JP2002524087A - インビボにおいてタンパク質相互作用を調べる方法 - Google Patents

インビボにおいてタンパク質相互作用を調べる方法

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JP2002524087A JP2000569011A JP2000569011A JP2002524087A JP 2002524087 A JP2002524087 A JP 2002524087A JP 2000569011 A JP2000569011 A JP 2000569011A JP 2000569011 A JP2000569011 A JP 2000569011A JP 2002524087 A JP2002524087 A JP 2002524087A
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アラダー エイ． スザレイ，
ユバオ ワン，
ゲフ ワン−プルスキ，
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ローマ リンダ ユニバーシティー
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Abstract

(57)【要約】 生細胞内において第１のタンパク質が第２のタンパク質と相互作用するか否かを決定する方法。この方法は、生細胞内においてドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質およびアクセプター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を提供する工程を包含する。複合体化した第１のタンパク質および複合体化した第２のタンパク質は、生細胞内においてお互いに近接することを、可能とされる。次いで、ドナールシフェラーゼからのルミネセンス共鳴エネルギー移動から生じるアクセプター発蛍光団からの任意の蛍光を検出する。アクセプター発蛍光団からの蛍光は、第１のタンパク質が第２のタンパク質と相互作用したことを示す。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （背景） 生細胞内でのタンパク質間の相互作用の研究は、タンパク質の機能およびその
作用機序を理解するために、しばしば必要である。これらの相互作用は、免疫沈
降、酵母ツーハイブリッド方法、およびβ−ｇａｌ相補法を使用して、現在研究
される。
【０００２】 しかし、これらの方法は、いくつかの不利な点を伴う。例えば、これらの方法
は、擬陽性を伴う。第２に、これらの方法は、相互作用に関する定量的情報の決
定を可能にしない。さらに、これらの方法は、インビボにおけるリアルタイムの
相互作用のモニターリングを可能にしない。
【０００３】 従って、これらの不利な点を有さない、インビボにおいてタンパク質間の相互
作用を研究する別の方法を有することは、有利である。さらに好ましくは、この
方法を、広範に種々のタンパク質とともに、広範に種々の生細胞内において使用
し得る。また好ましくは、この方法を使用して、タンパク質以外の分子間の相互
作用を決定し得る。
【０００４】 （要旨） 本願発明の１つの実施態様に従って、生細胞内で第１のタンパク質が第２のタ
ンパク質と相互作用するか否かを決定する方法を提供する。この方法は、生細胞
内において、ドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質、およびア
クセプター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質とを提供する工程を包含す
る。ドナールシフェラーゼは、第１のタンパク質が第２のタンパク質の近傍にあ
る場合、アクセプター発蛍光団にルミネセンス共鳴エネルギー移動し得る。次い
で、複合体化した第１のタンパク質および複合体化した第２のタンパク質が、生
細胞内においてお互いに近傍に来ることを可能にする。次に、アクセプター発蛍
光団由来の任意の蛍光を検出する。ドナールシフェラーゼからアクセプター発蛍
光団へのルミネセンス共鳴エネルギー移動から生じるアクセプター発蛍光団の蛍
光は、第１のタンパク質が第２のタンパク質と相互作用したことを示す。
【０００５】 好ましい実施態様において、ドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタン
パク質およびアクセプター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を提供する
工程は、ＤＮＡを遺伝子操作すること、遺伝子操作されたＤＮＡを生細胞に移入
すること、ドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質およびアクセ
プター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質をその細胞に産生させること、
を包含する。特に好ましい実施態様において、ドナールシフェラーゼと複合体化
した第１のタンパク質が提供される細胞、およびアクセプター発蛍光団と複合体
化した第２のタンパク質が提供される細胞は、哺乳動物細胞である。
【０００６】 別の好ましい実施態様において、提供されるドナールシフェラーゼは、Ｒｅｎ
ｉｌｌａルシフェラーゼである。なお別の好ましい実施態様において、提供され
るアクセプター発蛍光団は、Ａｅｑｕｏｒｅａグリーン蛍光タンパク質である。
【０００７】 特に好ましい実施態様において、アクセプター発蛍光団の蛍光の検出は、分光
蛍光分析を使用して行われる。
【０００８】 （説明） 本発明は、ルミネセンス共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）を使用して、生細胞
内において、第１のタンパク質が第２のタンパク質と相互作用するか否かを決定
する方法を含む。ルミネセンス共鳴エネルギー移動は、ドナールシフェラーゼか
らアクセプター発蛍光団への励起状態エネルギーの移動より生じる。ＬＲＥＴを
生じさせるために、ドナールシフェラーゼの発光スペクトルとアクセプター発蛍
光団の励起スペクトル間の重複がなければならない。
【０００９】 ルミネセンス共鳴エネルギー移動の効率は、他の変化可能なもののなかでも、
ドナールシフェラーゼとアクセプター発蛍光団を隔てる距離に依存する。一般に
、有意なエネルギー移動は、ドナールシフェラーゼおよびアクセプター発蛍光団
がお互いに約８０Å未満である場合にのみ、生じる。この近距離は、従来の顕微
鏡を使用する２つの実体間での、光学的な解像度のために必要な距離よりも、か
なり短い。従って、ドナールシフェラーゼとアクセプター発蛍光団との間のルミ
ネセンス共鳴エネルギー移動の検出は、ドナールシフェラーゼおよびアクセプタ
ー発蛍光団が、ＬＲＥＴが生じるのに必要な距離内（すなわち、お互いに約８０
Å未満）に来たことを示す。
【００１０】 本発明は、ルミネセンス共鳴エネルギー移動を利用して、生細胞内において、
第１のタンパク質と第２のタンパク質との間で相互作用が生じるか否かを決定す
る。このことは、第１のタンパク質をドナールシフェラーゼと複合体化させ、そ
して第２のタンパク質をアクセプター発蛍光団と複合体化させ、そして第１のタ
ンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用が生じるのに適切な条件下で生細
胞内に複合体化した第１のタンパク質および複合体化第２のタンパク質を配置す
ることによって、達成される。第１のタンパク質が第２のタンパク質と相互作用
する場合、ドナールシフェラーゼが、アクセプター発蛍光団に対して、ルミネセ
ンス共鳴エネルギー移動を生じるのに十分近接し、そしてアクセプター発蛍光団
が蛍光を発する。それによって、アクセプター発蛍光団からの蛍光の検出は、第
１のタンパク質が第２のタンパク質と相互作用したことを示す。有利なことに、
この方法は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用が従来の顕微鏡
のような光学的方法によって検出され得ない場合であっても、その相互作用の検
出を可能にする。
【００１１】 本発明に従って、２つのタンパク質間の相互作用を検出するためにルミネセン
ス共鳴エネルギー移動を使用することには、いくつかの利点がある。第１に、蛍
光色素の生細胞内への導入が非常に困難である場合、生細胞内のタンパク質の特
異的標識が、遺伝子操作方法を介して達成され得る。さらに、蛍光色素は急速に
光退色するが、ルシフェラーゼ（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）の発
光は酵素反応から生じ、この発光は、基質および酸素が供給されれば、比較的安
定である。
【００１２】 本開示において使用する場合、「第１のタンパク質をドナールシフェラーゼと
複合体化する」とは、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の
間に、ドナールシフェラーゼおよび第１のタンパク質が、お互いに実質的に同一
の近傍にとどまる様式において、ドナールシフェラーゼを第１のタンパク質に結
合することをいう。同様に、「第２のタンパク質をアクセプター発蛍光団と複合
体化する」とは、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の間に
、アクセプター発蛍光団および第２のタンパク質が、お互いに実質的に同一の近
傍にとどまる様式において、アクセプター発蛍光団を第２のタンパク質に結合す
ることをいう。そのような複合体化は、例えば、細胞を遺伝子操作して、ドナー
ルシフェラーゼと第１のタンパク質、およびアクセプター発蛍光団と第２のタン
パク質とを含む融合タンパク質を産生させることによってなされ得る。
【００１３】 好ましい実施態様において、本発明は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを、ド
ナールシフェラーゼとして使用し、そして「ヒト化」Ａｅｑｕｏｒｅａグリーン
蛍光タンパク質（「ヒト化」ＧＦＰ）をアクセプター発蛍光団として使用する。
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓから
精製される３４ｋＤａの酵素である。この酵素は、酸素の存在下でセレンテラジ
ンの酸化的脱炭酸を触媒し、４７１ｍｍでの最大発光波長を有する青色光を生じ
る。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをドナールシフェラーゼとして使用する。な
ぜなら、これは励起のために、外来の光よりもむしろ、外来の基質を必要とする
からである。有利なことに、このことは、外来の光源および自己蛍光からのバッ
クグラウンドノイズを除去し、容易かつ正確な光生成の定量的測定を可能にする
。
【００１４】 「ヒト化」ＧＦＰは、４８０ｍｍでの最大励起を有する、２７ｋＤａのタンパ
ク質発蛍光団である。このタンパク質は、野生型Ａｅｑｕｏｒｅａグリーン蛍光
タンパク質から１アミノ酸の差異を有する。「ヒト化」ＧＦＰを、アクセプター
発蛍光団として選択した。なぜなら、その励起スペクトルは、Ｒｅｎｉｌｌａル
シフェラーゼの励起スペクトルと重複するからである。さらに、「ヒト化」ＧＦ
Ｐからの発光は、生細胞内において可視化され得るからである。さらに、「ヒト
化」ＧＦＰは、本方法を実証するために使用された「ヒト化」ＧＦＰ ｃＤＮＡ
でトランスフェクトされた哺乳動物細胞において、良好に発現するからである。
【００１５】 本発明に従って、第１のタンパク質が第２のタンパク質と相互作用するか否か
を決定するための方法を、以下のように実証した。要約すれば、インスリン様増
殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６）およびインスリン様増殖因子ＩＩ（Ｉ
ＧＦ−ＩＩ）を第１のタンパク質および第２のタンパク質として選択した。ＩＧ
ＦＢＰ６は、ＩＧＦ−ＩＩに対して顕著な結合親和性を有することが公知のタン
パク質である。
【００１６】 ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼｃＤＮＡを、ＩＧＦＢＰ６ ｃＤＮＡと融合し
、そして「ヒト化」ＧＦＰ ｃＤＮＡをＩＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡと融合した。生
細胞を、融合したｃＤＮＡを用いてトランスフェクトし、そして融合タンパク質
を発現した。細胞抽出物を生成し、そして混合した。融合したＲｅｎｉｌｌａル
シフェラーゼ−ＩＧＦＢＰ６タンパク質のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ部分に
ついての基質を添加した。最後に、融合「ヒト化」ＧＦＰ−ＩＧＦ−ＩＩタンパ
ク質の「ヒト化」ＧＦＰ部分からの蛍光を検出した。本発明に従う１つの方法の
実証を、ここでより詳細に記載する。
【００１７】 （Ａ）ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼｃＤＮＡと融合したＩＧＦＢＰ−６ ｃ
ＤＮＡ；「ヒト化」ＧＦＰ ｃＤＮＡと融合したＩＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡ；およ
び「ヒト化」ＧＦＰ ｃＤＮＡと融合したインスリンｃＤＮＡのクローニング：
） 第１に、３つの融合ｃＤＮＡを生成した：１）融合したＩＧＦＢＰ−６ ｃＤ
ＮＡおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼｃＤＮＡ；２）融合したＩＧＦ−ＩＩ
ｃＤＮＡおよび「ヒト化」ＧＦＰ ｃＤＮＡ；ならびに３）融合したインスリ
ンｃＤＮＡおよび「ヒト化」ＧＦＰ ｃＤＮＡ。ＩＧＦＢＰ−６ ｃＤＮＡ（配
列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６９０５４）、コードされるＩＧＦＢＰ−
６（配列番号２、第１のタンパク質として使用された）。Ｒｅｎｉｌｌａルシフ
ェラーゼｃＤＮＡ（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６３５０１）、コー
ドされるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（配列番号４、ドナールシフェラーゼと
して使用された）。ＩＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡ（配列番号５）、コードされたＩＧ
Ｆ−ＩＩ（配列番号６、第２のタンパク質として使用された）。「ヒト化」ＧＦ
Ｐ ｃＤＮＡ（配列番号７、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５０９６３）、コードさ
れる「ヒト化」ＧＦＰ（配列番号８、アクセプター発蛍光団として使用された）
。インスリンｃＤＮＡ（配列番号９、登録番号ＡＨ００２８４４）、コードされ
るインスリン（配列番号１０）。「ヒト化」ＧＦＰを融合したインスリンを、コ
ントロールタンパク質として使用した。なぜなら、インスリンは、ＩＧＦ−ＩＩ
のホモログであるが、ＩＧＦＢＰ−６に結合しないからである。ＩＧＦＢＰ−６
ｃＤＮＡ（配列番号１）、ＩＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡ（配列番号５）およびイン
スリンｃＤＮＡ（配列番号９）を、以下のように、ＰＣＲを用いて改変した。
【００１８】 第１に、ＥｃｏＲＩフラグメント上に保有されるプレプロＩＧＦ−ＩＩのｃＤ
ＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ＩＩベクター中にクローニングした
。挿入物を、Ｔ７およびＴ３プライマーを使用して配列決定し、プレプロＩＧＦ
−ＩＩの公知のｃＤＮＡ配列を含有することを確認した。ＩＧＦ−ＩＩ前駆体の
５’末端を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ＩＩベクター中のＴ７プロモー
ターに連結した。ＩＧＦ−ＩＩ ３’プライマーを、ＮｏｔＩ制限部位を生成す
るように設計し、プレプロＩＧＦ−ＩＩのＤおよびＥドメインを取り除き、そし
て「ヒト化」ＧＦＰのＮｏｔＩ制限部位を、ＩＧＦ−ＩＩのオープンリーディン
グフレームとインフレームで維持した。
【００１９】 次に、ＩＧＦ−ＩＩフラグメントをＴ７プロモータープライマーおよびＩＧＦ
−ＩＩ ３’プライマーを用いるＰＣＲを使用して増幅した。ＰＣＲ増幅したＩ
ＧＦ−ＩＩフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩによって消化し、ｐＣＤＮ
Ａ３．１（＋）ベクター中（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、
ＵＳ）にクローニングし、ｐＣＤＮＡ−ＩＧＦ−ＩＩを生成した。次いで、「ヒ
ト化」ＧＦＰのＮｏｔＩフラグメントをｐＣＤＮＡ−ＩＧＦ−ＩＩのＮｏｔＩ部
位に挿入して、ｐＣ−ＩＧＦ−ＩＩ−ＧＦＰを生成した。
【００２０】 シグナルペプチドＢ、ＣおよびＡドメインを含むインスリンの前駆体のｃＤＮ
Ａを、上記のＩＧＦ−ＩＩフラグメントに対応する様式において改変した。次い
で、「ヒト化」ＧＦＰ ｃＤＮＡを、改変されたインスリンｃＤＮＡの３’末端
に連結し、ｐＣ−ＩＮＳ−ＧＦＰを生成した。
【００２１】 最後に、ＩＧＦＢＰ６ ｃＤＮＡをＲａｔタグ化ヒトＩＧＦＢＰ６と称するプ
ラスミドからＰＣＲによって増幅した。ＩＧＦＢＰ６の終止コドンを取り除き、
そしてＩＧＦＢＰ６のオープンリーディングフレームは、ｐＣＥＰ４−ＲＵＣ由
来のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼｃＤＮＡとインフレームであった（Ｍａｙｅ
ｒｈｏｆｅｒ Ｒ、Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ＷＨＲ、Ｃｏｒｍｉｅｒ ＭＧおよび
Ｓｚａｌａｙ ＡＡ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａ
ｎｔｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｌｉｇｈｔ
ｅｍｉｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９５；７；１０
３１−８）。ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼｃＤＮＡの、改変ＩＧＦＢＰ６ ｃ
ＤＮＡの３’末端に対する連結は、ｐＣ−ＩＧＦＢＰ６−ＲＵＣを生成した。
【００２２】 全ての構築物由来の挿入ＤＮＡフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定分析に
よって確認した。Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇ
ｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）をプラスミドＤＮＡの精製のために
使用した。
【００２３】 （Ｂ）リン酸カルシウム沈殿法を用いるｐＣ−ＩＧＦ−ＩＩ−ＧＦＰ、ｐＣ−
ＩＮＳ−ＧＦＰ、およびｐＣ−ＩＧＦＢＰ６−ＲＵＣでの、哺乳動物細胞の一過
性トランスフェクション：） 次に、哺乳動物細胞を、クローン化した融合ＤＮＡでトランスフェクトした。
最初に、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞、Ａｍｅｒｉｃｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＲＬ １６５１）を、１
０％ ウシ胎仔血清および最終濃度でペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプト
マイシン１００ｍｇ／ｍｌおよびアンホテリシンＢ ２５０ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇ
ｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）を含む抗生物
質抗真菌溶液で補充された、Ｌ−グルタミンを有するダルベッコの改変イーグル
培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ2中で増殖させた。１×１０6のこれら
の細胞の群を、トランスフェクションの前日にプレーティングし、そしてトラン
スフェクション時には、約５０％〜６０％コンフルエントであった。
【００２４】 ４０ｍｇの各プラスミド融合ＤＮＡを、沈殿させ、そしてダルベッコリン酸緩
衝化生理食塩水溶液中に再懸濁し、そしてプラスミド融合ＤＮＡを、標準的なリ
ン酸カルシウム沈殿法を使用して、哺乳動物細胞に導入した。トランスフェクシ
ョン効率を、２４時間後に、蛍光顕微鏡によって、評価した。１プレートあたり
の緑色の蛍光細胞の数は、ｐＣ−ＩＧＦ−ＩＩ−ＧＦＰのＤＮＡでトランスフェ
クトした細胞、ｐＣ−ＩＮＳ−ＧＦＰのＤＮＡでトランスフェクトした細胞、お
よび陽性コントロールとして使用した、ＧＦＰのみを含むプラスミドＤＮＡでト
ランスフェクトした細胞のプレートと匹敵した。
【００２５】 （Ｃ）融合タンパク質の発現の確認：） ＤＮＡリン酸カルシウム沈殿法を使用するＤＮＡトランスフェクションの２４
時間後、個々のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、蛍
光顕微鏡を使用して、ＧＦＰ蛍光の検出によって可視化した。ｐＣ−ＩＧＦ−Ｉ
Ｉ−ＧＦＰおよびｐＣ−ＩＮＳ−ＧＦＰでトランスフェクトした細胞は、ＥＲか
らゴルジを通って輸送される分泌タンパク質の典型的な、類似の蛍光パターンを
示した。ｐＣ−ＩＧＦＢＰ６−ＲＵＣでトランスフェクトした細胞は、蛍光を発
しなかった。しかし、ｐＣ−ＩＧＦＢＰ６−ＲＵＣでトランスフェクトした細胞
は、セレンテラジンの添加後、微光画像化システムを使用して、ルミネセンスを
示した。
【００２６】 さらに、融合タンパク質ＩＧＦ−ＩＩ−ＧＦＰおよびＩＧＦＢＰ６−ＲＵＣ（
それぞれ、約３６ｋＤａおよび５６ｋＤａの予想分子量を有する）の存在が、イ
ムノブロット分析を使用して検出された。このことは、一過性のトランスフェク
ト細胞における、両方の融合タンパク質の存在を確認した。
【００２７】 （Ｄ）：分光蛍光分析によるタンパク質相互作用の検出） 予想された融合タンパク質ＩＧＦ−ＩＩ−ＧＦＰおよびＩＧＦＢＰ６−ＲＵＣ
の存在、ならびにドナールシフェラーゼおよびアクセプター発蛍光団の機能を確
認して、これら一過性トランスフェクト細胞からの細胞抽出物を使用して、融合
タンパク質のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと「ヒト化」ＧＦＰ部分との間のエ
ネルギー移動に基づくタンパク質結合アッセイを行った。カルシウムトランスフ
ェクションの４８時間後、ＣＯＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして０．５Ｍ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）を
含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で、細胞スクレイパーを使用して、収集し
た。収集された細胞を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５５０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉ
ｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕ
ｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳ）を使用して１０秒間、３回、１０秒のインターバルで超音
波処理し、細胞抽出液を生成した。
【００２８】 次に、ＩＧＦ−ＩＩ−ＧＦＰおよびＩＧＦＢＰ６−ＲＵＣを含有する細胞抽出
液を混合し、そして０．１μｇのセレンテラジンをすぐに添加した。ＳＰＥＸ
ＦｌｕｏｒｏＭａｘ（登録商標）（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｓ．Ａ．、Ｉｎｃ
．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）を使用する分光蛍光分析を、行った。スペクトルは、
４７１ｎｍでの単一の発光ピーク（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの公知の発光
に対応する）を示した。
【００２９】 第１の分光蛍光分析の後、混合液を、室温で３０分間保存し、新鮮なセレンテ
ラジンを添加した後に、再度スペクトルをトレースした。３０分でのトレースは
、４７１ｎｍおよび５０３ｎｍでの最大発光の２つのピークを示した。細胞抽出
液の分光蛍光分析を、より長時間行ったが、スペクトルパターンは時間を経ても
変化しなかった。
【００３０】 ｐＣ−ＩＮＳ−ＧＦＰおよびｐＣ−ＩＧＦＢＰ６−ＲＵＣでトランスフェクト
された細胞由来のコントロール細胞抽出液混合物を、同様に作製し、そのスペク
トルをトレースした。そのトレースは、４７１ｎｍでの１つのみのピーク（Ｒｅ
ｎｉｌｌａルシフェラーゼに発光ピークに対応する）を示した。スペクトルパタ
ーンは、時間を経ても変化しなかった。
【００３１】 従って、これらのデータは、ＩＧＦＢＰ６およびＩＧＦ−ＩＩは相互作用した
が、インスリンおよびＩＧＦＢＰ６は相互作用しなかったことを実証した。
【００３２】 上記に開示された実施例に加えて、タンパク質間の相互作用もまた、同時形質
転換されるＥ．ｃｏｌｉ細胞および哺乳動物細胞内において、対応する方法を使
用するＬＲＥＴの検出によって検出された。
【００３３】 本発明は、特定の好ましい実施例を参照して、かなり詳細に記載されたが、他
の実施態様も可能である。例えば、タンパク質以外の分子間の相互作用が、対応
する方法によって研究され得る。そのような他の分子は、拡散、注入、および取
り込みまたは他の手段によって生細胞に提供され得る。さらに、遺伝子操作され
た生細胞から生成された融合タンパク質は、その相互作用を調べる前に、翻訳後
の変化（例えば、糖部分の添加）を有し得る。また生細胞は、細胞、コロニーお
よび組織内の微光画像解析による分光蛍光分析によるこれらの方法を使用して、
可視化され得る。さらに、コロニーの高スループットスクリーニングが、マイク
ロタイターディッシュまたはマルチアレイ検出の細胞ソーティングおよび微光ビ
デオ分析と組み合わせた本方法を使用して、達成され得る。従って、添付の特許
請求の範囲の趣旨および範囲は、本明細書に含まれる好ましい実施態様の記載に
よって限定されないべきである。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ // Ｇ０１Ｎ 21/78 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 ワン−プルスキ， ゲフ カナダ国 ビー２エヌ ４エル３ ノバ スコティア， トルロ， ヒルクレスト アベニュー 114 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 GA07 GB21 JA01 KA02 LA01 MA01 2G045 AA40 CB01 DA36 FA29 FB01 FB12 GC15 2G054 AA08 AB10 CA23 CD01 CE02 EB01 GA04 GB02 4B024 AA11 BA08 BA80 CA01 DA03 GA11 HA13 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ79 QR02 QR16 QR56 QR66 QS03 QS28 QX02

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生細胞内において、第１のタンパク質が第２のタンパク質と
    相互作用するか否か決定する方法であって、該方法は、以下： ａ）該細胞内において、ドナールシフェラーゼと複合体化した該第１のタンパ
    ク質、およびアクセプター発蛍光団と複合体化した該第２のタンパク質を提供す
    る工程； ｂ）該複合体化した第１のタンパク質および該複合体化した第２のタンパク質
    を、該細胞内においてお互いに近傍に配置する工程；ならびに ｃ）該アクセプター発蛍光団からの任意の蛍光を検出する工程； を包含する方法であって、 ここで、該第１のタンパク質が、該第２のタンパク質の近傍にある場合、該ド
    ナールシフェラーゼが、該アクセプター発蛍光団に対して、ルミネセンス共鳴エ
    ネルギー移動し得、そして ここで、該ドナールシフェラーゼからのルミネセンス共鳴エネルギー移動から
    生じる該アクセプター発蛍光団の蛍光が、該第１のタンパク質が該第２のタンパ
    ク質と相互作用したことを示す、方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ドナールシフ
    ェラーゼと複合体化した第１のタンパク質、および前記アクセプター発蛍光団と
    複合体化した第２のタンパク質を提供する工程が、 ＤＮＡを遺伝子操作し、 該遺伝子操作されたＤＮＡを前記生細胞に移入し、 該細胞に、該ドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質、および
    該アクセプター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を産生させること、 を包含する、方法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ドナールシフ
    ェラーゼと複合体化した第１のタンパク質を提供される前記細胞が、哺乳動物細
    胞である、方法。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記アクセプター
    発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を提供される前記細胞が、哺乳動物細
    胞である、方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記提供されるド
    ナールシフェラーゼが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼである、方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記提供されるア
    クセプター発蛍光団が、グリーン蛍光タンパク質である、方法。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記提供されるア
    クセプター発蛍光団が、Ａｅｑｕｏｒｅａグリーン蛍光タンパク質である、方法
    。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ドナールシフ
    ェラーゼからの任意の蛍光の検出が、分光蛍光分析を使用して行われる、方法。
