CN108519484A - 利用自连接标签的双分子荧光互补技术成像和追踪活细胞内的蛋白质相互作用 - Google Patents

利用自连接标签的双分子荧光互补技术成像和追踪活细胞内的蛋白质相互作用 Download PDF

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Abstract

蛋白质之间的相互作用构成细胞生命活动的基础。揭示蛋白质之间的相互作用关系并探究相互作用复合物的动态行为已成为蛋白质组学研究的热点。现存的研究蛋白质相互作用的方法无法同时具备活细胞，高时空分辨率，单分子等特点，因此需要开发新的标记和追踪蛋白质相互作用的方法。本发明公开一种基于自连接标签双分子荧光互补的新型标记蛋白质相互作用复合物的方法。在合适的位点将自连接标签分裂成两个部分，分别融合两个具有相互作用的蛋白质，这两个蛋白质相互作用可以把分裂的自连接标签在空间上拉近而形成完整的自连接标签，加入染料可以使相互作用复合物发出荧光。新型自连接标签双分子荧光互补标记方法在细胞生物学中有广泛应用，可以实现在高时空分辨率的单分子水平检测和追踪细胞内一对蛋白质的相互作用。

Description

利用自连接标签的双分子荧光互补技术成像和追踪活细胞内 的蛋白质相互作用
技术领域
本发明涉及一种新的活细胞蛋白质相互作用的检测和追踪方法，及其在细胞生物学中的应用。属于细胞生物学领域。
背景技术
中心法则指出，DNA通过转录形成RNA，RNA翻译成蛋白质发挥功能，蛋白质是细胞一切生命活动的基础。细胞可以选择性接收外源或内源的调控信号，通过其特有的信号调节途径，调节基因的表达，以保持其对环境和自身条件的适应。因此蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学过程。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是绝大部分的蛋白质都是和其伴侣分子相互协作或是与其他蛋白质形成复合物机器来发挥功能。因此，为了更好地理解细胞的各种生命活动，必须很好地解决蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。蛋白与蛋白相互作用是大多数细胞生命活动的基础，它是细胞进行一切代谢活动的根本。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。现在已经利用生物化学和质谱学等方法已经在细胞内鉴定了很多的蛋白质相互作用对。
常见的研究蛋白质相互作用的方法有：遗传学筛选，生物化学方法，和荧光成像方法。遗传学筛选主要使用合成致死筛选和酵母双杂交。合成致死效应是指两个基因同时发生突变时会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时，则无致死效应。该方法可以用于分析两个相同重要功能的蛋白之间的相互作用，但是通量低，同时周期比较长，一般用于育种和菌株的筛选。酵母双杂交系统把待检测相互作用的蛋白分别融合到DNA结合结构域和转录激活结构域。前者可识别靶基因上的特异序列，并使转录激活结构域定位到靶基因的上游，促进基因的转录。生物化学方法主要包括融合蛋白pull-down和免疫共沉淀。融合蛋白pull-down 技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的其他蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱条件而回收。pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是验证两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。如果在非变性的条件下裂解细胞，蛋白质之间的相互作用还可以保持，所以就可利用免疫共沉淀方法找出相互作用的蛋白质。利用荧光成像检测蛋白质相互作用的方法主要包括：荧光共振能量转移技术和双分子荧光互补技术。荧光共振能量转移技术的原理是：处于激活状态的供体，可以将其本身的荧光传递到与之邻近(通常在10nm之内)的受体上。当待检测蛋白分别融合了荧光供体和受体，激发供体，能检测到受体的荧光发射，则表明这两个蛋白有相互作用。双分子荧光互补的原理是利用荧光蛋白分裂之后能互补形成完整的荧光蛋白来检测两个蛋白的相互作用。将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端两个多肽，这两个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但是，当这两个荧光蛋白的片段分别连接到有相互作用的目标蛋白上时，在细胞内共表达或体外混合这两个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的两个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。
