CN112575052B - 基于Cy5标记配体的NanoBRET受体结合药物筛选系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于Cy5及其衍生物Sulfo‑Cy5荧光标记配体的NanoBRET受体结合高通量药物筛选系统，所述药物筛选系统包括Cy5及其衍生物Sulfo‑Cy5荧光标记配体和表达NanoLuc融合G蛋白偶联受体的工程化细胞。本发明将NanoLuc融合于受体的N端构建NanoLuc融合受体，配对Cy5及其衍生物Sulfo‑Cy5荧光标记的肽类、蛋白质或小分子配体，创立了价廉且灵敏的NanoBRET高通量受体药物筛选系统。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基于Cy5或Sulfo-Cy5标记配体的NanoBRET受体结合药物筛选系统，尤其涉及基于Cy5及其衍生物Sulfo-Cy5荧光标记配体的NanoBRET G蛋白偶联受体结合高通量药物筛选系统。
背景技术
G蛋白偶联受体(GPCRs)是人类基因组中最大的膜蛋白超家族，广泛分布于神经系统、内分泌系统、心血管系统及免疫系统等几乎所有的器官和组织中，介导神经递质和激素的细胞信号转导，参与调节细胞发育、分化和正常的生理功能活动，与多种疾病的发生、发展密切相关。在目前的临床用药中，有约40％的药物作用于GPCRs，但是只有少数的GPCRs具有相应的临床药物(HAUSER,A.S.,CHAVALI,S.,MASUHO,I.,JAHN,L.J.,MARTEMYANOV,K.A.,GLORIAM,D.E.&BABU,M.M.2018.Pharmacogenomics of GPCR Drug Targets.Cell,172,41-54)，因此GPCRs仍然是最重要的药物开发靶点之一(SANTOS,R.,URSU,O.,GAULTON,A.,BENTO,A.P.,DONADI,R.S.,BOLOGA,C.G.,KARLSSON,A.,AL-LAZIKANI,B.,HERSEY,A.,OPREA,T.I.&OVERINGTON,J.P.2017.A comprehensive map of molecular drugtargets.Nature Reviews Drug Discovery,16,19-34.；HAUSER,A.S.,ATTWOOD,M.M.,RASK-ANDERSEN,M.,SCHIOTH,H.B.&GLORIAM,D.E.2017.Trends in GPCR drug discovery:new agents,targets and indications.Nat Rev Drug Discov,16,829-842.；NIETOGUTIERREZ,A.&MCDONALD,P.H.2018.GPCRs:Emerging anti-cancer drugtargets.Cellular Signaling,41,65-74.)。目前靶向GPCRs的药物研发正在进一步加速。
新药研发的关键问题之一是开发创新的高通量配体鉴定方法，以发现小分子化合物、多肽或蛋白质与受体的结合特性及其药理活性。传统的放射性配体受体结合实验由于存在放射性危害，需要过滤、洗涤去除游离的放射性配体，不适用于高通量药物筛选。时间分辨荧光能量共振转移(TR-FRET)是近年来新兴的受体结合分析技术(EMAMI-NEMINI,A.,ROUX,T.,LEBLAY,M.,BOURRIER,E.,LAMARQUE,L.,TRINQUET,E.&LOHSE,M.J.2013.Time-resolved fluorescence ligand binding for G protein–coupled receptors.NatureProtocols,8,1307.)。Cisbio公司的Tag-Lite专利技术将SNAP融合到GPCRs的N末端，形成SNAP-GPCRs，而SNAP可被含有镧系元素铽的荧光基团(Lumi4-Tb)共价标记，从而在细胞膜上得到荧光标记的受体，通过检测激发受体的荧光基团与加入的荧光配体之间的FRET信号，来测定受体与配体的结合能力。但是这一方法也存在一些缺陷，如费用高昂、本底值高，另外分子内激发过程(电子转移、FRET、光漂白)以及化合物或蛋白的荧光外部相互作用会对受体或配体产生淬灭效应等，限制了它的广泛应用。
NanoBRET是Promega公司于2015年推出的用于检测蛋白质间相互作用的最新技术。与上述荧光共振能量转移技术(FRET)相比，生物发光共振能量转移技术(BRET)存在诸多优点：无需激发光，背景/本底值低，有效避免了光漂白和自发荧光等问题，是目前为数不多的能够用于研究细胞内分子间相互作用的技术。NanoBRET技术的出现，完美解决了传统BRET技术的应用痛点(如RLuc光输出量低，存在较高光谱重叠所致的高背景/检测噪音等)。NanoBRET使用分子量仅为19kDa(171个氨基酸)的NanoLuc荧光素酶作为能量供体，配合Promega配套的618荧光基团(可与融合的HaloTag蛋白结合)受体，NanoLuc供体发出明亮的蓝移发光信号(比RLuc高两个数量级)，耦合到远红移的HaloTag受体上，光谱叠加效果佳、信号强，比传统BRET的本底值更低(MACHLEIDT,T.,WOODROOFE,C.C.,SCHWINN,M.K.,,J.,ROBERS,M.B.,ZIMMERMAN,K.,OTTO,P.,DANIELS,D.L.,KIRKLAND,T.A.