CN104568861A - 一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法。该方法是利用snap标签蛋白在其41位或75位拆分所得的两部分片段,分别与被研究的一对蛋白进行融合;若被研究的蛋白之间存在相互作用,则融合蛋白被snap标签蛋白底物共价修饰,通过荧光成像或斑点免疫印迹的方法检测蛋白质之间的相互作用。本发明提供的方法可以在体外或在大肠杆菌、哺乳动物细胞中检测蛋白质之间的相互作用,该方法消除了双分子互补时自结合所造成的假阳性问题;其中基于snap标签蛋白在75位拆分的方法,具有检测时更低信号背景的特点,基于snap标签蛋白在41位拆分的方法,具有更高检测信号的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法,该方法是通过对snap标签蛋白进行拆分所得的两部分片段,分别与被研究的一对蛋白进行融合;若被研究的蛋白之间存在相互作用,则融合蛋白被snap标签蛋白底物共价修饰,通过荧光成像或斑点免疫印迹的方法检测蛋白质之间的相互作用。该方法具体涉及snap标签蛋白在41位、75位的拆分及与被研究相互作用的蛋白质的融合,融合蛋白的纯化,和检测蛋白相互作用的实验方法。被研究相互作用的蛋白质对为:一、FKBP蛋白和FRB蛋白,由雷帕霉素(rapamycin)介导相互作用;二、亮氨酸拉链(leu-zipper)。
背景技术
蛋白质相互作用在很多生物过程中,和许多疾病中(例如癌症)都扮演者不可或缺的角色,例如DNA的复制等都是由大量的蛋白质相互作用参与联系的。蛋白相互作用形式多样:蛋白质可能会持续相互作用很长时间,来组成更加复杂的蛋白质复合体;也可能作为转运蛋白,携带另一种蛋白,例如蛋白的跨膜运输;或者短暂的与其他蛋白质相互作用一下,例如一种蛋白激酶给另一个目标蛋白的添加磷酸基团。蛋白质相互作用目前正从生物化学、量子化学、分子动力学、化学生物学、信号转导和其他代谢性或遗传/表观遗传网络等角度进行研究。也正说明蛋白质相互作用是任何活细胞这个生命过程的核心。
正因为蛋白相互作用研究的重要性,蛋白相互作用检测模型一直以来得到的广大的开发和应用。蛋白相互作用检测模型也在不同层面开发出很多的工具。蛋白相互作用检测的生物学方法通常包含以下几种:
(1)酵母双杂交技术和串联亲和纯化技术。这两种方法,可以提供较快的方式进行蛋白质相互作用的鉴别。但是在绘制蛋白质相互作用网络中具有很大的局限性。酵母双杂交技术具有很高的假阳性率;而串联亲和纯化需要在体外进行,破坏了蛋白所处的原始环境。并且两种方法均不能提供相互作用的亚细胞定位信息 (Fields,S.and O.Song(1989)."A novel genetic system to detect protein-protein interactions."Nature340(6230):245-246.)(Rigaut,G.,et al.,A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.Nat Biotechnol,1999.17(10):p.1030-2.)。
(2)能量共振转移技术,它是基于两个荧光团之间的激发能量转移形成的,当这两个荧光团处于足够近的空间位置和相对宽松的方向时,就能够发生。该技术的优势在于能够直观观测蛋白质相互作用的情况,并且不会破坏蛋白质所处于的原始环境。由于荧光团需要足够距离的接近才能够产生能量共振转移现象,因此,该技术还能够在一定程度上指示相互作用蛋白质之间的相对距离(Sourjik,V.and H.C.Berg(2004)."Functional interactions between receptors in bacterial chemotaxis."Nature428(6981):437-441.),也由于此产生假阳性结果,该技术无法判别蛋白是直接相互作用,还是在一个蛋白复合体上。
(3)蛋白质片段互补技术,它被用来研究在活细胞内生物学相关蛋白的相互作用。其原理是:一个蛋白,通常是一个酶或荧光蛋白,被拆分为两个片段,这两个片段单独都不会有功能而且这两个片段不能自发重装配,拆分的片段分别被融合在可能发生相互作用的蛋白质上,由相互作用引发的拆分片段重装配会导致蛋白质功能的恢复,这可以通过蛋白质活性或荧光进行检测(Michnick,S.W.Protein fragment complementation strategies for biochemical network mapping.Curr.Opin.Biotechnol.2003.14:610-7.)。目前,许多蛋白被用来进行拆分和重装配实验,包括β-内酰胺酶,荧光素酶,二氢叶酸还原酶,绿色荧光蛋白及其突变体例如黄色荧光蛋白。
该技术与之前所描述的技术相比有许多优点:有越来越多的蛋白和酶可供选择。拆分β-半乳糖苷酶依赖酶促反应,信号能够被放大,该方法灵敏度很高(Eglen,R.M.and Singh,R.β-Galactosidase enzyme fragment complementation as a novel technology for high-throughput screening.Comb.Chem.High Throughput Screen.2003.6:381-7.)。拆分β-内酰胺酶除了具有拆分β-半乳糖苷酶模型一样的优点外,还在真核生物和原核细胞没有直系同源(Galarneau,A.,Primeau,M.,Trudeau,L.E.and Michnick,S.W.β-Lactamase protein fragment complementation assays as in vivo and in vitro sensors of protein-protein interactions.Nat.Biotechnol.2002.20:619-22.),降 低了模型检测时的背景信号。但是,这些技术均不能反映出蛋白质相互作用在细胞中的定位信息。
而拆分荧光蛋白,能够通过荧光直观的反映出相互作用的蛋白质的亚细胞定位信息(Hu,C.D.,Y.Chinenov,and T.K.Kerppola,Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.Mol Cell,2002.9(4):p.789-98.)。目前该技术广泛应用于蛋白质相互作用研究中。但是,由于拆分的荧光蛋白需要较长的时间才能恢复荧光特性,低的时间分辨力限制了其在研究相互作用上的应用。
SNAP标签蛋白是DNA修复酶O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的突变体,大小约20kD,它的底物是烷基鸟嘌呤,苯甲基鸟嘌呤及其衍生物(Damoiseaux,R.,Keppler,A.&Johnsson,K.Synthesis and applications of chemical probes for human O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase.ChemBioChem.2001.2:285-287.)。Snap标签蛋白作为研究蛋白质的一类多功能的蛋白标签,由NEB公司推出。该蛋白可通过形成融合蛋白的方式,标记或纯化所要研究的目的蛋白质。
Snap标签蛋白在生物学研究中,具有以下优点。通过对其底物共轭基团的替换(包括荧光团,生物素和磁珠),可使用多种实验方法对目的蛋白进行研究。其底物与snap标签蛋白特异性的共价结合,合成底物与snap标签蛋白的反应速率与原始底物一样且具有很快的反应速率,在蛋白质研究时具有较好的时空分辨力。该蛋白能为活细胞或固定细胞提供简单的并且多样的蛋白质成像方法。同时,它也能用以体外蛋白质的研究。
