CN117106097A - 一种rna-蛋白质复合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种RNA‑蛋白质复合物，包括：a)N1‑N2或N2‑N1嵌合RNA，其中N1是任意感兴趣的靶标RNA序列，N2为RNA适配体序列；b)P1‑P2或P2‑P1重组融合蛋白，其中P1是RNA结合蛋白，P2为发光蛋白，所述P1RNA结合蛋白可以特异性识别结合N1靶标RNA序列。本发明还提供包含这种RNA‑蛋白质复合物各组分的表达载体，及用这种RNA‑蛋白质复合物检测靶标RNA‑蛋白质相互作用和/或检测靶标RNA的方法。本发明还提供装有所述RNA‑蛋白质复合物各组分的试剂盒。本发明的RNA‑蛋白质复合物具有低背景、高信噪比、高动态响应范围等优点，可用于检测体外、细胞和活体中靶标RNA或RNA‑蛋白质相互作用。
Description
技术领域
本发明涉及遗传工程、蛋白质工程、合成生物学、化学生物学等多学科交叉领域，具体地涉及RNA及RNA-蛋白质相互作用检测，更具体地涉及一种RNA-蛋白质复合物和采用该系统检测RNA及RNA-蛋白质相互作用的方法。
背景技术
RNA是生命活动中最重要的生物大分子之一，它不仅能将遗传信息从DNA传递到蛋白质，还在生命活动的多种功能调控方面发挥重要作用(Cech etal.Cell 2014.157:77-94)。根据功能的不同，人们将RNA分为信使RNA(messenger RNA，mRNA)、转运RNA(transferRNA，tRNA)、核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)、非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)和环RNA(circular RNA，circRNA)等多种类型。mRNA将储藏在DNA序列中的遗传信息传递到蛋白质，tRNA和rRNA参与蛋白质的合成，ncRNA具有调控mRNA翻译、指导染色体沉默、参与核仁构建等多种作用，circRNA可吸附miRNA以解除miRNA对基因表达的抑制作用。此外，RNA还与多种多样的蛋白质相互作用来调控自身的合成、定位和功能(Gerstbergeret al.Nat RevGenet2014.15:829-845)。例如，RNA的生物合成、RNA的运输、RNA的剪接、RNA的甲基化等修饰、细胞质RNA处理小体(processing bodies，P-bodies)(Anderson etal.BiochimBiophys Acta 2015.1849:861-870)和应激颗粒(stress granules，SGs)(Khonget al.Mol Cell 2017.68:808-820)的形成过程等，都有蛋白质的参与。通过上述分子生物学和生物化学机制，RNA直接参与了非常广泛的生命活动过程，包括细胞不对称分化、极性细胞的局部翻译、免疫细胞激活和记忆、癌细胞中可变剪接的异常积累等等(Eliscovichet al.The Journal of biological chemistry 2013.288:20361-20368)。除了已知功能的RNA外，还存在着很多作用机制及功能尚未被揭示的RNA。研究特定RNA的时空分布和动力学，能够揭示由于RNA调控失衡导致的疾病的发生机制。因此，开发用于研究RNA时空分布的工具十分重要。此外，细胞内RNA功能的发挥大都有RNA结合蛋白的参与(Ramanathan et al.Nature methods 2019.16:225-234；Jankowsky et al.Nat Rev MolCell Bio 2015.16:533-544)，RNA结合蛋白的功能丧失或调控失衡与很多疾病相关。因此，在分子或活细胞水平研究RNA与蛋白质相互作用对RNA功能机制以及人类生理或疾病的研究至关重要。
在生命科学研究领域，活细胞成像是在细胞水平获取生命活动信息最直观、最真实的方法。在RNA的研究中，最直观的方法就是能够直接观察到它们在细胞中的合成、运输和定位，这就需要对细胞内的目的RNA进行标记和成像。然而，RNA的瞬变特性和低拷贝数，有的甚至是在一个细胞中只有一个拷贝(Schwanhausser et al.Nature 2011,473:337-342)，给RNA的研究带来很大的困难，研究者们很难精确绘制RNA从合成到降解的生命过程。荧光蛋白(fluorescent protein,FP)能够在活细胞和活体中对目的蛋白进行定位标记，是监测蛋白表达、相互作用等动力学过程强有力的工具(Enterina et al.Current opinionin chemical biology 2015.27:10-17)。然而，由于缺乏性质优良的天然荧光RNA，科学家们很难对活细胞中的RNA直接进行研究。因此，性质优良的RNA成像工具，将在活细胞中RNA的检测和示踪方面发挥重要作用。
目前，可对细胞中特定RNA进行成像的技术包括荧光原位杂交技术(FluorescenceIn-Situ Hybridization，FISH)(Raj et al.Nature methods 2008.5:877-879；Battichet al.Nature methods 2013.10:1127-1133)、共价标记技术(Li,F etal.AngewandteChemie 2015.54:4597-4602；Alexander et al.Journal of the AmericanChemical Society 2015.137:12756-12759)、RNA结合蛋白-荧光蛋白技术(RNA bindingprotein-fluorescent protein，RBP-FP)(Bertrand et al.Mol Cell 1998.2:437-445；Batra et al.Cell 2017.170:899-912)和荧光RNA技术(Paige et al.Science 2011.333:642-646；Ouellet et al.Front Chem 2016.4:29)。FISH技术利用荧光团修饰的单链DNA作为荧光标签对核酸分子进行标记。共价标记技术通过共价修饰使荧光团分子与目的RNA发生化学反应，对目的RNA进行标记。RBP-FP技术利用荧光蛋白作为荧光报告分子，与RNA结合蛋白融合，从而达到结合并标记RNA的目的。荧光RNA技术直接在目的RNA上融合RNA适配体，通过添加能够被RNA适配体结合并激活的染料，达到标记目的RNA的目的。
现有的RNA成像技术存在一些缺陷。原位杂交技术可以直接标记内源性RNA，不需要额外添加RNA靶点，但受限于细胞膜的核酸低渗透性，通常只能用于固定细胞或组织中RNA的成像，很难进行活细胞中RNA的成像。共价标记技术只需要在目的RNA上共价标记分子量很小的荧光团(<1kDa)，对目的RNA的影响较小，且标记稳定性好，但现有的共价标记通常也只能用于固定细胞。RBP-FP技术能够对活细胞RNA进行成像，然而游离的融合荧光蛋白造成较高的背景荧光，为了提高信噪比，需要在目的RNA中插入多个结合模块，但是多分子融合荧光蛋白的结合会干扰目的RNA的合成、运输和定位等正常生理过程及功能(Tutucci etal.Nature methods 2018.15:81-89；You et al.Annual review of biophysics2015.44:187-206)，且蛋白从生成到成熟需要很长的时间，对RNA的检测信息有滞后性。
荧光RNA的出现为活细胞RNA成像提供了新型的工具，它作为RNA的荧光标签具有很多优点：(1)作为遗传编码标签，它的合成与目的RNA的转录同步，对RNA的标记具有实时性；(2)它的分子量小，标记系统简单，对目的RNA的干扰小；(3)它与染料的结合是可逆的，可以直接通过漂洗去除染料；(4)染料分子只有在结合特定的RNA适配体后，才能发出荧光，因此背景荧光非常低；(5)操作简单，只需直接在目的RNA上融合RNA适配体，再加入染料分子标记即可。克服了以上三种RNA成像技术的缺陷。然而，许多荧光染料如花菁染料、Hoechst类似物和荧光团-淬灭剂，它们在活细胞中有很强的背景荧光或很难透过细胞膜，因此不适合用于活细胞RNA标记与成像。Spinach、Broccoli和Corn等荧光RNA的染料分子由天然荧光蛋白的荧光团演化而来，具有背景荧光低、细胞通透性好、细胞毒性低等优点。这些荧光RNA已经成功用于细胞内不同RNA的成像，还成功用于多种代谢物和蛋白质探针的设计，并在原来的基础上开拓了光谱(Bouheddaet al.International journal ofmolecular sciences 2018.19:44)。遗憾的是，它们的细胞荧光亮度低，热稳定性和光稳定性都较差，很难实现对低丰度RNA的成像。其中Spinach、Broccoli和Mango等含有G-四联体结构的荧光RNA对于染料的特异性比较差，可以激活其他荧光RNA的染料，如Spinach、Broccoli可以激活Mango的染料TO1(Huang et al.Nature chemical biology 2014.10:686-691；Trachmanet al.Nature chemical biology 2017.13:807-813)。这一缺陷使得它们不能在细胞内同时使用，很难实现多种RNA的同时成像(Jenget al.RNA 2016.22:1884-1892)。此外，G-四联体在哺乳动物细胞中是不稳定的(Guo et al.Science 2016.353:6306)，这使得具有这类结构的荧光RNA在哺乳动物细胞中只有少部分正确折叠的荧光RNA分子能真正起到标记RNA的作用，因此这类荧光RNA的热稳定性和光稳定性都较差。还有些荧光RNA，如Corn等，还需要形成二聚体才能够激活染料的荧光，这很可能干扰目的RNA的分子间独立性，影响目的RNA的功能。本实验室发表的Pepper荧光RNA在荧光亮度和稳定性方面有较大的提高，但它与其他荧光RNA一样，都需要额外提供激发光才能实现对RNA的成像。额外给予激发光，会有一定的光毒性，对细胞造成损伤，且在活体成像时，激发光难以透过深层组织。而荧光素酶催化底物发出的光也可以激发受体荧光团的荧光，或许可以替代激发光。
RNA的功能发挥大都需要蛋白质的参与，传统的RNA与蛋白质相互作用的研究方法是将细胞裂解后，对RNA-蛋白质复合物进行体外研究，例如，以特定RNA为中心对与其相互作用的蛋白进行研究，或以特定蛋白为中心对与其相互作用的RNA进行研究。目前，活细胞中监测RNA与蛋白质相互作用的方法较少，主要是基于FRET原理，利用荧光蛋白作为能量供体，经典的RBP-FP系统作为能量受体。RBP-FP系统的缺陷前面已多次提及，系统复杂且很可能对研究对象的正常功能和代谢造成影响(Huranovaet al.Rna 2009.15:2063-2071)。也有研究者利用RNA荧光染料作为能量受体，虽不需要RBP-FP融合蛋白，但非特异性的荧光染料也会造成较高的背景荧光(Lorenz et al.Rna 2009.15:97-103)。此外，FRET方法需要外源激发光提供能量，不适用于深层组织和活体成像(Mohanty et al.J Mod Optic2015.62:949-970)。
生物发光共振能量转移(Bioluminescence resonance energy transfer，BRET)用荧光素酶催化底物发出的光激发受体荧光团的荧光，是底物介导的受体激发过程，不存在FRET中的自发荧光、光漂白和同时激活供体和受体的问题，有利于光敏感的生物系统研究。并且荧光素酶的分子量较小，对目的蛋白本身的结构影响较少，这使BRET在活细胞和活体成像方面更有优势(Xu et al.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America2007.104:10264-10269)，十分有利于生命科学领域的研究。最原始的BRET系统由海肾荧光素酶(Renilla luciferase，Rluc)作为能量供体，GFP作为能量受体。后来，研究者开发了性质更加优良的NanoLuc荧光素酶(NanoLucluciferase，NLuc)，它能够催化Furimazine发光，发射峰在460nm(Hall et al.ACSchemical biology 2012.7:1848-1857)。NLuc的分子量小(19kDa)、发射光强度高和光谱相对较窄等性质使它适合作为BRET能量供体。目前，BRET系统已经成为检测蛋白之间相互作用的强大工具。
荧光RNA可作为BRET系统的能量受体用于RNA与蛋白质之间相互作用的检测。荧光RNA与目的RNA融合，荧光素酶与目的蛋白融合，当目的RNA与目的蛋白发生相互作用时，荧光RNA与荧光素酶在空间上靠近到合适的相对位置，就能够发生BRET现象。良好的BRET能量受体应当具有高量子产率、较大的斯托克斯位移和较长的发射波长等优点。
BRET信号的强度受到以下几个因素的影响：(1)BRET供体与受体之间的距离，BRET效率与能量供体和能量受体之间距离的六次方成反比，E＝1/(1+R6/R0 6)，R0是指供体能量50％转移到受体时供体和受体之间的距离(Xia et al.CurrOpinBiotechnol 2009.20:37-44)。(2)供体的发射光谱与受体的激发光谱的重叠程度。(3)供体与受体之间的相对方向，这与能量共振转移发生机制中偶极子-偶极子的性质相关。(4)受体与供体浓度的比率，BRET信号强度随着受体和供体浓度比率的升高而升高，当所有供体被受体饱和时，BRET信号不再上升。因此，通过优化BRET供体和受体之间的距离和空间位置关系，能够提高BRET效率。
发明概述
本发明提供一种RNA-蛋白质复合物，其特征在于，所述RNA-蛋白质复合物包括：
a)N1-N2或N2-N1嵌合RNA，其中N1是任意感兴趣的靶标RNA序列，N2为RNA适配体；
b)P1-P2或P2-P1重组融合蛋白，其中P1是RNA结合蛋白，P2为发光蛋白，并且，其中，P1代表的RNA结合蛋白可以特异性识别结合所述N1代表的靶标RNA序列。
其中所述嵌合RNA序列N1和N2之间可直接连接或操作性连接，和/或，所述重组融合蛋白P1与P2之间可操作性连接。
所述RNA适配体可以特异性识别结合荧光团分子，并显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光信号。
所述RNA适配体可选自Pepper RNA适配体、Clivia RNA适配体、Spinach RNA适配体、Spinach2 RNA适配体、iSpinachRNA适配体、Broccoli RNA适配体、Red Broccoli RNA适配体、Orange BroccoliRNA适配体、Corn RNA适配体、Mango RNA适配体、Chili RNA适配体、DNB RNA适配体、SRB-2RNA适配体、13-2min RNA适配体、A1 RNA适配体、A RNA适配体、ATRNA适配体、DIR-Apt1 RNA适配体、DIR2s-Apt RNA适配体、Mango RNA适配体、MGA RNA适配体，或其任何一种的生物活性变体或片段，或所述RNA适配体的嵌合体。
所述荧光团分子可选自HBC485、HBC497、HBC508、HBC514、HBC525、HBC530、HBC599、HBC620、IV-39、IV-17、IV-20、IV-18、IV-21、IV-19、IV-22、IV-37、IV-4、IV-3、IV-2、IV-1、IV-6、IV-5、DFHBI、DFHBI-1T、DFHBI-2T、BI、OBI、TBI、DFHO、DIR、OTB-SO3、OTB-T-SO3、DIR-Pro、SR-DN、TMR-DN、RG-DN、DMHBI-Imi、DMHBI+、DMHBO+、TO1、TO3、MG。
所述发光蛋白可催化特定的底物分子产生特定波长的光。
所述发光蛋白可选自深海细角刺虾荧光素酶、海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、腔肠荧光素酶、北美萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶、铁路蠕虫荧光素酶、细菌荧光素酶、高斯荧光素酶、水母发光蛋白、Arachnocompa荧光素酶，或其中任何一种的生物活性变体或片段，或其中两种或更多种的嵌合体。
所述荧光素酶能够催化特定的底物产能。底物可选自荧光素、腔肠素、Furimazine，或其中任何一种的衍生物或类似物。
所述的RNA-蛋白质复合物中，P1及N1的结合使P2催化底物产生的特定波长光，经生物发光共振能量转移(BRET)激活N2 RNA适配体-荧光团分子复合物产生荧光。
所述的RNA-蛋白质复合物中，P1和N1可选自来源于噬菌体的MCP衣壳蛋白与MS2发夹RNA、N蛋白与boxB RNA、U1A蛋白与U1 snRNA stem loop2 RNA、HnRNP C蛋白与Poly URNA、LARP7蛋白与7SK SL4 RNA、Nova-1蛋白与UCAGUCAC基序RNA、STAR蛋白与ACUAAC RRE、Fox-1蛋白与UGCAUGU RRE、TAP蛋白与CTE RNA、ZRANB2蛋白与AGGUAA RRE，或其任何一种的生物活性变体或片段。
所述的RNA-蛋白质复合物中，P1和N1还可包含它们的串联体、环状更替突变体，或其任何一种的生物活性变体或片段，或其中两种或更多种的嵌合体。