上述的三种方法各有优缺点。遗传学方法容易实现高通量筛选，但是结果比较间接，容易受到很多因素的影响。生化的方法只能在细胞外完成检测，不能很好的反应细胞内的蛋白相互作用，且没有时间和空间的信息。而利用光学的方法能有效展示的活细胞里蛋白质之间的相互作用，比较完整地反映了蛋白质在生理状态的活动。同时，基于光学的检测方法可以观察到蛋白质相互作用发生在细胞内亚结构的定位，还可以提供发生的动态过程信息。然而，上述三种方法都无法实现在单分子水平验证和追踪蛋白与蛋白的相互作用。利用分裂的光转换或者光激活荧光蛋白虽然可以实现在单分子水平研究蛋白质之间的相互作用，但是荧光蛋白亮度低，光稳定性差，容易漂白。在单分子实验中，最重要的两个参数就是单个分子的定位精度和追踪的时间长短。单分子定位精度由单个荧光分子所发射出的光子数决定，光子数越多，定位精度越高。追踪时间的长短由单个荧光染料的光稳定性决定。越不容易漂白，则追踪的时间越长。荧光蛋白分子的定位精度差，持续时间短严重限制了其在单分子追踪中的应用。特别是研究结合到DNA上的蛋白分子，如转录因子，有一个重要参数是驻留时间，可以反映出蛋白质分子与DNA作用时间的长短。通过单分子追踪的实验数据所计算的表观驻留时间由真实驻留时间和光漂白时间共同决定。当光漂白的速度很快时，将给真实驻留时间的计算带来很大误差。
有鉴于此，目前需要开发可以实现活细胞内长时间在单分子水平追踪蛋白质相互作用的方法。比起荧光蛋白，荧光染料亮度高，光稳定性好，不容易漂白。但是荧光染料无法基因编码，无法直接融合到要研究的蛋白上。利用最近开发的自连接蛋白标签可以实现将染料融合到蛋白上的目的。这类自连接蛋白标签一般都是来自原核生物的酶，可以催化细胞内的某种底物转化反应。给这些酶进行一些突变，使反应停留在底物共价结合酶的中间状态不能释放出产物。荧光染料标记的小分子底物就可以连接到酶自身，所以称为自连接标签。这类自连接标签种类很多，包括HaloTag，SnapTag，CLIPTag等。利用自连接标签可以同时具有荧光蛋白的基因编码和染料的亮度高、稳定性高的优点。但现在所利用的自连接标签主要用来研究一个蛋白的单分子行为。本发明将自连接标签HaloTag进行分裂，使之可以用来在单分子水平研究一对相互作用的蛋白的行为(说明书附图1)。
发明内容
本发明的技术目的是发展基于自连接标签蛋白的双分子荧光互补的新型研究蛋白质相互作用的方法，可以实现活细胞内在单分子水平长时间追踪一对相互作用的蛋白的目的，用以解决活细胞内相互作用蛋白对的成像和动态观测的问题。利用基于自连接标签蛋白的双分子荧光互补的新型蛋白质相互作用的标记方法，可以实现在活细胞中单分子水平研究一对相互作用的蛋白的空间位置和动态变化，对于揭示蛋白质相互作用的机制具有重要作用。
本发明公开一种筛选自连接标签蛋白双分子荧光互补分裂位点的活细胞荧光扣留新方法。将自连接标签HaloTag分裂成两个片段，使之可以用来在单分子水平研究一对相互作用的蛋白的行为。我们在HaloTag的多个二级结构的单元之间把自连接标签HaloTag分裂成两个部分N端和C端。分别将N端和C端融合到一对相互作用的蛋白上，利用细胞荧光扣留高通量筛选的办法，筛选出分裂之后靠近到一起后能形成完整的有功能的HaloTag的位点。同时，有效的分裂位点还包括低背景或无背景，即当把分裂的两半自连接标签蛋白融合到无相互作用的蛋白对时，无法自发互补，无荧光产生。
本发明公开一种检测分裂的自连接标签蛋白互补形成完整的有活性的蛋白的成熟动力学方法。将分裂的自连接标签蛋白融合到一对可诱导相互作用的蛋白上，这样可以将蛋白质表达和蛋白质成熟过程分离开。先允许系统表达足够长的时间，再加入诱导剂，然后观测了分裂后的HaloTag的成熟过程，最后测量了成熟时间。我们利用雷帕霉素(Rap)可以诱导蛋白 FKBP和FRB的相互作用，研究分裂的自连接标签HaloTag的互补成熟过程的动力学。
本发明公开一种研究以二聚体形式结合染色质DNA的转录因子在活细胞内与DNA相互作用的方法。以转录因子c-Fos和c-Jun为例，研究了一对可以形成二聚体的转录因子与染色质DNA的相互作用过程。比较单体形式和二聚体形式与DNA相互作用的不同，揭示二聚体化的转录因子与DNA的作用机制。
本发明公开一种基于分裂自连接标签的双分子荧光互补的研究蛋白质相互作用的活细胞单分子标记方法。在具体实施过程中，可以根据所研究的对象不同灵活调整所用的蛋白连接方式。也可根据需要，使用不同的染料，实现不同的观测目的。本发明所公开的一种基于分裂自连接标签的双分子荧光互补的研究蛋白质相互作用的活细胞单分子标记方法，包括以下实验步骤：
(1)首先根据待分裂的自连接标签蛋白的结构确定可能的蛋白的分裂位点。
(2)通过PCR扩增出分裂的两段蛋白，分别与一对可以相互作用的蛋白通过柔性的短肽链连接。根据需要，可以调整融合蛋白的连接顺序。构建出一对能表达相互作用蛋白对的质粒。
(3)通过PCR扩增出分裂的两段蛋白，分别与一对不能相互作用的蛋白通过柔性的短肽链连接。根据需要，可以调整融合蛋白的连接顺序。构建出一对能表达无相互作用蛋白对的质粒。
(4)将所构建的可相互作用和无相互作用的质粒分别转染哺乳动物细胞。
(5)24-48小时后，加入可以结合自连接标签的染料使用显微镜或流式细胞仪观察细胞的荧光强度。确定分裂位点。
(6)将确定合适分裂位点的两段自连接标签按照上述方法与一对待研究的蛋白融合，在活细胞内使用显微镜在单分子水平观测蛋白的相互作用过程。
