CN110226087A - 生物体物质的检测方法、该方法中使用的化学发光指示剂 - Google Patents

生物体物质的检测方法、该方法中使用的化学发光指示剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种能够容易进行定量测定的生物体物质的检测方法。一种检测方法，其为试样中的生物体物质的检测方法，其包含：向所述试样中混合使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)、及所述化学发光蛋白质(B)的底物；以及，观察来自所述试样的发光信号，所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。

Description

生物体物质的检测方法、该方法中使用的化学发光指示剂
技术领域
本公开涉及一种生物体物质的检测方法、及该方法中使用的化学发光指示剂。
背景技术
作为检测试样中的生物体物质的方法，可举出使用荧光蛋白的方法。例如，专利文献1提出了如下方案：使用结合作为生物体物质的非结合型胆红素则发挥荧光特性的UnaG蛋白或其变异体，来检测非结合型胆红素。
胆红素是指作为血红蛋白的构成物的亚铁血红素的分解产物。胆红素有脂溶性的非结合型胆红素(也称为间接胆红素)和水溶性的结合型胆红素(也称为直接胆红素)。非结合型胆红素随着肝功能的降低而被排出至血液中或尿中。高浓度的间接胆红素引起核黄疸(胆红素脑病)。
目前，胆红素的测定主要是以重氮法为代表的比色定量法。在血液检查时，通常测定总胆红素(直接胆红素和间接胆红素的合计)和直接胆红素，算出其差值，作为间接胆红素。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2014/133158
发明内容
发明所要解决的技术问题
使用UnaG那样的结合生物体物质的荧光蛋白进行该生物体物质的检测、定量的情况下，需要用于观测的激发光源。另外，由于为一波长激发一波长测光，因此，有时难以进行定量测定。
因此，本公开在一方式中提供一种能够容易进行定量测定的生物体物质的检测方法及化学发光指示剂。
用于解决问题的技术方案
本公开在一个或多个实施方式中涉及一种检测方法，其为试样中的生物体物质的检测方法(以下，也称为本公开的检测方法。)，其包含：
向所述试样中混合使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)、及所述化学发光蛋白质(B)的底物；以及
观察来自所述试样的发光信号，
所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，
所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，
所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
本公开在其它的一个或多个实施方式中涉及一种化学发光指示剂，其为含有使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)的化学发光指示剂，其中，
所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，
所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，
所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
本公开在其它的一个或多个实施方式中涉及一种载体或转化体，其可表达融合蛋白(C)。
本公开在其它的一个或多个实施方式中涉及一种判别方法，其包含：基于用本公开的检测方法得到的发光信号数据，判别试样中的生物体物质浓度。
发明效果
根据本公开，在一方式中，可以提供一种能够容易进行定量测定的生物体物质的检测方法。
附图说明
图1表示进行了C末端/N末端缺损变异的各种各样的UnaG与NLuc的融合蛋白的化学发光光谱。UnaG(CΔ0)+NLuc(NΔ1)表示最大的FRET效率。
图2表示在接头序列中插入各种各样的变异时的化学发光光谱。与野生型化学发光胆红素指示剂的序列(GT)相比，置换为DD序列的变异体显示最大的FRET效率变化。
图3表示野生型化学发光胆红素指示剂的滴定曲线。将3次独立测量的平均值进行标绘，利用希尔公式进行拟合。Kd值为3.05nM。
图4表示相对于在室温下保存的冷冻干燥试样的胆红素的亲和性(解离常数、Kd值)的变化。
图5表示用智能手机拍摄的野生型化学发光胆红素指示剂和各种各样的浓度的胆红素溶液的96孔板上的化学发光像。
图6表示实施例2中的利用UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白的胆红素测定的结果的一例，图6的A表示化学发光光谱，图6的B是表示UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白溶液(检测试剂)的稀释率和由发光强度得到的峰值的比率值(530nm/460nm)的关系的坐标图。
图7表示比较例1中的利用UnaG蛋白的胆红素测定的结果的一例，图7的A表示荧光光谱，图7的B是表示UnaG蛋白溶液(检测试剂)的浓度和峰值(530nm)的荧光强度的关系的坐标图。
具体实施方式
本公开基于如下见解：通过在当检测生物体物质时与该生物体物质结合而发出荧光的蛋白质上，以可引起共振能量转移的方式融合化学发光蛋白质，从而不使用用于观测的激发光源，另外，可以使用双波长的测定光，可以容易地进行该生物体物质的定量。
本公开的检测方法在一个或多个实施方式中包含：将使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)作为化学发光指示剂使用，检测试样中的生物体物质。
