CN101830972B

CN101830972B - 基于绿色荧光蛋白sfGFP的荧光互补系统

Info

Publication number: CN101830972B
Application number: CN2010101436185A
Authority: CN
Inventors: 林坚; 夏斌; 周军
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-04-07
Filing date: 2010-04-07
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-04-07
Also published as: CN101830972A

Abstract

本发明公开了基于绿色荧光蛋白sfGFP的荧光互补系统。该蛋白片段，如1)、2)或3)所示：1)氨基酸序列如SEQUENCE ID：5所示的蛋白片段；2)氨基酸序列如SEQUENCEID：7所示的蛋白片段；3)氨基酸序列如SEQUENCEID：9所示的蛋白片段。本发明基于superfolder GFP(sfGFP)荧光蛋白，从其第214和第215氨基酸残基分离得到两个荧光蛋白片段(sfGFPN and sfGFPC)；其中sfGFPC片段通过点突变的方法改进为假阳性更少的蛋白片段。实验证明，本发明突变得到的sfGFPC片段与sfGFPN用于构建检测蛋白质相互作用的荧光互补系统的效果很好，且假阳性率很低，远低于对照组。本发明构建的super fold GFP BiFC克服了superfold GFP本身自激活产生假阳性结果的缺陷。因此，本发明在检测蛋白质相互作用领域将有广阔的应用前景。

Description

基于绿色荧光蛋白sfGFP的荧光互补系统

技术领域

本发明涉及基于绿色荧光蛋白sfGFP的荧光互补系统。

背景技术

研究蛋白质-蛋白质间的相互作用(PPI)是研究细胞中信号通道和传导的基础。细胞的平衡态、内部变化和细胞生理功能都很大程度上依赖于蛋白质-蛋白质相互作用的信号网络进行调节。检测他们之间的相互作用，揭示生物学功能是当代生物医药领域的热点。

通过分子生物学的方法，调节特定的蛋白质与蛋白质相互作用为一些疑难杂症也提供了一种新的治疗方法的可能性。因此，无论是学术科研机构还是制药公司对这一领域都表现出浓厚的兴趣，希望将调节蛋白质与蛋白质相互作用作为一种新的治疗手段。

在生物体外有很多种研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。其中大多需要首先将这些蛋白从其环境中纯化出来才可以使用。但因为只有将所研究的蛋白还原到自然细胞生理状态下进行研究，我们才能得到准确空间信息，因此能够用于活细胞中PPI的分析技术显得尤为重要。

类似的技术包括：荧光共振能量转移技术(FRET)、双分子荧光互补技术(BiFC)、荧光互相关谱(FCCS)等。在这些方法中，双分子荧光互补技术(BiFC)被证明是较为普遍的研究蛋白质相互作用的技术，并且广泛用于研究各类细胞和生物。另外，亚细胞定位、多蛋白质分析同样也能够被双分子荧光互补技术(BiFC)检测出来。

双分子荧光互补技术(BiFC)属于蛋白质互补分析的一种，包括GFP的拆分、内酰胺酶的拆分、荧光素酶的拆分等。BiFC的原理是通过分子工程技术，在适当的位置将荧光蛋白拆分为互补的两个片段。在细胞中，这两个片段本没有荧光，通常会先和各自的蛋白质结合(速度较快)，然后随着这两个蛋白的相互作用，两个荧光蛋白片段自组装，发出荧光。目前，青色、绿色、黄色、红色荧光蛋白都已经用于双分子荧光互补技术。

双荧光互补系统(Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC)以其快速便捷，细胞生理水平即时检测蛋白质相互作用和无需裂解细胞等诸多优势而受到分子标记领域的广泛青睐。但是，BiFC主要的缺点是大部分被拆分的荧光蛋白片段本身仍具有很高的亲和力和同源性，易于自组装，导致即使蛋白没有相互作用也能发出荧光的假阳性。这个问题大大限制了BiFC的灵敏度，时空分辨率和准确度。要使BiFC能够在更大的范围内应用，一些更加可行的改进方法迫在眉睫。

Superfolder GFP蛋白，简称sfGFP蛋白。Superfolder GFP是绿色荧光蛋白家族的重要成员。和其他GFP相比，superfolder GFP具有更好的循环排列，更强的适应化学变性和更强的折叠能力。但是，superfolder GFP最大的劣势是，以其构建BiFC容易自激活从而产生严重的假阳性结果。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用作荧光互补系统的蛋白片段及其编码基因。