&WOOD,K.V.2015.NanoBRET—A Novel BRET Platform for the Analysis of Protein–Protein Interactions.ACS Chemical Biology,10,1797-1804.)，显著提高了检测灵敏度，非常适合细胞水平蛋白质相互作用的研究。最近NanoBRET已被成功用于检测GPCRs与不同G蛋白的偶联效应(MASUHO,I.,OSTROVSKAYA,O.,KRAMER,G.M.,JONES,C.D.,XIE,K.&MARTEMYANOV,K.A.2015.Distinct profiles of functional discrimination among Gproteins determine the actions of G protein–coupled receptors.ScienceSignaling,8,ra123-ra123.)以及β肾上腺素受体与BODIPY-630/650标记的β肾上腺素受体小分子拮抗剂之间的结合特性(STODDART,L.A.,JOHNSTONE,E.K.M.,WHEAL,A.J.,GOULDING,J.,ROBERS,M.B.,MACHLEIDT,T.,WOOD,K.V.,HILL,S.J.&PFLEGER,K.D.G.2015.Application of BRET to monitor ligand binding to GPCRs.Nat Meth,12,661-663.)。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了基于Cy5及其衍生物Sulfo-Cy5荧光标记配体的NanoBRET受体结合高通量药物筛选系统，以Cy5或其衍生物Sulfo-Cy5荧光标记多肽作为配体，与N端融合表达NanoLuc标签的受体相互结合，建立了受体高通量药物筛选系统，实现了灵敏且廉价的受体高通量药物筛选。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种药物筛选系统，所述药物筛选系统包括荧光标记配体和表达NanoLuc融合受体的工程化细胞。
本发明中，将NanoLuc融合表达于受体的N端构建NanoLuc融合受体，配合荧光标记的肽类/蛋白质配体或小分子配体，构建得到价廉且灵敏的NanoBRET高通量受体药物筛选系统。
优选地，所述药物筛选系统包括荧光标记配体和表达NanoLuc融合G蛋白偶联受体的工程化细胞，所述配体包括G蛋白偶联受体的激动剂和/或拮抗剂。
优选地，所述荧光标记配体的荧光标记基团包括Cy5及其衍生物Sulfo-Cy5。
本发明中，以G蛋白偶联受体为模型，构建了Sulfo-Cy5荧光标记G蛋白偶联受体的配体和表达NanoLuc融合G蛋白偶联受体的工程化细胞，组成G蛋白偶联受体药物筛选模型，其中，NanoLuc融合G蛋白偶联受体表达于工程化细胞表面，Sulfo-Cy5荧光标记G蛋白偶联受体的配体通过与受体结合，构建了NanoBRET药物筛选技术，Cy5荧光标记配体还可用于实现组织和细胞中的G蛋白偶联受体分布、定位和受体动力学的活细胞成像。
优选地，所述Cy5荧光标记配体包括Sulfo-Cy5荧光标记改造型促性腺激素释放激素或Sulfo-Cy5荧光标记Kisspeptin及其变体，所述Kisspeptin变体例如可以是Kisspeptin-10或Kisspeptin-18。
优选地，将野生型促性腺激素释放激素I的第六位Gly取代改变为D-Lys，并在D-Lys6的ε-amino基团上连接生物发光共振能量转移基团Sulfo-Cy5，得到Sulfo-Cy5荧光标记改造型促性腺激素释放激素。
优选地，所述Sulfo-Cy5荧光标记改造型促性腺激素释放激素的结构式如式I所示；
优选地，所述NanoLuc融合G蛋白偶联受体包括NanoLuc融合促性腺激素释放激素受体或NanoLuc融合G蛋白偶联受体54，优选为NanoLuc融合人突变型促性腺激素释放激素受体。
优选地，所述NanoLuc融合表达在所述G蛋白偶联受体的N端。
优选地，所述NanoLuc融合人突变型促性腺激素释放激素受体为NanoLuc融合表达在第191位赖氨酸缺失突变型促性腺激素释放激素受体的N端。
优选地，所述Sulfo-Cy5荧光标记促性腺激素释放激素配体在所述药物筛选系统中的终浓度为1～50nM，例如可以是1nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM或50nM，优选为10～20nM。
优选地，所述表达NanoLuc融合受体的工程化细胞在所述药物筛选系统中的终浓度为5×105～5×106个细胞/mL，150μL/孔(96孔板)。
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的药物筛选系统的制备方法，所述制备方法包括人工合成Sulfo-Cy5荧光标记配体，并构建表达NanoLuc融合受体的工程化细胞。
