CN116068198A - Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 - Google Patents
Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116068198A CN116068198A CN202211524398.XA CN202211524398A CN116068198A CN 116068198 A CN116068198 A CN 116068198A CN 202211524398 A CN202211524398 A CN 202211524398A CN 116068198 A CN116068198 A CN 116068198A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- smbit
- lgbit
- fusion protein
- protein
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 claims abstract description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 19
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 23
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 38
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 38
- 229920000333 poly(propyleneimine) Polymers 0.000 description 23
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108700043045 nanoluc Proteins 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 7
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 4
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- HTBLMRUZSCCOLL-UHFFFAOYSA-N 8-benzyl-2-(furan-2-ylmethyl)-6-phenylimidazo[1,2-a]pyrazin-3-ol Chemical compound OC1=C(CC2=CC=CO2)N=C2N1C=C(N=C2CC1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1 HTBLMRUZSCCOLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000708009 Homo sapiens Sentrin-specific protease 8 Proteins 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010378 bimolecular fluorescence complementation Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125864 PPI inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100031407 Sentrin-specific protease 8 Human genes 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid;2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound CCS(O)(=O)=O.OCCN1CCNCC1 DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 europium ion Chemical class 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000011991 general safety test Methods 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPWOBEOETVOESI-UHFFFAOYSA-N imidazo[4,5-b]pyrazin-2-one Chemical class N1=CC=NC2=NC(=O)N=C21 MPWOBEOETVOESI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBECWGJPSXHFCS-UHFFFAOYSA-N imidazole-1-carbaldehyde Chemical class O=CN1C=CN=C1 XBECWGJPSXHFCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002877 time resolved fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物分子技术领域，具体涉及一种PPI原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用。本发明利用LgBit和抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体构建LgBit‑antiM Nb质粒，优化表达得到融合蛋白1；利用SmBit和抗兔lgG Fc的纳米抗体构建SmBit‑antiR Nb质粒；优化表达得到融合蛋白2；在固定细胞样本或病理组织中孵育上述两种融合蛋白，加入萤光素酶底物，通过检测化学发光强度判断目标蛋白对是否存在相互作用。本专利的检测方法融合了NanoBit系统与Nb的优势，解决了哺乳动物细胞或者组织中内源蛋白质相互作用信号极弱的问题，实现低表达量和高通量的蛋白质相互作用的原位检测。
Description
技术领域
本发明属于生物分子技术领域，具体涉及一种PPI原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用。
背景技术