所述的RNA-蛋白质复合物中，P1-P2或P2-P1重组融合蛋白可选自NLuc-MCP、NLuc-cpMCP、NLuc-dMCP、NLuc-dMCP-Y85G、NLuc-dMCP-K43G、NLuc-dMCP-E63G、NLuc-dMCP-N55G/K57G、NLuc-dMCP-E89G/T91G、NLuc-dMCP-Y85G/K43G、NLuc-dMCP-Y85G/E63G、NLuc-dMCP-Y85G/N55G/K57、NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G、NLuc-dMCP-N55G/K57/E63G、NLuc-dMCP-E89G/T91G/E63G、NLuc-dMCP-N55G/K57/K43G、NLuc-dMCP-E89G/T91G/K43G、NLuc-ddMCPmax、NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G/E63G、NLuc-λN、NLuc-U1A、NLuc-HnRNPC、LARP7-NLuc、Nova-1-NLuc、STAR-NLuc、Fox-1-NLuc、TAP-NLuc、ZRANB2 D-NLuc、GLuc-ddMCPmax、FLuc-ddMCPmax。
所述的RNA-蛋白质复合物中，N1-N2或N2-N1嵌合RNA可选自Clivia-MS2max、Clivia-MS2-7、Clivia-MS2-6、Clivia-MS2-5、Clivia-MS2-4、Clivia-boxB、Clivia-U1SL2、Clivia-UUUUC、Clivia-7SK-SL4、Clivia-UCAGUCAC、Clivia-ACUAAC、Clivia-UGCAUGU、Clivia-CTE、Clivia-AGGUAA、Clivia-CGGUAA、Clivia-ACGUAA、Clivia-AGCUAA、Clivia-AGGGAA、Clivia-AGGUUA、Clivia-AGGUAC、Pepper-MS2、Broccoli-MS2、Red Broccoli-MS2、Orange Broccoli-MS2、Spinach-MS2、Spinach2-MS2、iSpinach-MS2、Corn-MS2、MGA-MS2。
本发明还提供包含这种RNA-蛋白质复合物各组分的表达载体。所述表达载体含有所述N1-N2或N2-N1嵌合RNA编码核苷酸序列，和/或所述P1-P2或P2-P1重组融合蛋白编码核苷酸序列，其中N1和P1编码核苷酸序列空缺。
所述的RNA-蛋白质复合物用于检测宿主细胞中靶标RNA或RNA-蛋白质相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：a)将所述RNA-蛋白质复合物的各组分构建在原核或真核质粒表达载体中；b)将重组质粒引入宿主细胞；c)分别加入荧光团分子和发光蛋白底物分子，检测荧光团分子在合适波长下的荧光强度和荧光素酶催化底物产生的合适波长下的发光强度。
RNA-蛋白质复合物用于检测细胞外靶标RNA或RNA-蛋白质相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：a)制备所述RNA-蛋白质复合物的嵌合RNA和重组融合蛋白组分；b)将嵌合RNA和重组融合蛋白组分混合；c)分别加入荧光团分子和发光蛋白底物分子，检测荧光团分子在合适波长下的荧光强度和荧光素酶催化底物产生的合适波长下的发光强度。
本发明还提供一种试剂盒，试剂盒装有包含所述RNA-蛋白质复合物的嵌合RNA和重组融合蛋白组分，和/或含有所述RNA-蛋白质复合物中各组分的表达载体，和/或含有所述RNA-蛋白质复合物中各组分表达载体的原核或真核细胞，和/或整合含有所述RNA-蛋白质复合物组分的原核或真核细胞。
附图说明
图1.BRET系统基本发生原理示意图。
图2.NLuc与MCP的不同融合蛋白与Clivia-MS2的相互作用活细胞BRET检测。图3.Clivia与MS2的不同嵌合RNA和NLuc与MCP的不同融合蛋白的相互作
用活细胞BRET检测。(a)使用不同茎长连接Clivia与MS2的嵌合RNA示意图；(b)使用不同长度连接肽(1至5个氨基酸)连接的NLuc和
ddMCPmax重组蛋白示意图；(c)不同连接肽重组蛋白与不同茎长嵌合
RNA正交BRET检测；(d)最佳组合Clivia-MS2max和NLuc-ddMCPmax的
BRET发光光谱。
图4.不同RNA适配体与MS2的嵌合RNA BRET检测。(a)Pepper-MS2和
NLuc-ddMCPmax的BRET检测；(b)Broccoli-MS2和NLuc-ddMCPmax的BRET检测；(c)MS2-Red Broccoli和GLuc-ddMCPmax的BRET检测；
(d)MS2-Orange Broccoli和GLuc-ddMCPmax的BRET检测；(e)MS2-
Spinach和NLuc-ddMCPmax的BRET检测；(f)MS2-Spinach2和GLuc-
ddMCPmax的BRET检测；(g)MS2-iSpinach和NLuc-ddMCPmax的BRET检测；(h)MS2-Corn和GLuc-ddMCPmax的BRET检测；(i)MS2-MGA和FLuc-ddMCPmax的BRET检测。
图5.利用Clivia对应的一系列荧光团分子对Clivia-MS2与NLuc-MCP相互作用
进行活细胞内BRET检测。
图6.其他发光蛋白替换NLuc进行BRET检测。(a)Clivia-MS2和GLuc-ddMCPmax相互作用的BRET检测；(b)Clivia-MS2和FLuc-ddMCPmax相互作用的BRET检测。
图7.宿主细胞中靶标RNA-蛋白质相互作用的活细胞成像。(a)共表达Clivia-MS2max和NLuc-ddMCPmax的HEK293T细胞与1μM IV-4和10μMFurimazine孵育成像，共表达Clivia和NLuc-ddMCPmax的HEK293T细胞作为对照，比例尺20μm；(b)图(a)中BRET效率的统计分析，数据代表平均值和标准方差(N＝50个细胞)。
图8.宿主细胞中靶标RNA-蛋白质相互作用的检测。LARP7-NLuc重组蛋白与
Clivia-7SK-SL4嵌合RNA(a)、Fox-1-NLuc重组蛋白与Clivia-
UGCAUGU嵌合RNA(c)、Nova-1-NLuc重组蛋白与Clivia-UCAGUCAC嵌合RNA(e)、NLuc-U1A重组蛋白与Clivia-U1SL2嵌合RNA(g)、
TAP-NLuc重组蛋白与Clivia-CTE嵌合RNA(i)、NLuc-HnRNPC重组蛋白与Clivia-UUUUC嵌合RNA(k)、STAR-NLuc重组蛋白与Clivia-
ACUAAC嵌合RNA(m)的表达系统示意图；共表达Clivia-7SK-SL4和
LARP7-NLuc(b)、Clivia-GCAUG和Fox-1-NLuc(d)、Clivia-UCAC和
Nova-1-NLuc(f)、Clivia-U1和NLuc-U1A(h)、Clivia-CTE和TAP-
NLuc(j)、Clivia-UUUUC和NLuc-HnRNPC(l)或Clivia-ACUAAC和
STAR-NLuc(n)的HEK293T细胞的BRET检测。
图9.宿主细胞中靶标RNA boxB的检测。(a)HEK293T细胞中靶标RNAboxB的生物发光成像；(b)图(a)中NLuc-λN与Clivia-boxB的BRET效率统计分析，数据代表平均值和标准方差(N＝50个细胞)。
图10.ZRANB2与其靶标RNA AGGUAA相互作用的检测。(a)ZRANB2与AGGUAA的复合物晶体结构(PDB ID:3G9Y)；(b)ZRANB2 D-NLuc重组蛋白与Clivia-AGGUAA嵌合RNA表达系统示意图。(c)共表达Clivia-AGGUAA突变体和ZRANB2 D-NLuc的HEK293T细胞的BRET成像，共表达Clivia和ZRANB2 D-NLuc的HEK293T细胞作为对照，比例尺20μm；(d)图(c)中BRET效率统计分析。数据代表平均值和标准差(N＝35)。
图11.Clivia及其对应的一系列荧光团分子用于MS2 RNA与MCP蛋白质的体
外相互作用检测。
图12.活体动物中靶标RNA-蛋白质相互作用的检测。(a)共表达Clivia-MS2max和NLuc-ddMCPmax的HEK293T细胞皮下注射到小鼠背部；(b)小鼠活体成像；(c)图(b)中BRET效率统计分析。数据代表平均值和标准差(N＝5)。
发明详述
本发明提供一种RNA-蛋白质复合物，复合物包含至少两个部分：N1-N2或N2-N1嵌合RNA，其中N1是任意感兴趣的靶标RNA序列，N2为RNA适配体，RNA适配体是任意能够结合荧光团分子发出合适光谱荧光的RNA序列；第二部分是P1-P2或P2-P1重组融合蛋白，其中P1是RNA结合蛋白，P2为发光蛋白，并且，其中，P1代表的RNA结合蛋白可以特异性识别结合所述N1代表的靶标RNA序列，P2代表的发光蛋白是能够催化底物产能的任意合适发光光谱的蛋白质。
其中所述N1和N2嵌合RNA中，序列N1和N2之间可直接连接，即N1序列的3′-末端与RNA适配体的5′-末端直接连接或N1序列的5′-末端与RNA适配体的3′-末端直接连接；N1和RNA适配体序列之间也可操作性连接，即在N1序列的3′-末端与RNA适配体的5′-末端之间添加或截掉一个或多个核苷酸，或将N1序列插入到RNA适配体的非功能区序列中，或N1序列直接替换掉RNA适配体中的非功能区。
其中所述P1与P2重组融合蛋白中，P1与P2之间可直接连接，即P1的C-末端与P2的N-末端直接连接或P1的N-末端与P2的C-末端直接连接；P1与P2之间也可操作性连接，即P1与P2之间添加一个或多个氨基酸的接头肽或截掉一个或多个不影响蛋白功能的末端氨基酸，或将P2插入到P1的柔性非功能肽链中。
所述RNA适配体可选自Pepper RNA适配体、Clivia RNA适配体、Spinach RNA适配体、Spinach2 RNA适配体、iSpinachRNA适配体、Broccoli RNA适配体、Red Broccoli RNA适配体、Orange BroccoliRNA适配体、Corn RNA适配体、Mango RNA适配体、Chili RNA适配体、DNB RNA适配体、SRB-2RNA适配体、13-2min RNA适配体、A1 RNA适配体、A RNA适配体、ATRNA适配体、DIR-Apt1 RNA适配体、DIR2s-Apt RNA适配体、Mango RNA适配体、MGA RNA适配体，或其任何一种的生物活性变体或片段，或所述两种或多种RNA适配体的嵌合体。所述RNA适配体可以特异性识别结合荧光团分子，形成的复合物在合适波长激发光的照射下会发出特定波长的荧光信号。其中Pepper RNA适配体可以特异性识别结合荧光团分子HBC及其一系列衍生物，如HBC485、HBC497、HBC508、HBC514、HBC525、HBC599、HBC620，Pepper RNA适配体与HBC620结合形成的复合物Pepper620，荧光最适激发波长为577nm，最适发射波长为620nm。一些RNA适配体与相应荧光团分子的复合物荧光激发波长和发射波长见表1。
表1RNA适配体与相应荧光团分子的复合物荧光性质
对应的荧光团分子的结构如下：
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所述发光蛋白可催化一特定的底物分子产生特定波长的光。
所述发光蛋白可选自深海细角刺虾荧光素酶、海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、腔肠荧光素酶、北美萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶、铁路蠕虫荧光素酶、细菌荧光素酶、高斯荧光素酶、水母发光蛋白、Arachnocompa荧光素酶，或其任何一种的生物活性变体或片段，或其两种或更多种的嵌合体，或任何其他可以催化某种底物发光的蛋白质。
所述荧光素酶能够催化特定的荧光素底物产能。底物也可是能被催化产能的荧光素的衍生物。在一些实施方案中，生物发光蛋白P2能够修饰底物。在一些实施方案中，底物是荧光素、钙、腔肠素或腔肠素的衍生物或类似物。
RNA-蛋白质复合物中，P1及N1的结合使P2与N2在空间上靠近到合适的相对位置，从而使P2催化底物产生的特定波长光，可经生物发光共振能量转移(BRET)激活N2 RNA适配体-荧光团分子复合物产生荧光。
本发明还提供包含这种RNA-蛋白质复合物各组分的表达载体。所述表达载体含有所述N1-N2嵌合RNA编码核苷酸序列，和/或所述P1-P2重组融合蛋白编码核苷酸序列，其中N1和P1编码核苷酸序列空缺。
一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有包含所述的RNA-蛋白质复合物各组分的表达载体，或/和，所述试剂盒含有所述的RNA-蛋白质复合物中各组分表达载体的原核或真核细胞，或/和，所述试剂盒装有N1和P1编码核苷酸序列空缺的表达载体。
本发明提供了利用RNA-蛋白质复合物检测宿主细胞中目的RNA的方法，使用此方法的步骤是：构建表达N1-N2-目的RNA的嵌合RNA的原核或真核表达质粒；构建表达P1-荧光素酶重组蛋白的原核或真核表达质粒；将以上重组质粒引入到宿主细胞中表达；N1与P1结合后，使RNA适配体与荧光素酶靠近，加入荧光团分子和发光蛋白底物分子，可通过成像检测荧光团分子合适波长下的发光信号，观察目的RNA在细胞中的分布。
本发明提供一种检测宿主细胞中RNA-蛋白质相互作用的方法，使用此方法的步骤是：构建表达N1-N2嵌合RNA的原核或真核表达质粒；构建表达P1-P2重组蛋白的原核或真核表达质粒；将以上质粒共转到宿主细胞中表达；加入荧光团分子和荧光素酶底物，检测荧光团分子合适波长下的光强度和荧光素酶催化底物产生的合适波长下的光强度。N1与P1结合后，使RNA适配体与荧光素酶靠近，在添加荧光团分子和荧光素酶的特定荧光素底物后，能够检测到生物发光共振能量转移(BRET)信号。BRET的发生反映RNA-蛋白质相互作用的发生。
RNA-蛋白质复合物用于检测细胞外目的RNA或RNA-蛋白质相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：a)制备所述RNA-蛋白质复合物的嵌合RNA和重组融合蛋白组分；b)将嵌合RNA和重组融合蛋白组分混合；c)分别加入荧光团分子和发光蛋白底物分子，检测荧光团分子在合适波长下的荧光强度和荧光素酶催化底物产生的合适波长下的发光强度。
本文所用术语的定义和解释
本发明中“宿主细胞”指原核的细菌细胞或真核的哺乳动物细胞，可以是原始的未经改造的细胞，也可以是基因改造过的商业化细胞。本发明中优选的细菌细胞是大肠杆菌BL21，优选的哺乳动物细胞是人HEK293T细胞、HeLa细胞、Cos-7细胞。
“目的蛋白”也可称为“感兴趣的蛋白”，指任何用来研究的蛋白质。在本发明一优选实施方式中，目的蛋白是噬菌体衣壳蛋白MCP；在本发明另一优选实施方式中，目的蛋白是噬菌体衣壳蛋白MCP的循环更替突变体；在本发明另一优选实施方式中，目的蛋白是噬菌体衣壳蛋白MCP与其循环更替突变体的串联体；在本发明另一优选实施方式中，目的蛋白是噬菌体衣壳蛋白MCP与其循环更替突变体的串联体的突变体；在本发明另一优选实施方式中，目的蛋白是来源于噬菌体的N蛋白；在本发明另一优选实施方式中，目的蛋白是RNA结合蛋白LARP7、U1A、Nova-1、STAR、Fox-1、TAP和HnRNP C。除了本发明实施例中列出的蛋白质之外，目的蛋白也可以是猜想可能会与某RNA相互作用的蛋白质，或用于筛选能够与其产生相互作用的RNA的蛋白质。这些蛋白质可以是天然的蛋白质，也可以是经过基因重组、人工修饰或突变的蛋白质。
“目的RNA”也可称为“感兴趣的RNA”，也称“靶标RNA”，指任何用来研究的RNA，在本发明一优选实施方式中，目的RNA是噬菌体RNA MS2；在本发明另一优选实施方式中，目的RNA是噬菌体RNA boxB；在本发明另一优选实施方式中，目的RNA是与U1A蛋白相互作用的U1snRNA stem loop2(U1SL2)RNA、与HnRNP C蛋白相互作用的Poly U RNA、与LARP7蛋白相互作用的7SK SL4 RNA、与Nova-1蛋白相互作用的UCAGUCAC基序RNA、与STAR蛋白相互作用的ACUAAC RRERNA、与Fox-1蛋白相互作用的UGCAUGU RNA识别元件(RNA recognitionelement，RRE)、与TAP蛋白相互作用的CTE RNA。除了本发明实施例中列出的RNA之外，目的RNA也可以是任意与蛋白质发生相互作用的RNA，或用于筛选能够与其产生相互作用的蛋白质的RNA。这些RNA可以是天然的RNA，也可以是经过基因重组、人工修饰或突变的RNA。
“生物发光”是化学发光的一种形式。化学发光是由于化学反应而具有有限的热发射(发光)的能量发射。当化学诱导的有机染料激发态的能量衰减到基态时，发生化学发光发射。化学发光发射的持续时间和强度主要取决于反应溶液中存在的化学试剂的程度。非酶化学发光是在催化剂存在下有机染料和氧化剂之间的化学反应的结果。生物发光依赖酶(通常称为生物发光蛋白)的活性。