优选地，所述表达NanoLuc融合受体的工程化细胞的构建方法包括将含有NanoLuc融合受体编码基因的重组载体导入哺乳动物细胞的步骤。
优选地，所述含有NanoLuc融合受体编码基因的重组载体的构建方法包括以下步骤：
(1)将受体编码基因连接入含有NanoLuc编码基因的质粒中，使所述受体编码基因位于所述NanoLuc编码基因的下游，构建第一重组载体；
(2)对第一重组载体进行酶切处理，以酶切产物为模板、采用引物进行PCR反应，将NanoLuc和受体编码基因之间的载体序列替换为接头序列(4～10个Gly-Ser氨基酸序列)，将扩增产物插入表达载体，构建第二重组载体；
(3)将分泌(Sec)信号肽编码基因连接入第二重组载体，使所述信号肽编码基因位于所述NanoLuc和受体编码基因的上游，构建第三重组载体；
(4)对第三重组载体进行酶切处理，以酶切产物为模板、采用引物进行PCR反应，将扩增产物插入表达载体，得到含有NanoLuc融合受体编码基因的重组载体。
第三方面，本发明提供了一种药物筛选试剂盒，所述药物筛选试剂盒包括第一方面所述的药物筛选系统。
优选地，所述药物筛选试剂盒还包括荧光素酶底物。
优选地，所述试剂盒还包括缓冲液和/或黑色96孔板。
第四方面，本发明提供了一种药物筛选方法，所述药物筛选方法包括：
将不同浓度的待筛选药物加入第一方面所述的药物筛选系统中，孵育完成后加入荧光素酶底物，根据荧光标记配体的荧光强度与NanoLuc融合受体化学发光强度的比例确定待筛选药物的抑制常数。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将NanoLuc荧光素酶融合于促性腺激素释放激素受体N端，在保证受体固有生物活性的前提下，表达于工程化细胞表面，与Sulfo-Cy5荧光标记配体相结合，构建了基于NanoBRET的高通量受体药物筛选系统，所述药物筛选系统光谱叠加效果佳、本底信号低、信号强、灵敏度高；
(2)本发明以G蛋白偶联受体人类促性腺激素受体为模型，构建了Sulfo-Cy5荧光标记促性腺激素释放激素配体，具有生物活性，可以应用于实现组织和细胞中的G蛋白偶联受体分布、定位和受体动力学的活细胞成像；
(3)本发明基于G蛋白偶联受体药物筛选模型，NanoLuc融合G蛋白偶联受体与Cy5荧光标记配体发生生物发光共振能量转移，发出了可检测的BRET信号，两者相互配合形成G蛋白偶联受体药物筛选系统，成功检测到不同G蛋白偶联受体抑制剂的抑制常数，基于NanoBRET药物筛选技术实现了高通量、灵敏、准确的G蛋白偶联受体药物筛选；在G蛋白偶联受体药物筛选领域具有重要及广泛的应用前景。
附图说明
图1为[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与HEK293细胞表达的大鼠GnRH受体的饱和结合曲线；
图2为GnRH I对[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与HEK293细胞表达的大鼠GnRH受体的竞争结合抑制曲线；
图3A为[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与hGnRHR结合的共聚焦图，图3B为[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与hGnRHR的结合受到GnRH I的完全抑制；
图4为[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与HEK293细胞瞬时表达的SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的NanoBRET饱和结合曲线；
图5为[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与HEK293细胞稳定表达的SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的NanoBRET饱和结合曲线；
图6为GnRH及GnRH拮抗剂(Cetrorelix)对[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与HEK293细胞稳定表达的SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的NanoBRET竞争结合曲线；
图7为Sulfo-Cy5-Kisspeptin 18与HEK293细胞瞬时表达的SecNanoLuc-hGPR54的NanoBRET饱和结合曲线；
图8为Kisspeptin-10对Sulfo-Cy5-Kisspeptin 18与HEK293细胞瞬时表达的SecNanoLuc-hGPR54的NanoBRET竞争结合曲线。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其应用效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 Sulfo-Cy5荧光标记配体的设计