附图说明
图1基于自连接标签的双分子荧光互补方法示意图。以分裂的自连接标签HaloTag为例进行说明。在合适的位点把HaloTag分成两个部分，HaloTag N和HaloTag C，分别融合两个有相互作用的蛋白，A和B。当在活细胞内表达时，A与B相互作用会使HaloTag N和HaloTag C在空间上相互靠近，形成完整的有活性的HaloTag。当加入能结合HaloTag的染料时，就可以特异性地标记出A和B相互作用形成的复合物。可以在活细胞内单分子水平追踪A和B 形成的复合物在细胞内的运动，获得分子的运动轨迹，提取运动参数，建立运动模型。
图2自连接标签的双分子荧光互补分裂位点的筛选过程。以分裂的自连接标签HaloTag 为例进行说明。(a)荧光扣留检测方法筛选分裂位点示意图。上图为HaloTag N和HaloTag C 分别融合β-Fos和β-Jun。当β-Fos和β-Jun相互作用，可以形成一个完整的HaloTag，并结合染料，使染料扣留在细胞内无法扩散出细胞，因此细胞发光。下图为HaloTag N和HaloTag C 分别融合去掉二聚体功能域的β-Fos(ΔZIP)和β-Jun。β-Fos(ΔZIP)无法和β-Jun相互作用，不能形成一个完整的HaloTag，不结合染料，染料无法被扣留在细胞内，迅速扩散出细胞，因此细胞不发光。(b)不同的分裂位点的细胞扣留荧光强度。(c)HaloTag两个分裂位点58和261 在细胞内诱导互补荧光图像。在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染相应的质粒，使用透膜染料Janelia549(JF549)。细胞核使用DPAI染色。
图3检测自连接标签的双分子荧光互补的成熟动力学过程。(a)可诱导的荧光扣留检测方法示意图。HaloTag N和HaloTag C分别融合FKBP和FRB。当不加入雷帕霉素时，FKBP和FRB无相互作用，不能形成一个完整的HaloTag，不结合染料，染料无法扣留在细胞内，会迅速扩散出细胞，因此细胞不发光。当加入雷帕霉素时，FKBP和FRB相互作用，形成一个完整的HaloTag，并结合染料，染料被扣留在细胞内，细胞发光。检测不同时间点的细胞内的荧光强度就可以描述分裂的自连接标签的成熟过程。(b)HaloTag的两个分裂位点58和 261位在细胞内互补的荧光图像。在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染相应的质粒，使用透膜染料JF549标记互补后的复合物。左侧细胞未加入雷帕霉素，右侧细胞加入雷帕霉素。(c) 左侧：分裂位点58和261位的细胞内荧光强度与不同的雷帕霉素浓度的关系。右侧：分裂位点58和261位的细胞内荧光强度与加入1nM的雷帕霉素的作用时间的关系。
图4自连接标签的双分子荧光互补后仍然具有单分子行为。(a)单细胞单分子荧光图像。人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染了β-Fos-HaloTag C58和HaloTag N58-β-Jun质粒，24 小时后加入染料JF549。利用高入射角度的斜射照明方式，可以观测到细胞内的荧光单分子信号。(b)单分子信号的波动曲线记录图。取(a)中的一条直线，将这条直线上的像素作为纵轴，时间作为横轴展开得到波动曲线记录图。从图中可以看出，所有的分子都是一条亮度均一的线段，没有断断续续或忽明忽暗的分子出现，这表明所观测的荧光信号来自单分子的荧光。 (c)单个分子的荧光一步漂白曲线。从(a)中选出9个荧光信号点，记录它们的荧光强度随时间的变化。可以看出，所有的分子都展现了阶梯状的荧光强度变化曲线，且是单阶梯。单步的漂白过程表明所观测的信号来源于单分子。
图5荧光蛋白的双分子荧光互补与自连接标签的双分子荧光互补对比。(a)单分子亮度比较。上图：基于光转换荧光蛋白mMaple3的双分子荧光互补的细胞荧光图像。人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染了β-Fos-mMaple3C174和mMaple3N175-β-Jun质粒。利用高入射角度的斜射照明方式，可以观测到细胞核内互补后的荧光蛋白单分子信号。下图：基于自连接标签HaloTag的双分子荧光互补的细胞荧光图像。人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染了β-Fos-HaloTag C58和HaloTag N58-β-Jun质粒，24小时后加入染料JF549。利用高入射角度的斜射照明方式，可以观测到细胞核内互补后染料分子的单分子荧光信号。从这两个图的对比中可以看出，基于自连接标签HaloTag双分子荧光互补的单分子信号要比基于光转换荧光蛋白mMaple3要亮很多。(b)细胞总体的荧光漂白过程比较。实线部分是多个细胞的平均值，阴影部分代表标准差。从图中可以看出，基于自连接标签HaloTag双分子荧光互补的漂白过程要比基于光转换荧光蛋白mMaple3双分子荧光互补慢很多。(c)光漂白的时间常数和光漂白速率的比较。针对(b)中的漂白曲线使用单指数衰减函数拟合，可以得到漂白过程的时间常数和漂白速率。这表明光转换荧光蛋白mMaple3双分子荧光互补的漂白速度是自连接标签 HaloTag双分子荧光互补的漂白速率的三倍。
图6利用自连接标签的双分子荧光互补技术研究二聚体转录因子c-Fos和c-Jun结合 DNA的比例。(a)二聚体转录因子c-Fos和c-Jun的不同组合在活细胞内的扩散系数分布直方图。从图中可以看出，扩散系数的分布有两个峰。扩散较慢的峰描述的是结合DNA的分子在随着染色质DNA缓慢扩散。扩散较快的峰描述的是自由运动的分子。(b)二聚体转录因子 c-Fos和c-Jun的不同组合在活细胞内的扩散系数累计分布直方图。插入框表示的是扩散系数的盒状图。(c和d)对(a)图中的频率分布直方图使用二组分高斯函数拟合，可以到的快慢两个组分的扩散系数和各自的比例。从这些图中可以得到，c-Fos要比c-Jun结合DNA的比例大。对于二聚体状态的转录因子，异源二聚体稳定结合DNA的比例高于同源二聚体。
图7利用自连接标签的双分子荧光互补技术研究二聚体转录因子c-Fos和c-Jun结合 DNA的驻留时间。(a)二聚体转录因子c-Fos和c-Jun的不同组合在活细胞内结合DNA的蛋白分子比例随时间变化过程。(b)二聚体转录因子c-Fos和c-Jun的不同组合在活细胞内结合 DNA的蛋白分子存活概率随时间变化过程。(c)二聚体转录因子c-Fos和c-Jun的不同组合在活细胞内稳定和非稳定结合DNA的蛋白分子比例。(d)二聚体转录因子c-Fos和c-Jun的不同组合在活细胞内稳定结合DNA的蛋白分子的驻留时间。(e)二聚体转录因子c-Fos和c-Jun的不同组合在活细胞内不稳定结合DNA的蛋白分子的驻留时间。这些数据表明，c-Fos结合DNA的驻留时间最长，c-Jun最短，其他组合的二聚体的驻留时间介于二者之间。
具体实施方式
本发明的技术目的是发展基于自连接标签的双分子荧光互补标记方法研究细胞内单分子水平的蛋白质分子相互作用。其特征在于，使用分裂的自连接标签，在所融合的待检测蛋白质之间有相互作用时有荧光产生，从而实现检测和追踪蛋白质之间的相互作用，可以解决活细胞内蛋白质之间相互作用难以从单分子水平动态观测的问题。利用分裂的自连接标签标记方法，可以实现检测和追踪细胞内一对蛋白质的相互作用，尤其是可以相互作用形成复合物的DNA结合蛋白与染色质DNA相互作用过程，包括测量相互作用复合物结合DNA的比例，驻留时间等参数。下面结合具体数个实施例进行说明。为了更清楚的阐述本发明的方法内容，现将本发明所涉及的产品和方法更进一步的总结如下，所涉及的实验数据、步骤或者合成方法等，属于本领域的常规技术，其并不对本专利的保护范围造成限制。这些具体的实施例只用于说明本发明，并不用于限制本发明的范围。下述所有实例均是以自连接标签HaloTag为例进行说明，本发明的适用范围不局限于HaloTag，其他的自连接标签也可以使用同样的方法。
实施例一：筛选合适的自连接标签分裂位点：
(1)分裂位点的要求是在蛋白质二级结构之间的无规则区域，不影响蛋白质的功能。因为HaloTag是由大肠杆菌脱卤素酶改造而来，现在已经解析出大肠杆菌脱卤素酶的晶体结构而尚无HaloTag的晶体结构，所以按照大肠杆菌脱卤素酶的三维结构设计分裂位点。对比 HaloTag和大肠杆菌脱卤素酶的蛋白质序列，确定HaloTag的分裂位点。本实验中共设计了 17个分裂位点，分别是19、33、48、58、78、98、121、141、156、166、180、207、234、 244、261、269、278。
(2)通过PCR从含有β-Fos，β-Fos(ΔZIP)，和β-Jun的质粒上扩增出相应的DNA片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段，得到β-Fos，β-Fos(ΔZIP)，和β-Jun片段。所使用的PCR扩增体系如下：
(3)将上步回收的β-Fos，β-Fos(ΔZIP)，和β-Jun与真核生物表达载体pcDNA3.1(+)分别使用限制酶双酶切过夜，通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。所使用的酶切体系如下：
(4)将经过酶切回收的β-Fos，β-Fos(ΔZIP)，和β-Jun分别连入已经使用相同的酶切的载体pcDNA3.1(+)，得到载体pcDNA3.1(+)-β-Fos，pcDNA3.1(+)-β-Fos(ΔZIP)，和pcDNA3.1(+)- β-Jun。所使用的连接体系如下：
(5)通过PCR从含有完整的HaloTag的质粒上扩增出相应的HaloTag分裂片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段，得到HaloTag N和HaloTag C。所使用的PCR扩增体系参照步骤(2)。
(6)将上步回收的HaloTag N和表达载体pcDNA3.1(+)-β-Jun使用限制酶双酶切连接。将HaloTag C和表达载体pcDNA3.1(+)-β-Fos，pcDNA3.1(+)-β-Fos(ΔZIP)分别使用限制酶双酶切连接。所使用的酶切体系和连接体系分别参照步骤(3)和(4)。分别得到载体pcDNA3.1(+)- HaloTag N-β-Jun，pcDNA3.1(+)-β-Fos-HaloTag C，和pcDNA3.1(+)-β-Fos(ΔZIP)-HaloTag C。
(7)将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在6 孔板中，共35个孔，培养24小时。
(8)上述细胞中的17盘分别使用6mL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N-β-Jun和pcDNA3.1(+)-β-Fos-HaloTag C。另外的17盘细胞中分别使用6mL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N-β-Jun和pcDNA3.1(+)- β-Fos(ΔZIP)-HaloTag C。剩余一盘只加入6mL的脂质体Lipo-2000作为空白对照。转染所用的培养基为不含血清的Opti-MEM。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。
(9)分别在上述25盘细胞的培养基中加入HaloTag的结合底物染料JF549，终浓度为 10nM。在培养箱中继续培养20分钟，使HaloTag充分与染料反应。
(10)使用1×PBS清洗细胞三遍，以去除没有反应的游离染料。最后清洗完成后使用浓度为0.25％的胰酶消化细胞。收集细胞后500G离心3分钟以沉淀细胞，吸去上清，各加入 0.5mL的1×PBS重悬细胞。
(11)将所有细胞进行流式细胞仪分析，所使用的检测通道为561nm。确定空白组、阴性对照组、阳性实验组的荧光强度分布。筛选出阳性实验组荧光强度最高和阴性实验组荧光强度最低的分裂位点作为后续实验所用的分裂位点。
(12)对于步骤(11)中所筛选到的分裂位点，使用步骤(7)-(9)所描述的方法转染细胞。使用1×PBS清洗细胞三遍，以去除没有反应的游离染料。最后清洗完成后换上不含酚红的培养基。使用带有活细胞培养装置的高倍全内反射显微镜观察细胞内的荧光驻留情况，记录细胞内的荧光强度和空间分布。确定分裂位点58位和261位为较好分裂位点。实验结果见说明书附图2。
实施例二：测量分裂的自连接标签的成熟动力学过程：
(1)通过PCR从含有FKBP和FRB的质粒上扩增出相应的DNA片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段，得到FKBP和FRB片段。所使用的PCR扩增体系参照实施例一步骤(2)。
(2)将载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N-β-Jun和pcDNA3.1(+)-β-Fos-HaloTag C分别使用限制酶双酶切过夜，得到切开的载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N和pcDNA3.1(+)-HaloTagC。同时 FKBP和FRB片段也使用相同的限制酶双酶切过夜。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。所使用的酶切体系参照实施例一步骤(3)。
(3)将pcDNA3.1(+)-HaloTag N与FRB连接得到载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N-FRB，pcDNA3.1(+)-HaloTag C与FKBP连接，得到载体pcDNA3.1(+)-FKBP-HaloTag C。所使用的连接体系参照实施例一步骤(4)。
(4)将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在6 孔板中，共96个孔，培养24小时。
(5)上述细胞中的48盘分别使用6mL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N58-FRB和pcDNA3.1(+)-FKBP-HaloTag C58。另外的48盘细胞中分别使用6mL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N261-FRB和pcDNA3.1(+)-FKBP-HaloTag C261。转染所用的培养基为不含血清的Opti-MEM。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。
(6)分别在上述96盘细胞的培养基中加入HaloTag的结合底物染料JF549，终浓度为 10nM。在培养箱中继续培养20分钟，以便使细胞与染料混合均匀。
(7)开始诱导实验。前11小时每隔1小时往平行的三盘细胞中加入终浓度为1nM的雷帕霉素。后3小时每隔0.5小时往平行的三盘细胞中加入终浓度为1nM的雷帕霉素。14个小时后终止加药实验。针对两个分裂位点，每个时间点有三盘平行细胞进行加药实验。
(8)使用1×PBS清洗细胞三遍，以去除没有反应的游离染料。最后清洗完成后使用浓度为0.25％的胰酶消化细胞。收集细胞后500G离心3分钟以沉淀细胞，吸去上清，各加入0.5mL的1×PBS重悬细胞。
(9)将所有细胞进行流式细胞仪分析，所使用的检测通道为561nm。确定不同时间点的荧光强度分布。相同时间点的三盘细胞的荧光强度取平均值。实验结果见说明书附图3。
实施例三：自连接标签的双分子荧光互补与光转换荧光蛋白双分子荧光互补的比较：
(1)通过PCR从含有mMaple3的质粒上扩增出相应的mMaple3N175和mMaple3C174片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段，得到mMaple3N175和mMaple3C174片段。所使用的PCR扩增体系参照实施例一步骤(2)。
(2)将载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N-β-Jun和pcDNA3.1(+)-β-Fos-HaloTag C分别使用限制酶双酶切过夜，得到切开的载体pcDNA3.1(+)-β-Jun和pcDNA3.1(+)-β-Fos。同时mMaple3 N174和mMaple3C175片段也使用相同的限制酶双酶切过夜。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。所使用的酶切体系参照实施例一步骤(3)。
(3)将pcDNA3.1(+)-β-Jun与mMaple3N175连接得到载体pcDNA3.1(+)-mMaple3N175- β-Jun，pcDNA3.1(+)-β-Fos与mMaple3C174连接，得到载体pcDNA3.1(+)-β-Fos-mMaple3 C174。所使用的连接体系参照实施例一步骤(4)。
(4)将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在2 盘成像专用的35mm Petri-Dish里，培养24小时。
(5)上述细胞中的1盘使用6mL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg载体pcDNA3.1(+)-mMaple3N175-β-Jun和pcDNA3.1(+)-β-Fos-mMaple3C174。另外的1盘细胞中使用6mL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N58-β-Jun和pcDNA3.1(+)-β-Fos-HaloTag C58。转染所用的培养基为不含血清的Opti-MEM。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。
(6)在上述转染分裂的自连接标签HaloTag的细胞培养基中加入HaloTag的结合底物染料JF549，终浓度为10nM。在培养箱中继续培养20分钟，使HaloTag充分与染料反应。
(7)使用1×PBS清洗转染分裂的自连接标签HaloTag的细胞三遍，以去除没有反应的游离染料。最后清洗完成后换上不含酚红的培养基。使用1×PBS清洗转染分裂的光转换荧光蛋白mMaple3的细胞一遍，换上不含酚红的培养基。
(8)针对转染分裂的自连接标签HaloTag的细胞，使用带有活细胞培养装置的高倍全内反射显微镜观察细胞内的荧光亮度。选择表达量较为合适的细胞，使用最强激光进行持续光照漂白，直到细胞中的出现单分子信号停止漂白。降低激光功率，采集单分子实验数据。对所得数据进行单分子漂白过程分析，实验结果见说明书附图4。
(8)针对转染分裂的自连接标签HaloTag的细胞和转染分裂的光转换荧光蛋白mMaple3 的细胞，分别使用带有活细胞培养装置的高倍全内反射显微镜观察细胞内的荧光亮度。选择表达量较为合适的细胞，使用相同功率的激光进行持续光照漂白，并在漂白过程中连续采集图像，直到细胞中的荧光完全漂白。对所得数据进行细胞整体漂白过程分析，实验结果见说明书附图5。
实施例四：利用自连接标签的双分子荧光互补技术研究二聚体转录因子c-Fos和c-Jun结合染色质DNA的动态过程。
(1)通过PCR从人的cDNA文库中扩增出c-Fos和c-Jun片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段，得到 c-Fos和c-Jun片段。所使用的PCR扩增体系参照实施例一步骤(2)。
(2)将载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N58-β-Jun和pcDNA3.1(+)-β-Fos-HaloTag C58分别使用限制酶双酶切过夜，得到切开的载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N58和pcDNA3.1(+)-HaloTag C58。同时c-Fos和c-Jun片段也使用相同的限制酶双酶切过夜。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。所使用的酶切体系参照实施例一步骤(3)。
(3)将pcDNA3.1(+)-HaloTag N58与c-Jun连接得到载体pcDNA3.1(+)-HaloTagN58-c- Jun。pcDNA3.1(+)-HaloTag C58与c-Fos连接，得到载体pcDNA3.1(+)-c-Fos-HaloTag C58。所使用的连接体系参照实施例一步骤(4)。
(4)将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在成像专用的35mm Petri-Dish里，培养24小时。
(5)上述细胞使用6mL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg载体pcDNA3.1(+)-HaloTagN58-c-Jun和pcDNA3.1(+)-c-Fos-HaloTag C58。转染所用的培养基为不含血清的Opti-MEM。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。
(6)在上述转染的细胞培养基中加入HaloTag的结合底物染料JF549，终浓度为10nM。在培养箱中继续培养20分钟，以便使细胞与染料混合均匀。
(7)使用1×PBS清洗细胞三遍，以去除没有反应的游离染料。最后清洗完成后换上不含酚红的培养基。
(8)使用带有活细胞培养装置的高倍全内反射显微镜观察细胞内的荧光亮度。选择表达量较为合适的细胞，使用最强激光进行持续光照漂白，直到细胞中的出现单分子信号停止漂白。降低激光功率，采集单分子实验数据。分别在两个时间尺度内进行实验。使用10ms的短曝光时间连续采集单分子数据，用来研究所有分子的扩散行为，求取结合DNA的分子的比例。使用500ms的长曝光时间连续采集单分子数据，用来研究稳定结合DNA的分子的驻留时间。实验结果见说明书附图6和7。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 利用自连接标签的双分子荧光互补技术成像和追踪活细胞内的蛋白质相互作用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val
1 5 10 15
Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp
20 25 30
Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val
35 40 45
Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro
50 55
<210> 2
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Thr His Arg Cys Ile Ala Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp
1 5 10 15
Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp
20 25 30
Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His
35 40 45
Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu
50 55 60
Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr
65 70 75 80
Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg
85 90 95
Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile
100 105 110
Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu
115 120 125
Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro
130 135 140
Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn
145 150 155 160
Ile Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro
165 170 175
Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro
180 185 190
Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val
195 200 205
Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu
210 215 220
Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly
225 230 235 240
<210> 3
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val
1 5 10 15
Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp
20 25 30
Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val
35 40 45
Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala
50 55 60
Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Phe Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu
85 90 95
Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu
100 105 110
Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala
115 120 125
Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu
130 135 140
Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg
145 150 155 160
Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met
165 170 175
Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu
180 185 190
Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn
195 200 205
Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu
210 215 220
Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe
225 230 235 240
Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu
245 250 255
Ala Lys Ser Leu Pro
260
<210> 4
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn Leu Leu Gln Glu
1 5 10 15
Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Ser Thr
20 25 30
Leu Glu Ile Ser Gly
35

Claims (10)

1.一种基于自连接标签的双分子荧光互补方法，其特征在于，使用分裂的自连接标签，在所融合的待检测蛋白质之间有相互作用时有荧光产生，从而实现检测和追踪蛋白质之间的相互作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在合适的位点将自连接标签分裂成两个部分，分别融合两个具有相互作用的蛋白质，当这两个蛋白质相互作用时可以把分裂的自连接标签在空间上拉近而形成完整的有功能的自连接标签，加入荧光染料连接的底物时可以发出荧光。
3.根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于，通过在不同的不影响蛋白质三维结构的位点将自连接标签分裂成两个部分，利用细胞内荧光扣留的检测方法筛选出合适的自连接标签的分裂位点。
4.根据权利要求1-3所述的方法，一种基于自连接标签的双分子荧光互补方法，其特征在于，所使用的自连接标签可以是HaloTag，SnapTag，ClipTag等。
5.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所使用的荧光染料为光稳定性好、亮度高的小分子透膜染料。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于，所使用的体系可以是固定细胞，也可以是活细胞，在固定细胞中可以用来检测蛋白质之间相互作用，在活细胞中可以追踪蛋白质之间的相互作用。
7.根据权利要求1-6所述的方法，其特征在于，既可以在单细胞水平检测蛋白质之间的相互作用，也可以在单分子水平检测蛋白质之间的相互作用。
8.根据权利要求1-7所述的方法，一种基于自连接标签的双分子荧光互补方法，其特征在于，由以下步骤制备：
在不同的位点将自连接标签分裂成两个部分，通过PCR扩增出分裂的两段蛋白，分别融合一对待检测的蛋白质，连入具有表达框的载体，构建质粒，转染哺乳动物细胞，加入相应染料，在显微镜下观察细胞内是否发生互补产生荧光。
9.权利要求1-5所述的方法在检测和追踪细胞内一对蛋白质的相互作用中的应用。
10.权利要求1-5和10所述的方法在检测可以相互作用形成复合物的DNA结合蛋白与染色质DNA相互作用过程中的应用，包括测量相互作用复合物结合DNA的比例，驻留时间等参数。
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