“生物发光蛋白”指催化底物发光的蛋白质，也称为“荧光素酶”。本领域应当理解，生物发光蛋白是将底物转化为活化产物，然后当其松弛时释放能量的酶。可以是海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、腔肠荧光素酶、北美萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶、铁路蠕虫荧光素酶、细菌荧光素酶、高斯荧光素酶、水母发光蛋白、Arachnocampa荧光素酶，或其任何一种的生物活性变体或片段，或其两种或更多种的嵌合体，或任何其他可以催化某底物发光的蛋白质。生物发光蛋白分离自许多发光生物体，包括细菌、原生动物、腔肠动物、软体动物、鱼、多足类、苍蝇、真菌、蠕虫、甲壳类和甲虫。在本发明的一优选实施方式中，发光蛋白是NLuc荧光素酶，它可以催化底物Furimazine发光，发射峰值为460nm的蓝光。在本发明的另一优选的实施方式中，发光蛋白是GLuc荧光素酶，可催化底物荧光素，发射峰值为480nm的蓝光。在本发明的另一优选的实施方式中，发光蛋白是FLuc荧光素酶，它可催化底物腔肠素，发射峰值为560nm的黄绿光。除了本发明实施例中列出的发光蛋白外，P2可以是任何合适的生物发光蛋白。P2可以包括但不限于荧光素酶、β-半乳糖苷酶、内酰胺酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和β-葡糖苷酶或其生物活性片段或变体。因此，具有荧光素酶活性的生物发光蛋白可从多种来源或通过多种方法获得。
表2提供了生物发光蛋白的非限制性实例。
表2：示例性生物发光蛋白：
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“生物发光蛋白底物分子”指能够被蛋白质催化发光的分子。如本文所用，Furimazine，可被NanoLuc荧光素酶催化发出蓝色的光。目前被发现的生物发光底物有虫荧光素、腔肠素、虾素等。
“RNA适配体”也称为“核酸适配体”、“适配体分子”，在本专利中指能够结合“荧光 团分子”的RNA序列。在本专利的一优选实施方式中，RNA适配体是Clivia，它可以特异性识别并结合荧光团分子IV-39及其一系列衍生物，如IV-17、IV-20、IV-18、IV-21、IV-19、IV-22，使它们在合适的激发光下发出特定波长的荧光信号。在本专利的另一优选实施方式中，RNA适配体是Pepper，它可以特异性识别并结合荧光团分子HBC及其一系列衍生物，如HBC485、HBC497、HBC508、HBC514、HBC525、HBC599、HBC620，使它们在合适的激发光下能够发出特定波长的荧光信号。在本专利的另一优选实施方式中，RNA适配体是Broccoli，它可以特异性识别并结合荧光团分子DFHBI-1T，使它在合适的激发光下能够发出特定波长的荧光信号。除了本发明实施例中列出的RNA适配体外，RNA适配体可以是Spinach、Spinach2、iSpinach、RedBroccoli、OrangeBroccoli、Corn、DIR-Apt1、DIR2s-apt、SRB-2、DNB、Chili、Mango-I、Mango-II、Mango-III、Mango-IV、MGA，它们可以结合DFHBI、DFHBI-1T、DFHBI-2T、BI、OBI或DFHO，使它们在合适的激发光下能够发出特定波长的荧光信号，或是能够特异性性结合相应荧光团或相应荧光团衍生物的上述RNA适配体的截短体或突变体。“荧光RNA”指RNA适配体结合相应荧光团分子形成的RNA-荧光团复合物。
本发明所述的“荧光团分子”也称为“荧光团”、“染料”、“染料分子”，是指一类可以在合适波长光激发下发出特定波长荧光的化学分子。“荧光团分子”既可以是常亮型荧光分子或染料，如罗丹明、荧光素、Cy3、Cye5等，也可以是可被条件性激活的荧光团分子，所述条件性激活的荧光团分子在没有核酸适配体的情况下显示出较低的量子产率，当其被核酸适配体结合后可显著增加其在特定波长激发下的荧光强度。在具体的实施方式中，当没有与特定适配体结合时，荧光团的量子产率低于0.1，更优的低于0.01，最优的低于0.001；当荧光团被特定适配体结合后，荧光团的量子产率提高2倍以上，更优的提高10倍以上，最优的提高100倍以上。荧光团分子优选水溶性的，对细胞无毒且易穿透膜的。本发明的荧光团优选能够通过主动运输或者被动扩散通过细胞膜或细胞壁进入细胞浆或细胞周质。在本发明的实施方式中，荧光团可以透过革兰氏阴性菌的外膜和内膜，植物细胞的细胞壁和细胞膜，真菌和细胞壁和细胞膜，动物细胞的细胞膜，以及活体动物的GI和内皮细胞膜。本发明中一系列优选的荧光团实例详见表1中Clivia所对应的荧光团。
“融合蛋白”也可称“重组蛋白”或“重组融合蛋白”，指两种或两种以上蛋白质通过基因重组得到的重组蛋白质。融合蛋白可以是不同蛋白质的直接连接，也可以是操作性连接。本发明中的融合蛋白包含一个荧光素酶和一个RNA结合蛋白。在本发明中，荧光素酶可以插在RNA结合蛋白的N端或C端，也可以插在RNA结合蛋白的序列内部。在本发明一优选实施方式中，融合蛋白为NLuc-MCP；在本发明另一优选实施方式中，融合蛋白是NLuc-cpMCP；在本发明另一优选实施方式中，融合蛋白是NLuc-dMCP；在本发明另一优选实施方式中，融合蛋白是NLuc-dMCP-Y85G、NLuc-dMCP-K43G、NLuc-dMCP-E63G、NLuc-dMCP-N55G/K57G、NLuc-dMCP-E89G/T91G、NLuc-dMCP-Y85G/K43G、NLuc-dMCP-Y85G/E63G、NLuc-dMCP-Y85G/N55G/K57、NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G、NLuc-dMCP-N55G/K57/E63G、NLuc-dMCP-E89G/T91G/E63G、NLuc-dMCP-N55G/K57/K43G、NLuc-dMCP-E89G/T91G/K43G、NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G/E63G；在本发明另一优选实施方式中，融合蛋白是NLuc-ddMCPmax；在本发明另一优选实施方式中，融合蛋白是NLuc-λN。在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为NLuc-U1A；在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为NLuc-HnRNPC；在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为LARP7-NLuc；在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为Nova-1-NLuc；在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为STAR-NLuc；在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为Fox-1-NLuc；在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为TAP-NLuc；在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为ZRANB2 D-NLuc；在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为GLuc-ddMCPmax；在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白为FLuc-ddMCPmax。本发明中的融合蛋白除了包含一个荧光素酶和一个RNA结合蛋白之外，可能在这两个蛋白之间添加1个或多个氨基酸作为连接肽。其中优选的实施例包括：NLuc-1-ddMCPmax、NLuc-2-ddMCPmax、NLuc-3-ddMCPmax、NLuc-4-ddMCPmax、NLuc-5-ddMCPmax。
“嵌合RNA”指两种或两种以上RNA通过遗传操作得到的重组RNA，在本专利中指目的RNA与荧光RNA适配体通过遗传操作得到的重组RNA。嵌合RNA可以是不同RNA的直接或可操作性连接，目的RNA可以在荧光RNA适配体RNA的5′端或3′端，也可以是其中一个RNA插入到另一个RNA的序列之中。本发明的嵌合RNA包含一个荧光RNA适配体和一个目的RNA。在本发明一优选的实施方案中，MS2 RNA插入到RNA适配体Clivia的非功能区环中。在本发明另一优选的实施方案中，7SK SL4 RNA插入到RNA适配体Clivia的3′端。除了将目的RNA直接插入荧光RNA适配体之外，还可以对插入后形成的重组RNA进行截短，得到含有部分目的RNA序列和部分荧光RNA适配体序列的嵌合RNA。在本发明一优选实施方式中，嵌合RNA为Clivia-MS2max；在本发明的另一优选实施方式中，嵌合RNA为Clivia-MS2-7、Clivia-MS2-6、Clivia-MS2-5、Clivia-MS2-4；在本发明的另一优选实施方式中，嵌合RNA为Clivia-boxB；在本发明的另一优选实施方式中，嵌合RNA为Clivia-U1SL2、Clivia-UUUUC、Clivia-7SK-SL4、Clivia-UCAGUCAC、Clivia-ACUAAC、Clivia-UGCAUGU、Clivia-CTE；在本发明的另一优选实施方式中，嵌合RNA为Clivia-AGGUAA、Clivia-CGGUAA、Clivia-ACGUAA、Clivia-AGCUAA、Clivia-AGGGAA、Clivia-AGGUUA、Clivia-AGGUAC。在本发明的另一优选实施方式中，嵌合RNA为Pepper-MS2、Broccoli-MS2、Red Broccoli-MS2、Orange Broccoli-MS2、Spinach-MS2、Spinach2-MS2、iSpinach-MS2、Corn-MS2、MGA-MS2。除了本发明优选实施方式中使用的RNA适配体，其中所述RNA适配体还可选自DIR-Apt1、DIR2s-apt、SRB-2、DNB、Chili、Mango-I、Mango-II、Mango-III、Mango-IV。
生物发光共振能量转移(BRET)，如本文所用，“BRET”或“生物发光共振能量转移”是基于生物发光蛋白供体和受体分子之间的非放射性能量转移的测定。“生物发光共振能量转移”和“BRET”可互换使用。在生物发光蛋白和受体分子之间发生的能量转移表示为使用选择特定波长的滤光片(一个用于受体分子发射，另一个用于生物发光蛋白发射)测量的发射的计算比(参见等式1)。
Ea/Ed＝BRET比(1)
其中Ea定义为受体分子发射强度(使用适合于受体发射的特定滤光器选择发射光)，Ed定义为生物发光蛋白发射强度(使用适合于生物发光蛋白发射的特定滤光器选择发射光)。通常，受体发射强度与供体发射强度的比反映能量转移效率，它随着能量转移效率的增加而增加。
“表达载体”、“载体”、“重组质粒”、“基因表达载体”或“质粒”在本文中含义相同，可互换使用，指能够在宿主细胞中表达目的蛋白、荧光素酶或他们的重组蛋白、目的RNA、RNA适配体、或他们的嵌合RNA的质粒载体。
“转化”指利用化学方法或者物理方法使外源质粒DNA分子进入原核细菌细胞中。具体的方法可参见Sambrooka等人的《分子克隆实验手册》(第二版，1989年，冷泉港出版社)和其它有关教材。
“转染”是指将质粒导入到宿主细胞的过程。本发明中许多实施例中的“转染”是利用购买自翊圣生物的脂质体转染试剂Hieff TransTM操作的。
“BRET”即生物发光能量共振转移，是荧光素酶催化底物发出的能量激发受体荧光团荧光的现象。本发明以NanoLuc荧光素酶催化底物Furimazine发出的能量，激活荧光RNAClivia-IV-4的荧光。
本发明还提供装有所述RNA-蛋白质复合物各组分的试剂盒。此试剂盒装有RNA-蛋白质复合物各组分表达载体或/和含有所述RNA-蛋白质复合物各组分表达载体的原核或真核细胞，或/和装有N1和R1编码核苷酸序列空缺的表达载体，及相应的说明书。
具体实施方式
以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著,黄培堂等译：《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
实施例中所用的pET-28a(+)、pCDFDuet-1、pEGFP-N1、pcDNA3.1(+)、pLKO.1质粒载体购自购自Invitrogen公司。所有用于PCR的引物由上海杰瑞生物工程技术有限公司以及南京金斯瑞生物科技有限公司合成。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfuDNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTP。XbaI、BamHI、BglII、HindIII、NdeI、XhoI、SacI、EcoRI、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4 PNK)购自Fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。实施例中所用的infusion一步克隆试剂盒购自翊圣生物有限公司。除非特别声明，无机盐类化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。卡那霉素(Kanamycin)购自Ameresco公司；氨苄青霉素(Amp)购自Ameresco公司；链霉素购自Ameresco公司；各种细胞培养皿、细胞培养板购自Corning公司；384孔发光检测白板、384孔荧光检测黑板购自WHB公司。
实施例中所用的无内毒素真核质粒小抽试剂盒购自OMEGA公司，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。克隆菌株DH5α购自全式金公司，克隆菌株Mach1和Top10购自Invitrogen公司。BL21(DE3)、JM109(DE3)表达菌株购自Invitrogen公司，BL21Star(DE3)菌株购自上海唯地生物公司。哺乳动物细胞株HEK293T(人胚肾细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、COS-7(非洲绿猴SV40转化的肾细胞)来源于中科院细胞库。
实施例中用到的主要仪器：Biotek Synergy 2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，PCR扩增仪(德国Biometra公司)，活体成像系统(美国Kodak公司)，光度计(日本和光公司)，核酸电泳仪(申能博彩公司)，倒置荧光显微镜(日本Nikon)，Leica SP8激光共聚焦显微镜(德国)
缩写词意义如下：“h”指小时，“min”指分钟，“s”指秒，“d”指天，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“bp”指碱基对，“mM”指毫摩尔，“μM”指微摩尔。
20种氨基酸及简称
| 中文名称 | 三字母缩写 | 单字母符号 | 中文名称 | 三字母缩写 | 单字母符号 |
| 甘氨酸 | Gly | G | 苏氨酸 | Thr | T |
| 丙氨酸 | Ala | A | 半胱氨酸 | Cys | C |
| 缬氨酸 | Val | V | 蛋氨酸 | Met | M |
| 亮氨酸 | Leu | L | 天冬酰胺 | Asn | N |
| 异亮氨酸 | Ile | I | 谷氨酰胺 | Gln | Q |
| 脯氨酸 | Pro | P | 天冬氨酸 | Asp | D |
| 苯丙氨酸 | Phe | F | 谷氨酸 | Glu | E |
| 酪氨酸 | Tyr | Y | 赖氨酸 | Lys | K |
| 色氨酸 | Trp | W | 精氨酸 | Arg | R |
| 丝氨酸 | Ser | S | 组氨酸 | His | H |
(一)聚合酶链式反应(PCR)：
1.短片段扩增PCR：
2.长片段(>2500bp)扩增PCR：
本文载体扩增PCR使用的DNA聚合酶是Max DNA聚合酶。其中质粒模板通常需要稀释，以降低原始质粒载体在PCR产物中的占比，从而提高质粒鉴定时的阳性率。加样体系和反应程序设置参照上表。
(二)核酸内切酶的酶切反应：
1.对质粒载体进行双酶切的体系(n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量)：
2.对PCR产物片段进行双酶切的体系(n含义同上)：
3.将双酶切后PCR产物片段连接入双酶切后的质粒载体成环的体系：
注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1—6:1之间。
(三)DNA片段5′端磷酸化反应然后自身环化反应：
从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故需对PCR产物的5′端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。自身环化连接反应指线性化载体的3′端和5′端连接反应。
T4 PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5′端磷酸基团的加成反应。使5′端磷酸化的DNA片段产物自身环化的反应体系：
(四)同源重组
用同源重组法进行质粒构建时，在PCR扩增制备目的DNA片段时，在正向引物和反向引物的5′端分别引入15～25bp与线性化载体末端同源的序列，目的DNA片段与线性化载体的两端都有重复序列，在同源重组酶的作用下，可以完成DNA片段与线性化载体的连接。本文中使用的同源重组酶购买自南京诺唯赞生物科技有限公司或上海翊圣生物科技有限公司，按照使用说明加样混合均匀后置于PCR仪中，设置温度为50℃，反应20min。连接产物置于冰上，可直接转化。若暂时储存在-20℃，转化效率会有所降低。
(五)质粒转化
质粒转化：
a)取100μL感受态细胞于冰浴上融化。