本实施例将促性腺激素释放激素受体(GnRH-R)的内源性配体促性腺激素释放激素I(GnRH I)的第六位Gly取代为D-Lys，并在D-Lys6的ε-amino基团上连接生物发光共振能量转移基团Sulfo-Cy5，得到具有高受体亲和力和药理活性的GnRH荧光标记多肽[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH(pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(-Sulfo-Cy5)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，结构式如式I所示，其中，pyroGlu为焦谷氨酸(pyroglutamic acid)。
实施例2 Sulfo-Cy5荧光标记配体的受体结合活性检测
培养稳定表达大鼠GnRH受体的HEK293细胞，待细胞密度达到80％以上时，吸弃培养基，用PBS清洗细胞一次，吸弃PBS；加入适量胰酶消化细胞形成细胞悬液，吹打形成单细胞悬液，进行细胞计数；将200μL单细胞悬液加入到底部透明、周围不透光的黑色96孔细胞培养板中，使每孔的细胞数为5×104个细胞；
24小时后，总结合实验组加入100μL不同浓度的Sulfo-Cy5荧光标记配体[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH，非特异性组同时加入100倍过量的GnRH I，用PBS调节到相同体积，每点设置3复孔，4℃孵育4h，孵育完成后用4℃ PBS缓冲液洗涤细胞去除游离配体，置于酶标仪中于640nm激发光，测定680nm处发射荧光强度。
如图1所示，稳定表达大鼠GnRH受体的HEK293细胞与不同浓度的[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH在4℃下孵育4h，荧光强度逐渐增加，并且达到饱和，证明[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和GnRH受体的结合为特异性结合；在不存在未标记GnRH I的条件下测定总结合，在另加100倍过量GnRH I的条件下测定非特异性结合，从总结合中减去非特异性结合获得[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和GnRH受体的特异性结合，经Graphpad分析，显示[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和GnRH受体的结合解离常数(Kd)为2.67±0.91nM。
本实施例向稳定表达大鼠GnRH受体的HEK293细胞中，加入100μL[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH(终浓度为10nM)和等体积的不同浓度的GnRH I(0nM～10μM)，每个浓度设置3复孔，4℃下孵育4小时，孵育完成后用4℃ PBS缓冲液洗涤细胞去除游离配体，置于酶标仪中，检测GnRH I对[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与大鼠GnRH受体特异性结合的竞争抑制作用。如图2所示，经Graphpad分析，GnRH I的抑制常数(Ki)为9.46±2.78nM。
实施例3 SecNanoLuc标记受体的设计与构建
人类促性腺激素释放激素受体(hGnRH-R)为七次跨膜蛋白，通过在其N端连接分泌信号肽Sec和生物发光共振能量转移供体蛋白纳米荧光素酶(NanoLuc)，构建SecNanoLuc标记的hGnRH-R，具体包括以下步骤：
(1)配制表1所示的酶切体系，利用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切含有HA-hGnRH-R基因的重组pcDNA3.1(+)和pNLF1-N.CMV Hygro载体(Promega)，酶切后在1×TAE缓冲液中、120V电泳40min，纯化回收得到HA-hGnRH-R基因和线性化pNLF1-N.CMV Hygro载体；
表1
(2)配制表2所示的连接体系，16℃孵育1h，将HA-hGnRH-R基因连接至pNLF1-N.CMVHygro载体(Promega)的EcoRI和XbaI位点之间，获得含有融合蛋白NanoLuc-GnRH-R编码基因的重组载体；
表2
| 成分 | 用量 |
| HA-hGnRH-R基因 | 3.5μL |
| 线性化pNLF1-N.CMV Hygro载体 | 1.5μL |
| DNA连接酶和缓冲液 | 5μL |
(3)将步骤(2)的重组载体经过NheI、EcoRI和XbaI限制性内切酶处理后作为模板，利用SEQ ID NO:1～4所示的引物进行重叠延伸聚合酶链式反应(overlap extension PCR)(共进行3次PCR，第一次PCR的引物为SEQ ID NO:1&2、模板为NheI和EcoRI酶切产物，第二次PCR的引物为SEQ ID NO:3&4、模板为EcoRI和XbaI酶切产物，第三次PCR的引物为SEQ IDNO:1&4、模板为前两次PCR产物)，体系如表3所示，条件为95℃预变性120s，95℃变性20s、60℃退火30s、72℃延伸30s、30次循环，72℃延伸180s，4℃保存；