Masayasu Mie等人于2012年发表了其研究成果(Mie,M.,T.Naoki,et al.(2012)."Development of a split SNAP-tag protein complementation assay for visualization of protein-protein interactions in living cells."Analyst137(20):4760-4765.),它们成功开发了一种利用snap标签蛋白来检测蛋白质相互作用的方法。但是该方法并没有解决在检测中会出现假阳性结果的问题,在没有蛋白相互作用的介导下,snap标签蛋白片段浓度在0.1nM时,还有很明显的检测信号。
不应认为对本文所述参考文献的引用或讨论意味着承认这些参考文献是本发明的现有技术。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的第一个目的是提供一种基于双分子互补的共价修饰标记检测蛋白相互作用的方法,还提供了两种snap标签蛋白拆分方法,该方法能使拆分后所得的两部分片段通过双分子互补具有完整snap标签蛋白的活性。
本发明的第二个目的是提供一种基于双分子互补的共价修饰标记在体外检测蛋白相互作用的方法。
本发明的第三个目的是提供一种基于双分子互补的共价修饰标记在大肠杆菌中检测蛋白相互作用的方法。
本发明的第四个目的是提供一种基于双分子互补的共价修饰标记在哺乳动物细胞中检测蛋白相互作用的方法。
为实现上述目的,本发明技术方案:
本发明提供的一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法,其特征在于,所述方法利用对snap标签蛋白的拆分所得的两部分片段,分别与被研究的一对蛋白进行融合形成融合蛋白;若被研究的蛋白之间存在相互作用,则融合蛋白被snap标签蛋白底物共价修饰标记,通过荧光成像或斑点免疫印迹的方法在体外或在大肠杆菌、哺乳动物细胞中检测蛋白质之间的相互作用。
根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法,所述对snap标签蛋白拆分得到两部分氨基酸片段,其拆分位点在snap标签蛋白的41位或75位。
根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法,所述在体外检测蛋白质之间的相互作用包括以下步骤:
(1)构建编码所述融合蛋白核酸序列的表达载体;
(2)在宿主细胞中表达所述融合蛋白;
(3)使用亲和纯化或蛋白质变性和复性的实验方法得到所述融合蛋白;
(4)在体外进行融合蛋白的双分子互补和共价修饰标记;
(5)通过凝胶电泳和荧光成像检测蛋白质的相互作用。
根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法,所述在大肠杆菌中检测蛋白质之间的相互作用包括以下步骤:
(1)构建编码所述融合蛋白核酸序列的表达载体;
(2)在宿主细胞中表达所述融合蛋白;
(3)经过细胞裂解后,对细胞中的融合蛋白进行共价修饰标记;
(4)通过凝胶电泳和荧光成像检测蛋白质的相互作用。
根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法,所述在哺乳动物细胞中检测蛋白相互作用包括以下步骤:
(1)构建编码所述融合蛋白核酸序列的表达载体;
(2)在哺乳动物细胞中表达所述融合蛋白;
(3)对细胞中的融合蛋白进行共价修饰标记;
(4)通过荧光成像和斑点免疫印迹的方法检测蛋白质的相互作用。
根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法,所述融合蛋白由蛋白质sumo,被拆分的snap标签蛋白片段Nsnap、Csnap,被研究相互作用的蛋白质FKBP、FRB、Nzipper、Czipper和接头X1、X2组成;其组合形式是:(1)sumo-X1-FRB-X2-Nsnap;(2)sumo-X1-Csnap-X2-FKBP;(3)Nzipper-X1-Nsnap;(4)Csnap-X2-Czipper;在上述两种结合方式中的X1和X2氨基酸序列相同或者不同,在(1)、(2)、(3)和(4)中的X1和X2氨基酸序列相同或者不同,所述接头的氨基酸长度没有或者多个,优选3-6个氨基酸。
根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法,所述的融合蛋白由被拆分的snap标签蛋白片段Nsnap、Csnap,被研究相互作用的蛋白质FKBP、FRB、Nzipper、Czipper和接头X1、X2组成;其组合形式是:(1)FRB-X1-Nsnap;(2)Csnap-X2-FKBP;(3)Nzipper-X1-Nsnap;(4)Csnap-X2-Czipper;在上述两种组合形式中的X1和X2氨基酸序列相同或者不同,在(1)、(2)、(3)和(4)中的X1和X2氨基酸序列相同或者不同,所述接头的氨基酸长度没有或者多个,优选3-6个氨基酸。
根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法,编码所述snap标签蛋白的基因为原核表达型基因,其核酸序列SEQ ID NO:1。
根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法,所述编码snap标签蛋白的基因为真核表达型基因,其核酸序列SEQ ID NO:13。
根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法,所述融合蛋白被snap标签蛋白底物修饰的方式是共价修饰。
两种snap标签蛋白拆分方法,该方法能使拆分后所得的两部分片段通过双分子互补具有完整snap标签蛋白的活性。该方法所涉及的融合蛋白的氨基酸序列同SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19;该方法所涉及的snap标签蛋白基因为原核表达型基因,其核酸序列为SEQ ID NO:1。该方法由编 码上述的融合蛋白的核酸序列的表达载体构建方法,表达上述融合蛋白的实验方法和检测snap标签蛋白拆分片段双分子互补的实验方法组成。
基于双分子互补的共价修饰标记在体外检测蛋白相互作用的方法。其所涉及的snap标签蛋白基因为原核表达型基因,其核酸序列为SEQ ID NO:1;所涉及的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12。该方法由编码上述的融合蛋白的核酸序列的表达载体构建方法,表达和纯化上述融合蛋白的实验方法和检测融合蛋白共价修饰标记的实验方法组成。
基于双分子互补的共价修饰标记在大肠杆菌中检测蛋白相互作用的方法。其所涉及的snap标签蛋白基因为原核表达型基因,其核酸序列为SEQ ID NO:1;所涉及的融合蛋白的氨基酸序列同SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19。该方法由编码上述的融合蛋白的核酸序列的表达载体构建方法,表达上述融合蛋白的实验方法和检测融合蛋白共价修饰标记的实验方法组成。
基于双分子互补的共价修饰标记在哺乳动物细胞中检测蛋白相互作用的方法。其所涉及的snap标签蛋白基因为真核表达型基因,其核酸序列为SEQ ID NO:13;所涉及的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23。该方法由编码上述的融合蛋白的核酸序列的表达载体构建方法,表达上述融合蛋白的实验方法和检测融合蛋白共价修饰标记的实验方法组成。
发明详述
本发明使用NEB购买的snap标签蛋白作为原料,对snap标签蛋白进行了两种位点的拆分,开发了一种基于双分子互补的共价修饰标记检测蛋白相互作用的方法。这两个拆分位点为:41位拆分位点,75位拆分位点。
本发明提供的方法,是利用将被拆分的snap标签蛋白片段与要研究相互作用的蛋白质分别形成融合蛋白,在要研究的蛋白质相互作用的介导下,snap标签蛋白 片段发生双分子互补,并被snap标签蛋白的底物特异性共价修饰标记,实现检测蛋白质之间的相互作用。
在一个实施方式中,所述融合蛋白能与荧光底物共价标记修饰的部分是snap标签蛋白序列,SEQ ID NO:2。
