮＡの切断はＮＥＢ社、Ｔｏｙｏｂｏ社、またはＴａｋａｒａ社の制限酵素、およびその添付バッファーと添付ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ（１００ｘＢＳＡ）を用いて行った。反応は、１〜２μｇのＤＮＡに添付バッファー（３μｌ）、添付１００ｘＢＳＡ（０．３μｌ）および各制限酵素（１０ユニット）を加えて全量を３０μｌとした中で、摂氏３７度で１〜３時間行った。

アガロースゲル（ＡｇａｒｏｓｅＬＥ、ナカライテスク）は、ＴＡＥバッファー（４．９８ｇ／ｌＴｒｉｓｂａｓｅ（ナカライテスク）、１．１４２ｍｌ／ｌ氷酢酸（ナカライテスク）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）（Ｄｏｊｉｎｄｏ））にて加熱溶解し、１％または２％となるように調製した。λＨｉｎｄIIIｄｉｇｅｓｔ（Ｔｏｙｏｂｏ）または１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）をＤＮＡサイズマーカーとして、ＤＮＡ試料は制限酵素に添付されている１０ｘサンプルバッファーを１／１０量と、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）にて１００倍希釈したＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１／１０量加えたものを、ＴＡＥバッファーを用いて１００Vにて電気泳動を行い、ＳａｆｅＩｍａｇｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。

ゲルからのＤＮＡの回収にはＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、まずアガロースゲル電気泳動後ＳａｆｅＩｍａｇｅｒ上で目的のバンドをなるべく小さくなるようにメスで切り出し、吸着液を４００μｌ加えて室温に放置してゲルを完全に溶解させた。次に磁性ビーズを３０μｌ加えて時々撹拌しながら室温に２分放置した。ＤＮＡを吸着した磁性ビーズはマグネットスタンドを用いて吸着し、上清は捨てた。回収した磁気ビーズに洗浄液を６００μｌ加えてボルテックスミキサーで１０秒撹拌し、マグネットスタンドを用いてＤＮＡを吸着した磁性ビーズを同様の手法で回収した。これに７５％エタノールを１ｍｌ加えてボルテックスミキサーで１０秒撹拌し、ＤＮＡを吸着した磁性ビーズはマグネットスタンドを用いて回収した。これをスピンダウンして完全に上清を捨て、５５度で2分間乾燥させた後、水又はＴＥを２５〜１００μｌ加えて時々撹拌しながら、室温で２分間放置した。ＤＮＡを解離させた後の磁性ビーズはマグネットスタンドを用いて分離し、ＤＮＡを含む上清を回収した。

Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応にはＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、約２５ｆｍｏｌのプラスミドベクターおよび約２５〜２５０ｆｍｏｌのインサートＤＮＡの混合溶液に等量のＬｉｇａｔｉｏｎＭｉｘを添加して混和した後、摂氏１６度で３０分間反応させた。

形質転換はＥ．ｃｏｌｉコンピテントセルＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ）、またはＫＲＸ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。詳細には、１００μｌのコンピテントセルを氷上にて溶解し、ＤＮＡ溶液１μｌまたはＬｉｇａｔｉｏｎ反応液１μｌを加えて氷上で３０分間放置した後、摂氏４２度で４５秒間加熱した。その後さらに氷上で５分間放置し、ＬＢ培地５００μｌを加えて摂氏３７度で１時間培養後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む選択培地（ＬＢ培地）に植えて、摂氏３７度にて一晩培養した。翌日、コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１〜５ｍｌの液体培地（ＬＢ培地）に植えつぎ、摂氏３７度にて１６時間培養した。

大腸菌からのプラスミドの回収にはＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、まず５ｍｌの大腸菌培養液を約２，０００ｘｇ、１０分の遠心に付し、上清をデカンテーションまたはピペッティングで除去して大腸菌の沈殿を得た。この沈殿に氷冷したＲＮａｓｅ入りＰ１バッファーを２５０μｌ加えてサスペンドし、Ｐ２バッファーを２５０μｌ加えて室温に５分放置してアルカリＳＤＳにより菌体を破砕した。その後Ｎ３バッファーを３５０μｌ加えて中性化した。その菌体破砕液をｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎに移し、約１３，２００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してプラスミドをカラムに吸着させた。カラム素通り液はデカンテーションにて除去した。次にカラムにＰＥバッファーを７５０μｌ加えて約１３，２００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してカラムを洗浄した。カラム素通り液はデカンテーションにて除去した。さらにバッファーを加えずにもう一度約１３，２００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してカラムに残った液滴を完全に除去した。カラムを新しい回収用マイクロチューブにとりつけ、カラムにＥＢバッファーを５０μｌ加えて約１３，２００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してカラムからプラスミドを溶出し回収した。

