CN116068198A - Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物分子技术领域，具体涉及一种PPI原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用。本发明利用LgBit和抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体构建LgBit‑antiM Nb质粒，优化表达得到融合蛋白1；利用SmBit和抗兔lgG Fc的纳米抗体构建SmBit‑antiR Nb质粒；优化表达得到融合蛋白2；在固定细胞样本或病理组织中孵育上述两种融合蛋白，加入萤光素酶底物，通过检测化学发光强度判断目标蛋白对是否存在相互作用。本专利的检测方法融合了NanoBit系统与Nb的优势，解决了哺乳动物细胞或者组织中内源蛋白质相互作用信号极弱的问题，实现低表达量和高通量的蛋白质相互作用的原位检测。

Description

PPI原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用

技术领域

本发明属于生物分子技术领域，具体涉及一种PPI原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用。

背景技术

蛋白质相互作用（protein-protein interaction，简称“PPI”）是蛋白质行使生物功能的重要环节。PPI参与调控细胞生命活动的方方面面，包括但不限于基因的复制与激活，信号传导，代谢活动的调控等。异常PPI会导致疾病的发生，促进疾病的进展。例如，癌症中存在异常的P53蛋白和MDM2蛋白相互作用，其介导P53蛋白降解，阻止癌细胞的凋亡。PPI抑制剂是药物开发的新领域，为针对传统意义上“无成药性（undruggable）”的非酶蛋白靶点，提供新思路。PPI也为临床诊断提供重要的靶点和方向。

目前PPI体外研究的主要技术包括免疫共沉淀、酵母双杂交和GST融合蛋白沉降（GST pull down）等技术。这些技术需要裂解细胞或者酵母外源表达，难以真实指示哺乳动物细胞或者组织内的蛋白相互作用。基于荧光蛋白开发的荧光共振能量转移技术（FRET）和双分子荧光互补技术（BiFC）可以检测活细胞内的蛋白质相互作用，然而这两种方法均依赖于异源基因在哺乳细胞内的导入与过表达。且由于细胞自发荧光的限制，基于荧光的检测技术难以降低背景，导致信噪比和灵敏度均有限。目前邻近连接技术可以实现细胞原位PPI的检测，但该方法需要在抗体上化学耦连不同的核苷酸链，并且在免疫标记结束后，还需要滚环扩增和荧光探针孵育等复杂的显色步骤。该方法假阳率高，耗时长且试剂成本高昂。

基于分割型萤光素酶（Split萤光素酶；Split NanoLuc）开发的PPI检测技术，利用其生物发光和酶催化的特性，不仅可以最大程度的消除背景，同时可以数量级地放大信号，显著提升信噪比。纳米荧光素酶（Nanoluciferase；简称：NanoLuc）是近年来发现的新型萤光素酶。该酶分子量小，相较于萤火虫萤光素酶（61kDa）和海肾萤光素酶（36kDa），分子量仅为19KD，便于融合表达；发光强度较传统萤光素酶高出两个数量级，线性范围高达六个数量级，有利于提高检测灵敏度；不依赖于ATP（腺嘌呤核苷三磷酸），与专用底物furimazine（咪唑并吡嗪酮类的发光底物）的反应稳定，不受环境温度等因素的影响。NanoLuc® BinaryTechnology(简称NanoBit系统)是一种基于NanoLuc萤光素酶的二子单元系统，可用来检测活细胞内蛋白质的相互作用；NanoBit系统将完整的NanoLuc蛋白拆分为两个亚基，包含18kDa的大片段（简称LgBit）和1.3kDa的小片段（简称SmBit）。将LgBit和SmBit分别融合表达在待检测PPI蛋白上，即可通过互补激活的萤光素酶活性指示目标蛋白质的相互作用。目前，NanoBit系统主要通过在哺乳动物细胞中过表达以上融合蛋白体系，来指示细胞内的蛋白质相互作用程度。但是该方法需要因蛋白而异的定制质粒和过表达异源蛋白，难以实现原代细胞和病理组织中PPI的原位检测和临床诊断等。

公开号为CN111198272A的发明专利公开了一种基于NanoBiT系统的体外检测蛋白间相互作用的方法，然而该方法需要因蛋白而异的定制质粒和过表达异源蛋白，难以实现原代细胞和病理组织中PPI的原位检测，同时该专利也并未公开纳米抗体的应用。

有鉴于此，本专利通过融合NanoBit系统与纳米抗体（Nanobody,Nb）的优势，开发一种可以原位、高通量、复杂样本的快速检测PPI的通用方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于PPI原位检测的诊断试剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于PPI原位检测的诊断试剂，所述诊断试剂包括表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1和/或表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2；所述融合蛋白1中的纳米抗体为抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体，所述融合蛋白1包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的LgBit；所述融合蛋白2中的纳米抗体为抗兔lgG Fc的纳米抗体，所述融合蛋白2包含核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的SmBit-antiR Nb。

本发明的目的之二在于提供一种采用所述诊断试剂检测蛋白质相互作用的原位检测方法，该方法通过构建和表达LgBit或SmBit与纳米抗体二抗的融合蛋白，实现PPI的原位检测。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

采用所述诊断试剂检测蛋白质相互作用的原位检测方法，通过基因工程和生物发酵制备标签蛋白修饰的纳米抗体，进而实现蛋白质相互作用的原位检测。

进一步，所述标签蛋白为LgBit和/或SmBit。

进一步，所述方法包括以下步骤：

S1：利用所述LgBit和所述抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体构建LgBit-antiM Nb载体；

S2：将所述LgBit-antiM Nb载体进行优化表达，得到所述表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1；

S3：利用所述SmBit和所述抗兔lgG Fc的纳米抗体构建所述SmBit-antiR Nb载体；

S4：将所述SmBit-antiR Nb载体进行优化表达，得到所述表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2；

S5：在固定细胞样本或病理组织中孵育所述融合蛋白1和所述融合蛋白2，加入萤光素酶底物，通过检测化学发光强度，判断目标蛋白对是否存在相互作用。

纳米抗体的单链和小尺寸特性使其易于采用原核系统表达各种标签融合的多功能衍生蛋白。相较于传统单克隆抗体需采用真核表达体系，且需在纯化后进行标签化，标签蛋白修饰的纳米抗体只需通过构建质粒和生物发酵就可大量获得，成本低廉，且稳定性好。

本专利根据Split NanoLuc的原理，通过原核表达优化LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb稳定活性蛋白，作为检测蛋白质互作的通用二抗。只需要三步即可对蛋白相互作用进行原位检测和诊断：1.选择合适的一抗对细胞或者组织样本孵育，用于特异性标记靶蛋白对；2.使用原核表达的二抗孵育样本，便于蛋白质互作的通用检测；3.原位发光或者成像，也可进行大规模高通量筛选。简单来说，对于待测的PPI对，只需购买鼠/兔不同种属的一抗，采用传统免疫荧光染色步骤，对细胞或者组织样本进行一抗孵育，然后孵育LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb即可。对于相互作用的PPI来说，一抗介导LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb相互靠近，从而促使LgBit与SmBit互补形成一个完整的NanoLuc萤光素酶。加入furimazine，即可催化生物发光。通过检测生物发光的强弱即可测量蛋白质相互作用的多寡。

进一步，所述方法具体包括以下步骤：

1）将LgBit与抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体同时构建到优化后的原核表达载体中，获得融合的LgBit-antiM Nb表达载体；

2）在原核系统中优化LgBit-antiM Nb的表达，获得稳定的活性蛋白；

3）将SmBit与抗兔lgG Fc的纳米抗体同时构建到优化后的原核表达载体中，获得融合的SmBit-antiR Nb表达载体；

4）在原核系统中优化SmBit-antiR Nb的表达，获得稳定的活性蛋白；

5）采用哺乳动物细胞，通过固定，穿孔，一抗标记，LgBit-antiM Nb和SmBit-antiRNb孵育，以及底物液发光等步骤，观测目标蛋白对是否存在相互作用。

进一步，底物发光表明目标蛋白对存在相互作用；底物不发光表明目标蛋白对不存在相互作用。

当目标蛋白对存在相互作用，LgBit与SmBit互补进而形成完整的NanoLuc萤光素酶，催化底物发光。

进一步，通过酶标仪和/或显微镜成像定量分析蛋白相互作用的多寡。

本发明的目的之三在于提供一种用于构建所述融合蛋白1的LgBit-antiM Nb表达载体。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于构建所述融合蛋白1的LgBit-antiM Nb表达载体，LgBit-antiM Nb扩增的LgBit_For和LgBit_Rev引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的之四在于提供一种用于构建所述融合蛋白2的SmBit-antiR Nb表达载体。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于构建所述融合蛋白2的SmBit-antiR Nb表达载体，SmBit-antiR Nb扩增的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的SmBit_F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的SmBit_F2、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的SmBit_R1、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的SmBit_R2。

本发明的目的之五在于提供一种所述的诊断试剂在制备用于蛋白质相互作用原位检测的试剂盒中的应用。

进一步，所述诊断试剂在制备用于检测低表达量的蛋白质相互作用的试剂盒中的应用。

进一步，所述诊断试剂在制备用于筛选病理相关PPI靶点的试剂盒中的应用。

进一步，所述诊断试剂在制备用于PPI抑制剂的高通量筛选的产品中的应用。

本发明的目的之六在于提供一种用于PPI原位检测的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测蛋白质相互作用的试剂盒，所述试剂盒含有所述表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1和/或所述表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2。

本发明方法涵盖了采用LgBit或SmBit耦连纳米抗体二抗用于蛋白质相互作用的原位检测；检测手段包括但不限于酶标仪和显微镜成像；检测应用包括但不限于细胞或组织内PPI的原位检测，PPI抑制剂的高通量筛选等。

本发明的有益效果在于：

1.本专利提供的检测方法，不需要导入异源基因就可以对原代细胞和病理切片进行蛋白质相互作用的原位检测；

2.本专利采用商业一抗，不需要针对目标蛋白进行一抗的标记或者开发，使用方便；同时本发明采用生物发酵可大量获得LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb，成本较低；

3.本发明基于NanoLuc生物发光原理，检测限低，相较于时间分辨荧光共振能量转移（TR FRET），可以检出表达量更低的蛋白质相互作用，实现高通量的蛋白质相互作用的原位检测；

4.本专利的检测方法稳定可靠，可以大规模通用检测，适合临床病理等各种样本检测，并且本检测方法操作简便，可以快速实现检测和诊断，适合临床试剂盒开发；

5.本发明方法解决了哺乳动物细胞或者组织中，天然蛋白质相互作用信号极弱的问题，利用NanoLuc的超强发光与抗体的信号放大功能，实现了96孔板内细胞的蛋白质相互作用的原位检测。

附图说明

图1为原位检测蛋白质相互作用方法的原理示意图。

图2为LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb的SDS PAGE图。

图3为α-tubulin与β-tubulin的免疫荧光图。

图4为基于本发明检测MCF-7细胞中α-tubulin与β-tubulin的相互作用的结果图，横坐标中，G1表示LgBit-antiM Nb+SmBit-antiR Nb；G2表示Primary antibody+LgBit-antiM Nb+SmBit-antiR Nb；G3表示Primary antibody+LgBit-antiM Nb；纵坐标Lum表示发光强度。

图5为基于本发明检测U2OS细胞中α-tubulin与β-tubulin的相互作用的结果图，横坐标中，G1表示LgBit-antiM Nb+SmBit-antiR Nb；G2表示Primary antibody+LgBit-antiM Nb+SmBit-antiR Nb；G3表示Primary antibody+LgBit-antiM Nb；纵坐标Lum表示发光强度。

图6为基于TR FRET检测U2OS细胞中α-tubulin与β-tubulin的相互作用的结果图；横坐标中，A1表示α/β tubulin antibody+antiR Eu+antiM Alexa647；A2表示α/β tubulin+antiR Eu；A3表示antiR Eu+antiM Alexa647；纵坐标665/615nm ratio表示FRET比例。

具体实施方式

下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

本申请中：

抗小鼠lgG1 Fc：抗小鼠免疫球蛋白1的可结晶段；

抗兔lgG Fc：抗兔免疫球蛋白的可结晶段；

lgG：免疫球蛋白的一种；

LgBit_For：大片段上游引物；LgBit_Rev：大片段下游引物；

SmBit_F1：小片段上游引物1；SmBit_F2：小片段上游引物2；SmBit_R1：小片段下游引物1；SmBit_R2：小片段下游引物2；

α-tubulin rabbit mAb：α-微管蛋白兔单抗；

β-tubulin mouse mAb：β-微管蛋白小鼠单抗；

Kpn1、BamH1、Hind III：限制性核酸内切酶；

Gibson assembly同源重组方法：一种分子克隆方法，它允许在单个等温反应中连接多个DNA片段，是一种不使用限制酶将片段插入质粒的常见方法；

DH5α：大肠杆菌的一种诱变菌株；

BL21(DE3)pLysS感受态：细胞是大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化；

sanger法测序：根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，从而获得DNA碱基序列的一种方法；

LB培养基：全称Luria-Bertani培养基，是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基；

HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；

Imidazole：1-甲酰基咪唑；

1×PBS：浓度为0.01M的磷酸缓冲盐溶液；

Primary antibody：一级抗体；

LgBit-antiM Nb：N端融合表达LgBit的抗鼠IgG1 Fc的纳米抗体；

SmBit-antiR Nb：N端融合表达SmBit的抗兔IgG Fc的纳米抗体；

antiR Nb：抗兔IgG Fc的纳米抗体；

α/β tubulin antibody：α或者β微管蛋白一抗；

antiR Eu：Eu纳米颗粒标记的抗兔IgG抗体；

antiM Alexa647：Alexa647标记的抗鼠IgG抗体；

pFN33K LgBiT TK-neo Flexi^® Vector：商业化质粒，来源于promega公司；

pTP1122质粒：商业化质粒，来源于addgene公司；

pTP955质粒：商业化质粒，来源于addgene公司；

NEBuilder^® HiFi DNA Assembly Master Mix：商业化试剂，用于DNA片段连接，来源于New England Biolabs公司；

Alexa647：商业化荧光小分子，激发光为647nm。

实施例1

蛋白质相互作用的原位检测方法原理如图1所示，该方法具体包括以下步骤：

1）将LgBit与抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体同时构建到优化后的原核表达载体中，获得融合的LgBit-antiM Nb表达载体；

2）在原核系统中优化LgBit-antiM Nb的表达，获得稳定的活性蛋白1；

3）将SmBit与抗兔lgG Fc的纳米抗体同时构建到优化后的原核表达载体中，获得融合的SmBit-antiR Nb表达载体；

4）在原核系统中优化SmBit-antiR Nb的表达，获得稳定的活性蛋白2；

5）采用哺乳动物细胞，通过固定，穿孔，一抗标记，LgBit-antiM Nb和SmBit-antiRNb孵育，以及底物液显色等步骤，观测目标蛋白对是否存在相互作用。若存在相互作用，则LgBit与SmBit互补形成完整的NanoLuc萤光素酶，从而催化底物发光。通过酶标仪或者显微镜成像可定量分析蛋白相互作用的多寡。

实施例2. LgBit-antiM Nb质粒构建

从pFN33K LgBiT TK-neo Flexi^® Vector（商业化质粒）中采用LgBit_For和LgBit_Rev引物扩增带有同源臂的LgBiT基因序列。采用Kpn1和BamH1酶切pTP1122质粒（商业化质粒），获得载体。采用Gibson assembly同源重组方法连接LgBiT与酶切后载体。将连接产物转入DH5α感受态菌落，涂板挑取单克隆，采用sanger法测序鉴定和挑选正确质粒，最后获得LgBit-antiM Nb的原核表达质粒。LgBiT扩增的LgBit_For和LgBit_Rev引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，扩增后序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例3. SmBit-antiR Nb质粒构建

从pTP955质粒（商业化质粒）中采用SmBit_F1和SmBit_R1引物扩增带有部分SmBit序列的antiR Nb基因序列。采用SmBit_F2和SmBit_R2引物扩增带同源臂以及完整SmBit序列的antiR Nb基因序列。采用Hind III和BamH1酶切pTP955质粒（商业化质粒），获得载体。按照NEBuilder^® HiFi DNA Assembly Master Mix说明书连接SmBit-antiR Nb与酶切后载体。将连接产物转入DH5α感受态菌落，涂板挑取单克隆，采用sanger法测序鉴定和挑选正确质粒，获得SmBit-antiR Nb的原核表达质粒。

SmBit-antiR Nb扩增的PCR引物序列：SmBit_F1如SEQ ID NO.4所示；SmBit_F2如SEQ ID NO.5所示；SmBit_R1如SEQ ID NO.6所示；SmBit_R2如SEQ ID NO.7所示。扩增后序列如SEQ ID NO.8所示。

实施例4. 融合蛋白的表达

将实施例1构建的LgBit-antiM Nb和实施例2构建的SmBit-antiR Nb质粒导入BL21(DE3)pLyss感受态，筛选获得单克隆。挑取单克隆至5mL新鲜的LB培养基中，37度扩增培养过夜。将培养后的大肠杆菌稀释至1L新鲜的LB培养基中，37度培养2-3小时，当OD600（即溶液在600nm波长处的吸光值）达到0.4时，采用浓度为0.2mM IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达20小时，表达温度为18度。采用8000rpm离心收集菌液，采用40mL裂解缓冲液重悬沉淀，高压匀质10分钟，裂解缓冲液由浓度为50mM的HEPES、浓度为500mM的氯化钠和浓度为20mM的Imidazole组成，pH为7.5。采用20000g离心30分钟，取上清用Ni-NTA（镍离子金属鳌合亲和层析介质）纯化目标蛋白。采用5mL洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，洗脱缓冲液由浓度为50mM的HEPES、浓度为500mM的氯化钠和浓度为500mM的Imidazole组成，pH为7.5。在洗脱后的蛋白液中加入浓度为300nM的NEDP1酶切纯化标签。采用1×PBS（含有浓度为20mM的Imidazole）透析酶切后产物，透析后再次采用Ni-NTA去除纯化标签、NEDP1酶及含有组氨酸的杂蛋白，穿透液采用1×PBS透析，最后用超滤管浓缩蛋白至1mg/ml，分装后于-80℃保存。纯化后蛋白的SDS PAGE图（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图）如图2所示。

实施例5. 选取和验证蛋白质相互作用模型

α微管蛋白（α-tubulin）与β微管蛋白（β-tubulin）通常形成异二聚体并进一步聚合成微管，因此是测试PPI的良好模型。首先，我们选择免疫荧光检测抗体的适用性，使用α-tubulin rabbit mAb(公司：abcam，货号：ab52866，稀释倍数：1:250)和β-tubulin mousemAb(公司：abclonal， 货号：AC021，稀释倍数：1:100)作为特异性靶向α-tubulin和β-tubulin的抗体，采用抗兔lgG Alexa 488（公司：abcam, 货号：ab150077，稀释倍数：1:1000）和抗鼠lgG Alexa 594（公司：CST，货号：8890S，稀释倍数：1:1000）标记识别不同种属的一抗。采用搭载Airyscan2（面阵列检测器）的Zeiss 980共聚焦荧光显微镜，观测抗体的染色效果。免疫荧光结果如图3所示，该结果表明α-tubulin和β-tubulin的抗体在细胞质中存在明显的共定位，且可清晰指示细胞中微管的纤维状结构。

实施例6. 以α-tubulin 和β-tubulin作为模型原位检测蛋白相互作用

采用MCF-7（人乳腺癌细胞）作为细胞模型。铺板96孔细胞培养板，每孔3万细胞。培养过夜后，采用PBS清洗贴壁细胞。采用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，采用质量分数为0.25%的Triton（破膜液）破膜，采用质量分数为5%的BSA（牛血清白蛋白）封闭两小时。然后采用α-tubulin rabbit mAb(公司：abcam，货号：ab52866，稀释倍数：1:250)和β-tubulin mousemAb(公司：abclonal，货号：AC021，稀释倍数：1:100)孵育细胞过夜或者37℃孵育1小时。采用LgBit-antiM Nb和SmBit-antiR Nb在37℃条件下孵育细胞1h。彻底清洗未结合的抗体，加入NanoLuc底物，采用酶标仪检测化学发光强度。结果如图4所示。相较于对照组，即不加入一抗或不加入SmBit-antiR Nb，实验组的化学发光强度高出一个数量级左右。

实施例7. 对比本发明方法与商业化TR FRET方法的灵敏度

采用U2OS（人骨肉瘤细胞）作为细胞模型。铺板96孔细胞培养板，每孔3万细胞。采用如实施例5所示方法，检测α-tubulin和β-tubulin的相互作用。结果如图5所示。相较于对照组，即不加入一抗或不加入SmBit-antiR Nb，实验组的化学发光强度高出4-6倍。同时采用相同的细胞密度铺板96孔板，过夜培养后，如前所示固定、穿透、封闭细胞，并采用α-tubulin和β-tubulin抗体孵育细胞过夜或者37℃孵育1小时。然后采用抗兔lgG抗体（铕离子标记，浓度为1nM）和抗鼠lgG抗体（Alexa647标记）在37℃条件下孵育细胞1h。采用说明书推荐方法检测TR FRET的强度。结果如图6所示，相较于对照组，即不加入一抗或不加入SmBit-antiR Nb，实验组的化学发光强度高出2-4倍。通过对比，可以发现本发明方法相较于商业化试剂具有更高灵敏度。

Claims (11)

1.用于PPI原位检测的诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1和/或表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2；所述融合蛋白1中的纳米抗体为抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体，所述融合蛋白1包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的LgBit；所述融合蛋白2中的纳米抗体为抗兔lgG Fc的纳米抗体，所述融合蛋白2包含核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的SmBit-antiR Nb。

2.采用权利要求1所述的诊断试剂检测蛋白质相互作用的原位检测方法，其特征在于，通过基因工程和生物发酵制备标签蛋白修饰的纳米抗体，进而实现蛋白质相互作用的原位检测。

3.根据权利要求2所述的原位检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：利用所述LgBit和所述抗小鼠lgG1 Fc的纳米抗体构建LgBit-antiM Nb载体；

S2：将所述LgBit-antiM Nb载体进行优化表达，得到所述表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1；

S3：利用所述SmBit和所述抗兔lgG Fc的纳米抗体构建所述SmBit-antiR Nb载体；

S4：将所述SmBit-antiR Nb载体进行优化表达，得到所述表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2；

S5：在固定细胞样本或病理组织中孵育所述融合蛋白1和所述融合蛋白2，加入萤光素酶底物，通过检测化学发光强度，判断目标蛋白对是否存在相互作用。

4.根据权利要求3所述的原位检测方法，其特征在于，底物发光表明目标蛋白对存在相互作用；底物不发光表明目标蛋白对不存在相互作用。

5.用于构建所述融合蛋白1的LgBit-antiM Nb表达载体，其特征在于，LgBit-antiM Nb扩增的LgBit_For和LgBit_Rev引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

6.用于构建所述融合蛋白2的SmBit-antiR Nb表达载体，其特征在于，SmBit-antiR Nb扩增的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的SmBit_F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的SmBit_F2、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的SmBit_R1、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的SmBit_R2。

7.权利要求1所述的诊断试剂在制备用于蛋白质相互作用原位检测的试剂盒中的应用。

8.权利要求1所述的诊断试剂在制备用于检测低表达量的蛋白质相互作用的试剂盒中的应用。

9.权利要求1所述的诊断试剂在制备用于筛选病理相关PPI靶点的试剂盒中的应用。

10.权利要求1所述的诊断试剂在制备用于PPI抑制剂的高通量筛选的产品中的应用。

11.一种用于PPI原位检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有所述表达LgBit和纳米抗体二抗的融合蛋白1和/或所述表达SmBit和纳米抗体二抗的融合蛋白2。

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