在一个实施方式中,基于双分子互补的共价修饰标记在体外检测蛋白相互作用的方法,所涉及的融合蛋白由蛋白质sumo,被拆分的snap标签蛋白片段Nsnap、Csnap,被研究相互作用的蛋白质FKBP、FRB、Nzipper、Czipper和接头X1、X2组成。其组合形式是:
(1)sumo-X1-FRB-X2-Nsnap;
(2)sumo-X1-Csnap-X2-FKBP;
(3)Nzipper-X1-Nsnap;
(4)Csnap-X2-Czipper;
(5)在上述两种结合方式中的X1和X2氨基酸序列可以相同也可以不同,在(1)、(2)、(3)和(4)中的X1和X2氨基酸序列也可以相同也可以不同,所述接头的氨基酸长度可以没有也可以是多个,优选3-6个氨基酸。其sumo蛋白的作用为增加融合蛋白可溶性。本发明包括但不限于使用sumo蛋白增加融合蛋白可溶性。
在另一实施方式中,基于双分子互补的共价修饰标记在大肠杆菌或哺乳动物细胞中检测蛋白相互作用的方法,所涉及的融合蛋白由被拆分的snap标签蛋白片段Nsnap、Csnap,被研究相互作用的蛋白质FKBP、FRB、Nzipper、Czipper和接头X1、X2组成。其组合形式是:
(1)FRB-X1-Nsnap;
(2)Csnap-X2-FKBP;
(3)Nzipper-X1-Nsnap;
(4)Csnap-X2-Czipper;
(5)在上述两种结合方式中的X1和X2氨基酸序列可以相同也可以不同,在(1)、(2)、(3)和(4)中的X1和X2氨基酸序列也可以相同也可以不同,所述接头的氨基酸长度可以没有也可以是多个,优选3-6个氨基酸。
在一个实施方式中,基于双分子互补的共价修饰标记在体外检测蛋白相互作用的方法,其所涉及的snap标签蛋白基因为原核表达型基因,其核酸序列为SEQ ID NO:1;所涉及的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12。
在一个实施方式中,基于双分子互补的共价修饰标记在大肠杆菌中检测蛋白相互作用的方法,其所涉及的snap标签蛋白基因为原核表达型基因,其核酸序列为SEQ ID NO:1;所涉及的融合蛋白的氨基酸序列同SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19。
在另一个实施方式中,基于双分子互补的共价修饰标记在哺乳动物细胞中检测蛋白相互作用的方法,其所涉及的snap标签蛋白基因为真核表达型基因,其核酸序列为SEQ ID NO:13;所涉及的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23。
在又一方面,本发明还提供三种表达载体,其中两种包含与表达控制序列操作性连接的本发明原核细胞内表达的融合蛋白核酸序列。另一种包含与表达控制序列操作性连接的本发明真核细胞内表达的融合蛋白核酸序列。所述表达控制序列可以是复制起点、启动子、增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等。
在又一方面,本发明还提供两种宿主细胞,一种宿主细胞其包含本发明原核细胞内表达的两种表达载体,另一种宿主细胞其包含本发明真核细胞内表达的表达载体,
在又一方面,本发明还提供一种制备本发明融合蛋白的方法,包括以下步骤:
a.将本发明表达载体转移到宿主细胞中,
b.在适合所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞。
c.由所述宿主细胞分离所述融合蛋白。
d.对可溶性的融合蛋白进行蛋白质纯化,获得所述融合蛋白。
e.对包涵体形式的融合蛋白进行变性和复性处理,获得有活性的所述融合蛋白。
在本发明中,术语“snap标签蛋白”指是一种适合本领域应用的一种多功能标签蛋白,分子量为20kDa,可以与其特异性识别的荧光染料底物以共价键的形式结合,形成荧光标记蛋白。snap标签蛋白中涉及与底物结合的关键位点是位于145位的半胱氨酸。
本发明中所涉及的“snap标签蛋白”的氨基酸序列可以包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。
本发明中所涉及的“柔性区域”是指蛋白质高级结构中存在的一些特定的如Loop结构域等结构,这些结构域相比于其他的蛋白质高级结构具有更高的移动性和柔性,并且能够导致结构域发生动态变化,而蛋白质在这些区域也存在着极大地发生空间构象改变的趋势。
本发明中,术语“leu zipper”是指亮氨酸拉链。它是由伸展的氨基酸组成,每7个氨基酸中的第7个氨基酸是亮氨酸,当这2个氨基酸片段分子平行排列时,亮氨酸之间相互作用形成二聚体,形成“拉链”。
本发明中,术语“Nzipper”和“Czipper”是指组成亮氨酸拉链的一对氨基酸片段。它们之间能够相互作用形成二聚体。
本发明中,术语“FKBP”是指FK506结合蛋白,是一类具有脯氨酰异构酶活性的蛋白质。它在功能方面与亲环素家族蛋白类似,但是没有蛋白序列上相似性。它能够与FK506的类似物雷帕霉素形成复合物。
本发明中,术语“FRB”是一类蛋白质的结构域,这类蛋白是哺乳动物中雷帕霉素的靶标,FKBP与FK506复合物的结合蛋白,该结构域能够与FKBP和雷帕霉素的复合物发生亲和结合。
本发明中,术语“rapamycin”是指雷帕霉素,属大环内酯类抗生素,与FK506的结构相似,能结合在相同的免疫亲和蛋白FKBP上,形成复合物。
在本发明中,术语“sumo蛋白”指sumo蛋白,是一类分子量约为11KDa,在结构上与泛素存在一定相似性的蛋白质。它们的一级结构虽然只有18%的序列相似性,但二级、三级结构惊人的相似。其可以增强蛋白质的稳定性和可溶性。
本文所用术语“融合蛋白”,指包含第一种多肽或蛋白质或者其片段、类似物或衍生物的氨基酸序列,以及异源多肽或蛋白质(即,不同于第一种多肽或蛋白质或者其片段、类似物或衍生物的第二种多肽或蛋白质或者其片段、类似物或衍生物)的氨基酸序列的多肽或蛋白质。在一个实施方式中,融合蛋白由snap标签蛋白片段、被研究的目的蛋白与两部分之间的氨基酸接头组成。
本文所用术语“Nsnap”和“Csnap”,指snap标签蛋白被拆分后包含原snap标签蛋白N端的氨基酸序列和包含原snap标签蛋白C端的氨基酸序列。
本文所用术语“荧光底物”,指与snap标签蛋白特异性结合的具有荧光特性的底物。具体是指从NEB公司获得的两种荧光探针,这两种底物的具体荧光特性和使用方法,均按照NEB公司的标准protocol为准。
本文所用术语“底物”,包含荧光底物snapcell505,snapcell430和其他底物snap-biotin。
本文所用术语“斑点免疫印迹”,又叫做“dot-blotting”,它是一种用来检测生物分子,或分子和鉴别蛋白质的分子生物学技术。其原理和蛋白质免疫印迹法类似。
本文所用术语“原核表达型基因”,是指目的蛋白在原核细胞中表达时优化的基因序列,可以增强目的蛋白在原核细胞中的表达量。
本文所用术语“真核表达型基因”,是指目的蛋白在真核细胞中表达时优化的基因序列,可以增强目的蛋白在真核细胞中的表达量。
本文所用术语“接头”,指在本发明多肽、蛋白质或核酸中连接两个部分的氨基酸或核酸序列。在本发明多肽或蛋白质中进行连接时,接头的长度可以没有也可以多个,优选是3-6个氨基酸。
本文所用术语“可溶性融合蛋白”,是指从宿主细胞分离所述融合蛋白时,存在于液相部分的融合蛋白。
本文说用术语“包涵体”,是指重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的水不溶性结构。
本文所用术语“变性”和“复性”,是指在发明所述融合蛋白在体外纯化过程中的处理操作。由于融合蛋白在体外已“包涵体”形式存在,故使用“变性”操作使其变为线性的氨基酸序列,再通过“复性”操作使线性的氨基酸序列重新折叠成应有的蛋白质空间构象,形成所需的有活性的融合蛋白。