[生物体物质及试样]
作为本公开的检测方法的检测对象，可举出生物体试样中的生物体物质。作为生物体试样，为含有源自生物的该生物体物质的试样，优选为液体状。作为这样的生物体试样，没有特别限制，可举出例如：全血、血清、血浆、及尿等体液试样。另外，本发明中的生物体试样可以根据需要进行稀释和/或前处理等。本公开的检测方法当然可以将上述“生物体试样”以外的试样设为测定对象。可举出例如检测对象的生物体物质的标准试样、即用于测定的对照试样。作为生物体物质，为结合于后述的蛋白质(A)的物质，可举出例如：生物体内的低分子化合物、分解代谢物、核酸、糖、肽、蛋白质、细胞、或微生物等。
[可结合生物体物质的蛋白质(A)]
作为本公开的“可结合生物体物质的蛋白质(A)”，在一个或多个实施方式中，可举出：在结合有生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、及可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)。
作为在结合有生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)，在一个或多个实施方式中，可举出在脱辅基蛋白时为无荧光性、结合作为配体的生物体物质而成为全蛋白时有荧光性的蛋白质。作为所述蛋白质(A1)的一个或多个实施方式，可举出UnaG蛋白。另外，作为所述蛋白质(A1)的其它的一个或多个实施方式，可举出smURFP、IFP、及iRFP。
UnaG蛋白具有与间接胆红素特异性地结合、利用青色的激发光而发光成绿色的性质(Kumagai et al.,Cell 2013,153,1602-1611)。UnaG与间接胆红素具有极高的结合能力(解离常数＝98pM)。UnaG的序列信息可以参照UniProtKB/Swiss-Prot：P0DM59.1、或GenBank：AB763906.1(2016年8月时刻)。如果使用UnaG蛋白作为所述蛋白质(A1)，则可以进行例如间接胆红素的检测。
smURFP为small ultra red fluorescent protein(小超红蛋白)的简称，为与作为血红蛋白的代谢物的胆绿素结合而显示红色的荧光性的蛋白质(Rodriguez et al.,Nature Methods,2016,13,763-769)。
IFP为infrared-fluorescent protein(红外荧光蛋白)的简称，为与胆绿素结合而显示红色的荧光性的蛋白质(Shu X,et al.,Science 2009,324(5928),804-8-7)。
iRFP为near-infrared fluorescent protein(近红外荧光蛋白)的简称，为与胆绿素结合而显示红色的荧光性的蛋白质(Filonov GS,et al.,Nat Biotech 2011,29(8),757-761)。
如果使用这些smURFP、IFP、或iRFP作为所述蛋白质(A1)，则可以进行例如胆绿素的检测。
作为所述蛋白质(A1)，可以为UnaG蛋白或smURFP、IFP、或iRFP的变异体。作为UnaG蛋白或smURFP、IFP、或iRFP的变异体，可以在能够维持当结合作为配体的胆红素或胆绿素而成为全蛋白则有荧光性的特性的范围内发生缺失、附加、置换等变异。作为变异的氨基酸的数量，没有特别限制，在一个或多个实施方式中，可举出1～4、1～3、1～2、或1个，或者可举出显示至少90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或99.5％以上的同源性的氨基酸序列的范围。作为变异的非限定性的实例，可举出融合蛋白(C)中的与蛋白质(B)的融合部分(C末端或N末端)的缺失。
可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)是指通过结合该自体荧光分子而有荧光性的蛋白质。作为所述自体荧光分子，可举出黄素单核苷酸(FMN)。作为可结合自体荧光分子(FMN)的蛋白质(A2)，在一个或多个实施方式中，可举出FbFP、iLOV蛋白、及mini-SOG蛋白。
FbFP为Flavin mononucleotide(FMN)-based fluorescent protein(黄素但核苷酸基荧光蛋白)的简称，为源自细菌的青色受体的荧光蛋白(Drepper T.,et al.,NatBiotech.2007,25(4)443-445)。
iLOV蛋白为改变源自植物青色受体向光素的light,oxygen or voltage-sensing(LOV，光-氧-电感受)结构域的荧光蛋白而荧光特性得以改善的蛋白质(Chapman S.,etal.,PNAS 2008,105(50)20038-43)。
mini-SOG蛋白为mini Singlet Oxygen Generator(迷你单线态氧发生器)的简称，为源自拟南芥(Arabidopsis)的向光素2的荧光蛋白(Shu X.,et al.,PLoS Biol.2011,9(4))。
所述蛋白质(A2)可以是在可结合所述自体荧光分子的范围内发生了缺失、附加、或置换等变异的变异体。作为变异的氨基酸的数量，可举出上述的范围。
[化学发光蛋白质(B)]
化学发光蛋白质(B)可以利用其发光能量激发蛋白质(A)的荧光或自体荧光。使用这种融合化学发光蛋白质(B)而成的融合蛋白(C)作为检测试剂，因此，根据本公开的检测方法，可以不使用用于观察的激发光源而进行生物体物质的定量测定。作为化学发光蛋白质(B)，可举出可成为可以利用共振能量转移激发所述蛋白质(A)的荧光的共振能量转移的供体的发光蛋白质(荧光素酶)。从可以根据发光色判定检测方面考虑，优选所述蛋白质(A)的发光色与所述蛋白质(B)的发光色不同。
已知所述共振能量转移为荧光共振能量转移(FRET)或生物发光共振能量转移(BRET)。该蛋白质(B)可以根据所述蛋白质(A1)的吸收波长、或结合于所述蛋白质(A2)的自体荧光分子的吸收波长而选择。作为该蛋白质(B)，可举出公知的发光蛋白质、例如萤火虫荧光素酶、水母发光蛋白、细菌荧光素酶、及它们的变异体。
所述蛋白质(A)为UnaG的情况下，作为所述蛋白质(B)，在一个或多个实施方式中，可举出以腔肠素化合物为发光底物的荧光素酶。作为该荧光素酶的一个或多个实施方式，可举出NLuc。
所述蛋白质(B)可以为公知的荧光素酶的变异体。作为荧光素酶的变异体，可以在能够维持通过结合荧光素而发光的特性的范围内发生缺失、附加、置换等变异。作为变异的氨基酸的数量，没有特别限制，在一个或多个实施方式中，可举出1～4、1～3、1～2、或1个，或者可举出显示至少90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或99.5％以上的同源性的氨基酸序列的范围。作为变异的非限定性的实例，可举出蛋白质(C)中的与蛋白质(A)的融合部分(C末端或N末端)的缺失。
[接头]
在所述融合蛋白(C)中，所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)可以通过接头结合。该接头可以以从所述蛋白质(B)向所述蛋白质(A)的共振能量转移的效率升高的方式选择。作为该接头的长度，在一个或多个实施方式中，可举出1～10、1～5、2～4或2～3氨基酸残基。
所述蛋白质(A)为UnaG的情况下，作为接头，在一个或多个实施方式中，可举出GT、DD、GTG、或GTGG等，这些接头中，从发光效率方面考虑，优选DD、GTG、或GTGG，更优选GTG。
所述融合蛋白(C)中的所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)的融合的顺序没有特别限定，N末侧可以为所述蛋白质(A)，也可以为所述蛋白质(B)。所述融合蛋白(C)在一个或多个实施方式中可以在N末端或C末端融合标签蛋白。
由于所述融合蛋白(C)具备上述的构成，因此，在作为所述蛋白质(A)的底物的生物体物质和作为所述蛋白质(B)的底物的荧光素同时存在的情况下，显示所述蛋白质(A)的发光色的倾向，作为所述蛋白质(A)的底物的生物体物质的量越少，所述蛋白质(B)的发光色的倾向越强。因此，如果使用所述融合蛋白(C)，则可以进行生物体物质的检测/测定。
[检测方法]
因此，本公开的检测方法为试样中的生物体物质的检测方法，其中，包含：
向所述试样中混合使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)、及所述化学发光蛋白质(B)的底物；以及
观察来自所述试样的发光信号，
所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，
所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，
所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
在对象的试样中添加融合蛋白(C)和蛋白质(B)的底物时，试样进行发光。以其发光信号为指标，可以判别结合于蛋白质(A)的生物体物质的有无。基本上，如果该生物体物质存在，则发光色成为蛋白质(A)的发光色，如果其不存在，则成为蛋白质(B)的发光色。
本公开的检测方法在一个或多个实施方式中可以在室温或环境温度下进行。作为将所述融合蛋白(C)和所述蛋白质(B)的底物进行混合后至观察的时间，在一个或多个实施方式中，可举出数秒～数分钟左右、或数秒～1分钟左右。作为本公开的检测方法中的所述融合蛋白(C)，可以使用上述的融合蛋白(C)。
另外，本公开的检测方法在一个或多个实施方式中试样的发光色依赖该生物体物质的浓度而变化。该生物体物质的浓度越提高，试样的发光色越从蛋白质(B)的发光色变化为蛋白质(A)的发光色。即，可以对发光信号中的蛋白质(A)与蛋白质(B)的发光强度比和生物体物质的浓度建立关联。
因此，根据本公开的检测方法，不管试样量，可以由发光信号定量地测定该生物体物质的浓度。从可以进行定量测定方面考虑，向试样中添加的融合蛋白(C)的摩尔浓度优选在Kd左右的浓度域。
在一个或多个实施方式中，本公开的检测方法可以包含由试样的发光信号定量地算出生物体物质的浓度的工序。
[指示剂]
本公开在其它的方式中，涉及一种融合蛋白(C)。
另外，融合蛋白(C)可以作为所述生物体物质的化学发光指示剂使用。因此，本公开在其它的方式中涉及一种化学发光指示剂，其为含有使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)的化学发光指示剂，其中，所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
另外，所述化学发光指示剂可以在本公开的检测方法中使用，因此，本公开在其它的方式中涉及一种用于在本公开的检测方法中使用的所述化学发光指示剂、及其用途。
所述融合蛋白(C)在一个或多个实施方式中既可以为利用基因重组技术制作的重组蛋白质，也可以为通过化学合成而合成的蛋白质。作为利用基因重组技术的重组蛋白质的制作，在一个或多个实施方式中，可举出使用利用含有编码融合蛋白(C)的基因的表达载体转化的宿主而制作的方法、或者在无细胞系中制作的方法。该融合蛋白(C)可以利用标签蛋白等进行纯化。
[核酸]
本公开在一方式中，涉及一种编码本公开的融合蛋白(C)的核酸。本公开中，核酸可举出选自合成DNA、cDNA、基因组DNA及质粒DNA中的单链或双链DNA、以及这些DNA的转录产物。
[表达盒]
本公开在一方式中涉及一种含有编码本公开的融合蛋白(C)的核酸的表达盒。在该表达盒中，所述核酸中，与导入的宿主细胞相应的表达调节序列操作性地被连结。作为表达调节序列，可举出启动子、增强子、转录终止子等，此外，可举出起始密码子、内含子的剪接信号、及终止密码子等。
[载体]
本公开在一方式中涉及一种可表达本公开的融合蛋白(C)的载体。本公开在其它的方式中，本公开的载体在一个或多个实施方式中为具有本公开的核酸或表达盒的表达载体。本公开的载体可以适当选择、使用与要表达的细胞(宿主)相应的表达载体系统。作为可以在本公开的载体中利用的载体，作为非限定性的一个或多个实施方式，可举出质粒、黏粒、YACS、病毒(例如腺病毒、反转录病毒、附加体EBV等)载体及噬菌体载体。
[转化体]
本公开在一方式中涉及一种表达本公开的融合蛋白(C)的转化体。本公开在一个或多个实施方式中涉及一种具有本公开的核酸或载体的转化体。本公开的转化体在一个或多个实施方式中可以通过将本公开的核酸、表达盒或载体导入于宿主而制作。作为宿主，可举出：动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、及微生物等。
[判别方法]
本公开在其它的方式中涉及一种试样中的生物体物质的浓度判别方法，其包含基于用本公开的检测方法得到的发光信号数据判别试样中的生物体物质的浓度的步骤。
如上所述，用本公开的检测方法得到的发光信号中的蛋白质(A)与(B)的发光强度比可以依赖于试样中的生物体物质的浓度。因此，可以由检测中使用的融合蛋白(C)的信息和发光信号判别生物体物质的浓度。
所述发光信号数据可以用移动终端(智能手机等)的彩色照相机等彩色检测器简便地取入、接收发送，因此，可以简便地把握生物体物质的浓度。
本公开进一步涉及以下的非限定性的一个或多个实施方式。
[1]一种检测方法，其为试样中的生物体物质的检测方法，其包含：
向所述试样中混合使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)、及所述化学发光蛋白质(B)的底物；以及
观察来自所述试样的发光信号，
所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，
所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，
所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
[2]根据[1]所述的检测方法，其中，所述蛋白质(A1)为在结合有胆红素的状态下可发出荧光的UnaG蛋白或其变异体，检测对象的生物体物质为胆红素。
[3]根据[1]所述的检测方法，其中，所述蛋白质(A1)为在结合有胆绿素的状态下可发出荧光的、IFP、iRFP、smURFP、及它们的变异体，检测对象的生物体物质为胆绿素。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的检测方法，其中，所述蛋白质(A2)为可结合黄素单核苷酸的、选自由FbFP、iLOV蛋白、mini-SOG蛋白、及它们的变异体构成的组中的蛋白质，检测对象的生物体物质为黄素单核苷酸。
[5]一种化学发光指示剂，其含有使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)，其中，
所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，
所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，
所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
[6]根据[5]所述的化学发光指示剂，其用于[1]～[4]中任一项所述的检测方法。
[7]一种载体或转化体，其可表达[1]～[4]中任一项所规定的融合蛋白(C)。
[8]一种试样中的生物体物质的浓度判别方法，其包含：基于用[1]～[4]中任一项所述的检测方法得到的发光信号数据，判别试样中的生物体物质的浓度。
以下，通过实施例进一步详细地说明本公开，但这些实施例为例示的实施例，本公开并不限于这些实施例。
实施例
[实施例1]
1.融合蛋白(化学发光指示剂)的基因构建
使用在N末端附加有BamHI限制酶部位、在C末端附加有KpnI限制酶部位的以下的引物将野生型UnaG的C末缺损变异体进行扩增。
Forward primer:CGCGGATCCGGGTGGTTCTGGTATGG序列号1
Reverse primer0:(CΔ0)GCTGGTACCTTCCGTCGCCCTCCG序列号2
Reverse primer1:(CΔ1)GCTGGTACCCGTCGCCCTCCGGTA序列号3
Reverse primer2:(CΔ2)GCTGGTACCCGCCCTCCGGTAGCT序列号4
Reverse primer3:(CΔ3)GCTGGTACCCCTCCGGTAGCTGCG序列号5
Reverse primer4:(CΔ4)GCTGGTACCCCGGTAGCTGCGCAC序列号6
使用在N末端附加有KpnI限制酶部位、在C末端附加有EcoRI限制酶部位的以下的引物将野生型NLuc的N末端缺损变异体进行扩增。
Forward primer 1:(NΔ1)GCCGGTACCGTCTTCACACTCGAAGATTTCG序列号7
Forward primer 2:(NΔ4)GCCGGTACCCTCGAAGATTTCGTTGGGGAC序列号8
Forward primer 3:(NΔ5)GCCGGTACCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGC序列号9
Reverse primer:ATGAATTCTTACGCCAGAATGCGTTCGCACAG序列号10
将聚合酶链反应(PCR)中扩增的DNA片段利用苯酚·氯仿法提取。UnaG的DNA片段利用BamHI及KpnI进行限制酶处理。NLuc的DNA片段用KpnI及EcoRI进行限制酶处理。琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶将带切出之后进行纯化(QIAEX2,QIAGEN)。将纯化的各片段和利用BamHI、EcoRI进行了限制酶处理的pRSET B载体连接，转化JM109(DE3)株之后，在于10cm培养皿制作的LB琼脂培养基上在37℃下培养一夜。
2.筛选
将菌落生长的琼脂培养基置于室温，加入冷却至室温附近的在1％低熔点琼脂糖凝胶中加入有最终浓度10μM的胆红素的溶液4mL，注入于琼脂培养基上，在室温下固化。接着，从凝胶上加入10μM腔肠素-h溶液，立即利用设置于暗箱的一眼反射式相机(Sonyα7)拍摄，取得菌落的彩色图像。由RGB图像的绿通道(UnaG的发光)和蓝通道(NLuc的发光)图像制作比率图像，拾起比率值高的菌落。接着，将拾起的菌落在96孔板上、在LB培养基+10μM胆红素+100μg/mL氨苄青霉素中在23℃下培养60小时。在培养液中加入10μM coelenterazine，利用荧光分光光度计(FV7000)或酶标仪测量化学发光光谱。以波长450nm标准化，以波长525nm的相对值(比率值)为基础进行筛选。
筛选使C末端缺损变异体UnaG和N末端缺损变异体NLuc在KpnI位点融合的蛋白质。结果，UnaG(CΔ0)和NLuc(NΔ1)的组合(以下，称为"UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白"。)显示最大的荧光共振能量转移(FRET)效率(图1)。该UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白的碱基序列为序列号11，氨基酸序列为序列号12。
3.融合蛋白的接头序列的最佳化
将作为UnaG和NLuc的接头的序列的2残基(GT)利用反向PCR法置换为随机的序列。使用以下的引物。
Forward primer:NNKNNKGTCTTCACACTCGAAGATTTC序列号13
Reverse primer:TTCCGTCGCCCTCCGGTAGCTG序列号14
将含有载体序列的全长扩增后，通过用限制酶DpnI进行处理而将模板质粒进行处理，连接后，转化JM109(DE3)株，在于10cm培养皿制作的LB琼脂培养基上在37℃下培养一夜。用上述2中记述的方法筛选表达的菌落。
4.向融合蛋白的接头序列的插入
在UnaG和NLuc的接头的序列(GT)后，利用反向PCR法插入接头序列。使用以下的引物。
Forward primer(G):GGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC序列号15
Forward primer(GG):GGCGGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC序列号16
Forward primer (GGS):GGCGGCAGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC序列号17
Reverse primer:GGTACCTTCCGTCGCCCTC序列号18
将含有载体序列的全长通过PCR扩增后，通过用限制酶DpnI进行处理而将模板质粒进行处理，连接后，转化JM109(DE3)株，在于10cm培养皿制作的LB琼脂培养基上在37℃下培养一夜。用上述2中记述的方法筛选表达的菌落。
通过利用随机变异插入进行的接头序列最佳化，与野生型的接头序列(GT)相比，(DD)序列显示大的FRET效率的变化(图2)。进而，研究追加有挠性接头的化学发光胆红素指示剂的FRET效率，结果，(GTG)序列显示最大的FRET效率。
5.蛋白质的纯化
将转化到JM109(DE3)株中的UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白在200mL的LB培养基+100μg/mL Carvenisillin溶液中、在23℃下培养60小时。集菌后，利用弗氏压碎法将大肠杆菌破碎，利用使用有Ni-NTA柱(QIAGEN)的亲和性色谱法进行纯化。进而，为了除去过量的咪唑，使用凝胶过滤柱(PD-10,GE HealthCare)。利用Bradford法测量蛋白质浓度。
6.冷冻干燥试样的制作
将纯化的UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白500μL放入于15mL falcon管，利用液氮使其冻结。其后，利用冷冻干燥装置，得到蛋白质溶液的粉末。粉末在室温下保存。
7.滴定曲线的测量
相对于最终浓度5nM的UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白混合0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2.5nM、5nM或10nM的胆红素(BR)溶液及最终浓度5μM腔肠素-h，利用多通道分光器(PMA-12,浜松光电制)或酶标仪测量发光光谱。将其结果的一例示于图3。标绘3次独立的测量的平均值，利用希尔公式进行拟合。Kd值为3.05nM。
另外，冷冻干燥试样制作后，为了研究保持怎样的程度的期间活性，在室温下保存每隔数日将冷冻干燥试样溶解于水而形成的溶液，利用上述7中记述的方法测量胆红素的亲和性。其结果得知：虽然亲和性稍微降低，但是，保持活性(图4)。
8.利用智能手机的测定
在96多孔板上将最终浓度10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、100nM或250nM的胆红素溶液及最终浓度5μM腔肠素-h与最终浓度50nM的融合蛋白进行混合，使用搭载于iPhone(注册商标)6的仪表(Manual-Custom exposure camera)，利用ISO1500、曝光时间0.5秒进行测量。
对在多孔板上制作的融合蛋白及各种各样的浓度的胆红素溶液进行彩色拍摄的结果，成功地测量到溶液由于胆红素浓度依赖而从蓝色变化为绿色的情形(图5)。如图5所示，胆红素为0nM时为化学发光蛋白质的发光色(青色)。随着胆红素浓度增加，变化为UnaG的发光色(绿色)。使用RGB说明颜色的变化的情形的一例时，发光色为0nM(56,133,204)、10nM(79,157,215)、20nM(96,169,209)、30nM(101,164,194)、40nM(119,179,189)、50nM(123,169.156)、100nM(154,187,111)、250nM(158,191,107)。
如果存在图5那样的相关，则可以由发光数据(发光色)算出胆红素浓度。
[实施例2]
相对于一定浓度的胆红素·发光底物(腔肠素-h)溶液，将原液、2倍稀释、4倍稀释或8倍稀释的UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白溶液进行混合，利用多通道分光器(PMA-12，浜松光电制)测量发光光谱，由得到的发光强度算出UnaG的发光波长(530nm)的发光强度和NLuc的发光波长(460nm)的发光强度的比率值(530nm/460nm)。将其结果的一例示于图6。图6中，图6的A是表示化学发光光谱的坐标图，图6的B是表示UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白溶液(检测试剂)的稀释率和比率值(530nm/460nm)的关系的坐标图。
[比较例1]
在96孔板(黑色)上加入UnaG蛋白溶液(8.25nM，16.5nM，31.5nM，62.5nM，125nM或250nM)各50μL，接着加入400nM胆红素溶液各50μL。使用微酶标仪(SH-9000，corona社制)照射450nm的波长的激发光之后，取得荧光光谱。将其结果的一例示于图7。图7中，图7的A是表示荧光光谱的坐标图，图7的B是表示UnaG蛋白溶液(检测试剂)的浓度和UnaG的发光波长(530nm)的荧光强度的关系的坐标图。
比较例1中，如图7的A及B所示，虽然作为检测对象的胆红素的浓度相同，但是，荧光强度因检测试剂的浓度而变化。即，可以说比较例1(使用有UnaG蛋白的方法)不能进行定量的测量。
与此相对，使用UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白进行测量的实施例2中，虽然发光强度因检测试剂的浓度而不同，但是，光谱的波形一定(如图6的A)，如图6的B所示，不管检测试剂的浓度，相对于相同的胆红素浓度的峰值比率值(530nm/460nm)大致相同。因此，可以说，通过使用UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白，可以进行与检测试剂的浓度无关的测定、即定量的测量。
序列号1：正向引物
序列号2：反向引物
序列号3：反向引物
序列号4：反向引物
序列号5：反向引物
序列号6：反向引物
序列号7：正向引物
序列号8：正向引物
序列号9：正向引物
序列号10：反向引物
序列号11：UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合蛋白的碱基序列
序列号12：UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合蛋白的氨基酸序列
序列号13：正向引物
序列号14：反向引物
序列号15：正向引物
序列号16：正向引物
序列号17：正向引物
序列号18：反向引物
序列表
<110> 国立大学法人大阪大学（Osaka University）
<120> 生物体物质的检测方法、用于其的化学发光指示剂该方法中使用的化学发光指示剂
<130> H4531
<150> JP 2017-013463
<151> 2017-01-27
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 1
cgcggatccg ggtggttctg gtatgg 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物0
<400> 2
gctggtacct tccgtcgccc tccg 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物1
<400> 3
gctggtaccc gtcgccctcc ggta 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物2
<400> 4
gctggtaccc gccctccggt agct 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物3
<400> 5
gctggtaccc ctccggtagc tgcg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物4
<400> 6
gctggtaccc cggtagctgc gcac 24
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 1
<400> 7
gccggtaccg tcttcacact cgaagatttc g 31
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 2
<400> 8
gccggtaccc tcgaagattt cgttggggac 30
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 3
<400> 9
gccggtaccg aagatttcgt tggggactgg c 31
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 10
atgaattctt acgccagaat gcgttcgcac ag 32
<210> 11
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UnaG(C 0)-NLuc(N 1)
<400> 11
ggtggttctg gtatggtcga gaaatttgtt ggcacctgga agatcgcaga cagccataat 60
tttggtgaat acctgaaagc tatcggagcc ccaaaggaat taagcgatgg tggggatgcc 120
acgacgccga cattgtacat ctcccagaag gacggagaca aaatgacagt gaaaatagag 180
aatggacctc ctacgttcct tgacactcaa gtaaagttca aattagggga ggagttcgac 240
gaatttcctt ctgatcgaag aaaaggcgta aaatctgtcg tgaacttggt gggagagaag 300
ctggtgtacg tacaaaagtg ggacggcaag gagacgacgt atgtccgaga gataaaggac 360
ggtaaactgg tcgtgacact tacgatggga gacgtcgtgg ctgtgcgcag ctaccggagg 420
gcgacggaag gtaccgtctt cacactcgaa gatttcgttg gggactggcg acagacagcc 480
ggctacaacc tggaccaagt ccttgaacag ggaggtgtgt ccagtttgtt tcagaatctc 540
ggggtgtccg taactccgat ccaaaggatt gtcctgagcg gtgaaaatgg gctgaagatc 600
gacatccatg tcatcatccc gtatgaaggt ctgagcggcg accaaatggg ccagatcgaa 660
aaaattttta aggtggtgta ccctgtggat gatcatcact ttaaggtgat cctgcactat 720
ggcacactgg taatcgacgg ggttacgccg aacatgatcg actatttcgg acggccgtat 780
gaaggcatcg ccgtgttcga cggcaaaaag atcactgtaa cagggaccct gtggaacggc 840
aacaaaatta tcgacgagcg cctgatcaac cccgacggct ccctgctgtt ccgagtaacc 900
atcaacggag tgaccggctg gcggctgtgc gaacgcattc tggcgtaa 948
<210> 12
<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UnaG(C 0)-NLuc(N 1)
<400> 12
Gly Gly Ser Gly Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala
1 5 10 15
Asp Ser His Asn Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys
20 25 30
Glu Leu Ser Asp Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser
35 40 45
Gln Lys Asp Gly Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro
50 55 60
Thr Phe Leu Asp Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp
65 70 75 80
Glu Phe Pro Ser Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu
85 90 95
Val Gly Glu Lys Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr
100 105 110
Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly
115 120 125
Asp Val Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu Gly Thr Val
130 135 140
Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr
145 150 155 160
Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln
165 170 175
Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly
180 185 190
Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly
195 200 205
Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val
210 215 220
Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg
245 250 255
Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr
260 265 270
Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn
275 280 285
Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly
290 295 300
Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala
305 310
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n 是 a, c, g或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> k 是 g或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n 是a, c, g或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> k 是 g或t
<400> 13
nnknnkgtct tcacactcga agatttc 27
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 14
ttccgtcgcc ctccggtagc tg 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 15
ggcgtcttca cactcgaaga tttc 24
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 16
ggcggcgtct tcacactcga agatttc 27
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 17
ggcggcagcg tcttcacact cgaagatttc 30
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 18
ggtaccttcc gtcgccctc 19

Claims (8)

1.一种检测方法，其为试样中的生物体物质的检测方法，其包含：
向所述试样中混合融合蛋白(C)、及化学发光蛋白质(B)的底物，所述融合蛋白(C)为使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)；以及
观察来自所述试样的发光信号，
所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，
所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，
所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，
所述蛋白质(A1)为在结合有胆红素的状态下可发出荧光的UnaG蛋白或其变异体，
检测对象的生物体物质为胆红素。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，
所述蛋白质(A1)为在结合有胆绿素的状态下可发出荧光的、选自由IFP、iRFP、smURFP、及它们的变异体构成的组中的蛋白质，
检测对象的生物体物质为胆绿素。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，
所述蛋白质(A2)为可结合黄素单核苷酸的、选自由FbFP、iLOV蛋白、mini-SOG蛋白、及它们的变异体构成的组中的蛋白质，
检测对象的生物体物质为黄素单核苷酸。
5.一种化学发光指示剂，其含有融合蛋白(C)，所述融合蛋白(C)为使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)，其中，
所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，
所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，
所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
6.根据权利要求5所述的化学发光指示剂，其中，所述化学发光指示剂用于权利要求1～4中任一项所述的检测方法。
7.一种载体或转化体，其可表达权利要求1～4中任一项所规定的融合蛋白(C)。
8.一种试样中的生物体物质的浓度判别方法，其包含：基于用权利要求1～4中任一项所述的检测方法得到的发光信号数据，判别试样中的生物体物质的浓度。
CN201880008839.6A 2017-01-27 2018-01-26 生物体物质的检测方法、该方法中使用的化学发光指示剂 Pending CN110226087A (zh)

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