b)加入适当体积的连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。通常加入的连接产物的体积少于感受态细胞体积的1/10。
c)将菌液放入42℃水浴中热激90秒，迅速转移至冰浴中放置3min。
d)加入500μL LB，于37℃恒温摇床上200转培养1h。
e)将菌液4000rpm/min离心3min，留100μL上清将菌体吹匀，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。
实施例中用到的常规细胞实验方法
(一)哺乳动物细胞培养
本文中所用的细胞都是贴壁细胞。细胞培养相关实验都在无菌超净台中进行。细胞培养所用耗材都经过高温高压(121，20min)灭菌处理(购买的无菌耗材除外)。所用细胞均在恒温CO2培养箱(37℃，5％ CO2)中培养。常用高糖培养基(DMEM)、RPMI 1640培养基，所用培养基都含有10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)。
(二)细胞转染
细胞转染首先需要准备一定密度的细胞，通常在转染的前一天晚上进行细胞铺板。为了使细胞更好地贴壁，保证细胞更好的伸展开，便于对细胞内亚细胞结构的成像，通常在铺板之前用多聚赖氨酸包被细胞培养板。
1.多聚-L-赖氨酸包被
多聚-L-赖氨酸(Poly-L-Lysine)常见分子量为70000～150000，150000～300000和>300000。分子量越大，则黏附力越强，但溶解比较困难。配制时，通常用PBS配制1mg/mL储液，保存在-20℃冰箱；使用时，再用PBS稀释10倍(0.1mg/mL)，直接加入玻璃底培养皿中，在37℃恒温培养箱孵育1h即可。在水溶液中，多聚赖氨酸容易分解，工作液最好是现配现用，或保存于4℃，尽快用完。
2.细胞铺板：
a)移除培养液，用适量PBS洗去残余培养液；
b)胰蛋白酶消化使细胞脱离培养皿底部，用适量新鲜培养基重悬细胞；
c)重悬细胞后进行细胞计数，将50μL细胞悬液与50μL溴酚蓝混匀，滴加到细胞计数板孔中，用细胞计数仪计数；
d)所需稀释的倍数等于细胞计数结果显示的活细胞密度除以铺板所需要的细胞密度(即每孔所需细胞数除以每孔细胞悬液体积)；例如，需要在24孔板铺板密度10万个细胞/孔，体积0.5mL细胞悬液/孔，则所需细胞悬液密度为20万/mL，若细胞计数结果为A万/mL，则所需稀释倍数为
A/20；
e)分装新鲜培养基至新的培养皿，按照稀释倍数，转移适量细胞悬液至新鲜培养基，混匀；
f)将以上稀释好的细胞悬液分装至孔板中。
3.细胞瞬时转染：
本文实验所用的转染试剂有购买自翊圣生物的和Invitrogen的Lipofectamine3000。通常情况下，293T/17细胞选用HieffTransTM，COS-7细胞选用Lipofectamine 3000转染。
(1)使用HieffTransTM转染的实验步骤(以24孔板转染为例)
a)将OM分装到96孔板中，每个孔中50μL；
b)将400ng质粒加入一个孔分装好的OM中，混匀；
c)将1μLHieffTransTM转染试剂(以下简称“HT”)加入另一个孔分装好的OM中，混匀；
d)以上两种混合液分别孵育5min后，再将两种混合液混合在一起混匀，静置20min；
e)将混合液加入铺好细胞的24孔板的一个孔中，轻轻摇晃孔板使转染试剂均匀分布在孔中。
(2)使用Lipofectamine 3000转染的实验步骤
a)将OM分装到96孔板中，每个孔中25μL；
b)将400ng质粒和1μL P3000加入一个孔分装好的OM中，混匀；
c)将1μL Lipo3000加入另一个孔分装好的OM中，混匀；
d)以上两种混合液分别孵育5min后，再将两种混合液混合在一起混匀，静置20min；
e)将混合液加入铺好细胞的24孔板的一个孔中，轻轻摇晃孔板使转染试剂均匀分布在孔中。
(三)细胞成像
细胞成像用于直观地获取分子在细胞内的信息。本研究所用到的细胞成像技术包括荧光显微成像技术和发光显微成像技术。荧光成像是通过对目的分子或细胞进行荧光标记后，通过收集荧光信号观察目的分子或细胞的技术。发光成像是用荧光素酶标记靶标分子，通过收集发光信号，观察靶标分子在细胞内的行为的技术。
活细胞发光成像使用配置CSU-W1和Prime 95B sCMOS相机的尼康eclipse Ti2显微镜，利用滤光片460±25nm检测NLuc发射信号，620±30nm滤光片检测Clivia发射信号。BRET效率利用620±30nm发射信号与460±25nm发射信号的比值定义。
(四)活体成像
活体发光成像使用PerkinElmer的Spectrum CT活体成像仪，利用500/20nm带通滤光片检测NLuc发射信号，600/20nm带通滤光片检测Clivia发射信号。BRET效率利用600/20nm发射信号与500/20nm发射信号的比值定义。
实施例1.分别构建含NLuc的不同融合蛋白的表达质粒。
为了构建NLuc-MCP融合蛋白表达质粒，用引物P1、P2对pcDNA3.1-CMV-NLuc进行扩增获得线性化载体，利用引物P3、P4对MCP蛋白质粒进行扩增获得MCP蛋白编码基因片段，线性化载体与片段通过一步法克隆试剂盒连接，所得质粒命名为pCMV-NLuc-MCP，其编码融合蛋白NLuc-MCP，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：25。
扩增线性化载体的引物为：
上游引物(P1)：5′-TCTAGAAAGCTTTAAGGGCCC-3′
下游引物(P2)：5′-GATCCCGCCAGAATGCGTTCGCAC-3′
扩增MCP蛋白编码基因片段的引物为：
上游引物(P3)：
5′-CATTCTGGCGGGATCCGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3′
下游引物(P4)：
5′-CTTAAAGCTTTCTAGAGTAGATGCCGGAGTTTG-3′
为了构建MCP衣壳蛋白的环状更替突变体(cpMCP)与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用含有多克隆位点的引物P5、P6以pcDNA3.1-CMV-NLuc质粒为模板进行PCR扩增，通过单片段自身infusion得到含有多克隆位点的质粒，命名为pcDNA3.1-NLuc-E。多克隆位点包含的酶切位点顺序为BamHI、XhoI、XbaI和HindIII。利用XbaI和HindIII酶切pcDNA3.1-NLuc-E得到线性化载体，利用引物P7和P8将MCP蛋白环状更迭N端编码基因MCPsplitN进行扩增，通过infusion连接得到质粒pcDNA3.1-NLuc-MCPsplitN。利用引物P9和P10将MCP蛋白环状更迭的C端编码基因MCPsplitC进行扩增，将质粒pcDNA3.1-NLuc-MCPsplitN利用BamHI和XhoI酶切得到线性化载体，通过infusion连接得到质粒，命名为pCMV-NLuc-cpMCP，其编码融合蛋白NLuc-cpMCP，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：26。
上游引物(P5)：
5′-GGATCCCTCGAGTCTAGAAAGCTTGGGCCCGTTTAAACCCGCTG-3′
下游引物(P6)：
5′-AGACTCGAGGGATCCCGCCAGAATGCGTTCGCACAG-3′
上游引物(P7):
5′-CTACTCTAGAGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3′
下游引物(P8):
5′-CTTAAAGCTTACCTTTAGGCACCTCGACTTTG-3′
上游引物(P9)：
5′-AACGCATTCTGGCGGGATCCGGCGCCTGGCGTTCGTAC-3′
下游引物(P10)：
5′-AGACTCGAGGTAGATGCCGGAGTTTGCTG-3′
为了构建MCP衣壳蛋白与其环状更替突变体组成的串联二聚体(cptdMCP)与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P11和P12在MCP编码基因片段两端引入酶切位点XbaI和XhoI，将其与质粒pCMV-NLuc-cpMCP利用XbaI和XhoI酶切，通过T4连接法连接得到表达质粒，命名为pCMV-NLuc-dMCP，其编码融合蛋白NLuc-cptdMCP，其氨基酸序列为序列SEQ IDNO：27。
上游引物(P11)：
5′-GGATCCGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3′
下游引物(P12)：
5′-TCTAGAGTAGATGCCGGAGTTTGCTG-3′
为了构建含点突变的cptdMCP与NLuc的融合蛋白表达质粒，分别设计点突变引物对：P13/P14、P15/P16、P17/P18、P19/P20、P21/P22，分别以pCMV-NLuc-MCP为模板PCR后进行自身infusion连接获得含有点突变的MCP编码基因的质粒载体，分别命名为pCMV-NLuc-MCP-E63G、pCMV-NLuc-MCP-85G、pCMV-NLuc-MCP-K43G、pCMV-NLuc-MCP-E89G/T91G、pCMV-NLuc-MCP-N55G/K57G。
E63G突变体的引物为：
上游引物(P13)：
5′-TCGGAGTGCCTAAAGTGGC-3′
下游引物(P14)：
5′-CTTTAGGCACTCCGACTTTG-3′
Y85G突变体的引物为：
上游引物(P15)：
5′-GTTCGGGTTTAAATATGGAAC-3′
下游引物(P16)：
5′-TATTTAAACCCGAACGCCATG-3′
K43G突变体的引物为：
上游引物(P17)：
5′-CTTACGGAGTAACCTGTAGC-3′
下游引物(P18)：
5′-AGGTTACTCCGTAAGCCTGTG-3′
E89G&T91G突变体的引物为：
上游引物(P19)：
5′-ATGGGACTAGGAATTCCAATTTTCGCCACGAATTC-3′
下游引物(P20)：
5′-AATTCCTAGTCCCATATTTAAGTACGAACGCC-3′
N55G&K57G突变体的引物为：
上游引物(P21)：
5′-CAGGGACGCGGATACACCATCAAAGTCGAGGTG-3′
下游引物(P22)：
5′-GTATCCGCGTCCCTGCGCAGAGCTCTGACGAAC-3′
为了获得dMCP-Y85G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P23和P24以pCMV-NLuc-MCP-Y85G为模板PCR获得两端分别含有酶切位点BamHI和XhoI的含Y85G突变的MCPsplitC编码基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP质粒用BamHI、XhoI酶切，再通过T4连接获得质粒，命名为pCMV-NLuc-dMCP-Y85G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-Y85G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：28。
为了获得dMCP-K43G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P25和P26以pCMV-NLuc-MCP-K43G为模板PCR获得两端含有酶切位点XbaI和HindIII的含K43G突变的MCPsplitN编码基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP用XbaI和HindIII酶切，通过T4连接获得质粒，命名为pCMV-NLuc-dMCP-K43G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-K43G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：28。
为了获得dMCP-E63G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P27和P28以pCMV-NLuc-MCP-E63G为模板PCR获得两端含有酶切位点XbaI和HindIII的含E63G突变的MCPsplitN编码基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP用XbaI和HindIII酶切，通过T4连接获得质粒，命名为pCMV-NLuc-dMCP-E63G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-E63G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：29。
为了获得dMCP-N55G/K57G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P29和P30以pCMV-NLuc-MCP-N55G/K57G为模板PCR获得两端含有酶切位点XhoI和XbaI的MCP-N55G/K57G突变体基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP用XhoI和XbaI酶切，通过T4连接获得质粒，命名为pCMV-NLuc-dMCP-N55G/K57G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-N55G/K57G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：30。
为了获得dMCP-E89G/T91G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P29和P30以pCMV-NLuc-MCP-E89G/T91G为模板PCR获得两端含有酶切位点XhoI和XbaI的MCP-E89G/T91G突变体基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP用XhoI和XbaI酶切，再通过T4连接获得质粒，命名为pCMV-NLuc-dMCP-E89G/T91G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-E89G/T91G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：32。
为了获得dMCP-Y85G/N55G/K57G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P29和P30以pCMV-NLuc-MCP-N55G/K57G为模板PCR获得两端含有酶切位点XhoI和XbaI的MCP-N55G/K57G突变体基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-Y85G用XhoI和XbaI酶切，再通过T4连接获得质粒。获得的质粒命名为pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/N55G/K57G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-Y85G/N55G/K57G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：33。
为了获得dMCP-Y85G/E89G/T91G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P29和P30以pCMV-NLuc-MCP-E89G/T91G为模板PCR获得两端含有酶切位点XhoI和XbaI的MCP-E89G/T91G突变体基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-Y85G用XhoI和XbaI酶切，再通过T4连接获得质粒，命名为pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-Y85E89T91，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：34。
为了获得dMCP-Y85G/K43G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P25和P26以pCMV-NLuc-MCP-K43G为模板PCR获得两端含有酶切位点XbaI和HindIII的含K43G突变的MCPsplitN编码基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-Y85G用XbaI和HindIII酶切，再通过T4连接获得质粒。获得的质粒命名为pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/K43G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-Y85G/K43G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：35。