本发明所提供的蛋白片段，如1)、2)或3)所示：1)氨基酸序列如SEQUENCE ID：5所示的蛋白片段；2)氨基酸序列如SEQUENCE ID：7所示的蛋白片段；3)氨基酸序列如SEQUENCE ID：9所示的蛋白片段。

本发明的另一个目的是提供一组用作荧光互补系统的蛋白片段及其编码基因。

本发明所提供的蛋白片段组，由蛋白片段I和蛋白片段II组成，所述蛋白片段I的氨基酸序列如SEQUENCE ID：1所示，所述蛋白片段II的氨基酸序列为SEQUENCE ID：5、SEQUENCE ID：7或SEQUENCE ID：9所示；所述蛋白片段I和蛋白片段II分别独立包装。

所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)的基因：

1)SEQUENCE ID：5所示蛋白片段的编码基因为SEQUENCE ID：6所示的DNA分子；

2)SEQUENCE ID：7所示蛋白片段的编码基因为SEQUENCE ID：8所示的DNA分子；

3)SEQUENCE ID：9所示蛋白片段的编码基因为SEQUENCE ID：10所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)、2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

5)与1)、2)或3)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

上述任一所述蛋白片段或蛋白片段组在检测待测蛋白质A与待测蛋白质B是否相互作用中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述编码基因在检测待测蛋白质A与待测蛋白质B是否相互作用中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述蛋白片段或蛋白片段组在构建荧光互补系统中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述编码基因在构建荧光互补系统中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述荧光互补系统是用于检测待测蛋白质A与待测蛋白质B是否相互作用的荧光互补系统。

所述荧光互补为双分子荧光互补。

本发明基于superfolder GFP(sfGFP)荧光蛋白，从其第214和第215氨基酸残基分离得到两个荧光蛋白片段(sfGFPN and sfGFPC)；其中sfGFPC片段通过点突变的方法改进为假阳性更少的蛋白片段。实验证明，本发明突变得到的sfGFPC片段与sfGFPN用于构建检测蛋白质相互作用的荧光互补系统的效果很好，且假阳性率很低，远低于对照组。本发明构建的super folder GFP BiFC克服了super folder GFP本身自激活产生假阳性结果的缺陷。因此，本发明在检测蛋白质相互作用领域将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为superfolder GFP(sfGFP)荧光蛋白的拆分方式及检测蛋白质相互作用的示意图。

图2为转入重组表达载体的Hela细胞中观察到的荧光的数量和强度(Scale bar10μm)。

图3为转入重组表达载体的Hela细胞中检测到的蛋白量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、本发明构思

(1)如图1所示，将绿色荧光蛋白super fold GFP从214/215氨基酸残基处拆分成GFP1-10βstrands(sfGFPN)和GFP11βstrand(sfGFPC)；sfGFPN和sfGFPC分别通过两段linker和待检测蛋白A(如Bcl-Xl)、待检测蛋白B(如Bak+)融合；若蛋白A和蛋白B相互作用，则被分开的sfGFPN和sfGFPC会重新组装成可以发出荧光的GFP，若蛋白A和蛋白B不相互作用，则被分开的sfGFPN和sfGFPC不会重新组装，不能发出荧光。(2)本发明进一步将sfGFPC片段进行点突变，再按照(1)中所述方式检测蛋白A和蛋白B的相互作用。(3)从sfGFPC非突变、sfGFPC不同点突变的片段中，选择荧光效果强且假阳性低的sfGFPC片段，以应用于其它待测蛋白的相互作用检测，从而完成了本发明。

可以用任何具有相互作用的蛋白验证，本发明中使用Bcl-XL蛋白和Bak(+)蛋白。Bak蛋白与Bcl-XL蛋白是已知的明确具有相互作用，Bak(+)蛋白片段是Bak蛋白中与Bcl-XL特异结合的“BH3结构域”。