ＬＢ液体培地
１０ｇ／ｌＢａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌＢａｃｔｏ−ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌＮａＣｌ（ナカライテスク）、１ｇ／ｌｇｌｕｃｏｓｅ（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ）。オートクレーブにて滅菌して調製。

ＬＢ寒天培地
１０ｇ／ｌＢａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌＢａｃｔｏ−ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌＮａＣｌ（ナカライテスク）、１ｇ／ｌｇｌｕｃｏｓｅ（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ）、１５ｇ／ｌＡｇａｒ（ナカライテスク）。オートクレーブにて滅菌後、温度が４５度程度まで下がったところで抗生物質（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ））を加え、プラスチックディシュに流し込んで調製。
ＴＥ（ｐＨ８）（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ, １ｍＭＥＤＴＡ）（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ）

（Ａ−２）蛋白質の精製
Ｒ−ＣａＭＰ１．０７およびＲ−ＣａＭＰ１．０１の蛋白質精製にはこれらの蛋白質がＨｉｓタグを持っていることを利用して、Ｈｉｓタグに特異的に結合するＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、ｐＲＳＥＴ_Ｂ−Ｒ−ＣａＭＰ１．０７をＥ．ｃｏｌｉコンピテントセルＫＲＸに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ選択培地に植え、摂氏３７度で一晩培養した。コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌの液体培地（ＬＢ培地）に植えつぎ、摂氏３７度にて１６時間培養した。培養液１０ｍｌをさらに１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌの液体培地（ＬＢ培地）に植えつぎ、吸光度ＯＤ６００で０．５〜１となるまで摂氏３７度で培養した後、最終濃度が１％になるようにラムノース（プロメガ）を加えて、摂氏１８〜２２．５度で４〜５時間さらに培養した。

３，０００回転１５分遠心して（６２００遠心機、Ｋｕｂｏｔａ）、大腸菌を回収した。１ｍｌのＬＢ培地で大腸菌を懸濁した。摂氏−２０度で３０分凍らせたのち、室温で３０分解凍した。もう１度凍結、解凍を繰り返した。氷上で冷やした４０ｍｌのｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク）、蛋白分解酵素阻害剤（０．１ｍＭＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌロイペプチン（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ））を加え、よく混ぜて大腸菌を懸濁した。摂氏４度にて１００,０００ｘｇで１５分間遠心し、上清を得た。５ＭＮａＣｌを最終濃度が０．３Ｍとなるように加え、２ｍｌの５０％Ｎｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ；蛋白質結合能５〜１０ｍｇ／ｍｌレジン）をさらに加えて１時間室温でおだやかに混ぜて反応させた。反応液を空のカラム（エコノカラム；カラムサイズ〜２０ｍｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に移し、余分の液がカラムから滴下してなくなるのを待った。１０ｍｌの洗浄液（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８）（ナカライテスク）、０．３ＭＮａＣｌ、２０ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ナカライテスク））で2回洗浄した後、３〜４ｍｌの回収液（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８）（ナカライテスク）、０．３ＭＮａＣｌ、２５０ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ナカライテスク））にて溶出し、Ｈｉｓタグ付きの蛋白質をカラムから回収した。次に、回収した液を透析チューブ（Ｓａｎｋｏｕｊｕｎｙａｋｕ）に入れて１２５ｍｌまたはそれ以上のＫＭバッファー（０．１ＭＫＣｌ（ナカライテスク）、２０ｍＭＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）（Ｄｏｊｉｎｄｏ））で摂氏４度にて透析した。ＫＭバッファーは４〜５時間ごとに交換し、液交換を３回以上行った後、透析チューブから蛋白質の溶液を回収した。

蛋白質の濃度測定にはプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、操作はそのマニュアルに従ってＢｒａｄｆｏｒｄ法（Bradford, M. M. Anal. Biochem. 1976, 72, 248―254.）で測定した。まず、１０〜２００μｇ／ｍｌとなるように水で希釈した蛋白質の溶液５０μｌにＢｒａｄｆｏｒｄ試薬を１ｍｌ加えて３０分後に５９５ｎｍの吸光度を測定した。蛋白質の基準濃度は牛血清アルブミンを基準蛋白質として用いて測定して求めた。測定は室温にて行った。