为了获得dMCP-Y85G/E63G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P27和P28以pCMV-NLuc-MCP-E63G为模板PCR获得两端含有酶切位点XbaI和HindIII的含E63G突变的MCPsplitN编码基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-Y85G用XbaI和HindIII酶切，再通过T4连接获得质粒。获得的质粒命名为pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/E63G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-Y85G/E63G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：36。
为了获得dMCP-N55G/K57G/K43G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P29和P30以pCMV-NLuc-MCP-N55G/K57G为模板PCR获得两端含有酶切位点XhoI和XbaI的MCP-N55G/K57G突变体基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-K43G用XhoI和XbaI酶切，再通过T4连接获得质粒。获得的质粒命名为pCMV-NLuc-dMCP-N55G/K57G/K43G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-N55G/K57G/K43G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：37。
为了获得dMCP-E89G/T91G/K43G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P29和P30以pCMV-NLuc-MCP-E89G/T91G为模板PCR获得两端含有酶切位点XhoI和XbaI的MCP-E89G/T91G突变体基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-K43G用XhoI和XbaI酶切，再通过T4连接获得质粒。获得的质粒命名为pCMV-NLuc-dMCP-E89G/T91G/K43G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-E89GT91GK43G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：38。
为了获得dMCP-N55G/K57G/E63G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P29和P30以pCMV-NLuc-MCP-N55G/K57G为模板PCR获得两端含有酶切位点XhoI和XbaI的MCP-N55G/K57G突变体基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-E63G用XhoI和XbaI酶切，再通过T4连接获得质粒。获得的质粒命名为pCMV-NLuc-dMCP-N55G/K57G/E63G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-N55G/K57G/E63G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：39。
为了获得dMCP-E89G/T91G/E63G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P29和P30以pCMV-NLuc-MCP-E89G/T91G为模板PCR获得两端含有酶切位点XhoI和XbaI的MCP-E89G/T91G突变体基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-E63G用XhoI和XbaI酶切，再通过T4连接获得质粒。获得的质粒命名为pCMV-NLuc-dMCP-E89G/T91G/E63G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-E89G/T91G/E63G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：40。
为了获得dMCP-Y85G/N55G/K57G/E63G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P27和P28以pCMV-NLuc-MCP-E63G为模板PCR获得两端含有酶切位点XbaI和HindIII的含E63G突变的MCPsplitN编码基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/N55G/K57G用XbaI和HindIII酶切，再通过T4连接获得质粒。获得的质粒命名为pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/N55G/K57G/E63G，本专利中简写为pCMV-NLuc-ddMCPmax，其编码融合蛋白NLuc-ddMCPmax，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：41。
为了获得dMCP-Y85G/E89G/T91G/E63G突变体与NLuc的融合蛋白表达质粒，利用引物P25和P26以pCMV-NLuc-MCP-K43G为模板PCR获得两端含有酶切位点XbaI和HindIII的含K43G突变的MCPsplitN编码基因片段，将以上片段和pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G用XbaI和HindIII酶切，再通过T4连接获得质粒。获得的质粒命名为pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G/E63G，其编码融合蛋白NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G/E63G，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：42。
两端含有酶切位点BamHI和XhoI的含Y85G突变的MCPsplitC编码基因片段的引物为：
上游引物(P23)：
5′-GGCGGGATCCGGCGCCTGGCGTTCGGG-3′
下游引物(P24)：
5′-CCAAGCTTTCTAGACTCGAGGTAGATGCCGGAGTTTGCTG-3′
两端含有酶切位点XbaI和HindIII的含K43G突变的MCPsplitN编码基因片段的引物为：
上游引物(P25)：
5′-CTACTCTAGAGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3′
下游引物(P26)：
5′-CTTAAAGCTTACCTTTAGGCACCTCGACTTTG-3′
两端含有酶切位点XbaI和HindIII的含E63G突变的MCPsplitN编码基因片段的引物为：
上游引物(P27)：
5′-CTACTCTAGAGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3′
下游引物(P28)：
5′-CTTAAAGCTTACCTTTAGGCACTCCGACTTTG-3′
两端含有酶切位点XhoI和XbaI的MCP-N55G/K57G、MCP-E89G/T91G突变体基因片段的引物为：
上游引物(P29)：
5′-CTACCTCGAGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3′
下游引物(P30)：
5′-CTTTCTAGAGTAGATGCCGGAGTTTGCTG-3′
为了构建含不同长度连接肽的NLuc-ddMCPmax表达质粒，我们首先构建了1-5个氨基酸连接肽的质粒载体。以pcDNA3.1-NLuc-E为模板，通过引物P31和引物P32进行PCR后自身infusion，在NLuc与多克隆位点之间增加1个氨基酸；通过引物P31和引物P33进行PCR后自身infusion，在NLuc与多克隆位点之间增加2个氨基酸；通过引物P31和引物P34进行PCR后自身infusion，在NLuc与多克隆位点之间增加3个氨基酸；通过引物P31和引物P35进行PCR后自身infusion，在NLuc与多克隆位点之间增加4个氨基酸；通过引物P31和引物P36进行PCR后自身infusion，在NLuc与多克隆位点之间增加5个氨基酸。分别命名为pcDNA3.1-NLuc-1-E，pcDNA3.1-NLuc-2-E，pcDNA3.1-NLuc-3-E，pcDNA3.1-NLuc-4-E，pcDNA3.1-NLuc-5-E。以pcDNA3.1-NLuc-1-E，pcDNA3.1-NLuc-2-E，pcDNA3.1-NLuc-3-E，pcDNA3.1-NLuc-4-E，pcDNA3.1-NLuc-5-E为载体模板，以pCMV-NLuc-ddMCPmax为片段模板，将载体模板和片段模板分别用BamHI酶和HindIII酶进行酶切，获得的载体和片段进行T4连接，最终获得含有1-5个氨基酸连接肽的质粒：pCMV-NLuc-1-ddMCPmax、pCMV-NLuc-2-ddMCPmax、pCMV-NLuc-3-ddMCPmax、pCMV-NLuc-4-ddMCPmax、pCMV-NLuc-5-ddMCPmax，它们分别编码融合蛋白NLuc-1-ddMCPmax、NLuc-2-ddMCPmax、NLuc-3-ddMCPmax、NLuc-4-ddMCPmax、NLuc-5-ddMCPmax，它们的氨基酸序列分别为序列SEQ ID NO：43、44、45、46、47。
下游引物(P31)：
5′-CGCCAGAATGCGTTCGCACAG-3′
上游引物(P32)：
5′-CGAACGCATTCTGGCGGGAGGATCCCTCGAGTC-3′
上游引物(P33)：
5′-CGAACGCATTCTGGCGGGAGGTGGATCCCTCG-3′
上游引物(P34)：
5′-CGAACGCATTCTGGCGGGAGGTGGAGGATCCC-3′
上游引物(P35)：
5′-CGAACGCATTCTGGCGGGAGGTGGAAGCGGATC-3′
上游引物(P36)：
5′-CGAACGCATTCTGGCGGGAGGTGGAGGCAGCG-3′
为了构建其他不同RNA结合蛋白与NLuc的重组融合蛋白表达质粒，使目的蛋白连接在NLuc的C端，通过引物P37和P38以pcDNA3.1-CMV-NLuc质粒为模板进行载体片段扩增；目的蛋白编码基因以人类ORF文库(Thermo)中的质粒为模板扩增获得。利用引物P39和P40对U1A结构域编码基因片段(PDB ID:1AUD)扩增；以引物P41和P42将HnRNP C结构域编码基因片段(PDB ID:2MZ1)扩增；将扩增的载体和片段infusion连接，获得的融合蛋白表达质粒分别命名为pCMV-NLuc-U1A、pCMV-NLuc-HnRNPC，它们分别编码融合蛋白NLuc-U1A、NLuc-HnRNPC，它们的氨基酸序列分别为序列SEQ ID NO：48、49。
目的蛋白连接在NLuc的C端的载体片段扩增引物：
上游引物(P37)：5′-TAACTCGAGTCTAGAGGGCCC-3′
下游引物(P38)：5′-CGCCAGAATGCGTTCGCACAG-3′
上游引物(P39)：
5′-TGTGCGAACGCATTCTGGCGATGGCAGTTCCCGAGACCCG-3′
下游引物(P40)：
5′-GGCCCTCTAGACTCGAGTTACACGAAGGTGCCTTTCATC-3′
上游引物(P41)：
5′-TGTGCGAACGCATTCTGGCGATGGCCAGCAACGTTACCAAC-3′
下游引物(P42)：
5′-GGCCCTCTAGACTCGAGTTACCCGTACATCTCCGCTGCAG-3′
为了构建其他不同RNA结合蛋白与NLuc的重组融合蛋白表达质粒，使目的蛋白连接在NLuc的N端，通过引物P43和P44以pcDNA3.1-CMV-NLuc质粒为模板进行载体片段扩增；目的蛋白编码基因以人类ORF文库(Thermo)中的质粒为模板扩增获得。利用引物P45和P46对LARP7结构域编码基因片段(PDB ID:6D12)扩增；以引物P47和P48将Nova-1基因片段(PDBID:2ANR)扩增；以引物P49和P50将STAR基因片段(PDB ID：4JVH)扩增；以引物P51和P52将Fox-1基因片段(PDB ID:2ERR)扩增；以引物P53和P54将TAP基因片段(PDB ID:3RW6)扩增；将扩增的载体和片段infusion连接，获得的融合蛋白表达质粒分别命名为pCMV-LARP7-NLuc、pCMV-Nova-1-NLuc、pCMV-STAR-NLuc、pCMV-Fox-1-NLuc和pCMV-TAP-NLuc，它们分别编码融合蛋白LARP7-NLuc、Nova-1-NLuc、STAR-NLuc、Fox-1-NLuc和TAP-NLuc，它们的氨基酸序列分别为序列SEQ ID NO：50、51、52、53、54(图8)。
目的蛋白连接在NLuc的N端的载体片段扩增引物：
上游引物(P43)：
5′-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3′
下游引物(P44)：
5′-CATGGTGGCTAGCCAGCTTG-3′
上游引物(P45)：
5′-CAAGCTGGCTAGCCACCATGAATGCAACAGGACCACAGTTC-3′
下游引物(P46)：
5′-GAGTGTGAAGACCATCTTTTCAGTGCCTCTTTTCTTTTC-3′
上游引物(P47)：
5′-CAAGCTGGCTAGCCACCATGATGGCGGCAGCTCCCATC-3′
下游引物(P48)：
5′-TCTTCGAGTGTGAAGACCATTTGTGGATCCTCTTGTATCTTC-3′
上游引物(P49)：
5′-CAAGCTGGCTAGCCACCATGGTCGGGGAAATGGAAACG-3′
下游引物(P50)：
5′-GAGTGTGAAGACCATAAGGGCTGGTGATTTAATGTTG-3′
上游引物(P51)：
5′-CAAGCTGGCTAGCCACCATGGCTCAGCCTTACGCTTCG-3′
下游引物(P52)：
5′-GAGTGTGAAGACCATGCCATTTGTATAAGGGTTGAC-3′
上游引物(P53)：
5′-CAAGCTGGCTAGCCACCATGGCGGACGAGGGGAAGTC-3′
下游引物(P54)：
5′-GAGTGTGAAGACCATAAAGGCAATTGGTGGGGGTAG-3′
为了构建λN与NLuc重组融合蛋白表达质粒。以含有pcDNA3.1-CMV-NLuc的质粒为载体模板，通过上述引物P37和P38将含有NLuc的载体片段扩增；以λN编码基因序列为模板(通过引物合成的方法获得密码子优化的序列)，利用引物P55和P56将λN蛋白编码基因片段扩增。将扩增的载体和片段通过一步法克隆试剂盒连接，获得融合蛋白质粒，得到的质粒命名为pCMV-NLuc-λN。它编码融合蛋白NLuc-λN，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：55。
λN编码基因序列模板：
5′-TGCACAAACTAGACGTAGAGAGAGAAGAGCAGAGAAGCAGGCTCAAT GGAAGGCAGCTAACCCTCTGCTGGTGGGCGTGAGCGCAAAGCCAGTGA ACCGAC-3′
上游引物(P55)：
5′-TGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAGATGCACAAACTAGACG-3′
下游引物(P56)：
5′-GGCCCTCTAGACTCGAGTTATGGTCGGTTCACTGGCTTTG-3′
为了构建ZRANB2与NLuc重组融合蛋白表达质粒。将ZRANB2蛋白RNA结合域ZRANB2D(1-95)(PDB ID:3G9Y)用连接肽GGGGS连接在NLuc的N端，得到ZRANB2 D-NLuc重组蛋白(图10)。以含有pcDNA3.1-CMV-NLuc的质粒为载体模板，通过上述引物P43和P44将含有NLuc的载体片段扩增；以引物P57和P58将ZRANB2 D编码基因片段扩增。将扩增的载体和片段infusion连接获得融合蛋白质粒，得到的质粒命名为pCMV-ZRANB2 D-NLuc。它编码融合蛋白ZRANB2 D-NLuc，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：56。
用于扩增ZRANB2-D的引物为：
上游引物(P57)：
5′-CAAGCTGGCTAGCCACCATGTCGACCAAGAATTTCCG-3′
下游引物(P58)：
5′-TCTTCGAGTGTGAAGACCATGCTGCCTCCACCTCCTTTAGCATACTTTG GAGTATTAC-3′
实施例2.含不同荧光素酶的融合蛋白表达质粒构建。
为了构建噬菌体衣壳蛋白MCP与GLuc重组融合蛋白表达质粒。利用引物P59与P60扩增GLuc编码基因片段，利用引物P61和P62，以pCMV-NLuc-ddMCPmax为模板扩增获得线性化载体，通过一步法克隆试剂盒连接片段和载体，获得质粒pCMV-GLuc-ddMCPmax。它编码融合蛋白GLuc-ddMCPmax，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：57。
上游引物(P59)：
5′-AAGCCCACCGAGAACAACG-3′
下游引物(P60)：
5′-GTCACCACCGGCCCCCTTG-3′
上游引物(P61)：
5′-GGGGGCCGGTGGTGACGGATCCGGCGCCTGGC-3′
下游引物(P62)：
5′-GTTCTCGGTGGGCTTCATGTGGCTAGCCAGCTTGG-3′
为了构建噬菌体衣壳蛋白MCP与FLuc重组融合蛋白表达质粒。利用引物P63与P64扩增FLuc编码基因片段，利用引物P65和P66，以pCMV-NLuc-ddMCPmax为模板扩增获得线性化载体，通过一步法克隆试剂盒连接片段和载体，获得质粒pCMV-FLuc-ddMCPmax。它编码融合蛋白FLuc-ddMCPmax，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：58。
上游引物(P63)：
5′-ATGGACTACAAGGACG-3′
下游引物(P64)：
5′-CACGGCGATCTTTCCGC-3′
上游引物(P65)：
5′-CGGAAAGATCGCCGTGGGATCCGGCGCCTGGC-3′
下游引物(P66)：
5′-GTCCTTGTAGTCCATGTGGCTAGCCAGCTTGG-3′
实施例3.含Clivia的嵌合RNA表达质粒构建。
为了构建MS2 RNA与Clivia的嵌合RNA表达质粒，将MS2编码基因序列替换Clivia的非功能区环GAAA，将MS2嵌合到Clivia中。以pU6-Clivia为载体模板，通过引物P47和P48扩增得到含MS2序列的线性化质粒，最终通过自身infusion得到pU6-Clivia-MS2，其编码嵌合RNA Clivia-MS2，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：2。嵌合RNA的MS2与Clivia之间设计不同长度连接茎，得到一系列不同长度的嵌合RNA质粒：pU6-Clivia-MS2-7、pU6-Clivia-MS2-6、pU6-Clivia-MS2-5、pU6-Clivia-MS2-4、pU6-Clivia-MS2-3(pU6-Clivia-MS2max)，它们分别编码嵌合RNA Clivia-MS2-7、Clivia-MS2-6、Clivia-MS2-5、Clivia-MS2-4、Clivia-MS2max，它们的核苷酸序列分别为序列SEQ ID NO：3、4、5、6、7。
上游引物(P67)：
5′-ACATGAGGATCACCCATGTGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P68)：
5′-GGGTGATCCTCATGTGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-MS2-7的引物为：
上游引物(P69)：
5′-CCATGAGGATCACCCATGGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P70)：
5′-GGGTGATCCTCATGGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-MS2-6的引物为：
上游引物(P71)：
5′-ATGAGGATCACCCATGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P72)：
5′-ATGGGTGATCCTCATGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-MS2-5的引物为：
上游引物(P73)：
5′-GCCTGAGGATCACCCAGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P74)：
5′-GGGTGATCCTCAGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-MS2-4的引物为：
上游引物(P75)：
5′-CGCTGAGGATCACCCAGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P76)：
5′-GGGTGATCCTCAGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-MS2-3(即Clivia-MS2max)的引物为：
上游引物(P77)：
5′-ACGTGAGGATCACCCACGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P78)：
5′-GGGTGATCCTCACGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
为了构建boxB RNA与Clivia的嵌合RNA表达质粒，将boxB编码基因序列替换Clivia的非功能区环GAAA，将boxB嵌合到Clivia中。以pU6-Clivia为载体模板，通过引物P79和P80扩增得到含boxB序列的线性化质粒，最终通过自身infusion得到pU6-Clivia-boxB，其编码嵌合RNA Clivia-boxB，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：8。
上游引物(P79)：
5′-GCCCTGAAAAAGGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P80)：
5′-GCCCTTTTTCAGGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
为了构建不同RNA与Clivia的嵌合RNA表达质粒，利用引物P81和P82以pU6-Clivia为模板PCR后自身infusion，将与U1A蛋白相互作用的U1snRNA stem loop2插入Clivia的茎环中得到Clivia-U1SL2嵌合RNA表达质粒，命名为pU6-Clivia-U1SL2，其编码嵌合RNAClivia-U1SL2，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：9；利用引物P83和P84以pU6-Clivia为模板PCR后自身infusion，将与HnRNP C蛋白相互作用的Poly U RNA插入Clivia的茎环中得到Clivia-UUUUC嵌合RNA表达质粒，命名为pU6-Clivia-UUUUC，其编码嵌合RNA Clivia-UUUUC，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：10；利用引物P85和P86以pU6-Clivia为模板PCR后自身infusion，将与LARP7蛋白相互作用的7SK SL4 RNA插入Clivia的茎环中得到Clivia-7SK-SL4嵌合RNA表达质粒，命名为pU6-Clivia-7SK-SL4，其编码嵌合RNA Clivia-7SK-SL4，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：11；利用引物P87和P88以pU6-Clivia为模板PCR后自身infusion，将与Nova-1蛋白相互作用的UCAGUCAC基序RNA插入Clivia的茎环中得到Clivia-UCAGUCAC嵌合RNA表达质粒，命名为pU6-Clivia-UCAGUCAC，其编码嵌合RNA Clivia-UCAGUCAC，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：12；利用引物P89和P90以pU6-Clivia为模板PCR后自身infusion，将与STAR蛋白相互作用的ACUAAC RRE插入Clivia的茎环中得到Clivia-ACUAAC嵌合RNA表达质粒，命名为pU6-Clivia-ACUAAC，其编码嵌合RNA Clivia-ACUAAC，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：13；利用引物P91和P92以pU6-Clivia为模板PCR后自身infusion，将与Fox-1蛋白相互作用的UGCAUGU RRE插入Clivia的茎环中得到Clivia-UGCAUGU嵌合RNA表达质粒，命名为pU6-Clivia-UGCAUGU，其编码嵌合RNA Clivia-UGCAUGU，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：14；利用引物P93和P94以pU6-Clivia为模板PCR后自身infusion，将与TAP蛋白相互作用的CTE RNA插入Clivia的茎环中得到Clivia-CTE嵌合RNA表达质粒，命名为pU6-Clivia-CTE，其编码嵌合RNA Clivia-CTE，其核苷酸序列为序列SEQID NO：15(图8)。
用于构建pU6-Clivia-U1SL2的引物为：
上游引物(P81)：
5′-TTCGGGACATTGCACCTGCCGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P82)：
5′-GTGCAATGTCCCGAAGGACTCTGCCGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-UUUUC的引物为：
上游引物(P83)：
5′-ACGCCATTTTTCGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P84)：
5′-GCCGAAAAATGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3
用于构建pU6-Clivia-7SK-SL4的引物为：
上游引物(P85)：
5′-TGTGGCAGCTCGGGCTGCATGTGGCAGCTCATCAGTCGGCGTGGACTG TAG-3′
下游引物(P86)：
5′-GCCCGAGCTGCCACATGCAGCCGGCAGGAAGTGTCCGCCTTTC-3′
用于构建pU6-Clivia-UCAGUCAC的引物为：
上游引物(P87)：
5′-CGCGGATCAGTCACCCAAGCGGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P88)：
5′-GGTGACTGATCCGCGGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-ACUAAC的引物为：
上游引物(P89)：
5′-CCTTCACTAACAAGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P90)：
5′-CCTTGTTAGTGAAGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-UGCAUGU的引物为：
上游引物(P91)：
5′-ACGCCTGCATGTGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P92)：
5′-GCCACATGCAGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
于构建pU6-Clivia-CTE的引物为：
上游引物(P93)：
5′-GCCGGGAAACCTGCCTAATCCAATGACGGGTAATAGTGTGGCGGACAC TTCCTGCC-3′
下游引物(P94)：
5′-GGCAGGTTTCCCGGCCCTCCTGTCTTAGGTTAGTGCGGCGTGTTTACAA TCTTCCTG-3′
为了构建AGGUAA与Cilvia嵌合RNA的表达质粒，以pU6-Clivia为载体模板，通过引物P95和P96将AGGUAA RRE插入Clivia的茎环中得到嵌合RNA Clivia-AGGUAA，通过自身infusion得到真核表达质粒。通过不同引物对Clivia-AGGUAA中的AGGUAA序列进行点突变，通过自身infusion得到不同的真核表达质粒。获得的质粒分别命名为pU6-Clivia-AGGUAA、pU6-Clivia-CGGUAA、pU6-Clivia-ACGUAA、pU6-Clivia-AGCUAA、pU6-Clivia-AGGGAA、pU6-Clivia-AGGUUA、pU6-Clivia-AGGUAC，它们分别编码嵌合RNA Clivia-AGGUAA、Clivia-CGGUAA、Clivia-ACGUAA、Clivia-AGCUAA、Clivia-AGGGAA、Clivia-AGGUUA、Clivia-AGGUAC，它们的核苷酸序列分别为序列SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21、22(图10)。
用于构建pU6-Clivia-AGGUAA的引物为：
上游引物(P95)：
5′-CCAGGTAAAGGTAAGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P96)：
5′-CTTACCTTTACCTGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-CGGUAA的引物为：
上游引物(P97)：
5′-CCCGGTAACGGTAAGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P98)：
5′-CTTACCGTTACCGGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-ACGUAA的引物为：
上游引物(P99)：
5′-CCACGTAAACGTAAGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P100)：
5′-CTTACGTTTACGTGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-AGCUAA的引物为：
上游引物(P101)：
5′-CCAGCTAAAGCTAAGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P102)：
5′-CTTAGCTTTAGCTGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-AGGGAA的引物为：
上游引物(P103)：
5′-CCAGGGAAAGGGAAGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P104)：
5′-CTTCCCTTTCCCTGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-AGGUUA的引物为：
上游引物(P105)：
5′-CCAGGTTAAGGTTAGGCGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P106)：
5′-CTAACCTTAACCTGGCGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
用于构建pU6-Clivia-AGGUAC的引物为：
上游引物(P107)：
5′-CCCCTGAAAAAGGGGGACACTTCCTGCC-3′
下游引物(P108)：
5′-CCCCTTTTTCAGGGGTGTTTACAATCTTCCTG-3′
实施例4.含不同荧光RNA适配体的MS2嵌合RNA表达质粒构建。
为了构建MS2与Pepper嵌合RNA表达质粒，用MS2替换Pepper的非功能区环，将MS2嵌合到Pepper中得到Pepper-MS2嵌合RNA。以pU6-Pepper为载体模板，利用引物P109和P110进行PCR扩增，通过自身infusion连接，所得质粒命名为pU6-Pepper-MS2，其编码嵌合RNAPepper-MS2，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：23。
上游引物(P109)：
5′-CCTTGAGGATCACCCAAGGCACTGGCGCCGTC-3′
下游引物(P110)：
5′-GGGTGATCCTCAAGGCCGACACGCCACGATTG-3′
为了构建MS2与Broccoli嵌合RNA表达质粒，用MS2替换Broccoli的非功能区环，将MS2嵌合到Broccoli中得到Broccoli-MS2嵌合RNA。以pU6-Broccoli为载体模板，利用引物P111和P112进行PCR扩增，通过自身infusion连接，所得质粒命名为得到pU6-Broccoli-MS2，其编码嵌合RNA Broccoli-MS2，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：24。
上游引物(P111)：
5′-AGATGAGGATCACCCATCTGTCGAGTAGAGTGTG-3′