对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，纯化回收电泳产物，经NheI和XbaI双酶切后连接回载体，将NanoLuc和GnRH-R之间的载体序列替换为连接肽GGGS的编码序列；
SEQ ID NO:1：
5’-CGCGCGCGCTAGCTAGCGCTCACCATGGTCTTC-3’；
SEQ ID NO:2：
5’-GGAGAGGCACTGTTTGCCATGGATCCACCTCCCGCCAGAATGCGTTCGC-3’；
SEQ ID NO:3：
5’-GCGAACGCATTCTGGCGGGAGGTGGATCCATGGCAAACAGTGCCTCTCC-3’；
SEQ ID NO:4：
5’-CGCGCGCGCGTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCC-3’；
表3
(4)将分泌信号肽从Sec pNLF1-secN.CMV Hygro载体(Promega)中通过NheI和SanDI限制性内切酶克隆至NanoLuc-GnRH-R的N端，获得含有融合蛋白SecNanoLuc-GnRH-R编码基因的重组载体；
(5)将步骤(4)的重组载体经过NheI、EcoRI和XbaI限制性内切酶处理后作为模板，利用SEQ ID NO:5～8所示的引物进行重叠延伸聚合酶链式反应(overlap extension PCR)(共进行3次PCR，第一次PCR的引物为SEQ ID NO:5&6、模板为NheI和EcoRI酶切产物，第二次PCR的引物为SEQ ID NO:7&8、模板为EcoRI和XbaI酶切产物，第三次PCR的引物为SEQ IDNO:5&8、模板为前两次PCR产物)；
对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，纯化回收电泳产物，经PflMI和XbaI双酶切后连接回载体，最终获得含有融合蛋白SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ(GnRH-R赖氨酸191切除(K191Δ))编码基因的重组载体；
SEQ ID NO:5：
5’-GCGCGCGCGCATGGGATGTGGAACATTACAGTCC-3’；
SEQ ID NO:6：
5’-CACATTGAGAGAAAACTGTCTGTCCAGAGCTGTC-3’；
SEQ ID NO:7：
5’-GACAGCTCTGGACAGACAGTTTTCTCTCAATGTG-3’；
SEQ ID NO:8：
5’-CGCGCGCGCGGAAGGACCCGTGTCAGGG-3’。
实施例4[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ在细胞内定位
向稳定表达人类促性腺激素释放激素受体(hGnRH-R)的HEK293细胞中加入10nM[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH，利用LSM880荧光显微镜(Zeiss)观察[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH在稳定转染SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的HEK293细胞中的定位。
结果如图3A和图3B所示，转染有SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ重组载体的HEK293细胞膜上表达融合蛋白受体SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ，荧光标记配体[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH可以与HEK293细胞膜上的SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ结合，并且这种结合可以被1μM非标记天然配体GnRH I完全抑制。
这些结果表明，荧光标记配体[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与hGnRH-R特异性结合，融合蛋白受体SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ表达定位正确，可用于进一步BRET实验。
实施例5基于NanoBRET测定hGnRH-R与配体的结合
利用Fugene HD将SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ重组载体瞬时转染至HEK293细胞中，48小时后吸弃培养基，用PBS清洗一至两次，吸弃PBS；加入1mL PBS在每一6孔板中，使细胞从皿底脱离形成细胞悬液，吹打形成单细胞悬液，进行细胞计数；将100μL单细胞悬液加入到底部不透明、周围不透光的黑色96孔板中，使每孔的细胞数为5×104个细胞；