蛋白质相互作用（protein-protein interaction，简称“PPI”）是蛋白质行使生物功能的重要环节。PPI参与调控细胞生命活动的方方面面，包括但不限于基因的复制与激活，信号传导，代谢活动的调控等。异常PPI会导致疾病的发生，促进疾病的进展。例如，癌症中存在异常的P53蛋白和MDM2蛋白相互作用，其介导P53蛋白降解，阻止癌细胞的凋亡。PPI抑制剂是药物开发的新领域，为针对传统意义上“无成药性（undruggable）”的非酶蛋白靶点，提供新思路。PPI也为临床诊断提供重要的靶点和方向。
目前PPI体外研究的主要技术包括免疫共沉淀、酵母双杂交和GST融合蛋白沉降（GST pull down）等技术。这些技术需要裂解细胞或者酵母外源表达，难以真实指示哺乳动物细胞或者组织内的蛋白相互作用。基于荧光蛋白开发的荧光共振能量转移技术（FRET）和双分子荧光互补技术（BiFC）可以检测活细胞内的蛋白质相互作用，然而这两种方法均依赖于异源基因在哺乳细胞内的导入与过表达。且由于细胞自发荧光的限制，基于荧光的检测技术难以降低背景，导致信噪比和灵敏度均有限。目前邻近连接技术可以实现细胞原位PPI的检测，但该方法需要在抗体上化学耦连不同的核苷酸链，并且在免疫标记结束后，还需要滚环扩增和荧光探针孵育等复杂的显色步骤。该方法假阳率高，耗时长且试剂成本高昂。
基于分割型萤光素酶（Split萤光素酶；Split NanoLuc）开发的PPI检测技术，利用其生物发光和酶催化的特性，不仅可以最大程度的消除背景，同时可以数量级地放大信号，显著提升信噪比。纳米荧光素酶（Nanoluciferase；简称：NanoLuc）是近年来发现的新型萤光素酶。该酶分子量小，相较于萤火虫萤光素酶（61kDa）和海肾萤光素酶（36kDa），分子量仅为19KD，便于融合表达；发光强度较传统萤光素酶高出两个数量级，线性范围高达六个数量级，有利于提高检测灵敏度；不依赖于ATP（腺嘌呤核苷三磷酸），与专用底物furimazine（咪唑并吡嗪酮类的发光底物）的反应稳定，不受环境温度等因素的影响。NanoLuc® BinaryTechnology(简称NanoBit系统)是一种基于NanoLuc萤光素酶的二子单元系统，可用来检测活细胞内蛋白质的相互作用；NanoBit系统将完整的NanoLuc蛋白拆分为两个亚基，包含18kDa的大片段（简称LgBit）和1.3kDa的小片段（简称SmBit）。将LgBit和SmBit分别融合表达在待检测PPI蛋白上，即可通过互补激活的萤光素酶活性指示目标蛋白质的相互作用。目前，NanoBit系统主要通过在哺乳动物细胞中过表达以上融合蛋白体系，来指示细胞内的蛋白质相互作用程度。但是该方法需要因蛋白而异的定制质粒和过表达异源蛋白，难以实现原代细胞和病理组织中PPI的原位检测和临床诊断等。
公开号为CN111198272A的发明专利公开了一种基于NanoBiT系统的体外检测蛋白间相互作用的方法，然而该方法需要因蛋白而异的定制质粒和过表达异源蛋白，难以实现原代细胞和病理组织中PPI的原位检测，同时该专利也并未公开纳米抗体的应用。
有鉴于此，本专利通过融合NanoBit系统与纳米抗体（Nanobody,Nb）的优势，开发一种可以原位、高通量、复杂样本的快速检测PPI的通用方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于PPI原位检测的诊断试剂。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于PPI原位检测的诊断试剂，所述诊断试剂包括表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1和/或表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2；所述融合蛋白1中的纳米抗体为抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体，所述融合蛋白1包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的LgBit；所述融合蛋白2中的纳米抗体为抗兔lgG Fc的纳米抗体，所述融合蛋白2包含核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的SmBit-antiR Nb。
本发明的目的之二在于提供一种采用所述诊断试剂检测蛋白质相互作用的原位检测方法，该方法通过构建和表达LgBit或SmBit与纳米抗体二抗的融合蛋白，实现PPI的原位检测。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
采用所述诊断试剂检测蛋白质相互作用的原位检测方法，通过基因工程和生物发酵制备标签蛋白修饰的纳米抗体，进而实现蛋白质相互作用的原位检测。
进一步，所述标签蛋白为LgBit和/或SmBit。
进一步，所述方法包括以下步骤：
S1：利用所述LgBit和所述抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体构建LgBit-antiM Nb载体；
S2：将所述LgBit-antiM Nb载体进行优化表达，得到所述表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1；
S3：利用所述SmBit和所述抗兔lgG Fc的纳米抗体构建所述SmBit-antiR Nb载体；
S4：将所述SmBit-antiR Nb载体进行优化表达，得到所述表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2；
S5：在固定细胞样本或病理组织中孵育所述融合蛋白1和所述融合蛋白2，加入萤光素酶底物，通过检测化学发光强度，判断目标蛋白对是否存在相互作用。
纳米抗体的单链和小尺寸特性使其易于采用原核系统表达各种标签融合的多功能衍生蛋白。相较于传统单克隆抗体需采用真核表达体系，且需在纯化后进行标签化，标签蛋白修饰的纳米抗体只需通过构建质粒和生物发酵就可大量获得，成本低廉，且稳定性好。