本发明中使用的Bak(-)蛋白片段与Bak(+)蛋白片段相比，缺少了几个氨基酸残基，因而不能与Bcl-XL蛋白特异结合。

绿色荧光蛋白super fold GFP是已知的蛋白，其氨基酸序列如SEQUENCE ID：11所示。

Bak(+)蛋白的氨基酸序列为(⁷²GQVGRQLAIIGDDINR⁸⁷)；Bak(-)蛋白的氨基酸序列为(⁷⁸QLAIIGDDINR⁸⁷)。Bcl-XL蛋白的氨基酸序列如SEQUENCE ID：13所示。

将sfGFPN和Bak(+)(或Bak(-))连接的linker氨基酸序列为：IDGGGGSGGGGSSG。

将sfGFPC和Bcl-Xl连接的linker氨基酸序列为：IDGGGGSGGGGSSG。

Linker的编码基因序列是：

5’-ATCGATGGTGGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCTCCGGA-3’。

实施例2、本发明构建的荧光互补系统组成

本发明构建的各组荧光互补系统均由蛋白片段I和蛋白片段II组成，具体如下：

1、蛋白片段I：SEQUENCE ID：1所示(即sfGFPN)；蛋白片段II：SEQUENCE ID：3所示(即sfGFPC)；

2、蛋白片段I：SEQUENCE ID：1所示(即sfGFPN)；蛋白片段II：SEQUENCE ID：5所示(即点突变的sfGFPC，记作sfGFPC(m6))；

3、蛋白片段I：SEQUENCE ID：1所示(即sfGFPN)；蛋白片段II：SEQUENCE ID：7所示(即点突变的sfGFPC，记作sfGFPC(m12))；

4、蛋白片段I：SEQUENCE ID：1所示(即sfGFPN)；蛋白片段II：SEQUENCE ID：9所示(即点突变的sfGFPC，记作sfGFPC(m15))；

实施例3、本发明的各组荧光互补系统的效果验证

下述试验中所用的引物如表1和表2所示。

质粒pcDNA3.1购自Invitrogen，产品目录号为V860-20。

一、表达各种融合蛋白的重组表达载体的制备

(一)表达融合蛋白sfGFPC-Bcl-xL的重组表达载体的制备

1、sfGFPC基因的制备

用引物Fold03c，Fold04n，Fold-05c，Fold-06n通过退火连接合成sfGFPC基因，该合成的基因的两端带有NotI和ClaI酶切位点。

退火合成的基本过程：

(1)片段处理：引物浓度0.1nmol/ul，Fold03c 10ul，Fold04n 10ul，Fold05c10ul，Fold06n 10ul，Ligase buffer(10×)5ul，H₂O 5ul，共50ul。煮沸5min，冷却至室温

(2)连接：取上述体系10ul，Ligase Buffer 2ul，Ligase 1.5ul，H₂O 6.5ul；共20ul。室温连接2h。

(3)酶切载体pcDNA3.1：载体1ul，NotI 0.5ul，ClaI 0.5ul，Buffer2 2ul，H₂O 16ul，共20ul。37度酶切4h。

(4)胶回收酶切后的载体；

(5)连接：(2)步中连接的片段2ul，酶切后的载体1ul，Ligase Buffer 2ul，Ligase 1.5ul，H₂O 13.5ul；共20ul。室温连接2h。

(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板，挑取单克隆。

(7)验证：将单克隆接种于LB液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行酶切验证和测序验证。结果：载体中在NotI和ClaI酶切位点间插入的sfGFPC编码基因的核苷酸序列如SEQUENCE ID：4所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPC。

2、linker的制备

构建融合基因时中间的linker可以通过”退火连接”并用ClaI和BspEI分别连接到sfGPN和sfGFPC的C端。

Linker-up：5’-ATCGATGGTGGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCTCCGGA-3’

Linker-down：5’-TCCGGAGGACCCACCACCTCCAGAGCCACCGCCACCATCGAT-3’

退火合成的基本过程：

(1)片段处理：引物浓度0.1nmol/ul，Linker-up 10ul，Linker-down 10ul，Ligase buffer(10×)3ul，H2O 7ul；共30ul。煮沸5min，冷却至室温。

(3)酶切载体pcDNA3.1-sfGFPC：载体1ulg，BspEI 0.5ul，ClaI 0.5ul，Buffer 2 2ul，H₂O 16ul，共20ul。37度酶切4h。

(4)胶回收酶切后的载体；

(7)验证：将单克隆接种于LB液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行酶切验证和测序验证。结果：载体中在ClaI和BspEI酶切位点间插入的Linker基因的核苷酸序列为：5’-ATCGATGGTGGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCTCCGGA-3’，表明构建的Linker基因正确且构建的载体结构及序列正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPC-linker。

3、Bcl-xL基因的制备

Bcl-Xl cDNA克隆购自Origene公司。

以Bcl-Xl cDNA克隆为模板，以ZJ1n/ZJ2c为引物，进行PCR扩增，得到Bcl-xL基因，该基因的两端带有BspEI和XbaI酶切位点。

ZJ1n：5’-caatTCCGGA ATGTCTCAGAGCAACCGG-3’；

ZJ2c：5’-cgacTCTAGA TTATTTCCGACTGAAGAGTGAG-3’.

4、重组载体的制备

用限制性内切酶BspEI和XbaI酶切pcDNA3.1-sfGFPC-linker，回收载体大片段；用限制性内切酶BspEI和XbaI酶切Bcl-xL基因，回收目的片段；将回收产物连接，得到目的重组表达载体。

(1)酶切PCR产物Bcl-XL：PCR产物40ul，BspEI 1ul，XbaI 1ul，Buffer2 5ul，H₂O 3ul；共50ul。37度酶切4h。

(2)酶切载体pcDNA3.1-sfGFPC-linker：载体1ulg，BspEI 0.5ul，XbaI0.5ul，Buffer 2 2ul，H₂O 16ul，共20ul。37度酶切4h。

(3)胶回收酶切后的载体和PCR产物；

(4)连接：酶切后PCR产物10ul，酶切后的载体1ul，Ligase Buffer2ul，Ligase 1.5ul，H₂O 13.5ul；共20ul。室温连接2h。

(6)转化

取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板，挑取单克隆。

(7)验证：将单克隆接种于LB液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行酶切验证和测序验证。结果：载体中在BspEI和XbaI酶切位点间插入的Bcl-XL基因的核苷酸序列如SEQUENCE ID：14所示，表明插入的Bcl-XL基因正确且构建的载体正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPC-linker-Bcl-XL。

(二)表达融合蛋白sfGFPC-m6-Bcl-xL的重组载体的制备

用定点突变PCR试剂盒(购自北京赛百盛基因技术有限公司)进行突变，按照说明书操作。

以质粒pcDNA3.1-sfGFPC-linker-Bcl-XL为模板，Primer11n/12c为引物做定点突变。

反应体系：

模板质粒 1ul(20ng)

正向引物 1ul(10pmol/ul)

反向引物 1ul(10pmol/ul)

10×reaction buffer 2.5ul

dNTP 1ul(2.5mM)

Muta-direct Enzyme 0.5ul(2.5u/ul)

H2O 18ul

25ul

反应条件：94度 5min

2 94度 30Sec

3 60度 40sec

4 72度 12min

72度 30min

4度 10min

2，3，4为cycle反应需要20cycles

PCR后再用1ul Muta Enzyme(10u/ul)酶切上述PCR产物，得到的产物即为目的突变产物。

验证：将目的突变产物转入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板，挑取单克隆。将单克隆接种于LB液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行酶切验证和测序验证。结果：载体中在NotI和ClaI酶切位点间插入的sfGFPC-m6基因的核苷酸序列如SEQUENCE ID：6所示，表明突变得到的sfGFPC-m6基因正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPC(m6)-linker-Bcl-XL。

(三)表达融合蛋白sfGFPC-m12-Bcl-xL的重组载体的制备

以pcDNA3.1-sfGFPC(m6)-linker-Bcl-XL为模板，以primer17n/18c做一轮点突变，突变体系及反应条件与实验(二)中所述一致；以第一轮点突变的产物为模板，用primer19n/20c做第二轮点突变，突变体系及反应条件与实验(二)中所述一致，得到目的突变产物。

验证：方法与实验(二)中所述一致。结果：载体中在NotI和ClaI酶切位点间插入的sfGFPC-m12基因的核苷酸序列如SEQUENCE ID：8所示，表明突变得到的sfGFPC-m12基因正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPC(m12)-linker-Bcl-XL。