  9. 【請求項９】 生細胞内において、第１の分子が第２の分子と相互作用する
    か否か決定する方法であって、該方法は、以下： ａ）該細胞内において、ドナールシフェラーゼと複合体化した該第１の分子、
    およびアクセプター発蛍光団と複合体化した該第２の分子を提供する工程； ｂ）該複合体化した第１の分子および該複合体化した第２の分子を、該細胞内
    においてお互いに近傍に配置する工程；ならびに ｃ）該アクセプター発蛍光団からの任意の蛍光を検出する工程； を包含する方法であって、 ここで、該第１の分子が、該第２の分子の近傍にある場合、該ドナールシフェ
    ラーゼが、該アクセプター発蛍光団に対して、ルミネセンス共鳴エネルギー移動
    し得、そして ここで、該ドナールシフェラーゼからのルミネセンス共鳴エネルギー移動から
    生じる該アクセプター発蛍光団の蛍光が、該第１の分子が該第２の分子と相互作
    用したことを示す、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法であって、 ここで、前記第１の分子が第１のタンパク質であり、そして前記第２の分子が
    第２のタンパク質であり；そして ここで、前記ドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質、および
    前記アクセプター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を提供する工程が、 ＤＮＡを遺伝子操作し、 該遺伝子操作されたＤＮＡを前記生細胞に移入し、 該細胞に、該ドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質、および
    該アクセプター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を産生させること、 を包含する、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記ドナール
    シフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質を提供される前記細胞が、哺乳動
    物細胞である、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記アクセプ
    ター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を提供される前記細胞が、哺乳動
    物細胞である、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項９に記載の方法であって、ここで、前記提供される
    ドナールシフェラーゼが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼである、方法。
  14. 【請求項１４】 請求項９に記載の方法であって、ここで、前記提供される
    アクセプター発蛍光団が、グリーン蛍光タンパク質である、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項９に記載の方法であって、ここで、前記提供される
    アクセプター発蛍光団が、Ａｅｑｕｏｒｅａグリーン蛍光タンパク質である、方
    法。
  16. 【請求項１６】 請求項９に記載の方法であって、ここで、前記ドナールシ
    フェラーゼからの任意の蛍光の検出が、分光蛍光分析を使用して行われる、方法
    。
  17. 【請求項１７】 第１のタンパク質が第２のタンパク質と相互作用するか否
    か決定する方法であって、該方法は、以下： ａ）ドナールシフェラーゼと複合体化した該第１のタンパク質、およびアクセ
    プター発蛍光団と複合体化した該第２のタンパク質を提供する工程； ｂ）該複合体化した第１のタンパク質および該複合体化した第２のタンパク質
    を、お互いに近傍に配置する工程；ならびに ｃ）アクセプター発蛍光団からの任意の蛍光を検出する工程； を包含する方法であって、 ここで、該第１のタンパク質が、該第２のタンパク質の近傍にある場合、該ド
    ナールシフェラーゼが、該アクセプター発蛍光団に対して、ルミネセンス共鳴エ
    ネルギー移動し得、そして ここで、該ドナールシフェラーゼからのルミネセンス共鳴エネルギー移動から
    生じる該アクセプター発蛍光団の蛍光が、該第１のタンパク質が該第２のタンパ
    ク質と相互作用したことを示す、方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記ドナール
    シフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質、および前記アクセプター発蛍光
    団と複合体化した第２のタンパク質を提供する工程が、 ＤＮＡを遺伝子操作し、 該遺伝子操作されたＤＮＡを生細胞に移入し、 該細胞に、該ドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質、および
    該アクセプター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を産生させること、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記ドナール
    シフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質を提供される前記細胞が、哺乳動
    物細胞である、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記アクセプ
    ター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を提供される前記細胞が、哺乳動
    物細胞である、方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記提供され
    るドナールシフェラーゼが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼである、方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記提供され
    るアクセプター発蛍光団が、グリーン蛍光タンパク質である、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記提供され
    るアクセプター発蛍光団が、Ａｅｑｕｏｒｅａグリーン蛍光タンパク質である、
    方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記ドナール
    シフェラーゼからの任意の蛍光の検出が、分光蛍光分析を使用して行われる、方
    法。
  25. 【請求項２５】 第１の分子が第２の分子と相互作用するか否か決定する方
    法であって、該方法は、以下： ａ）ドナールシフェラーゼと複合体化した該第１の分子、およびアクセプター
    発蛍光団と複合体化した該第２の分子を提供する工程； ｂ）該複合体化した第１の分子および該複合体化した第２の分子を、お互いに
    近傍に配置する工程；ならびに ｃ）アクセプター発蛍光団からの任意の蛍光を検出する工程； を包含する方法であって、 ここで、該第１の分子が、該第２の分子の近傍にある場合、該ドナールシフェ
    ラーゼが、該アクセプター発蛍光団に対して、ルミネセンス共鳴エネルギー移動
    し得、そして ここで、該ドナールシフェラーゼからのルミネセンス共鳴エネルギー移動から
    生じる該アクセプター発蛍光団の蛍光が、該第１の分子が該第２の分子と相互作
    用したことを示す、方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の方法であって、 ここで、前記第１の分子が第１のタンパク質であり、そして前記第２の分子が
    第２のタンパク質であり；そして ここで、前記ドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質、および
    前記アクセプター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を提供する工程が、 ＤＮＡを遺伝子操作し、 該遺伝子操作されたＤＮＡを生細胞に移入し、 該細胞に、該ドナールシフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質、および
    該アクセプター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を産生させること、 を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の方法であって、ここで、前記ドナール
    シフェラーゼと複合体化した第１のタンパク質を提供される前記細胞が、哺乳動
    物細胞である、方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２６に記載の方法であって、ここで、前記アクセプ
    ター発蛍光団と複合体化した第２のタンパク質を提供される前記細胞が、哺乳動
    物細胞である、方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記提供され
    るドナールシフェラーゼが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼである、方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記提供され
    るアクセプター発蛍光団が、グリーン蛍光タンパク質である、方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記提供され
    るアクセプター発蛍光団が、Ａｅｑｕｏｒｅａグリーン蛍光タンパク質である、
    方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記ドナール
    シフェラーゼからの任意の蛍光の検出が、分光蛍光分析を使用して行われる、方
    法。
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