JP2023515926A - アルギニン蛍光プローブ及びその製造方法並びに使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アルギニン感受性を有するポリペプチドＢとアルギニンを発現する蛍光タンパク質Ａとを含むアルギニン蛍光プローブを提供する。前記蛍光タンパク質ＡがポリペプチドＢに挿入され、ＢがＢ１とＢ２の上下構造部分に分けられ、Ｂ１－Ａ－Ｂ２式のプローブ構造が形成される。同様に、異なる部位で切断・部位特異的変異した最適化ミュータントにおいて、前記ポリペプチドＢとアルギニンとの特異的結合によって蛍光タンパク質Ａの蛍光シグナルが変更され、前記ポリペプチドＢがアルギニン結合タンパク質及びそのミュータントである。本発明により提供されるアルギニン蛍光プローブは、タンパク質分子量が比較的に小さく、発現しやすく、蛍光の動的変化が大きく、特異性が良好であると共に、遺伝子操作の方法により細胞の異なるサブオルガネラで発現でき、細胞内外においてハイスループット、定量でアルギニンを検出できる。【選択図】なし
Description
本発明は、光学プローブ技術分野に関し、特に、アルギニン光学プローブ及びその製造方法並びに使用に関する。
アルギニンは、２０種類の天然アミノ酸の１つとして、１８８６年にＳｃｈｌｕｓにより植物であるルピナスの苗から初めて分離・抽出され、２０世紀初にその分子構造が解明されると共に、人工合成できるようになった。アルギニンは、生体内において生理活性を有するＬ－アルギニンの形態で生物学機能を果たしている。アルギニンは、生体のタンパク質を構成する成分であるほかに、ポリアミン、ＮＯなどの様々な生物活性物質を合成するための前駆体でもあり、一部のホルモンの分泌を刺激することで、内分泌調節や生体の特異的免疫調節などの生物学的過程に関与する。また、アルギニンは、尿素サイクルの中間体として、尿素サイクルにおいてアンモニア中毒を防止することで、アンモニア過剰による代謝障害を回避する。また、アルギニンは、生体の均質化代謝において重要な作用を果たしており、アルギナーゼ、一酸化窒素シンターゼ、アルギニン／グリシングアニジノトランスフェラーゼ、アルギニル－ｔＲＮＡシンテターゼなどの様々な代謝経路に利用される。そのため、現在、アルギニンの様々な生物学機能は、科学研究者に広く注目され、アミノ酸研究の焦点になっている。
哺乳動物におけるアルギニンの主な代謝経路は２つある。１つ目の代謝経路として、アルギニンはアルギナーゼの作用でオルニチンと尿素に分解される。オルニチンはポリアミン類物質を合成するための前駆体である。ポリアミンは細胞成長と発育の調節にとって重要な意味を持っている。２つ目の代謝経路として、アルギニンは一酸化窒素シンターゼの作用で等分子のシトルリンとＮＯに分解される。ＮＯは細胞内、細胞間及び神経伝達物質で働くメッセンジャー分子であり、細胞間と細胞内のシグナル伝達に広く関与する。また、アミジン基転移反応のアミジン基供与体として、アルギニン、グリシンとメチオニンからグアニジノ酢酸とホスホクレアチンを合成する。神経組織において、アルギニンからもγ－グアニジノ酪酸を合成する（Delforge Jら、Eur J Biochem. 1975, 57(1):231-239（非特許文献１）；Fernandez MLら、J. Bacteriol. 2004, 186(18):6142-6149（非特許文献２）；Fernandez MLら、J. Bacteriol. 2008, 190(18):3018-3025（非特許文献３））。
アルギニンはクレアチンを形成する３つの基質の１つである。クレアチンは重要な栄養素（クレアチン欠乏により知的障害を引き起こす）であり、腹水の形成にも利用され、生体内のシグナル分子でもある。アルギニンは尿素（Ｌ－オルニチン、Ｌ－シトルリンとアルギニノコハク酸を含む）と一酸化窒素サイクル（オルニチンとアルギニノコハク酸を含む）における中間産物であるほかに、オルニチンを介して細胞機能を調節できるポリアミン構造を産生する。アルギニンの欠乏（アルギナーゼによってアルギニンをオルニチンに変換することができるため、アルギナーゼの活性を促進することで誘発できる）は、Ｂ細胞機能（免疫性）や毛髪と筋肉の成長に影響を与えるほかに、神経と筋肉の機能に影響を与える可能性もある。２型糖尿病患者におけるアルギナーゼの過剰発現が当該患者における心血管疾患進展の要因であることや、腎不全患者においてアルギナーゼが低減することは、すでに知られている。
アルギニンが上記に示される重要な作用を持っているため、アルギニン含有量の検出は特に重要である。アルギニンの通常の検出方法は、キャピラリー電気泳動法（Li X-tら、Chem Res Chin Univ 2013, 29(3):434-438（非特許文献４）；Meng Jら、The Analyst 2010, 135(7):1592-1599（非特許文献５））、高速液体クロマトグラフ法（Tateda Nら、Analytical sciences : the international journal of the Japan Society for Analytical Chemistry 2001, 17(6):775-778（非特許文献６）；Wadud Sら、Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 2002, 767(2):369-374（非特許文献７））、酵素結合免疫吸着測定法及び紫外可視分光法（Hortpro MAら、J Am Chem So 2003, 125(1):20-21（非特許文献８）；Pu Fら、Anal Chem 2010, 82(19):8211-8216（非特許文献９）；Du Jら、Chemical communications (Cambridge, England) 2013, 49(47):5399-5401（非特許文献１０）；Engeser Mら、Chemical Communications 1999, (13):1191-1192（非特許文献１１））並びに蛍光分光法（Engeser Mら、Chemical Communications 1999, (13):1191-1192（非特許文献１１））がある。
しかしながら、生細胞の研究では、これらの検出方法は、重大な欠陥があり、細胞破砕、分離・抽出・精製など時間がかかるサンプル処理過程を必要とし、生細胞とサブオルガネラにおいてインサイチュ、リアルタイム、動的、ハイスループット、高時間分解能で検出できない。本分野では、細胞内外においてアルギニンをリアルタイムインサイチュ、定量、ハイスループットで検出できる方法は、依然として必要とする。
Delforge Jら、Eur J Biochem. 1975, 57(1):231-239
Fernandez MLら、J. Bacteriol. 2004, 186(18):6142-6149
Fernandez MLら、J. Bacteriol. 2008, 190(18):3018-3025
Li X-tら、Chem Res Chin Univ 2013, 29(3):434-438
Meng Jら、The Analyst 2010, 135(7):1592-1599
Tateda Nら、Analytical sciences : the international journal of the Japan Society for Analytical Chemistry 2001, 17(6):775-778
Wadud Sら、Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 2002, 767(2):369-374
Hortpro MAら、J Am Chem So 2003, 125(1):20-21
Pu Fら、Anal Chem 2010, 82(19):8211-8216
Du Jら、Chemical communications (Cambridge, England) 2013, 49(47):5399-5401
Engeser Mら、Chemical Communications 1999, (13):1191-1192
上記に鑑みて、本発明は、細胞内外においてリアルタイム局在、ハイスループット、定量でアルギニンを検出するアルギニン蛍光プローブを提供すること、を目的とする。
本発明は、上記の発明目的を実現するために、以下の技術案を提供する。
本発明は、アルギニン感受性ポリペプチド又はその機能的バリアント及び光学活性ポリペプチド又はその機能的バリアントを含むアルギニン光学プローブであって、光学活性ポリペプチド又はその機能的バリアントがアルギニン感受性ポリペプチド又はその機能的バリアントの配列内にあるアルギニン光学プローブを提供する。アルギニン感受性ポリペプチド又はその機能的バリアントが光学活性ポリペプチド又はその機能的バリアントによって第１部分と第２部分に分けられている。
本発明は、アルギニン感受性ポリペプチドＢと光学活性ポリペプチドＡを含むアルギニン光学プローブであって、光学活性ポリペプチドＡがアルギニン感受性ポリペプチドＢの配列内にあり、アルギニン感受性ポリペプチドＢが第１部分Ｂ１と第２部分Ｂ２に分けられ、Ｂ１－Ａ－Ｂ２式のプローブ構造が形成されるアルギニン光学プローブを提供する。
一実施形態において、アルギニン感受性ポリペプチドがアルギニン結合タンパク質のアルギニン結合ドメイン及びそのミュータントを含む。一実施形態において、アルギニン感受性ポリペプチドがアルギニン結合タンパク質又はその機能断片である。１つ又は複数の実施形態において、前記アルギニン結合タンパク質がＳＴＭ４３５１タンパク質である。一実施形態において、アルギニン感受性ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列、又はそれと少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列同一性を有すると共にアルギニン感受性を保持する配列を有する。
一実施形態において、光学活性ポリペプチドが蛍光タンパク質又はその機能断片或いはバリアントである。一実施形態において、蛍光タンパク質が黄色蛍光タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるｃｐＹＦＰ）、サフランイエロー蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるｃｐＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるｃｐＢＦＰ）、アップルレッド蛍光タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるｃｐｍＡｐｐｌｅ）から選ばれる。好ましくは、光学活性ポリペプチドがｃｐＹＦＰである。一実施形態において、蛍光タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～５の何れか１つに示される配列を有する。
一実施形態において、光学プローブが前記光学活性ポリペプチドの側鎖上に連結される１つ又は複数のリンカーを更に含む。一実施形態において、光学活性ポリペプチドの側鎖が、５個以下のアミノ酸のリンカー、例えば、０、１、２、３、４個のアミノ酸のリンカーを含む。一実施形態において、光学活性ポリペプチドの側鎖のリンカーがアミノ酸Ｙを含む。一実施形態において、リンカーＹが光学活性ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にある。一実施形態において、光学プローブが、下記のように、即ち、アルギニン感受性ポリペプチドの第１部分Ｂ１－Ｙ－光学活性ポリペプチドＡ－アルギニン感受性ポリペプチドの第２部分Ｂ２に示される。一実施形態において、本発明の光学プローブがリンカーを含まない。
一実施形態において、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの残基１０３～１１１及び／又は１９７～２０９の間にあり、番号がアルギニン結合タンパク質の全長に対応する。一実施形態において、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの残基１０２～１１２及び／又は１９６～２１０の間の１つ又は複数のアミノ酸を置換し、番号がアルギニン結合タンパク質の全長に対応する。
一実施形態において、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの以下から選ばれる１つ又は複数の部位、即ち、１０３／１０４、１０３／１０５、１０３／１０６、１０３／１０７、１０３／１０８、１０３／１０９、１０３／１１０、１０３／１１１、１０４／１０５、１０４／１０６、１０４／１０７、１０４／１０８、１０４／１０９、１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１０７、１０５／１０８、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０７、１０６／１０８、１０６／１０９、１０６／１１０、１０６／１１１、１０７／１０８、１０７／１０９、１０７／１１０、１０７／１１１、１０８／１０９、１０８／１１０、１０８／１１１、１０９／１１０、１０９／１１１、１１０／１１１、１９７／１９８、１９７／１９９、１９７／２００、１９７／２０１、１９７／２０２、１９７／２０３、１９７／２０４、１９７／２０５、１９７／２０６、１９７／２０７、１９７／２０８、１９７／２０９、１９８／１９９、１９８／２００、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９８／２０４、１９８／２０５、１９８／２０６、１９８／２０７、１９８／２０８、１９８／２０９、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、１９９／２０５、１９９／２０６、１９９／２０７、１９９／２０８、１９９／２０９、２００／２０１、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２００／２０７、２００／２０８、２００／２０９、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０４、２０１／２０５、２０１／２０６、２０１／２０７、２０１／２０８、２０１／２０９、２０２／２０３、２０２／２０４、２０２／２０５、２０２／２０６、２０２／２０７、２０２／２０８、２０２／２０９、２０３／２０４、２０３／２０５、２０３／２０６、２０３／２０７、２０３／２０８、２０３／２０９、２０４／２０５、２０４／２０６、２０４／２０７、２０４／２０８、２０４／２０９、２０５／２０６、２０５／２０７、２０５／２０８、２０５／２０９、２０６／２０７、２０６／２０８、２０６／２０９、２０７／２０８、２０７／２０９又は２０８／２０９にある。
好ましくは、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの以下から選ばれる１つ又は複数の部位、即ち、１０３／１０４、１０３／１０６、１０３／１０７、１０３／１０８、１０３／１０９、１０３／１１０、１０４／１０５、１０４／１０６、１０４／１０８、１０４／１０９、１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１０７、１０５／１０８、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０７、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０８、１０７／１０９、１０７／１１０、１０７／１１１、１０８／１０９、１０８／１１１、１０９／１１０、１０９／１１１、１１０／１１１、１９７／１９８、１９７／１９９、１９７／２００、１９７／２０１、１９７／２０２、１９７／２０３、１９７／２０４、１９７／２０５、１９７／２０６、１９７／２０８、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９８／２０４、１９８／２０５、１９８／２０６、１９８／２０８、１９８／２０９、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、１９９／２０５、１９９／２０６、１９９／２０８、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２００／２０７、２００／２０８、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０４、２０１／２０５、２０１／２０６、２０１／２０８、２０１／２０９、２０２／２０３、２０２／２０５、２０２／２０６、２０３／２０４、２０３／２０６、２０４／２０５、２０４／２０６、２０４／２０８、２０５／２０６、２０５／２０７、２０５／２０８又は２０６／２０７にある。これらのプローブはアルギニンに対する応答が対照組を上回る。
好ましくは、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの以下から選ばれる１つ又は複数の部位、即ち、１０４／１０９、１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１０７、１０５／１１０、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１１０／１１１、１９７／１９９、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０２、１９８／２０３、１９８／２０４、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０４、１９９／２０５、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０４、２０１／２０５、２０１／２０６、２０２／２０５、２０３／２０６、２０４／２０５又は２０４／２０６にある。これらのプローブはアルギニンに対する応答が対照組の１．５倍を上回る。
好ましくは、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの以下から選ばれる１つ又は複数の部位、即ち、１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１１０、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０２、１９９／２００、１９９／２０２、２００／２０３、２００／２０５、２０１／２０２、２０１／２０５、２０２／２０５、２０３／２０６、２０４／２０５又は２０４／２０６にある。これらのプローブはアルギニンに対する応答が対照組の２倍を上回る。
例示的な実施形態において、本発明の光学プローブは、ｃｐＹＦＰがアルギニン結合タンパク質の１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１１０、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０２、１９９／２００、１９９／２０２、２００／２０３、２００／２０５、２０１／２０２、２０１／２０５、２０２／２０５、２０３／２０６、２０４／２０５又は２０４／２０６部位にあるプローブであってもよい。一実施形態において、本発明の光学プローブがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～３９に示される配列を有し、又はこれらの配列からなる。
本発明は、１つ又は複数の突然変異を有するアルギニン感受性ポリペプチドのミュータントを更に提供する。前記アミノ酸の突然変異がアミノ酸の修飾、置換、欠失又は配列の切断を含む。一実施形態において、前記突然変異がアルギニン結合タンパク質の３０（Ｓ）、９６（Ｒ）及び１７７（Ｄ）番目の１つ、２つ又は３つにある。好ましくは、前記突然変異がＳ３０Ｎ、Ｄ１７７Ｎ、Ｒ９６Ｍ、Ｒ９６Ｋの１つ、２つ又は３つから選ばれる。
本発明は、１つ又は複数の突然変異を有するアルギニン感受性ポリペプチドを含む光学プローブを更に提供する。１つ又は複数の実施形態において、光学プローブが上記に示されるように光学活性ポリペプチドが挿入される任意の光学プローブであると共に、前記光学プローブにおけるアルギニン感受性ポリペプチドがＳ３０、Ｒ９６及びＤ１７７の１つ、２つ又は３つから選ばれる部位で突然変異を有する。１つ又は複数の実施形態において、突然変異したアルギニン感受性ポリペプチドを含む光学プローブは突然変異していない対照物よりアルギニンに対する応答が低くない。好ましくは、前記突然変異がＳ３０Ｎ、Ｄ１７７Ｎ、Ｒ９６Ｍ、Ｒ９６Ｋの１つ、２つ又は３つから選ばれる。
例示的な実施形態において、本発明の光学プローブは、アルギニン結合タンパク質の１０７／１１１部位にｃｐＹＦＰが挿入されると共に、Ｓ３０Ｎ、Ｄ１７７Ｎ、Ｒ９６Ｍ及びＲ９６Ｋから選ばれる１つ又は複数の突然変異を有するプローブであってもよい。好ましくは、本発明の光学プローブは、アルギニン結合タンパク質の１０７／１１１部位にｃｐＹＦＰが挿入されると共に、Ｓ３０Ｎ又はＤ１７７Ｎから選ばれる突然変異を有するプローブである。一実施形態において、本発明の光学プローブがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０～４１に示される配列を有し、又はこれらの配列からなる。
本発明により提供される光学プローブが、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～４１の何れか１つ又はそのバリアントを含む。一実施形態において、本発明により提供される光学プローブが、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～４１の何れか１つと少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
本発明は、本明細書に記載される光学プローブとその他のポリペプチドとを含む融合ポリペプチドを更に提供する。幾つかの実施形態において、その他のポリペプチドが前記光学プローブのＮ末端及び／又はＣ末端にある。幾つかの実施形態において、その他のポリペプチドが、光学プローブを異なるオルガネラ又はサブオルガネラに局在させるポリペプチドと、精製用タグ又はイムノブロット用タグを含む。
本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド、プローブ又はタンパク質のコード配列或いはその相補配列若しくは断片を含む核酸配列を更に提供する。一実施形態において、本発明の核酸配列が、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～４１の何れか１つに示されるアミノ酸配列のコード配列又はその相補配列、（２）（１）と少なくとも９９％、９５％、９０％、８０％、７０％又は５０％の同一性を有する配列、（３）（１）又は（２）の断片、から選ばれる。一実施形態において、本発明の核酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２又はそのバリアント或いは断片を含む。１つ又は複数の実施形態において、前記断片がプライマーである。
本発明は、本発明の光学プローブ又は融合タンパク質の断片、類似体、誘導体、可溶性断片及びバリアントをコードする核酸配列或いはその相補配列を含む、上記核酸配列の相補配列又はそのバリアントに更に関する。
本発明は、本明細書に記載される核酸配列又はその相補配列を含む核酸コンストラクトであって、当該核酸配列が本発明に係る光学プローブ又は融合ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトを更に提供する。１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトがクローニングベクター、発現ベクター又は組換えベクターである。１つ又は複数の実施形態において、前記核酸配列が発現制御配列に操作可能に連結される。幾つかの実施形態において、発現ベクターが原核細胞発現ベクター、真核細胞発現ベクター及びウイルスベクターから選ばれる。
本発明は、本発明に係る核酸配列又は発現ベクターを含む細胞を更に提供する。１つ又は複数の実施形態において、前記細胞が本明細書に記載される光学プローブ又は融合ポリペプチドを発現する。
本発明は、本明細書に記載される光学プローブ、融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は本明細書に記載される方法で調製される光学プローブ或いは融合ポリペプチドを含む検出試薬キットを更に提供する。
本発明は、本明細書に記載される光学プローブ又は融合ポリペプチドを発現する細胞を提供すること、前記細胞の発現条件で前記細胞を培養すること、及び光学プローブ又は融合ポリペプチドを分離すること、を含む、本明細書に記載される光学プローブの調製方法を提供する。
本発明は、本明細書に記載される光学プローブ又は融合ポリペプチド、或いは本明細書に記載される方法で調製される光学プローブ又は融合ポリペプチドをサンプルに接触させること、及び光学活性ポリペプチドの変化を検出すること、を含む、サンプルにおけるアルギニンの検出方法を更に提供する。前記検出は、インビボ、インビトロ、サブオルガネラ又はインサイチュで行ってもよい。前記サンプルは、例えば、血液である。
本発明は、本明細書に記載される光学プローブ又は融合ポリペプチド、或いは本明細書に記載される方法で調製される光学プローブ又は融合ポリペプチドをサンプルに接触させること、光学活性ポリペプチドの変化を検出すること、及び光学活性ポリペプチドの変化によってサンプルにおけるアルギニンを定量化すること、を含む、サンプルにおけるアルギニンの定量方法を更に提供する。
本発明は、本明細書に記載される光学プローブ又は融合ポリペプチド、或いは本明細書に記載される方法で調製される光学プローブ又は融合ポリペプチドを候補化合物に接触させること、光学活性ポリペプチドの変化を検出すること、及び光学活性ポリペプチドの変化によって化合物を選別すること、を含む、化合物（例えば、薬物）の選別方法を更に提供する。前記方法は、ハイスループットで化合物を選別できる。
本発明は、本明細書に記載されるアルギニン光学プローブ又は融合ポリペプチド、或いは本明細書に記載される方法で調製されるアルギニン光学プローブ又は融合ポリペプチドの、アルギニンの細胞内／外局在における使用、を更に提供する。１つ又は複数の実施形態において、前記局在がリアルタイム局在である。
本発明は下記の優位性を有する。本発明により提供されるアルギニン蛍光プローブは、アルギニン感受性を有するポリペプチドＢと蛍光タンパク質Ａとを含む。前記蛍光タンパク質ＡがポリペプチドＢに挿入され、ＢがポリペプチドＢ１とポリペプチドＢ２の２つの部分に分けられて、Ｂ１－Ａ－Ｂ２式のプローブ構造が形成される。本発明により提供されるＢ１－Ａ－Ｂ２式のアルギニン蛍光プローブは、成熟しやすく、蛍光の動的変化が大きく、特異性が良好であると共に、遺伝子操作の方法により細胞で発現でき、細胞内外においてリアルタイム局在、ハイスループット、定量でアルギニンを検出できる。時間がかかるサンプルの処理工程は簡略された。実験効果によれば、本願により提供されるアルギニン蛍光プローブは、アルギニンに対する最高応答が１１倍以上であり、細胞質、ミトコンドリア、細胞核、ゴルジ体、ペルオキシソーム及びリソソームなどのサブオルガネラ構造で細胞の局在検出ができると共に、ハイスループットの化合物選別及び血中アルギニンの定量検出ができる。
本発明は、下記の工程、即ち、１）本明細書に記載されるアルギニン光学プローブをコードする核酸配列を発現ベクターに組み込む工程と、２）発現ベクターを宿主細胞に移動する工程と、３）前記発現ベクターの発現に適する条件で前記宿主細胞を培養する工程と、４）アルギニン光学プローブを分離する工程と、を含む、上記アルギニン光学プローブの調製方法を更に提供する。
以下、図面と実施例を参照しながら、本発明を具体的に説明する。
図１は、実施例２に係るアルギニン蛍光プローブのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析図である。
図２は、黄色蛍光タンパク質ｃｐＹＦＰがアルギニン結合タンパク質の異なる部位に挿入されることで形成されるアルギニン蛍光プローブのアルギニンに対する応答の変化図である。
図３は、緑色蛍光タンパク質ｃｐＧＦＰがアルギニン結合タンパク質の異なる部位に挿入されることで形成されるアルギニン蛍光プローブのアルギニンに対する応答の変化図である。
図４は、青色蛍光タンパク質ｃｐＢＦＰがアルギニン結合タンパク質の異なる部位に挿入されることで形成されるアルギニン蛍光プローブのアルギニンに対する応答の変化図である。
図５は、アップルレッド蛍光タンパク質ｃｐｍＡｐｐｌｅがアルギニン結合タンパク質の異なる部位に挿入されることで形成されるアルギニン蛍光プローブのアルギニンに対する応答の変化図である。
図６は、黄色蛍光タンパク質ｃｐＹＦＰがアルギニン結合タンパク質の１０７／１１１部位に挿入されることで形成されるアルギニン蛍光プローブを基にＳ３０、Ｒ９６、Ｄ１７７部位で突然変異した場合のアルギニンに対する応答の変化図である。
図７Ａ～Ｂは、１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１１０、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１９７／１９９、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０５、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０５、２０２／２０５、２０３／２０６、２０４／２０５、２０４／２０６の異なる部位に挿入されることで形成されるアルギニン蛍光プローブの異なる濃度のアルギニンに対する滴定曲線である。
図７Ａ～Ｂは、１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１１０、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１９７／１９９、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０５、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０５、２０２／２０５、２０３／２０６、２０４／２０５、２０４／２０６の異なる部位に挿入されることで形成されるアルギニン蛍光プローブの異なる濃度のアルギニンに対する滴定曲線である。
図８は、１０４／１１０、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２０１／２０２の異なる部位に挿入されることで形成されるアルギニン蛍光プローブの２０種類アミノ酸に対する特異性の検出である。
図９Ａ～Ｂは、例示的なアルギニン蛍光プローブの蛍光スペクトル特性図である。
図９Ａ～Ｂは、例示的なアルギニン蛍光プローブの蛍光スペクトル特性図である。
図１０は、例示的なアルギニン蛍光プローブの哺乳動物細胞におけるサブオルガネラ局在の分析図である。
図１１は、アルギニン蛍光プローブの哺乳動物細胞におけるアルギニン膜貫通輸送に対する動的監視である。
図１２は、実施例１１に係る生細胞レベルでアルギニン蛍光プローブによるハイスループット化合物選別の分析図である。
図１３は、実施例１２に係るアルギニン蛍光プローブのマウスとヒト血液におけるアルギニンに対する定量の分析図である。
数値又は範囲を示す場合、本明細書に使用される用語「約」とは、当該数値又は範囲が所定数値又は範囲の２０％以内、１０％以内及び５％以内であることを指す。
本明細書に使用される用語「含む」、「備える」及び「含有」と「…からなる」などを含むこれらの同等の形態とは、例えば、Ｘを「含む」組成物の場合、Ｘのみからなってもよく、或いは、例えば、Ｘ＋Ｙのように、その他の物質を含んでもよいことを意味する。
本明細書に使用される用語「アルギニン感受性ポリペプチド」又は「アルギニン応答性ポリペプチド」とは、アルギニンに対して応答するポリペプチドを指す。前記応答は、感受性ポリペプチドの相互作用に関するポリペプチドの化学、生物学、電気学又は生理学パラメーターの任意応答を含む。応答は、例えば、ポリペプチドのアミノ酸又はペプチド断片の方向の変化などの小さい変化、及び、例えば、プロトン化、電気化学ポテンシャル及び／又は立体配座の変化などの、例えばポリペプチドの一次、二次又は三次構造の変化を含む。「立体配座」は、分子のうちの、ペンダント基を備える分子の一次、二次及び三次構造の立体配置である。分子の立体構造が変化した場合、立体配座が変化する。立体配座の変化の実例は、αヘリックスからβシートへの変換、又はβシートからαヘリックスへの変換を含む。検出された変更が立体配座の変更でなくても、蛍光タンパク質部分の蛍光が変更されればよいと、理解してもよい。本明細書に記載されるアルギニン感受性ポリペプチドはその機能的バリアントを更に含んでもよい。アルギニン感受性ポリペプチドの機能的バリアントは、アルギニンと相互作用することで、親アルギニン感受性ポリペプチドと相同又は類似な変化が発生できるバリアントを含むが、これらに限定されない。
本発明に係るアルギニン感受性ポリペプチドは、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）に由来するアルギニン結合タンパク質ＳＴＭ４３５１又は大腸菌（Escherichia coli）に由来するアルギニン周辺質結合タンパク質、或いはそれと９０％以上の相同性を有するバリアントを含むが、これらに限定されない。これらの結合タンパク質は、２つの構造ドメインからなり、２つの構造ドメインが２つの柔らかいアミノ酸のペプチド鎖により連結される。アルギニン結合タンパク質がアルギニン濃度変化を感知でき、アルギニン濃度の動的変化過程においてアルギニン結合タンパク質の立体配座が大きく変化する。ＳＴＭ４３５１がアルギニン結合／規制ドメインとＤＮＡ結合ドメインからなる。例示的なＳＴＭ４３５１タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。１つ又は複数の実施形態において、アルギニン感受性ポリペプチドがＳＴＭ４３５１タンパク質のアルギニン結合ドメインを含むが、ＤＮＡ結合ドメインを含まない。
本明細書に使用される用語「光学プローブ」とは、光学活性ポリペプチドと融合するアルギニン感受性ポリペプチドを指す。発明者は、アルギニン感受性ポリペプチド、例えば、アルギニン結合タンパク質が生理濃度のアルギニンに特異的に結合することで発生された立体配座の変化により、光学活性ポリペプチド（例えば、蛍光タンパク質）の立体配座の変化が起こされて、更に光学活性ポリペプチドの光学特性の変化が起こされること、を発見した。アルギニンの異なる濃度で測定された蛍光タンパク質の蛍光を基に検量線を作成することで、アルギニンの存在及び／又はレベルを検出及び分析できる。本発明の光学プローブを記載する場合（例えば、挿入部位又は突然変異部位を記載する場合）に言及されるアミノ酸残基番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を参照する。
本発明の光学プローブにおいて、光学活性ポリペプチド（例えば、蛍光タンパク質）がアルギニン感受性ポリペプチドに操作可能に挿入される。タンパク質に基づく「光学活性ポリペプチド」は蛍光放出能力を有するポリペプチドである。蛍光は光学活性ポリペプチドの光学特性であり、本発明の光学プローブの応答性の検出手段として利用してもよい。好ましくは、未活性化と活性化の立体配座状態で容易に区別できる蛍光特性を有するように、タンパク質の基質を選択する。本明細書に記載される光学活性ポリペプチドがその機能的バリアントであってもよい。光学活性ポリペプチドの機能的バリアントは、親光学活性ポリペプチドと相同又は類似な蛍光特性の変化が発生できるバリアントを含むが、これらに限定されない。
本明細書に使用される用語「蛍光タンパク質」とは、励起光の照射により蛍光が放出されるタンパク質を指す。蛍光タンパク質は、生物学分野における基本的な検出手段として、例えば、バイオテクノロジー分野でよく使われる緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ、及び、当該タンパク質の突然変異により誘導される環状転位の青色蛍光タンパク質（ｃｐＢＦＰ）、環状転位の緑色蛍光タンパク質（ｃｐＧＦＰ）、環状転位の黄色蛍光タンパク質（ｃｐＹＦＰ）などが挙げられるが、更に、本技術分野でよく使われる赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ、及び、例えば、ｃｐｍＡｐｐｌｅ、ｃｐｍＯｒａｎｇｅ、ｃｐｍＫａｔｅなどの当該タンパク質により誘導される環状転位のタンパク質が挙げられる。本分野では、本発明に利用できる蛍光タンパク質及びその配列が知られている。例示的に、ｃｐＹＦＰはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、ｃｐＧＦＰはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、ｃｐＢＦＰはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示され、ｃｐｍＡｐｐｌｅはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
「リンカー」又は「リンカー領域」とは、本発明のポリペプチド、タンパク質又は核酸において、２つの部分を連結するアミノ酸又はヌクレオチド配列を指す。例示的に、本発明において、アルギニン感受性ポリペプチドと光学活性ポリペプチドのリンカー領域のアミノ基末端のアミノ酸数が０～３個に選択され、カルボキシ基末端のアミノ酸数が０～２個に選択されるが、組換え光学プローブは基本的なユニットとして機能性タンパク質に連結される場合、組換え光学プローブのアミノ酸又はカルボキシ基末端に融合されてもよい。リンカー配列は、例えば、Ｙである、１つ又は複数の柔らかいアミノ酸からなる短鎖ペプチドであってもよい。
本発明に係るアルギニン光学プローブは、例えばアルギニン結合タンパク質又はそのバリアントであるアルギニン感受性ポリペプチドＢと、例えば蛍光タンパク質である光学活性ポリペプチドＡとを含む。光学活性ポリペプチドＡがアルギニン感受性ポリペプチドＢに挿入され、ＢがＢ１とＢ２の２つの部分に分けられ、Ｂ１－Ａ－Ｂ２式のプローブ構造が形成される。アルギニン感受性ポリペプチドＢがアルギニンと相互作用することで、光学活性ポリペプチドＡの光シグナルが強くなる。
本発明の光学プローブにおいて、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの任意部位にあってもよい。一実施形態において、光学活性ポリペプチドがＮ－Ｃ方向でＮ－Ｃ方向のアルギニン感受性ポリペプチドの任意部位にある。具体的に、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドのフレキシブル領域にある。前記フレキシブル領域とは、環状構造ドメインなど、タンパク質の高次構造に存在する幾つかの特別な構造を指す。これらの構造ドメインがタンパク質のその他の高次構造より高い移動性と柔軟性を有すると共に、当該領域は当該タンパク質がリガンドに結合した後に、立体構造の立体配座が動的に変化する。本発明に係るフレキシブル領域は、主にアルギニン結合タンパク質における挿入部位のある領域を指し、例えば、アミノ酸残基の１０２～１１２及び１９６～２１０領域である。一実施形態において、光学活性ポリペプチドが、アルギニン感受性ポリペプチドの以下から選ばれる１つ又は複数の部位、即ち、１０３／１０４、１０３／１０５、１０３／１０６、１０３／１０７、１０３／１０８、１０３／１０９、１０３／１１０、１０３／１１１、１０４／１０５、１０４／１０６、１０４／１０７、１０４／１０８、１０４／１０９、１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１０７、１０５／１０８、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０７、１０６／１０８、１０６／１０９、１０６／１１０、１０６／１１１、１０７／１０８、１０７／１０９、１０７／１１０、１０７／１１１、１０８／１０９、１０８／１１０、１０８／１１１、１０９／１１０、１０９／１１１、１１０／１１１、１９７／１９８、１９７／１９９、１９７／２００、１９７／２０１、１９７／２０２、１９７／２０３、１９７／２０４、１９７／２０５、１９７／２０６、１９７／２０７、１９７／２０８、１９７／２０９、１９８／１９９、１９８／２００、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９８／２０４、１９８／２０５、１９８／２０６、１９８／２０７、１９８／２０８、１９８／２０９、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、１９９／２０５、１９９／２０６、１９９／２０７、１９９／２０８、１９９／２０９、２００／２０１、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２００／２０７、２００／２０８、２００／２０９、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０４、２０１／２０５、２０１／２０６、２０１／２０７、２０１／２０８、２０１／２０９、２０２／２０３、２０２／２０４、２０２／２０５、２０２／２０６、２０２／２０７、２０２／２０８、２０２／２０９、２０３／２０４、２０３／２０５、２０３／２０６、２０３／２０７、２０３／２０８、２０３／２０９、２０４／２０５、２０４／２０６、２０４／２０７、２０４／２０８、２０４／２０９、２０５／２０６、２０５／２０７、２０５／２０８、２０５／２０９、２０６／２０７、２０６／２０８、２０６／２０９、２０７／２０８、２０７／２０９又は２０８／２０９にある。本明細書において、「Ｘ／Ｙ」の形で表される部位の２つの数字が連続する整数である場合、光学活性ポリペプチドが当該数字に示されるアミノ酸の間にあることを示す。例えば、挿入部位９３／９４は、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドのアミノ酸９３と９４の間にあることを示す。「Ｘ／Ｙ」の形で表される部位の２つの数字が連続する整数ではない場合、当該数字に示されるアミノ酸の間のアミノ酸が光学活性ポリペプチドで置換されることを示す。例えば、挿入部位９３／９７は、アルギニン感受性ポリペプチドのアミノ酸９４～９６が光学活性ポリペプチドで置換されることを示す。好ましくは、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの以下から選ばれる１つ又は複数の部位、即ち、１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１１０、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０２、１９９／２００、１９９／２０２、２００／２０３、２００／２０５、２０１／２０２、２０１／２０５、２０２／２０５、２０３／２０６、２０４／２０５又は２０４／２０６にある。
特定のポリペプチド又はタンパク質が言及される場合、本発明で使用される用語「バリアント」又は「ミュータント」は、前記ポリペプチド又はタンパク質と相同な機能を有するが、配列が異なるバリアントを含む。ポリペプチド又はタンパク質のバリアントは、相同性配列、保存的バリアント、対立遺伝子バリアント、自然発生ミュータント、誘発ミュータントを含んでもよい。これらのバリアントは、前記ポリペプチド又はタンパク質の配列に１つ又は複数の（通常は１～３０個であり、好ましくは１～２０個であり、より好ましくは１～１０個であり、最も好ましくは１～５個である）アミノ酸が欠失、挿入及び／又は置換され、及びそのカルボキシ基末端及び／又はアミノ基末端に１つ又は複数の（通常は２０個以下であり、好ましくは１０個以下であり、より好ましくは５個以下である）アミノ酸が付加されることで得られた配列を含むが、これらに限定されない。これらのバリアントは、前記ポリペプチド又はタンパク質との配列同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は１００％であるポリペプチド又はタンパク質を更に含んでもよい。理論に拘束されずに、アミノ酸残基が変化しても、ポリペプチド又はタンパク質の全体の立体配置と機能が変化しないこと、即ち、機能的保存突然変異が好ましい。例えば、本分野において、近い特性又は類似的な特性を持つアミノ酸で置換した場合、通常、ポリペプチド又はタンパク質の機能が変化することはない。本分野において、通常、類似的な特性を持つアミノ酸は、類似的な側鎖を有するアミノ酸ファミリーであり、本分野では明確に定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。また、例えば、アミノ基末端及び／又はカルボキシ基末端に１つ又は複数のアミノ酸が付加された場合でも、通常、ポリペプチド又はタンパク質の機能が変化することはない。一般的に知られている様々な非遺伝性コードアミノ酸の保存的なアミノ酸置換については、本分野で既に知られている。その他の非コードアミノ酸の保存的な置換はその物理特性と遺伝性コードアミノ酸の特性との比較によって決定される。
２つ以上のポリペプチド又は核酸分子配列において、用語「同一性」又は「同一性パーセンテージ」は、手作業の整列によるか、または目視検査による、配列比較アルゴリズムなどの当技術分野で公知の方法を使用して測定するとおり、比較ウィンドウまたは指定領域にわたる最大の一致について比較および整列を行う場合に、同じである２つ以上の配列もしくはサブ配列、または、特定の領域にわたり同じである、アミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセントを有する（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である）。例えば、配列同一性パーセンテージと配列類似性パーセンテージの測定に適する好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３をそれぞれ参照できる。
遺伝子クローン操作では、適切な制限酵素切断部位を常に設計する必要があるため、発現されるポリペプチド又はタンパク質末端に１つ又は複数の無関係な残基が導入されるが、目標ポリペプチド又はタンパク質の活性に影響を与えないことは、当業者にとって周知である。また、例えば、融合タンパク質の構築、組換えタンパク質発現の促進、宿主細胞外に自動的に分泌される組換えタンパク質の取得、又は組換えタンパク質精製の支援のために、常に特定のアミノ酸を組換えタンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端又は当該タンパク質のその他の適切な領域に付加する必要がある。当該タンパク質のその他の適切な領域は、例えば、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端延長、グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、タンパク質Ａ、６Ｈｉｓ又はＦｌａｇなどのタグ、又はＦａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビン或いはエンテロキナーゼのタンパク質分解酵素部位を含むが、これらに限定されない。
本発明の光学プローブは突然変異を有するアルギニン感受性ポリペプチドを含んでもよい。一実施形態において、前記突然変異がアルギニン結合タンパク質の３０（Ｓ）、９６（Ｒ）及び１７７（Ｄ）番目にある。例示的に、前記突然変異がＳ３０Ｎ、Ｄ１７７Ｎ、Ｒ９６Ｍ、Ｒ９６Ｋである。本発明の光学プローブにおけるアルギニン感受性ポリペプチドが前記ミュータントであってもよい。例示的な実施形態において、本発明の光学プローブは、アルギニン結合タンパク質の１０７／１１１部位にｃｐＹＦＰが挿入されると共に、Ｓ３０Ｎ、Ｄ１７７Ｎ、Ｒ９６Ｍ及びＲ９６Ｋから選ばれる１つ又は複数の突然変異を有するプローブであってもよい。
本明細書に使用される用語「機能断片」、「誘導体」及び「類似体」とは、元のポリペプチド又はタンパク質（例えば、アルギニン結合タンパク質又は蛍光タンパク質）と相同な生物学機能又は活性を基本的に保持するタンパク質を指す。本発明のポリペプチド又はタンパク質（例えば、アルギニン結合タンパク質又は蛍光タンパク質）の機能的バリアント、誘導体或いは類似体は、（i）１つ又は複数の保存的な又は非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換され、当該置換されるアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされてもよく、或いはコードされなくてもよいタンパク質、（ii）１つ又は複数のアミノ酸残基に置換基を有するタンパク質、（iii）成熟したタンパク質がその他の化合物（例えば、ポリエチレングリコールなどの、タンパク質の半減期を延長する化合物）に融合して形成されたタンパク質、或いは（iv）付加されたアミノ酸配列が当該タンパク質配列に融合されて形成されたタンパク質（例えば、分泌配列、当該タンパク質を精製するための配列又はタンパク質構成配列、或いは抗原ＩｇＧ断片と形成された融合タンパク質）であってもよい。本明細書に教示されるように、これらの機能的バリアント、誘導体及び類似体は、当業者の周知範囲である。
前記類似体と元のポリペプチド又はタンパク質との相違点は、アミノ酸配列の相違点であってもよく、配列に影響を与えない修飾形態の相違点であってもよく、或いはその両方であってもよい。これらのタンパク質は天然又は誘導の遺伝的バリアントを含む。誘導バリアントは様々な技術により得られるが、例えば、放射により、又は突然変異誘起剤に暴露させることで、ランダムな突然変異を誘発し、或いは、部位特異的突然変異誘発法又はその他の既知の分子生物学技術により得られる。
前記類似体は、天然Ｌ－アミノ酸と異なる残基（例えば、Ｄ－アミノ酸）を有する類似体、及び天然に存在しないアミノ酸又は合成したアミノ酸（例えば、β、γ－アミノ酸）を有する類似体、を更に含む。本発明のアルギニン感受性ポリペプチドは、上記に挙げられる代表的なタンパク質、バリアント、誘導体及び類似体に限定されない、と理解すべきである。修飾（通常、一次構造を変更しない）形態は、例えば、アセチル化又はカルボキシル化などの、インビボ又はインビトロにおけるタンパク質の化学誘導形態を含む。修飾はグリコシル化を更に含むが、例えば、タンパク質の合成と加工過程中に、又は更なる加工工程中にグリコシル化修飾を行うことで産生されたタンパク質が挙げられる。当該修飾は、タンパク質を、グリコシル化を行う酵素（例えば、哺乳動物のグリコシラーゼ又は脱グリコシル化酵素）に暴露させることで実施する。修飾形態は、リン酸化されるアミノ酸の残基（例えば、リン酸化チロシン、リン酸化セリン、リン酸化スレオニン）を有する配列を更に含む。修飾されることで、タンパク質分解防止特性が向上され、又は溶解性が改善されたタンパク質を更に含む。
本発明の融合ポリペプチドは、本明細書に記載される光学プローブとその他のポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される光学プローブはそれと融合するその他のポリペプチドを更に含む。本明細書に記載されるその他のポリペプチドが光学プローブの特性に影響を与えない。その他のポリペプチドは前記光学プローブのＮ末端及び／又はＣ末端にあってもよい。幾つかの実施形態において、その他のポリペプチドが、光学プローブを異なるオルガネラ又はサブオルガネラに局在させるポリペプチドと、精製用タグ又はイムノブロット用タグを含む。本明細書に記載される融合ポリペプチドにおける光学プローブとその他のポリペプチドとの間にはリンカーを有してもよい。
本明細書に記載されるサブオルガネラは、細胞質、ミトコンドリア、細胞核、小胞体、細胞膜、ゴルジ体、リソソーム及びペルオキシソームなどを含む。幾つかの実施形態において、精製するためのタグ又はイムノブロットのためのタグは、６ヒスチジン（６＊Ｈｉｓ）、グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ＧＳＴ）、Ｆｌａｇを含む。
本発明の発現ベクターは、発現制御配列に操作可能に連結される本発明に係る核酸配列又はその相補配列を含み、当該核酸配列が本発明に係る光学プローブ又は融合ポリペプチドをコードする。本発明で使用される用語「核酸」、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸配列」はＤＮＡ形態又はＲＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡ形態はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は人工合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖又は二本鎖であってもよい。ＤＮＡはコード鎖又は非コード鎖であってもよい。核酸が言及される場合、本明細書に使用される用語「バリアント」は、天然に発生する対立遺伝子バリアント又は天然に発生しないバリアントであってもよい。これらのヌクレオチドバリアントは、縮退バリアント、置換バリアント、欠失バリアント及び挿入バリアントを含む。本分野で知られているように、対立遺伝子バリアントは１つの核酸の交換形態であり、１つ又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入であってもよいが、それによりコードされるタンパク質の機能を実質的に変更することはない。本発明の核酸は、前記核酸配列との配列同一性が少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は１００％であるヌクレオチド配列を含んでもよい。本発明は上記配列とハイブリダイゼーションを行う核酸断片に更に関する。本明細書に使用される「核酸断片」の長さは、少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。核酸断片は核酸の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）に利用できる。
本発明の光学プローブ又は融合タンパク質の全長配列或いはその断片は、通常、ＰＣＲ増幅法、人工合成法又は組換え法により得られる。ＰＣＲ増幅法について、本発明に開示されたヌクレオチド配列に応じてプライマーを設計し、市販されるｃＤＮＡライブラリー又は当業者の既知の通常方法により調製されるｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして増幅して、関連配列を得る。ヌクレオチド配列が２５００ｂｐより大きい場合、好ましくはＰＣＲ増幅を２～６回行った後に、それぞれ増幅された断片を正確な順番で結合する。本発明は、前記ＰＣＲ増幅の過程とシステムについて特に限定せず、本分野における通常のＰＣＲ増幅過程とシステムを利用すればよい。更に組換え法により関連配列を大量に得ることができる。通常、それをベクターにクローニングして、細胞に導入した後に、通常の方法により増殖した宿主細胞から分離・精製して関連ポリペプチド又はタンパク質を得る。また、特に断片の長さが短い場合、人工合成方法により関連配列を合成してもよい。本発明において、光学プローブのヌクレオチド配列が２５００ｂｐより小さい場合、人工合成方法により合成してもよい。前記人工合成方法は、本分野における通常のＤＮＡ人工合成方法であり、その他の要求が特にない。通常、複数の小さい断片を合成した後に、これらを結合して長い配列の断片を得る。現在、化学合成だけにより、本発明のタンパク質（又はその機能的バリアント、誘導体或いは類似体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。その後、当該ＤＮＡ配列を本分野における既知の様々な既存ＤＮＡ分子（例えば、ベクター）と細胞に導入する。突然変異ＰＣＲ又は化学合成などの方法により突然変異を本発明のタンパク質配列に導入してもよい。
本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、及びこれらの配列に操作可能に連結される１つ又は複数の調節配列を含む核酸コンストラクトにも関する。本発明に係るポリヌクレオチドは、前記ポリペプチド又はタンパク質の発現を確実にするために、様々な形態で操作されてもよい。核酸コンストラクトをベクターに挿入する前に、発現ベクターの相違点又は要求に応じて核酸コンストラクトを操作してもよい。組換えＤＮＡ方法でポリヌクレオチド配列を変更する技術は本分野で既知である。
特定の実施形態において、前記核酸コンストラクトはベクターである。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、又は相同組換えベクターであってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドなどの、様々なタイプのベクターにクローニングされてもよい。クローニングベクターは、本発明のタンパク質又はポリペプチドのコード配列の提供に利用できる。発現ベクターは細菌ベクター又はウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。通常、本発明のポリヌクレオチドをプロモーターに操作可能に連結すると共に、コンストラクトを発現ベクターに導入することで、本発明のポリヌクレオチドの発現が実現される。当該ベクターは真核細胞の複製と統合に適する。代表的な発現ベクターは、所望される核酸配列の発現の調節に利用できる発現制御配列を含む。１つ又は複数の実施形態において、クローニングベクターと発現ベクターは同じベクター、即ちクローニング発現ベクターである。相同組換えベクターは本明細書に記載される発現カセットを宿主ゲノムに統合するために利用される。
本明細書に使用される用語「発現制御配列」とは、ターゲット遺伝子の転写、翻訳と発現を調節すると共に、ターゲット遺伝子に操作可能に連結されるエレメントを指し、複製開始点、プロモーター、マーカー遺伝子又は翻訳制御エレメントであってもよく、エンハンサー、オペロン、ターミネーター、リボソーム結合部位などを含む。発現制御配列の選択は使用される宿主細胞によって決定される。組換え発現ベクターにおいて、「操作可能に連結」とは、ターゲットヌクレオチド配列がヌクレオチド配列発現可能な形態で調節配列に連結されることを指す。本発明の融合タンパク質のコード配列と適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの構築方法は当業者にとってよく知られている。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、インビボ組換え技術などを含む。ｍＲＮＡ合成を案内するために、前記ＤＮＡ配列を発現ベクターにおける適切なプロモーターに有効的に連結してもよい。これらのプロモーターの代表的な例として、大腸菌のｌａｃ又はｔｒｐプロモーター；λファージＰＬプロモーター；及び、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、並びにその他の既知の制御可能な遺伝子の、原核細胞又は真核細胞或いはそのウイルスにおいて発現するプロモーターなどを含む真核細胞プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、翻訳開始に利用されるリボソーム結合部位と転写ターミネーターを更に含む。一実施形態において、発現ベクターは市販されるｐＥＴ２８ａベクターを使用可能とし、その他の要求が特にない。例示的に、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩを使用して、それぞれ前記光学プローブをコードするヌクレオチド配列と発現ベクターに対してダブルダイジェストを行った後に、両者のダイジェスト産物を連結して組換え発現ベクターを得る。本発明は、ダイジェストと連結の具体的な工程及びパラメーターが特に限定されず、本分野における通常の工程及びパラメーターを使用すればよい。
融合タンパク質を含むタンパク質又はペプチドを産生するために、組換え発現ベクターを得た後に、当該ベクターを宿主細胞に形質転換する。このような導入過程は、形質転換又はトランスフェクションなどの当業者が熟知する通常の技術により実施できる。本発明に係る宿主細胞とは、組換えＤＮＡ分子を受入れて収容できる細胞を指し、組換え遺伝子を増幅する場所である。望ましい受容体細胞は、容易に取得・増殖できるという、２つの条件を満たすものとする。本発明の「宿主細胞」は、原核細胞と真核細胞を含み、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を具体的に含む。具体的に、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、植物細胞、ミバエＳ２又はＳｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ細胞、又はＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞などが挙げられ、上記のような宿主細胞を含むが、これらに限定されない。前記宿主細胞は、遺伝子産物の発現又は発酵生産に有利な様々な細胞が好ましい。これらの細胞は本分野で熟知されると共に、よく使われている。本発明の実施例で使用される例示的な宿主細胞が大腸菌ＪＭ１０９－ＤＥ３菌株である。当業者は適切なベクター、プロモーター、エンハンサー及び宿主細胞の選択方法をはっきりと知っている。
本発明に係る宿主細胞への導入方法は、本分野における通常の方法であり、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ－マンナン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、ナチュラルコンピテンス、化学的に媒介される導入又はエレクトロポレーションを含む。宿主が大腸菌などの原核細胞である場合、好ましくは、前記方法はＣａＣｌ２法又はＭｇＣｌ２法で処理することであり、使用される工程は本分野において周知である。宿主細胞が真核細胞である場合、リン酸カルシウム共沈法などのＤＮＡトランスフェクション法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージングなどの通常機械方法を選択してもよい。
本発明は、発現ベクターを宿主細胞に導入した後に、発現ベクターに導入された宿主細胞を増幅・発現・培養し、更に分離してアルギニン光学プローブを得る。前記宿主細胞の増幅・発現・培養は通常の方法を使用すればよい。培養に使用される培地は、使用される宿主細胞の種類によって、様々な通常の培地であってもよい。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。
本発明において、光学プローブが細胞内、細胞膜に発現され、又は細胞外に分泌される。必要に応じて、その物理的、化学的、及びその他の特性を利用して、様々な分離方法で組換えタンパク質を分離又は精製してもよい。本発明は、前記アルギニン蛍光タンパク質の分離方法が特に限定されず、本分野における通常の融合タンパク質の分離方法を使用すればよい。これらの方法は、当業者が熟知するものであり、通常の再生処理、塩析方法、遠心分離、浸透殺菌、超音波処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びその他の様々な液体クロマトグラフィー技術、並びにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、Ｈｉｓタグのアフィニティークロマトグラフィーにより光学プローブを分離する。
本発明は、前記アルギニン光学プローブの、アルギニンのリアルタイム局在、定量検出及びハイスループット化合物選別における使用を更に提供する。一様態において、前記アルギニン光学プローブは、好ましくは、細胞の異なる部位のシグナルペプチドに連結されて、細胞に導入され、細胞における蛍光シグナルの強弱を検出することで、アルギニンに対してリアルタイム局在を行い、アルギニン標準滴定曲線により対応するアルギニンの定量検出を行う。本発明に係るアルギニン標準滴加曲線は、アルギニン光学プローブの、異なる濃度のアルギニンにある場合の蛍光シグナルにより作成したものである。本発明に係るアルギニン光学プローブが細胞に直接的に導入されるため、アルギニンのリアルタイム局在及び定量検出過程において、時間がかかるサンプル処理過程を必要とせず、より正確である。本発明のアルギニン光学プローブは、ハイスループット化合物選別を行う場合、異なる化合物を細胞の培養液に添加して、アルギニン含有量の変化を測定することで、アルギニン含有量の変化に影響を与える化合物を選別する。本発明に係るアルギニン光学プローブの、アルギニンのリアルタイム局在、定量検出及びハイスループット化合物選別における使用は、いずれも診断及び治療目的のものではなく、疾患の診断及び治療に関わることはない。
本明細書において、濃度、含有量、パーセンテージ及びその他の数値は、レンジ形式で示すことができる。便利性と簡潔性を考慮した上で、レンジ形式を採用することにしたが、当該レンジ形式は、レンジの上限と下限としてはっきりと示される数値を含み、当該レンジに含まれる全ての単一の数値又はサブレンジを更に含むことと適切に読み替える、と理解すべきである。
以下、実施例を参照しながら本発明により提供されるアルギニン蛍光プローブについて詳しく説明するが、本発明の保護範囲を限定するものではないと理解すべきである。
Ｉ． 実験材料及び試薬
実施例では、主に通常の遺伝子工学分子生物学クローン方法、細胞培養及びイメージング方法などを利用する。これらの方法は当業者が熟知するものである。例えば、Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓら、「Ｌａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ」；Ｊｏｓｅｐｈ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ著、黄培堂ら訳、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第３版、２００２年８月、科学出版社により出版、北京）；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（第５版）、章静波、徐存▲栓▼ら訳；Ｊｕａｎ Ｓ． Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ、Ｍ．Ｄａｓｓａｕｌｔら、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、章静波ら訳、が挙げられる。
実施例では、主に通常の遺伝子工学分子生物学クローン方法、細胞培養及びイメージング方法などを利用する。これらの方法は当業者が熟知するものである。例えば、Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓら、「Ｌａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ」；Ｊｏｓｅｐｈ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ著、黄培堂ら訳、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第３版、２００２年８月、科学出版社により出版、北京）；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（第５版）、章静波、徐存▲栓▼ら訳；Ｊｕａｎ Ｓ． Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ、Ｍ．Ｄａｓｓａｕｌｔら、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、章静波ら訳、が挙げられる。
実施例で使用されるｐＥＴ２８ａ－ｃｐＹＦＰ、ｐＥＴ２８ａ－アルギニン結合タンパク質に基づくプラスミドは華東理工大学タンパク質実験室により構築され、ｐＥＴ２８ａプラスミドベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入される。ＰＣＲに使用される全てのプライマーは上海捷瑞生物工程技術有限公司により合成・精製されるが、質量分析法により鑑定した結果、適切である。実施例で構築された発現プラスミドは配列決定された。配列決定は華大遺伝子公司と傑李シークエンシング公司により実施された。各実施例で使用されるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは東盛生物より購入され、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは天根生化科技（北京）有限公司より購入され、ｐｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼはＴａＫａＲａ社より購入された。３種のポリメラーゼは、購入時に対応するポリメラーゼ緩衝液とｄＮＴＰが付帯されている。ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩなどの制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４リガーゼ、Ｔ４ホスホリラーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）はＦｅｒｍｅｎｔａｓ社より購入され、購入時に対応する緩衝液などが付帯されている。トランスフェクション試薬Ｌｉｐ２０００ ＫｉｔはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入される。アルギニンなどは全てＳｉｇｍａ社より購入される。特に断りのない限り、無機塩類などの化学試薬は全てＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入される。ＨＥＰＥＳ塩、アンピシリン（Ａｍｐ）及びピューロマイシンはＡｍｅｒｅｓｃｏ社より購入される。９６ウェルテストプレート（黒）、３８４ウェル蛍光テストプレート（黒）はＧｒｅｎｉｅｒ社より購入される。
実施例で使用されるＤＮＡ精製試薬キットはＢＢＩ社（カナダ）より購入され、一般プラスミド少量抽出キットは天根生化科技（北京）有限公司より購入される。クローン株Ｍａｃｈ１はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入される。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムと脱塩カラムのパッキングはＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より購入される。
実施例で使用される主な機器は、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２マルチモードマイクロプレートリーダー（アメリカＢｉｏ－Ｔｅｋ社）、Ｘ－１５Ｒ高速冷凍遠心機（アメリカＢｅｃｋｍａｎ社）、Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ２２Ｒ卓上式高速冷凍遠心機（アメリカＢｅｃｋｍａｎ社）、ＰＣＲ増幅装置（ドイツＢｉｏｍｅｔｒａ社）、超音波破砕機（寧波新芝公司）、核酸電気泳動装置（申能博彩公司）、蛍光分光光度計（アメリカＶａｒｉａｎ社）、ＣＯ２インキュベーター（ＳＡＮＹＯ）、倒立蛍光顕微鏡（日本Ｎｉｋｏｎ社）を含む。
II． 分子生物学方法及び細胞実験方法
II．１ ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：
１．目標断片増幅ＰＣＲ：
当該方法は主に遺伝子断片の増幅及びコロニーＰＣＲによる陽性クローン鑑定に利用される。前記ＰＣＲ増幅の反応系は下記の通りであり、即ち、テンプレート配列０．５～１μＬ、フォワードプライマー（２５μＭ）０．５μＬ、リバースプライマー（２５μＭ）０．５μＬ、１０×ｐｆｕ緩衝液５μＬ、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）１μＬ、滅菌超純水（ｄｄＨ２Ｏ）４１．５～４２μＬ、総体積５０μＬである。ＰＣＲ増幅過程は下記の通りであり、即ち、９５℃で２～１０分間変性し、３０サイクル（９４～９６℃で３０～４５秒間保持、５０～６５℃で３０～４５秒間保持、７２℃で一定時間保持（６００ｂｐ／ｍｉｎ））を行い、７２℃で１０分間延長する。
II．１ ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：
１．目標断片増幅ＰＣＲ：
当該方法は主に遺伝子断片の増幅及びコロニーＰＣＲによる陽性クローン鑑定に利用される。前記ＰＣＲ増幅の反応系は下記の通りであり、即ち、テンプレート配列０．５～１μＬ、フォワードプライマー（２５μＭ）０．５μＬ、リバースプライマー（２５μＭ）０．５μＬ、１０×ｐｆｕ緩衝液５μＬ、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）１μＬ、滅菌超純水（ｄｄＨ２Ｏ）４１．５～４２μＬ、総体積５０μＬである。ＰＣＲ増幅過程は下記の通りであり、即ち、９５℃で２～１０分間変性し、３０サイクル（９４～９６℃で３０～４５秒間保持、５０～６５℃で３０～４５秒間保持、７２℃で一定時間保持（６００ｂｐ／ｍｉｎ））を行い、７２℃で１０分間延長する。
２．長断片（＞２５００ｂｐ）増幅ＰＣＲ：
本発明に使用される長断片増幅は、主にインバースＰＣＲの増幅ベクターであり、下記実施例において部位特異的突然変異を得るための技術である。変異部位にインバースＰＣＲプライマーを設計し、そのうちの１本のプライマーの５’末端に変異したヌクレオチド配列が含まれる。増幅された産物は対応する突然変異部位を含む。長断片増幅ＰＣＲ反応系は下記の通りであり、即ち、テンプレート配列（１０ｐｇ～１ｎｇ）１μＬ、フォワードプライマー（２５μＭ）０．５μＬ、リバースプライマー（２５μＭ）０．５μＬ、５×ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ緩衝液１０μＬ、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μＬ、滅菌超純水（ｄｄＨ２Ｏ）３３．５μＬ、総体積５０μＬである。ＰＣＲ増幅過程は下記の通りであり、即ち、９５℃で５分間変性し、３０サイクル（９８℃で１０秒間保持、５０～６８℃で５～１５秒間保持、７２℃で一定時間保持（１０００ｂｐ／ｍｉｎ））を行い、７２℃で１０分間延長し、或いは、９５℃で５分間変性し、３０サイクル（９８℃で１０秒間保持、６８℃で一定時間保持（１０００ｂｐ／ｍｉｎ））を行い、７２℃で１０分間延長する。
本発明に使用される長断片増幅は、主にインバースＰＣＲの増幅ベクターであり、下記実施例において部位特異的突然変異を得るための技術である。変異部位にインバースＰＣＲプライマーを設計し、そのうちの１本のプライマーの５’末端に変異したヌクレオチド配列が含まれる。増幅された産物は対応する突然変異部位を含む。長断片増幅ＰＣＲ反応系は下記の通りであり、即ち、テンプレート配列（１０ｐｇ～１ｎｇ）１μＬ、フォワードプライマー（２５μＭ）０．５μＬ、リバースプライマー（２５μＭ）０．５μＬ、５×ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ緩衝液１０μＬ、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μＬ、滅菌超純水（ｄｄＨ２Ｏ）３３．５μＬ、総体積５０μＬである。ＰＣＲ増幅過程は下記の通りであり、即ち、９５℃で５分間変性し、３０サイクル（９８℃で１０秒間保持、５０～６８℃で５～１５秒間保持、７２℃で一定時間保持（１０００ｂｐ／ｍｉｎ））を行い、７２℃で１０分間延長し、或いは、９５℃で５分間変性し、３０サイクル（９８℃で１０秒間保持、６８℃で一定時間保持（１０００ｂｐ／ｍｉｎ））を行い、７２℃で１０分間延長する。
II．２ エンドヌクレアーゼによるダイジェスト反応：
プラスミドベクターに対してダブルダイジェストを行う系は下記の通りであり、即ち、プラスミドベクター２０μＬ（約１．５μｇ）、１０×緩衝液５μＬ、制限エンドヌクレアーゼ１１～２μＬ、制限エンドヌクレアーゼ２１～２μＬであり、総体積５０μＬとなるように滅菌超純水を補充する。反応条件３７℃で、１～７時間反応する。
プラスミドベクターに対してダブルダイジェストを行う系は下記の通りであり、即ち、プラスミドベクター２０μＬ（約１．５μｇ）、１０×緩衝液５μＬ、制限エンドヌクレアーゼ１１～２μＬ、制限エンドヌクレアーゼ２１～２μＬであり、総体積５０μＬとなるように滅菌超純水を補充する。反応条件３７℃で、１～７時間反応する。
II．３ ＤＮＡ断片５’末端のリン酸化反応
微生物から抽出されたプラスミド又はゲノム末端にはリン酸基が含まれるが、ＰＣＲ産物には含まれない。ＤＮＡ分子の末端にリン酸基を含まなければ、連結反応できないため、ＰＣＲ産物の５’末端の塩基に対してリン酸基付加反応を行う。リン酸化反応系は下記の通りであり、即ち、ＰＣＲ産物断片のＤＮＡ配列５～８μＬ、１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液１μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）１μＬ、滅菌超純水０～３μＬ、総体積１０μＬである。反応条件３７℃で、３０分間～２時間反応した後に、７２℃で２０分間不活化する。
微生物から抽出されたプラスミド又はゲノム末端にはリン酸基が含まれるが、ＰＣＲ産物には含まれない。ＤＮＡ分子の末端にリン酸基を含まなければ、連結反応できないため、ＰＣＲ産物の５’末端の塩基に対してリン酸基付加反応を行う。リン酸化反応系は下記の通りであり、即ち、ＰＣＲ産物断片のＤＮＡ配列５～８μＬ、１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液１μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）１μＬ、滅菌超純水０～３μＬ、総体積１０μＬである。反応条件３７℃で、３０分間～２時間反応した後に、７２℃で２０分間不活化する。
II．４ 目標断片とベクターの連結反応
異なる断片によりベクターとの連結方法には相違点がある。本発明では３つの連結方法を使用した。
異なる断片によりベクターとの連結方法には相違点がある。本発明では３つの連結方法を使用した。
１．平滑末端の短断片とリニアベクターとの平滑末端連結
当該方法のメカニズムとして、ＰＣＲにより得られた平滑末端産物がＴ４ ＰＮＫの作用を受けてＤＮＡ断片の５’末端に対してリン酸化反応を行った後に、ＰＥＧ４０００とＴ４ ＤＮＡリガーゼの作用を受け、リニア化されたベクターに連結して、組換えプラスミドを得る。相同組換え連結系は下記の通りであり、即ち、Ｔ４ ＰＮＫで処理されたＤＮＡ断片４μＬ、リニアベクター断片４μＬ、ＰＥＧ４０００ １μＬ、１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液１μＬ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、合計１０μＬである。反応条件２２℃で、３０分間反応する。
当該方法のメカニズムとして、ＰＣＲにより得られた平滑末端産物がＴ４ ＰＮＫの作用を受けてＤＮＡ断片の５’末端に対してリン酸化反応を行った後に、ＰＥＧ４０００とＴ４ ＤＮＡリガーゼの作用を受け、リニア化されたベクターに連結して、組換えプラスミドを得る。相同組換え連結系は下記の通りであり、即ち、Ｔ４ ＰＮＫで処理されたＤＮＡ断片４μＬ、リニアベクター断片４μＬ、ＰＥＧ４０００ １μＬ、１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液１μＬ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、合計１０μＬである。反応条件２２℃で、３０分間反応する。
２．粘着末端が含まれるＤＮＡ断片と粘着末端が含まれるベクター断片との連結
制限エンドヌクレアーゼにより切断されたＤＮＡ断片は、通常、突出した粘着末端が産生されるため、配列と相補的な粘着末端が含まれるベクター断片に連結して、組換えプラスミドを形成することができる。連結反応系は下記の通りであり、即ち、ダイジェスト後のＰＣＲ産物断片のＤＮＡ １～７μＬ、ダイジェスト後のプラスミド０．５～７μＬ、１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液１μＬ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬであり、総体積１０μＬとなるように滅菌超純水を補充する。反応条件１６℃で、４～８時間反応する。
制限エンドヌクレアーゼにより切断されたＤＮＡ断片は、通常、突出した粘着末端が産生されるため、配列と相補的な粘着末端が含まれるベクター断片に連結して、組換えプラスミドを形成することができる。連結反応系は下記の通りであり、即ち、ダイジェスト後のＰＣＲ産物断片のＤＮＡ １～７μＬ、ダイジェスト後のプラスミド０．５～７μＬ、１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液１μＬ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬであり、総体積１０μＬとなるように滅菌超純水を補充する。反応条件１６℃で、４～８時間反応する。
３．インバースＰＣＲに部位特異的突然変異が導入された後、５’末端がリン酸化したＤＮＡ断片産物の自己環化による連結反応
５’末端がリン酸化したＤＮＡ断片に対して自己環化により連結反応を行い、リニアベクターの３’末端と５’末端に対して連結反応を行って、組換えプラスミドを得る。自己環化連結反応系は下記の通りであり、即ち、リン酸化反応系１０μＬ、Ｔ４リガーゼ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ、総体積１０．５μＬである。反応条件１６℃で、４～１６時間反応する。
５’末端がリン酸化したＤＮＡ断片に対して自己環化により連結反応を行い、リニアベクターの３’末端と５’末端に対して連結反応を行って、組換えプラスミドを得る。自己環化連結反応系は下記の通りであり、即ち、リン酸化反応系１０μＬ、Ｔ４リガーゼ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ、総体積１０．５μＬである。反応条件１６℃で、４～１６時間反応する。
II．５ コンピテントセルの調製及び形質転換
コンピテントセルの調製：
１．シングルコロニー（例えば、Ｍａｃｈ１）を選定して、５ｍＬ ＬＢ培地に接種し、３７℃でシェーカーに一晩置く。
２．一晩培養したバクテリア液０．５～１ｍＬを取り、５０ｍＬ ＬＢ培地に移植し、３７℃、２２０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．５に達するまで、３～５時間培養する。
３．氷浴で細胞を２時間予冷する。
４．４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
５．上澄を捨て、予冷された緩衝液５ｍＬで細胞を再懸濁させ、均一になってから、最終体積が５０ｍＬとなるように、再懸濁緩衝液を入れる。
６．氷浴に４５分間置く。
７．４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、氷で予冷された保存緩衝液５ｍＬで細菌を再懸濁させる。
８．各ＥＰ管に１００μＬバクテリア液を入れて、－８０℃又は液体窒素で凍結保存する。
再懸濁緩衝液：ＣａＣｌ２（１００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（７０ｍＭ）、ＮａＡｃ（４０ｍＭ）
保存緩衝液：０．５ｍＬ ＤＭＳＯ、１．９ｍＬ ８０％グリセリン、１ｍＬ １０×ＣａＣｌ２（１Ｍ）、１ｍＬ １０×ＭｇＣｌ２（７００ｍＭ）、１ｍＬ １０×ＮａＡｃ（４００ｍＭ）、４．６ｍＬ ｄｄＨ２Ｏ
コンピテントセルの調製：
１．シングルコロニー（例えば、Ｍａｃｈ１）を選定して、５ｍＬ ＬＢ培地に接種し、３７℃でシェーカーに一晩置く。
２．一晩培養したバクテリア液０．５～１ｍＬを取り、５０ｍＬ ＬＢ培地に移植し、３７℃、２２０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．５に達するまで、３～５時間培養する。
３．氷浴で細胞を２時間予冷する。
４．４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
５．上澄を捨て、予冷された緩衝液５ｍＬで細胞を再懸濁させ、均一になってから、最終体積が５０ｍＬとなるように、再懸濁緩衝液を入れる。
６．氷浴に４５分間置く。
７．４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、氷で予冷された保存緩衝液５ｍＬで細菌を再懸濁させる。
８．各ＥＰ管に１００μＬバクテリア液を入れて、－８０℃又は液体窒素で凍結保存する。
再懸濁緩衝液：ＣａＣｌ２（１００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（７０ｍＭ）、ＮａＡｃ（４０ｍＭ）
保存緩衝液：０．５ｍＬ ＤＭＳＯ、１．９ｍＬ ８０％グリセリン、１ｍＬ １０×ＣａＣｌ２（１Ｍ）、１ｍＬ １０×ＭｇＣｌ２（７００ｍＭ）、１ｍＬ １０×ＮａＡｃ（４００ｍＭ）、４．６ｍＬ ｄｄＨ２Ｏ
コンピテントセルの形質転換：
１．１００μＬコンピテントセルを取り、氷浴で溶けさせる。
２．適切な体積の連結産物を入れて、ゆっくりと均一に吹き、氷浴で３０分間置く。通常、入れた連結産物の体積がコンピテントセルの体積の１／１０より小さい。
３．バクテリア液を４２℃水浴に入れ、熱衝撃を９０秒間与えてから、速やかに氷浴に移動して、５分間置く。
４．５００μＬ ＬＢを入れて、３７℃恒温シェーカーを利用して２００ｒｐｍで１時間培養する。
５．バクテリア液を４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、２００μＬ上澄を残して、菌体を均一に吹き、適切な抗生物質が含まれる寒天プレート表面に均一に塗布して、プレートを反転して３７℃恒温インキュベーターに一晩置く。
１．１００μＬコンピテントセルを取り、氷浴で溶けさせる。
２．適切な体積の連結産物を入れて、ゆっくりと均一に吹き、氷浴で３０分間置く。通常、入れた連結産物の体積がコンピテントセルの体積の１／１０より小さい。
３．バクテリア液を４２℃水浴に入れ、熱衝撃を９０秒間与えてから、速やかに氷浴に移動して、５分間置く。
４．５００μＬ ＬＢを入れて、３７℃恒温シェーカーを利用して２００ｒｐｍで１時間培養する。
５．バクテリア液を４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、２００μＬ上澄を残して、菌体を均一に吹き、適切な抗生物質が含まれる寒天プレート表面に均一に塗布して、プレートを反転して３７℃恒温インキュベーターに一晩置く。
II．６ タンパク質の発現、精製及び蛍光検出
１．ｐＥＴ２８ａを基にするアルギニンプローブプラスミドをＪＭ１０９（ＤＥ３）に変換し、反転して一晩培養し、プレートから選択して、２５０ｍｌ三角フラスコにクローニングし、３７℃シェーカーに置き、ＯＤ＝０．４～０．８となるように２２０ｒｐｍで培養し、１／１０００（ｖ／ｖ）のＩＰＴＧ（１Ｍ）を入れて、１８℃で２４～３６時間誘導発現する。
２．誘導発現が完了した後、４０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して菌体を収穫し、５０ｍＭリン酸塩緩衝液を入れて、菌体の沈殿物を再懸濁させ、菌体が透き通るまで超音波で破砕する。９６００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。
３．上澄を遠心分離し、自己装填式Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムにより精製してタンパク質を取得し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより処理されたタンパク質を、更に自己装填式脱塩カラムにより処理して、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）又はリン酸塩緩衝液ＰＢＳに溶解されたタンパク質を取得した。
４．精製されたアルギニン結合タンパク質変異タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより鑑定した後、測定緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）又はリン酸塩緩衝液ＰＢＳで最終濃度５～１０μＭのタンパク質溶液となるようにプローブを希釈させる。測定緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）又はリン酸塩緩衝液ＰＢＳでアルギニンを最終濃度１Ｍの保存液に調製する。
５．１００μｌの５μＭタンパク質溶液を取り、３７℃で５分間インキュベートし、それぞれアルギニンを入れて最終濃度１００ｍＭとなるように均一に混ぜて、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーによりタンパク質の３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
６．１００μｌの１μＭ蛍光プローブ溶液を取り、３７℃で５分間インキュベートし、アルギニンを入れて滴定し、タンパク質が４８５ｎｍ蛍光により励起されて放出した５２８ｎｍ蛍光の強度を測定する。サンプルに対する蛍光の励起、放出蛍光の測定はマルチモード蛍光マイクロプレートリーダーにより実施する。
７．１００μｌの１μＭ蛍光プローブ溶液を取り、３７℃で５分間インキュベートし、アルギニンを入れて、プローブタンパク質の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定する。サンプルに対する吸収スペクトルと蛍光スペクトルの測定は分光光度計と蛍光分光光度計により実施する。
１．ｐＥＴ２８ａを基にするアルギニンプローブプラスミドをＪＭ１０９（ＤＥ３）に変換し、反転して一晩培養し、プレートから選択して、２５０ｍｌ三角フラスコにクローニングし、３７℃シェーカーに置き、ＯＤ＝０．４～０．８となるように２２０ｒｐｍで培養し、１／１０００（ｖ／ｖ）のＩＰＴＧ（１Ｍ）を入れて、１８℃で２４～３６時間誘導発現する。
２．誘導発現が完了した後、４０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して菌体を収穫し、５０ｍＭリン酸塩緩衝液を入れて、菌体の沈殿物を再懸濁させ、菌体が透き通るまで超音波で破砕する。９６００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。
３．上澄を遠心分離し、自己装填式Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムにより精製してタンパク質を取得し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより処理されたタンパク質を、更に自己装填式脱塩カラムにより処理して、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）又はリン酸塩緩衝液ＰＢＳに溶解されたタンパク質を取得した。
４．精製されたアルギニン結合タンパク質変異タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより鑑定した後、測定緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）又はリン酸塩緩衝液ＰＢＳで最終濃度５～１０μＭのタンパク質溶液となるようにプローブを希釈させる。測定緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）又はリン酸塩緩衝液ＰＢＳでアルギニンを最終濃度１Ｍの保存液に調製する。
５．１００μｌの５μＭタンパク質溶液を取り、３７℃で５分間インキュベートし、それぞれアルギニンを入れて最終濃度１００ｍＭとなるように均一に混ぜて、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーによりタンパク質の３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
６．１００μｌの１μＭ蛍光プローブ溶液を取り、３７℃で５分間インキュベートし、アルギニンを入れて滴定し、タンパク質が４８５ｎｍ蛍光により励起されて放出した５２８ｎｍ蛍光の強度を測定する。サンプルに対する蛍光の励起、放出蛍光の測定はマルチモード蛍光マイクロプレートリーダーにより実施する。
７．１００μｌの１μＭ蛍光プローブ溶液を取り、３７℃で５分間インキュベートし、アルギニンを入れて、プローブタンパク質の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定する。サンプルに対する吸収スペクトルと蛍光スペクトルの測定は分光光度計と蛍光分光光度計により実施する。
II．７ 哺乳動物細胞のトランスフェクションと蛍光検出
１．ＰＡＡＶを基にするアルギニンプローブプラスミドをトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＨｅＬａにトランスフェクションして、３７℃と５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて培養する。外来遺伝子を２４～３６時間で十分に発現してから蛍光検出を行う。
２．誘導発現が完了した後、接着培養されたＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＨＢＳＳ溶液に入れて、蛍光顕微鏡とマイクロプレートリーダー検出をそれぞれ行う。
１．ＰＡＡＶを基にするアルギニンプローブプラスミドをトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＨｅＬａにトランスフェクションして、３７℃と５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて培養する。外来遺伝子を２４～３６時間で十分に発現してから蛍光検出を行う。
２．誘導発現が完了した後、接着培養されたＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＨＢＳＳ溶液に入れて、蛍光顕微鏡とマイクロプレートリーダー検出をそれぞれ行う。
実施例１：アルギニン結合タンパク質プラスミド
ＰＣＲによりアグロバクテリウムツメファシェンス遺伝子におけるＳＴＭ４３５１遺伝子を増幅させ、ＰＣＲ産物に対してゲル電気泳動を行った後に回収して、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでダイジェストした。それと同時に、ｐＥＴ２８ａベクターに対して同様にダブルダイジェストを行った。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結した後、産物を連結してＴｒａｎｓ５ａを変換し、変換されたＴｒａｎｓ５ａをＬＢプレート（カナマイシン１００ｕｇ／ｍＬ）に塗布して、３７℃で一晩培養した。成長されたＴｒａｎｓ５ａトランスフォーマントに対してプラスミドを抽出した後に、ＰＣＲ鑑定を実施した。陽性プラスミドに対してシークエンシングを行った結果、正確である場合、その後のプラスミド構築を行った。
ＰＣＲによりアグロバクテリウムツメファシェンス遺伝子におけるＳＴＭ４３５１遺伝子を増幅させ、ＰＣＲ産物に対してゲル電気泳動を行った後に回収して、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでダイジェストした。それと同時に、ｐＥＴ２８ａベクターに対して同様にダブルダイジェストを行った。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結した後、産物を連結してＴｒａｎｓ５ａを変換し、変換されたＴｒａｎｓ５ａをＬＢプレート（カナマイシン１００ｕｇ／ｍＬ）に塗布して、３７℃で一晩培養した。成長されたＴｒａｎｓ５ａトランスフォーマントに対してプラスミドを抽出した後に、ＰＣＲ鑑定を実施した。陽性プラスミドに対してシークエンシングを行った結果、正確である場合、その後のプラスミド構築を行った。
実施例２：異なる挿入部位のｃｐＹＦＰ光学プローブの発現及び検出
本実施例において、ｐＥＴ２８ａ－ＳＴＭ４３５１を基に、アルギニン結合タンパク質の結晶構造に応じて、下記の部位、即ち、１０３／１０４、１０３／１０５、１０３／１０６、１０３／１０７、１０３／１０８、１０３／１０９、１０３／１１０、１０３／１１１、１０４／１０５、１０４／１０６、１０４／１０７、１０４／１０８、１０４／１０９、１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１０７、１０５／１０８、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０７、１０６／１０８、１０６／１０９、１０６／１１０、１０６／１１１、１０７／１０８、１０７／１０９、１０７／１１０、１０７／１１１、１０８／１０９、１０８／１１０、１０８／１１１、１０９／１１０、１０９／１１１、１１０／１１１、１９７／１９８、１９７／１９９、１９７／２００、１９７／２０１、１９７／２０２、１９７／２０３、１９７／２０４、１９７／２０５、１９７／２０６、１９７／２０７、１９７／２０８、１９７／２０９、１９８／１９９、１９８／２００、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９８／２０４、１９８／２０５、１９８／２０６、１９８／２０７、１９８／２０８、１９８／２０９、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、１９９／２０５、１９９／２０６、１９９／２０７、１９９／２０８、１９９／２０９、２００／２０１、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２００／２０７、２００／２０８、２００／２０９、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０４、２０１／２０５、２０１／２０６、２０１／２０７、２０１／２０８、２０１／２０９、２０２／２０３、２０２／２０４、２０２／２０５、２０２／２０６、２０２／２０７、２０２／２０８、２０２／２０９、２０３／２０４、２０３／２０５、２０３／２０６、２０３／２０７、２０３／２０８、２０３／２０９、２０４／２０５、２０４／２０６、２０４／２０７、２０４／２０８、２０４／２０９、２０５／２０６、２０５／２０７、２０５／２０８、２０５／２０９、２０６／２０７、２０６／２０８、２０６／２０９、２０７／２０８、２０７／２０９又は２０８／２０９を選択してｃｐＹＦＰを挿入し、対応するプラスミドを得た。例示的な光学プローブの酸配列は表１に示される。
本実施例において、ｐＥＴ２８ａ－ＳＴＭ４３５１を基に、アルギニン結合タンパク質の結晶構造に応じて、下記の部位、即ち、１０３／１０４、１０３／１０５、１０３／１０６、１０３／１０７、１０３／１０８、１０３／１０９、１０３／１１０、１０３／１１１、１０４／１０５、１０４／１０６、１０４／１０７、１０４／１０８、１０４／１０９、１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１０７、１０５／１０８、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０７、１０６／１０８、１０６／１０９、１０６／１１０、１０６／１１１、１０７／１０８、１０７／１０９、１０７／１１０、１０７／１１１、１０８／１０９、１０８／１１０、１０８／１１１、１０９／１１０、１０９／１１１、１１０／１１１、１９７／１９８、１９７／１９９、１９７／２００、１９７／２０１、１９７／２０２、１９７／２０３、１９７／２０４、１９７／２０５、１９７／２０６、１９７／２０７、１９７／２０８、１９７／２０９、１９８／１９９、１９８／２００、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９８／２０４、１９８／２０５、１９８／２０６、１９８／２０７、１９８／２０８、１９８／２０９、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、１９９／２０５、１９９／２０６、１９９／２０７、１９９／２０８、１９９／２０９、２００／２０１、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２００／２０７、２００／２０８、２００／２０９、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０４、２０１／２０５、２０１／２０６、２０１／２０７、２０１／２０８、２０１／２０９、２０２／２０３、２０２／２０４、２０２／２０５、２０２／２０６、２０２／２０７、２０２／２０８、２０２／２０９、２０３／２０４、２０３／２０５、２０３／２０６、２０３／２０７、２０３／２０８、２０３／２０９、２０４／２０５、２０４／２０６、２０４／２０７、２０４／２０８、２０４／２０９、２０５／２０６、２０５／２０７、２０５／２０８、２０５／２０９、２０６／２０７、２０６／２０８、２０６／２０９、２０７／２０８、２０７／２０９又は２０８／２０９を選択してｃｐＹＦＰを挿入し、対応するプラスミドを得た。例示的な光学プローブの酸配列は表１に示される。
ＰＣＲによりｃｐＹＦＰのＤＮＡ断片を産生し、５’末端のリン酸基付加操作により当該ＤＮＡ断片を不活性化させると共に、インバースＰＣＲ増幅により異なる切断部位が含まれるｐＥＴ２８ａ－アルギニン結合タンパク質リニアベクターを産生し、ＰＥＧ４０００とＴ４ ＤＮＡリガーゼの作用を受けて、リニア化されたｐＥＴ２８ａ－ＳＴＭ４３５１と５’末端がリン酸化されたｃｐＹＦＰ断片を連結して組換えプラスミドを産生し、これらのプレートをＫｏｄａｋ多機能生体イメージングシステムに置き、ＦＩＴＣチャンネルにより励起されて黄色蛍光が放出されたクローンを選択し、北京六合華大基因科技股▲分▼有限公司上海支社によりシークエンシングが実施された。
シークエンシングを行った結果、正確である場合、組換えプラスミドをＪＭ１０９（ＤＥ３）に形質転換して誘導発現すると共に、タンパク質を精製して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行った結果、サイズが約５５Ｋｄａであった。当該サイズは、ｐＥＴ２８ａ－ＳＴＭ４３５１－ｃｐＹＦＰにより発現されたＨｉｓ－ｔａｇ精製タグが含まれるＳＴＭ４３５１－ｃｐＹＦＰ融合タンパク質のサイズと一致する。結果は図１に示される。
精製されたＳＴＭ４３５１－ｃｐＹＦＰ融合タンパク質のアルギニン応答選別を実施した。１００ｍＭアルギニンが含まれる融合蛍光タンパク質の検出シグナルを、アルギニンを含まない融合蛍光タンパク質の検出シグナルで割る。結果は図２に示され、検出結果によれば、アルギニンに対する応答が２倍を上回るのは、１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９８／２０１、１９９／２００、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０５、２０４／２０５部位である。
実施例３．異なる挿入部位のｃｐＧＦＰ光学プローブの発現及び検出
実施例１の方法によりｃｐＹＦＰを緑色蛍光タンパク質ｃｐＧＦＰに変更し、アルギニン結合タンパク質に融合してアルギニン緑色蛍光タンパク質蛍光プローブを構築し、実施例２の方法により発現と検出を行った。結果は図３に示され、蛍光検出結果によれば、アルギニンに対する応答が２倍を上回るのは、１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９８／２０１、１９９／２００、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０５、２０４／２０５部位である。
実施例１の方法によりｃｐＹＦＰを緑色蛍光タンパク質ｃｐＧＦＰに変更し、アルギニン結合タンパク質に融合してアルギニン緑色蛍光タンパク質蛍光プローブを構築し、実施例２の方法により発現と検出を行った。結果は図３に示され、蛍光検出結果によれば、アルギニンに対する応答が２倍を上回るのは、１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９８／２０１、１９９／２００、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０５、２０４／２０５部位である。
実施例４．異なる挿入部位のｃｐＢＦＰ光学プローブの発現及び検出
実施例１の方法によりｃｐＹＦＰを青色蛍光タンパク質ｃｐＢＦＰに変更し、アルギニン結合タンパク質に融合してアルギニン青色蛍光タンパク質蛍光プローブを構築し、実施例２の方法により発現と検出を行った。結果は図４に示され、蛍光検出結果によれば、アルギニンに対する応答が２倍を上回るのは、１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９８／２０１、１９９／２００、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０５、２０４／２０５部位である。
実施例１の方法によりｃｐＹＦＰを青色蛍光タンパク質ｃｐＢＦＰに変更し、アルギニン結合タンパク質に融合してアルギニン青色蛍光タンパク質蛍光プローブを構築し、実施例２の方法により発現と検出を行った。結果は図４に示され、蛍光検出結果によれば、アルギニンに対する応答が２倍を上回るのは、１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９８／２０１、１９９／２００、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０５、２０４／２０５部位である。
実施例５．異なる挿入部位のｃｐｍＡｐｐｌｅ光学プローブの発現及び検出
実施例１の方法によりｃｐＹＦＰをアップルレッド蛍光タンパク質ｃｐｍＡｐｐｌｅに変更し、アルギニン結合タンパク質に融合してアルギニン赤色蛍光タンパク質蛍光プローブを構築し、実施例２の方法により発現と検出を行った。結果は図５に示され、蛍光検出結果によれば、アルギニンに対する応答が２倍を上回るのは、１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９８／２０１、１９９／２００、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０５、２０４／２０５部位である。
実施例１の方法によりｃｐＹＦＰをアップルレッド蛍光タンパク質ｃｐｍＡｐｐｌｅに変更し、アルギニン結合タンパク質に融合してアルギニン赤色蛍光タンパク質蛍光プローブを構築し、実施例２の方法により発現と検出を行った。結果は図５に示され、蛍光検出結果によれば、アルギニンに対する応答が２倍を上回るのは、１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９８／２０１、１９９／２００、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０５、２０４／２０５部位である。
実施例６．突然変異したｃｐＹＦＰ光学プローブの発現及び検出
インバースＰＣＲリニア化プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＳＴＭ４３５１－１０７／１１１－ｃｐＹＦＰ、プライマーに突然変異しようとする部位が含まれる塩基配列により、ＰＮＫ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及びＰＥＧ４０００の作用を受けて、得られたＰＣＲ産物に対してリン酸基付加による連結を行い、Ｓ３０、Ｒ９６、Ｄ１７７の３つの部位の部位特異的変異プラスミドを得て、北京六合華大基因科技股▲分▼有限公司上海支社によりシークエンシングが実施された。実施例２の方法により発現と検出を行った。一部突然変異した光学プローブのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（１０７／１１１－Ｓ３０Ｎ）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１（１０７／１１１－Ｄ１７７Ｎ）に示され、核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２（Ｓ３０Ｎ－１０７／１１１）に示される。
結果は図６に示され、蛍光検出結果によれば、アルギニンに対する応答が３倍を上回るのは、Ｓ３０Ｎ－１０７／１１１及びＤ１７７Ｎ－１０７／１１１ミュータントである。
インバースＰＣＲリニア化プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＳＴＭ４３５１－１０７／１１１－ｃｐＹＦＰ、プライマーに突然変異しようとする部位が含まれる塩基配列により、ＰＮＫ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及びＰＥＧ４０００の作用を受けて、得られたＰＣＲ産物に対してリン酸基付加による連結を行い、Ｓ３０、Ｒ９６、Ｄ１７７の３つの部位の部位特異的変異プラスミドを得て、北京六合華大基因科技股▲分▼有限公司上海支社によりシークエンシングが実施された。実施例２の方法により発現と検出を行った。一部突然変異した光学プローブのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（１０７／１１１－Ｓ３０Ｎ）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１（１０７／１１１－Ｄ１７７Ｎ）に示され、核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２（Ｓ３０Ｎ－１０７／１１１）に示される。
結果は図６に示され、蛍光検出結果によれば、アルギニンに対する応答が３倍を上回るのは、Ｓ３０Ｎ－１０７／１１１及びＤ１７７Ｎ－１０７／１１１ミュータントである。
実施例７．プローブの滴定曲線及び特異性
２８個のＳＴＭ４３５１－ｃｐＹＦＰ融合タンパク質１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１１０、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１９７／１９９、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０５、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０５、２０２／２０５、２０３／２０６、２０４／２０５、２０４／２０６を選択して濃度勾配でアルギニン検出を行い、４２０ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度と４８５ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度との比の変化を検出した。異なる挿入部位１０５／１１０、１９９／２００、２００／２０３及び２００／２０５アルギニンプローブは、Ｋｄ（結合定数）がそれぞれ５．４μＭ、１１．７μＭ、５８．５μＭ及び１５μＭであり、レンジアビリティがそれぞれ４．３倍、１１．０倍、８．６倍及び３．０倍である。結果は図７Ａ～Ｂに示される。応答倍数が比較的に大きい挿入部位１０４／１１０、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２０１／２０２に対して特異性検出を行った。結果によれば、図８に示されるように、プローブはアルギニンに対して優れた特異性を有する。
２８個のＳＴＭ４３５１－ｃｐＹＦＰ融合タンパク質１０４／１１０、１０５／１０６、１０５／１１０、１０６／１０８、１０６／１０９、１０７／１０９、１９７／１９９、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０５、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０５、２０２／２０５、２０３／２０６、２０４／２０５、２０４／２０６を選択して濃度勾配でアルギニン検出を行い、４２０ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度と４８５ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度との比の変化を検出した。異なる挿入部位１０５／１１０、１９９／２００、２００／２０３及び２００／２０５アルギニンプローブは、Ｋｄ（結合定数）がそれぞれ５．４μＭ、１１．７μＭ、５８．５μＭ及び１５μＭであり、レンジアビリティがそれぞれ４．３倍、１１．０倍、８．６倍及び３．０倍である。結果は図７Ａ～Ｂに示される。応答倍数が比較的に大きい挿入部位１０４／１１０、１０７／１０９、１０７／１１１、１９７／２０３、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２０１／２０２に対して特異性検出を行った。結果によれば、図８に示されるように、プローブはアルギニンに対して優れた特異性を有する。
実施例８．プローブのスペクトル特性
応答倍数が比較的に高く、且つ特異性が優れたミュータントＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰを精製し、精製されたアルギニン蛍光プローブをそれぞれ０ｍＭ及び１００ｍＭアルギニンで１０分間処理した後に、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルの検出を行った。放出スペクトルの測定として、所定の励起波長がそれぞれ４２０ｎｍと４８５ｎｍであり、３６０～５４０ｎｍの放出スペクトルを記録して、５ｎｍ刻みで数値を読取った。アルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１０４／１１０－ｃｐＹＦＰのスペクトル曲線は図９Ａの第１図に示され、プローブは、５００ｍＭアルギニン添加後の４２０ｎｍ励起における蛍光強度の低下が０ｍＭアルギニン添加の１．４倍であり、４８５ｎｍ励起における蛍光強度の向上が０ｍＭアルギニン添加の２．０倍である。同じ条件で１０５／１０６、１０５／１１０、１０７／１１１、１９７／１９９、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０２、１９８／２０３、１９９／２００、１９９／２０２、１９９／２０５、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２０１／２０２、２０１／２０４、２０１／２０５、２０１／２０６、２０２／２０５及び２０４／２０５プローブに対して同じ処理を行い、そのスペクトル曲線は図９Ａ～Ｂに示される。
応答倍数が比較的に高く、且つ特異性が優れたミュータントＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰを精製し、精製されたアルギニン蛍光プローブをそれぞれ０ｍＭ及び１００ｍＭアルギニンで１０分間処理した後に、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルの検出を行った。放出スペクトルの測定として、所定の励起波長がそれぞれ４２０ｎｍと４８５ｎｍであり、３６０～５４０ｎｍの放出スペクトルを記録して、５ｎｍ刻みで数値を読取った。アルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１０４／１１０－ｃｐＹＦＰのスペクトル曲線は図９Ａの第１図に示され、プローブは、５００ｍＭアルギニン添加後の４２０ｎｍ励起における蛍光強度の低下が０ｍＭアルギニン添加の１．４倍であり、４８５ｎｍ励起における蛍光強度の向上が０ｍＭアルギニン添加の２．０倍である。同じ条件で１０５／１０６、１０５／１１０、１０７／１１１、１９７／１９９、１９７／２０３、１９７／２０４、１９８／２０２、１９８／２０３、１９９／２００、１９９／２０２、１９９／２０５、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２０１／２０２、２０１／２０４、２０１／２０５、２０１／２０６、２０２／２０５及び２０４／２０５プローブに対して同じ処理を行い、そのスペクトル曲線は図９Ａ～Ｂに示される。
実施例９．プローブのサブオルガネラ局在及びサブオルガネラにおける特性
本実施例において、異なる局在シグナルペプチドをアルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰのＣ末端又はＮ末端に融合すると共に、アルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰを異なるオルガネラに局在した。
異なる局在シグナルペプチドに融合するアルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ遺伝子のプラスミドをＨｅＬａ細胞に３６時間トランスフェクションした後に、ＰＢＳで洗浄し、ＨＢＳＳ溶液に置き、倒立蛍光顕微鏡によりＦＩＴＣチャンネルで蛍光検出を行った。アルギニン蛍光プローブＦＬＩＰｐｒｏが異なる特異的な局在シグナルペプチドに融合することで、細胞質、ミトコンドリア、細胞核、ゴルジ体、小胞体及び細胞膜などのサブオルガネラに局在することは発現された。結果は図１０に示され、異なるサブオルガネラ構造には蛍光が示されると共に、蛍光の分布と強度が様々である。
本実施例において、異なる局在シグナルペプチドをアルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰのＣ末端又はＮ末端に融合すると共に、アルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰを異なるオルガネラに局在した。
異なる局在シグナルペプチドに融合するアルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ遺伝子のプラスミドをＨｅＬａ細胞に３６時間トランスフェクションした後に、ＰＢＳで洗浄し、ＨＢＳＳ溶液に置き、倒立蛍光顕微鏡によりＦＩＴＣチャンネルで蛍光検出を行った。アルギニン蛍光プローブＦＬＩＰｐｒｏが異なる特異的な局在シグナルペプチドに融合することで、細胞質、ミトコンドリア、細胞核、ゴルジ体、小胞体及び細胞膜などのサブオルガネラに局在することは発現された。結果は図１０に示され、異なるサブオルガネラ構造には蛍光が示されると共に、蛍光の分布と強度が様々である。
実施例１０．アルギニン膜貫通輸送の動的監視
細胞質で発現するＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ遺伝子のプラスミドをＨｅＬａ細胞に３６時間トランスフェクションした後に、ＰＢＳで洗浄し、ＨＢＳＳ溶液に置いてから、４０ｍｉｎ時間内に４２０ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度と４８５ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度との比の変化を検出した。結果は図１１に示され、飢餓のまま２時間経過した後、１０ｍＭアルギニンを添加してから２０分間検出し、ｒａｔｉｏ４８５／４２０が徐々に２．２倍にも増加した。ＳＴＭ４３５１－１０５／１１０－ｃｐＹＦＰプローブ及びＳＴＭ４３５１－２００／２０３－ｃｐＹＦＰプローブと同様である。
細胞質で発現するＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ遺伝子のプラスミドをＨｅＬａ細胞に３６時間トランスフェクションした後に、ＰＢＳで洗浄し、ＨＢＳＳ溶液に置いてから、４０ｍｉｎ時間内に４２０ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度と４８５ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度との比の変化を検出した。結果は図１１に示され、飢餓のまま２時間経過した後、１０ｍＭアルギニンを添加してから２０分間検出し、ｒａｔｉｏ４８５／４２０が徐々に２．２倍にも増加した。ＳＴＭ４３５１－１０５／１１０－ｃｐＹＦＰプローブ及びＳＴＭ４３５１－２００／２０３－ｃｐＹＦＰプローブと同様である。
実施例１１．生細胞レベルでプローブに基づくハイスループット化合物の選別
本実施例において、アルギニンプローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ細胞質で発現するＨｅＬａ細胞によりハイスループット化合物を選別した。
ＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ遺伝子がトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞をＰＢＳで洗浄してから、ＨＢＳＳ溶液（アルギニン無添加）に置き、１時間処理した後に、１０μＭ化合物で１時間処理した。アルギニンをそれぞれ滴下した。マイクロプレートリーダーにより４２０ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度と４８５ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度との比の変化を記録した。任意の化合物で処理していないサンプルを標準とした。結果は図１２に示され、２０００種の化合物で細胞を処理した後、大部分の化合物が細胞へのアルギニン進入に対して影響が小さい。細胞のアルギニンに対する摂取能力を向上する化合物は１６種であり、また、細胞のアルギニンに対する摂取を明らかに低下する化合物は１１種である。
本実施例において、アルギニンプローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ細胞質で発現するＨｅＬａ細胞によりハイスループット化合物を選別した。
ＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ遺伝子がトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞をＰＢＳで洗浄してから、ＨＢＳＳ溶液（アルギニン無添加）に置き、１時間処理した後に、１０μＭ化合物で１時間処理した。アルギニンをそれぞれ滴下した。マイクロプレートリーダーにより４２０ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度と４８５ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度との比の変化を記録した。任意の化合物で処理していないサンプルを標準とした。結果は図１２に示され、２０００種の化合物で細胞を処理した後、大部分の化合物が細胞へのアルギニン進入に対して影響が小さい。細胞のアルギニンに対する摂取能力を向上する化合物は１６種であり、また、細胞のアルギニンに対する摂取を明らかに低下する化合物は１１種である。
実施例１２．プローブの血中アルギニンに対する定量検出
本実施例において、精製されたアルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰタンパク質でマウス及びヒトの血液上澄におけるアルギニンを分析した。
アルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ蛍光タンパク質と希釈された血液上澄を１０分間混ぜた後に、マイクロプレートリーダーにより４２０ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度と４８５ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度の比を検出した。結果は図１３に示され、マウス血液におけるアルギニン含有量は約５６μＭであり、ヒト血液におけるアルギニン含有量は約６８μＭである。
上記の実施例によれば、本発明により提供されるアルギニン蛍光プローブは、タンパク質分子量が比較的に小さく、且つ成熟しやすく、蛍光の動的変化が大きく、特異性が良好であると共に、遺伝子操作の方法により細胞で発現でき、細胞内外においてアルギニンに対してリアルタイム局在、定量検出を行うことができ、更にハイスループットで化合物選別を行うことができる。
本実施例において、精製されたアルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰタンパク質でマウス及びヒトの血液上澄におけるアルギニンを分析した。
アルギニン蛍光プローブＳＴＭ４３５１－１９９／２００－ｃｐＹＦＰ蛍光タンパク質と希釈された血液上澄を１０分間混ぜた後に、マイクロプレートリーダーにより４２０ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度と４８５ｎｍ励起５２８ｎｍ放出における蛍光強度の比を検出した。結果は図１３に示され、マウス血液におけるアルギニン含有量は約５６μＭであり、ヒト血液におけるアルギニン含有量は約６８μＭである。
上記の実施例によれば、本発明により提供されるアルギニン蛍光プローブは、タンパク質分子量が比較的に小さく、且つ成熟しやすく、蛍光の動的変化が大きく、特異性が良好であると共に、遺伝子操作の方法により細胞で発現でき、細胞内外においてアルギニンに対してリアルタイム局在、定量検出を行うことができ、更にハイスループットで化合物選別を行うことができる。
上記に記載されるものは本発明の好ましい実施形態である。当業者にとって本発明の原理を逸脱することなく、幾つかの改良や修飾を行うことができる。これらの改良や修飾は本発明の保護範囲と見なす。
Claims (10)
- アルギニン感受性ポリペプチドと光学活性ポリペプチドを含む光学プローブであって、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの配列内にある光学プローブ。
- 請求項１に記載の光学プローブであって、アルギニン感受性ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列又はその機能断片、或いはそれと３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有する配列を有する光学プローブ。
- 請求項１または請求項２に記載の光学プローブであって、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの残基１０２～１１２及び／又は１９６～２１０にあり、
好ましくは、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの以下から選ばれる１つ又は複数の部位、即ち、１０３／１０４、１０３／１０５、１０３／１０６、１０３／１０７、１０３／１０８、１０３／１０９、１０３／１１０、１０３／１１１、１０４／１０５、１０４／１０６、１０４／１０７、１０４／１０８、１０４／１０９、１０４／１１０、１０４／１１１、１０５／１０６、１０５／１０７、１０５／１０８、１０５／１０９、１０５／１１０、１０５／１１１、１０６／１０７、１０６／１０８、１０６／１０９、１０６／１１０、１０６／１１１、１０７／１０８、１０７／１０９、１０７／１１０、１０７／１１１、１０８／１０９、１０８／１１０、１０８／１１１、１０９／１１０、１０９／１１１、１１０／１１１、１９７／１９８、１９７／１９９、１９７／２００、１９７／２０１、１９７／２０２、１９７／２０３、１９７／２０４、１９７／２０５、１９７／２０６、１９７／２０７、１９７／２０８、１９７／２０９、１９８／１９９、１９８／２００、１９８／２０１、１９８／２０２、１９８／２０３、１９８／２０４、１９８／２０５、１９８／２０６、１９８／２０７、１９８／２０８、１９８／２０９、１９９／２００、１９９／２０１、１９９／２０２、１９９／２０３、１９９／２０４、１９９／２０５、１９９／２０６、１９９／２０７、１９９／２０８、１９９／２０９、２００／２０１、２００／２０２、２００／２０３、２００／２０４、２００／２０５、２００／２０６、２００／２０７、２００／２０８、２００／２０９、２０１／２０２、２０１／２０３、２０１／２０４、２０１／２０５、２０１／２０６、２０１／２０７、２０１／２０８、２０１／２０９、２０２／２０３、２０２／２０４、２０２／２０５、２０２／２０６、２０２／２０７、２０２／２０８、２０２／２０９、２０３／２０４、２０３／２０５、２０３／２０６、２０３／２０７、２０３／２０８、２０３／２０９、２０４／２０５、２０４／２０６、２０４／２０７、２０４／２０８、２０４／２０９、２０５／２０６、２０５／２０７、２０５／２０８、２０５／２０９、２０６／２０７、２０６／２０８、２０６／２０９、２０７／２０８、２０７／２０９及び２０８／２０９にあり、
好ましくは、前記アルギニン感受性ポリペプチドが下記部位、即ち、Ｓ３０、Ｒ９６、Ｄ１７７から選ばれる部位における突然変異を含み、好ましくは、前記突然変異がＳ３０Ｎ、Ｄ１７７Ｎ、Ｒ９６Ｍ、Ｒ９６Ｋである光学プローブ。 - 請求項３に記載の光学プローブであって、光学活性ポリペプチドがアルギニン感受性ポリペプチドの残基１０２～１１２及び／又は１９７～２１０にある光学プローブ。
- 核酸配列であって、
（１）請求項１～４の何れか１項に記載の光学プローブをコードするポリヌクレオチド、
（２）（１）の断片、
（３）（１）又は（２）の相補配列から選ばれる、核酸配列。 - 請求項５に記載の核酸配列を含み、好ましくは、発現ベクターである、核酸コンストラクト。
- 宿主細胞であって、
（１）請求項１～４の何れか１項に記載の光学プローブを発現し、
（２）請求項５に記載の核酸配列を含み、又は
（３）請求項６に記載の核酸コンストラクトを含む、宿主細胞 - 請求項７に記載の宿主細胞を培養すること、及び培養物から前記光学プローブを分離すること、を含む、請求項１～４の何れか１項に記載の光学プローブの調製方法。
- 請求項１～４の何れか１項に記載の光学プローブ、請求項５に記載の核酸配列、又は請求項６に記載の核酸コンストラクトの、サンプルにおけるアルギニンの検出又は化合物の選別における使用であって、前記検出がアルギニン定性、局在又は定量検出を含む、使用。
- 検出試薬キットであって、
（１）請求項１～４の何れか１項に記載の光学プローブ又は請求項８に記載の方法で調製される光学プローブ、
（２）請求項５に記載の核酸配列、
（３）請求項６に記載の核酸コンストラクト、又は
（４）請求項７に記載の細胞、及び
光学プローブでアルギニンを検出するためのその他の試薬を含む、検出試薬キット。
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