本专利根据Split NanoLuc的原理，通过原核表达优化LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb稳定活性蛋白，作为检测蛋白质互作的通用二抗。只需要三步即可对蛋白相互作用进行原位检测和诊断：1.选择合适的一抗对细胞或者组织样本孵育，用于特异性标记靶蛋白对；2.使用原核表达的二抗孵育样本，便于蛋白质互作的通用检测；3.原位发光或者成像，也可进行大规模高通量筛选。简单来说，对于待测的PPI对，只需购买鼠/兔不同种属的一抗，采用传统免疫荧光染色步骤，对细胞或者组织样本进行一抗孵育，然后孵育LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb即可。对于相互作用的PPI来说，一抗介导LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb相互靠近，从而促使LgBit与SmBit互补形成一个完整的NanoLuc萤光素酶。加入furimazine，即可催化生物发光。通过检测生物发光的强弱即可测量蛋白质相互作用的多寡。
进一步，所述方法具体包括以下步骤：
1）将LgBit与抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体同时构建到优化后的原核表达载体中，获得融合的LgBit-antiM Nb表达载体；
2）在原核系统中优化LgBit-antiM Nb的表达，获得稳定的活性蛋白；
3）将SmBit与抗兔lgG Fc的纳米抗体同时构建到优化后的原核表达载体中，获得融合的SmBit-antiR Nb表达载体；
4）在原核系统中优化SmBit-antiR Nb的表达，获得稳定的活性蛋白；
5）采用哺乳动物细胞，通过固定，穿孔，一抗标记，LgBit-antiM Nb和SmBit-antiRNb孵育，以及底物液发光等步骤，观测目标蛋白对是否存在相互作用。
进一步，底物发光表明目标蛋白对存在相互作用；底物不发光表明目标蛋白对不存在相互作用。
当目标蛋白对存在相互作用，LgBit与SmBit互补进而形成完整的NanoLuc萤光素酶，催化底物发光。
进一步，通过酶标仪和/或显微镜成像定量分析蛋白相互作用的多寡。
本发明的目的之三在于提供一种用于构建所述融合蛋白1的LgBit-antiM Nb表达载体。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于构建所述融合蛋白1的LgBit-antiM Nb表达载体，LgBit-antiM Nb扩增的LgBit_For和LgBit_Rev引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之四在于提供一种用于构建所述融合蛋白2的SmBit-antiR Nb表达载体。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于构建所述融合蛋白2的SmBit-antiR Nb表达载体，SmBit-antiR Nb扩增的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的SmBit_F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的SmBit_F2、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的SmBit_R1、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的SmBit_R2。
本发明的目的之五在于提供一种所述的诊断试剂在制备用于蛋白质相互作用原位检测的试剂盒中的应用。
进一步，所述诊断试剂在制备用于检测低表达量的蛋白质相互作用的试剂盒中的应用。
进一步，所述诊断试剂在制备用于筛选病理相关PPI靶点的试剂盒中的应用。
进一步，所述诊断试剂在制备用于PPI抑制剂的高通量筛选的产品中的应用。
本发明的目的之六在于提供一种用于PPI原位检测的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于检测蛋白质相互作用的试剂盒，所述试剂盒含有所述表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1和/或所述表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2。
本发明方法涵盖了采用LgBit或SmBit耦连纳米抗体二抗用于蛋白质相互作用的原位检测；检测手段包括但不限于酶标仪和显微镜成像；检测应用包括但不限于细胞或组织内PPI的原位检测，PPI抑制剂的高通量筛选等。
本发明的有益效果在于：
1.本专利提供的检测方法，不需要导入异源基因就可以对原代细胞和病理切片进行蛋白质相互作用的原位检测；
2.本专利采用商业一抗，不需要针对目标蛋白进行一抗的标记或者开发，使用方便；同时本发明采用生物发酵可大量获得LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb，成本较低；
3.本发明基于NanoLuc生物发光原理，检测限低，相较于时间分辨荧光共振能量转移（TR FRET），可以检出表达量更低的蛋白质相互作用，实现高通量的蛋白质相互作用的原位检测；
4.本专利的检测方法稳定可靠，可以大规模通用检测，适合临床病理等各种样本检测，并且本检测方法操作简便，可以快速实现检测和诊断，适合临床试剂盒开发；
5.本发明方法解决了哺乳动物细胞或者组织中，天然蛋白质相互作用信号极弱的问题，利用NanoLuc的超强发光与抗体的信号放大功能，实现了96孔板内细胞的蛋白质相互作用的原位检测。
附图说明
图1为原位检测蛋白质相互作用方法的原理示意图。
图2为LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb的SDS PAGE图。
图3为α-tubulin与β-tubulin的免疫荧光图。
图4为基于本发明检测MCF-7细胞中α-tubulin与β-tubulin的相互作用的结果图，横坐标中，G1表示LgBit-antiM Nb+SmBit-antiR Nb；G2表示Primary antibody+LgBit-antiM Nb+SmBit-antiR Nb；G3表示Primary antibody+LgBit-antiM Nb；纵坐标Lum表示发光强度。
图5为基于本发明检测U2OS细胞中α-tubulin与β-tubulin的相互作用的结果图，横坐标中，G1表示LgBit-antiM Nb+SmBit-antiR Nb；G2表示Primary antibody+LgBit-antiM Nb+SmBit-antiR Nb；G3表示Primary antibody+LgBit-antiM Nb；纵坐标Lum表示发光强度。
图6为基于TR FRET检测U2OS细胞中α-tubulin与β-tubulin的相互作用的结果图；横坐标中，A1表示α/β tubulin antibody+antiR Eu+antiM Alexa647；A2表示α/β tubulin+antiR Eu；A3表示antiR Eu+antiM Alexa647；纵坐标665/615nm ratio表示FRET比例。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本申请中：
抗小鼠lgG1 Fc：抗小鼠免疫球蛋白1的可结晶段；
抗兔lgG Fc：抗兔免疫球蛋白的可结晶段；
lgG：免疫球蛋白的一种；
LgBit_For：大片段上游引物；LgBit_Rev：大片段下游引物；
SmBit_F1：小片段上游引物1；SmBit_F2：小片段上游引物2；SmBit_R1：小片段下游引物1；SmBit_R2：小片段下游引物2；
α-tubulin rabbit mAb：α-微管蛋白兔单抗；
β-tubulin mouse mAb：β-微管蛋白小鼠单抗；
Kpn1、BamH1、Hind III：限制性核酸内切酶；
Gibson assembly同源重组方法：一种分子克隆方法，它允许在单个等温反应中连接多个DNA片段，是一种不使用限制酶将片段插入质粒的常见方法；
DH5α：大肠杆菌的一种诱变菌株；
BL21(DE3)pLysS感受态：细胞是大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化；
sanger法测序：根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，从而获得DNA碱基序列的一种方法；
LB培养基：全称Luria-Bertani培养基，是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基；
HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；
Imidazole：1-甲酰基咪唑；
1×PBS：浓度为0.01M的磷酸缓冲盐溶液；
Primary antibody：一级抗体；
LgBit-antiM Nb：N端融合表达LgBit的抗鼠IgG1 Fc的纳米抗体；
SmBit-antiR Nb：N端融合表达SmBit的抗兔IgG Fc的纳米抗体；
antiR Nb：抗兔IgG Fc的纳米抗体；
α/β tubulin antibody：α或者β微管蛋白一抗；
antiR Eu：Eu纳米颗粒标记的抗兔IgG抗体；
antiM Alexa647：Alexa647标记的抗鼠IgG抗体；
pFN33K LgBiT TK-neo Flexi® Vector：商业化质粒，来源于promega公司；
pTP1122质粒：商业化质粒，来源于addgene公司；
pTP955质粒：商业化质粒，来源于addgene公司；
NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix：商业化试剂，用于DNA片段连接，来源于New England Biolabs公司；
Alexa647：商业化荧光小分子，激发光为647nm。
实施例1
蛋白质相互作用的原位检测方法原理如图1所示，该方法具体包括以下步骤：
1）将LgBit与抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体同时构建到优化后的原核表达载体中，获得融合的LgBit-antiM Nb表达载体；
2）在原核系统中优化LgBit-antiM Nb的表达，获得稳定的活性蛋白1；
3）将SmBit与抗兔lgG Fc的纳米抗体同时构建到优化后的原核表达载体中，获得融合的SmBit-antiR Nb表达载体；
4）在原核系统中优化SmBit-antiR Nb的表达，获得稳定的活性蛋白2；
5）采用哺乳动物细胞，通过固定，穿孔，一抗标记，LgBit-antiM Nb和SmBit-antiRNb孵育，以及底物液显色等步骤，观测目标蛋白对是否存在相互作用。若存在相互作用，则LgBit与SmBit互补形成完整的NanoLuc萤光素酶，从而催化底物发光。通过酶标仪或者显微镜成像可定量分析蛋白相互作用的多寡。
实施例2. LgBit-antiM Nb质粒构建
从pFN33K LgBiT TK-neo Flexi® Vector（商业化质粒）中采用LgBit_For和LgBit_Rev引物扩增带有同源臂的LgBiT基因序列。采用Kpn1和BamH1酶切pTP1122质粒（商业化质粒），获得载体。采用Gibson assembly同源重组方法连接LgBiT与酶切后载体。将连接产物转入DH5α感受态菌落，涂板挑取单克隆，采用sanger法测序鉴定和挑选正确质粒，最后获得LgBit-antiM Nb的原核表达质粒。LgBiT扩增的LgBit_For和LgBit_Rev引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，扩增后序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例3. SmBit-antiR Nb质粒构建
从pTP955质粒（商业化质粒）中采用SmBit_F1和SmBit_R1引物扩增带有部分SmBit序列的antiR Nb基因序列。采用SmBit_F2和SmBit_R2引物扩增带同源臂以及完整SmBit序列的antiR Nb基因序列。采用Hind III和BamH1酶切pTP955质粒（商业化质粒），获得载体。按照NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix说明书连接SmBit-antiR Nb与酶切后载体。将连接产物转入DH5α感受态菌落，涂板挑取单克隆，采用sanger法测序鉴定和挑选正确质粒，获得SmBit-antiR Nb的原核表达质粒。
SmBit-antiR Nb扩增的PCR引物序列：SmBit_F1如SEQ ID NO.4所示；SmBit_F2如SEQ ID NO.5所示；SmBit_R1如SEQ ID NO.6所示；SmBit_R2如SEQ ID NO.7所示。扩增后序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例4. 融合蛋白的表达