总结合实验组加入50μL不同浓度的荧光配体[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH，非特异性结合组同时加入100倍过量的GnRH I，用PBS调整至相同体积，每个浓度均为3复孔，孵育后加入荧光素酶底物复立玛津(furimazine)至终浓度为5μM，上机测定BP 460～80nm和LP610nm两处发射光强度，根据LP 610nm发射光强度/BP 460～80nm发射光强度计算得到BRET比值。
如图4所示，将SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ重组载体瞬时转染入HEK293后，与不同浓度的[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH在37℃下孵育30min，BRET比值逐渐增加，说明[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和NanoLuc可以产生能量共振转移；随着配体[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH浓度的增加，BRET比值逐渐增加，并且达到饱和，证明[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的结合为特异性结合；在不存在未标记GnRH I的条件下测定总结合，在另加100倍过量GnRH I的条件下测定非特异性结合，非特异性结合很低，从总结合中减去非特异性结合获得[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的特异性结合，经Graphpad分析，显示[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的结合解离常数(Kd)为5.54±3.41nM。
本实施例进一步利用HEK293细胞稳定表达SecNanoLuc-hGnRH-R-K191Δ，测定不同浓度的[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH与SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的结合特性。
如图5所示，经Graphpad分析，显示[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的结合解离常数(Kd)为1.61±0.40nM。
本实施例进一步利用HEK293细胞稳定表达SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ，检测GnRHI(0.3nM～1μM)、GnRH II(0.3nM～1μM)或GnRH拮抗剂Cetrorelix(0.03nM～0.3μM)对[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH(10nM)与SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ特异性结合的竞争抑制作用：将25μL配体[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和25μL GnRH I、GnRH II或Cetrorelix加入到稳定表达SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的HEK293细胞中，4℃孵育4h，孵育完成后在室温下加入荧光素酶底物复立玛津(furimazine)(终浓度5μM)，立即测量化学发光及荧光强度。
如图6所示，经Graphpad分析，GnRH I的Ki值为5.48±0.81nM，GnRH II的Ki值为77.2±19.4nM，Cetrorelix的Ki值为4.42±0.25nM。这一结果表明，[Sulfo-Cy5-D-Lys6]GnRH和稳定表达SecNanoLuc-hGnRHR-K191Δ的HEK293细胞可应用于药物筛选领域，在96孔微量板中进行NanoBRET高通量检测，而无须洗涤操作。
实施例6基于NanoBRET测定人类GPR54(hGPR54)与配体的结合
本实施例将Sulfo-Cy5荧光标记配体Kisspeptin进一步应用于检测与hGPR54的结合，Sulfo-Cy5荧光标记配体与SecNanoLuc融合的受体配对，光谱叠加效果佳、信号强，与传统的BRET相比背景值低，数据窗口宽，检测效果出众。
利用Fugene HD将SecNanoLuc-hGPR54重组载体瞬时转染至HEK293细胞中，48小时后吸弃培养基，用PBS清洗一至两次，吸弃PBS；加入1mL PBS在每一6孔板中，使细胞从皿底脱离形成细胞悬液，吹打形成单细胞悬液，进行细胞计数；将100μL单细胞悬液加入到底部不透明、周围不透光的黑色96孔板中，使每孔的细胞数为5×104个细胞；
