CN101620233B - 一种蛋白质相互作用的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测方法,属于生物分子领域。本发明利用双分子荧光互补技术,基于橙红荧光蛋白和远红荧光蛋白,可以用来检测蛋白质之间的相互作用。本发明可以应用于在活体成像检测蛋白质相互作用,同时本发明还可以同步并行检测多对蛋白质相互作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法,用于检测蛋白质相信作用,属于生物分子领域。
背景技术
蛋白质相互作用(protein-protein interaction,以下简称“PPI”),是在维持生物体的正常生理功能中起重要作用的生理过程,PPI涉及几乎所有的重要生命活动,包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等。例如,精确调控和实现细胞生理功能的信号通路即通过信号分子和对应受体的相互作用来实现信号传导和放大,从而实现细胞对外部环境刺激的应激反应。此外,多种具有重要功能的蛋白质分子都以二聚体,三聚体或寡聚体的形式行使作用,这些蛋白间的相互作用对其生理功能实现十分重要。蛋白质相互作用必须被精确调控,并以此来维持我们机体的正常功能,无序、失控的蛋白质相互作用可引发癌症或其他严重疾病。
研究蛋白质-蛋白质相互作用,不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能,而且对于研究生长、发育、分化和凋亡等生命活动规律至关重要,为探讨重大疾病的机理、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供重要的理论基础。生物化学家以及不少公司都在通过研究蛋白之间的相互作用来揭示信号传递通路中的关键部位,并开发影响信号传递的药物,以达到疾病治疗目的。其中在生理过程中最为普遍则是两个蛋白之间的相互作用,例如表皮生长因子EGF和表皮生长因子受体EGFR的相互作用被发现在细胞生长和癌症发生中起到重要的作用。而细胞信号通路的信号传导和级联放大也是通过如Ras、Raf等蛋白相互作用来实现的。
目前,研究蛋白质间相互作用的主要技术有酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术和pull-down技术等。但这些技术主要在体外或者在非哺乳动物细胞内进行,结果并不直接、可靠。虽然基于荧光蛋白对的FRET技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer)可实时监测活哺乳细胞内蛋白相互作用的时空动力学,但该方法灵敏度比较低,而且数据处理繁琐,仪器要求高,限制其对于蛋白相互作用图谱的研究。因此,一种直观,动态,简便,可操作性强,可在生理条件下实施的研究方法在蛋白质相互作用及其相关疾病的研究中是非常急需的。
双分子荧光互补技术(BiFC)可实现更直接,更简便的理解蛋白质相互作用及其相关生理过程。Hu教授于2002年发明的基于GFP荧光蛋白家族的BiFC方法(BimolecularFluorescence Complementation)不仅可以检测强相互作用,而且可以高灵敏的检测弱相互作用。该方法可直接标记目标蛋白,实现在生理条件下的细胞环境(或组织,甚至在体)中直接观察蛋白质何时,何地,何种强度发生相互作用,可信,充分的说明真实的生理过程,并且只须普通荧光显微镜即可实现,具有可操作性强的特点。目前已有文献报道利用BiFC技术研究活细胞内多对蛋白相互作用网络。但利用BiFC方法检测蛋白质相互作用,多用绿色荧光蛋白,穿透性差,不能解决多对蛋白质相互作用的检测;而已知的红色荧光蛋白(mRFP-Q66T)虽也可以用来进行BiFC研究,但该荧光蛋白不仅亮度相对低,而且对pH不稳定(pKa=7.5),很难在酸性环境中研究蛋白相互作用,不能在生理温度37℃工作,不能同步并行检测多对蛋白质相互作用,同时不能活体成像检测蛋白质的相互作用。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题而提供了一种利用双分子荧光互补技术,基于橙红荧光蛋白和远红荧光蛋白,检测蛋白质相互作用的方法。
本发明所采用的技术方案是:
一种蛋白质相互作用的检测方法,利用双分子荧光互补技术,基于橙红荧光蛋白,该检测方法包括以下步骤:
1)将橙红荧光蛋白切割成两个蛋白序列片段,分别为TN和TC,构成红色双分子荧光互补探针;