将实施例1构建的LgBit-antiM Nb和实施例2构建的SmBit-antiR Nb质粒导入BL21(DE3)pLyss感受态，筛选获得单克隆。挑取单克隆至5mL新鲜的LB培养基中，37度扩增培养过夜。将培养后的大肠杆菌稀释至1L新鲜的LB培养基中，37度培养2-3小时，当OD600（即溶液在600nm波长处的吸光值）达到0.4时，采用浓度为0.2mM IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达20小时，表达温度为18度。采用8000rpm离心收集菌液，采用40mL裂解缓冲液重悬沉淀，高压匀质10分钟，裂解缓冲液由浓度为50mM的HEPES、浓度为500mM的氯化钠和浓度为20mM的Imidazole组成，pH为7.5。采用20000g离心30分钟，取上清用Ni-NTA（镍离子金属鳌合亲和层析介质）纯化目标蛋白。采用5mL洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，洗脱缓冲液由浓度为50mM的HEPES、浓度为500mM的氯化钠和浓度为500mM的Imidazole组成，pH为7.5。在洗脱后的蛋白液中加入浓度为300nM的NEDP1酶切纯化标签。采用1×PBS（含有浓度为20mM的Imidazole）透析酶切后产物，透析后再次采用Ni-NTA去除纯化标签、NEDP1酶及含有组氨酸的杂蛋白，穿透液采用1×PBS透析，最后用超滤管浓缩蛋白至1mg/ml，分装后于-80℃保存。纯化后蛋白的SDS PAGE图（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图）如图2所示。
实施例5. 选取和验证蛋白质相互作用模型
α微管蛋白（α-tubulin）与β微管蛋白（β-tubulin）通常形成异二聚体并进一步聚合成微管，因此是测试PPI的良好模型。首先，我们选择免疫荧光检测抗体的适用性，使用α-tubulin rabbit mAb(公司：abcam，货号：ab52866，稀释倍数：1:250)和β-tubulin mousemAb(公司：abclonal， 货号：AC021，稀释倍数：1:100)作为特异性靶向α-tubulin和β-tubulin的抗体，采用抗兔lgG Alexa 488（公司：abcam, 货号：ab150077，稀释倍数：1:1000）和抗鼠lgG Alexa 594（公司：CST，货号：8890S，稀释倍数：1:1000）标记识别不同种属的一抗。采用搭载Airyscan2（面阵列检测器）的Zeiss 980共聚焦荧光显微镜，观测抗体的染色效果。免疫荧光结果如图3所示，该结果表明α-tubulin和β-tubulin的抗体在细胞质中存在明显的共定位，且可清晰指示细胞中微管的纤维状结构。
实施例6. 以α-tubulin 和β-tubulin作为模型原位检测蛋白相互作用
采用MCF-7（人乳腺癌细胞）作为细胞模型。铺板96孔细胞培养板，每孔3万细胞。培养过夜后，采用PBS清洗贴壁细胞。采用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，采用质量分数为0.25%的Triton（破膜液）破膜，采用质量分数为5%的BSA（牛血清白蛋白）封闭两小时。然后采用α-tubulin rabbit mAb(公司：abcam，货号：ab52866，稀释倍数：1:250)和β-tubulin mousemAb(公司：abclonal，货号：AC021，稀释倍数：1:100)孵育细胞过夜或者37℃孵育1小时。采用LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb在37℃条件下孵育细胞1h。彻底清洗未结合的抗体，加入NanoLuc底物，采用酶标仪检测化学发光强度。结果如图4所示。相较于对照组，即不加入一抗或不加入SmBit-antiR Nb，实验组的化学发光强度高出一个数量级左右。
实施例7. 对比本发明方法与商业化TR FRET方法的灵敏度
采用U2OS（人骨肉瘤细胞）作为细胞模型。铺板96孔细胞培养板，每孔3万细胞。采用如实施例5所示方法，检测α-tubulin和β-tubulin的相互作用。结果如图5所示。相较于对照组，即不加入一抗或不加入SmBit-antiR Nb，实验组的化学发光强度高出4-6倍。同时采用相同的细胞密度铺板96孔板，过夜培养后，如前所示固定、穿透、封闭细胞，并采用α-tubulin和β-tubulin抗体孵育细胞过夜或者37℃孵育1小时。然后采用抗兔lgG抗体（铕离子标记，浓度为1nM）和抗鼠lgG抗体（Alexa647标记）在37℃条件下孵育细胞1h。采用说明书推荐方法检测TR FRET的强度。结果如图6所示，相较于对照组，即不加入一抗或不加入SmBit-antiR Nb，实验组的化学发光强度高出2-4倍。通过对比，可以发现本发明方法相较于商业化试剂具有更高灵敏度。
Claims (11)
1.用于PPI原位检测的诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1和/或表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2；所述融合蛋白1中的纳米抗体为抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体，所述融合蛋白1包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的LgBit；所述融合蛋白2中的纳米抗体为抗兔lgG Fc的纳米抗体，所述融合蛋白2包含核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的SmBit-antiR Nb。
2.采用权利要求1所述的诊断试剂检测蛋白质相互作用的原位检测方法，其特征在于，通过基因工程和生物发酵制备标签蛋白修饰的纳米抗体，进而实现蛋白质相互作用的原位检测。
3.根据权利要求2所述的原位检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：利用所述LgBit和所述抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体构建LgBit-antiM Nb载体；
S2：将所述LgBit-antiM Nb载体进行优化表达，得到所述表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1；
S3：利用所述SmBit和所述抗兔lgG Fc的纳米抗体构建所述SmBit-antiR Nb载体；
S4：将所述SmBit-antiR Nb载体进行优化表达，得到所述表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2；
S5：在固定细胞样本或病理组织中孵育所述融合蛋白1和所述融合蛋白2，加入萤光素酶底物，通过检测化学发光强度，判断目标蛋白对是否存在相互作用。
4.根据权利要求3所述的原位检测方法，其特征在于，底物发光表明目标蛋白对存在相互作用；底物不发光表明目标蛋白对不存在相互作用。
5.用于构建所述融合蛋白1的LgBit-antiM Nb表达载体，其特征在于，LgBit-antiM Nb扩增的LgBit_For和LgBit_Rev引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
6.用于构建所述融合蛋白2的SmBit-antiR Nb表达载体，其特征在于，SmBit-antiR Nb扩增的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的SmBit_F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的SmBit_F2、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的SmBit_R1、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的SmBit_R2。
7.权利要求1所述的诊断试剂在制备用于蛋白质相互作用原位检测的试剂盒中的应用。
8.权利要求1所述的诊断试剂在制备用于检测低表达量的蛋白质相互作用的试剂盒中的应用。
9.权利要求1所述的诊断试剂在制备用于筛选病理相关PPI靶点的试剂盒中的应用。
10.权利要求1所述的诊断试剂在制备用于PPI抑制剂的高通量筛选的产品中的应用。
11.一种用于PPI原位检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有所述表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1和/或所述表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211524398.XA CN116068198B (zh) | 2022-11-30 | 2022-11-30 | Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211524398.XA CN116068198B (zh) | 2022-11-30 | 2022-11-30 | Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116068198A true CN116068198A (zh) | 2023-05-05 |
| CN116068198B CN116068198B (zh) | 2024-01-09 |
Family
ID=86169047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211524398.XA Active CN116068198B (zh) | 2022-11-30 | 2022-11-30 | Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116068198B (zh) |
Citations (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030032154A1 (en) * | 2001-01-30 | 2003-02-13 | Yizhong Gu | Human LCCL domain containing protein |
| CN102449147A (zh) * | 2009-05-29 | 2012-05-09 | 国立大学法人东京大学 | 蛋白质间相互作用的高灵敏度检测方法 |
| CN103443121A (zh) * | 2010-11-02 | 2013-12-11 | 普罗梅加公司 | 新型腔肠素底物及其使用方法 |
| CN104568861A (zh) * | 2013-10-25 | 2015-04-29 | 华东理工大学 | 一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法 |
| WO2016122259A1 (ko) * | 2015-01-30 | 2016-08-04 | 동국대학교 산학협력단 | 단일사슬항체조각과 페리틴을 포함하는 융합단백질 및 그의 용도 |
| WO2016207313A1 (en) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and kits for detecting protein-protein interactions |
| CN108048480A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-05-18 | 湖北大学 | 一种split-TEV-Fast系统的构建方法及其在检测蛋白相互作用中的应用 |
| US20180224459A1 (en) * | 2017-02-08 | 2018-08-09 | Colorado State University Research Foundation | Nanobody conjugates and protein fusions as bioanalytical reagents |
| CN108519484A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-09-11 | 北京大学 | 利用自连接标签的双分子荧光互补技术成像和追踪活细胞内的蛋白质相互作用 |
| CN109385450A (zh) * | 2017-08-02 | 2019-02-26 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统及应用 |
| CN110283244A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-27 | 重庆医科大学 | 用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统 |
| CN110475864A (zh) * | 2017-02-02 | 2019-11-19 | 纽约基因组研究中心公司 | 用于识别或量化在生物样品中的靶标的方法和组合物 |
| WO2020043812A1 (en) * | 2018-08-30 | 2020-03-05 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. | Method for detecting a modulator compound for chemical targeting of protein-protein interactions |