(四)表达融合蛋白sfGFPC-m15-Bcl-xL的重组载体的制备

以pcDNA3.1-sfGFPC(m12)-linker-Bcl-XL为模板，以primer21n/22c做一轮点突变，突变体系及反应条件与实验(二)中所述一致；以第一轮点突变的产物为模板，用primer23n/24c做第二轮点突变，突变体系及反应条件与实验(二)中所述一致，得到目的突变产物。

验证：方法与实验(二)中所述一致。结果：载体中在NotI和ClaI酶切位点间插入的sfGFPC-m15基因的核苷酸序列如SEQUENCE ID：10所示，表明突变得到的sfGFPC-m15基因正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPC(m15)-linker-Bcl-XL。

(五)表达融合蛋白sfGFPN-Bak(+)或sfGFPN-Bak(-)的重组载体的制备

人工合成superfold GFP编码基因，该基因序列如SEQUENCE ID：12所示。

1、sfGFPN基因的制备

以superfold GFP基因为模板，用引物Fold-01n和Fold-02c进行PCR扩增，得到sfGFPN基因，该基因两端含有NotI和ClaI酶切位点。

用限制性内切酶NotI和ClaI酶切PCR产物，回收目的片段；用限制性内切酶NotI和ClaI酶切载体pcDNA3.1，回收载体大片段；目的片段与载体大片段连接，取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板，挑取单克隆。将单克隆接种于LB液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行酶切验证和测序验证。结果：载体中在NotI和ClaI酶切位点间插入的sfGFPN基因核苷酸序列如SEQUENCE ID：2所示，表明得到的sfGFPN基因的序列正确且构建的载体正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPN。

2、退火合成Linker：Linker合成方法与实验(一)中所述一致。

将合成的Linker与用BspEI和ClaI酶切后的pcDNA3.1-sfGFPN连接，取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板，挑取单克隆。将单克隆接种于LB液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行酶切验证和测序验证。

结果：载体中在ClaI和BspEI酶切位点间插入的Linker基因序列正确，且构建的载体正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPN-linker。

3、Bak(+)或Bak(-)的制备：

Bak(+)由引物Venus01n，Venus02c退火合成，并用BspEI+XbaI连接到pcDNA3.1-sfGFPN-linker的C端。

Bak(-)由引物Venus03n，Venus04c退火合成，并用BspEI+XbaI连接到pcDNA3.1-sfGFPN-linker的C端。

退火合成的基本过程：

(1)片段处理：引物浓度0.1nmol/ul

Venus01n(Venus03n) 10ul

Venus02c(Venus04c) 10ul

Ligase buffer(10×) 3ul

H2O 7ul

30ul

煮沸5min，冷却至室温

(2)连接：

去上述体系 10ul

Ligase Buffer 2ul

Ligase 1.5ul

H2O 6.5ul

20ul

室温连接2h。

4、重组载体的制备：

(1)酶切载体pcDNA3.1-sfGFPN-linker

载体 1ulg

BspEI 0.5ul

XbaI 0.5ul

Buffer2 2ul

H2O 16ul

20ul

37度酶切4h

(2)胶回收酶切后的载体；

(3)连接

步骤3的产物 2ul

酶切后的载体 1ul

Ligase Buffer 2ul

Ligase 1.5ul

H2O 13.5ul

20ul

室温连接2h。

(4)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板，挑取单克隆。

(5)验证：将单克隆接种于LB液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行酶切验证和测序验证。

结果：载体中在BspEI和ClaI酶切位点间插入的Bak(+)基因的核苷酸序列为：5’-GGGCAGGTGGGACGGCAGCTCGCCATCATCGGGGACGACATCAACCGA-3’，表明得到的Bak(+)基因正确且载体结构正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(+)。

载体中在BspEI和ClaI酶切位点间插入的Bak(-)基因的核苷酸序列为：5’-CAGCTCGCCATCATCGGGGACGACATCAACCGA-3’，表明得到的Bak(-)基因正确且载体结构正确，将该重组载体记作pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(-)。