（Ｂ）Ｒ−ＣａＭＰ１．０７を用いた測定法
（Ｂ−１）カルシウム結合能の測定
Ｒ−ＣａＭＰ１．０７蛋白質のカルシウム結合能はさまざまなカルシウム濃度溶液中における蛍光強度を測定して得られたカルシウム濃度―蛍光強度の容量反応曲線に基づいて算出した。既述のように精製したＲ−ＣａＭＰ１．０７蛋白質はＫＭバッファーで最終濃度が０．３μＭとなるように希釈した。蛍光強度測定には、蛍光分光光度計Ｆ−２５００（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用い５６０ｎｍで励起し５８５ｎｍで蛍光を記録した。まず測定標品に２０ｍＭＢＡＰＴＡ（（Ｄｏｊｉｎｄｏ））を添加してカルシウム非存在下における測定を行った後、逐次ＣａＣｌ_２をさまざまな濃度になるように添加して測定した。測定は室温にて行った。

（Ｂ−２）ＨｅＬａ細胞の培養とプラスミドの導入
炭酸ガス培養器を用いて、培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘペニシリン・ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））にてＨｅＬａ細胞を摂氏３７度で培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養細胞にｐＮ１−Ｒ−ＣａＭＰ１．０７のプラスミドを導入した。導入操作は試薬のマニュアルに従って行った。まず、血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌでプラスミド０．８μｇを希釈した。次に２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌに加え室温で５分放置した。その後両希釈液を混合して室温で２０分放置した。この混合液の全量を２４穴培養シャーレ中のＨｅＬａ細胞に投与してプラスミドを導入した。プラスミドを導入した後細胞は摂氏３７度で１〜３日培養した。

（Ｂ−３）ＨｅＬａ細胞での蛍光測定
蛍光測定にはコンピューターにて制御（アクアコスモス（浜松ホトニクス））されたＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ−ＥＲ、浜松ホトニクス）を搭載した倒立蛍光顕微鏡（ＩＸ７０（オリンパス）、ＷＩＹフィルターセット（オリンパス）、対物レンズ２０ｘ（オリンパス））を用いた。プラスミドを導入した細胞を顕微鏡にセットし、ＨＢＳバッファー（１０７ｍＭ NａＣｌ、６ｍＭＫＣｌ、１．２ｍＭＭｇＳＯ_４（ナカライテスク）、２ｍＭＣａＣｌ_２、１．２ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ナカライテスク）、１１．５ｍＭｇｌｕｃｏｓｅ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）（ｐＨ７．４））を細胞外液として還流し、１００μＭＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を細胞外に投与して細胞を刺激し、その際に起こる細胞内カルシウム濃度変化を蛍光強度変化として検出した。測定は室温にて行った。

本発明は、筋肉の収縮、神経興奮性やホルモン分泌、酵素活性の変化などの各種の細胞機能の調節因子として、生体機能の維持および調節に不可欠な役割を担っているカルシウム濃度の生体内での変動を、従来のものに比べ極めて高感度で測定するカルシウムセンサー蛋白質を提供するもので、その利用価値は高く、生体機序の解明や医学・創薬といった分野に大きく貢献するものである。

Claims

下記（ａ）〜（ｋ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質：
（ａ）配列番号１の２番目のＡｒｇが欠失したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６で示されるアミノ酸配列（リンカーＡ）；
（ｃ）配列番号７で示されるアミノ酸配列；
（ｄ）前述の（ｃ）の配列と後述の（ｅ）の配列とを連結するＰｒｏ−Ｖａｌのアミノ酸配列（リンカーＢ）；
（ｅ）配列番号３で示される配列の１５１番目〜２３６番目であって、１５１番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、１５２番目のアミノ酸がＳｅｒに置換され、１６９番目のアミノ酸がＧｌｙに置換され、１７１番目のアミノ酸がＡｒｇに置換され、２１９番目のアミノ酸がＣｙｓに置換されているアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号８で示されるアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号３で示される配列の１番目〜１５０番目までのアミノ酸配列であり、１番目のアミノ酸がＬｅｕに置換され、８番目のアミノ酸がＡｓｐに置換され、５２番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、５４番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、７６番目のアミノ酸がＡｌａに置換され、１３６番目のアミノ酸がＰｒｏに置換されているアミノ酸配列；
（ｈ）前述の（ｇ）の配列と後述の（ｉ）の配列とを連結するＴｈｒ−Ａｒｇのアミノ酸配列（リンカーＣ）；
（ｉ）配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目までのアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列（リンカーＤ）；
（ｋ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
前記請求項１に記載の蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子。