2)将两个蛋白序列片段分别构建到两个表达载体中,将待测的两个目标蛋白的DNA序列分别与TN和TC构建用于表达融合蛋白;
3)利用双分子荧光互补现象,将融合蛋白序列载体共转染细胞,使用光源及光学组件,在荧光显微镜观察刺激前后是否存在红色荧光;如果两目标蛋白存在相互作用,则TN和TC足够靠近,从而自发重组为完整荧光蛋白,产生红色荧光信号;如果没有或者只有极其微弱红色荧光,证明目标蛋白之间无相互作用。
优选地,所述橙红荧光蛋白为TagRFP。
进一步地,所述橙红荧光蛋白TagRFP的切割点为第154号氨基酸与第155号氨基酸之间。
一种蛋白质相互作用的检测方法,利用双分子荧光互补技术,基于远红荧光蛋白,该检测方法包括以下步骤:
1)将远红荧光蛋白切割成两个蛋白序列片段,分别为KN和KC,构成红色双分子荧光互补探针;
2)将两个蛋白序列片段分别构建到两个表达载体中,将待测的两个目标蛋白的DNA序列分别与KN和KC构建用于表达融合蛋白;
3)利用双分子荧光互补现象,将融合蛋白序列载体共转染细胞,使用光源及光学组件,在荧光显微镜观察刺激前后是否存在红色荧光;如果两目标蛋白存在相互作用,则KN和KC足够靠近,从而自发重组为完整荧光蛋白,产生红色荧光信号;如果没有或者只有极其微弱红色荧光,证明目标蛋白之间无相互作用。
优选地,所述远红荧光蛋白为mKate及其突变体mLumin。
进一步地,所述远红荧光蛋白mKate及其突变体mLumin的切割点为第154号氨基酸与第155号氨基酸之间
进一步地,所述检测方法可以用于同步并行检测多对蛋白质相互作用。
进一步地,所述检测方法可以用于活体成像检测蛋白质相互作用。
本发明具有以下优点:
该方法能够检测蛋白质的相互作用,基于橙红荧光蛋白和远红荧光蛋白,与绿色荧光蛋白相比,组织穿透性上更强,有更大的临床应用前景;与已知的红色荧光蛋白(mRFP-Q66T)相比,本发明中的橙红荧光蛋白和远红荧光蛋白不仅亮度相对高,而且在pH不稳定(pKa=7.5)的酸性环境中仍能检测蛋白相互作用。橙红荧光蛋白TagRFP不仅亮度高,是mRFP-Q66T的三倍,而且耐漂白性好,极其抗酸(pKa<4.0),特别适合酸性细胞器中,线虫体内,或者长时间成像的蛋白质相互作用研究。而远红荧光蛋白mKate及其突变mLumin,是在发射波长大于620nm的荧光蛋白中单体性最好,亮度最高,远红荧光蛋白的波长范围,使其在生物组织中吸收低,穿透深度深,从而可以应用于在活体成像检测蛋白质相互作用,同时本发明还可以同步并行检测多对蛋白质相互作用。
附图说明
图1为TagRFP的基因序列切割点;
图2为mKate的基因序列切割点;
图3为mLumin的基因序列切割点;
图4为TagRFP和mKate及其突变体mLumin的光学参数图;
图5为纯化的mKate及其突变体SDS Page与常见荧光蛋白Katushka,mCFP的比较电泳图;
图6为mKate155位点的BiFC探针质粒图,表征探针表达量的荧光蛋白为mCitrine;
图7是mKate155位点的BiFC探针质粒图,表征探针表达量的荧光蛋白为mCerulean;
图8是基于TagRFP155位点的BiFC分子探针的结构图;
图9是基于TagRFP155位点的BiFC分子探针的原理图;
图10是基于TagRFP155位点的BiFC探针在细胞中的应用的荧光图;
图11为HeLa细胞共转mCitrine-bFos-TagRFP155N和mCerulean-bJun-TagRFP155C于26℃培养24h后单细胞图;
图12为HeLa细胞共转mCitrine-ΔbFos-TagRFP155N和mCerulean-bJun-TagRFP155C于26℃培养24h后单细胞图;
图13是基于TagRFP155位点的BiFC系统研究BACE酶细胞二聚化的原理示意图;
图14是HeLa细胞BACE(FL)-TagRFP155N和BACE(FL)-TagRFP155C于26℃培养24h后单细胞图;
图15是基于TagRFP155位点的BiFC系统三色标记荧光图;
图16是为线虫共转染L2534-mCitrine-bFos-TagRFP155N与L2534-mCerulean-bJun-TagRFP155C 26℃培养24h的荧光图;
图17是基于mKate的BiFC分子探针原理示意图;
图18是COS-7细胞共转染21小时后荧光图;
图19是基于mKate的BiFC系统效率计算,用于表征最有位点,以及系统信噪比的统计图;
图20是COS-7细胞中分别共转染三种基于mkate及其突变体mLumin,mKate-S158C的BiFC系统荧光图;
图21是基于mKate以及突变体的BiFC探针与其他常用BiFC探针的联用比较图;
图22是利用BiFC系统分析EGFR和STAT5间相互作用,COS-7细胞共转染后37℃培养23小时的显微镜图;
图23是利用BiFC系统分析EGFR和STAT5间相互作用,COS-7细胞共转染质粒后37℃培养23小时的微镜单细胞图;
图24是COS-7细胞共转染后,37℃培养17小时,再加入EGF刺激培养12小时,利用普通倒置显微镜的成像图;
图25是基于mKate以及突变体的BiFC系统在线虫26℃培养24h的荧光图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步具体说明。
本发明是一种蛋白质相互作用的检测方法,基于橙红荧光蛋白和远红荧光蛋白,而该检测方法的关键在于,荧光蛋白的选取和对应互补位点的选取。本具体实施方式中选用的是橙红荧光蛋白TagRFP和远红荧光蛋白mKate及其突变体mLumin,实施例中的TagRFP和mKate及其突变体mLumin是目前最优良的红色荧光蛋白,但不排除以后会出现更加优良的突变体。原则上,其他优秀红色荧光蛋白也能利用本专利的思路和方法构建成,但是具体的互补位点等技术关键,也需要实验证明。所以本专利中TagRFP蛋白质可以上升到橙红荧光蛋白范围,mKate蛋白质及其突变体mLumin可以上升到整个远红蛋白的的范围,而橙红荧光蛋白和远红荧光蛋白可以上升到红色荧光蛋白的范围。
图4为TagRFP和mKate及其突变体光学参数,从图中可以看出,目前最常用的mCherry荧光蛋白比较,TagRFP有荧光强度大,pKa值低的显著优势;而mKate及其突变体mLumin,mKate-S158C,有着波长更长,综合性能突出,应用性强的特点。
图5为纯化的mKate及其突变体SDS-Page分析及与常见荧光蛋白Katushka,mCFP的比较电泳图,从图中可以看出见mKate及其突变体mLumin,mKate-S158C为单体,基本没有二聚化或寡聚化现象,说明其应用性强。
图6和图7是mKate155位点的BiFC探针质粒图。基于mKate155位点的BiFC探针由表征探针表达量的荧光蛋白mCitrine和mCerulean,BiFC荧光蛋白片段mKate-155C,mKate-155N组成。构建质粒时,所用载体为CMV启动子和Kan筛选抗性。其他本发明所涉及的探针亦可方便的通过Xho I和BamH I或其他相关酶切位点,对结构进行替换,构建为同类BiFC探针。
图21是基于mKate以及突变体的BiFC探针与其他常用BiFC探针的联用比较图;
本发明前期工作是BiFc中间载体的构建、TagRFP和mKate及其突变体mLumin获得以及三种蛋白质的切割。
其具体步骤为:
1)BiFC中间载体pmCerulean-bJun和pmCitrine-bFos(ΔbFos)质粒构建
pmCerulean-C1和pmCitrine-C1首先进行改造,在载体的KpnI和BamHI之间引入一段寡核苷酸,从而引进SalI、EcoRI和NotI。寡核苷酸5’
-CGGTGGCTCTAAGTCGACGAATTCGCGGCCGCG-3’和5’
-GATCCGCGGCCGCGAATTCGTCGACTTAGAGCCACCGGTAC-3’,其中下划线为SalI,黑色方框中为EcoRI,阴影为NotI酶切位点。两条寡核苷酸退火后,形成含粘性末端的双链:
5′CGGTGGCTCTAAGTCGACGAATTCGCGGCCGCG 3′
3′CATGGCCACCGAGATTCAGCTGCTTAAGCGCCGGCGCCTAG 5′,双链和pmCerulean-C1和pmCitrine-C1双酶切(KpnI和BamHI)的大片断相连,构建pmCerulean和pmCitrine。以pBiFC-bJun-VN173,pBiFC-bFos-VC155和pBiFC-ΔbFos-VC155为模板,用PCR方法扩增出bJun、bFos和ΔbFos。bJun的上游引物为5’-CCGCTCGAGGTAAGGCGGAGAGGAAGCGCATGA-3’(XhoI),下游引物为5’-CCGGGTACCAAACGTTTGCAACTGCTGCGTTAGC-3’(KpnI)。bFos(ΔbFos)的上游引物为5’-CCGCTCGAGGTGGTCGTGCGCAGTCCATCGGT-3’(XhoI),下游引物为5’-CCGGGTACCACCCAGGTCGTTCGGGATTTTGC-3’(KpnI)。PCR产物用XhoI和KpnI双酶切后克隆到pmCerulean-bJun和pmCitrine-bFos载体的双酶切(XhoI-KpnI)大片断中,构建pmCerulean-bJun,pmCitrine-bFos和pmCitrine-ΔbFos。为了后面叙述简单,将pmCerulean-bJun,pmCitrine-bFos和pmCitrine-ΔbFos简称为pC-bJun,pY-bFos和pY-ΔbFos。
2)TagRFP和mKate获得
mRFP-Q66T:以pRSETB-mRFP为模板,采用大引物突变技术进行Q66T点突变。上游引物为:5’-ACGCGTCGACTATGGCCTCCTCCGAGGACGTCAT-3’(SalI),下游引物为5’-GAGCGCGGCCGCTTAGGCGCCGGTGGAGTGGCG-3’(NotI),突变引物为5’-TCACGTAGGCCTTGGAGCCGTAGGTGAACTGAGGGGACAGGATGTCC-3’(方框中为Q66T)。上游引物和突变引物扩增出大约为200bp片断,切胶回收后片断和下游引物继续扩增mRFP,扩增后的全长mRFP-Q66T进行SalI和NotI双酶切,然后连入pC-bJun载体双酶切(SalI-NotI)的大片断中构建pC-bJun-mRFP-Q66T。
TagRFP:采用基于PCR的全基因合成法合成TagRFP。根据Evrogen公司的pTagRFP-C序列合成,其序列如下
ATGGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAGAACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCCCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCAACACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAAGCGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAACTTCAAGACCACATACAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCGTCTACTATGTGGACCACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCTGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAACTTAAT。其中方框中序列为两条相临引物的完全互补序列。一共合成了20条引物
Tag-1
AAAAGGATCCGAATTCATGGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTGATTAAGGAGAACATGCAC(下划线为BamHI,阴影为EcoRI)
Tag-2
TGGTTGTTCACGGTGCCCTCCATGTACAGCTTCATGTGCATGTTCTCCTTAATCAGC
Tag-3
GGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCC
Tag-4
CACCTTGATTCTCATGGTCTGGGTGCCCTCGTAGGGCTTGCCTTCGCCCTCGGATGT
Tag-5
CCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATC
Tag-6
AAGGTTCTGCTGCCGTACATGAAGCTGGTAGCCAGGATGTCGAAGGCGAAGGGGAGAG
Tag-7
CATGTACGGCAGCAGAACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAG
Tag-8
ACTCTCTCCCATGTGAAGCCCTCAGGGAAGGACTGCTTAAAGAAGTCGGGGATGCCCT
Tag-9
GGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTAC
Tag-10
TAGATGAGGCAGCCGTCCTGGAGGCTGGTGTCCTGGGTAGCGGTCAGCACGCCCCCG
Tag-11
CCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCCCATCCAA
Tag-12
CCCAGCCGAGTGTTTTCTTCTGCATCACAGGGCCGTTGGATGGGAAGTTCACCCCTC
Tag-13
AGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCAACACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGCG
Tag-14
CGAGCTTCAGGGCCATGTCGCTTCTGCCTTCCAGGCCGCCGTCAGCGGGGTACAGC
Tag-15
GCGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAACTTCAAGACC
Tag-16
TTGAGGTTCTTAGCGGGTTTCTTGGATCTGTATGTGGTCTTGAAGTTGCAGATCAGGT
Tag-17
AAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCGTCTACTATGTGGACCACAGACTG
Tag-18
CGTAGGTCTCTTTGTCGGCCTCCTTGATTCTTTCCAGTCTGTGGTCCACATAGTAG
Tag-19
GGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCTGTGGCCAGATACTGCG
Tag-20
TTTTCTCGAGAGTTTGTGCCCCAGTTTGCTAGGGAGGTCGCAGTATCTGGCCACAGCC(XhoI)
合成后的TagRFP的全长用BamHI和XhoI双酶切,然后克隆进pRSETB双酶切(BamHI和XhoI)后的大片断中,构建pRSETB-TagRFP。由于经过多次PCR,构建好的TagRFP中存在几个缺失,因此再进行修补后,重新扩增正确的全长TagRFP。上游引物为5’-AAAAGGATCCGAATTCATGGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTG-3’(下划线为BamHI,阴影为EcoRI),下游引物为5’-TTTTCTCGAGATTAAGTTTGTGCCCCAGTTTGCTAGGGAGGTCGCAG-3’(Xho I)。PCR产物用EcoRI和XhoI双酶切,然后连入pRSETB双酶切的大片断中,重新构建pRSETB-TagRFP
mKate:在TagRFP的基础上进行四个点突变。
2)红色荧光蛋白的BiFC质粒构建
以pC-bJun-mRFP-Q66T、pRSETB-mCherry、pRSETB-TagRFP以及pRSETB-mKate,pRSETB-mLumin为模板,分别扩出红色荧光蛋白的N端和C端,PCR产物都用SalI和NotI双酶切,连入pC-bJun、pY-bFos和pY-ΔbFos双酶切(SalI和NotI)的大片断中。构建过程所用的引物序列为
郥agRFP和mKate
T(K)-N-F:5’-ACGCGTCGACTATGGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTG-3’(SalI)
T(K)-C-R:5’-GAGCGCGGCCGCTTAATTAAGTTTGTGCCCCAGTTTGC-3’(NotI)
T-149N-R:5’-GAGCGCGGCCGCTTAGGGGTACAGCATCTCGGTGTTGGC-3’(NotI)
K-149N-R:5’-GAGCGCGGCCGCTTAGGGGTACAGCATCTCGGTGCTGGC-3’(NotI)
T(K)-149C-F:5’-ACGCGTCGACTGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAG-3’(SalI)
T(K)-151N-R:5’-GAGCGCGGCCGCTTAGTCAGCGGGGTACAGCATCTCGGT-3’(NotI)
T(K)-151C-F:5’-ACGCGTCGACTGGCGGCCTGGAAGGCAGAAGCGA-3’(SalI)
T(K)-165N-R:5’-GAGCGCGGCCGCTTACACGAGCTTCAGGGCCATGTCGC-3’(NotI)
T(K)-165C-F:5’-ACGCGTCGACTGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAA-3’(SalI)
参照图1、图2和图3,这三附图是TagRFP、mKate及其突变体mLumin的基因序列切割点
实施例1
本实施实例是利用TagRFP的BiFC现象研究转录因子bFos和bJun的相互作用。基于此目的,需要将bFos与TagRFP蛋白或序列的N端相连(以下简称TN),bJun与TagRFP蛋白或序列的C端相连(以下简称TC),同时为了定量表征研究中每个融合构建体(bFos-TN或bJun-TC)的表达量,将常用黄色荧光蛋白mCerulean和常用青色荧光蛋白mCitrine作为荧光标记分别连接到以上融合构建体上。
参照图8和图9,图8是基于TagRFP155位点的BiFC分子探针结构,用于研究bJun与bFos相互作用的BiFC系统,其探针由荧光蛋白mCerulean/mCitrine,目标蛋白bJun/bFos/ΔbFos以及TagRFP-C段/N段组成。用于研究BACE二聚化的BiFC系统,其探针由全长/截断BACE以及TagRFP-C段/N段组成;图9是BiFC现象应用于bJun,bFos相互作用研究的原理。
其具体步骤为:首先应用基因工程技术构建mCerulean-bJun、mCitrine-bFos(bJun和bFos能够相互作用)和mCitrine-ΔbFos(bJun和ΔbFos不能够相互作用)融合蛋白。应用PCR技术在TagRFP的不同位置分成两段(N端命名为TN,C端命名为TC),TN和TC分别克隆插入含Fos(ΔFos)和Jun的真核表达载体中,即构建三组质粒载体,分别为pmCerulean-bJun-TC、pmCitrine-bFos-TN和pmCitrine-ΔbFos-TN,从而得到可表达BiFC分子探针的质粒。即完成本发明所涉及的BiFC探针构建。
图10是基于TagRFP155位点的BiFC探针在细胞中的应用的荧光图,图11为HeLa细胞共转mCitrine-bFos-TagRFP155N和mCerulean-bJun-TagRFP155C于26℃培养24h后单细胞图,图12为HeLa细胞共转mCitrine-ΔbFos-TagRFP155N和mCerulean-bJun-TagRFP155C于26℃培养24h后单细胞图。从这三幅荧光图上可以看出,pmCerulean-bJun-TC和pmCitrine-bFos-TN共转HeLa细胞后,普通荧光显微镜下(针对TagPFR,红色滤光片参数520-550,455DCLP,DM565,580LP,Olympus),观察发现TagRFP的154和155位置有很强的红色荧光信号,而于其它位置(153、169和171)分开的TagRFP探针对没有红色荧光信号,然后154和155两个位置的pmCerulean-bJun-TC和pmCitrine-ΔbFos-TN共转HeLa细胞,普通荧光显微镜下观察发现没有红色荧光信号,这说明TagPFR的154和155位置可以进行BiFC研究。即完成本发明涉及的BiFC位点选择并证明本发明提供的探针及方法可应用于活细胞能转录因子的相互作用研究。
参照图17、图18、图19和图20,这四幅图是基于mKate的BiFC分子探针结构和原理示意图。图17为基于mKate的BiFC分子探针原理示意图;图18为COS-7细胞共转染图中所示质粒21小时后荧光图;图19为基于mKate的BiFC系统效率计算,用于表征最有位点,以及系统信噪比。图20为COS-7细胞中分别共转染三种基于mkate及其突变体mLumin,mKate-S158C的BiFC系统荧光图,所用质粒如图中所示。
实施例2
BACE酶的二聚化,BACE酶和γ-分泌酶依次酶切水解淀粉样前体蛋白(amyloidprecursor protein,APP)产生4kD的β淀粉样肽(amyloidβ-peptide,Aβ)。Aβ累积则导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发生。最近,Haass C小组利用非变性凝胶电泳和免疫共沉淀的方法,发现BACE以同源二聚体的形式存在。因此,BACE二聚化可作为活细胞蛋白相互作用很好的模型。
图13是基于TagRFP155位点的BiFC系统研究BACE酶细胞二聚化的原理示意图,图14是HeLa细胞BACE(FL)-TagRFP155N和BACE(FL)-TagRFP155C于26℃培养24h后单细胞图。将155位置的两个片段(TN155和HTC155)克隆插入BACE酶载体中,构建BACE(FL)-TN155和BACE(FL)-TC155,然后共转HeLa细胞,于26C培养24h,其单细胞图参照图14。荧光显微镜观察发现高尔基处有比较强的红色荧光信号,与此前文献报道相符。而通过酶切及PCR技术剪切掉BACE酶相互作用部位后(不再发生二聚化),构建BACE(NT)-TN155和BACE(NT)-TC155,然后共转HeLa细胞,于荧光显微镜下未发现明显红色荧光信号。可见本发明所提供的基因型生物分子探针可在哺乳动物细胞内灵敏的检测蛋白质的相互作用。
为了在活细胞内检测BACE的二聚化,将TN151和TC151分别连接到全长BACE(BACE(FL))的C末端,构建了两个融合质粒,pBACE(FL)-TN151和pBACE(FL)-TC151。将这两个质粒共转染进HeLa细胞,26℃孵育40h后发现细胞的高尔基处出现很强的红色荧光信号。这与在之前的文献报道是一致的。将BACE去除跨膜区域(TM,461-477)和一小段胞质内C末端尾巴(478-501),获得可溶性的BACE(NT)。该BACE(NT)对应BACE(FL)的氨基酸残基1-454,是BACE的活性部分。将BACE(NT)分别和TN151和TC151片断融合,构建pBACE(NT)-TN151和pBACE(NT)-TC151。截短和全长质粒两两组合成三组,每组共转染HeLa细胞,26℃孵育40h后荧光成像,成像结果表明没有一组细胞可检测到荧光,这也证实跨膜区域对BACE二聚化起着关键作用。
而同样可以应用基于mLumin的BiFC系统对BACE二聚化的亚细胞定位进行系统研究。
首先构建全长型BACE(FL)和截短型BACE(NT)的真核表达BiFC载体:pCMV-BACE(FL)-KN151、pCMV-BACE(FL)-LC151、pCMV-BACE(NT)-KN151和pCMV-BACE(NT)-LC151。四个载体两两组合,共四个组合,每个组合共转染96孔板中的HeLa细胞,37℃培养24h后在IX71荧光显微镜下进行荧光成像。只要共转染质粒存在BACE(NT),细胞内就没有BiFC荧光信号,即BACE不能进行二聚化,证实了跨膜区域对BACE二聚化起着关键作用,这个结果与TagRFP结果完全一致。
实施例3
线虫内的蛋白相互作用研究,线虫生长快速,可大量养殖,易于产生突变。此外它构造简单,全身透明,易于追踪和成像。最早将BiFC应用于线虫的是2008年诺贝尔化学奖得主Martin Chalfie,他将GFP突变体的荧光片断(157位点劈开)分别和反向平行的亮氨酸短肽(NZ和CZ)融合,研究不同启动子调节基因表达以及蛋白定位。此外2008年Hu教授利用基于Venus的系统系统研究了线虫内Jun和Fos蛋白相互作用的研究。但目前还没有红色BiFC系统应用线虫的报道。
将融合片断C-bJ-TC151、Y-bF-TN151以及Y-ΔbF-TN151克隆至热休克启动子hsp16-2下游,构建pHsp-C-bJ-TC151、pHsp-Y-bF-TN151和pHsp-Y-ΔbF-TN151。热休克启动子为hsp16-2,该启动子在热诱导(35℃)后转录下游基因,表达的蛋白质主要定位在肠、神经和真皮组织。阳性组(pHsp-C-bJ-TC151+pHsp-Y-bF-TN151)和阴性组(pHsp-C-bJ-TC151+pHsp-Y-ΔbF-TN151)质粒通过显微注射到线虫的母代,通过筛选后得到稳定表达的种系。L4晚期的线虫放在35℃下热激30min,然后放在20℃恢复2h后进行成像,结果参照图25。参照图16,阳性组线虫的肠细胞核内出现明显的三种颜色的荧光点,其中青色和黄色表征融合蛋白的表达,而红色信号则为BiFC信号。阴性组中的线虫虽然表达了融合蛋白,但BiFC信号非常微弱,说明了阳性组的BiFC信号反应了bJun和bFos之间的相互作用。
跟TagRFP线虫过程类似,将融合片断C-bJ-LC151、Y-bF-KN151以及Y-ΔbF-KN151克隆至热休克启动子hsp16-2下游,构建pHsp-C-bJ-LC151、pHsp-Y-bF-KN151、pHsp-Y-ΔbF-KN151。显微注射阳性组pHsp-C-bJ-LC151+pHsp-Y-bF-KN151和阴性组pHsp-C-bJ-LC151+pHsp-Y-ΔbF-KN151质粒到线虫的母代,通过筛选后得到稳定遗传的种系。稳定遗传的线虫在35℃下热激30min,然后立即转移至20℃,培养2h后在IX71荧光显微镜下荧光成像。阳性组线虫内出现明显的三种颜色的荧光点,其中青色和黄色表征融合蛋白的表达,而红色信号则为BiFC信号。阴性组中的线虫虽然表达了融合蛋白,但BiFC信号非常微弱,说明了阳性组的BiFC信号反应了bJun和bFos之间的相互作用。
实施例4
多对蛋白同步并行检测,由于mLumin和mCerulean以及mVenus光谱存在明显差异,因此利用普通荧光显微镜和合适的滤光片就可以很好的区分不同荧光蛋白。因此mLumin和mCerulean以及mVenus可以很好的进行三色BiFC,在37℃下在同一个细胞内对三对相互作用蛋白同时检测。已经证实bJun-bFos、EGFR-Grb2和STAT5B-STAT5B能够在活细胞内发生相互作用。因此我们以这三对蛋白作为模型来进行三色BiFC研究。
参照图15、图22、图23、和图24,图15是基于TagRFP155位点的BiFC系统三色标记荧光图;图22、图23、和图24,这三幅图是基于mKate突变体mLumin155位点的BiFC系统研究EGFR相关二聚化的图。图22和图23是利用BiFC系统分析EGFR和STAT5间相互作用,COS-7细胞共转染质粒后37℃培养23小时,图22为荧光显微镜图,图23为共聚焦显微镜单细胞图;图24为活细胞内三对蛋白质相互作用的BiFC研究,COS-7细胞共转染质粒后,37℃培养17小时,再加入EGF刺激培养12小时,利用普通倒置显微镜成像。
bJun和bFos片断和mCerulean片断相连,构建pbF-CrC155和pbJ-CrN173。EGFR和Grb2蛋白分别和mVenus片断相连,构建pEGFR-VC155和pGrb2-VN173。STAT5B分别和mLumin片断相连,构建pLC151-STAT5B和pSTAT5B-KN151。这六个质粒同时转染接种在96孔板中的COS-7细胞,其中pbF-CrC155和pbJ-CrN173为0.025μg/孔,其它四个质粒都为0.06μg/孔。转染后16h,加EGF至终浓度为100ng/ml。1h后接种到35mm皿中。继续孵育12h后进行成像。我们看出细胞中同时在三个不同通道可观察到荧光,其中CFP通道荧光定位在细胞核内,核仁尤其明显,表示bJun和bFos相互作用;YFP通道荧光荧光定位在细胞膜和内涵体中,表示EGFR和Grb2相互作用;RFP通道荧光定位在细胞核质中,核仁内荧光非常微弱,表征磷酸化后的STAT5B二聚化。
文献报道GFP突变体的两个互补片断同时表达于细胞中,有部分片断形成非特异性的BiFC复合物。为了进一步说明CFP和YFP通道荧光信号特异反映bJun-bFos以及EGFR-Grb2相互作用,样品组pbJ-CrN173+pEGFR-VC155和pGrb2-VN173+pbF-CrC155以及对照组pEGFR-VC155+pGrb2-VN173分别共转COS-7细胞,样品组在CFP和YFP通道均不存在荧光,说明在三色BiFC条件下不存在交叉互补。样品组结果同前文YFP通道结果,进一步说明三色BiFC结果的可靠性。
最后所应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种蛋白质相互作用的检测方法,利用双分子荧光互补技术,其特征在于,基于橙红荧光蛋白,该检测方法包括以下步骤:
1)将橙红荧光蛋白切割成两个蛋白序列片段,分别为TN和TC,构成红色双分子荧光互补探针;
2)将两个蛋白序列片段分别构建到两个表达载体中,将待测的两个目标蛋白的DNA序列分别与TN和TC构建用于表达融合蛋白;
3)利用双分子荧光互补现象,将融合蛋白序列载体共转染细胞,使用光源及光学组件,在荧光显微镜观察刺激前后是否存在红色荧光;如果两目标蛋白存在相互作用,则TN和TC足够靠近,从而自发重组为完整荧光蛋白,产生红色荧光信号;如果没有或者只有极其微弱红色荧光,证明目标蛋白之间无相互作用;
所述橙红荧光蛋白为TagRFP,所述橙红荧光蛋白TagRFP的切割点为第154号氨基酸与第155号氨基酸之间。
2.一种蛋白质相互作用的检测方法,利用红色双分子荧光互补技术,其特征在于,基于远红荧光蛋白,该检测方法包括以下步骤:
1)将远红荧光蛋白切割成两个蛋白序列片段,分别为KN和KC,构成红色双分子荧光互补探针;
2)将两个蛋白序列片段分别构建到两个表达载体中,将待测的两个目标蛋白的DNA序列分别与KN和KC构建用于表达融合蛋白;
3)利用双分子荧光互补现象,将融合蛋白序列载体共转染细胞,使用光源及光学组件,在荧光显微镜观察刺激前后是否存在红色荧光;如果两目标蛋白存在相互作用,则KN和KC足够靠近,从而自发重组为完整荧光蛋白,产生红色荧光信号;如果没有或者只有极其微弱红色荧光,证明目标蛋白之间无相互作用;
所述远红荧光蛋白为mKate及其突变体mLumin,所述远红荧光蛋白mKate及其突变体mLumin的切割点为第154号氨基酸与第155号氨基酸之间。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的一种蛋白质相互作用的检测方法,其特征在于,所述检测方法可以用于同步并行检测多对蛋白质相互作用。
4.根据权利要求1或2任意一项所述的一种蛋白质相互作用的检测方法,其特征在于,所述检测方法可以用于活体成像检测蛋白质相互作用。
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