表1、退火所用的引物片段

Primer No.	Oligonucleotides(5’-3’)
		Fold-01n	5’-TAATGCGGCCGCACCATGTCCAAAGGAGAA-3’
Fold-02c	5’-ACATATCGATTTTTTCATTTGGATCTTG-3’
		Fold-03c	5’-CGATTGTAATCCCAGCAGCATTTACATACTCATGAAGGACCATG-3’
Fold-04n	5’-AAATGCTGCTGGGATTACAAT-3’
		Fold-05c	5’-TGGTCACGCATGGTGC-3’
Fold-06n	5’-GGCCGCACCATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGT-3’
		Venus01n	5’-CCGGAGGGCAGGTGGGACGGCAGCTCGCCATCATCGGGGACGACATCAACCGAT-3’
Venus02c	5’-CTAGATCGGTTGATGTCGTCCCCGATGATGGCGAGCTGCCGTCCCACCTGCCC-3’
		Venus03n	5’-CCGGACAGCTCGCCATCATCGGGGACGACATCAACCGATGAT-3’
Venus04c	5’-CTAGATCATCGGTTGATGTCGTCCCCGATGATGGCGAGCTGT-3’
		Linker-up	5’-ATCGATGGTGGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCTCCGGA-3’
Linker-down	5’-TCCGGAGGACCCACCACCTCCAGAGCCACCGCCACCATCGAT-3’

表2、突变所用引物

二、重组表达载体转染细胞及荧光检测结果

HeLa细胞购自美国模式培养物研究所(简称ATCC)。转染试剂购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司(Vigofect)。BFP根据Gene Bank的序列由博迈德科技发展有限公司全基因合成。BFP的Gene Bank号为ABP88744.1。

将HeLa细胞于37℃，5％的二氧化碳的加湿孵化器中培养，培养液为含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’Modified Eagle’s medium)。然后将细胞移至24孔组织培养板，当细胞密度达到70％，迅速将各处理组的重组表达载体转染细胞，使用PEI转染试剂。24小时后检测荧光量。

使用DMIL荧光显微镜(蔡司，德国)为所有转染细胞进行荧光图像拍摄，然后由ImageJ1.42软件进行分析，得出各处理组的最终相对荧光强度值。

ImageJ1.42分析荧光照片的强度：以BFP为对照，由软件分析具有“荧光光斑的细胞”的相对光强。软件对荧光照片分析后给出光斑的Area及Mean值；BFP和GFP的相对荧光强度＝Sum(Mean×Area)/Sum Area；将得到的BFP和GFP的相对荧光强度做比值，就得出各处理组的最终相对荧光强度值。

各处理组如下：

(a).用pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(+)和pcDNA3.1-sfGFPC-Bcl-xL转染；

(b).用pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(-)和pcDNA3.1-sfGFPC-Bcl-xL转染；

(c).用pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(+)和pcDNA3.1-sfGFPC(m6)-Bcl-xL转染；

(d).用pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(-)和pcDNA3.1-sfGFPC(m6)-Bcl-xL转染；

(e).用pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(+)和pcDNA3.1-sfGFPC(m12)-Bcl-xL转染；

(f).用pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(-)和pcDNA3.1-sfGFPC(m12)-Bcl-xL转染；

(g).用pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(+)和pcDNA3.1-sfGFPC(m15)-Bcl-xL转染；

(h).用pcDNA3.1-sfGFPN-linker-Bak(-)和pcDNA3.1-sfGFPC(m15)-Bcl-xL转染.

对照组：用BFP质粒转染。

转染量：质粒BFP为400ng。处理组的重组表达载体分别为300ng。

同时，本实验还将spGFPC进行其它各位点的突变(spGFPC突变片段序列如表3所示)，并按照实验一的方法构建重组表达载体，再按照本实验中上述方法进行转染和荧光互补检测。

结果如图2所示(Scale bar 10μm)。(a)-(h)组的荧光检测结果如图2A所示，(a)-(h)组的荧光量化结果如图2B所示。各spGFPC突变片段对应的检测效果如表3所示。

表3、sfGFPC片段、及点突变的sfGFPC片段

相对平均荧光强度由软件ImageJ分析得到。

(-)代表无可见荧光；(+/-)代表荧光几乎不可见；(+)，(++)，(+++)，(++++)分别代表可见荧光。

(+)代表sfGFP BiFC和BFP的荧光强度比值大于0小于等于0.3；

(++)代表sfGFP BiFC和BFP的荧光强度比值大于0.3小于等于0.6；

(+++)代表sfGFP BiFC和BFP的荧光强度比值大于0.6小于等于0.9；

(++++)代表sfGFP BiFC和BFP的荧光强度比值大于0.9小于等于1.2。

sfGFP BiFC表示转入本发明的荧光互补表达载体的处理组；BFP表示转入BFP质粒的对照组。

“AF of Positive Control”表示Bcl-xL与Bak(+)组；“AF of Negative Control”表示Bcl-xL与Bak(-)组。

结果表明，通过突变改造的突变体sfGFPC(m6)、sfGFPC(m12)、sfGFPC(m15)区分阳性和阴性的效果更佳显著，且假阳性明显降低，背景荧光也明显下降，sfGFPC(m15)的效果最好。除了spGFPC-m6、spGFPC-m12、spGFPC-m15外，其它spGFPC突变片段均有假阳性高的缺点。

实验设3次重复，结果一致。

三、Western印迹

为了确定sfGFPN和sfGFPC及其突变体的表达量，在实验一中所述的各重组表达载体中sfGFPN的5′端插入Myc标签的编码基因，使表达的融合蛋白的的N端带有Myc标签；在实验一中所述的各重组表达载体中sfGFPC的5′端插入His标签的编码基因，使表达的融合蛋白的N端带有His标签。

按照实验二中所述的各处理组，将加有His标签和Myc标签后的重组表达载体转染细胞，24h后收集细胞。

用细胞裂解液(购自碧云天公司，产品号P0013B)裂解细胞，得到的裂解产物做western blot检测。

抗His按1∶1000稀释；抗Myc一抗按1∶1000稀释，内参对照b-actin按1∶1000稀释；二抗(山羊抗小鼠)按1∶40000稀释。(抗体均购自碧云天公司)。

同时以用重组表达载体pcDNA3.1-His-sfGFP-Bcl-xL转染的细胞及用重组表达载体pcDNA3.1-Myc-sfGFP-Bcl-XL转染的细胞作为对照。

重组表达载体pcDNA3.1-His-sfGFP-Bcl-xL的制备：将SEQUENCE ID：12所示的sfGFP编码基因插入载体pcDNA3.1的NotI和ClaI酶切位点，同时将SEQUENCE ID：14所示的Bcl-xL编码基因插入载体pcDNA3.1的BspEI和XbaI酶切位点，再同时将His编码基因插入载体pcDNA3.1的EcoRI+NotI酶切位点，得到重组表达载体pcDNA3.1-His-sfGFP-Bcl-xL。

重组表达载体pcDNA3.1-Myc-sfGFP-Bcl-XL的制备：将SEQUENCE ID：12所示的sfGFP编码基因插入载体pcDNA3.1的NotI和ClaI酶切位点，同时将SEQUENCE ID：14所示的Bcl-xL编码基因插入载体pcDNA3.1的BspEI和XbaI酶切位点，再同时将Myc编码基因插入载体pcDNA3.1的EcoRI+NotI酶切位点，得到重组表达载体pcDNA3.1-Myc-sfGFP-Bcl-xL。

检测结果如图3所示。

图3A中，

1.Myc-sfGFPN-Bak(+)和His-sfGFPC-Bcl-xL，

2.Myc-sfGFPN-Bak(+)和His-sfGFPC(mutant 6)-Bcl-xL，

3.Myc-sfGFPN-Bak(+)和His-sfGFPC(mutant 12)-Bcl-xL，

4.Myc-sfGFPN-Bak(+)和His-sfGFPC(mutant 15)-Bcl-xL.

5.His-sfGFP-Bcl-xL。

图3B中，

1.Myc-sfGFPN-Bak(-)和His-sfGFPC-Bcl-xL，

2.Myc-sfGFPN-Bak(-)和His-sfGFPC(mutant 6)，

3.Myc-sfGFPN-Bak(-)和His-sfGFPC(mutant 12)，

4.Myc-sfGFPN-Bak(-)和His-sfGFPC(mutant 15)，

5.Myc-sfGFP-Bcl-XL。

本实验旨在检测：用本发明的荧光互补系统检测Bcl-XL和Bak(+)/Bak(-)蛋白对的相互作用时，是否是因为蛋白表达量不同而导致荧光数量和强度的不同。结果可以看到用Mys和His标签的抗体检测后，条带粗细基本一致；表明，用本发明的荧光互补系统检测Bcl-XL和Bak(+)/Bak(-)蛋白对的相互作用时，荧光强弱不同，并不是因为荧光蛋白片段表达量不同而造成的，完全是因为待测蛋白片段的结合能力所致；本发明的突变体荧光互补系统在正确检测出待测蛋白片段能否相互结合的基础上，还大大降低了背景荧光和假阳性。