总结合实验组加入50μL不同浓度的配体Sulfo-Cy5-Kisspeptin-18，非特异性结合组同时加入100倍过量的Kisspeptin-10，用PBS调整至相同体积，每个浓度均为3复孔，孵育后加入荧光素酶底物复立玛津(furimazine)至终浓度为5μM，上机测定BP 460～80nm和LP 610nm两处发射光强度，根据LP 610nm发射光强度/BP 460～80nm发射光强度计算得到BRET比值。
如图7所示，将SecNanoLuc-hGPR54重组载体瞬时转染入HEK293细胞后，与不同浓度的Sulfo-Cy5-Kisspeptin-18在4℃下孵育4h，BRET比值逐渐增加，说明Sulfo-Cy5-Kisspeptin-18和NanoLuc可以产生能量共振转移；在不存在未标记Kisspeptin-10的条件下测定总结合，在另加100倍过量Kisspeptin-10的条件下测定非特异性结合，从总结合中减去非特异性结合确定Sulfo-Cy5-Kisspeptin-18和SecNanoLuc-hGPR54的特异性结合，经Graphpad分析，显示Sulfo-Cy5-Kisspeptin-18和SecNanoLuc-hGPR54的结合解离常数(Kd)为0.70±0.08μM。
本实施例进一步利用HEK293细胞瞬时表达SecNanoLuc-hGPR54，检测不同浓度Kisspeptin-10对Sulfo-Cy5-Kisspeptin-18(100nM)和SecNanoLuc-hGPR54特异性结合的竞争抑制作用：将25μL配体Sulfo-Cy5-Kisspeptin-18(100nM)和25μL Kisspeptin-10(100nM to 10μM)加入到细胞中，4℃下孵育4小时，孵育完成后在室温下加入荧光素酶底物复立玛津(furimazine)(终浓度5μM)，立即测量化学发光与荧光强度。
如图8所示，经Graphpad分析，Kisspeptin-10的Ki值为2.2nM。
综上所述，本发明将NanoLuc融合G蛋白偶联受体和Cy5荧光标记配体相互配合，构建G蛋白偶联受体高通量药物筛选系统，基于NanoBRET药物筛选技术实现了高通量、灵敏、准确的G蛋白偶联受体药物筛选，在G蛋白偶联受体药物筛选领域具有重要意义和广泛的应用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 西交利物浦大学
<120> 基于Cy5标记配体的NanoBRET受体结合药物筛选系统
<130> 20201214
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcgcgcgct agctagcgct caccatggtc ttc 33
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggagaggcac tgtttgccat ggatccacct cccgccagaa tgcgttcgc 49
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgaacgcat tctggcggga ggtggatcca tggcaaacag tgcctctcc 49
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcgcgcgcg tctagatgca tgctcgagcg gcc 33
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcgcgcgcgc atgggatgtg gaacattaca gtcc 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacattgaga gaaaactgtc tgtccagagc tgtc 34
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gacagctctg gacagacagt tttctctcaa tgtg 34
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgcgcgcgcg gaaggacccg tgtcaggg 28
Claims (11)
1.一种药物筛选系统，其特征在于，包括荧光标记配体和表达NanoLuc融合G蛋白偶联受体的工程化细胞；
所述荧光标记配体的荧光标记基团为Sulfo-Cy5；
所述Sulfo-Cy5荧光标记的配体为Sulfo-Cy5荧光标记改造型促性腺激素释放激素；
所述Sulfo-Cy5荧光标记改造型促性腺激素释放激素的结构式如式I所示；
式I；
所述NanoLuc融合G蛋白偶联受体为NanoLuc融合促性腺激素释放激素受体；
所述Sulfo-Cy5荧光标记的配体在所述药物筛选系统中的终浓度为1~50 nM；
所述NanoLuc融合在所述G蛋白偶联受体的N端。
2.根据权利要求1所述的药物筛选系统，其特征在于，所述NanoLuc融合G蛋白偶联受体为NanoLuc融合人突变型促性腺激素释放激素受体；
所述NanoLuc融合人突变型促性腺激素释放激素受体为NanoLuc融合在第191位赖氨酸缺失突变型促性腺激素释放激素受体的N端。
3.根据权利要求1所述的药物筛选系统，其特征在于，所述NanoLuc融合G蛋白偶联受体为NanoLuc融合G蛋白偶联受体54；
所述荧光标记的配体为Sulfo-Cy5荧光标记Kisspeptin-18。
4.根据权利要求1所述的药物筛选系统，其特征在于，所述表达NanoLuc融合G蛋白偶联受体的工程化细胞在所述药物筛选系统中的终浓度为5×105~5×106个细胞/mL。
5.一种权利要求1-4任一项所述的药物筛选系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括人工合成Sulfo-Cy5荧光标记配体，并构建表达NanoLuc融合受体的工程化细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述表达NanoLuc融合受体的工程化细胞的构建方法包括将含有NanoLuc融合受体编码基因的重组载体导入哺乳动物细胞的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含有NanoLuc融合受体编码基因的重组载体的构建方法包括以下步骤：
（1）将受体编码基因连接入含有NanoLuc编码基因的质粒中，使所述受体编码基因位于所述NanoLuc编码基因的下游，构建第一重组载体；
（2）对第一重组载体进行酶切处理，以酶切产物为模板、采用引物进行PCR反应，将NanoLuc和受体编码基因之间的载体序列替换为接头序列，将扩增产物插入表达载体，构建第二重组载体；
（3）将分泌信号肽编码基因连接入第二重组载体，使所述信号肽编码基因位于所述NanoLuc和受体编码基因的上游，构建第三重组载体；
（4）对第三重组载体进行酶切处理，以酶切产物为模板、采用引物进行PCR反应，将扩增产物插入表达载体，得到含有NanoLuc融合受体编码基因的重组载体。
8.一种药物筛选试剂盒，其特征在于，所述药物筛选试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的药物筛选系统。
9.根据权利要求8所述药物筛选试剂盒，其特征在于，所述药物筛选试剂盒还包括荧光素酶底物。
10.根据权利要求8所述药物筛选试剂盒，其特征在于，所述药物筛选试剂盒还包括缓冲液和/或黑色96孔板。
11.一种G蛋白偶联受体药物筛选方法，其特征在于，所述药物筛选方法包括：将不同浓度的待筛选药物加入权利要求1-4任一项所述的药物筛选系统中，孵育完成后加入荧光素酶底物，根据荧光标记配体的荧光强度与NanoLuc融合受体化学发光强度的比例确定待筛选药物的抑制常数。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011479932.0A CN112575052B (zh) | 2020-12-15 | 基于Cy5标记配体的NanoBRET受体结合药物筛选系统 |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN112575052A CN112575052A (zh) | 2021-03-30 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110835641A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-02-25 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 基于nanoBRET的促蛋白泛素化降解药物筛选系统及方法 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110835641A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-02-25 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 基于nanoBRET的促蛋白泛素化降解药物筛选系统及方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| "NanoBRET approaches to study ligand binding to GPCRs and RTKs";Leigh A Stoddart, 等;Trends Pharmacol Sci.;第39卷(第2期);摘要，第1-2、5-6页，Box 1，图1 * |
| Leigh A Stoddart,等."NanoBRET approaches to study ligand binding to GPCRs and RTKs".Trends Pharmacol Sci..2017,第39卷(第2期),摘要，第1-2、5-6页，Box 1，图1. * |
| Shun Huang,等."Synthesis and evaluation of 18F-labeled peptide for gonadotropin-releasing hormone receptor imaging".Constrast Media Mol Imaging.2019,摘要，图2. * |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |