WO2015025959A1 - 蛍光特性を示すポリペプチド、およびその利用 - Google Patents

蛍光特性を示すポリペプチド、およびその利用 Download PDF

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WO2015025959A1
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polypeptide
polynucleotide
fluorescence
cell
expression
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PCT/JP2014/072039
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宮脇　敦史
亮子 安藤
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独立行政法人理化学研究所
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide exhibiting fluorescence characteristics and use thereof.
  • Fluorescent proteins are indispensable as tools for visualizing cells, tissues, or living organisms.
  • Patent Document 1 describes a fluorescent protein that emits green fluorescence.
  • Various modified proteins have also been reported for fluorescent proteins that emit red fluorescence (Patent Document 2, Non-Patent Documents 1-3).
  • An object of the present invention is to provide a fluorescent protein that is a modified fluorescent protein derived from the common common coral (Montipora monasteriata) and exhibits useful properties when used as a fluorescent protein.
  • the present invention includes one of the following aspects.
  • (2) 1-34 amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 (2) 1-34 amino acids are substituted, deleted, or inserted in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 And / or a polynucleotide encoding a polypeptide having an added amino acid sequence and having fluorescent properties, (3) having a sequence identity of 85% or more to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 And (4) a polynucleotide that encodes a polypeptide having fluorescent properties, and (4) a polynucleotide that is complementary to the polynucleotide described in (1) above and hybridizes under stringent conditions, A polynucleotide encoding a polypeptide having properties.
  • ⁇ 3> An expression cassette comprising: (a) an expression control region functional in an expression host; and (b) the polynucleotide according to ⁇ 2>.
  • ⁇ 4> A vector comprising the polynucleotide according to ⁇ 2> above or the expression cassette according to ⁇ 3>.
  • ⁇ 5> A transformant comprising the polynucleotide according to ⁇ 2> above, the expression cassette according to ⁇ 3>, or the vector according to ⁇ 4>.
  • ⁇ 6> A fusion polypeptide comprising the polypeptide according to ⁇ 1> above and another polypeptide.
  • ⁇ 7> A method for fluorescence observation, wherein the polypeptide according to ⁇ 1> or the fusion polypeptide according to ⁇ 6> is produced in a cell, and fluorescence derived from the polypeptide or the fusion polypeptide An observation step of observing.
  • a method for evaluating the action of one or more test substances on the expression and / or localization of one or more target genes in a cell i) the above which may be fused with a first target gene ⁇ 2> a nucleic acid molecule comprising the polynucleotide according to 2>, wherein the first nucleic acid molecule operably linked to the expression control sequence so as to be placed under the control of the first expression control sequence
  • An introduction step to be introduced ii) a culture step for culturing the cells that have undergone the introduction step in the presence and absence of the test substance, iii) a fluorescence detection step for detecting fluorescence emission in the cells, and iv) the presence of the test substance
  • ⁇ 9> A method for producing a transformant containing all or part of the polynucleotide according to ⁇ 2> above in a cell, the polynucleotide according to ⁇ 2>, and the expression cassette according to ⁇ 3> Or a method comprising introducing the vector according to ⁇ 4> into a cell.
  • ⁇ 10> A transformant or a progeny thereof obtained by the method according to ⁇ 9> above.
  • ⁇ 11> A method for producing a non-human transgenic organism containing all or part of the polynucleotide according to ⁇ 2> in a cell, the polynucleotide according to ⁇ 2>, and the polynucleotide according to ⁇ 3> A method comprising introducing the expression cassette or the vector according to ⁇ 4> into a fertilized egg collected from a donor cell.
  • ⁇ 12> A non-human transgenic organism or a progeny thereof obtained by the method according to ⁇ 11> above.
  • ⁇ 13> A method for producing pluripotent stem cells by collecting cells from the non-human transgenic organism according to ⁇ 12> or a progeny thereof, and introducing an initialization factor into the cells.
  • the present invention provides a fluorescent polypeptide having fluorescence stability and rapid fluorescence emission when introduced into a cell.
  • the fluorescent polypeptide of the present invention the fluorescent polypeptide useful in many biological fields such as molecular biology can be used.
  • FIG. 4 is a diagram showing fluorescence characteristics of 1-29 and 1-41 proteins in Examples of the present invention. It is the figure which showed the expression and fluorescence characteristic in colon_bacillus
  • FIG. 5B is a graph corresponding to FIG.
  • polynucleotide can also be referred to as “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”. “Polynucleotide”, unless otherwise stated, encompasses polynucleotides containing known analogs of naturally occurring nucleotides that can function in a manner similar to the naturally occurring nucleotides.
  • base sequence can also be referred to as “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence”. Unless otherwise stated, “base sequence” intends a deoxyribonucleotide sequence or a ribonucleotide sequence.
  • the polynucleotide may be a single strand or a double strand structure. In the case of a single strand, the polynucleotide may be a sense strand or an antisense strand.
  • gene refers to a “polynucleotide” encoding a protein.
  • the “expression control region” of a gene refers to a “polynucleotide” that controls the expression of the gene.
  • Examples of the “expression control region” include a promoter region and an enhancer region.
  • the “expression cassette” refers to an expression unit comprising an expression control region functional in an expression host and a polynucleotide operably linked to the expression control region.
  • the polynucleotide is preferably a gene or a fragment of a gene.
  • An example of the expression cassette is one in which the expression control region and the polynucleotide are linked by genetic engineering.
  • “Operably linked” refers to a condition in which the expression of a polynucleotide is controlled by an expression control sequence.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector.
  • polypeptide can also be referred to as “protein”.
  • the “polypeptide” includes a structure in which amino acids are peptide-bonded, and may further include a structure such as a sugar chain or an isoprenoid group.
  • Polypeptide encompasses a polypeptide containing a known analog of a naturally occurring amino acid that can function similarly to the naturally occurring amino acid unless otherwise specified.
  • fluorescent polypeptide refers to a polypeptide having fluorescent properties.
  • the polypeptide having fluorescence characteristics refers to a polypeptide having a property of emitting fluorescence when irradiated with excitation light having a predetermined wavelength.
  • a and / or B is a concept that includes both A and B and A or B, and can also be referred to as “at least one of A and B”.
  • Polypeptide having fluorescent properties is a fluorescent polypeptide shown in any of (1) to (4) below.
  • the number of amino acids substituted, deleted, inserted and / or added is preferably 1 to 25, more preferably 1 to 23, and further preferably 1 to 12. 1 to 5 or 6 is particularly preferable.
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or additions may be collectively referred to as amino acid mutations.
  • the sequence identity is preferably 88% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99 % Or more is particularly preferable.
  • fluorescent polypeptide A The origin of fluorescent polypeptide A is not limited. For example, it may be chemically synthesized or produced using a gene recombination technique. More specifically, fluorescent polypeptide A includes in its category isolated and purified polypeptides, chemically synthesized polypeptides, and polypeptides produced from host cells based on genetic recombination techniques. Host cells will be described in detail in the section describing “transformants”.
  • fluorescent polypeptide A is a fluorescent polypeptide whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the fluorescent polypeptide A shown in the above (2) to (4) can be regarded as a variant when the fluorescent polypeptide A shown in (1) is used as a reference.
  • the fluorescent polypeptide A shown in (2) to (4) is artificially added to the polynucleotide encoding fluorescent polypeptide A shown in (1) above by using, for example, site-specific mutagenesis. It may be obtained by expressing a mutation introduced. Examples of site-directed mutagenesis include the Kunkel method (KunkelKet al. (1985): Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82. p488-).
  • An example of the fluorescent polypeptide A shown in the above (2) to (4) is a fluorescent polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 5 to 7.
  • XYG (X represents an arbitrary amino acid) is known as an amino acid sequence forming a chromophore.
  • the amino acid sequence at positions 68 to 70 in SEQ ID NOS: 1 and 2 is MYG. Therefore, even in the fluorescent polypeptide A shown in the above (2) to (4), the 68th amino acid in SEQ ID NOs: 1 and 2 may be substituted, but the 69th to 70th amino acid is maintained without mutation. It is more preferable that all the 68th to 70th amino acids are maintained without mutation.
  • regions except the region consisting of the 69th to 70th amino acids in SEQ ID NOs: 1 and 2 are regions suitable for introducing amino acid mutations.
  • the third to eighth, 65th to 67th (preferably 67th), 71st to 73rd (preferably 72th), 77th to 82nd, 104th to 112th in SEQ ID NOS: 1 and 2 (Preferably 106th to 110th, more preferably 108th) 119th to 129th, 131st to 135th, 139th to 143rd, 146th to 150th (preferably 146th to 148th, more preferably 146th or 148th), 158th to 172nd (preferably 159th to 166th, more preferably 162nd to 166th, more preferably 164th), 177th to 181st (preferably 179th), 190th to 194th, 196th to 202nd (preferably 199th), 204th To 212 th, and region
  • a region where a difference in the corresponding amino acid between SEQ ID NOs: 1 and 2 is a region that is more suitable for introducing an amino acid mutation.
  • the 85th amino acid, the 151st amino acid, and the 176th amino acid in SEQ ID NOS: 1 and 2 are other than the above-described specific parts. It is suggested that the amino acid can be substituted.
  • the fluorescent polypeptide A shown in the above (2) to (4) may exhibit the same fluorescence characteristics as the fluorescent polypeptide A represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • “equivalent fluorescence property” means that the same excitation wavelength, equivalent fluorescence wavelength, equivalent pH sensitivity, and equivalent fluorescence as the fluorescent polypeptide A represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Equivalent fluorescence properties preferably refers to having fluorescence stability and rapid fluorescence emission when introduced into a cell, and equivalent quantum yield. Specifically, the fluorescence stability when introduced into a cell means that no aggregate is formed in the cell, and the quantum yield ⁇ is 0.4 or more, preferably 0.6 or more. More preferably, it means having an equivalent excitation wavelength in addition to an equivalent quantum yield. Specifically, the excitation wavelength is 550 nm to 600 nm.
  • the fluorescent polypeptide A may be a monomer or a multimer.
  • the fluorescent polypeptide is preferably a monomer in the case of labeling a molecule and using it as a probe for FRET (fluorescence resonance energy transfer).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • 104 to 112 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 preferably 106 to 110, more preferably 108
  • the region consisting of the 150th and 158th to 172nd amino acids are both presumed to be particularly involved in the formation of fluorescent polypeptide A multimers. Is done.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 65th to 67th (preferably 67th), 146th to 150th (preferably 148th), 158th to 172nd (preferably 159th), 177th to It is presumed that the 181st (preferably 179th) and 196th to 202nd (preferably 199th) amino acid regions are all particularly involved in the fluorescence wavelength shift. Therefore, when obtaining fluorescent polypeptide A having a shifted fluorescence wavelength, it is preferable to cause mutation in at least one of the amino acid regions.
  • the amino acid mutation is more preferably an amino acid substitution.
  • the fluorescence quantum yield ⁇ in an environment of pH 7.4 is, for example, 0.6 (60%) or more, preferably 0.65 (65%) or more, and more preferably. Is 0.7 (70%) or more. As shown in the Examples, this quantum yield value is significantly higher than that of the conventional red fluorescent protein. Note that the higher the quantum yield of fluorescence, the more the fluorescence intensity increases and the fluorescence generally becomes brighter, which is more suitable for use in fluorescence observation and the like. An example of fluorescent polypeptide A that exhibits such a quantum yield of fluorescence is one that emits red fluorescence.
  • the quantum yield ⁇ of fluorescence under an environment of pH 7.4 is, for example, 0.40 (40%) or more, preferably 0.45 (45%) or more. Yes, more preferably 0.55 (55%) or more.
  • the molar extinction coefficient (M ⁇ 1 cm ⁇ 1 ) is, for example, 70000 or more, preferably 80000 or more, and more preferably 100000 or more.
  • polynucleotide encoding fluorescent polypeptide
  • the polynucleotide according to the present invention encodes any one of the above fluorescent polypeptides A.
  • the polynucleotide encoding fluorescent polypeptide A is the polynucleotide described in any one of (1-1) to (1-4) below.
  • (1-1) A polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • (1-2) A polypeptide having an amino acid sequence in which 1 to 34 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2, and having fluorescence characteristics Polynucleotide.
  • the number of amino acids substituted, deleted, inserted and / or added is preferably 1 to 25, more preferably 1 to 23, and further preferably 1 to 12. 1 to 5 or 6 is particularly preferable.
  • (1-3) A polynucleotide encoding a polypeptide having a fluorescence identity with 85% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the sequence identity is preferably 88% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99 % Or more is particularly preferable.
  • (1-4) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising a sequence complementary to the polynucleotide according to (1-1) and encodes a polypeptide having fluorescence characteristics .
  • This polynucleotide preferably has a sequence identity of 85% or more with respect to the base sequence of the polynucleotide described in (1-1) above.
  • the sequence identity is preferably 88% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99%. The above is particularly preferable.
  • stringent conditions include, for example, the conditions described in the reference [Molecular cloning-a Laboratory-manual 2nd edition (Sambrook et al., 1989)]. More specifically, stringent conditions include, for example, 6 ⁇ SSC (composition of 1 ⁇ SSC: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 X A condition of incubating with a probe in a solution containing Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA at 65 ° C. for 8 to 16 hours for hybridization.
  • 6 ⁇ SSC composition of 1 ⁇ SSC: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0
  • SDS 0.5% SDS
  • 5 X A condition of incubating with a probe in a solution containing Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA at 65 ° C. for 8 to 16 hours for hybridization.
  • the polynucleotide according to the present invention may exist in the form of RNA or DNA.
  • RNA is, for example, mRNA.
  • DNA is, for example, cDNA or genomic DNA.
  • the DNA may be double-stranded or single-stranded.
  • the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 4 and 8 to 10, which are examples of the polynucleotide according to the present invention, are cDNAs encoding the fluorescent polypeptide A shown in SEQ ID NOs: 1, 2 and 5 to 7, respectively.
  • polypeptides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 and 19, which are other examples of the polynucleotide according to the present invention are cDNAs encoding the fluorescent polypeptide A shown in SEQ ID NOs: 16 and 18, respectively.
  • the polynucleotide according to the present invention may contain an additional sequence such as an untranslated region (UTR) sequence.
  • UTR untranslated region
  • the method for obtaining (isolating) the polynucleotide according to the present invention is not particularly limited.
  • a probe that specifically hybridizes with a part of the base sequence of the polynucleotide is prepared, and the genome is prepared.
  • a DNA library or a cDNA library may be screened.
  • the polynucleotide according to the present invention may be synthesized according to a nucleic acid synthesis method such as a phosphoramidite method.
  • examples of the method for obtaining the polynucleotide according to the present invention include a method using a nucleic acid amplification method such as PCR.
  • primers are prepared from 5 ′ and 3 ′ sequences (or their complementary sequences) in the cDNA of the polynucleotide, and PCR or the like is performed using genomic DNA or cDNA as a template using these primers. To amplify the DNA region sandwiched between both primers. Thereby, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide according to the present invention can be obtained.
  • the polynucleotide (for example, DNA) according to the present invention may be inserted into an appropriate vector and used as a vector.
  • the vector may be an autonomously replicating vector such as a plasmid, or it may be integrated into the host cell genome when introduced into the host cell and replicated with the host cell chromosome. Good.
  • the above vector is preferably an expression vector.
  • the polynucleotide according to the present invention is functionally linked to elements necessary for transcription such as a promoter sequence.
  • a promoter sequence is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell.
  • the type of promoter sequence to be used may be appropriately selected according to the type of host cell and the purpose of using the fluorescent polypeptide according to the present invention. Examples of host cell types include [4. Transformants and methods for producing transformants].
  • Promoter sequences operable in host cells include Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene (Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene), Bacillus licheniformis ⁇ amylase gene (Bacillus licheniformis alpha-amylase gene), Bacillus amylo gene.
  • liquefatiens BAN amylase gene Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene
  • Bacillus subtilis alkaline protease gene Bacillus Subtilis alkaline protease gene
  • Bacillus pumilus xylosidase gene Bacillus pumilus xylosldase gene
  • Promoter or PL promoter Escherichia coli lac promoter, trp promoter, tac promoter; polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa calihornica polyhed Locis basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, baculovirus 39K delayed early gene promoter, yeast glycolytic gene-derived promoter, alcohol dehydrogenase gene promoter, TPI1 promoter, ADH2-4c promoter, ADH3 promoter, tpiA Promoter, cauliflower mosaic virus 35S promoter, SV40 promoter, MT-1 (metallothionein gene) promote
  • the polynucleotide according to the present invention may be operably linked to an appropriate terminator (eg, polyadenylation signal, mammalian growth hormone terminator, TPI1 terminator or ADH3 terminator) as required.
  • an appropriate terminator eg, polyadenylation signal, mammalian growth hormone terminator, TPI1 terminator or ADH3 terminator
  • Appropriate types of terminators may be selected depending on the types of host cells.
  • the vector according to the present invention may further have elements such as a transcription enhancer sequence or a translation enhancer sequence.
  • the vector according to the present invention may further have a DNA sequence that enables replication of the vector in a host cell.
  • a DNA sequence that enables replication of the vector in a host cell.
  • examples of such a DNA sequence include the SV40 origin of replication.
  • the vector according to the present invention may further have a selection marker.
  • selectable markers include drug resistance genes for drugs such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, neomycin or hygromycin.
  • the expression cassette according to the present invention refers to an expression cassette comprising (a) an expression control region functional in an expression host; and (b) a polynucleotide according to the present invention.
  • the expression cassette according to the present invention may be in the form of the expression vector described above.
  • Transformant and method for producing transformant (Transformant and method for producing transformant)
  • a transformant can be prepared by introducing the polynucleotide according to the present invention, the expression cassette according to the present invention, or the vector according to the present invention into an appropriate host cell.
  • the produced transformant contains the full length of the polynucleotide according to the present invention, or at least a part of the polynucleotide, and can express any of the fluorescent polypeptides according to the present invention.
  • the progeny of the transformant obtained using the transformant according to the present invention also contains the full length of the polynucleotide according to the present invention or at least a part of the polynucleotide, Any of the fluorescent polypeptides according to the invention can be expressed.
  • the full length or a part of the polynucleotide according to the present invention is preferably integrated in the genome.
  • the polynucleotide according to the present invention, the expression cassette according to the present invention, and the vector according to the present invention are collectively referred to as “foreign nucleic acid molecule” of the present invention.
  • the method for introducing the foreign nucleic acid molecule of the present invention into the host cell may be selected according to the type of the host cell, as exemplified below. Moreover, what is necessary is just to select the method of obtaining the offspring of the transformant which concerns on this invention according to the kind of transformant.
  • Examples of host cells include bacterial cells, yeast cells, fungal cells other than yeast cells, and higher eukaryotic cells.
  • Examples of higher eukaryotic cells include plant cells and animal cells.
  • Examples of animal cells include insect cells, amphibian cells, reptile cells, avian cells, fish cells, mammalian cells, and the like.
  • Examples of bacterial cells include Gram positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces; Gram negative bacteria such as E. coli.
  • Examples of yeast cells include cells belonging to Saccharomyces or Schizosaccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces kluyveri.
  • Examples of fungal cells other than yeast cells include filamentous fungal cells.
  • filamentous fungal cells include, for example, filamentous fungal cells belonging to Aspergillus, Neurospora, Fusarium, or Trichoderma.
  • insect cells include silkworm cells.
  • mammalian cells include HEK293 cells, HeLa cells, COS cells, BHK cells, CHL cells or CHO cells.
  • the transformation of the host cell may be appropriately selected according to the type of the host cell and the like, for example, protoplast method, method using competent cells, electroporation method, spheroblast method, lithium acetate method, calcium phosphate method, The lipofection method, Agrobacterium method, particle gun method and the like can be used.
  • a method of transformation by obtaining a host cell in which the foreign nucleic acid molecule of the present invention is integrated into a host chromosome. Integration of the foreign nucleic acid molecule into the host chromosome can be performed, for example, by homologous recombination or heterologous recombination.
  • the foreign nucleic acid molecule of the present invention and baculovirus are co-introduced into the host cells to obtain recombinant baculovirus in the culture supernatant of the host cells, and then recombinant baculoviruses.
  • Examples include a method of infecting a host cell with a virus and producing the fluorescent polypeptide according to the present invention in the host cell.
  • Examples of the co-introduction method include a calcium phosphate method and a lipofection method.
  • the above-mentioned transformant is cultured or grown under conditions that allow expression of the introduced foreign nucleic acid molecule.
  • the form of the transformant is not limited to cells. That is, the transformant may be, for example, a tissue, an organ, or an individual transformed with the foreign nucleic acid molecule according to the present invention. However, the transformant other than the cell may be preferably derived from non-human, and the individual is preferably derived from non-human. A transformed individual that is derived from a non-human is referred to as a non-human transgenic organism.
  • the non-human transgenic organism according to the present invention is, for example, a higher organism.
  • the transgenic plant include transgenic dicotyledonous plants such as Arabidopsis; monocotyledonous plants such as Brachypodium distachyon, rice, wheat and barley.
  • Examples of transgenic animals include transgenic animals such as zebrafish, mice, rats, and pigs.
  • the method for producing a non-human transgenic organism according to the present invention may be selected according to the type of the transgenic organism.
  • a method for producing a transgenic animal includes, for example, introducing a foreign nucleic acid molecule according to the present invention into a fertilized egg collected from a donor organism in vitro according to a microinjection method or the like; Infecting cells of early-development embryos derived from donor organisms.
  • the foreign nucleic acid molecule according to the present invention is introduced into a plant cell according to the Agrobacterium method; the particle gun method; the electroporation method; The transformed plant individual may be obtained through the above process.
  • the method for obtaining the offspring of the non-human transgenic organism according to the present invention may be selected according to the type of the non-human transgenic organism.
  • a method of obtaining offspring by mating can be mentioned.
  • offspring may be obtained using asexual reproduction techniques according to the type of plant.
  • the present invention includes, for example, producing a clone using the non-human transgenic organism according to the present invention.
  • the produced clone contains the full length of the polynucleotide according to the present invention or at least a part of the polynucleotide in the genome in the same manner as the original non-human transgenic organism. Any of the fluorescent polypeptides can be expressed.
  • the clone is a concept including both embryonic cell clones and somatic cell clones.
  • Examples of the method for producing a clone include a nuclear transfer method in which a donor's cell nucleus is transplanted into a recipient, unnucleated unfertilized egg.
  • the donor cell nucleus includes 1) a somatic cell nucleus of the original non-human transgenic organism, or 2) an embryonic cell nucleus derived from the original non-human transgenic organism.
  • the donor cell nucleus contains the full length of the polynucleotide of the present invention or at least a part of the polynucleotide in the genome.
  • the method for nuclear transfer of donor cell nuclei is not particularly limited. For example, 1) a method of cell fusion of a nucleus-removed unfertilized egg and a donor cell, and 2) a cell removed from a nucleus-removed unfertilized egg. And a method of introducing donor cells without fusion.
  • Fusion polypeptide comprising the fluorescent polypeptide according to the present invention and another polypeptide (hereinafter referred to as the fusion polypeptide according to the present invention) is also within the scope of the present invention.
  • the fusion polypeptide is, for example, a fusion protein produced by expression of the expression cassette and / or vector according to the present invention; a fusion protein in which any protein is labeled with the fluorescent polypeptide according to the present invention; the fluorescent polypeptide according to the present invention And a predetermined peptide sequence for stabilizing fluorescence; a FRET probe comprising the fluorescent polypeptide according to the present invention and another fluorescent polypeptide; and the like. That is, the type of other polypeptide to be fused with the fluorescent polypeptide according to the present invention is not particularly limited.
  • the fusion polypeptide according to the present invention may be chemically synthesized by the same method as that for the fluorescent polypeptide according to the present invention, or may be produced using a gene recombination technique.
  • an antibody that specifically binds to the fluorescent polypeptide of the present invention is also included in the scope of the present invention.
  • the present invention also includes a method for producing pluripotent stem cells from cells of the non-human transgenic organism according to the present invention.
  • a method for producing a pluripotent stem cell includes introducing an initialization factor into a cell (sometimes referred to as a starting cell) collected from the non-human transgenic organism according to the present invention, or treating the cell with the initialization factor.
  • a step of preparing pluripotent stem cells is included.
  • the non-human transgenic organism is, for example, a non-human transgenic higher animal, particularly a non-human transgenic mammal.
  • a somatic cell is preferable.
  • a method for collecting cells from a non-human transgenic organism may be performed by an appropriate method according to the type of the cells.
  • the type of somatic cell may be any cell other than germ cells, including somatic stem cells having differentiation ability, induced pluripotent stem cells, and somatic cells induced to differentiate from these stem cells.
  • the origin of somatic cells may be derived from a mature individual in addition to those derived from a fetus (fetal) individual, for example.
  • the reprogramming factor refers to a factor that causes nuclear reprogramming of the cell by being introduced into a cell collected from a non-human transgenic organism or used for processing the cell. Pluripotent stem cells are induced by cell nuclear reprogramming.
  • the reprogramming factor may be a “gene”, a gene product of the “gene” (protein or RNA encoded by the gene), or “other factors” such as drugs. There may be.
  • the reprogramming factor is preferably a “gene” or “protein”, more preferably a “gene”.
  • the reprogramming factor as a gene is, for example, at least one gene selected from the group consisting of a Klf family gene, an Oct family gene, a Sox family gene, and a Myc family gene. Among these, it is preferable to use at least one of the Klf family gene and the Oct family gene. Specific examples of the Oct family gene, the Klf family gene, the Sox family gene, and the Myc family gene are shown in International Publication WO2007 / 69666 (reference document).
  • reprogramming factors as genes include factors used for establishment of iPS cells.
  • Lin family gene For example, Lin family gene, Nanog gene, Tbx family gene, UTF1 gene, SALL family gene, Nr5a2 gene, Nr5a1 Gene, Nr1i2 gene, Rem2 GTPase gene, TCL-1A gene, Esrr family gene, Prmt5 gene, Glis family gene, and the like, or similar genes.
  • miR-291-3p miR-294, miR-295; miR-17-92, miR-106b-25, miR106a- which are ES cell-specific miRNAs 363, miR-93 and miR-106b; mir-302 family miRNA; mir-200c, mir-302s and mir-369s family miRNAs;
  • arginine methylase (PRMT) inhibitors PRMT
  • TGF- ⁇ inhibitors TGF- ⁇ inhibitors
  • GSK3 inhibitors GSK3 inhibitors
  • lysine-specific demethylase 1 (LSD1) inhibitors and other low molecular compounds used for the establishment of iPS cells
  • siRNA for the p53 gene, germ cell histones and histone chaperones.
  • the above initialization process is performed, for example, in a culture environment in which starting cells and pluripotent stem cells can be grown and maintained.
  • the culture environment in which the starting cells and pluripotent stem cells can be propagated and maintained refers to, for example, various culture environments adopted for the production of induced pluripotent stem cells and culture environments obtained by modifying them.
  • the reprogramming factor is introduced into the starting cell, for example, using a vector containing the reprogramming factor so that it can be expressed.
  • the type of the vector may be appropriately selected according to the type of the starting cell, and examples thereof include a plasmid vector and a virus vector (preferably an adenovirus vector, a retrovirus vector, etc.).
  • methods for introducing a vector into a starting cell include electroporation (Nucleic, Acids Res. 15, 1311-1326 (1987)) and calcium phosphate method (Mol. Cell Biol. 7,2745-2752 (1987)). And lipofection method (Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, Nature Genetics 5, 22-30 (1993)).
  • the reprogramming factor is a protein
  • the reprogramming factor is added to the medium in which the starting cells are cultured, and is taken into the starting cells (reference: Zhou et al., Cell Stem Cell. 2009 May 8; 4 (5): 381-4., Kim et al., Cell Stem Cell. 2009 Jun 5; 4 (6): 472-6., JP 2010-110289 (publication date May 20, 2010) JP, No. 2010-252786 (publication date: November 11, 2010)), or somatic cells rich in reprogramming factors in addition to the starting cells (eg, overexpression of reprogramming factors) Prepared cells), and a method of fusing both cells by cell fusion technology may be employed.
  • the reprogramming factor is another factor that is neither a gene nor a protein (for example, a drug)
  • the reprogramming factor is added to the culture medium in which the starting cell is cultured, and is taken into the starting cell, or is started What is necessary is just to process a cell.
  • the resulting pluripotent stem cell exhibits at least multipotency, more preferably a state showing pluripotency or a state before that.
  • multipotency refers to the ability to differentiate into some cell types such as nervous system or hematopoietic system.
  • pluripotency refers to the ability to differentiate into all cells and tissues constituting an individual, although the individual itself cannot be constructed.
  • An example of the resulting pluripotent stem cell is a so-called “induced pluripotent stem cell”.
  • “Induced pluripotent stem cells” are cells having properties close to those of ES cells (Embryonic Stem Cells), more specifically, undifferentiated cells, which are pluripotency and undifferentiated depending on the culture conditions. Includes cells having proliferative potential.
  • Fluorescence observation includes a step (fluorescence detection step) of detecting fluorescence emitted from the fluorescent polypeptide or fusion polypeptide according to the present invention.
  • An example of fluorescence observation includes a method comprising the step of producing the fluorescent polypeptide or fusion polypeptide according to the present invention in a cell (production step) and the above-mentioned “fluorescence detection step”.
  • the above production process is, for example, the above [4. It can be carried out by the method described in the section "Transformant and method for producing transformant".
  • said fluorescence detection process is a process of detecting fluorescence emitted from the polypeptide or fusion polypeptide according to the present invention.
  • the fluorescence detection method is not particularly limited. For example, the presence or absence of fluorescence emission, fluorescence emission using a fluorescence detection means such as UV transilluminator or LED transilluminator; fluorescence microscope; fluorescence detector; or flow cytometry; Distribution or fluorescence intensity may be measured temporarily or with time.
  • fluorescence observation examples include a method including a step of introducing the fluorescent polypeptide or fusion polypeptide of the present invention into a cell (introduction step) and the above-mentioned “fluorescence detection step”.
  • introduction step a step of introducing the fluorescent polypeptide or fusion polypeptide of the present invention into a cell
  • fluorescence detection step examples include a microinjection method in which a purified fluorescent polypeptide is injected into the cell.
  • polypeptide localization or dynamics One objective of fluorescence observation is the analysis of polypeptide localization or dynamics.
  • polypeptide X a fusion polypeptide in which the fluorescent polypeptide according to the present invention is fused with another polypeptide
  • the localization or dynamics of polypeptide X in cells can be visualized and analyzed.
  • the type of polypeptide X is not particularly limited, and examples thereof include proteins localized in cells, proteins specific to intracellular organelles, and targeting signals. Examples of targeting signals include nuclear translocation signals and mitochondrial presequences.
  • Another objective of fluorescence observation is the expression analysis of the target gene.
  • the activity of the expression control sequence can be measured.
  • the activity of the expression control sequence of the target gene reflects the expression level of the target gene.
  • fluorescence observation evaluation of test substances
  • Yet another example of fluorescence observation is application to an evaluation method for evaluating the effect of a test substance on the expression and / or localization of one or more target genes.
  • localization of target gene intends the localization of the expression product of the target gene.
  • This evaluation method includes at least the following steps i) to iv).
  • a first nucleic acid molecule including a polynucleotide encoding the fluorescent polypeptide according to the present invention (referred to as the polynucleotide according to the present invention), which may be fused with the first target gene, into the cell.
  • the first nucleic acid molecule is operably linked to the expression control sequence so as to be under the control of the first expression control sequence.
  • a fluorescence detection step of detecting fluorescence emission in the cells.
  • target gene refers to an arbitrary gene selected for the purpose of confirming the action of the test substance. When there are a plurality of “target genes”, they may be distinguished as first and second target genes.
  • the test substance refers to any substance that can act directly or indirectly on the “target gene”.
  • the target gene is, for example, a gene associated with the onset of the disease.
  • the target gene is, for example, a gene such as Nanog whose expression changes with cell reprogramming.
  • the initialization factor refer to [6. Reference is made to the [pluripotent stem cells and method for producing pluripotent stem cells] column.
  • the “first nucleic acid molecule” includes at least the polynucleotide according to the present invention.
  • the expression of the first nucleic acid molecule is controlled by the first expression control sequence.
  • the first nucleic acid molecule may contain a first target gene fused with the polynucleotide according to the present invention, if necessary. In this case, a fusion polypeptide in which the expression product of the first target gene and the fluorescent polypeptide according to the present invention are fused is produced. Therefore, the localization of the first target gene can be evaluated in the evaluation step.
  • the “first expression control sequence” may be the expression control sequence of the “first target gene”.
  • the polynucleotide according to the present invention is expressed so as to reflect the expression pattern of the first target gene. Therefore, in the evaluation step, the effect of the test substance on the expression of the first target gene can be evaluated.
  • the “first expression control sequence” is preferably a promoter sequence.
  • introduction step and “culture step” are, for example, the above-mentioned [4. It can be carried out according to the method described in the column “Transformant and method for producing transformant”.
  • the fluorescence detection step the presence or absence of fluorescence emission, the distribution of fluorescence emission, or the fluorescence intensity may be measured temporarily or with time using the fluorescence detection means described above.
  • the fluorescence detection step is performed on both cells cultured in the presence of the test substance and cells cultured in the absence of the test substance.
  • the fluorescence emission in the cells obtained in the presence and absence of the test substance is compared. Then, based on the obtained comparison result, it is evaluated whether the test substance affects the expression and / or localization of the target gene. For example, when there is no substantial difference in the fluorescence emission detection results in the presence and absence of the test substance, it is evaluated that the test substance does not affect the expression of the target gene. If there is a significant difference in the detection results of fluorescence emission in the presence and absence of the test substance, it is evaluated that the test substance has an effect on the expression of the target gene.
  • the evaluation in the evaluation process includes evaluating the presence or absence and degree of influence of the test substance on the expression and / or localization of the target gene.
  • a second nucleic acid molecule may be introduced into the cell in addition to the first nucleic acid molecule, if necessary.
  • the second nucleic acid molecule comprises a polynucleotide encoding a fluorescent polypeptide different from the “first nucleic acid molecule” (referred to as a second fluorescent polypeptide).
  • the expression of the second nucleic acid molecule is under the control of the second expression control sequence. Since the first nucleic acid molecule and the second nucleic acid molecule encode fluorescent polypeptides having different fluorescence characteristics, these fluorescent polypeptides are distinguished from each other and evaluated in the fluorescence detection step and the evaluation step described above. You can also
  • the second nucleic acid molecule may contain a second target gene fused with a polynucleotide encoding the second fluorescent polypeptide, if necessary.
  • a fusion polypeptide is produced in which the expression product of the second target gene and the second fluorescent polypeptide are fused. Therefore, the localization of the second target gene can be evaluated in the evaluation step.
  • the “second expression control sequence” may be the expression control sequence of the “second target gene”.
  • the polynucleotide encoding the second fluorescent polypeptide is expressed so as to reflect the expression pattern of the second target gene. Therefore, in the evaluation step, the effect of the test substance on the expression of the second target gene can be evaluated.
  • the “second expression control sequence” is preferably a promoter sequence.
  • first target gene and the “second target gene” are preferably different from each other. Further, the first expression control sequence and the second expression control sequence are preferably different from each other.
  • the above evaluation method is performed ex vivo. That is, this evaluation method is performed on an isolated cell or a cell contained in an isolated tissue.
  • the present invention also provides a method for producing a mutant fluorescent polypeptide based on a fluorescent polypeptide having any one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, and 5-7.
  • one aspect of the method for producing a fluorescent polypeptide according to the present invention is as follows. i) producing a mutant polypeptide in which at least one amino acid mutation is caused in amino acids other than the 69th to 70th amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2 or 5-7; ii) a comparison step of comparing the fluorescence characteristics of the mutant polypeptide with the fluorescence characteristics of the polypeptide before causing the mutation; and iii) a selection step of selecting a mutant polypeptide having a fluorescent property changed as compared with that before the mutation in the comparison step.
  • mutant polypeptides that have fluorescence characteristics but have changed fluorescence characteristics are selected, and mutant polypeptides that have completely lost fluorescence characteristics are excluded.
  • the above-described method for producing a mutant fluorescent polypeptide can also be regarded as a method for screening a mutant fluorescent polypeptide.
  • kit comprises 1) a fluorescent polypeptide according to the present invention, 2) a polynucleotide encoding the fluorescent polypeptide according to the present invention, 3) an expression cassette according to the present invention, 4) a vector according to the present invention, 5 It comprises at least one selected from the group consisting of :) a transformant according to the present invention; and 6) a fusion polypeptide according to the present invention.
  • the polynucleotide 2) is RNA, it can also be applied to living organisms such as humans as a kit for primary expression without gene recombination.
  • the kit according to the present invention can be prepared using materials and techniques known in the art.
  • Reagents such as fluorescent polypeptides or polynucleotides can be prepared in a form suitable for storage by dissolving in a suitable solvent.
  • a suitable solvent water, ethanol, various known buffers and the like can be used.
  • the kit according to the present invention may further include at least one of various reagents and instruments (buffer solutions, test tubes, pipettes, etc.) and instructions for using the kit, if necessary.
  • various reagents and instruments buffer solutions, test tubes, pipettes, etc.
  • instructions for using the kit if necessary.
  • the contents of the detection method according to the present invention described in the above section [7. Observation using fluorescent polypeptide] are recorded in the instruction manual of the kit, for example.
  • the kit is used, for example, for reagent use or diagnostic use.
  • the present invention may be any of the following aspects.
  • ⁇ 1> A polypeptide having fluorescence characteristics described in any of (1) to (4) below.
  • (2) 1-34 amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2
  • (4) a polypeptide described in (1) above A polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising a sequence complementary to the encoding polynucleotide.
  • ⁇ 4> An expression cassette comprising: (a) an expression control region functional in an expression host; and (b) the polynucleotide according to ⁇ 3>.
  • ⁇ 5> A vector comprising the polynucleotide according to ⁇ 3> above or the expression cassette according to ⁇ 4>.
  • ⁇ 6> A transformant comprising the polynucleotide according to ⁇ 3> above, the expression cassette according to ⁇ 4>, or the vector according to ⁇ 5>.
  • ⁇ 7> The transformant according to ⁇ 6>, which is a non-human transgenic organism.
  • ⁇ 8> A fusion polypeptide comprising the polypeptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above and another polypeptide.
  • ⁇ 9> A fluorescence observation method, wherein the polypeptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> or the fusion polypeptide according to ⁇ 8> is produced in a cell, and the polypeptide or fusion polypeptide An observation step of observing fluorescence derived from the method.
  • a method for evaluating the action of one or more test substances on the expression and / or localization of one or more target genes in a cell wherein i) the above may be fused with a first target gene ⁇ 3> a nucleic acid molecule comprising the polynucleotide according to 3>, wherein the first nucleic acid molecule operably linked to the expression control sequence so as to be placed under the control of the first expression control sequence
  • An introduction step to be introduced ii) a culture step for culturing the cells that have undergone the introduction step in the presence and absence of the test substance, iii) a fluorescence detection step for detecting fluorescence emission in the cells, and iv) the presence of the test substance
  • a nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding a fluorescent polypeptide different from the first nucleic acid molecule, wherein the nucleic acid molecule is under the control of a second expression control sequence.
  • the method according to ⁇ 10>, wherein the second nucleic acid molecule operably linked to the expression control sequence is introduced into the cell.
  • ⁇ 12> A method for producing a transformant containing the whole or part of the polynucleotide according to ⁇ 3> in a cell, the polynucleotide according to ⁇ 3>, the expression cassette according to ⁇ 4> Or a method comprising introducing the vector according to ⁇ 5> into a cell.
  • ⁇ 13> A transformant or a progeny thereof obtained by the method according to ⁇ 12> above.
  • ⁇ 14> A method for producing a non-human transgenic organism containing in its cells all or part of the polynucleotide according to ⁇ 3> above, the polynucleotide according to ⁇ 3>, and the polynucleotide according to ⁇ 4> A method comprising introducing the expression cassette or the vector according to ⁇ 5> into a fertilized egg collected from a donor cell.
  • ⁇ 15> A non-human transgenic organism or a progeny thereof obtained by the method according to ⁇ 14> above.
  • ⁇ 16> A method for producing a pluripotent stem cell by collecting a cell from the non-human transgenic organism according to ⁇ 15> or a progeny thereof and introducing an initialization factor into the cell.
  • ⁇ 17> The polypeptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, the polynucleotide according to ⁇ 3>, the expression cassette according to ⁇ 4>, the vector according to ⁇ 5>, ⁇ 6> or ⁇ 7> Or a transformant according to ⁇ 8> or a fusion polypeptide according to ⁇ 8>.
  • coli (a vector prepared by replacing the multicloning site of pRSET (Invitrogen) with the multicloning site of pFastBac (Invitrogen)), and then E. coli JM109 (DE3) (Promega) And cultured on a plate of LB solid medium containing ampicillin to obtain colonies.
  • the obtained colony was irradiated with light using a UV illuminator, a blue LED, and a green LED, respectively, and it was confirmed whether to emit fluorescence. Colonies that were confirmed to emit fluorescence were cultured in a liquid medium, and then DNA was extracted from the E. coli solution, and the nucleotide sequence was determined.
  • E. coli expression vector in E. coli, culture and protein purification The above-mentioned plasmid DNA for E. coli expression was introduced into E. coli strain JM109 (DE3) (Promega) by the heat shock method, and seeded on a plate of LB solid medium containing ampicillin to obtain a colony. The obtained colonies were inoculated into LB liquid medium and cultured at room temperature for 3 days. After culturing, the cells of E. coli were collected by centrifugation using a centrifuge.
  • Escherichia coli cells were disrupted by a freeze-thaw method, and the disrupted solution was centrifuged using a centrifuge to obtain a supernatant.
  • the supernatant was His-tag purified using a Ni-NTA column.
  • buffer exchange was performed using a Sephadex G-25 column.
  • BSA bovine serum albumin
  • the absorption spectrum was measured by suspending the protein in 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) to 40 ⁇ M. Further, using SynergyMx (Biotek), the protein was suspended in 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) to 2 ⁇ M, and the fluorescence spectrum was measured. Furthermore, using an absolute PL quantum yield measuring apparatus (Hamamatsu Photonics), the protein was suspended in 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) to 2 ⁇ M, and the quantum yield was measured. The results are shown in FIG. The obtained measurement results are summarized in Table 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing the fluorescence characteristics of 1-29 and 1-41 proteins.
  • UV irradiation is performed on a gel obtained by electrophoresis of the modified protein by Pseud-Native-PAGE electrophoresis, and the fluorescence of the protein at the molecular weight corresponding to the monomer is emitted. This was done by checking. The clones confirmed to be monomerized were examined for amino acid sequence variations. The results are shown in FIG.
  • FIG. 2 is a diagram showing expression and fluorescence characteristics of the monomerized variant in E. coli.
  • FIG. 2 (a) is a view of a gel obtained by electrophoresis of the modified protein by Pseud-Native-PAGE electrophoresis and UV irradiation with a UV transilluminator.
  • amino acid sequences of 9-2B, 9-4, and 10-3 are shown in SEQ ID NOs: 5, 6, and 1 in this order.
  • the main fluorescent properties of monomeric fluorescent polypeptide A 10-3 are as follows. Maximum excitation wavelength (nm): 574 Maximum fluorescence wavelength (nm): 598 (red) Molar extinction coefficient (M ⁇ 1 cm ⁇ 1 ): 49500 Quantum yield (%): 66 (pH 7.4) Fluorescence lifetime (nanoseconds): pH sensitivity: Fluorescence intensity is stable at pH 6 or more, particularly pH 6 to 11, and there is no sensitivity.
  • the main fluorescent characteristics of 9-2B (SEQ ID NO: 5), which is a monomeric fluorescent polypeptide A, are as follows. Maximum excitation wavelength (nm): 573 Maximum fluorescence wavelength (nm): 594 (red) Molar extinction coefficient (M -1 cm -1 ): 60300 Quantum yield (%): 68 (pH 7.4) Fluorescence lifetime (nanoseconds): pH sensitivity: Fluorescence intensity is stable at pH 6 or more, particularly pH 6 to 11, and there is no sensitivity.
  • the main fluorescent characteristics of 9-4 (SEQ ID NO: 6), which is monomeric fluorescent polypeptide A, are as follows.
  • the protein was suspended in 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) to a concentration of 40 ⁇ M, the absorption spectrum was measured, and the molar extinction coefficient was calculated at the maximum absorption wavelength. Further, using SynergyMx (BioTek), the protein was suspended in 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) to 2 ⁇ M, and the fluorescence spectrum was measured. Furthermore, using an absolute PL quantum yield measuring apparatus (Hamamatsu Photonics), the protein was suspended in 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) to 2 ⁇ M, and the quantum yield was measured.
  • FIG. 2 is a diagram showing expression and fluorescence characteristics of the monomerized variant in E. coli.
  • FIG. 2 (b) is a graph showing the fluorescence characteristics of two monomerized clones (9-2B and 10-3). The above shows an absorption spectrum for each of the two monomerized clones. The bottom shows the excitation spectrum (EX) and fluorescence spectrum (EM) for each of the two monomerized clones.
  • the fluorescence intensity of the excitation spectrum indicates the value when the wavelength of the detection light is fixed at 640 nm, and the two fluorescence spectra are when the wavelength of the excitation light is 540 nm (upper spectrum) and 380 nm, respectively (lower spectrum) ) Value.
  • FIG. 3 is a diagram showing fluorescence characteristics of the three modified monomers. Absorption spectra of the three variants are shown. As a known red fluorescent protein, mStrawberry and TagRFP were used.
  • mStrawberry was 52000 (Shaner et al, 2004 2004 Nature Biotechnolgy report 90000), TagRFP was 48700 (Merzlyak et al., 2007 2007 Nature Methods report 100000). On the other hand, it was 60300 for 9-2B, 44100 for 9-4, and 49500 for 10-3.
  • the quantum yield is 0.31 under the conditions of pH 7.4 for mStrawberry (0.22 according to the report of Shaner et al., 2004 2004 Nature Biotechnolgy), and 0.52 under the condition of pH 7.4 for TagRFP (Merzlyak et al. , -22007 Nature Methods reported 0.48), whereas 9-2B was 0.68 under the condition of pH 7.4, and 9-4 was 0.73 under the condition of pH 7.4. 3 was 0.66 under the condition of pH 7.4.
  • FIG. 4 shows the pH sensitivity of fluorescence intensity in the three monomerized variants.
  • FIG. 5A and FIG. 5B are a diagram (FIG. 5A) and a graph (FIG. 5B) showing the fluorescence stability of the three monomerized variants.
  • 9-2B, 9-4 and 10-3 could be expressed without any problem in mammalian cells.
  • TagRFP as shown in the lower right of FIG. 5A, spots indicating the possibility that TagRFP aggregated in the cytoplasm were confirmed. Such spots were not observed in 9-2B, 9-4 and 10-3, and mStrawberry was the same.
  • FIG. 6 is a diagram showing the shift of the fluorescence wavelength of the two variants.
  • 1-29 variant 1-29C SEQ ID NO: 7
  • 1-29G SEQ ID NO: 2
  • Whether or not the obtained variant is monomerized is confirmed by irradiating the gel obtained by electrophoresis of the variant protein by Pseud-Native-PAGE electrophoresis with UV, and at a molecular weight corresponding to the monomer. This was done by confirming the fluorescence emission of the protein.
  • the clones confirmed to be monomerized were examined for amino acid sequence variations.
  • the amino acid sequence of the new variant thus obtained (referred to as mAzalea) is shown as SEQ ID NO: 16, and the base sequence of the coding region of the gene encoding mAzalea is shown as SEQ ID NO: 17.
  • the protein was suspended in 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) to a concentration of 40 ⁇ M, the absorption spectrum was measured, and the molar extinction coefficient was calculated at the maximum absorption wavelength.
  • the molar extinction coefficient was calculated on the basis of that the molar extinction coefficient at 446 nm of the mature GFP chromophore was 44000 (M ⁇ 1 cm ⁇ 1 ) when denatured with 1M NaOH. It is calculated from the ratio of the “absorption value at 446 nm when denatured” and the “absorption value of the peak at pH 7.4”.
  • FIG. 7 is a diagram showing the fluorescence characteristics of mAzalea.
  • the upper graph in the figure shows the absorption spectrum of mAzalea.
  • the lower two graphs in the figure show the excitation spectrum (ex640: indicated by a dotted line) and the fluorescence spectrum (em540, em470: indicated by a solid line) of mAzalea.
  • the fluorescence intensity of the excitation spectrum indicates a value when the wavelength of the detection light is fixed at 640 nm
  • the two fluorescence spectra (em540 and em470) indicate values when the wavelength of the excitation light is 540 nm and 470 nm, respectively. .
  • FIG. 8 shows the pH sensitivity of fluorescence intensity in mAzalea.
  • the top two graphs in the figure show the excitation spectrum (ex640) and fluorescence spectrum (em540) of mAzalea under various pH conditions.
  • the fluorescence intensity of the excitation spectrum shows a value when the wavelength of the detection light is fixed at 640 nm
  • the fluorescence spectrum (em540) shows a value when the wavelength of the excitation light is 540 nm.
  • the lower left graph in the figure shows the absorption spectrum of mAzalea under various pH conditions. Further, the lower right graph in the figure shows the absorption of light at a wavelength of 575 nm (Abs_575), the fluorescence intensity of the excitation spectrum, and the fluorescence spectrum of mAzalea under various pH conditions.
  • the fluorescence intensity of the excitation spectrum indicates a value of 574 nm when the wavelength of the detection light is fixed at 640 nm
  • the fluorescence spectrum (em_598) indicates a value of 598 nm when the wavelength of the excitation light is fixed at 540 nm. Indicates.
  • MAzalea has a stable fluorescence intensity and no sensitivity in the range of pH 5 to 9 and particularly in the range of pH 6-8. However, when the pH is less than 5 or more than pH 9, the fluorescence intensity of mAzalea is greatly reduced. That is, mAzalea can be used as a pH sensor, a pH-dependent switch, or the like as a pH-sensitive fluorescent protein.
  • FIG. 9 is a graph showing the stability of fluorescence of mAzalea, mRuby2, mCherry and TagRFP-T.
  • the left side in the figure is the result when the cells are fixed, and the right side is the result when the cells are not fixed. From this result, it can be seen that the fluorescence stability of mAzalea is superior to that of mRuby2, and is comparable to other fluorescent proteins.
  • Lyn-mAzalea / pcDNA3 is a gene construct in which a sequence of Lyn that is membrane-bound and a mAzalea gene are linked.
  • the gene construct corresponding to FIG. 11 is obtained by linking calreticulin-FP (fluorescent protein) -KDEL in this order.
  • the gene construct corresponding to FIG. 12 includes FP (fluorescent protein), ⁇ -tubulin, Are linked by a linker (GGGGS) ⁇ 3, and the gene construct corresponding to FIG. 13 is a FP (fluorescent protein) and ⁇ -actin linked by a linker (GGGGS) ⁇ 3.
  • Microscope FV1000 (manufactured by Olympus); objective lens: x60 UplanApo W / IR; scan speed: 4.0 ⁇ sec / pixel; A.
  • Microscope FV1000 (manufactured by Olympus); objective lens: x60 UplanApo W / IR; scan speed: 2.0 ⁇ sec / pixel; A. : 130 ⁇ m; Kalman: line, ⁇ 2; Laser: 543 nm; Fluorescence: 560-660 nm (result) As shown in FIG. 10 to FIG. 13, it was found that mAzalea functions as a fluorescent marker that is locally expressed at the target site in HeLa cells.
  • HeLa cell culture conditions DMEM medium supplemented with 10% FBS. The culture conditions were the presence of 5% concentration carbon dioxide at 37 ° C. using a microscope culture apparatus FV10i. Observation conditions for fluorescence emission: Laser: 559nm_7.5%, PMT: 40%, em: 570-670nm, C. A .: 300um Objective lens (Obj): UPlanSApo 10 ⁇ , Scan speed: 2 ⁇ s / pixel Image size: 512x 512, Zoom: x1, Kalman: line x2 Interval: 15min [15.
  • modified protein based on mAzalea] [9. ]
  • a modified protein was produced in which the 85th amino acid was substituted from isoleucine to leucine and the 176th amino acid was substituted from tyrosine to methionine, and this was designated as mAzalea_B5.
  • the site-specific amino acid mutation was introduced using the gene sequence of mAzalea as a template.
  • the amino acid sequence of mAzalea_B5 is shown in SEQ ID NO: 18, and the base sequence of the coding region of the gene is shown in SEQ ID NO: 19.
  • the graph on the right side of FIG. 15 shows the fluorescence spectra under various pH conditions for mAzalea and mAzalea_B5.
  • the fluorescence spectrum has a value of 598 nm when the wavelength of excitation light is fixed at 540 nm for mAzalea, and a value of 596 nm when the wavelength of excitation light is fixed at 540 nm for mAzalea_B5.
  • mAzalea_B5 has a more stable and insensitive fluorescence intensity than mAzalea within a pH range of 5 to 9 and in particular within a pH range of 6-8. However, when the pH is less than 5 or exceeds pH 9, the fluorescence intensity of mAzalea_B5 is greatly reduced. That is, mAzalea_B5 can be used as a pH sensor, a pH-dependent switch, or the like as a pH-sensitive fluorescent protein.
  • Buffer HBSS containing 10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4); CCD camera: CoolSNAP HQ; Fluorescent filter cube: U-MPFP HQ (manufactured by Olympus); Objective lens: ⁇ 40 UplanFL N; ND filter: 30%; Binning: 1; Exposure time: 25 milliseconds; Irradiation interval: 1 minute.
  • HeLa cells were used to analyze the expression of mAzalea and mAzalea_B5 in the endoplasmic reticulum. HeLa cells were each transfected using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen), and the cells were observed using a fluorescence microscope one day later. The gene construct used for transfection is obtained by linking calreticulin-FP-KDEL in this order, and FP indicates the gene of mAzalea or mAzalea_B5.
  • Microscope FV1000 (manufactured by Olympus); objective lens: x60 UplanApo W / IR; scan speed: 4.0 ⁇ sec / pixel; A. : 120 ⁇ m; Kalman: line, ⁇ 4; Laser: 543 nm (30%); Fluorescence: 560-660 nm, PMT: 770 V (result) As shown in FIG. 17, it was found that mAzalea_B5 functions as a fluorescent marker that is more excellent than mAzalea and is locally expressed in the endoplasmic reticulum in HeLa cells.
  • An example of the fluorescent protein according to the present invention has excellent properties such as quantum yield. Therefore, for example, it is useful in the biochemical analysis field and the medical field as a fluorescent label for analyzing the expression pattern of a target gene, a fluorescent label for screening a drug candidate compound, and the like.

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Abstract

　本願発明に係るポリペプチドの一態様は、蛍光特性を示し、（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有する、（２）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において１～３４個のアミノ酸が置換などしたアミノ酸配列を有する、（３）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有する、または、（４）（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する。

Description

蛍光特性を示すポリペプチド、およびその利用
　本発明は、蛍光特性を示すポリペプチドとその利用とに関する。
　蛍光タンパク質は、細胞、組織、または生物個体などを可視化するツールとして、欠かせないものとなっている。例えば、特許文献１には、緑色蛍光を発する蛍光タンパク質が記載されている。赤色蛍光を発する蛍光タンパクについても様々な改変タンパク質が報告されている（特許文献２、非特許文献１－３）。
米国特許５４９１０８４（１９９６年２月１３日） 米国特許７１６６４４４（２００７年１月２３日）
Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY.　 Nature Biotechnolgy. 2004; 22(12):p1567-72. Epub 2004 Nov 21. S Ekaterina M Merzlyak, Joachim Goedhart, Dmitry Shcherbo, Mariya E Bulina, Aleksandr S Shcheglov, Arkady F Fradkov, Anna Gaintzeva, Konstantin A Lukyanov, Sergey Lukyanov, Theodorus W J Gadella & Dmitriy M Chudakov.　Nature Methods. 2007; 4, p555 - 557 Simone Kredel, Franz Oswald, Karin Nienhaus, Karen Deuschle, Carlheinz Rocker, Michael Wolff, Ralf Heilker, G. Ulrich Nienhaus, and Jorg Wiedenmann.　PLoS ONE. 2009; 4(2): e4391.
　近年、蛍光タンパク質を用いて細胞またはタンパク質をラベルする需要が急速に高まっている。当該需要の高まりにともなって、蛍光タンパク質に求められる特性も多様化している。そのため、これまで報告がなされた蛍光タンパク質とは異なる新規な蛍光タンパク質が求められている。
　本発明は、コイボコモンサンゴ（Montipora monasteriata）由来の蛍光タンパク質の改変体であって蛍光タンパク質として利用する上で有用な性質を示す蛍光タンパク質を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本願発明は以下の何れかの一態様を包含する。
＜１＞　以下の（１）～（４）の何れかに示す、蛍光特性を有するポリペプチド。（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（２）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において１～３４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、（３）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、（４）上記（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
＜２＞　以下の（１）～（４）の何れかに記載のポリヌクレオチド。（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において１～３４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（３）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜３＞　（ａ）発現宿主内で機能的な発現制御領域；および、（ｂ）＜２＞に記載のポリヌクレオチド；を含む、発現カセット。
＜４＞上記＜２＞に記載のポリヌクレオチドまたは＜３＞に記載の発現カセットを含むベクター。
＜５＞上記＜２＞に記載のポリヌクレオチド、＜３＞に記載の発現カセットまたは＜４＞に記載のベクターを含む形質転換体。
＜６＞上記＜１＞に記載のポリペプチドと他のポリペプチドとからなる融合ポリペプチド。
＜７＞蛍光観察の方法であって、＜１＞に記載のポリペプチド、あるいは＜６＞に記載の融合ポリペプチドを細胞において産生させる産生工程と、当該ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに由来する蛍光を観察する観察工程とを含む、方法。
＜８＞細胞において１以上の目的遺伝子の発現および／または局在性に対する１以上の試験物質の作用を評価する方法であって、ｉ）第一の目的遺伝子と融合されていてもよい上記＜２＞に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第一の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第一の核酸分子を、細胞内に導入する導入工程、ｉｉ）導入工程を経た上記細胞を上記試験物質の存在下および不在下で培養する培養工程、ｉｉｉ）上記細胞における蛍光発光を検出する蛍光検出工程、およびｉｖ）試験物質の存在下および不在下で得られた、上記細胞における蛍光発光を比較して、上記目的遺伝子の発現および／または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価工程、を含む、方法。
＜９＞上記＜２＞に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む形質転換体を作製する方法であって、＜２＞に記載のポリヌクレオチド、＜３＞に記載の発現カセットまたは＜４＞に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法。
＜１０＞上記＜９＞に記載の方法で得られた形質転換体またはその子孫。
＜１１＞上記＜２＞に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む非ヒトトランスジェニック生物を作製する方法であって、＜２＞に記載のポリヌクレオチド、＜３＞に記載の発現カセットまたは＜４＞に記載のベクターを、ドナー細胞から採取した受精卵に導入する工程を含む、方法。
＜１２＞上記＜１１＞に記載の方法で得られた非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫。
＜１３＞上記＜１２＞に記載の非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫より細胞を採取し、該細胞に初期化因子を導入して多能性幹細胞を作製する方法。
＜１４＞上記＜１＞に記載のポリペプチド、＜２＞に記載のポリヌクレオチド、＜３＞に記載の発現カセット、＜４＞に記載のベクター、＜５＞に記載の形質転換体、あるいは＜６＞に記載の融合ポリペプチドを含む、キット。
　本発明は、細胞に導入した際の蛍光安定性および早い蛍光発光の特性を有する蛍光ポリペプチドを提供する。本発明の蛍光ポリペプチドによれば、分子生物学などの多くの生物学分野で有用な蛍光ポリペプチドを利用することができるという効果を奏する。
本発明の実施例における、１－２９および１－４１タンパク質の蛍光特性を示す図である。 本発明の実施例における、単量体化した改変体の大腸菌における発現および蛍光特性を示した図である。 本発明の実施例における、単量体化した３つの改変体の蛍光特性を示した図である。３つの改変体の吸収スペクトルを示す。 本発明の実施例における、単量体化した３つの改変体における蛍光強度のｐＨ感受性を示した図である。 本発明の実施例における、単量体化した３つの改変体の蛍光の安定性を示した図である。 図５Ａに対応し、本発明の実施例における、単量体化した３つの改変体の蛍光の安定性を示したグラフである。 本発明の実施例における、２つの改変体の蛍光波長のシフトを示した図である。 本発明の他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａの蛍光特性を示した図である。 本発明の他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａのｐＨ感受性を示した図である。 本発明の他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａの蛍光の安定性を、ｍＲｕｂｙ２、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＴａｇＲＦＰ－Ｔの蛍光の安定性と比較して示した図である。 本発明の他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａの、ＨｅＬａ細胞のサイトゾルでの局所的な発現を示した図である。 本発明の他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａの、ＨｅＬａ細胞の小胞体での局所的な発現を示した図である。 本発明の他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａの、ＨｅＬａ細胞のαチューブリンを含む器官での局所的な発現を示した図である。 本発明の他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａの、ＨｅＬａ細胞のβアクチンを含む器官での局所的な発現を示した図である。 本発明の他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａの光り始める早さを、ｍＣｈｅｒｒｙと比較した結果を示す図である。 本発明のさらに他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５のｐＨ感受性を示した図である。 本発明のさらに他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の光安定性を示した図である。 本発明のさらに他の実施例にかかるタンパク質であるｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の、ＨｅＬａ細胞の小胞体での局所的な発現を示した図である。
　以下、本発明の実施の一形態について詳細に説明する。
　〔用語などの定義〕
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言できる。「ポリヌクレオチド」は、特に明記しない場合は、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含有するポリヌクレオチドを包含する。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言できる。特に言及のない限り、「塩基配列」はデオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。また、ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖構造であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
　本明細書において、「遺伝子」は、タンパク質をコードしている「ポリヌクレオチド」を指す。
　本明細書において、遺伝子の「発現制御領域」は、遺伝子の発現を制御している「ポリヌクレオチド」を指す。「発現制御領域」の一例としては、プロモータ領域、エンハンサ領域などが挙げられる。
　本明細書において、「発現カセット」は、発現宿主内で機能的な発現制御領域と、当該発現制御領域と作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む発現単位を指す。発現カセットにおいて、当該ポリヌクレオチドは好ましくは遺伝子または遺伝子の断片である。発現カセットの一例は、上記発現制御領域と上記ポリヌクレオチドとを遺伝子工学的に連結したものである。「作動可能に連結」とは、ポリヌクレオチドの発現が発現制御配列によって制御されている状態を指す。発現カセットは発現ベクターの形態であってもよい。
　本明細書において、「ポリペプチド」は、「タンパク質」とも換言できる。「ポリペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合してなる構造を含むが、さらに、例えば、糖鎖、またはイソプレノイド基などの構造を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、特に明記しない場合は、天然に存在するアミノ酸と同様に機能することができる、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体を含有するポリペプチドを包含する。
　本明細書において、「蛍光ポリペプチド」とは、蛍光特性を有するポリペプチドを指す。蛍光特性を有するポリペプチドとは、所定波長の励起光の照射を受けることによって、蛍光を発する性質を持つポリペプチドを指す。
　本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」は、ＡおよびＢとＡまたはＢとの双方を含む概念であり、「ＡおよびＢの少なくとも一方」とも換言できる。
　〔１．蛍光特性を有するポリペプチド〕
　（１－１：　蛍光ポリペプチドＡ）
　本発明に係るポリペプチドＡは、以下の（１）～（４）の何れかに示す、蛍光ポリペプチドである。
（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有する蛍光ポリペプチド。
（２）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において１～３４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有する蛍光ポリペプチド。なお、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、１～２５個であることが好ましく、１～２３個であることがより好ましく、１～１２個であることがさらに好ましく、１～５または６個であることが特に好ましい。以下、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加を、アミノ酸の変異と総称する場合がある。
（３）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有する蛍光ポリペプチド。なお、配列同一性は、８８％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。
（４）上記（１）に記載の蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる蛍光ポリペプチド。なお、ストリンジェントな条件については、本発明に係るポリヌクレオチドの欄で後述する。
　蛍光ポリペプチドＡの由来は限定されず、例えば、化学合成されても、或いは、遺伝子組み換え技術を用いて産生されてもよい。より具体的には、蛍光ポリペプチドＡは、単離精製されたポリペプチド、化学合成されたポリペプチド、および、遺伝子組み換え技術に基づいて宿主細胞から産生されたポリペプチドをその範疇に含む。なお、宿主細胞については「形質転換体」を説明する欄で詳述する。
　蛍光ポリペプチドＡの一例は、配列番号１または２にそのアミノ酸配列を示す蛍光ポリペプチドである。
　上記（２）～（４）に示した蛍光ポリペプチドＡは、（１）に示した蛍光ポリペプチドＡを基準とした場合に改変体と捉えることができる。（２）～（４）に示した蛍光ポリペプチドＡは、例えば、部位特異的な突然変異誘発法を用いて、上記（１）に示した蛍光ポリペプチドＡをコードするポリヌクレオチドに人為的に変異を導入したものを発現させて得てもよい。部位特異的な突然変異誘発法としては、例えば、Kunkel法（Kunkel et al.(1985):Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.82.p488-）などが挙げられる。上記（２）～（４）に示した蛍光ポリペプチドＡの一例は、配列番号５～７に記載のアミノ酸配列を有する蛍光ポリペプチドである。
　蛍光ポリペプチドにおいて、発色団を形成するアミノ酸配列としてＸ－Ｙ－Ｇ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）が知られている。上記（１）に示した蛍光ポリペプチドＡでは、配列番号１および２における６８～７０番目のアミノ酸配列がＭ－Ｙ－Ｇである。したがって、上記（２）～（４）に示した蛍光ポリペプチドＡでも、配列番号１および２における６８番目のアミノ酸は置換されてもよいが６９番目～７０番目のアミノ酸を変異なく維持していることが好ましく、６８番目～７０番目のアミノ酸全てを変異なく維持していることがより好ましい。
　一方、配列番号１および２における６９番目～７０番目のアミノ酸からなる領域を除く領域は全て、アミノ酸の変異を導入するに適した領域である。中でも、配列番号１および２における、３番目～８番目、６５番目～６７番目（好ましくは６７番目）、７１番目～７３番目（好ましくは７２番目）、７７番目～８２番目、１０４番目～１１２番目（好ましくは１０６番目～１１０番目、より好ましくは１０８番目）、１１９番目～１２９番目、１３１番目～１３５番目、１３９番目～１４３番目、１４６番目～１５０番目（好ましくは１４６番目～１４８番目、より好ましくは１４６番目または１４８番目）、１５８番目～１７２番目（好ましくは１５９番～１６６番、より好ましくは１６２番目～１６６番目、さらに好ましくは１６４番目）、１７７番目～１８１番目（好ましくは１７９番目）、１９０番目～１９４番目、１９６番目～２０２番目（好ましくは１９９番目）、２０４番目～２１２番目、２１６番目～２２０番目のアミノ酸からなる領域などは、アミノ酸の変異を導入するにより適した領域である。また、ここで具体的に例示した領域に限らず、配列番号１と２との間で対応するアミノ酸に相違がみられる領域は、アミノ酸の変異を導入するにより適した領域である。例えば、後述の実施例におけるｍＡｚａｌｅａまたはｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の配列情報からは、上記した具体的な箇所以外にも、配列番号１および２における８５番目のアミノ酸、１５１番目のアミノ酸、および１７６番目のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換可能であることが示唆される。
　上記（２）～（４）に示した蛍光ポリペプチドＡは、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列で示される蛍光ポリペプチドＡと同等の蛍光特性を示してもよい。ここで、「同等の蛍光特性」を示すとは、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列で示される蛍光ポリペプチドＡと同等の励起波長、同等の蛍光波長、同等のｐＨ感受性、同等の蛍光安定性、同等のモル吸光係数、同等の蛍光量子効率、同等の励起スペクトルまたは同等の発光スペクトルの形、同等の励起波長極大および同等の発光波長極大、同等の、２つの異なる波長における励起振幅の比、同等の、２つの異なる波長における発光振幅の比、同等の励起状態寿命、ならびに同等の発色団成熟速度などの少なくとも１つ以上を有することを指す。「同等の蛍光特性」は、好ましくは、細胞に導入した際の蛍光安定性および蛍光発光の早さ、ならびに同等の量子収率を有することを指す。具体的には、細胞に導入した際の蛍光安定性とは細胞内で凝集体を形成しないことであり、量子収率Φが０．４以上であり、好ましくは０．６以上である。また、より好ましくは同等の量子収率に加えて、同等の励起波長を有することを指す。具体的には、励起波長が５５０ｎｍ～６００ｎｍである。
　また、蛍光ポリペプチドＡは単量体であっても多量体であってもよい。例えば、分子をラベルする場合およびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）のプローブとして用いる場合などでは、蛍光ポリペプチドが単量体であることが好ましい。配列番号１に示すアミノ酸配列における１０４番目～１１２番目（好ましくは１０６番目～１１０番目、より好ましくは１０８番目）、１１９番目～１２９番目、１３１番目～１３５番目、１３９番目～１４３番目、１４６番目～１５０番目、および１５８番目～１７２番目（好ましくは１６２番目～１６６番目、より好ましくは１６４番目）のアミノ酸からなる領域はいずれも、蛍光ポリペプチドＡの多量体の形成に特に関与していると推定される。
　配列番号１および２に示すアミノ酸配列における、６５番目～６７番目（好ましくは６７番目）、１４６番目～１５０番目（好ましくは１４８番目）、１５８番目～１７２番目（好ましくは１５９番目）、１７７番目～１８１番目（好ましくは１７９番目）、および１９６番目～２０２番目（好ましくは１９９番目）のアミノ酸からなる領域はいずれも、蛍光波長のシフトに特に関与していると推定される。従って、蛍光波長のシフトした蛍光ポリペプチドＡを得る場合は、上記アミノ酸領域の少なくとも一つに変異を生じさせることが好ましい。ここで、アミノ酸の変異は、アミノ酸の置換であることがより好ましい。
　蛍光ポリペプチドＡの一例では、ｐＨ７．４の環境下における蛍光の量子収率Φが、例えば０．６（６０％）以上であり、好ましくは０．６５（６５％）以上であり、より好ましくは０．７（７０％）以上である。実施例にも示すが、この量子収率の値は、従来の赤色蛍光タンパク質と比較して顕著に高い。なお、蛍光の量子収率が高いほど、蛍光強度が増大し、蛍光は一般的に明るくなるので、蛍光観察などに用いる上でより好適である。このような蛍光の量子収率を示す蛍光ポリペプチドＡの一例として赤色蛍光を発するものが挙げられる。
　また、蛍光ポリペプチドＡの他の例では、ｐＨ７．４の環境下における蛍光の量子収率Φが、例えば０．４０（４０％）以上であり、好ましくは０．４５（４５％）以上であり、より好ましくは０．５５（５５％）以上である。この他の例において、モル吸光係数（Ｍ-1ｃｍ-1）は、例えば、７００００以上であり、好ましくは８００００以上であり、より好ましくは１０００００以上である。
　〔２．蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド〕
　本発明に係るポリヌクレオチドは、上記蛍光ポリペプチドＡの何れかをコードするものである。
　蛍光ポリペプチドＡをコードするポリヌクレオチドは、具体的には、以下の（１－１）～（１－４）の何れかに記載のポリヌクレオチドである。
（１－１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１－２）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において１～３４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、１～２５個であることが好ましく、１～２３個であることがより好ましく、１～１２個であることがさらに好ましく、１～５または６個であることが特に好ましい。
（１－３）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、配列同一性は、８８％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。
（１－４）上記（１－１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。このポリヌクレオチドは、上記（１－１）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列に対して８５％以上の配列同一性を有することが好ましい。当該配列同一性は、８８％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。
　なお、上記のストリンジェントな条件下とは、例えば、参考文献[Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)]に記載の条件などが挙げられる。ストリンジェントな条件下とは、より具体的には例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハートおよび１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間インキュベートし、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態、またはＤＮＡの形態で存在し得る。ＲＮＡの形態とは、例えば、ｍＲＮＡである。ＤＮＡの形態とは、例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。
　本発明に係るポリヌクレオチドの一例である、配列番号３、４および８～１０に示す塩基配列は、順に、配列番号１、２および５～７に示す蛍光ポリペプチドＡをコードするｃＤＮＡである。また、本発明に係るポリヌクレオチドの他の例である、配列番号１７および１９に示す塩基配列を持つポリペプチドは、順に、配列番号１６および１８に示す蛍光ポリペプチドＡをコードするｃＤＮＡである。本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列などの付加的な配列を含むものであってもよい。
　本発明に係るポリヌクレオチドを取得する（単離する）方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記ポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。或いは、本発明に係るポリヌクレオチドを、ホスホロアミダイト法などの核酸合成法に従って合成してもよい。
　また、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲなどの核酸増幅法を用いる方法を挙げることができる。例えば、当該ポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡなどを鋳型にしてＰＣＲなどを行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅する。これによって、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
　〔３．ベクター、発現カセット〕
　本発明に係るポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）は、適当なベクター中に挿入して、ベクターとして利用してもよい。ベクターの種類は、プラスミドのような自律的に複製するベクターでもよいし、或いは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞の染色体と共に複製されるものであってもよい。
　上記ベクターは、好ましくは発現ベクターである。発現ベクターにおいて、本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば、プロモータ配列などの、転写に必要な要素が、機能的に連結されている。プロモータ配列は宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列である。用いるプロモータ配列の種類は、宿主細胞の種類および本発明に係る蛍光ポリペプチドを利用する目的に応じて適宜選択すればよい。宿主細胞の種類としては、例えば〔４．形質転換体、および形質転換体の作製方法〕において記載したものが挙げられる。
　宿主細胞内で作動可能なプロモータ配列としては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ；ファージ・ラムダのＰRプロモータまたはＰLプロモータ；大腸菌の、lacプロモータ、trpプロモータ、tacプロモータ；ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、バキュロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータ、ＡＤＨ３プロモータ、ｔｐｉＡプロモータ、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ－１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、サイトメガロプロモータまたはアデノウイルス２主後期プロモータなどが挙げられる。
　発現ベクターにおいて、本発明に係るポリヌクレオチドは、必要に応じて、適切なターミネータ（例えば、ポリアデニレーションシグナル、哺乳動物の成長ホルモンターミネータ、ＴＰＩ１ターミネータまたはＡＤＨ３ターミネータ）に機能的に結合されてもよい。適切なターミネータの種類は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。
　本発明に係るベクターは、さらに、転写エンハンサ配列、または翻訳エンハンサ配列などの要素を有していてもよい。
　本発明に係るベクターは、さらに、該ベクターの宿主細胞内での複製を可能にするＤＮＡ配列を有していてもよい。宿主細胞が哺乳動物細胞の場合、かかるＤＮＡ配列としては、ＳＶ４０複製起点などが挙げられる。
　本発明に係るベクターはさらに選択マーカーを有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤に対する、薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
　本発明に係る発現カセットとは、（ａ）発現宿主内で機能的な発現制御領域；および、（ｂ）本発明に係るポリヌクレオチド；を含む、発現カセットを指す。本発明に係る発現カセットは、上記した発現ベクターの態様であってもよい。
　〔４．形質転換体、および形質転換体の作製方法〕
　（形質転換体、および形質転換体の作製方法）
　本発明に係るポリヌクレオチド、本発明に係る発現カセット、または、本発明に係るベクターを適当な宿主細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。作製された形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいて、本発明に係る蛍光ポリペプチドの何れかを発現可能である。同様に、本発明に係る形質転換体を用いて得られた当該形質転換体の子孫も、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいて、本発明に係る蛍光ポリペプチドの何れかを発現可能である。作製された形質転換体またはその子孫において、本発明に係るポリヌクレオチドの全長またはその一部は、ゲノム中に組み込まれていることが好ましい。
　なお、以下の説明において、本発明に係るポリヌクレオチド、本発明に係る発現カセット、および、本発明に係るベクターを、本発明の「外来（foreign）核酸分子」と総称する。本発明の外来核酸分子を宿主細胞に導入する方法は、下記に例示をする通り、宿主細胞の種類に応じて選択すればよい。また、本発明に係る形質転換体の子孫を得る方法も、形質転換体の種類に応じて選択すればよい。
　宿主細胞としては、例えば、細菌細胞、酵母細胞、酵母細胞以外の真菌細胞、および高等真核細胞などが挙げられる。高等真核細胞としては、例えば、植物細胞、動物細胞が挙げられる。動物細胞としては、昆虫細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、哺乳動物細胞などが挙げられる。また、細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセスなどのグラム陽性菌；大腸菌などのグラム陰性菌；が挙げられる。酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)などが挙げられる。酵母細胞以外の真菌細胞の例としては、糸状菌の細胞が挙げられる。糸状菌の細胞の例としては、例えば、アスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する糸状菌の細胞が挙げられる。昆虫細胞の例としては、例えば、カイコの細胞などが挙げられる。哺乳動物細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞などが挙げられる。
　宿主細胞の形質転換は、宿主細胞の種類等に応じて適宜選択すればよく、例えば、プロトプラスト法、コンピテント細胞を用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法およびパーティクルガン法などにより行うことができる。また、宿主細胞の形質転換のその他の方法としては、本発明の外来核酸分子を宿主染色体に組み込んだ宿主細胞を得ることによって形質転換を行う方法が挙げられる。外来核酸分子の宿主染色体への組み込みは、例えば、相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。宿主細胞の形質転換のさらに他の方法としては、本発明の外来核酸分子およびバキュロウイルスを宿主細胞に共導入して宿主細胞の培養上清中に組換えバキュロウイルスを得、次いで、組換えバキュロウイルスを宿主細胞に感染させて、本発明に係る蛍光ポリペプチドを当該宿主細胞に産生させる方法等が挙げられる。共導入の方法としては、例えば、リン酸カルシウム法またはリポフェクション法などを挙げることができる。
　上記の形質転換体は、導入された外来核酸分子の発現が可能な条件下で、培養または育成する。
　なお、形質転換体の態様は、細胞に限定されない。すなわち、形質転換体は、例えば、本発明に係る外来核酸分子で形質転換された組織、器官、および個体であってもよい。ただし、細胞以外の形質転換体は、非ヒト由来のものであることが好ましい場合があり、特に個体は非ヒト由来のものであることが好ましい。なお、形質転換されている個体であって、非ヒト由来のものを非ヒトトランスジェニック生物と称する。
　（非ヒトトランスジェニック生物、およびその作製方法）
　本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物は、例えば、高等生物である。トランスジェニック植物としては、例えば、シロイヌナズナなどの双子葉植物；ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）、イネ、コムギ、オオムギなどの単子葉植物；のトランスジェニックが挙げられる。トランスジェニック動物としては、例えば、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、ブタなどのトランスジェニックが挙げられる。
　本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物の作製方法は、トランスジェニック生物の種類に応じて選択をすればよい。トランスジェニック動物の作製法は、例えば、マイクロインジェクション法などに従って、生体外において、本発明に係る外来核酸分子をドナー生物から採取した受精卵に導入すること；生体外において、レトロウイルスなどのウイルスベクターを、ドナー生物に由来する初期発生胚の細胞に感染させること；などの方法が挙げられる。トランスジェニック植物の作製においては、例えば、アグロバクテリウム法；パーティクルガン法；エレクトロポレーション法；などに従って、本発明に係る外来核酸分子を植物細胞に導入し、続いて、必要に応じてカルス化のプロセスを経て、形質転換植物個体を得ればよい。
　また、本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物の子孫を得る方法も、当該非ヒトトランスジェニック生物の種類に応じて選択すればよい。高等生物の場合は、例えば、交配によって子孫を得る方法などが挙げられる。高等生物のうち植物の場合は、当該植物の種類に応じた無性生殖の手法を用いて子孫を得てもよい。
　（非ヒトトランスジェニック生物のクローン、およびクローンの作製方法）
　本発明は、例えば、本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物を用いて、そのクローンを作製することも包含する。作製されたクローンは、元となった非ヒトトランスジェニック生物と同様に、ゲノム中に、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいて、本発明に係る蛍光ポリペプチドの何れかを発現可能である。なお、クローンとは、胚細胞クローンも体細胞クローンも含む概念である。
　クローンの作製方法としては、例えば、レシピエントとなる、核除去された未受精卵に対して、ドナーの細胞核を移植する、核移植の方法が挙げられる。ここで、ドナーの細胞核とは、１）元となった非ヒトトランスジェニック生物の体細胞核、または、２）元となった非ヒトトランスジェニック生物に由来する胚細胞核、が挙げられる。なお、ドナーの細胞核は、ゲノム中に、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいる。
　なお、ドナーの細胞核を核移植する方法は特に限定されず、例えば、１）核除去された未授精卵とドナーの細胞とを細胞融合させる方法、２）核除去された未授精卵に、細胞融合を介さずにドナーの細胞を導入する方法、などが挙げられる。
　〔５．本発明に係る融合ポリペプチド、蛍光ポリペプチドに対する抗体〕
　（融合ポリペプチド）
　本発明に係る蛍光ポリペプチドと他のポリペプチドとからなる融合ポリペプチド（以下、本発明に係る融合ポリペプチドと称する）も本発明の範疇である。融合ポリペプチドは、例えば、本発明に係る発現カセットおよび／またはベクターの発現によって産生される融合タンパク質；任意のタンパク質を本発明に係る蛍光ポリペプチドで標識した融合タンパク質；本発明に係る蛍光ポリペプチドと、蛍光を安定化させるための所定のペプチド配列とが融合してなる融合タンパク質；本発明に係る蛍光ポリペプチドと他の蛍光ポリペプチドとを備えたＦＲＥＴ用プローブ；などが挙げられる。すなわち、本発明に係る蛍光ポリペプチドと融合させる他のポリペプチドの種類は特に限定されない。本発明に係る融合ポリペプチドは、本発明に係る蛍光ポリペプチドと同様の方法によって、化学合成されても、或いは、遺伝子組み換え技術を用いて産生されてもよい。
　（抗体）
　また、本発明に係る蛍光ポリペプチドに特異的に結合する抗体も本発明の範疇に含まれる。
　〔６．多能性幹細胞、および多能性幹細胞の作製方法〕
　本発明は、本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物の細胞から、多能性幹細胞を作製する方法も包含する。多能性幹細胞を作製する方法は、本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物から採取した細胞（出発細胞と称する場合もある）に初期化因子を導入する、或いは当該細胞を初期化因子で処理することによって、多能性幹細胞を作製する工程（初期化工程）、を含んでなる。なお、非ヒトトランスジェニック生物は、例えば、非ヒトトランスジェニック高等動物であり、中でも非ヒトトランスジェニック哺乳動物である。
　（出発細胞）
　本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物から採取する細胞の種類は特に限定されないが、体細胞であることが好ましい。非ヒトトランスジェニック生物から細胞を採取する方法は、当該細胞の種類に応じた適切な方法で行えばよい。体細胞の種類は、生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、分化能を有する体性幹細胞、人工多能性幹細胞およびこれらの幹細胞から分化誘導された体細胞も含まれる。
　体細胞の由来は、例えば、胎児期（胎仔期）の個体に由来するものの他、成熟した個体に由来するものを用いてもよい。
　（初期化因子）
　初期化因子は、非ヒトトランスジェニック生物から採取した細胞内に導入されるか、当該細胞の処理に用いられることによって、当該細胞の核初期化を引き起こす因子を指す。細胞の核初期化によって多能性幹細胞が誘導される。
　初期化因子は、「遺伝子」であってもよく、当該「遺伝子」の遺伝子産物（遺伝子がコードしているタンパク質またはＲＮＡ）であってもよく、或いは、例えば薬剤などの「その他の因子」であってもよい。初期化因子は好ましくは、「遺伝子」または「タンパク質」であり、より好ましくは「遺伝子」である。
　遺伝子としての初期化因子は、例えば、Klfファミリー遺伝子、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、および、Mycファミリー遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である。そして、これらの中では、Klfファミリー遺伝子、およびOctファミリー遺伝子の少なくとも一方を用いることが好ましい。Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子については国際公開ＷＯ２００７／６９６６６（参考文献）に具体例が示されている。
　また、遺伝子としての初期化因子の他の例は、ｉＰＳ細胞の樹立に用いられる因子が挙げられ、例えば、Linファミリー遺伝子、Nanog遺伝子、Tbxファミリー遺伝子、UTF1遺伝子、SALLファミリー遺伝子、Nr5a2遺伝子、Nr5a1遺伝子、Nr1i2遺伝子、Rem2 GTPase遺伝子、TCL-1A遺伝子、Esrrファミリー遺伝子、Prmt5遺伝子、Glisファミリー遺伝子など、またはこれらと類似の遺伝子が挙げられる。
　さらに、遺伝子としての初期化因子の他の例として、ＥＳ細胞特異的なmiRNAであるmiR-291-3p、miR-294、miR-295；miR-17-92、 miR-106b-25、miR106a-363、miR-93およびmiR-106b；mir-302ファミリーmiRNA；mir-200c、mir-302s およびmir-369s ファミリーmiRNA；などが挙げられる。
　さらに、上記その他の因子としてはアルギニンメチル化酵素（PRMT）阻害剤、TGF-β阻害剤、GSK3阻害剤、lysine-specific demethylase 1（LSD1）阻害剤などｉＰＳ細胞の樹立に用いられる低分子化合物、およびp53遺伝子に対するsiRNA、胚細胞ヒストンおよびヒストンシャペロンなどが挙げられる。
　（初期化工程）
　上記の初期化工程は、例えば、出発細胞および多能性幹細胞が増殖、維持可能な培養環境において行われる。なお、出発細胞および多能性幹細胞が増殖、維持可能な培養環境とは、例えば、誘導多能性幹細胞の作製に採用されている種々の培養環境およびそれを改変した培養環境を指す。
　上記初期化因子が遺伝子の場合、出発細胞内への当該初期化因子の導入は、例えば、発現可能に初期化因子を含むベクターを用いて行われる。ベクターの種類は出発細胞の種類に応じて適宜選択すればよく、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（好ましくはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど）などが挙げられる。ベクターを、出発細胞へ導入する方法としては、例えば、電気穿孔法（Nucleic,Acids Res.15,1311-1326(1987)）、リン酸カルシウム法（Mol.Cell Biol. 7,2745-2752(1987)）、リポフェクション法（Cell 7,1025-1037(1994);Lamb,Nature Genetics 5,22-30(1993)）などが挙げられる。
　一方、上記初期化因子がタンパク質の場合、出発細胞を培養している培地中に初期化因子を添加して、出発細胞に取り込ませるか（参考文献：Zhou et al., Cell Stem Cell. 2009 May 8;4(5):381-4.、Kim et al., Cell Stem Cell. 2009 Jun 5;4(6):472-6.、特開２０１０－１１０２８９号公報（公開日２０１０年５月２０日）、および特開２０１０－２５２７８６号公報（公開日２０１０年１１月１１日）など参照）、或いは、出発細胞以外に、初期化因子を豊富に含む体細胞（例えば、初期化因子を過剰発現させた細胞）を準備し、両細胞を細胞融合技術により融合する方法を採用してもよい。上記初期化因子が遺伝子でもタンパク質でもないその他の因子（例えば、薬剤など）である場合は、出発細胞を培養している培地中に初期化因子を添加して、出発細胞に取り込ませるか、出発細胞を処理すればよい。
　（得られる多能性幹細胞）
　得られる多能性幹細胞は少なくともmultipotencyを示し、より好ましくはpluripotencyを示す状態かそれ以前の状態を示す。なお、本発明において、multipotencyとは、例えば神経系または造血系など一部の細胞種に分化できる能力を指す。また、本発明において、pluripotencyとは、個体自体を構成することは出来ないが、個体を構成するすべての細胞および組織に分化できる能力を指す。得られる多能性幹細胞の一例は、いわゆる「誘導多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem Cell）」である。「誘導多能性幹細胞」とは、ＥＳ細胞（Embryonic Stem Cell）に近い性質を有する細胞であり、より具体的には、未分化細胞であって、培養条件によって全能性（pluripotency）および未分化増殖能を有する細胞を包含する。
　〔７.蛍光ポリペプチドを用いた観察など〕
　（蛍光観察）
　本発明に係る蛍光ポリペプチドや融合ポリペプチドの用途は特に限定されず、広く蛍光観察の用途に用いることができる。蛍光観察は、本発明に係る蛍光ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに由来する蛍光発光を検出する工程（蛍光検出工程）を含む。
　蛍光観察の一例としては、本発明に係る蛍光ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを細胞において産生させる工程（産生工程）と、上記「蛍光検出工程」と、を含む方法が挙げられる。
　上記の産生工程は、例えば、上記の〔４．形質転換体、および形質転換体の作製方法〕欄に記載の方法で行うことができる。また、上記の蛍光検出工程は、本発明に係るポリペプチドまたは融合ポリペプチドから発される蛍光発光を検出する工程である。蛍光の検出方法は特に限定されないが、例えば、ＵＶトランスイルミネーターもしくはＬＥＤトランスイルミネーター；蛍光顕微鏡；蛍光検出器；またはフローサイトメトリー；などの蛍光検出手段を用いて、蛍光発光の有無、蛍光発光の分布、または、蛍光強度などを、一時的にか経時的に測定すればよい。
　蛍光観察の他の例としては、本発明に係る蛍光ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを細胞内に導入する工程（導入工程）と、上記「蛍光検出工程」とを含む方法が挙げられる。細胞内に蛍光ポリペプチドなどを導入する方法としては、例えば、精製した蛍光ポリペプチドなどを細胞内に注入するマイクロインジェクション法などが挙げられる。
　蛍光観察の１つの目的は、ポリペプチドの局在または動態の分析である。本発明に係る蛍光ポリペプチドと他のポリペプチド（ポリペプチドＸとする）とを融合させた融合ポリペプチドを用いると、細胞内におけるポリペプチドＸの局在または動態を可視化して分析可能となる。ポリペプチドＸの種類は特に限定されないが、例えば、細胞内に局在するタンパク質、細胞内小器官に特異的なタンパク質、およびターゲティングシグナルなどが挙げられる。ターゲティングシグナルとは、例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列などが挙げられる。
　蛍光観察の他の目的は、目的遺伝子の発現解析である。上記の産生工程を、目的遺伝子の発現制御配列の制御下で行うことによって、当該発現制御配列の活性を測定可能である。目的遺伝子の発現制御配列の活性は、目的遺伝子の発現レベルを反映する。
　（蛍光観察の応用：試験物質の評価）
　蛍光観察のさらに他の例としては、１以上の目的遺伝子の発現および／または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価方法への応用が挙げられる。ここで、「目的遺伝子の局在性」とは、目的遺伝子の発現産物の局在性を意図している。
　この評価方法は、少なくとも、以下のｉ）～ｉｖ）の工程を含んで構成される。
ｉ）第一の目的遺伝子と融合されていてもよい本発明に係る蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本発明に係るポリヌクレオチドと称する）を含む、第一の核酸分子を、細胞内に導入する導入工程。なお、第一の核酸分子は、第一の発現制御配列の制御下におかれるように、当該発現制御配列と作動可能に連結されている。
ｉｉ）導入工程を経た上記細胞を試験物質の存在下および不在下で培養する培養工程。
ｉｉｉ）上記細胞における蛍光発光を検出する蛍光検出工程。
ｉｖ）試験物質の存在下および不在下で得られた、上記細胞における蛍光発光を比較して、上記目的遺伝子の発現および／または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価工程。
　上記「目的遺伝子」とは、試験物質の作用を確認する目的で選択された任意の遺伝子を指す。「目的遺伝子」が複数ある場合、第一、第二の目的遺伝子として区別する場合がある。また、試験物質は、「目的遺伝子」に対して直接的にか間接的に作用し得る任意の物質を指す。例えば、試験物質が特定の疾患に対する治療薬候補化合物の場合、目的遺伝子は、例えば、当該疾患の発症に関連する遺伝子である。また例えば、試験物質が初期化因子の場合、目的遺伝子は、例えば、細胞の初期化に伴って発現が変化するNanogなどの遺伝子である。なお、初期化因子については、〔６．多能性幹細胞、および多能性幹細胞の作製方法〕欄が参照される。
　上記「第一の核酸分子」は、少なくとも本発明に係るポリヌクレオチドを含む。第一の核酸分子の発現は、第一の発現制御配列によって制御されている。また、第一の核酸分子は、必要に応じて、本発明に係るポリヌクレオチドと融合された第一の目的遺伝子を含んでいてもよい。この場合、第一の目的遺伝子の発現産物と本発明に係る蛍光ポリペプチドとが融合した融合ポリペプチドが産生される。それゆえ、評価工程において、第一の目的遺伝子の局在性を評価することができる。
　「第一の発現制御配列」は、上記「第一の目的遺伝子」の発現制御配列であってもよい。この場合、本発明に係るポリヌクレオチドは、第一の目的遺伝子の発現パターンを反映するように発現する。それゆえ、評価工程において、第一の目的遺伝子の発現に対する試験物質の作用を評価することができる。また、「第一の発現制御配列」は、好ましくはプロモータ配列である。
　上記「導入工程」および「培養工程」は、例えば、上記の〔４．形質転換体、および形質転換体の作製方法〕欄に記載の方法に準じて行うことができる。
　上記「蛍光検出工程」は、上述の蛍光検出手段を用いて、蛍光発光の有無、蛍光発光の分布、または、蛍光強度などを、一時的にか経時的に測定すればよい。蛍光検出工程は、比較のために、試験物質の存在下で培養された細胞と、試験物質の不在下で培養された細胞との双方を対象に行う。「蛍光検出工程」では、比較のために、試験物質が存在するか否かという点を除いては実質的に同一の条件で、蛍光発光を検出することが好ましい。
　上記「評価工程」では、試験物質の存在下および不在下で得られた、上記細胞における蛍光発光を比較する。そして、得られた比較結果に基づいて、目的遺伝子の発現および／または局在性に対して試験物質が影響を及ぼすかの評価を行う。例えば、試験物質の存在下および不在下で、蛍光発光の検出結果に実質的な相違がない場合は、試験物質は目的遺伝子の発現などに対して影響を及ぼさないと評価する。試験物質の存在下および不在下で、蛍光発光の検出結果に有意な相違がある場合は、試験物質は目的遺伝子の発現などに対して影響を及ぼすと評価する。評価工程における評価には、試験物質が目的遺伝子の発現および／または局在性に対して与える影響の有無や程度を評価することが含まれる。
　また、上記「導入工程」において、必要に応じて、上記第一の核酸分子の他に、第二の核酸分子を細胞内に導入してもよい。第二の核酸分子は、上記「第一の核酸分子」とは異なる蛍光ポリペプチド（第二の蛍光ポリペプチドと称する）をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。但し、第二の核酸分子の発現は、第二の発現制御配列の制御下におかれている。第一の核酸分子と第二の核酸分子とは、蛍光特性が互いに異なる蛍光ポリペプチドをコードしているため、上記の蛍光検出工程および評価工程において、これら蛍光ポリペプチドを互いに区別して検出し評価することもできる。
　第二の核酸分子は、必要に応じて、第二の蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと融合された第二の目的遺伝子を含んでいてもよい。この場合、第二の目的遺伝子の発現産物と第二の蛍光ポリペプチドとが融合した融合ポリペプチドが産生される。それゆえ、評価工程において、第二の目的遺伝子の局在性を評価することができる。
　「第二の発現制御配列」は、上記「第二の目的遺伝子」の発現制御配列であってもよい。この場合、第二の蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、第二の目的遺伝子の発現パターンを反映するように発現する。それゆえ、評価工程において、第二の目的遺伝子の発現に対する試験物質の作用を評価することができる。また、「第二の発現制御配列」は、好ましくはプロモータ配列である。
　なお、「第一の目的遺伝子」と「第二の目的遺伝子」とは互いに異なる遺伝子であることが好ましい。また、第一の発現制御配列と第二の発現制御配列とは互いに異なることが好ましい。
　上記の評価方法は、生体外（exo vivo）において行われる。すなわち、この評価方法は、単離された細胞、または単離された組織などに含まれる細胞に対して行われる。
　〔８.蛍光ポリペプチドの作製法〕
　本発明は、配列番号１、２および５～７に記載のアミノ酸配列のいずれかを有する蛍光ポリペプチドに基づいて、変異型の蛍光ポリペプチドを作製する方法も提供する。
　すなわち、本発明に係る、蛍光ポリペプチドの作製方法の一態様は、
ｉ）配列番号１、２または５～７に記載のアミノ酸配列における６９番目～７０番目以外のアミノ酸において少なくとも１以上のアミノ酸の変異を生じさせた変異型ポリペプチドを作製する工程と、
ｉｉ）上記変異型ポリペプチドの蛍光特性と、変異を生じさせる前のポリペプチドの蛍光特性とを比較する比較工程と、
ｉｉｉ）上記比較工程において、変異を生じさせる前と比較して蛍光特性が変化した変異型ポリペプチドを選択する選択工程と、を含む、方法である。
　変異型ポリペプチドを作製する工程において、発色団を形成するアミノ酸配列Ｘ－Ｙ－Ｇ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）のうち－Ｙ－Ｇは固定して、その他のアミノ酸に変異を加えるようにしている。これにより蛍光特性を保持した変異型ポリペプチドを効率的に製造することが可能となる。なお、配列番号１、２および５～７それぞれにおいて、変異を生じさせるアミノ酸の個数や、アミノ酸の変異を生じさせる方法については、例えば、上述の〔１．蛍光特性を有するポリペプチド〕欄の記載を参照すればよい。
　また、上記の選択工程では、蛍光特性を有するが当該蛍光特性が変化している変異型ポリペプチドを選択し、蛍光特性を完全に喪失した変異型ポリペプチドは除外する。
　なお、上記した変異型の蛍光ポリペプチドを作製する方法は、変異型の蛍光ポリペプチドをスクリーニングする方法と捉えることもできる。
　〔９．本発明に係るキット〕
　（キット）
　本発明に係るキットは、１）本発明に係る蛍光ポリペプチド、２）本発明に係る蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、３）本発明に係る発現カセット、４）本発明に係るベクター、５）本発明に係る形質転換体、および、６）本発明に係る融合ポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種以上を含んでなる。上記２）のポリヌクレオチドがＲＮＡの場合は、遺伝子の組み換えを伴わない一次発現用のキットとして、ヒトなどの生物個体にも適用することができる。
　本発明に係るキットは、当技術分野において公知の材料および手法を用いて調製することができる。蛍光ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの試薬は、好適な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノールおよび公知の各種緩衝液などを用いることができる。
　本発明に係るキットは、さらに必要に応じて、各種試薬および器具（緩衝溶液、試験管およびピペットなど）ならびにキットの使用説明書などの少なくとも１つを備えていてもよい。なお、キットの使用説明書には、例えば、上述の〔７.蛍光ポリペプチドを用いた観察など〕の欄で説明した、本発明に係る検出方法の内容が記録されている。キットは、例えば、試薬用途、または診断用途に用いるものである。
　〔１０．〕
　本発明はまた以下に示す何れかの態様であってもよい。
＜１＞　以下の（１）～（４）の何れかに示す、蛍光特性を有するポリペプチド。（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（２）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において１～３４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、（３）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、（４）上記（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
＜２＞　蛍光の量子収率Φが０．６以上であるか０．４以上である、＜１＞に記載のポリペプチド。
＜３＞　以下の（１）～（４）の何れかに記載のポリヌクレオチド。（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において１～３４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（３）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜４＞　（ａ）発現宿主内で機能的な発現制御領域；および、（ｂ）＜３＞に記載のポリヌクレオチド；を含む、発現カセット。
＜５＞上記＜３＞に記載のポリヌクレオチドまたは＜４＞に記載の発現カセットを含むベクター。
＜６＞上記＜３＞に記載のポリヌクレオチド、＜４＞に記載の発現カセットまたは＜５＞に記載のベクターを含む形質転換体。
＜７＞非ヒトトランスジェニック生物である、＜６＞に記載の形質転換体。
＜８＞上記＜１＞または＜２＞に記載のポリペプチドと他のポリペプチドとからなる融合ポリペプチド。
＜９＞蛍光観察の方法であって、＜１＞または＜２＞に記載のポリペプチド、あるいは＜８＞に記載の融合ポリペプチドを細胞において産生させる産生工程と、当該ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに由来する蛍光を観察する観察工程とを含む、方法。
＜１０＞細胞において１以上の目的遺伝子の発現および／または局在性に対する１以上の試験物質の作用を評価する方法であって、ｉ）第一の目的遺伝子と融合されていてもよい上記＜３＞に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第一の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第一の核酸分子を、細胞内に導入する導入工程、ｉｉ）導入工程を経た上記細胞を上記試験物質の存在下および不在下で培養する培養工程、ｉｉｉ）上記細胞における蛍光発光を検出する蛍光検出工程、およびｉｖ）試験物質の存在下および不在下で得られた、上記細胞における蛍光発光を比較して、上記目的遺伝子の発現および／または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価工程、を含む、方法。
＜１１＞上記導入工程において、さらに、上記第一の核酸分子とは異なる蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第二の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第二の核酸分子を、上記細胞内に導入する、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞上記＜３＞に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む形質転換体を作製する方法であって、＜３＞に記載のポリヌクレオチド、＜４＞に記載の発現カセットまたは＜５＞に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法。
＜１３＞上記＜１２＞に記載の方法で得られた形質転換体またはその子孫。
＜１４＞上記＜３＞に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む非ヒトトランスジェニック生物を作製する方法であって、＜３＞に記載のポリヌクレオチド、＜４＞に記載の発現カセットまたは＜５＞に記載のベクターを、ドナー細胞から採取した受精卵に導入する工程を含む、方法。
＜１５＞上記＜１４＞に記載の方法で得られた非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫。
＜１６＞上記＜１５＞に記載の非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫より細胞を採取し、該細胞に初期化因子を導入して多能性幹細胞を作製する方法。
＜１７＞上記＜１＞または＜２＞に記載のポリペプチド、＜３＞に記載のポリヌクレオチド、＜４＞に記載の発現カセット、＜５＞に記載のベクター、＜６＞または＜７＞に記載の形質転換体、あるいは＜８＞に記載の融合ポリペプチドを含む、キット。
　なお、本出願は、２０１３年８月２３日出願の日本国特許出願、特願2013-173850を基礎出願とする優先権主張出願であり、基礎出願の内容は全て本明細書に包含される。
　以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　〔１．コイボコモンサンゴ由来の遺伝子のクローニング〕
　（材料および方法）
　コイボコモンサンゴ（Montipora monasteriata）をマルチビーズショッカー（安井器機）によって粉砕後、ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡからOligotex-dT30 <super>（タカラバイオ）を用いてｍＲＮＡを精製した。SuperScript Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning（Invitrogen）を用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写には、配列番号１１に示すプライマーを用いた。得られたｃＤＮＡを、大腸菌用発現ベクターpFASTSET（pRSET（Invitrogen）のマルチクローニングサイトをpFastBac（Invitrogen）のマルチクローニングサイトに差し替えることによって作製したベクター）に挿入した後、大腸菌JM109 (DE3)（Promega）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ固体培地のプレート上で培養してコロニーを得た。得られたコロニーに、ＵＶイルミネーター、青色ＬＥＤおよび緑色ＬＥＤをそれぞれ用いて光を照射し、蛍光を発するか否か確認した。蛍光を発することを確認したコロニーを液体培地で培養後、大腸菌液からＤＮＡを抽出し、塩基配列の決定を行った。
　（結果）
　２個の発光するコロニーが得られ、これらのコロニーから、２つの蛍光タンパク質（１-２９および１-４１）のクローンを得た。また、１個の着色したコロニーが得られ、色素タンパク質のクローンを得た。BLASTで検索したところ、２つの蛍光タンパク質は新規のタンパク質であった。一方、色素タンパク質は既知のタンパク質であった。
　〔２．大腸菌における１－２９および１－４１タンパク質の発現〕
　（材料および方法）
　＜大腸菌発現用ベクターの作製＞
　１－２９のＤＮＡは、配列番号１２のforward primerおよび配列番号１３のreverse primerを用いたＰＣＲにより増幅した。また、１－４１のＤＮＡを、配列番号１４のforward primerおよび配列番号１５のreverse primerを用いたＰＣＲにより増幅した。それぞれのＰＣＲによって得られた、Ｎ末端にＫｐｎＩサイトを付加し、Ｃ末端にＥｃｏＲＩサイトを付加したＤＮＡ断片を、大腸菌用発現ベクターｐＲＳＥＴ（Invitrogen）に挿入し、大腸菌発現用のプラスミドＤＮＡを得た。
　＜大腸菌発現用ベクターの大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製＞
　大腸菌株JM109(DE3)(Promega)にヒートショック法によって上述の大腸菌発現用のプラスミドＤＮＡを導入し、アンピシリンを含むＬＢ固体培地のプレートに播種してコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地に植菌し、室温で３日間培養した。培養後に、遠心機を用いて遠心をして大腸菌の菌体を回収した。続いて大腸菌の菌体を凍結融解法で破砕し、破砕液を遠心機を用いて遠心分離し上清を得た。上清をNi-NTAカラムを用いてＨｉｓ－ｔａｇ精製した。次にSephadex G-25カラムを用いてバッファー交換を行った。
　＜タンパク質濃度の測定＞
　ＢＳＡ（bovine serum albumin）を標準液としてブラッドフォード法によって測定した。
　〔３．１－２９および１－４１タンパク質の蛍光特性の分析〕
　（材料および方法）
　＜吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定＞
　１－２９および１－４１タンパク質の蛍光特性について分析するため、吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定を行った。
　分光光度計（日立ハイテク）を用い、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に４０μＭとなるようにタンパク質を懸濁させて吸収スペクトルを測定した。また、SynergyMx（Biotek）を用いて、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に２μＭとなるようにタンパク質を懸濁させて蛍光スペクトルを測定した。さらに、絶対ＰＬ量子収率測定装置（浜松ホトニクス）を用い、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に２μＭとなるようにタンパク質を懸濁させて量子収率を測定した。結果を図１に示す。また、得られた測定結果について、表１にまとめた。
　（結果）
　図１は、１－２９および１－４１タンパク質の蛍光特性を示す図である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　〔４．１－２９および１－４１改変体の解析〕
　（材料および方法）
　＜変異導入による１－２９改変体および１－４１改変体の作製、１－２９改変体および１－４１改変体の大腸菌発現用ベクターの作製、大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製＞
　単量体化した改変体を得ることを目指し、上述の２．において得られた野生体の１－２９および１－４１の大腸菌発現用ベクターを鋳型とし、１－２９および１－４１にrandom mutagenesis法およびpoint mutation法を用いてランダムに変異を導入し、複数の１－２９改変体および１－４１改変体を得た。それぞれの改変体について、２．に記載の方法と同様の方法を用いて、大腸菌発現用ベクターによる大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製を行った。
　単量体化されているか否か確認は、改変体のタンパク質をＰｓｅｕｄ－Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ電気泳動により電気泳動したゲルに、ＵＶ照射して、単量体に相当する分子量におけるタンパク質の蛍光の発光を確認することにより行った。単量体化が確認されたクローンについて、アミノ酸配列の変異を調べた。結果を図２の（ａ）に示す。
　（結果）
　図２は、単量体化した改変体の大腸菌における発現および蛍光特性を示した図である。図２の（ａ）は改変体のタンパク質を、Ｐｓｅｕｄ－Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ電気泳動により電気泳動したゲルを、ＵＶトランスイルミネーターによってＵＶ照射して観察した図である。
　図２の（ａ）に示した通り、単量体化された数個の改変体を得た。そのうち特に蛍光の明るいものが９－２Ｂ、９－４および１０－３であった。
　また、９－２Ｂ、９－４および１０－３のアミノ酸配列を、順に配列番号５、６、１に示した。
　単量体の蛍光ポリペプチドＡである１０－３（配列番号１）の主要な蛍光特性は、以下の通りである。
最大励起波長（ｎｍ）：５７４
最大蛍光波長（ｎｍ）：５９８（赤色）
モル吸光係数（Ｍ-1ｃｍ-1）：４９５００
量子収率（％）：６６（ｐＨ７．４）
蛍光寿命（ナノ秒）：
ｐＨ感受性：ｐＨ６以上、特にｐＨ６～１１で蛍光強度は安定し、感受性は無い。
　また、単量体の蛍光ポリペプチドＡである９－２Ｂ（配列番号５）の主要な蛍光特性は、以下の通りである。
最大励起波長（ｎｍ）：５７３ 
最大蛍光波長（ｎｍ）：５９４（赤色）
モル吸光係数（Ｍ-1ｃｍ-1）：６０３００
量子収率（％）：６８（ｐＨ７．４）
蛍光寿命（ナノ秒）：
ｐＨ感受性：ｐＨ６以上、特にｐＨ６～１１で蛍光強度は安定し、感受性は無い。
　また、単量体の蛍光ポリペプチドＡである９－４（配列番号６）の主要な蛍光特性は、以下の通りである。
最大励起波長（ｎｍ）：５７３ 
最大蛍光波長（ｎｍ）：６１０（赤色）
モル吸光係数（Ｍ-1ｃｍ-1）：４４１００
量子収率（％）：７３（ｐＨ７．４）
蛍光寿命（ナノ秒）：
ｐＨ感受性：ｐＨ６以上、特にｐＨ６～１１で蛍光強度は安定し、感受性は無い。
　〔５．単量体化した１－２９および１－４１改変体タンパク質の蛍光特性の分析〕
　（材料および方法）
　＜１－２９および１－４１改変体タンパク質の吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定＞
　単量体化した１－２９および１－４１改変体タンパク質の蛍光特性について分析するため、吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定を行った。
　分光光度計（日立ハイテク）を用い、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に４０μＭとなるようにタンパク質を懸濁させて吸収スペクトルを測定し、極大吸収波長においてモル吸光係数を計算した。
また、SynergyMx（BioTek）を用いて、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に２μＭとなるようにタンパク質を懸濁させて蛍光スペクトルを測定した。さらに、絶対ＰＬ量子収率測定装置（浜松ホトニクス）を用い、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に２μＭとなるようにタンパク質を懸濁させて量子収率を測定した。また、公知の蛍光タンパク質であるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙおよびＴａｇＲＦＰについても同様に測定を行い、１－２９および１－４１改変体の値と比較した。なお、ＴａｇＲＦＰは５２５ｎｍの吸収値が０．１になるように調整し、それ以外では５４０ｎｍの吸収値が０．１になるように調整した。結果を図２中の（ｂ）および図３に示す。また、得られた測定結果について、表２にまとめた。
　（結果）
　図２は、単量体化した改変体の大腸菌における発現および蛍光特性を示した図である。図２の（ｂ）は、単量体化した２つのクローン（９－２Ｂおよび１０－３）について、蛍光特性を示した図である。上は、単量体化した２つのクローンそれぞれについて、吸収スペクトルを示す。下は単量体化した２つのクローンそれぞれについて、励起スペクトル（ＥＸ）および蛍光スペクトル（ＥＭ）を示す。なお、励起スペクトルの蛍光強度は、検出光の波長を６４０ｎｍに固定したときの値を示し、２つの蛍光スペクトルはそれぞれ励起光の波長を５４０ｎｍ（上のスペクトル）および３８０ｎｍとしたとき（下のスペクトル）の値を示している。
　図３は、単量体化した３つの改変体の蛍光特性を示した図である。３つの改変体の吸収スペクトルを示す。公知の赤色蛍光タンパク質として、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙおよびＴａｇＲＦＰを用いた。
　モル吸光係数を計算した結果、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙでは５２０００（Shaner et al, 2004 Nature Biotechnolgyの報告では９００００）、ＴａｇＲＦＰでは４８７００（Merzlyak et al., 2007 Nature Methodsの報告では１０００００）であった。一方、９－２Ｂでは６０３００、９－４では４４１００、１０－３では４９５００であった。
　量子収率は、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙではｐＨ７．４の条件下で０．３１（Shaner et al, 2004 Nature Biotechnolgyの報告では０．２２）、ＴａｇＲＦＰではｐＨ７．４の条件下で０．５２（Merzlyak et al., 2007 Nature Methodsの報告では０．４８）であったのに対し、９－２ＢではｐＨ７．４の条件下で０．６８、９－４ではｐＨ７．４の条件下で０．７３、１０－３ではｐＨ７．４の条件下で０．６６であった。
　以上の比較より、本発明の蛍光ポリペプチドの優れた蛍光特性が確認された。
　次に、本発明の蛍光ポリペプチドの大腸菌（JM109DE3）コロニーで光り始める早さをｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙおよびＴａｇＲＦＰの場合と比較した。上記と同様にして大腸菌発現用ベクターを大腸菌に導入し、３７℃で１７時間培養した時点での蛍光発光を調べた。mStrawberryでは光り始めたコロニーがわずかであるのに対し、ＴａｇＲＦＰおよび本発明の蛍光ポリペプチドでは多くのコロニーで光ることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　〔６．単量体化した１－２９および１－４１改変体タンパク質のｐＨ感受性の分析〕
　（材料および方法）
　１－２９および１－４１単量体化改変体の精製タンパク質を５０ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ－ＣＨ３ＣＯＯＨ（ｐＨ４．０およびｐＨ５．０）、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＴｒｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ９．およびｐＨ１０．０）、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ１１．０）中で、SynergyMx（Biotek）を用いて蛍光強度を測定し、得られた測定値のうち最も高い数値によって標準化した。
　（結果）
　図４は、単量体化した３つの改変体における蛍光強度のｐＨ感受性を示す。
　クローン９－２Ｂおよび９－４はｐＫａ＝４．５であり、１０－３はｐＫａ＝４．８であった。
　〔７．単量体化した１－２９および１－４１改変体の蛍光安定性の分析〕
　（材料および方法）
　ＨｅＬａ細胞に９－２Ｂ、９－４、１０－３、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙおよびＴａｇＲＦＰの遺伝子をLipofectamine 2000 reagent（Invitrogen）を用いてそれぞれ導入し、1日後に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した（対物レンズ：ＵｐｌａｎＳＡｐｏ×６０、励起：562nm/40、蛍光：624nm/40、ダイクロイックミラー：601nm、ND：１％、経過時間：3分毎）。それぞれの細胞に同じ条件で励起光を照射し続け、退色を調べた。結果を図５Ａおよび図５Ｂに示す。
　（結果）
　図５Ａおよび図５Ｂは、単量体化した３つの改変体の蛍光の安定性を示した図（図５Ａ）とグラフ（図５Ｂ）である。
　９－２Ｂ、９－４および１０－３は哺乳動物細胞中で問題なく発現させることができた。一方、ＴａｇＲＦＰでは、図５Ａの右下に示す通り、細胞質内でＴａｇＲＦＰが凝集した可能性を示す斑点が確認された。このような斑点は９－２Ｂ、９－４および１０－３では観察されず、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙも同様であった。
　また、グラフでは蛍光強度の変遷を時間軸で表しているが、９－２Ｂ、９－４および１０－３の退色はｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙより生じにくいことが分かった。
　〔８．蛍光波長のシフトした１－２９および１－４１改変体タンパク質の蛍光特性の分析〕
　（材料および方法）
　上述の２．において得られた野生体の１－２９および１－４１の大腸菌発現用ベクターを鋳型とし、１－２９および１－４１に、４．に記載の方法と同様に、random mutagenesis法およびpoint mutation法を用いてランダムに変異を導入し、複数の１－２９改変体および１－４１改変体を得た。それぞれの改変体について、２．に記載の方法と同様の方法を用いて、大腸菌発現用ベクターによる大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製を行った。それぞれの改変体のタンパク質について、５．に記載の方法と同様の方法を用いて、吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定を行った。結果を図６に示す。
　（結果）
　図６は、２つの改変体の蛍光波長のシフトを示した図である。
　解析した結果、複数の１－２９改変体および１－４１改変体のうち、１－２９改変体である１－２９Ｃ（配列番号７）および１－２９Ｇ（配列番号２）において蛍光波長がそれぞれ４２０ｎｍ近傍、５００ｎｍ近傍にシフトしていた。これらの改変体によって目的に応じた蛍光波長の選択が可能となる。
　〔９．他の改変体の解析〕
　＜変異導入による１－４１改変体の作製、１－４１改変体の大腸菌発現用ベクターの作製、大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製＞
　上述の〔２．〕において得られた野生体の１－４１タンパク質の大腸菌発現用ベクターを鋳型として、random mutagenesis法およびpoint mutation法を用いてランダムに変異を導入し、複数の１－４１改変体を得た。それぞれの改変体について、上述の〔２．〕に記載の方法と同様の方法を用いて、大腸菌発現用ベクターによる大腸菌における発現、培養およびタンパク質の精製を行った。
　得られた改変体が単量体化されているか否か確認は、改変体のタンパク質をＰｓｅｕｄ－Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ電気泳動により電気泳動したゲルに、ＵＶ照射して、単量体に相当する分子量におけるタンパク質の蛍光の発光を確認することにより行った。単量体化が確認されたクローンについて、アミノ酸配列の変異を調べた。ここで得られた新たな改変体（ｍＡｚａｌｅａと称する）のアミノ酸配列は配列番号１６として、ｍＡｚａｌｅａをコードする遺伝子のコード領域の塩基配列を配列番号１７として示す。
　〔１０．ｍＡｚａｌｅａの蛍光特性の分析〕
　（材料および方法）
　＜ｍＡｚａｌｅａの吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定＞
　上述の〔９．〕で得たｍＡｚａｌｅａの蛍光特性について分析するため、吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定を行った。
　分光光度計（日立ハイテク）を用い、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に４０μＭとなるようにタンパク質を懸濁させて吸収スペクトルを測定し、極大吸収波長においてモル吸光係数を計算した。なお、モル吸光係数の計算は、１ＭのＮａＯＨで変性した時に、成熟したＧＦＰの発色団の４４６ｎｍでのモル吸光係数が４４０００（Ｍ-1ｃｍ-1）であることを基準として、ｍＡｚａｌｅａの「変性した時の４４６ｎｍでの吸収値」と「ｐＨ７．４でのピークの吸収値」の比から計算をしたものである。また、SynergyMx（BioTek）を用いて、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に２μＭとなるようにｍＡｚａｌｅａ（蛍光タンパク質）を懸濁させて蛍光スペクトルを測定した。さらに、絶対ＰＬ量子収率測定装置（浜松ホトニクス）を用い、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に２μＭとなるようにｍＡｚａｌｅａを懸濁させて量子収率を測定した。なお、ｍＡｚａｌｅａを２μＭとなるように懸濁することによって、５４０ｎｍの吸収値が０．１になるように調整されている。結果を図７に示す。
　（結果）
　図７は、ｍＡｚａｌｅａの蛍光特性を示した図である。図中の上のグラフは、ｍＡｚａｌｅａの吸収スペクトルを示す。図中の下の二つのグラフは、ｍＡｚａｌｅａの励起スペクトル（ex640：点線で示す）および蛍光スペクトル（em540, em470：実線で示す）を示す。なお、励起スペクトルの蛍光強度は、検出光の波長を６４０ｎｍに固定したときの値を示し、２つの蛍光スペクトル（em540, em470）はそれぞれ励起光の波長を５４０ｎｍおよび４７０ｎｍとしたときの値を示す。
　ｍＡｚａｌｅａの蛍光特性を解析した結果、ｐＨ７．４における主要な特性は以下の通りである。
　吸収ピーク（ｎｍ）：５７５
　最大励起波長（ｎｍ）：５７４
　最大蛍光波長（ｎｍ）：５９８（赤色）
　モル吸光係数（Ｍ-1ｃｍ-1）：１０３２００
　量子収率（％）：４９
　ｐＨ感受性：ｐＨ５以上で９以下の範囲内、特にｐＨ６～８の範囲内で蛍光強度は安定し、感受性は無い。ｐＨ５未満かｐＨ９を超える場合、蛍光強度は大きく減少する。　〔１１．ｍＡｚａｌｅａのｐＨ感受性の分析〕
　（材料および方法）
　ｍＡｚａｌｅａの精製タンパク質を５０ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ－ＣＨ３ＣＯＯＨ（ｐＨ４．０およびｐＨ５．０）、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＴｒｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ９．０およびｐＨ１０．０）、および、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ１１．０）中で、SynergyMx（Biotek）を用いて蛍光強度を測定し、得られた測定値のうち最も高い数値によって標準化した。また、分光光度計（日立ハイテク）を用いて吸収スペクトルも測定した。
　（結果）
　図８は、ｍＡｚａｌｅａにおける蛍光強度のｐＨ感受性を示す。図中の上の二つのグラフは、様々なｐＨ条件下における、ｍＡｚａｌｅａの励起スペクトル（ex640）および蛍光スペクトル（em540）を示す。なお、励起スペクトルの蛍光強度は、検出光の波長を６４０ｎｍに固定したときの値を示し、蛍光スペクトル（em540）は励起光の波長を５４０ｎｍとしたときの値を示す。
　図中の下の左側のグラフは、様々なｐＨ条件下における、ｍＡｚａｌｅａの吸収スペクトルを示す。また、図中の下の右側のグラフは、ｍＡｚａｌｅａに関する、様々なｐＨ条件下における、波長５７５ｎｍの光の吸収（Ａｂｓ_５７５）、励起スペクトルの蛍光強度、および、蛍光スペクトルを示す。なお、励起スペクトル（ex_574）の蛍光強度は、検出光の波長を６４０ｎｍに固定したときの、５７４ｎｍの値を示し、蛍光スペクトル（em_598）は励起光の波長を５４０ｎｍに固定した時の５９８ｎｍの値を示す。
　ｍＡｚａｌｅａは、ｐＨ５以上で９以下の範囲内、特にｐＨ６～８の範囲内で蛍光強度は安定し、感受性は無い。しかし、ｐＨ５未満かｐＨ９を超える場合は、ｍＡｚａｌｅａの蛍光強度等は大きく減少する。すなわち、ｍＡｚａｌｅａは、ｐＨ感受性のある蛍光タンパク質として、ｐＨセンサ、および、ｐＨ依存性スイッチ等として利用できる。
　〔１２．ｍＡｚａｌｅａの蛍光安定性の分析〕
　（材料および方法）
　ＨｅＬａ細胞に、ｍＡｚａｌｅａ、ｍＲｕｂｙ２(Kredel et al., 2009 PLoS ONE)、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＴａｇＲＦＰ－Ｔの遺伝子をLipofectamine 2000 reagentを用いてそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後に、細胞固定を行った場合と、細胞固定を行わなかった場合のそれぞれの光安定性を調べた。なお、測定の条件は以下の通りである。
＜細胞固定を行った場合＞
　　固定方法：トランスフェクションの１日後に４％ＰＦＡで３０分氷上にて固定；バッファ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）含有ＨＢＳＳ；CCDカメラ：ＤＰ３０（オリンパス社製）；蛍光フィルターキューブ：Ｕ－ＭＰＦＰ　ＨＱ（オリンパス社製）（励起が535-555nm(BP535-555HQ)、ダイクロイックミラーが565nm(DM565HQ)、蛍光が570-625nm(BA570-625HQ)；対物レンズ：×４０　ＵｐｌａｎＦＬ　Ｎ；ＮＤフィルタ：２５％；ビニング：２（ｍｃｈｅｒｒｙのみ、１秒）；露出時間：１５ミリ秒（ｍｃｈｅｒｒｙのみ、３０ミリ秒）；照射間隔：１分、
＜細胞固定を行っていない場合＞
　　バッファ：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Gibco社製）；CCDカメラ：ＤＰ３０（オリンパス社製）；蛍光フィルターキューブ：Ｕ－ＭＰＦＰ　ＨＱ（オリンパス社製）；対物レンズ：×４０　ＵｐｌａｎＦＬ　Ｎ；ＮＤフィルタ：２５％；ビニング：２；露出時間：４０ミリ秒（ｍｃｈｅｒｒｙとＴａｆＲＦＰは３０ミリ秒、ｍＲｕｂｙは２５ミリ秒）；照射間隔：１分。
　（結果）
　図９は、ｍＡｚａｌｅａ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＴａｇＲＦＰ－Ｔの蛍光の安定性を示した図である。図中の左側が細胞固定を行った場合の結果であり、右側が細胞固定を行っていない場合の結果である。この結果から、ｍＡｚａｌｅａの蛍光安定性は、ｍＲｕｂｙ２より優れ、その他の蛍光タンパク質と比較しても遜色がないことが判る。
　〔１３．ｍＡｚａｌｅａの局所的な発現〕
　ＨｅＬａ細胞を用いて、そのサイトゾル（図１０の左側）、原形質膜（図１０の右側）、小胞体（図１１）、αチューブリンを含む器官（図１２）、並びに、βアクチンを含む器官（図１３）における、ｍＡｚａｌｅａの発現を解析した。ＨｅＬａ細胞は、Lipofectamine 2000 reagent（Invitrogen）を用いてそれぞれトランスフェクションし、１日後に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。トランスフェクションに用いた遺伝子コンストラクトは、ｍＡｚａｌｅａ遺伝子（図１０の左側）、Ｌｙｎ-ｍＡｚａｌｅａ／ｐｃＤＮＡ３（図１０の右側）であり、そして、図１１～図１３については、ｍＡｚａｌｅａ、ｍＲｕｂｙ２、およびｍＣｈｅｒｒｙの遺伝子（図中でＦＰと示す）をそれぞれ含む複数の遺伝子コンストラクトを用いた。Ｌｙｎ-ｍＡｚａｌｅａ／ｐｃＤＮＡ３は、膜結合性であるＬｙｎの配列とｍＡｚａｌｅａ遺伝子とを連結した遺伝子コンストラクトである。なお、図１１に対応する遺伝子コンストラクトは、カルレティキュリン－ＦＰ（蛍光タンパク質）－ＫＤＥＬをこの順に連結したもので、図１２に対応する遺伝子コンストラクトは、ＦＰ（蛍光タンパク質）とαチューブリンとをリンカー（ＧＧＧＧＳ）×３で連結したもので、図１３に対応する遺伝子コンストラクトは、ＦＰ（蛍光タンパク質）とβアクチンとをリンカー（ＧＧＧＧＳ）×３で連結したものである。
　結果を図１０～１３に示す。なお、測定の条件は以下の通りである。
＜サイトゾルの観察＞
　　バッファ：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Gibco社製）；CCDカメラ：ＤＰ３０（オリンパス社製）；蛍光フィルターキューブ：Ｕ－ＭＰＦＰ　ＨＱ（オリンパス社製）；対物レンズ：×４０　ＵｐｌａｎＦＬ　Ｎ；ＮＤフィルタ：２５％；ビニング：２；露出時間：３５ミリ秒
＜原形質膜の観察＞
　バッファ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）含有ＨＢＳＳ；CCDカメラ：ＤＰ３０（オリンパス社製）；蛍光フィルターキューブ：Ｕ－ＭＰＦＰ　ＨＱ（オリンパス社製）；対物レンズ：×４０　ＵｐｌａｎＦＬ　Ｎ；ＮＤフィルタ：１０％；ビニング：２；露出時間：４００ミリ秒
＜小胞体の観察＞
　顕微鏡：ＦＶ１０００（オリンパス社製）；対物レンズ：×６０　ＵｐｌａｎＡｐｏ　Ｗ／ＩＲ；スキャン速度：２．０μ秒／ピクセル；Ｃ．Ａ．：１３０μｍ；Ｋａｌｍａｎ：ｌｉｎｅ、×２；レーザー：５４３ｎｍ；蛍光：５６０-６６０ｎｍ
＜αチューブリンを含む器官の観察＞
　顕微鏡：ＦＶ１０００（オリンパス社製）；対物レンズ：×６０　ＵｐｌａｎＡｐｏ　Ｗ／ＩＲ；スキャン速度：４．０μ秒／ピクセル；Ｃ．Ａ．：１２０μｍ；Ｋａｌｍａｎ：ｌｉｎｅ、×４；レーザー：５４３ｎｍ；蛍光：５６０-６６０ｎｍ
＜βアクチンを含む器官の観察＞
　顕微鏡：ＦＶ１０００（オリンパス社製）；対物レンズ：×６０　ＵｐｌａｎＡｐｏ　Ｗ／ＩＲ；スキャン速度：２．０μ秒／ピクセル；Ｃ．Ａ．：１３０μｍ；Ｋａｌｍａｎ：ｌｉｎｅ、×２；レーザー：５４３ｎｍ；蛍光：５６０-６６０ｎｍ
　（結果）
　図１０～図１３に示すように、ｍＡｚａｌｅａは、ＨｅＬａ細胞中の標的とした箇所に局在的に発現する蛍光マーカーとして機能することがわかった。
　〔１４．ｍＡｚａｌｅａの成熟速度〕
　次にｍＡｚａｌｅａの光り始める早さをｍＣｈｅｒｒｙの場合と比較した。ＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ　Ｓ３）に、ｍＡｚａｌｅａおよびｍＣｈｅｒｒｙの遺伝子をそれぞれトランスフェクションした。次いで、このＨｅＬａ細胞を、６時間、１２時間、１８時間培養した時点での蛍光発光を調べた。図１４に結果を示すように、ｍＡｚａｌｅａの光り始める早さは、ｍＣｈｅｒｒｙとほぼ同等であった。
　ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションの条件：FuGENE（登録商標） HD を用いて、１μｇのプラスミドをトランスフェクションした。
ＨｅＬａ細胞の培養条件：培地は１０％　ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地。培養条件は、顕微鏡用培養装置ＦＶ１０ｉを用いて、３７℃で５％濃度の二酸化炭素存在下。
蛍光発光の観察条件：
レーザ（Laser）: 559nm_7.5%, PMT: 40%, em: 570-670nm, C. A.: 300um
対物レンズ（Obj）: UPlanSApo 10×, スキャンスピード（Scan speed）: 2μs/pixel
イメージサイズ（Image size）: 512x 512, ズーム（Zoom）: x1, Kalman: line x2
インターバル（Interval）: 15min
　〔１５．ｍＡｚａｌｅａに基づく改変体タンパクの作製とその解析〕
　上述の〔９．〕欄で記載をしたｍＡｚａｌｅａのアミノ酸配列において、８５番目のアミノ酸をイソロイシンからロイシンに置換し、１７６番目のアミノ酸をチロシンからメチオニンに置換した改変体タンパク質を作製し、これをｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５と称した。なお、部位特異的なアミノ酸変異は、ｍＡｚａｌｅａの遺伝子配列を鋳型として導入をした。ｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５のアミノ酸配列は、配列番号１８に、遺伝子のコード領域の塩基配列は、配列番号１９に示す。
　次いで、得られたｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の蛍光特性について分析するため、吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび量子収率の測定を行った。分光光度計（日立ハイテク）を用い、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に４０μＭとなるようにタンパク質を懸濁させて吸収スペクトルを測定し、極大吸収波長においてモル吸光係数を計算した。モル吸光係数の計算は、ｍＡｚａｌｅａの場合と同様の条件で行った。また、SynergyMx（BioTek）を用いて、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に２μＭとなるようにｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５（蛍光タンパク質）を懸濁させて蛍光スペクトルを測定した。さらに、絶対ＰＬ量子収率測定装置（浜松ホトニクス）を用い、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に２μＭとなるようにｍＡｚａｌｅａを懸濁させて量子収率を測定した。なお、タンパク質を２μＭとなるように懸濁することによって、５４０ｎｍの吸収値が０．１になるように調整されている。結果を図１５の左側に示す。
　〔１６．ｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５のｐＨ感受性の分析〕
　（材料および方法）
　ｍＡｚａｌｅａおよびｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の精製タンパク質それぞれについて、５０ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ－ＣＨ３ＣＯＯＨ（ｐＨ４．０およびｐＨ５．０）、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＴｒｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ９．０およびｐＨ１０．０）、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ１１．０）、および５０ｍＭの０．２Ｍ　ＫＣｌ－０．２Ｍ　ＮａＯＨ（ｐＨ１２．０）中で、SynergyMx（Biotek）を用いて蛍光強度を測定し、得られた測定値のうち最も高い数値によって標準化した。また、分光光度計（日立ハイテク）を用いて吸収スペクトルも測定した。
　（結果）
　図１５の右側のグラフは、ｍＡｚａｌｅａおよびｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５に関する、様々なｐＨ条件下における蛍光スペクトルを示す。なお、蛍光スペクトルは、ｍＡｚａｌｅａについては励起光の波長を５４０ｎｍに固定した時の５９８ｎｍの値であり、ｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５については励起光の波長を５４０ｎｍに固定した時の５９６ｎｍの値である。
　　ｍＡｚａｌｅａ Ｂ５の蛍光特性を解析した結果、ｐＨ７．４における主要な特性は以下の通りである。
　吸収ピーク（ｎｍ）：５７４
　最大励起波長（ｎｍ）：５７４
　最大蛍光波長（ｎｍ）：５９６（赤色）
　モル吸光係数（Ｍ-1ｃｍ-1）：１０３７００
　量子収率（％）：５８
　ｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５は、ｐＨ５以上で９以下の範囲内、特にｐＨ６～８の範囲内で、ｍＡｚａｌｅａより一層、蛍光強度は安定し、感受性は無い。しかし、ｐＨ５未満かｐＨ９を超える場合は、ｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の蛍光強度等は大きく減少する。すなわち、ｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５は、ｐＨ感受性のある蛍光タンパク質として、ｐＨセンサ、および、ｐＨ依存性スイッチ等として利用できる。
　〔１７．ｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の蛍光安定性の分析〕
　ＨｅＬａ細胞に、ｍＡｚａｌｅａ、およびｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の遺伝子をLipofectamine 2000 reagent（Invitrogen）を用いてそれぞれトランスフェクションし、１日後に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。
　結果を図１６に示す。なお、測定条件は以下の通りである。
　バッファ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）含有ＨＢＳＳ；CCDカメラ：ＣｏｏｌＳＮＡＰ　ＨＱ；蛍光フィルターキューブ：Ｕ－ＭＰＦＰ　ＨＱ（オリンパス社製）；対物レンズ：×４０　ＵｐｌａｎＦＬ　Ｎ；ＮＤフィルタ：３０％；ビニング：１；露出時間：２５ミリ秒；照射間隔：１分。
　ｍＡｚａｌｅａおよびｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の蛍光安定性は同程度であることが確認された。
　〔１８．ｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の局所的な発現〕
　ＨｅＬａ細胞を用いて、その小胞体における、ｍＡｚａｌｅａおよびｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の発現を解析した。ＨｅＬａ細胞は、Lipofectamine 2000 reagent（Invitrogen）を用いてそれぞれトランスフェクションし、１日後に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。トランスフェクションに用いた遺伝子コンストラクトは、カルレティキュリン－ＦＰ－ＫＤＥＬをこの順に連結したものであり、ＦＰはｍＡｚａｌｅａまたはｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５の遺伝子を示す。
　結果を図１７に示す。なお、測定条件は以下の通りである。
　顕微鏡：ＦＶ１０００（オリンパス社製）；対物レンズ：×６０　ＵｐｌａｎＡｐｏ　Ｗ／ＩＲ；スキャン速度：４．０μ秒／ピクセル；Ｃ．Ａ．：１２０μｍ；Ｋａｌｍａｎ：ｌｉｎｅ、×４；レーザー：５４３ｎｍ（３０％）；蛍光：５６０-６６０ｎｍ、ＰＭＴ：７７０Ｖ
　（結果）
　図１７に示すように、ｍＡｚａｌｅａ_Ｂ５は、ｍＡｚａｌｅａより一層優れて、ＨｅＬａ細胞中の小胞体に局在的に発現する蛍光マーカーとして機能することがわかった。
　本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載した参考文献に記載の内容は全て、リファレンスとして本明細書の内容に援用される。
　本発明に係る蛍光タンパク質の一例は優れた量子収率等の特性を有する。そのため、例えば、標的遺伝子の発現パターンを解析するための蛍光標識や、医薬候補化合物をスクリーニングする際の蛍光標識等として、生化学的分析分野や医療分野等で有用である。

Claims (17)

  1. 　以下の（１）～（４）の何れかに示す、蛍光特性を有するポリペプチド。
    （１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （２）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において１～３４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （３）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、
    （４）上記（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
  2. 　蛍光の量子収率Φが０．４以上である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　以下の（１）～（４）の何れかに記載のポリヌクレオチド。
    （１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （２）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において１～３４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （３）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  4. 　（ａ）発現宿主内で機能的な発現制御領域；および
    　（ｂ）請求項３に記載のポリヌクレオチド； 
    を含む、発現カセット。
  5. 　請求項３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の発現カセットを含むベクター。
  6. 　請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の発現カセットまたは請求項５に記載のベクターを含む形質転換体。
  7. 　非ヒトトランスジェニック生物である、請求項６に記載の形質転換体。
  8. 　請求項１または２に記載のポリペプチドと他のポリペプチドとからなる融合ポリペプチド。
  9. 　蛍光観察の方法であって、
    　請求項１または２に記載のポリペプチド、あるいは請求項８に記載の融合ポリペプチドを細胞において産生させる産生工程と、当該ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに由来する蛍光を観察する観察工程とを含む、方法。
  10. 　細胞において１以上の目的遺伝子の発現および／または局在性に対する１以上の試験物質の作用を評価する方法であって、
    ｉ）第一の目的遺伝子と融合されていてもよい請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第一の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第一の核酸分子を、細胞内に導入する導入工程、
    ｉｉ）導入工程を経た上記細胞を上記試験物質の存在下および不在下で培養する培養工程、
    ｉｉｉ）上記細胞における蛍光発光を検出する蛍光検出工程、および
    ｉｖ）試験物質の存在下および不在下で得られた、上記細胞における蛍光発光を比較して、上記目的遺伝子の発現および／または局在性に対する試験物質の作用を評価する評価工程、を含む、方法。
  11. 　上記導入工程において、さらに、
    上記第一の核酸分子とは異なる蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、第二の発現制御配列の制御下におかれるように当該発現制御配列と作動可能に連結された第二の核酸分子を、上記細胞内に導入する、請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項３に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む形質転換体を作製する方法であって、
    　請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の発現カセットまたは請求項５に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法。
  13. 　請求項１２に記載の方法で得られた形質転換体またはその子孫。
  14. 　請求項３に記載のポリヌクレオチドの全体または一部を細胞中に含む非ヒトトランスジェニック生物を作製する方法であって、
    　請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の発現カセットまたは請求項５に記載のベクターを、ドナー細胞から採取した受精卵に導入する工程を含む、方法。
  15. 　請求項１４に記載の方法で得られた非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫。
  16. 　請求項１５に記載の非ヒトトランスジェニック生物またはその子孫より細胞を採取し、該細胞に初期化因子を導入して多能性幹細胞を作製する方法。
  17. 　請求項１または２に記載のポリペプチド、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の発現カセット、請求項５に記載のベクター、請求項６または７に記載の形質転換体、あるいは請求項８に記載の融合ポリペプチドを含む、キット。
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