CN109385450A - 一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统及应用 - Google Patents

一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统及应用，以荧光蛋白Venus为模板，分别在氨基酸154‑155位以及172‑173位将其拆分为不发荧光的三个片段VN154，VN(155‑172)和VC173，当这三个片段分别与相互作用的三个蛋白相融合表达时，无荧光的三个片段就可以被拉近而激发产生Venus的荧光信号；由于Venus的三片段荧光互补系统具有高的互补荧光强度和生理温度条件下成熟的特性，因此，可以在生理温度条件下实现三个蛋白相互作用的成像研究。该系统为一种简单、有效、方便的研究三蛋白相互作用的系统。

Description

一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统及应用
技术领域
本发明涉及三蛋白相互作用成像技术领域，更具体涉及一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统及应用。
背景技术
多蛋白复合体通过蛋白质间的相互作用调控了许多细胞生命过程。特别是许多细胞信号蛋白，如G蛋白，往往以三蛋白复合体的形式发挥功能(Khan,S.M.etal.Pharmacol.Rev.2013,65,545-577.)。但是，可视化和鉴定这些多蛋白复合体的相互作用仍然是一项具有挑战性的研究。目前有一些基于荧光成像的方法被用于研究蛋白质间的相互作用，比如：荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)(Jares-Erijman,E.A.et al.Curr.Opin.Chem.Biol.2006,10,409-416.)、双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)(Hu,C.D.et al.Mol.Cell2002,9,789-798.Chen,M.H.et al.Biomaterials 2015,48,97-107.)、荧光相关光谱技术(Oyama,R.et al.Nucleic Acids Res.2006,34,e102.)等。但是这些方法主要被用于两个蛋白质之间的相互作用研究。
最近发展的三个发射团所依赖的荧光共振能量转移(3-FRET)(Galperin,E.etal.Nat.M ethods 2004,1,209-217.)和双分子荧光互补依赖的荧光共振能量转移(BiFC-FRET)技术(Shy u,Y.J.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2008,105,151-156.)被用于研究三个蛋白质间的相互作用。但是这些方法往往依赖精端的荧光成像设备以及复杂的数据处理过程，同时在荧光共振能量转移过程中的光谱串色也容易混淆实验结果，因此发展一种简便、可行的研究三个蛋白质相互作用的方法显的尤为重要。
三片段荧光互补系统是一种以荧光蛋白作为材料的荧光片段互补系统。其基本原理是在合适的位点将荧光蛋白拆分成三个彼此不发荧光的片段，并且这三个片段若没有在相互作用蛋白的作用下，不能自发的互补而恢复荧光。若有三个相互作用的蛋白分别与拆分的荧光蛋白的三个片段相融合，在这三个相互作用蛋白的作用下，拆分的荧光蛋白的三个片段就会相互靠近，从而恢复完整荧光蛋白的构象而发出特异性的荧光。三片段荧光互补系统能够特异性的检测到弱的瞬间相互作用，是一种检测多蛋白相互作用的简便、直观、灵敏的方法。
所以，本研究构建了一种用于细胞内多蛋白相互作用成像的三片段荧光互补系统，用于在细胞生理温度条件下检测三个蛋白之间的相互作用。该新系统基于在同一细胞内共表达分别与Venus的拆分片段VN154、VN(155-172)和VC173相融合表达的蛋白，通过检测细胞内Venus的重构荧光，就可以成像多蛋白的相互作用。该系统为一种灵敏、有效、可靠的用于细胞内多蛋白相互作用成像的荧光片段互补系统。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统。该系统包括三个分别含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的表达载体，该系统为一种简单、有效、可靠的研究多蛋白相互作用的系统。
本发明的另一个目的在于提供了一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统的应用，该系统可以用于多蛋白相互作用的细胞生理温度成像。
该系统包括载体pVN154，pVN(155-172)和pVC173，其中pVN154载体为包含有序列SEQ ID NO.2的pcDNA3.1载体，pVN(155-172)载体为包含有序列SEQ ID NO.3的pcDNA3.1载体，pVC173载体为包含有序列SEQ ID NO.4的pcDNA3.1载体。该系统为一种简单、有效、可靠的研究多蛋白相互作用的系统。
本发明的设计思路如下：
以GFP来源的荧光蛋白Venus(其序列为SEQ ID NO.1所示)为材料，选取合适的拆分位点，在氨基酸154与155位以及172与173位之间将Venus拆分为三段，分别表达出三个不发荧光的蛋白片段VN154，VN(155-172)和VC173，当这三个片段分别与三个相互作用的蛋白相融合并共表达在同一个细胞内，三个不发荧光的蛋白片段VN154，VN(155-172)和VC173就可以被相互作用的蛋白拉近，重新恢复为荧光蛋白Venus的完整构象而激发产生荧光信号；由于此三片段荧光互补系统具有生理温度条件下成熟的特性，因此，该系统可以在细胞生理温度条件下研究多蛋白的相互作用。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统，该系统包括三个分别含有SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的表达载体。
以上所述的方案中，优选的，所述的表达载体为真核表达载体；
以上所述的方案中，优选的，所述的表达载体为哺乳动物细胞表达载体；
以上所述的方案中，优选的，所述的表达载体为pcDNA3.1或pEGFP-C1或pEGFP-N1表达载体。
一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统的应用，其应用过程包括：
将待研究相互作用的三个蛋白的核苷酸序列分别插入该互补系统的三个表达载体的多克隆位点中，得到的三个表达质粒共转染细胞并培养，考察荧光激发情况。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
A、含有需共转染的三个质粒可分别表达出荧光蛋白Venus的蛋白片段VN154、VN(155-172)和VC173；
B、含有氨苄霉素抗性基因，可以用于转化有该共转染质粒的细菌在抗性培养基上的筛选及培养；
C、在三个质粒的相应多克隆位点上分别插入待研究的相互作用蛋白复合物，可实现待研究相互作用蛋白复合物相互作用的研究；
D、由于此三片段荧光互补系统可以在37摄氏度下成熟，所以可以在细胞正常的生理温度条件下来研究三蛋白间的相互作用。
E、此系统是基于对Venus在154-155和172-173位点之间同时拆分而构建的荧光互补系统，与通常考虑的在荧光蛋白的单一位点之间进行拆分有很大的不同。
附图说明
图1为基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统的构建示意图；
其中，A：为载体pVN154的构建示意图；B：为载体pVN(155-172)的构建示意图；C：为载体pVC173的构建示意图。
图2为基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统研究三蛋白相互作用的示意图；
其中，A：为基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统研究三蛋白相互作用的荧光示意图；B：为基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统的荧光互补效率的统计图。
具体实施方式
本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例以pcDNA3.1(+)为例进行说明，本发明实施例提到的pcDNA3.1均为pcDNA3.1(+)；其他真核表达载体，pEGFP-C1或pEGFP-N1或是其他本领域的常规真核表达载体也能实现本发明。
实施例1：
一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统，包括以下三个表达载体：载体pVN154、pVN(155-172)和pVC173，具体的，所述三个载体的制备步骤如下：
载体pVN154：自质粒pNLS-Venus(该质粒是将Venus序列(SEQ ID NO.1所示)插入到pcDNA3.1载体中获得)上通过PCR扩增(上游引物：5′-CGGCTAGCGCCACCATGTCCAAGGGCGAGGAGCTG-3′，下游引物：5′-CGGGATCCGGCCGTGATGTACACGTTGTGGGAG-3′)获得荧光蛋白Venus的氮端片段VN154的基因序列(SEQ ID NO.2所示)，利用双酶切位点NheI和BamHI，把VN154基因插入pcDNA3.1(购自Clontech)载体的多克隆位点上，构建成载体pVN154(图1中A)；
载体pVN(155-172)：自质粒pNLS-Venus上通过PCR扩增(上游引物：5′-GGGGTACCGAGCCACCCCCTCCTGAGCCACCCCCTCCTGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAG-3′，下游引物：5′-ATTTGCGGCCGCTTACTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTGGCCTTG-3′)获得荧光蛋白Venus的氮端片段VN(155-172)的基因序列(SEQ ID NO.3所示)，利用双酶切位点KpnI和NotI，把VN(155-172)基因插入pcDNA3.1载体的多克隆位点上，构建成载体pVN(155-172)(图1中B)；
载体pVC173：自质粒pNLS-Venus上通过PCR扩增(上游引物：5′-GGGGTACCGAGCCACCCCCTCCTGAGCCACCCCCTCCTGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCG-3′，下游引物：5′-ATTTGCGGCCGCTCACTTGTAGAGCTCGTCCATGCCGTGGG-3′)获得荧光蛋白Venus的碳端片段VC173的基因序列(SEQ ID NO.4所示)，利用双酶切位点KpnI和NotI，把VC173基因插入pcDNA3.1载体的多克隆位点上，构建成载体pVC173(图1中C)；
实施例2：
一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统在研究多蛋白相互作用中的应用，其应用过程如下：
1)以质粒pmIN150-NFAT1(Chen,M.H.et al.ACS Nano 2016,10,8482-8490.)为模板，通过PCR扩增获得NFAT1的基因序列,PCR使用的上游引物：5′-CGGAATTCTGAGCCACCCCCTCCTGAGCCACCCCCTCCTCTTGAGTGGCCGCTGTCCAGTC-3′，下游引物：5′-ATTTGCGGCCGCTTATGGGTGGTAGGTAAAGTGCTGAGGC-3′，利用双酶切位点EcoRI和NotI，把NFAT1基因插入pVN154载体的多克隆位点上，构建成载体pVN154-NFAT1；
2)以质粒pbJun-iRN97(Chen,M.H.et al.Biomaterials 2015,48,97-107.)为模板，通过PCR扩增获得bJun的基因序列,PCR使用的上游引物：5′-CGGCTAGCGCCACCATGAAGGCGGAGAGGAAGCGCATG-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTAAACGTTTGCAACTGCTGCGTTAG-3′，利用双酶切位点NheI和HindIII，把bJun基因插入pVN(155-172)载体的多克隆位点上，构建成载体pbJun-VN(155-172)；
3)以质粒piRC98-bFos(Chen,M.H.et al.Biomaterials 2015,48,97-107.)为模板，通过PCR扩增获得bFos的基因序列,PCR使用的上游引物：5′-CGGCTAGCGCCACCATGGGTCGTGCGCAGTCCATCGG-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTACCCAGGTCGTTCGGGATTTTGCAC-3′，利用双酶切位点NheI和HindIII，把bFos基因插入pVC173载体的多克隆位点上，构建成载体pbFos-VC173；
4)对照组为使用上游引物5′-CGGAATTCTGAGCCACCCCCTCCTGAGCCACCCCCTCCTCTTGAGTGGCCGCTGTCCAGTC-3′和下游引物5′-ATTTGCGGCCGCTTATGGGTGGTAGGTAAAGTGCTGAGGCTG-3′以mNFAT1(Chen,M.H.et al.ACS Nano 2016,10,8482-8490.)为模板扩增出的mNFAT1替换相应的NFAT1而构建的质粒，mNFAT1与bJun-bFos二聚体间失去了彼此的相互作用；同时使用上游引物5′-CGGCTAGCGCCACCATGGGTCGTGCGCAGTCCATCG-3′和下游引物5′-CCCAAGCTTACCCAGGTCGTTCGGGATTTTGCACGCCGG-3′以mbFos(Chen,M.H.et al.Biomaterials2015,48,97-107.)为模板扩增出的mbFos替换相应的bFos而构建的质粒，mbFos与bJun失去了彼此间的相互作用。