下游引物(P112)：
5′-TGGGTGATCCTCATCTGGACCCGACCGTCTC-3′
为了构建MS2与Red Broccoli的嵌合RNA表达质粒，将MS2连接在Red Broccoli的5′末端，得到MS2-Red Broccoli嵌合RNA。以pU6-Clivia为载体模板，利用引物P113和P114进行PCR扩增，获得线性化载体；以合成的Red Broccoli单链DNA序列为模板(引物合成)，利用引物P115和P116进行PCR扩增，得到MS2-Red Broccoli嵌合RNA编码基因片段；再通过一步法克隆试剂盒连接，所得质粒命名为pU6-MS2-Red Broccoli，其编码嵌合RNA MS2-RedBroccoli，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：59。
载体上游引物(P113)：
5′-CTGCCATCAGTCGGCGTGGAC-3′
载体下游引物(P114)：
5′-ACATGGGTGATCCTCATGTCTGCCATCAGTCGGCATG-3′
MS2-Red Broccoli嵌合RNA编码基因片段上游引物(P115)：
5′-GACATGAGGATCACCCATGTGGAGACGGTCGGGTCCAC-3′
MS2-Red Broccoli嵌合RNA编码基因片段下游引物(P116)：
5′-TCCACGCCGACTGATGGCAGGGAGCCCAGACACTACTCAAC-3′
为了构建MS2与Orange Broccoli嵌合RNA表达质粒，将MS2连接在OrangeBroccoli的5′末端，得到MS2-Orange Broccoli嵌合RNA。以pU6-Clivia为载体模板，利用引物P113和P114进行PCR扩增，获得线性化载体；以合成的Orange Broccoli单链DNA序列为模板(引物合成)，利用引物P117和P118进行PCR扩增，得到MS2-Orange Broccoli嵌合RNA编码基因片段；再通过一步法克隆试剂盒连接，所得质粒命名为pU6-MS2-Orange Broccoli，其编码嵌合RNA MS2-Orange Broccoli，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：60。
Orange Broccoli模板：
5′-GGAGACGGTCCGGTCCAGGTGCACAAATGTGGCCTGTTGAGTAGCGTG TCGGCTCC-3′
上游引物(P117)：
5′-GACATGAGGATCACCCATGTGGAGACGGTCCGGTCCAGG-3′
下游引物(P118)：
5′-TCCACGCCGACTGATGGCAGGGAGCCGACACGCTACTCAAC-3′
为了构建MS2与Spinach的嵌合RNA表达质粒，将MS2连接在Spinach的5′末端，得到MS2-Spinach嵌合RNA。以pU6-Clivia为载体模板，利用引物P113和P114进行PCR扩增，获得线性化载体；以合成的Spinach单链DNA序列为模板(引物合成)，利用引物P119和P120进行PCR扩增，得到MS2-Spinach嵌合RNA编码基因片段；再通过一步法克隆试剂盒连接，所得质粒命名为pU6-MS2-Spinach，其编码嵌合RNA MS2-Spinach，其核苷酸序列为序列SEQ IDNO：61。
Spinach模板：
5′-GACGCGACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGGTGTGGCTGCTT CGGCAGTGCAGCTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTCGCG TC-3′
上游引物(P119)：
5′-GACATGAGGATCACCCATGTGACGCGACTGAATGAAATGG-3′
下游引物(P120)：
5′-TCCACGCCGACTGATGGCAGGACGCGACTAGTTACGGAGC-3′
为了构建MS2与Spinach2嵌合RNA表达质粒，将MS2连接在Spinach2的5′末端，得到MS2-Spinach2嵌合RNA。以pU6-Clivia为载体模板，利用引物P113和P114进行PCR扩增，获得线性化载体；利用引物P121和P122进行PCR扩增，通过自身infusion连接，所得质粒命名为pU6-MS2-Spinach2，其编码嵌合RNA MS2-Spinach2，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：62。
Spinach2模板：
5′-GATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGTAGGCTGCTTCG GCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATC-3′
上游引物(P121)：
5′-GACATGAGGATCACCCATGTGATGTAACTGAATGAAATGG-3′
下游引物(P122)：
5′-TCCACGCCGACTGATGGCAGGATGTAACTAGTTACGGAGC-3′
为了构建MS2与iSpinach嵌合RNA表达质粒，将MS2连接在iSpinach的5′末端，得到MS2-iSpinach嵌合RNA。以pU6-Clivia为载体模板，利用引物P113和P114进行PCR扩增，获得线性化载体；利用引物P123和P124进行PCR扩增，通过自身infusion连接，所得质粒命名为pU6-MS2-iSpinach，其编码嵌合RNA MS2-iSpinach，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：63。
iSpinach模板：
5′-GCGACTACGGTGAGGGTCGGGTCCAGTAGCTTCGGCTACTGTTGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTAGTCGC-3′
上游引物(P123)：
5′-GACATGAGGATCACCCATGTGCGACTACGGTGAGGGTC-3′
下游引物(P124)：
5′-TCCACGCCGACTGATGGCAGGCGACTACGGAGCCCACAC-3′
为了构建MS2与Corn嵌合RNA表达质粒，将MS2连接在Corn的5′末端，得到MS2-Corn嵌合RNA。以pU6-Clivia为载体模板，利用引物P125和P126进行PCR扩增，通过自身infusion连接，所得质粒命名为pU6-MS2-Corn，其编码嵌合RNA MS2-Corn，其核苷酸序列为序列SEQID NO：64。
上游引物(P125)：
5′-GCCGCGAGGAAGGAGGTCTGAGGAGGTCACTGCGGCCTGCCATCAGTCGG CGTG-3′
下游引物(P126)：
5′-CTCCTTCCTCGCGGCACATGGGTGATCCTCATGTCTGCCATCAGTCGGCATG-3′
为了构建MS2与MGA嵌合RNA表达质粒，将MS2连接在MGA的5′末端，得到MS2-MGA嵌合RNA。以pU6-Clivia为载体模板，利用引物P127和P128进行PCR扩增，通过自身infusion连接，所得质粒命名为pU6-MS2-MGA，其编码嵌合RNA MS2-MGA，其核苷酸序列为序列SEQ IDNO：65。
上游引物(P127)：
5′-CCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCCCTGCCATCAGTCGGCG TGGAC-3′
下游引物(P128)：
5′-CTCTCGCCAGTCGGGATCCACATGGGTGATCCTCATGTCTGCCATCAGTCG GCATG-3′
实施例5.活细胞中含NLuc的不同融合蛋白与含Clivia的嵌合RNA相互作用检测。
为了检测MCP与MS2相互作用，将实施例1和3中构建的重组蛋白和嵌合RNA质粒共转到HEK293T细胞中表达。重组蛋白表达质粒包括pCMV-NLuc-MCP、pCMV-NLuc-cpMCP、pCMV-NLuc-dMCP、pCMV-NLuc-dMCP-Y85G、pCMV-NLuc-dMCP-Y85G、pCMV-NLuc-dMCP-K43G、pCMV-NLuc-dMCP-E63G、pCMV-NLuc-dMCP-N55G/K57G、pCMV-NLuc-dMCP-E89G/T91G、pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/N55G/K57G、pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G、pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/K43G、pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/E63G、pCMV-NLuc-dMCP-N55G/K57G/K43G、pCMV-NLuc-dMCP-E89G/T91G/K43G、pCMV-NLuc-dMCP-N55G/K57G/E63G、pCMV-NLuc-dMCP-E89G/T91G/E63G、pCMV-NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G/E63G、pCMV-NLuc-ddMCPmax、pCMV-NLuc-1-ddMCPmax、pCMV-NLuc-2-ddMCPmax、pCMV-NLuc-3-ddMCPmax、pCMV-NLuc-4-ddMCPmax、pCMV-NLuc-5-ddMCPmax。嵌合RNA表达质粒包括pU6-Clivia-MS2-7、pU6-Clivia-MS2-6、pU6-Clivia-MS2-5、pU6-Clivia-MS2-4、pU6-Clivia-MS2-3(pU6-Clivia-MS2max)。共表达重组蛋白和嵌合RNA的HEK293T细胞与1μM IV-4和10μMFurimazine孵育，利用Synergy Neo2多功能酶标仪进行生物发光光谱扫描，以发光光谱中574nm处的荧光值与460nm处的荧光值的比值，作为衡量BRET效率的参数。结果如图2和图3所示都检测到BRET现象，其中重组蛋白NLuc-ddMCPmax和嵌合RNA Clivia-MS2max具有最高BRET效率。共表达Clivia-MS2max和NLuc-ddMCPmax的HEK293T细胞与1μM IV-4和10μM Furimazine孵育进行生物发光成像，共表达Clivia和NLuc-ddMCPmax的HEK293T细胞作为阴性对照组，结果如附图7所示，发生相互作用的样品共表达NLuc-ddMCPmax与Clivia-MS2max的HEK293T细胞在胞浆中拍摄到较强的Clivia的发光信号，统计细胞BRET效率的平均值约为0.728，而不发生相互作用的样品共表达NLuc-ddMCPmax与Clivia的HEK293T细胞，则检测不到明显的Clivia的发光信号，统计细胞BRET效率的平均值约为0.058，这项结果说明成功在活细胞中检测了MCP与MS2相互作用。
为了检测λN与boxB的相互作用，将实施例1中构建的重组蛋白质粒pCMV-NLuc-λN和实施例3中构建的嵌合RNA质粒pU6-Clivia-boxB共转到HEK293T细胞中表达。单独荧光RNA表达质粒pU6-Clivia与重组蛋白表达质粒pCMV-NLuc-λN共转至HEK293T细胞中作为阴性对照组。共表达重组蛋白与嵌合RNA或荧光RNA的细胞与1μM IV-4和10μM Furimazine孵育成像。结果如附图9所示，共表达NLuc-λN与Clivia-boxB的HEK293T细胞检测到BRET现象的发生，统计细胞BRET效率的平均值约为1.37，阴性对照HEK293T细胞BRET效率的平均值约为0.11。
为了检测其他多种RNA结合蛋白与其对应RNA的相互作用，将实施例1中构建的pCMV-NLuc-U1A和pCMV-NLuc-HnRNPC、pCMV-LARP7-NLuc、pCMV-Nova-1-NLuc、pCMV-STAR-NLuc、pCMV-Fox-1-NLuc和pCMV-TAP-NLuc，与对应的实施例3中构建的RNA与Clivia的嵌合RNA表达质粒pU6-Clivia-U1SL2、pU6-Clivia-UUUUC、pU6-Clivia-7SK-SL4、pU6-Clivia-UCAGUCAC、pU6-Clivia-ACUAAC、pU6-Clivia-UGCAUGU、pU6-Clivia-CTE一一对应共转至HEK293T细胞。单独荧光RNA表达质粒pU6-Clivia分别与不同重组蛋白表达质粒共转至HEK293T细胞中作为阴性对照组。共表达重组蛋白与嵌合RNA或荧光RNA的细胞与1μM IV-4和10μM Furimazine孵育，进行BRET效率的检测。结果如附图8所示，都检测到BRET现象的发生，证明BRET系统具有较好的普适性，适用于检测多种蛋白质与RNA的相互作用。
ZRANB2是一种富含精氨酸和丝氨酸的结构域蛋白，它在细胞中广泛表达且高度保守，能够调控可变剪接，它与AGGUAA RRE相互作用形成复合物(PDB ID:3G9Y)。为了检测ZRANB2与AGGUAA RRE的相互作用。将实施例1中构建的融合蛋白表达质粒pCMV-ZRANB2 D-NLuc分别与实施例3中构建的嵌合RNA表达质粒pU6-Clivia-AGGUAA、pU6-Clivia-CGGUAA、pU6-Clivia-ACGUAA、pU6-Clivia-AGCUAA、pU6-Clivia-AGGGAA、pU6-Clivia-AGGUUA、Clivia-AGGUAC共转到HEK293T细胞中。将融合蛋白表达质粒pCMV-ZRANB2 D-NLuc与单独荧光RNA表达质粒pU6-Clivia共转至HEK293T细胞中作为阴性对照组。共表达ZRANB2 D-NLuc和Clivia-AGGUAA突变体或Clivia的HEK293T细胞与1μM IV-4和10μM Furimazine孵育成像，结果如附图10所示，统计细胞BRET效率的平均值，其中AGGUAA BRET效率的平均值约为0.309，CGGUAA BRET效率的平均值约为0.321，ACGUAA BRET效率的平均值约为0.042，AGCUAA BRET效率的平均值约为0.039，AGGGAA BRET效率的平均值约为0.098，AGGUUA BRET效率的平均值约为0.231，AGGUAC BRET效率的平均值约为0.306，阴性对照样品BRET效率的平均值约为0.044，BRET效率与已报道的RNA突变体与ZRANB2的亲和力有显著的正相关性，说明Clivia-NLuc BRET系统能够反映单个碱基突变造成的分子间亲和力变化，具有较高的灵敏性。
实施例6.活细胞中含不同荧光素酶的融合蛋白与Clivia-MS2相互作用检测。
为了检测含不同荧光素酶的融合蛋白与Clivia-MS2的相互作用，将实施例1中构建的融合蛋白表达质粒pCMV-GLuc-ddMCPmax与实施例3中构建的嵌合RNA表达质粒pU6-Clivia-MS2max共转至HEK293T细胞中，将融合蛋白表达质粒pCMV-GLuc-ddMCPmax与单独荧光RNA表达质粒pU6-Clivia共转至HEK293T细胞中作为阴性对照组。共表达融合蛋白GLuc-ddMCPmax和Clivia-MS2或Clivia的HEK293T细胞与2μM IV-4和10μM腔肠素孵育，进行发光光谱检测，检测结果如附图6a所示。检测结果显示，相对于共表达GLuc-ddMCPmax与Clivia的对照HEK293T细胞，共表达GLuc-ddMCPmax与Clivia-MS2max的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含GLuc的融合的蛋白与含Clivia的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
将实施例1中构建的融合蛋白表达质粒pCMV-FLuc-ddMCPmax与实施例3中构建的嵌合RNA表达质粒pU6-Clivia-MS2max共转至HEK293T细胞中，将融合蛋白表达质粒pCMV-FLuc-ddMCPmax与单独荧光RNA表达质粒pU6-Clivia共转至HEK293T细胞中作为阴性对照组。共表达融合蛋白FLuc-ddMCPmax和Clivia-MS2或Clivia的HEK293T细胞与2μM IV-4和10μM荧光素孵育，进行发光光谱检测，检测结果如附图6b所示。检测结果显示，相对于共表达FLuc-ddMCPmax与Clivia的对照HEK293T细胞，共表达FLuc-ddMCPmax与Clivia-MS2max的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含FLuc的融合的蛋白与含Clivia的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
实施例7.活细胞中含不同荧光RNA适配体的嵌合RNA与不同荧光素酶融合蛋白相互作用检测。
为了检测不同荧光RNA适配体的嵌合RNA与NLuc-ddMCPmax、GLuc-ddMCPmax或FLuc-ddMCPmax的相互作用，将实施例2中构建的不同荧光素酶融合蛋白表达质粒pCMV-NLuc-ddMCPmax、pCMV-GLuc-ddMCPmax或pCMV-FLuc-ddMCPmax与实施例4中构建的不同荧光RNA适配体的嵌合RNA表达质粒按照光谱匹配分别共转至HEK293T细胞中。将融合蛋白表达质粒pCMV-NLuc-ddMCPmax、pCMV-GLuc-ddMCPmax或pCMV-FLuc-ddMCPmax与表达荧光RNA的质粒分别共转至HEK293T细胞中作为阴性对照组。
将共表达融合蛋白NLuc-ddMCPmax和Pepper-MS2或Pepper的HEK293T细胞与1μMHBC530和10μMFurimazine孵育，进行BRET效率检测。检测如附图4a所示，相对于共表达NLuc-ddMCPmax与Pepper的对照HEK293T细胞，共表达NLuc-ddMCPmax与Pepper-MS2的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含Pepper荧光RNA适配体的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
将共表达融合蛋白NLuc-ddMCPmax和Broccoli-MS2或Broccoli的HEK293T细胞与1μMDFHBI-1T和10μMFurimazine孵育，进行BRET效率检测。检测结果如附图4b所示，相对于共表达NLuc-ddMCPmax与Broccoli的对照HEK293T细胞，共表达NLuc-ddMCPmax与Broccoli-MS2的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含Broccoli荧光RNA适配体的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
将共表达融合蛋白GLuc-ddMCPmax和MS2-Red Broccoli或Red Broccoli的HEK293T细胞与1μMDFHO和10μM腔肠素孵育，进行BRET效率检测。检测结果如附图4c所示，相对于共表达NLuc-ddMCPmax与Red Broccoli的对照HEK293T细胞，共表达NLuc-ddMCPmax与RedBroccoli-MS2的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含Red Broccoli荧光RNA适配体的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
将共表达融合蛋白GLuc-ddMCPmax和MS2-Orange Broccoli或Orange Broccoli的HEK293T细胞与1μMDFHO和10μM腔肠素孵育，进行BRET效率检测。检测结果如附图4d所示，相对于共表达NLuc-ddMCPmax与Orange Broccoli的对照HEK293T细胞，共表达NLuc-ddMCPmax与MS2-Orange Broccoli的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含Orange Broccoli荧光RNA适配体的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
将共表达融合蛋白NLuc-ddMCPmax和MS2-Spinach或Spinach的HEK293T细胞与1μMDFHBI和10μM Furimazine孵育，进行BRET效率检测。检测结果如附图4e所示，相对于共表达NLuc-ddMCPmax与Spinach的对照HEK293T细胞，共表达NLuc-ddMCPmax与MS2-Spinach的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含Spinach荧光RNA适配体的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
将共表达融合蛋白GLuc-ddMCPmax和MS2-Spinach2或Spinach2的HEK293T细胞与1μMDFHBI-1T和10μM腔肠素孵育，进行BRET效率检测。检测结果如附图4f所示，相对于共表达NLuc-ddMCPmax与Spinach2的对照HEK293T细胞，共表达NLuc-ddMCPmax与MS2-Spinach2的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含Spinach2荧光RNA适配体的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
将共表达融合蛋白NLuc-ddMCPmax和MS2-iSpinach或iSpinach的HEK293T细胞与1μMDFHBI和10μMFurimazine孵育，进行BRET效率检测。检测结果如附图4g所示，相对于共表达NLuc-ddMCPmax与iSpinach的对照HEK293T细胞，共表达NLuc-ddMCPmax与MS2-iSpinach的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含iSpinach荧光RNA适配体的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
将共表达融合蛋白GLuc-ddMCPmax和MS2-Corn或Corn的HEK293T细胞与1μMDFHO和10μM腔肠素孵育，进行BRET效率检测。检测结果如附图4h所示，相对于共表达NLuc-ddMCPmax与Corn的对照HEK293T细胞，共表达NLuc-ddMCPmax与MS2-Corn的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含Corn荧光RNA适配体的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
将共表达融合蛋白FLuc-ddMCPmax和MS2-MGA或MGA的HEK293T细胞与1μMDFHO和10μM荧光素孵育，进行BRET效率检测。检测结果如附图4i所示，相对于共表达NLuc-ddMCPmax与MGA的对照HEK293T细胞，共表达NLuc-ddMCPmax与MS2-MGA的HEK293T细胞显出更高的BRET效率，表明含MGA荧光RNA适配体的嵌合RNA可用于活细胞RNA-蛋白质相互作用检测。
实施例8.基于Clivia-NLuc BRET系统的RNA或RNA与蛋白质相互作用体外检测。
为了在体外检测MCP与MS2的相互作用，构建重组蛋白NLuc-ddMCPmax原核表达质粒，利用引物P129和P130以含有pCDF载体的质粒为载体模板，获得线性化载体；利用引物P131和P132以质粒pCMV-NLuc-ddMCPmax为片段模板将NLuc-ddMCPmax重组蛋白编码基因片段进行扩增，通过infusion得到质粒pCDF-NLuc-ddMCPmax。在E.coli BL21(DE3)菌株中表达后进行重组蛋白的纯化。Clivia-MS2嵌合RNA通过体外转录获得。将20nM重组蛋白、100nM嵌合RNA、1μM不同染料在HEPES buffer中混合孵育后，加入底物10μM Furimazine用SynergyNeo2多功能酶标仪进行发光光谱扫描。结果如附图11所示Clivia系列染料都检测到明显的Clivia的发射峰信号，说明BRET现象发生，表明Clivia-MS2嵌合RNA和融合蛋白NLuc-ddMCPmax可用于体外RNA或者RNA与蛋白质相互作用检测。
上游引物(P129)：
5′-CACCATCATCACCACATGGTCTTCACACTCGAAG-3′
下游引物(P130)：
5′-AGTCGCGGCCGCTTTAAAGCTTACCTTTAGGC-3′
上游引物(P131)：
5′-TAAAGCGGCCGCGACTTAATTAAC-3′
下游引物(P132)：
5′-GTGGTGATGATGGTGATGGC-3′
实施例9.基于Clivia-NLuc BRET系统的RNA或RNA与蛋白质相互作用活体检测。
为了在活体中检测MCP与MS2的相互作用，将表达了嵌合RNA Clivia-MS2和融合蛋白NLuc-ddMCPmax的HEK293T细胞与染料孵育后皮下植入到小鼠背部左侧，以表达了RNAClivia和融合蛋白NLuc-ddMCPmax的HEK293T细胞与染料孵育后皮下植入到小鼠背部右侧作为阴性对照。腹腔注射底物furimazine，利用Spectrum CT活体成像仪进行发光成像。以500/20nm处收集的信号作为NLuc的发射信号，以600/20nm处收集的信号作为荧光RNA的发射信号，以600/20nm处信号与500/20nm处信号的强度比值定义为BRET效率。结果如图12所示，左侧拍摄到明显的Clivia信号，BRET效率的平均值约为0.897，右侧BRET效率的平均值约为0.063，表明Clivia-MS2嵌合RNA和融合蛋白NLuc-ddMCPmax可用于活体动物中RNA或者RNA与蛋白质相互作用检测。
应该理解，本说明书各实施例中的用量、反应条件等除非特别注明均为近似值，可根据实际情况略作改变而获得类似结果。除专门定义外，本文所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所理解的含意相同。本文提及的所有文献都引入本申请作为参考。本说明书中描述的是作为示范用的优选实施方案，本领域技术人员可采用与本文所述相似的方法及材料实施本发明获得相同或相似的结果，对本发明所作的各种改动或修改仍属于本申请所附权利要求书限定的范围内。
Claims (18)
1.一种RNA-蛋白质复合物，其特征在于，所述RNA-蛋白质复合物包括：
a)N1-N2或N2-N1嵌合RNA，其中N1是任意感兴趣的靶标RNA序列，N2为RNA适配体；
b)P1-P2或P2-P1重组融合蛋白，其中P1是RNA结合蛋白，P2为发光蛋白，并且，所述P1特异性识别结合所述N1。
2.根据权利要求1所述的RNA-蛋白质复合物，其特征在于，所述N1和N2之间可操作性连接，和/或，所述P1与P2之间可操作性连接。
3.根据权利要求1所述的RNA-蛋白质复合物，其特征在于，所述N2RNA适配体可以特异性识别结合荧光团分子。
4.根据权利要求3所述的RNA-蛋白质复合物，其特征在于，所述RNA适配体可选自Pepper RNA适配体、Clivia RNA适配体、Broccoli RNA适配体、Red Broccoli RNA适配体、Orange BroccoliRNA适配体、Corn RNA适配体、Spinach RNA适配体、Spinach2 RNA适配体、iSpinachRNA适配体、Chili RNA适配体、DNB RNA适配体、SRB-2RNA适配体、13-2min RNA适配体、A1RNA适配体、A RNA适配体、AT RNA适配体、DIR-Apt1 RNA适配体、DIR2s-Apt RNA适配体、Mango RNA适配体、MGA RNA适配体，或其任何一种的生物活性变体或片段。
5.根据权利要求3所述的RNA-蛋白质复合物，其特征在于，所述荧光团分子可选自HBC485、HBC497、HBC508、HBC514、HBC525、HBC530、HBC599、HBC620、IV-39、IV-17、IV-20、IV-18、IV-21、IV-19、IV-22、IV-37、IV-4、IV-3、IV-2、IV-1、IV-6、IV-5、DFHBI、DFHBI-1T、DFHBI-2T、BI、OBI、TBI、DFHO、DIR、OTB-SO3、OTB-T-SO3、DIR-Pro、SR-DN、TMR-DN、RG-DN、DMHBI-Imi、DMHBI+、DMHBO+、TO1、TO3、MG。
6.根据权利要求1所述的RNA-蛋白质复合物，其特征在于，所述发光蛋白可催化特定的底物分子产生特定波长的光。
7.根据权利要求6所述的RNA-蛋白质复合物，其特征在于，所述发光蛋白可选自深海细角刺虾荧光素酶、海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、腔肠荧光素酶、北美萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶、铁路蠕虫荧光素酶、细菌荧光素酶、高斯荧光素酶、水母发光蛋白、Arachnocompa荧光素酶，或其中任何一种的生物活性变体或片段，或其中两种或更多种的嵌合体。
8.根据权利要求6所述的RNA-蛋白质复合物，其特征在于，所述底物分子可选自荧光素、腔肠素、Furimazine，或其中任何一种的衍生物或类似物。
9.根据权利要求1所述的RNA-蛋白质复合物，其特征在于，P1可以与N1结合，促使P2催化底物产生的特定波长光经生物发光共振能量转移激活N2RNA适配体-荧光团分子复合物产生荧光。
10.如根据权利要求9所述的RNA-蛋白质复合物，P1和N1可选自来源于噬菌体的MCP衣壳蛋白与MS2发夹RNA、N蛋白与boxB RNA、U1A蛋白与U1 snRNAstem loop2 RNA、HnRNP C蛋白与Poly U RNA、LARP7蛋白与7SK SL4 RNA、Nova-1蛋白与UCAGUCAC基序RNA、STAR蛋白与ACUAAC RRE、Fox-1蛋白与UGCAUGU RRE、TAP蛋白与CTE RNA、ZRANB2蛋白与AGGUAA RRE，或其任何一种的生物活性变体或片段。
11.如根据权利要求10所述的RNA-蛋白质复合物，P1和N1还可包含它们的串联体、环状更替突变体，或其任何一种的生物活性变体或片段，或其中两种或更多种的嵌合体。
12.如根据权利要求1所述的RNA-蛋白质复合物，P1-P2或P2-P1重组融合蛋白可选自NLuc-MCP、NLuc-cpMCP、NLuc-dMCP、NLuc-dMCP-Y85G、NLuc-dMCP-K43G、NLuc-dMCP-E63G、NLuc-dMCP-N55G/K57G、NLuc-dMCP-E89G/T91G、NLuc-dMCP-Y85G/K43G、NLuc-dMCP-Y85G/E63G、NLuc-dMCP-Y85G/N55G/K57、NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G、NLuc-dMCP-N55G/K57/E63G、NLuc-dMCP-E89G/T91G/E63G、NLuc-dMCP-N55G/K57/K43G、NLuc-dMCP-E89G/T91G/K43G、NLuc-ddMCPmax、NLuc-dMCP-Y85G/E89G/T91G/E63G、NLuc-λN、NLuc-U1A、NLuc-HnRNPC、LARP7-NLuc、Nova-1-NLuc、STAR-NLuc、Fox-1-NLuc、TAP-NLuc、ZRANB2 D-NLuc、GLuc-ddMCPmax、FLuc-ddMCPmax。
13.如根据权利要求1所述的RNA-蛋白质复合物，N1-N2或N2-N1嵌合RNA可选自Clivia-MS2max、Clivia-MS2-7、Clivia-MS2-6、Clivia-MS2-5、Clivia-MS2-4、Clivia-boxB、Clivia-U1SL2、Clivia-UUUUC、Clivia-7SK-SL4、Clivia-UCAGUCAC、Clivia-ACUAAC、Clivia-UGCAUGU、Clivia-CTE、Clivia-AGGUAA、Clivia-CGGUAA、Clivia-ACGUAA、Clivia-AGCUAA、Clivia-AGGGAA、Clivia-AGGUUA、Clivia-AGGUAC、Pepper-MS2、Broccoli-MS2、RedBroccoli-MS2、Orange Broccoli-MS2、Spinach-MS2、Spinach2-MS2、iSpinach-MS2、Corn-MS2、MGA-MS2。
14.含有权利要求1-13中任一项所述的RNA-蛋白质复合物的表达载体。
15.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有N1-N2或N2-N1嵌合RNA编码核苷酸序列和/或P1-P2或P2-P1重组融合蛋白编码核苷酸序列，其中N1和P1编码核苷酸序列可以空缺。
16.权利要求1-13中任一项所述的RNA-蛋白质复合物用于检测宿主细胞中靶标RNA-蛋白质相互作用或靶标RNA的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：a)将所述RNA-蛋白质复合物的各组分构建在原核或真核质粒表达载体中；b)将重组质粒引入宿主细胞；c)分别加入荧光团分子和发光蛋白底物分子，检测荧光团分子在合适波长下的荧光强度和荧光素酶催化底物产生的合适波长下的发光强度。
17.权利要求1-13中任一项所述的RNA-蛋白质复合物用于检测细胞外靶标RNA或RNA-蛋白质相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：a)制备所述RNA-蛋白质复合物的嵌合RNA和重组融合蛋白组分；b)将嵌合RNA和重组融合蛋白组分混合；c)分别加入荧光团分子和发光蛋白底物分子，检测荧光团分子在合适波长下的荧光强度和荧光素酶催化底物产生的合适波长下的发光强度。
18.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有权利要求1-13所述的RNA-蛋白质复合物的嵌合RNA和重组融合蛋白组分和/或权利要求14所述的表达载体和/或含有权利要求14所述的表达载体的原核或真核细胞，和/或整合含有权利要求1-13所述RNA-蛋白质复合物组分的原核或真核细胞。
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