本发明所用术语“核酸”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明所涉及融合蛋白的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常 需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离和纯化得到有关多肽或蛋白。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段、衍生物、类似物或变异体)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。可通过突变PCR或化学合成等方法将突变引入本发明蛋白序列中。
本文所用的术语“表达载体”和“重组载体”可互换使用,指本领域熟知的原核或真核载体,例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体,这些载体能够在宿主体内复制和稳定,这些重组载体的一个重要特征是通常含有表达控制序列。本文所用术语“表达控制序列”指调控目的基因的转录、翻译和表达的可以与目的基因操作性连接的元件,可以是复制起点、启动子、标记基因或翻译控制元件,包括增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等,表达控制序列的选择取决于所用的宿主细胞。在本发明中适用的重组载体包括但不限于细菌质粒。在重组表达载体中,“操作性连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本领域普通技术人员将理解重组表达载体的设计可取决于如欲转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。此外,重组表达载体优选地包含一个或 多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如用于真核细胞的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性,或用于大肠杆菌的氯霉素或氨苄青霉素抗性。
在一种实施方式中,本发明模型或融合蛋白的大肠杆菌重组表达载体。可以将本发明的表达载体转移到宿主细胞中,以产生包括融合蛋白的蛋白或肽。此种转移过程可用转化或转染等本领域技术人员熟知的常规技术进行。
本文在所用术语“宿主细胞”又称为受体细胞,是指能够接收和容纳重组DNA分子的细胞,是重组基因扩增的场所,理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞,具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
本发明的表达载体可用于在原核或真核细胞中表达本发明荧光探针或融合蛋白。从而,本发明涉及已导入本发明表达载体的宿主细胞、优选大肠杆菌。宿主细胞可为任何原核或真核细胞,代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属,鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞,真菌细胞如酵母,植物细胞,果蝇S2或Sf9的昆虫细胞,CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等,其中包括但不限于上述的那些宿主细胞。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞,此类细胞已为本领域熟知并常用,例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的一个实施方式中,选用大肠杆菌BL21构建表达本发明融合蛋白的宿主细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
本文所用术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如,线性DNA或RNA(例如,线性化载体或无载体的单独的基因构建体))或载体形式的核酸(例如,质粒、粘粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其它DNA)导入宿主细胞的技术,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主细胞是真核细胞时,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
可以用适合所述宿主细胞表达的常规方法培养获得的转化细胞,表达本发明融合蛋白。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适 于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离或纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在一个实施方式中,通过包含本发明融合蛋白编码序列的大肠杆菌发酵生产本发明荧光探针或融合蛋白,并通过硫酸铵沉降,离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯形式的本发明模型或融合蛋白。
本发明方法的用途包括但不限于检测以下被研究相互作用的蛋白质:一、FKBP蛋白和FRB蛋白,由雷帕霉素(rapamycin)介导相互作用;二、亮氨酸拉链(leu-zipper)。
在本文中,浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解,使用这种范围形式只是为了方便和简洁,应该被弹性地借读为包括范围上下限所明确提及的数值,还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围,就好像明确提及各个数值和子范围那样。
有益的技术效果:
本发明提供一种基于双分子互补的共价修饰标记检测蛋白相互作用的方法,该方法利用snap标签蛋白在41位或75位拆分所得片段的双分子互补,通过荧光底物共价标记修饰的方法,实现了对蛋白质之间相互作用的检测。具体实现了在体外或在大肠杆菌、哺乳动物细胞中检测蛋白质之间的相互作用;并消除了双分子互补时自结合所造成的假阳性问题;其中基于snap标签蛋白在75位拆分的方法,具有检测时更低信号背景的特点,基于snap标签蛋白在41位拆分的方法,具有更高检测信号的特点;还也可利用荧光通过不同的色彩反映蛋白质之间的相互作用。本发明提供的方法,snap标签蛋白片段浓度为1μM时,在没有蛋白质相互作用介导下,并没有检测到明显被标记的信号。
附图说明
图1是不同浓度的snapcell505共价标记SNAP标签蛋白的电泳图;
图2是构建pCDFDuet-SUMO-NSNAP-NZipper,pET28a-SUMO-CZipper-CSNAP,pCDFDuet-SUMO-NSNAP-noZipper,pCDFDuet-NSNAP-FRB和pET28a-FKBP12-CSNAP质粒分布双酶切连接方法的示意图;
图3融合蛋白Nsnap-NZipper和Czipper-Csnap在大肠杆菌中的双分子互补和共价标记修饰实验;
图4融合蛋白Nsnap-Nzipper和Czipper-Csnap在体外的双分子互补和共价标记修饰实验;
图5融合蛋白Nsnap-FRB和FKBP12-Csnap在体外的双分子互补和共价标记修饰实验;
图6在293细胞中检测蛋白相互作用的荧光成像,使用snapcell505探针;
图7在293细胞中检测蛋白相互作用的荧光成像,使用snapcell430探针;
图8在cos-7细胞中检测蛋白相互作用的斑点免疫印迹实验。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等,《分子克隆:实验室指南》(美国纽约州:冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1989);或按照制造厂商所建议的条件进行。在本文中,除非另外说明,百分比和份数均按重量计算。
I.实验材料和试剂
试剂:除特别标注,其他均来自上海国药(集团化学试剂有限公司(中国上海)。
PCR扩增所使用的pfu酶、taq酶、缓冲液、dNTP;分子生物实验中所使用的蛋白酶、缓冲液、T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、T4多聚核苷酸激酶(PNK)、T4PNK缓冲液,均来自富酶泰斯公司(Fermentas,立陶宛维尔纽斯)。Snap-cell430染料、snap-cell505染料、snap-biotin购自NEB;细胞高糖培养基购自hyclone;lip2000购自Invitrogen。
实施例1 pET28a-snap,pCDFDuet-snap构建、表达和snap标签蛋白的共价修饰标记。
1.扩增snap的核酸序列:
以pT7-snap载体(购自NEB公司)上的snap基因为模板,利用引物snap标签蛋白的编码序列,引物序列(引物由上海生工生物工程有限公司(中国上海)合成)如下:
PCR反应体系为
PCR反应条件为:
将PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳30分钟,得到约576bp的snap片段。利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司,中国上海)按照厂商说明书从凝胶中回收和纯化snap片段。
2.目的基因片段与载体的连接
将回收纯化的PCR片段snap以及载体质粒pET28a,pCDFDuet分别进行双酶切,体系如下:
反应条件:37℃,6小时。
反应结束后,50μl反应体系中加入10μl6×上样缓冲液终止反应。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段,利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司,中国上海)按照厂商说明书回收并纯化片段。
将回收到的snap双酶切产物及载体质粒pET28a,pCDFDuet双酶切产物连接,体系如下:
反应条件:16℃连接6h。从而形成连接产物pET28a-SNAP,pCDFDuet-SNAP。
将重组质粒pET28a-SNAP,pCDFDuet-SNAP转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)MachI(华东理工大学蛋白质化学实验室保存(中国上海))中,获得重组菌,具体方法如下:
(i)在洁净条件下,取1μl质粒或10μl连接产物加入100μl感受态中,冰浴60分钟;
(ii)冰浴后,迅速于42℃水浴中热激90秒;
(iii)再冰浴5分钟;
(iv)加入600ul LB液体培养基,37℃、150rpm摇床复苏1小时;
(v)4000rpm、常温离心5分钟后,弃去上清;
(vi)用少量的新鲜LB重悬沉淀,随后将全部菌液均匀涂布于所需的LB平板上,37℃倒置培养过夜。
取菌落PCR鉴定为阳性的克隆,采用通用引物测序,由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司进行测序。测定的序列用Vector NTI8.0进行数据比对分析。结果表明该质粒中确实插入了snap的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示),该序列编码序列表中SEQ ID NO:2所示的蛋白。
3.pET28a-SNAP,pCDFDuet-SNAP的表达和蛋白纯化
将pET28a-SNAP,pCDFDuet-SNAP质粒转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLys(华东理工大学蛋白质化学实验室保存(中国上海),最初购自天根生化,(中国北京))中,进行小量表达。采用常规的菌落PCR方法筛选阳性克隆,并转入5ml含有相应抗性的LB液体培养基中,37℃、220rpm过夜培养。将转化了质粒的表达菌株BL21接种到500ml的LB培养基中,进行蛋白表达,加入IPTG(终浓度为0.7mM),37℃,220rpm,诱导6小时。4000rpm,4℃离心20min收集菌体,超声破碎收集的菌体,离心取上清。
使用AKTA purifier进行蛋白纯化,将Histrap FF1mL柱装在蠕动泵上,用去离子水洗柱子至中性(柱子在20%乙醇中保存),再用10倍柱体积的A液平衡柱子后,含有目的蛋白的上清以0.5mL/min的速度上样,流穿要收集起来备用,用20倍柱体积的A液洗除杂蛋白。使用Akta Purifier梯度洗脱纯化蛋白。
洗脱结束后,根据目的蛋白的洗脱峰,收集含有目的蛋白的洗脱溶液,用Bradford法测定蛋白浓度,并且等体积上量,进行SDS-PAGE电泳鉴定,均只在约19kD处有一条蛋白条带,为目的蛋白。-20℃保存纯化蛋白。
4.snap标签蛋白与其荧光底物的共价修饰标记
底物SNAP-Cell505能够和SNAP标签蛋白相互作用,发生共价相连,可以通过检测SNAP-Cell505的荧光而间接检测目的蛋白。SNAP-Cell505在和SNAP标签蛋白反应后,未反应的底物要和反应的底物分离,因此我们将反应的样品,用SDS-PAGE的方法进行电泳,使未反应的SNAP-Cell505和反应的底物在电泳胶上分离开,通过检测电泳胶上的荧光检测有活性的目的蛋白。
在PCR管中,加入15μl的反应体系,SNAP标签蛋白的终浓度为0.4、0.2、0.1、0.05μg/μl,SNAP-Cell505(可以标记SNAP-tag融合蛋白的一种绿色荧光底物)的浓度为0.5μM和2.5μM,室温,避光反应1小时。反应结束后,样品和5×蛋白电泳Loading Buffer混匀,变性的样品在15%的SDS-PAGE的电泳胶上电泳,未反应的底物和标记的蛋白分离,电泳过程要避光。电泳胶利用紫外分析仪,在在紫外灯下观察,拍照,保存图像。
结果显示:使用只需要0.5μM的底物,就能检测到0.025μg/μl的底物,也就是1.25μM,因此可也用这个浓度的底物检测重组的蛋白(图1)。
实施例2 pCDFDuet-NSNAP-Nzipper,pET28a-CZipper-CSNAP,pCDFDuet-NSNAP-noZipper,pCDFDuet-NSNAP-FRB和pET28a-FKBP12-CSNAP的质粒构建
通过分析SNAP的晶体结构,我们选择了两个位点进行拆分:“1”代表41位拆分位点;“2”代表75位拆分位点。这些位点位于蛋白质的柔性区域,以确保位点断开时不会破坏蛋白的结构和功能(Duguid EM,Rice PA,&He C.Journal of Molecular Biology.2005.350(4):657-666.)。我们把拆分的两个片段分别称为1N,2NSNAP和1C,2CSNAP。
1.扩增snapN、snapC、Nzipper、Czipper、FKBP、FRB核酸序列:
以pET28a-SNAP上的SNAP基因为模板,以实验室原有的FKBP、FRB模板(Banaszynski,L.A.,C.W.Liu,et al.(2005).J Am Chem Soc127(13):4715-4721.)和zipper模板(Indraneel Ghosh,et al.J.Am.Chem.Soc.2000,122,5658-5659),利用引物snap标签蛋白的编码序列扩增目的核酸序列,引物序列(引物由上海生工生物工程有限公司(中国上海)合成)如下:
PCR反应体系为
PCR反应条件为:
将PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳30分钟,得到如下基因片段:
利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司,中国上海)按照厂商说明书从凝胶中回收和纯化核酸片段。
2.目的基因片段与载体的连接
将回收纯化的PCR片段以及扩增的载体质粒pET28a-Csnap,pCDFDuet-Nsnap(获自华东理工大学蛋白质化学实验室(中国上海)分别进行双酶切,按照如图2所示进行分布双酶切连接方法构建质粒。
酶切体系:为50ul,PCR产物酶切量15ul,载体酶切量为10ul,所选酶量均为2ul。反应条件:37℃,6小时。
反应结束后,50μl反应体系中加入10μl6×上样缓冲液终止反应。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段,利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司,中国上海)按照厂商说明书回收并纯化片段。
将回收到的双酶切产物及载体质粒pET28a-Csnap,pCDFDue-Nsnap双酶切产物连接,体系如下:
反应条件:16℃连接6h。
将重组质粒转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)MachI(华东理工大学蛋白质化学实验室保存(中国上海))中,获得重组菌。具体构建的质粒列表为:
取菌落PCR鉴定为阳性的克隆,采用通用引物测序,由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司进行测序。测定的序列用Vector NTI8.0进行数据比对分析。结果表明该质粒中确实插入了目的核苷酸序列,其对应氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19)。
实施例3 pET28a-CZipper-CSNAP与pCDFDuet-NSNAP-Nzipper、pCDFDuet-NSNAP-noZipper在大肠杆菌中的共表达和snap标签蛋白共价标记。
含有互补片段基因的质粒(pCDFDuet–NSNAP-NZ和pET28a-CZ-CSNAP,pCDFDuet–NSNAP-noZ和pET28a-CZ-CSNAP),共转化BL21感受态细胞,涂平板筛选,琼脂培养基中含有相应的抗生素(Sm和Kana)。接种到到5ml LB中,进行小量蛋白表达。IPTG(终浓度为0.7mM),37℃,220rpm,诱导6h。4000rpm,4℃离心20min离心收集菌体。
共表达的细菌离心收集后,超声破碎。破碎的样品离心后,取上清。在室温下,15μl上清和底物SNAP-Cell505孵育,SNAP-Cell505终浓度为0.5μM,避光反应1小时。标记反应后,反应物和5×蛋白电泳Loading Buffer混匀,变性的样品在15%的SDS-PAGE的电泳胶上电泳,未反应的底物和标记的蛋白分离,电泳过程要避光。电泳胶利用柯达多光谱荧光活体成像系统进行分析,激发光为470nm,发射光为535nm,曝光时间为30s。
结果显示(图3),基于snap标签蛋白在41,75位点拆分片段的双分子互补的共价修饰标记方法,能够在大肠杆菌里检测蛋白质相互作用。
实施例4 pCDFDuet-sumo-NSNAP-Nzipper,pET28a-sumo-CZipper-CSNAP,pCDFDuet-sumo-NSNAP-noZipper质粒构建和蛋白的表达纯化。
本实施例记述申请人进一步优化融合蛋白的表达水平。
1.质粒优化构建。
以pCDFDuet-NSNAP-Nzipper,pET28a-CZipper-CSNAP,pCDFDuet-NSNAP-noZipper载体(先前构建)上的模型基因序列为模板,利用引物序列扩增目的核酸序列,引物序列(引物由上海生工生物工程有限公司(中国上海)合成)如下:
PCR反应体系为
PCR反应条件为:
将PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳30分钟。利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司,中国上海)按照厂商说明书从凝胶中回收和纯化snap片段。
2.目的基因片段与载体的连接
将回收纯化的PCR片段snap以及载体质粒pET28a-sumo,pCDFDuet-sumo(获自华东理工大学蛋白质化学实验室(中国上海)分别进行双酶切,体系如下:
反应条件:37℃,6小时。
反应结束后,50μl反应体系中加入10μl6×上样缓冲液终止反应。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段,利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司,中国上海)按照厂商说明书回收并纯化片段。
将回收到的snap双酶切产物及载体质粒pET28a-sumo,pCDFDuet-sumo双酶切产物连接,体系如下:
反应条件:16℃连接6h。从而形成连接产物pET28a-SNAP,pCDFDuet-SNAP。
将重组质粒pET28a-SNAP,pCDFDuet-SNAP转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)MachI(华东理工大学蛋白质化学实验室保存(中国上海))中,获得重组菌,具体方法同前。
取菌落PCR鉴定为阳性的克隆,采用通用引物测序,由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司进行测序。测定的序列用Vector NTI8.0进行数据比对分析。结果表明该质粒中确实插入了核苷酸序列,其对应氨基酸序列(如序列表中 SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8)。
获得的质粒列表为:
3.融合蛋白的表达和纯化
将pCDFDuet-sumo-(1,2)NSNAP-Nzipper,pET28a-sumo-(1,2)CZipper-CSNAP,pCDFDuet-(1,2)NSNAP-FRB和pET28a-FKBP12-(1,2)CSNAP质粒转化入感受态的大肠杆菌Rosetta(华东理工大学蛋白质化学实验室保存(中国上海);将pCDFDuet-sumo-(1,2)NSNAP-noZipper质粒转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLys(华东理工大学蛋白质化学实验室保存(中国上海),最初购自天根生化,(中国北京))中,进行表达。采用常规的菌落PCR方法筛选阳性克隆,并转入5ml含有相应抗性的LB液体培养基中,37℃、220rpm过夜培养。4000rpm,4℃离心20min收集菌体,超声破碎后,进行蛋白质的纯化。
其中SUMO-1,2NSNAP-Nzipper,SUMO-noZipper-1,2NSNAP蛋白表达在上清中,用Ni2+亲和层析柱(通用电气公司,瑞典乌普萨拉)从菌体裂解液中分离纯化重组蛋白可溶蛋白纯化步骤:
i.将泡在20%乙醇溶液中的96深孔板Ni2+柱(200μL)从4℃冰箱取出,用10倍柱体积的ddH2O洗柱子,ddH2O要经过超声脱气,ddH2O通过重力流过柱子,去除柱子中的乙醇。
ii.用10倍柱体积的His柱缓冲液A洗柱子,利用重力的作用。
iii.将含有目的蛋白的上清加入柱子中,用洗干净的96孔深孔板收集流穿液,标记好每个收集的样品。
iv.样品全部流穿柱子后,加入5~10倍柱体积的蛋白His柱缓冲液A,可以除掉与柱子结合力较弱的杂蛋白,弃去滤液。
v.加入10倍柱体积的5%蛋白His柱缓冲液B,除去杂蛋白,用干净的96深孔板收集洗杂液,置于冰上。
vi.用40%的蛋白His柱缓冲液B洗脱与柱子结合的目的蛋白。每次加入200ul洗脱缓冲液,用96孔的深孔板收集蛋白溶液。
vii.加入10倍柱体积的蛋白His柱缓冲液B,洗去和柱子结合的杂蛋白,收集杂蛋白。
viii.用10倍柱体积的ddH2O清洗柱子,直到滤液的pH值接近7.0,说明柱子中的缓冲液已被清洗干净。
ix.用10倍柱体积的20%乙醇清洗柱子,使乙醇溶液充满柱子后,用封口膜包好柱子放回4oC冰箱保存。纯化后的目的蛋白用Bradford法,测定蛋白的浓度,用SDS‐PAGE电泳进行小量鉴定,最后做好标记,在‐20℃或‐80℃冰箱保存备用。
而SUMO‐CZipper‐CSNAP,2NSNAP‐FRB和FKBP12‐1,2CSNAP表达在包涵体中,使用包涵体的纯化方法进行纯化。包涵体表达的蛋白在沉淀中,超声破碎表达菌体,4000rpm、4℃离心20min后,弃去上清,在沉淀中加入200μl变性缓冲液(称取96g尿素,0.03084g DTT,加入200ml的瓶子中,再加入去离子水定容到200ml,室温保存。终浓度为8M尿素,1mMDTT),室温放置2h,使包涵体溶解;12000rpm离心10min,取上清。用Bradford法测定蛋白的浓度。利用上述方法获得了较纯的SUMO-1,2NSNAP-Nzipper,SUMO-noZipper-1,2NSNAP,SUMO-Czipper-1,2CSNAP,1,2NSNAP-FRB和FKBP12-1,2CSNAP标签蛋白质。
实施例5 蛋白质相互作用的体外检测实验。
将等量的纯化的互补蛋白片段(SUMO-1,2NSNAP-Nzipper/SUMO-CZipper-1,2CSNAP和SUMO-noZipper-1,2NSNAP-/SUMO-CZipper-1,2CSNAP)在PCR管中混合后,加入复性缓溶液(称取0.26g KCl,0.019g MgCl2,0.605g Tris,0.0154g DTT,加入200ml的瓶子中,加入180ml去离子水,调节pH值到7.4,再加入去离子水定容到200ml,室温保存。终浓度为35mMKCl,2mM MgCl2,50mM Tris,1mM DTT。),稀释复性重装配6h,复性在室温下进行,蛋白质片段的终浓度为0.1,0.5,1μM三个浓度梯度,反应体系为15ul。在重装配的蛋白样品中加入底物SNAP-Cell505孵育,SNAP-Cell505终浓度为 0.5uM,避光反应1小时。标记反应后在15%的SDS-PAGE的电泳胶上电泳,电泳胶利用柯达多光谱荧光活体成像系统进行分析。
将等量的纯化的1,2NSNAP-FRB和FKBP12-1,2CSNAP互补蛋白片段在PCR管中混合后,加入复性缓溶液,反应体系为15μl,稀释复性重装配6h,蛋白质片段的终浓度为0.5,1,5,10μM四个浓度梯度。每对互补片段样品分成两个实验组,其中一组加入Rapamycin,终浓度为100μM,另一组不加入Rapamycin。复性在室温下进行。复性结束后,用底物SNAP-Cell505标记,SNAP-Cell505终浓度为0.5uM,避光反应1小时。标记反应后在15%的SDS-PAGE的电泳胶上电泳,电泳胶利用柯达多光谱荧光活体成像系统进行分析。
结果显示(图4,图5):通过纯化获得的融合蛋白,在体外进行共价修饰标记。在被研究蛋白质有相互作用的情况,该方法能通过荧光成像的方法展现出来。说明基于拆分snap标签蛋白的双分子互补的共价修饰标记,能在体外检测蛋白质之间的相互作用。
实施例6 Pcdna3.1-1,2NSNAPm-Nzipper,Pcdna3.1-CZipper-1,2CSNAPm,Pcdna3.1-1,2NSNAPm-noZipper,Pcdna3.1-1,2NSNAPm-FRB和Pcdna3.1-FKBP12-1,2CSNAPm,Pcdna3.1-SNAPm的质粒构建。
1.扩增snap的核酸序列:
以pT7-SNAPm载体(购自NEB公司)上的SNAP基因为模板,其中snapm核酸序列为哺乳动物细胞表达优化型的核酸序列,利用引物序列扩增目的基因,引物序列(引物由上海生工生物工程有限公司(中国上海)合成)如下:
将PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳30分钟。利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司,中国上海)按照厂商说明书从凝胶中回收和纯化PCR片段。
2.pcdna3.1载体PCR产物的扩增。
以pCDFDuet-sumo-(1,2)NSNAP-Nzipper,pET28a-sumo-(1,2)CZipper-CSNAP,pCDFDuet-(1,2)NSNAP-FRB和pET28a-(1,2)FKBP12-CSNAP为模板扩增基因(1,2)NSNAP-Nzipper、(1,2)CZipper-CSNAP、(1,2)NSNAP-FRB、FKBP12-(1,2)CSNAP。
将回收纯化的PCR片段以及载体质粒pcdna3.1分别使用HindIII和XhoI进行双酶切,反应条件:37℃,6小时。
反应结束后,通过琼脂糖凝胶电泳并胶回收双酶切的PCR和载体产物。连接回收的产物,反应条件:16℃连接6h。将重组质粒转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)MachI(华东理工大学蛋白质化学实验室保存(中国上海))中,获得重组菌。
取菌落PCR鉴定为阳性的克隆,采用通用引物测序,由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司进行测序。测定的序列用Vector NTI8.0进行数据比对分析。结果表明该质粒中确实插入了核苷酸序列。
以pcdna3.1-1NSNAP-Nzipper,pcdna3.1-1CZipper-CSNAP,pcdna3.1-1NSNAP-FRB和pcdna3.1-FKBP12-1CSNAP为模板,使用引物序列扩增载体片段,获得两端为Bsp119I和Bsp1407I酶切的位点的线性化载体(pcdna3.1-Nzipper,pcdna3.1-Czipper,pcdna3.1-FRB和pcdna3.1-FKBP12)。引物序列(引物由上海生工生物工程有限公司(中国上海)合成)如下:
3.目的基因片段与载体的连接。
使用Bsp119I和Bsp1407I双酶切胶回收的NSNAPm,CSNAPm的PCR片段和线性化载体。使用HindIII和XhoI双酶切胶回收的NSNAPm-nozipper的PCR片段和pcdna3.1反应条件:37℃,6小时。
反应结束后,通过琼脂糖凝胶电泳并胶回收双酶切的PCR和载体产物。连接回收的产物,反应条件:16℃连接6h。将重组质粒转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)MachI(华东理工大学蛋白质化学实验室保存(中国上海))中,获得重组菌。
取菌落PCR鉴定为阳性的克隆,采用通用引物测序,由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司进行测序。测定的序列用Vector NTI8.0进行数据比对分析。结果表明该质粒中确实插入了核苷酸序列,其对应氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23所示)。
获得的质粒列表为:
实施例7 蛋白质相互作用在哺乳动物细胞上的成像检测实验
1.模型质粒在哺乳动物细胞上的转染。
在96孔玻璃底细胞培养板中,将实施例6中质粒进行双质粒的转染实验,具体步骤如下:
1.在转染前一天,在500μl无抗性培养基中铺板0.5-2x105个细胞,使转染前细胞覆盖率为90-95%。
2.转染样品体系的配置:(从B步骤开始整个配置过程不要超过30min)
A.设定好转染质粒和脂质体混合比例,计算好各自所需的体积。
B.使用Opti-MEMI稀释转染质粒至25μl体系,并轻柔混匀。
C.轻柔混匀LipofectamineTM2000,然后使用Opti-MEMI稀释LipofectamineTM2000至25μl体系并轻柔混匀。
D.室温下孵育5min。
E.将稀释的质粒和LipofectamineTM2000加到一起轻柔混合,在室温下孵育20min。
3.每个板空中加入50μl上面配置的混合液,然后前后推动平板混匀。将培养基吸掉一半后,将转染混合液加入,培养6h后补加培养基。
4.放置在5%CO2,37℃条件下培养36小时。
2.蛋白质相互作用在哺乳动物细胞上的荧光成像检测。
在293中进行表达36h后,对细胞进行荧光染料的孵育,并在nikon显微镜上进行荧光成像检测。共设置如下实验组:
表达30h时,对FRB+FKBP实验组加入100nM rapamycin进行孵育。至36h检测时,共孵育6小时。
表达36h后,加入使用培养基稀释的5μM snap标签蛋白的荧光染料(snapcell505、snapcell430,购自NEB),对细胞孵育1小时。
使用培养基对细胞进行洗涤1次后,加入100ul新鲜培养基对细胞孵育30min。之后在重复操作一次,共使用新鲜培养基孵育细胞1小时。孵育完后,使用37℃的PBS溶液对细胞进行轻柔的洗涤,重复3次。洗涤完成后,洗掉洗涤液。加入100ul新的PBS溶液。进行细胞的荧光成像。
使用nikon公司的显微镜进行成像,成像通道和图片格式信息为:snap-cell505探针的成像FITC通道:1280x1024no binning;400ms曝光;1Xgain;BF通道:1280x1024no binning;15ms曝光;1Xgain。snap-cell430探针的成像DAPI通道:1280x1024no binning;100ms曝光;2Xgain;BF通道:1280x1024no binning;15ms曝光;2Xgain。对成像图片进行分析和处理。
结果显示(图6,图7):通过在哺乳动物细胞中表达融合蛋白并进行共价修饰标记,在被研究蛋白质有相互作用的情况,蛋白质相互作用能通过荧光成像的方法展现出来。说明基于拆分snap标签蛋白的双分子互补的共价修饰标记,能在扑入动物细胞中检测蛋白质之间的相互作用。
实施例8 蛋白质相互作用在哺乳动物细胞上的dot-blot检测实验
本实施例记述申请人进一步通过免疫的方法来研究基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白质相互总用的方法。
在6孔细胞培养板培养cos-7细胞中,对质粒pcdna3.1-2NSNAP-FRB和pcdna3.1-FKBP12-2CSNAP进行转染表达36h后,对样品进行dot-blot实验。具体实验步骤如下:
转染好的细胞,直接在所在平板中洗掉培养基,并用PBS洗涤1-2次。然后加入细胞裂解buffer100ul,然后用枪头搅动细胞,会有粘稠状物质出现,转移至1.5mlEP管中,此处注意枪头需在前段剪掉一部分,以便粘稠物质容易吸入。
收完的样品进行超声破碎打断DNA。使用探头,100s,超1停4,15%功率。破碎至溶液不在粘稠。样品破碎后,使用lorry法对蛋白定量(5ul样品+25ulA、S液[比例50:1]+200ul试剂B),估算上样量。将定量后的细胞破碎混合液按等量滴加在硝酸硝酸纤维膜上。样品的滴加方法为:每次滴加6ul混合液,风干后再滴加下滴,直至滴完混合液。
将硝酸纤维膜取出,用1*TBS洗2次,每次10min。然后将膜置于12ml1%blocking solution中在转移摇床上孵育1h。孵育后,用0.5%的stocking solution稀释一抗,自己特殊蛋白的抗体,用说明书上的稀释buffer进行稀释。在平面上覆上一层parafilm,保持平整,将不同抗体的膜分别摆放。在膜上用tip滴加一抗,盖上盖子孵育37℃1h或4℃过夜。一小片膜需500-1000ul一抗即可。加一抗前,用滤纸吸干膜上溶液。
使用1XTBST冲洗膜4次,每次至少5min,再用0.5%的blocking solution洗2次,每次10min。使用0.5%的blocking solution稀释二抗,滴加到膜上孵育1h。加 二抗前,用滤纸吸干膜上溶液。使用TBST至少洗涤5次,每次10min。之后,在使用TBS洗涤一次后,将膜泡在适量PBS溶液中暂存。
将Roche检测液按照说明书中的方法进行混合:溶液A:B=100:1混合。将PVDF放在干净的透明塑料膜上,滴加Roche检测液。反应60S后,将拍照PVDF膜放置在多光谱荧光活体成像系统进行发光检测。
结果显示(图8)::通过在哺乳动物细胞中表达融合蛋白并进行共价修饰标记,在被研究蛋白质有相互作用的情况,蛋白质相互作用能通过荧光成像的方法展现出来。说明基于拆分snap标签蛋白的双分子互补的共价修饰标记,能在哺乳动物细胞中定量检测蛋白质之间的相互作用。
Claims (13)
1.一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法,其特征在于,所述方法利用对snap标签蛋白的拆分所得的两部分片段,分别与被研究的一对蛋白进行融合形成融合蛋白;若被研究的蛋白之间存在相互作用,则融合蛋白被snap标签蛋白底物共价修饰标记,通过荧光成像或斑点免疫印迹的方法在体外或在大肠杆菌、哺乳动物细胞中检测蛋白质之间的相互作用。
2.根据权利要求1所述的检测蛋白相互作用的方法,其特征在于,所述对snap标签蛋白拆分得到两部分氨基酸片段,其拆分位点在snap标签蛋白的41位或75位。
3.根据权利要求1所述的检测蛋白相互作用的方法,其特征在于,所述在体外检测蛋白质之间的相互作用包括以下步骤:
(1)构建编码所述融合蛋白核酸序列的表达载体;
(2)在宿主细胞中表达所述融合蛋白;
(3)使用亲和纯化或蛋白质变性和复性的实验方法得到所述融合蛋白;
(4)在体外进行融合蛋白的双分子互补和共价修饰标记;
(5)通过凝胶电泳和荧光成像检测蛋白质的相互作用。
4.根据权利要求1所述的检测蛋白相互作用的方法,其特征在于,所述在大肠杆菌中检测蛋白质之间的相互作用包括以下步骤:
(1)构建编码所述融合蛋白核酸序列的表达载体;
(2)在宿主细胞中表达所述融合蛋白;
(3)经过细胞裂解后,对细胞中的融合蛋白进行共价修饰标记;
(4)通过凝胶电泳和荧光成像检测蛋白质的相互作用。
5.根据权利要求1所述的检测蛋白相互作用的方法,其特征在于,所述在哺乳动物细胞中检测蛋白相互作用包括以下步骤:
(1)构建编码所述融合蛋白核酸序列的表达载体;
(2)在哺乳动物细胞中表达所述融合蛋白;
(3)对细胞中的融合蛋白进行共价修饰标记;
(4)通过荧光成像和斑点免疫印迹的方法检测蛋白质的相互作用。
6.根据权利要求3所述的检测蛋白相互作用的方法,其特征在于,所述融合蛋白由蛋白质sumo,被拆分的snap标签蛋白片段Nsnap、Csnap,被研究相互作用的蛋白质FKBP、FRB、Nzipper、Czipper和接头X1、X2组成;其组合形式是:(1)sumo-X1-FRB-X2-Nsnap;(2)sumo-X1-Csnap-X2-FKBP;(3)Nzipper-X1-Nsnap;(4)Csnap-X2-Czipper;在上述两种结合方式中的X1和X2氨基酸序列相同或者不同,在(1)、(2)、(3)和(4)中的X1和X2氨基酸序列相同或者不同,所述接头的氨基酸长度没有或者多个,优选3-6个氨基酸。
7.根据权利要求4-5所述的检测蛋白相互作用的方法,其特征在于,所述的融合蛋白由被拆分的snap标签蛋白片段Nsnap、Csnap,被研究相互作用的蛋白质FKBP、FRB、Nzipper、Czipper和接头X1、X2组成;其组合形式是:(1)FRB-X1-Nsnap;(2)Csnap-X2-FKBP;(3)Nzipper-X1-Nsnap;(4)Csnap-X2-Czipper;在上述两种组合形式中的X1和X2氨基酸序列相同或者不同,在(1)、(2)、(3)和(4)中的X1和X2氨基酸序列相同或者不同,所述接头的氨基酸长度没有或者多个,优选3-6个氨基酸。
8.根据权利要求3-4所述的蛋白质相互作用检测方法,其特征在于,编码所述snap标签蛋白的基因为原核表达型基因,其核酸序列SEQ ID NO:1。
9.根据权利要求5所述的蛋白质相互作用检测方法,其特征在于,所述编码snap标签蛋白的基因为真核表达型基因,其核酸序列SEQ ID NO:13。
10.根据权利要求1所述的蛋白质相互作用检测方法,其特征在于,所述融合蛋白被snap标签蛋白底物修饰的方式是共价修饰。
11.根据权利要求3所述的蛋白质相互作用检测方法,其特征在于,所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12。
12.根据权利要求4所述的蛋白质相互作用检测方法,其特征在于,所述的融合蛋白的氨基酸序列同SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQID NO:18,SEQ ID NO:19。
13.根据权利要求5所述的蛋白质相互作用检测方法,其特征在于,所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23。
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