| CN111198272A (zh) * | 2018-11-20 | 2020-05-26 | 香港理工大学深圳研究院 | 体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用 |
| CN112567028A (zh) * | 2018-06-12 | 2021-03-26 | 普洛麦格公司 | 多部分萤光素酶 |
| CN113527476A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-10-22 | 华南农业大学 | 抗h5亚型禽流感病毒新纳米抗体及其应用 |
| CN114441772A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-05-06 | 北京大学 | 用于检测细胞内能够与rna结合的靶分子的方法和试剂 |
| CN114478761A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-13 | 集美大学 | 绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体、制备方法及其应用 |
| CN114957454A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-08-30 | 青岛农业大学 | 一种抗csfv e2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-11-30 CN CN202211524398.XA patent/CN116068198B/zh active Active
Patent Citations (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030032154A1 (en) * | 2001-01-30 | 2003-02-13 | Yizhong Gu | Human LCCL domain containing protein |
| CN102449147A (zh) * | 2009-05-29 | 2012-05-09 | 国立大学法人东京大学 | 蛋白质间相互作用的高灵敏度检测方法 |
| CN103443121A (zh) * | 2010-11-02 | 2013-12-11 | 普罗梅加公司 | 新型腔肠素底物及其使用方法 |
| CN104568861A (zh) * | 2013-10-25 | 2015-04-29 | 华东理工大学 | 一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法 |
| WO2016122259A1 (ko) * | 2015-01-30 | 2016-08-04 | 동국대학교 산학협력단 | 단일사슬항체조각과 페리틴을 포함하는 융합단백질 및 그의 용도 |
| WO2016207313A1 (en) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and kits for detecting protein-protein interactions |
| CN110475864A (zh) * | 2017-02-02 | 2019-11-19 | 纽约基因组研究中心公司 | 用于识别或量化在生物样品中的靶标的方法和组合物 |
| US20180224459A1 (en) * | 2017-02-08 | 2018-08-09 | Colorado State University Research Foundation | Nanobody conjugates and protein fusions as bioanalytical reagents |
| CN109385450A (zh) * | 2017-08-02 | 2019-02-26 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统及应用 |
| CN108048480A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-05-18 | 湖北大学 | 一种split-TEV-Fast系统的构建方法及其在检测蛋白相互作用中的应用 |
| CN108519484A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-09-11 | 北京大学 | 利用自连接标签的双分子荧光互补技术成像和追踪活细胞内的蛋白质相互作用 |
| CN112567028A (zh) * | 2018-06-12 | 2021-03-26 | 普洛麦格公司 | 多部分萤光素酶 |
| WO2020043812A1 (en) * | 2018-08-30 | 2020-03-05 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. | Method for detecting a modulator compound for chemical targeting of protein-protein interactions |
| CN111198272A (zh) * | 2018-11-20 | 2020-05-26 | 香港理工大学深圳研究院 | 体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用 |
| CN110283244A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-27 | 重庆医科大学 | 用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统 |
| CN113527476A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-10-22 | 华南农业大学 | 抗h5亚型禽流感病毒新纳米抗体及其应用 |
| CN114478761A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-13 | 集美大学 | 绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体、制备方法及其应用 |
| CN114441772A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-05-06 | 北京大学 | 用于检测细胞内能够与rna结合的靶分子的方法和试剂 |
| CN114957454A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-08-30 | 青岛农业大学 | 一种抗csfv e2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NIDHI NATH 等: "A homogeneous bioluminescent immunoassay for parallel characterization of binding between a panel of antibodies and a family of Fcγ receptors", SCI REP, vol. 12, no. 1 * |
| NIDHI NATH 等: "Deciphering the Interaction between Neonatal Fc Receptor and Antibodies Using a Homogeneous Bioluminescent Immunoassay", J IMMUNOL, vol. 207, no. 4 * |
| 赵燕;周俭民;: "萤火素酶互补实验检测蛋白互作", 植物学报, no. 01 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116068198B (zh) | 2024-01-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11198864B2 (en) | Protease-resistant systems for polypeptide display and methods of making and using thereof | |
| US11390653B2 (en) | Amino acid-specific binder and selectively identifying an amino acid | |
| Gu et al. | Protein tag-mediated conjugation of oligonucleotides to recombinant affinity binders for proximity ligation | |
| CN106916795B (zh) | 一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用 | |
| EP2585487B1 (en) | Coincidence detection | |
| CA3168282A1 (en) | Activity-specific cell enrichment | |
| EP1109931A1 (en) | METHOD FOR STUDYING PROTEIN INTERACTIONS $i(IN VIVO) | |
| Soppina et al. | Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs | |
| CN116068198B (zh) | Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 | |
| EP3622292B1 (en) | Genetically encoded potassium ion indicators | |
| CN114561423B (zh) | 一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒 | |
| WO2024113229A1 (zh) | Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 | |
| CN109880840B (zh) | 一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统 | |
| Shi et al. | Novel Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assay for in vivo visualization of the protein-protein interactions and cellular protein complex localizations | |
| CN113943718B (zh) | 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用 | |
| WO2024000408A1 (zh) | 荧光素酶突变体及其应用 | |
| KR102470653B1 (ko) | 특정 단백질의 메티오닌 잔기의 산화정도를 정량적으로 측정할 수 있는 형광단백질 센서 및 이의 용도 | |
| CN110437341B (zh) | 一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用 | |
| Schofield et al. | Sequencing and affinity determination of antigen-specific B lymphocytes from peripheral blood | |
| CN116445527A (zh) | 一种检测plk1赖氨酸乙酰化水平的探针及其应用 | |
| CN117069861A (zh) | 一种用于识别并标记糖链的融合蛋白及其应用 | |
| US20120282643A1 (en) | Cyan and yellow fluorescent color variants of split gfp | |
| KR20160071793A (ko) | 항체 검출용 비형광 프로브 | |
| Suwita et al. | p53 binds more dynamically to response elements that are closer to the consensus sequence | |
| KR20110026965A (ko) | 리포터로 사용 가능한 베타 클루코시다아제와 이를 인디케이터로 이용한 클로닝 벡터의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |