JP6667897B2 - 蛍光特性を示すポリペプチド、およびその利用 - Google Patents
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Description
<1> 以下の(1)〜(4)の何れかに示す、蛍光特性を有するポリペプチド。(1)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(2)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1〜34個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、(3)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するポリペプチド、(4)上記(1)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
<2> 以下の(1)〜(4)の何れかに記載のポリヌクレオチド。(1)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(2)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1〜34個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(3)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(4)上記(1)に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
<3> (a)発現宿主内で機能的な発現制御領域;および、(b)<2>に記載のポリヌクレオチド;を含む、発現カセット。
<4>上記<2>に記載のポリヌクレオチドまたは<3>に記載の発現カセットを含むベクター。
<5>上記<2>に記載のポリヌクレオチド、<3>に記載の発現カセットまたは<4>に記載のベクターを含む形質転換体。
<6>上記<1>に記載のポリペプチドと他のポリペプチドとからなる融合ポリペプチド。
<7>蛍光観察の方法であって、<1>に記載のポリペプチド、あるいは<6>に記載の融合ポリペプチドを細胞において産生させる産生工程と、当該ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに由来する蛍光を観察する観察工程とを含む、方法。
<8>細胞において1以上の目的遺伝子の発現および/または局在性に対する1以上の試験物質の作用を評価する方法であって、i)第一の目的遺伝子と融合されていてもよい上記<2>に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第一の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第一の核酸分子を、細胞内に導入する導入工程、ii)導入工程を経た上記細胞を上記試験物質の存在下および不在下で培養する培養工程、iii)上記細胞における蛍光発光を検出する蛍光検出工程、およびiv)試験物質の存在下および不在下で得られた、上記細胞における蛍光発光を比較して、上記目的遺伝子の発現および/または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価工程、を含む、方法。
<9>上記<2>に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む形質転換体を作製する方法であって、<2>に記載のポリヌクレオチド、<3>に記載の発現カセットまたは<4>に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法。
<10>上記<9>に記載の方法で得られた形質転換体またはその子孫。
<11>上記<2>に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む非ヒトトランスジェニック生物を作製する方法であって、<2>に記載のポリヌクレオチド、<3>に記載の発現カセットまたは<4>に記載のベクターを、ドナー細胞から採取した受精卵に導入する工程を含む、方法。
<12>上記<11>に記載の方法で得られた非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫。
<13>上記<12>に記載の非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫より細胞を採取し、該細胞に初期化因子を導入して多能性幹細胞を作製する方法。
<14>上記<1>に記載のポリペプチド、<2>に記載のポリヌクレオチド、<3>に記載の発現カセット、<4>に記載のベクター、<5>に記載の形質転換体、あるいは<6>に記載の融合ポリペプチドを含む、キット。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言できる。「ポリヌクレオチド」は、特に明記しない場合は、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含有するポリヌクレオチドを包含する。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言できる。特に言及のない限り、「塩基配列」はデオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。また、ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖構造であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
(1−1: 蛍光ポリペプチドA)
本発明に係るポリペプチドAは、以下の(1)〜(4)の何れかに示す、蛍光ポリペプチドである。
(1)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有する蛍光ポリペプチド。
(2)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1〜34個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有する蛍光ポリペプチド。なお、置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸の個数は、1〜25個であることが好ましく、1〜23個であることがより好ましく、1〜12個であることがさらに好ましく、1〜5または6個であることが特に好ましい。以下、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および/または付加を、アミノ酸の変異と総称する場合がある。
(3)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有する蛍光ポリペプチド。なお、配列同一性は、88%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがさらに好ましく、96%以上、97%以上、98%以上、或いは99%以上であることが特に好ましい。
(4)上記(1)に記載の蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる蛍光ポリペプチド。なお、ストリンジェントな条件については、本発明に係るポリヌクレオチドの欄で後述する。
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記蛍光ポリペプチドAの何れかをコードするものである。
(1−1)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(1−2)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1〜34個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸の個数は、1〜25個であることが好ましく、1〜23個であることがより好ましく、1〜12個であることがさらに好ましく、1〜5または6個であることが特に好ましい。
(1−3)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、配列同一性は、88%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがさらに好ましく、96%以上、97%以上、98%以上、或いは99%以上であることが特に好ましい。
(1−4)上記(1−1)に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。このポリヌクレオチドは、上記(1−1)に記載のポリヌクレオチドの塩基配列に対して85%以上の配列同一性を有することが好ましい。当該配列同一性は、88%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがさらに好ましく、96%以上、97%以上、98%以上、或いは99%以上であることが特に好ましい。
本発明に係るポリヌクレオチド(例えばDNA)は、適当なベクター中に挿入して、ベクターとして利用してもよい。ベクターの種類は、プラスミドのような自律的に複製するベクターでもよいし、或いは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞の染色体と共に複製されるものであってもよい。
(形質転換体、および形質転換体の作製方法)
本発明に係るポリヌクレオチド、本発明に係る発現カセット、または、本発明に係るベクターを適当な宿主細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。作製された形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいて、本発明に係る蛍光ポリペプチドの何れかを発現可能である。同様に、本発明に係る形質転換体を用いて得られた当該形質転換体の子孫も、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいて、本発明に係る蛍光ポリペプチドの何れかを発現可能である。作製された形質転換体またはその子孫において、本発明に係るポリヌクレオチドの全長またはその一部は、ゲノム中に組み込まれていることが好ましい。
本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物は、例えば、高等生物である。トランスジェニック植物としては、例えば、シロイヌナズナなどの双子葉植物;ミナトカモジグサ(Brachypodium distachyon)、イネ、コムギ、オオムギなどの単子葉植物;のトランスジェニックが挙げられる。トランスジェニック動物としては、例えば、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、ブタなどのトランスジェニックが挙げられる。
本発明は、例えば、本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物を用いて、そのクローンを作製することも包含する。作製されたクローンは、元となった非ヒトトランスジェニック生物と同様に、ゲノム中に、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいて、本発明に係る蛍光ポリペプチドの何れかを発現可能である。なお、クローンとは、胚細胞クローンも体細胞クローンも含む概念である。
(融合ポリペプチド)
本発明に係る蛍光ポリペプチドと他のポリペプチドとからなる融合ポリペプチド(以下、本発明に係る融合ポリペプチドと称する)も本発明の範疇である。融合ポリペプチドは、例えば、本発明に係る発現カセットおよび/またはベクターの発現によって産生される融合タンパク質;任意のタンパク質を本発明に係る蛍光ポリペプチドで標識した融合タンパク質;本発明に係る蛍光ポリペプチドと、蛍光を安定化させるための所定のペプチド配列とが融合してなる融合タンパク質;本発明に係る蛍光ポリペプチドと他の蛍光ポリペプチドとを備えたFRET用プローブ;などが挙げられる。すなわち、本発明に係る蛍光ポリペプチドと融合させる他のポリペプチドの種類は特に限定されない。本発明に係る融合ポリペプチドは、本発明に係る蛍光ポリペプチドと同様の方法によって、化学合成されても、或いは、遺伝子組み換え技術を用いて産生されてもよい。
また、本発明に係る蛍光ポリペプチドに特異的に結合する抗体も本発明の範疇に含まれる。