5)质粒pVN154-NFAT1、pbJun-VN(155-172)和pbFos-VC173共同转染到Vero细胞内，37℃培养24小时后，分别表达出与NFAT1、bJun和bFos融合表达的蛋白VN154-NFAT1、bJun-VN(155-172)和bFos-VC173，基于NFAT1、bJun和bFos的相互作用，可以将三个蛋白片段VN154、VN(155-172)和VC173拉近，使其恢复原有的Venus构象，并能产生黄色荧光(图2中A)。而作为对照，将bFos替换成mbFos或将NFAT1替换成mNFAT1的质粒虽然能表达出三个蛋白片段VN154、VN(155-172)和VC173，但不会产生荧光。说明基于pVN154、pVN(155-172)和pVC173的质粒系统可以用于研究三蛋白的相互作用。
ECFP青色荧光所选用的激发通道为445nm，Venus黄色荧光所选用的激发通道为514nm；荧光互补效率的计算方式为互补产生的Venus荧光强度与ECFP的荧光强度的比值，互补效率的统计结果如图2中B所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统及应用
<130> 一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtccaagg gcgaggagct gttcaccggc gtggtgccta tcctcgtgga gctcgacggc 60
gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgacgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagctcat ctgcaccacc ggcaagctcc cggtgccatg gccaaccctg 180
gtgaccaccc tcggctacgg cctgcagtgc ttcgccaggt accccgacca catgaagagg 240
cacgacttct tcaagagcgc catgccagag ggctacgtgc aggagaggac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gaccagggcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aacaggatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct gggccacaag 420
ctggagtaca actacaactc ccacaacgtg tacatcacgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggcca acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcggcgtgca gctggccgac 540
cactaccagc agaacacccc aatcggcgac ggcccggtgc tcctccctga caaccactac 600
ctcagctacc agtccgccct cagcaaggac ccgaacgaga agagggacca catggtgctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cggcatcacc cacggcatgg acgagctcta caagtga 717
<210> 2
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtccaagg gcgaggagct gttcaccggc gtggtgccta tcctcgtgga gctcgacggc 60
gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgacgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagctcat ctgcaccacc ggcaagctcc cggtgccatg gccaaccctg 180
gtgaccaccc tcggctacgg cctgcagtgc ttcgccaggt accccgacca catgaagagg 240
cacgacttct tcaagagcgc catgccagag ggctacgtgc aggagaggac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gaccagggcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aacaggatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct gggccacaag 420
ctggagtaca actacaactc ccacaacgtg tacatcacgg cc 462
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacaagcaga agaacggcat caaggccaac ttcaagatcc gccacaacat cgag 54
<210> 4
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacggcggcg tgcagctggc cgaccactac cagcagaaca ccccaatcgg cgacggcccg 60
gtgctcctcc ctgacaacca ctacctcagc taccagtccg ccctcagcaa ggacccgaac 120
gagaagaggg accacatggt gctgctggag ttcgtgaccg ccgccggcat cacccacggc 180
atggacgagc tctacaagtg a 201

Claims (5)

1.一种基于荧光蛋白Venus的三片段荧光互补系统，该系统包括三个分别含有SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的表达载体。
2.根据权利要求1所述的系统，所述的表达载体为真核表达载体。
3.根据权利要求1所述的系统，所述的表达载体为哺乳动物细胞表达载体。
4.根据权利要求1所述的系统，所述的表达载体为pcDNA3.1或pEGFP-C1或pEGFP-N1表达载体。
5.权利要求1所述的系统在研究蛋白质相互作用中的应用。
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