本発明は、本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物の細胞から、多能性幹細胞を作製する方法も包含する。多能性幹細胞を作製する方法は、本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物から採取した細胞(出発細胞と称する場合もある)に初期化因子を導入する、或いは当該細胞を初期化因子で処理することによって、多能性幹細胞を作製する工程(初期化工程)、を含んでなる。なお、非ヒトトランスジェニック生物は、例えば、非ヒトトランスジェニック高等動物であり、中でも非ヒトトランスジェニック哺乳動物である。
本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物から採取する細胞の種類は特に限定されないが、体細胞であることが好ましい。非ヒトトランスジェニック生物から細胞を採取する方法は、当該細胞の種類に応じた適切な方法で行えばよい。体細胞の種類は、生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、分化能を有する体性幹細胞、人工多能性幹細胞およびこれらの幹細胞から分化誘導された体細胞も含まれる。
初期化因子は、非ヒトトランスジェニック生物から採取した細胞内に導入されるか、当該細胞の処理に用いられることによって、当該細胞の核初期化を引き起こす因子を指す。細胞の核初期化によって多能性幹細胞が誘導される。
上記の初期化工程は、例えば、出発細胞および多能性幹細胞が増殖、維持可能な培養環境において行われる。なお、出発細胞および多能性幹細胞が増殖、維持可能な培養環境とは、例えば、誘導多能性幹細胞の作製に採用されている種々の培養環境およびそれを改変した培養環境を指す。
得られる多能性幹細胞は少なくともmultipotencyを示し、より好ましくはpluripotencyを示す状態かそれ以前の状態を示す。なお、本発明において、multipotencyとは、例えば神経系または造血系など一部の細胞種に分化できる能力を指す。また、本発明において、pluripotencyとは、個体自体を構成することは出来ないが、個体を構成するすべての細胞および組織に分化できる能力を指す。得られる多能性幹細胞の一例は、いわゆる「誘導多能性幹細胞(induced Pluripotent Stem Cell)」である。「誘導多能性幹細胞」とは、ES細胞(Embryonic Stem Cell)に近い性質を有する細胞であり、より具体的には、未分化細胞であって、培養条件によって全能性(pluripotency)および未分化増殖能を有する細胞を包含する。
(蛍光観察)
本発明に係る蛍光ポリペプチドや融合ポリペプチドの用途は特に限定されず、広く蛍光観察の用途に用いることができる。蛍光観察は、本発明に係る蛍光ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに由来する蛍光発光を検出する工程(蛍光検出工程)を含む。
蛍光観察のさらに他の例としては、1以上の目的遺伝子の発現および/または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価方法への応用が挙げられる。ここで、「目的遺伝子の局在性」とは、目的遺伝子の発現産物の局在性を意図している。
i)第一の目的遺伝子と融合されていてもよい本発明に係る蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(本発明に係るポリヌクレオチドと称する)を含む、第一の核酸分子を、細胞内に導入する導入工程。なお、第一の核酸分子は、第一の発現制御配列の制御下におかれるように、当該発現制御配列と作動可能に連結されている。
ii)導入工程を経た上記細胞を試験物質の存在下および不在下で培養する培養工程。
iii)上記細胞における蛍光発光を検出する蛍光検出工程。
iv)試験物質の存在下および不在下で得られた、上記細胞における蛍光発光を比較して、上記目的遺伝子の発現および/または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価工程。
本発明は、配列番号1、2および5〜7に記載のアミノ酸配列のいずれかを有する蛍光ポリペプチドに基づいて、変異型の蛍光ポリペプチドを作製する方法も提供する。
i)配列番号1、2または5〜7に記載のアミノ酸配列における69番目〜70番目以外のアミノ酸において少なくとも1以上のアミノ酸の変異を生じさせた変異型ポリペプチドを作製する工程と、
ii)上記変異型ポリペプチドの蛍光特性と、変異を生じさせる前のポリペプチドの蛍光特性とを比較する比較工程と、
iii)上記比較工程において、変異を生じさせる前と比較して蛍光特性が変化した変異型ポリペプチドを選択する選択工程と、を含む、方法である。
(キット)
本発明に係るキットは、1)本発明に係る蛍光ポリペプチド、2)本発明に係る蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、3)本発明に係る発現カセット、4)本発明に係るベクター、5)本発明に係る形質転換体、および、6)本発明に係る融合ポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種以上を含んでなる。上記2)のポリヌクレオチドがRNAの場合は、遺伝子の組み換えを伴わない一次発現用のキットとして、ヒトなどの生物個体にも適用することができる。
本発明はまた以下に示す何れかの態様であってもよい。
<1> 以下の(1)〜(4)の何れかに示す、蛍光特性を有するポリペプチド。(1)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(2)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1〜34個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、(3)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するポリペプチド、(4)上記(1)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
<2> 蛍光の量子収率Φが0.6以上であるか0.4以上である、<1>に記載のポリペプチド。
<3> 以下の(1)〜(4)の何れかに記載のポリヌクレオチド。(1)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(2)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1〜34個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(3)配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(4)上記(1)に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
<4> (a)発現宿主内で機能的な発現制御領域;および、(b)<3>に記載のポリヌクレオチド;を含む、発現カセット。
<5>上記<3>に記載のポリヌクレオチドまたは<4>に記載の発現カセットを含むベクター。
<6>上記<3>に記載のポリヌクレオチド、<4>に記載の発現カセットまたは<5>に記載のベクターを含む形質転換体。
<7>非ヒトトランスジェニック生物である、<6>に記載の形質転換体。
<8>上記<1>または<2>に記載のポリペプチドと他のポリペプチドとからなる融合ポリペプチド。
<9>蛍光観察の方法であって、<1>または<2>に記載のポリペプチド、あるいは<8>に記載の融合ポリペプチドを細胞において産生させる産生工程と、当該ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに由来する蛍光を観察する観察工程とを含む、方法。
<10>細胞において1以上の目的遺伝子の発現および/または局在性に対する1以上の試験物質の作用を評価する方法であって、i)第一の目的遺伝子と融合されていてもよい上記<3>に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第一の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第一の核酸分子を、細胞内に導入する導入工程、ii)導入工程を経た上記細胞を上記試験物質の存在下および不在下で培養する培養工程、iii)上記細胞における蛍光発光を検出する蛍光検出工程、およびiv)試験物質の存在下および不在下で得られた、上記細胞における蛍光発光を比較して、上記目的遺伝子の発現および/または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価工程、を含む、方法。
<11>上記導入工程において、さらに、上記第一の核酸分子とは異なる蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第二の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第二の核酸分子を、上記細胞内に導入する、<10>に記載の方法。
<12>上記<3>に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む形質転換体を作製する方法であって、<3>に記載のポリヌクレオチド、<4>に記載の発現カセットまたは<5>に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法。
<13>上記<12>に記載の方法で得られた形質転換体またはその子孫。
<14>上記<3>に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む非ヒトトランスジェニック生物を作製する方法であって、<3>に記載のポリヌクレオチド、<4>に記載の発現カセットまたは<5>に記載のベクターを、ドナー細胞から採取した受精卵に導入する工程を含む、方法。
<15>上記<14>に記載の方法で得られた非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫。
<16>上記<15>に記載の非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫より細胞を採取し、該細胞に初期化因子を導入して多能性幹細胞を作製する方法。
<17>上記<1>または<2>に記載のポリペプチド、<3>に記載のポリヌクレオチド、<4>に記載の発現カセット、<5>に記載のベクター、<6>または<7>に記載の形質転換体、あるいは<8>に記載の融合ポリペプチドを含む、キット。
(材料および方法)
コイボコモンサンゴ(Montipora monasteriata)をマルチビーズショッカー(安井器機)によって粉砕後、TRIzol(Invitrogen)を用いてtotalRNAを抽出した。抽出したtotalRNAからOligotex-dT30 <super>(タカラバイオ)を用いてmRNAを精製した。SuperScript Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning(Invitrogen)を用いて、mRNAからcDNAライブラリーを作製した。mRNAを鋳型とした逆転写には、配列番号11に示すプライマーを用いた。得られたcDNAを、大腸菌用発現ベクターpFASTSET(pRSET(Invitrogen)のマルチクローニングサイトをpFastBac(Invitrogen)のマルチクローニングサイトに差し替えることによって作製したベクター)に挿入した後、大腸菌JM109 (DE3)(Promega)に導入し、アンピシリンを含むLB固体培地のプレート上で培養してコロニーを得た。得られたコロニーに、UVイルミネーター、青色LEDおよび緑色LEDをそれぞれ用いて光を照射し、蛍光を発するか否か確認した。蛍光を発することを確認したコロニーを液体培地で培養後、大腸菌液からDNAを抽出し、塩基配列の決定を行った。
2個の発光するコロニーが得られ、これらのコロニーから、2つの蛍光タンパク質(1-29および1-41)のクローンを得た。また、1個の着色したコロニーが得られ、色素タンパク質のクローンを得た。BLASTで検索したところ、2つの蛍光タンパク質は新規のタンパク質であった。一方、色素タンパク質は既知のタンパク質であった。
(材料および方法)
<大腸菌発現用ベクターの作製>
1−29のDNAは、配列番号12のforward primerおよび配列番号13のreverse primerを用いたPCRにより増幅した。また、1−41のDNAを、配列番号14のforward primerおよび配列番号15のreverse primerを用いたPCRにより増幅した。それぞれのPCRによって得られた、N末端にKpnIサイトを付加し、C末端にEcoRIサイトを付加したDNA断片を、大腸菌用発現ベクターpRSET(Invitrogen)に挿入し、大腸菌発現用のプラスミドDNAを得た。
大腸菌株JM109(DE3)(Promega)にヒートショック法によって上述の大腸菌発現用のプラスミドDNAを導入し、アンピシリンを含むLB固体培地のプレートに播種してコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地に植菌し、室温で3日間培養した。培養後に、遠心機を用いて遠心をして大腸菌の菌体を回収した。続いて大腸菌の菌体を凍結融解法で破砕し、破砕液を遠心機を用いて遠心分離し上清を得た。上清をNi-NTAカラムを用いてHis−tag精製した。次にSephadex G-25カラムを用いてバッファー交換を行った。
BSA(bovine serum albumin)を標準液としてブラッドフォード法によって測定した。
(材料および方法)
<吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定>
1−29および1−41タンパク質の蛍光特性について分析するため、吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定を行った。
図1は、1−29および1−41タンパク質の蛍光特性を示す図である。
(材料および方法)
<変異導入による1−29改変体および1−41改変体の作製、1−29改変体および1−41改変体の大腸菌発現用ベクターの作製、大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製>
単量体化した改変体を得ることを目指し、上述の2.において得られた野生体の1−29および1−41の大腸菌発現用ベクターを鋳型とし、1−29および1−41にrandom mutagenesis法およびpoint mutation法を用いてランダムに変異を導入し、複数の1−29改変体および1−41改変体を得た。それぞれの改変体について、2.に記載の方法と同様の方法を用いて、大腸菌発現用ベクターによる大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製を行った。
図2は、単量体化した改変体の大腸菌における発現および蛍光特性を示した図である。図2の(a)は改変体のタンパク質を、Pseud−Native−PAGE電気泳動により電気泳動したゲルを、UVトランスイルミネーターによってUV照射して観察した図である。
最大励起波長(nm):574
最大蛍光波長(nm):598(赤色)
モル吸光係数(M-1cm-1):49500
量子収率(%):66(pH7.4)
蛍光寿命(ナノ秒):
pH感受性:pH6以上、特にpH6〜11で蛍光強度は安定し、感受性は無い。
最大励起波長(nm):573
最大蛍光波長(nm):594(赤色)
モル吸光係数(M-1cm-1):60300
量子収率(%):68(pH7.4)
蛍光寿命(ナノ秒):
pH感受性:pH6以上、特にpH6〜11で蛍光強度は安定し、感受性は無い。
最大励起波長(nm):573
最大蛍光波長(nm):610(赤色)
モル吸光係数(M-1cm-1):44100
量子収率(%):73(pH7.4)
蛍光寿命(ナノ秒):
pH感受性:pH6以上、特にpH6〜11で蛍光強度は安定し、感受性は無い。
(材料および方法)
<1−29および1−41改変体タンパク質の吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定>
単量体化した1−29および1−41改変体タンパク質の蛍光特性について分析するため、吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定を行った。
また、SynergyMx(BioTek)を用いて、50mMのHEPES−NaOH(pH7.4)に2μMとなるようにタンパク質を懸濁させて蛍光スペクトルを測定した。さらに、絶対PL量子収率測定装置(浜松ホトニクス)を用い、50mMのHEPES−NaOH(pH7.4)に2μMとなるようにタンパク質を懸濁させて量子収率を測定した。また、公知の蛍光タンパク質であるmStrawberryおよびTagRFPについても同様に測定を行い、1−29および1−41改変体の値と比較した。なお、TagRFPは525nmの吸収値が0.1になるように調整し、それ以外では540nmの吸収値が0.1になるように調整した。結果を図2中の(b)および図3に示す。また、得られた測定結果について、表2にまとめた。
図2は、単量体化した改変体の大腸菌における発現および蛍光特性を示した図である。図2の(b)は、単量体化した2つのクローン(9−2Bおよび10−3)について、蛍光特性を示した図である。上は、単量体化した2つのクローンそれぞれについて、吸収スペクトルを示す。下は単量体化した2つのクローンそれぞれについて、励起スペクトル(EX)および蛍光スペクトル(EM)を示す。なお、励起スペクトルの蛍光強度は、検出光の波長を640nmに固定したときの値を示し、2つの蛍光スペクトルはそれぞれ励起光の波長を540nm(上のスペクトル)および380nmとしたとき(下のスペクトル)の値を示している。
(材料および方法)
1−29および1−41単量体化改変体の精製タンパク質を50mMのCH3COONa−CH3COOH(pH4.0およびpH5.0)、50mMのKH2PO4−NaOH(pH6.0)、50mMのHEPES−NaOH(pH7.0)、50mMのTricine−NaOH(pH8.0)、50mMのGlycine−NaOH(pH9.およびpH10.0)、50mMのNa2HPO4−NaOH(pH11.0)中で、SynergyMx(Biotek)を用いて蛍光強度を測定し、得られた測定値のうち最も高い数値によって標準化した。
図4は、単量体化した3つの改変体における蛍光強度のpH感受性を示す。
(材料および方法)
HeLa細胞に9−2B、9−4、10−3、mStrawberryおよびTagRFPの遺伝子をLipofectamine 2000 reagent(Invitrogen)を用いてそれぞれ導入し、1日後に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した(対物レンズ:UplanSApo×60、励起:562nm/40、蛍光:624nm/40、ダイクロイックミラー:601nm、ND:1%、経過時間:3分毎)。それぞれの細胞に同じ条件で励起光を照射し続け、退色を調べた。結果を図5Aおよび図5Bに示す。
図5Aおよび図5Bは、単量体化した3つの改変体の蛍光の安定性を示した図(図5A)とグラフ(図5B)である。
(材料および方法)
上述の2.において得られた野生体の1−29および1−41の大腸菌発現用ベクターを鋳型とし、1−29および1−41に、4.に記載の方法と同様に、random mutagenesis法およびpoint mutation法を用いてランダムに変異を導入し、複数の1−29改変体および1−41改変体を得た。それぞれの改変体について、2.に記載の方法と同様の方法を用いて、大腸菌発現用ベクターによる大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製を行った。それぞれの改変体のタンパク質について、5.に記載の方法と同様の方法を用いて、吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定を行った。結果を図6に示す。
図6は、2つの改変体の蛍光波長のシフトを示した図である。
<変異導入による1−41改変体の作製、1−41改変体の大腸菌発現用ベクターの作製、大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製>
上述の〔2.〕において得られた野生体の1−41タンパク質の大腸菌発現用ベクターを鋳型として、random mutagenesis法およびpoint mutation法を用いてランダムに変異を導入し、複数の1−41改変体を得た。それぞれの改変体について、上述の〔2.〕に記載の方法と同様の方法を用いて、大腸菌発現用ベクターによる大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製を行った。
(材料および方法)
<mAzaleaの吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定>
上述の〔9.〕で得たmAzaleaの蛍光特性について分析するため、吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定を行った。
図7は、mAzaleaの蛍光特性を示した図である。図中の上のグラフは、mAzaleaの吸収スペクトルを示す。図中の下の二つのグラフは、mAzaleaの励起スペクトル(ex640:点線で示す)および蛍光スペクトル(em540, em470:実線で示す)を示す。なお、励起スペクトルの蛍光強度は、検出光の波長を640nmに固定したときの値を示し、2つの蛍光スペクトル(em540, em470)はそれぞれ励起光の波長を540nmおよび470nmとしたときの値を示す。
最大励起波長(nm):574
最大蛍光波長(nm):598(赤色)
モル吸光係数(M-1cm-1):103200
量子収率(%):49
pH感受性:pH5以上で9以下の範囲内、特にpH6〜8の範囲内で蛍光強度は安定し、感受性は無い。pH5未満かpH9を超える場合、蛍光強度は大きく減少する。 〔11.mAzaleaのpH感受性の分析〕
(材料および方法)
mAzaleaの精製タンパク質を50mMのCH3COONa−CH3COOH(pH4.0およびpH5.0)、50mMのKH2PO4−NaOH(pH6.0)、50mMのHEPES−NaOH(pH7.0)、50mMのTricine−NaOH(pH8.0)、50mMのGlycine−NaOH(pH9.0およびpH10.0)、および、50mMのNa2HPO4−NaOH(pH11.0)中で、SynergyMx(Biotek)を用いて蛍光強度を測定し、得られた測定値のうち最も高い数値によって標準化した。また、分光光度計(日立ハイテク)を用いて吸収スペクトルも測定した。
図8は、mAzaleaにおける蛍光強度のpH感受性を示す。図中の上の二つのグラフは、様々なpH条件下における、mAzaleaの励起スペクトル(ex640)および蛍光スペクトル(em540)を示す。なお、励起スペクトルの蛍光強度は、検出光の波長を640nmに固定したときの値を示し、蛍光スペクトル(em540)は励起光の波長を540nmとしたときの値を示す。
(材料および方法)
HeLa細胞に、mAzalea、mRuby2(Kredel et al., 2009 PLoS ONE)、mCherryおよびTagRFP−Tの遺伝子をLipofectamine 2000 reagentを用いてそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションの1日後に、細胞固定を行った場合と、細胞固定を行わなかった場合のそれぞれの光安定性を調べた。なお、測定の条件は以下の通りである。
<細胞固定を行った場合>
固定方法:トランスフェクションの1日後に4%PFAで30分氷上にて固定;バッファ:10mM HEPES−NaOH(pH7.4)含有HBSS;CCDカメラ:DP30(オリンパス社製);蛍光フィルターキューブ:U−MPFP HQ(オリンパス社製)(励起が535-555nm(BP535-555HQ)、ダイクロイックミラーが565nm(DM565HQ)、蛍光が570-625nm(BA570-625HQ);対物レンズ:×40 UplanFL N;NDフィルタ:25%;ビニング:2(mcherryのみ、1秒);露出時間:15ミリ秒(mcherryのみ、30ミリ秒);照射間隔:1分、
<細胞固定を行っていない場合>
バッファ:DMEM/F−12(Gibco社製);CCDカメラ:DP30(オリンパス社製);蛍光フィルターキューブ:U−MPFP HQ(オリンパス社製);対物レンズ:×40 UplanFL N;NDフィルタ:25%;ビニング:2;露出時間:40ミリ秒(mcherryとTafRFPは30ミリ秒、mRubyは25ミリ秒);照射間隔:1分。
図9は、mAzalea、mRuby2、mCherryおよびTagRFP−Tの蛍光の安定性を示した図である。図中の左側が細胞固定を行った場合の結果であり、右側が細胞固定を行っていない場合の結果である。この結果から、mAzaleaの蛍光安定性は、mRuby2より優れ、その他の蛍光タンパク質と比較しても遜色がないことが判る。
HeLa細胞を用いて、そのサイトゾル(図10の左側)、原形質膜(図10の右側)、小胞体(図11)、αチューブリンを含む器官(図12)、並びに、βアクチンを含む器官(図13)における、mAzaleaの発現を解析した。HeLa細胞は、Lipofectamine 2000 reagent(Invitrogen)を用いてそれぞれトランスフェクションし、1日後に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。トランスフェクションに用いた遺伝子コンストラクトは、mAzalea遺伝子(図10の左側)、Lyn-mAzalea/pcDNA3(図10の右側)であり、そして、図11〜図13については、mAzalea、mRuby2、およびmCherryの遺伝子(図中でFPと示す)をそれぞれ含む複数の遺伝子コンストラクトを用いた。Lyn-mAzalea/pcDNA3は、膜結合性であるLynの配列とmAzalea遺伝子とを連結した遺伝子コンストラクトである。なお、図11に対応する遺伝子コンストラクトは、カルレティキュリン−FP(蛍光タンパク質)−KDELをこの順に連結したもので、図12に対応する遺伝子コンストラクトは、FP(蛍光タンパク質)とαチューブリンとをリンカー(GGGGS)×3で連結したもので、図13に対応する遺伝子コンストラクトは、FP(蛍光タンパク質)とβアクチンとをリンカー(GGGGS)×3で連結したものである。
<サイトゾルの観察>
バッファ:DMEM/F−12(Gibco社製);CCDカメラ:DP30(オリンパス社製);蛍光フィルターキューブ:U−MPFP HQ(オリンパス社製);対物レンズ:×40 UplanFL N;NDフィルタ:25%;ビニング:2;露出時間:35ミリ秒
<原形質膜の観察>
バッファ:10mM HEPES−NaOH(pH7.4)含有HBSS;CCDカメラ:DP30(オリンパス社製);蛍光フィルターキューブ:U−MPFP HQ(オリンパス社製);対物レンズ:×40 UplanFL N;NDフィルタ:10%;ビニング:2;露出時間:400ミリ秒
<小胞体の観察>
顕微鏡:FV1000(オリンパス社製);対物レンズ:×60 UplanApo W/IR;スキャン速度:2.0μ秒/ピクセル;C.A.:130μm;Kalman:line、×2;レーザー:543nm;蛍光:560-660nm
<αチューブリンを含む器官の観察>
顕微鏡:FV1000(オリンパス社製);対物レンズ:×60 UplanApo W/IR;スキャン速度:4.0μ秒/ピクセル;C.A.:120μm;Kalman:line、×4;レーザー:543nm;蛍光:560-660nm
<βアクチンを含む器官の観察>
顕微鏡:FV1000(オリンパス社製);対物レンズ:×60 UplanApo W/IR;スキャン速度:2.0μ秒/ピクセル;C.A.:130μm;Kalman:line、×2;レーザー:543nm;蛍光:560-660nm
(結果)
図10〜図13に示すように、mAzaleaは、HeLa細胞中の標的とした箇所に局在的に発現する蛍光マーカーとして機能することがわかった。
次にmAzaleaの光り始める早さをmCherryの場合と比較した。HeLa細胞(HeLa S3)に、mAzaleaおよびmCherryの遺伝子をそれぞれトランスフェクションした。次いで、このHeLa細胞を、6時間、12時間、18時間培養した時点での蛍光発光を調べた。図14に結果を示すように、mAzaleaの光り始める早さは、mCherryとほぼ同等であった。
HeLa細胞の培養条件:培地は10% FBSを添加したDMEM培地。培養条件は、顕微鏡用培養装置FV10iを用いて、37℃で5%濃度の二酸化炭素存在下。
蛍光発光の観察条件:
レーザ(Laser): 559nm_7.5%, PMT: 40%, em: 570-670nm, C. A.: 300um
対物レンズ(Obj): UPlanSApo 10×, スキャンスピード(Scan speed): 2μs/pixel
イメージサイズ(Image size): 512x 512, ズーム(Zoom): x1, Kalman: line x2
インターバル(Interval): 15min
〔15.mAzaleaに基づく改変体タンパクの作製とその解析〕
上述の〔9.〕欄で記載をしたmAzaleaのアミノ酸配列において、85番目のアミノ酸をイソロイシンからロイシンに置換し、176番目のアミノ酸をチロシンからメチオニンに置換した改変体タンパク質を作製し、これをmAzalea_B5と称した。なお、部位特異的なアミノ酸変異は、mAzaleaの遺伝子配列を鋳型として導入をした。mAzalea_B5のアミノ酸配列は、配列番号18に、遺伝子のコード領域の塩基配列は、配列番号19に示す。
(材料および方法)
mAzaleaおよびmAzalea_B5の精製タンパク質それぞれについて、50mMのCH3COONa−CH3COOH(pH4.0およびpH5.0)、50mMのKH2PO4−NaOH(pH6.0)、50mMのHEPES−NaOH(pH7.0)、50mMのTricine−NaOH(pH8.0)、50mMのGlycine−NaOH(pH9.0およびpH10.0)、50mMのNa2HPO4−NaOH(pH11.0)、および50mMの0.2M KCl−0.2M NaOH(pH12.0)中で、SynergyMx(Biotek)を用いて蛍光強度を測定し、得られた測定値のうち最も高い数値によって標準化した。また、分光光度計(日立ハイテク)を用いて吸収スペクトルも測定した。
図15の右側のグラフは、mAzaleaおよびmAzalea_B5に関する、様々なpH条件下における蛍光スペクトルを示す。なお、蛍光スペクトルは、mAzaleaについては励起光の波長を540nmに固定した時の598nmの値であり、mAzalea_B5については励起光の波長を540nmに固定した時の596nmの値である。
最大励起波長(nm):574
最大蛍光波長(nm):596(赤色)
モル吸光係数(M-1cm-1):103700
量子収率(%):58
mAzalea_B5は、pH5以上で9以下の範囲内、特にpH6〜8の範囲内で、mAzaleaより一層、蛍光強度は安定し、感受性は無い。しかし、pH5未満かpH9を超える場合は、mAzalea_B5の蛍光強度等は大きく減少する。すなわち、mAzalea_B5は、pH感受性のある蛍光タンパク質として、pHセンサ、および、pH依存性スイッチ等として利用できる。
HeLa細胞に、mAzalea、およびmAzalea_B5の遺伝子をLipofectamine 2000 reagent(Invitrogen)を用いてそれぞれトランスフェクションし、1日後に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。
HeLa細胞を用いて、その小胞体における、mAzaleaおよびmAzalea_B5の発現を解析した。HeLa細胞は、Lipofectamine 2000 reagent(Invitrogen)を用いてそれぞれトランスフェクションし、1日後に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。トランスフェクションに用いた遺伝子コンストラクトは、カルレティキュリン−FP−KDELをこの順に連結したものであり、FPはmAzaleaまたはmAzalea_B5の遺伝子を示す。
(結果)
図17に示すように、mAzalea_B5は、mAzaleaより一層優れて、HeLa細胞中の小胞体に局在的に発現する蛍光マーカーとして機能することがわかった。
Claims (17)
- 以下の(1)または(2)の何れかに示す、蛍光特性を有するポリペプチド。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列における、85番目のアミノ酸、151番目のアミノ酸および176番目のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸が置換されており、且つ、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列における、85番目のアミノ酸、151番目のアミノ酸および176番目のアミノ酸が置換されており、且つ、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。 - 蛍光の量子収率Φが0.4以上である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 以下の(1)または(2)の何れかに記載のポリヌクレオチド。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列における、85番目のアミノ酸、151番目のアミノ酸および176番目のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸が置換されており、且つ、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列における、85番目のアミノ酸、151番目のアミノ酸および176番目のアミノ酸が置換されており、且つ、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - (a)発現宿主内で機能的な発現制御領域;および
(b)請求項3に記載のポリヌクレオチド;
を含む、発現カセット。 - 請求項3に記載のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチド、請求項4に記載の発現カセットまたは請求項5に記載のベクターを含む形質転換体であって、
上記形質転換体が個体である場合は、当該形質転換体は非ヒトトランスジェニック生物である、形質転換体。 - 非ヒトトランスジェニック生物である、請求項6に記載の形質転換体。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドと他のポリペプチドとからなる融合ポリペプチド。
- 蛍光観察の方法であって、
請求項1または2に記載のポリペプチド、あるいは請求項8に記載の融合ポリペプチドを細胞において産生させる産生工程と、当該ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに由来する蛍光を観察する観察工程とを含む、方法。 - 細胞において1以上の目的遺伝子の発現および/または局在性に対する1以上の試験物質の作用を評価する方法であって、
i)第一の目的遺伝子と融合されていてもよい請求項3に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第一の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第一の核酸分子を、細胞内に導入する導入工程、
ii)導入工程を経た上記細胞を上記試験物質の存在下および不在下で培養する培養工程、
iii)上記細胞における蛍光発光を検出する蛍光検出工程、および
iv)試験物質の存在下および不在下で得られた、上記細胞における蛍光発光を比較して、上記目的遺伝子の発現および/または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価工程、を含む、方法。 - 上記導入工程において、さらに、
上記第一の核酸分子とは異なる蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第二の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第二の核酸分子を、上記細胞内に導入する、請求項10に記載の方法。 - 請求項3に記載のポリヌクレオチドの全体を細胞中に含む形質転換体を作製する方法であって、
請求項3に記載のポリヌクレオチド、請求項4に記載の発現カセットまたは請求項5に記載のベクターを細胞に導入する工程を含んでおり、
上記形質転換体が個体である場合は、当該形質転換体は非ヒトトランスジェニック生物である、方法。 - 請求項12に記載の方法で得られた形質転換体またはその子孫であって、上記子孫は、上記ポリヌクレオチドの全体を細胞のゲノム中に含む形質転換体の子孫である、形質転換体またはその子孫。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドの全体を細胞中に含む非ヒトトランスジェニック生物を作製する方法であって、
請求項3に記載のポリヌクレオチド、請求項4に記載の発現カセットまたは請求項5に記載のベクターを、ドナー生物から採取した受精卵に導入する工程を含む、方法。 - 請求項14に記載の方法で得られた非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫であって、上記子孫は、上記ポリヌクレオチドの全体を細胞のゲノム中に含む非ヒトトランスジェニック生物の子孫である、非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫。
- 請求項15に記載の非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫より細胞を採取し、該細胞に初期化因子を導入して多能性幹細胞を作製する方法。
- 請求項1または2に記載のポリペプチド、請求項3に記載のポリヌクレオチド、請求項4に記載の発現カセット、請求項5に記載のベクター、請求項6または7に記載の形質転換体、あるいは請求項8に記載の融合ポリペプチドを含む、キット。
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