序列表

<110>北京大学

<120>基于绿色荧光蛋白sfGFP的荧光互补系统

<160>14

<210>1

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Val Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Thr

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Thr Val Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys

210

<210>2

<211>582

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

atgtccaaag gagaagaact gtttaccggt gttgtgccaa ttttggttga actcgatggt 60

gatgtcaacg gacataagtt ctcagtgaga ggcgaaggag aaggtgacgc caccattgga 120

aaattgactc ttaaattcat ctgtactact ggtaaacttc ctgtaccatg gccgactctc 180

gtaacaacgc ttacgtacgg agttcagtgc ttttcgagat acccagacca tatgaaaaga 240

catgactttt ttaagtcggc tatgcctgaa ggttacgtgc aagaaagaac aatttcgttc 300

aaagatgatg gaaaaaaagg aacagatttt aaagaagatg gtaatattct tggacacaaa 360

ctcgaataca attttaatag tcataacgta tacatcactg ctgataagca aaagaacgga 420

attaaagcga atttcacagt acgccataat gtagaagatg gcagtgttca acttgccgac 480

cattaccaac aaaacacccc tattggagac ggtccggtac ttcttcctga taatcactac 540

ctctcaacac aaacagtcct gagcaaagat ccaaatgaaa aa 582

<210>3

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Met Arg Asp His Met Val Leu His Glu Tyr Val Asn Ala Ala Gly Ile

1 5 10 15

Thr Ile Asp

<210>4

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atgcgtgacc acatggtcct tcatgagtat gtaaatgctg ctgggattac aatcgat 57

<210>5

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Met Asp His Met Val Leu His Glu Tyr Val Asn Ala Ala Gly Ile Thr

1 5 10 15

Ile Asp

<210>6

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

atggaccaca tggtccttca tgagtatgta aatgctgctg ggattacaat cgat 54

<210>7

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

Met Asp His Met Ala Ala His Glu Tyr Val Asn Ala Ala Gly Ile Thr

1 5 10 15

Ile Asp

<210>8

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

atggaccaca tggctgctca tgagtatgta aatgctgctg ggattacaat cgat 54

<210>9

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

Met Asp His Met Ala Ala His Glu Tyr Val Asn Ala Ala Gly Ile Thr

1 5 10 15

Gly Gly

<210>10

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

atggaccaca tggctgctca tgagtatgta aatgctgctg ggattacagg tggc 54

<210>11

<211>233

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Val Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Thr

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Thr Val Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Met Arg Asp His Met Val Leu His Glu Tyr

210 215 220

Val Asn Ala Ala Gly Ile Thr Ile Asp

225 230

<210>12

<211>639

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

atgtccaaag gagaagaact gtttaccggt gttgtgccaa ttttggttga actcgatggt 60

gatgtcaacg gacataagtt ctcagtgaga ggcgaaggag aaggtgacgc caccattgga 120

aaattgactc ttaaattcat ctgtactact ggtaaacttc ctgtaccatg gccgactctc 180

gtaacaacgc ttacgtacgg agttcagtgc ttttcgagat acccagacca tatgaaaaga 240

catgactttt ttaagtcggc tatgcctgaa ggttacgtgc aagaaagaac aatttcgttc 300

aaagatgatg gaaaaaaagg aacagatttt aaagaagatg gtaatattct tggacacaaa 360

ctcgaataca attttaatag tcataacgta tacatcactg ctgataagca aaagaacgga 420

attaaagcga atttcacagt acgccataat gtagaagatg gcagtgttca acttgccgac 480

cattaccaac aaaacacccc tattggagac ggtccggtac ttcttcctga taatcactac 540

ctctcaacac aaacagtcct gagcaaagat ccaaatgaaa aaatgcgtga ccacatggtc 600

cttcatgagt atgtaaatgc tgctgggatt acaatcgat 639

<210>13

<211>233

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu

20 25 30

Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Met Glu Thr Pro

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala

50 55 60

Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val

65 70 75 80

Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu

85 90 95

Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu

100 105 110

His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn

115 120 125

Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe

130 135 140

Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp

165 170 175

His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val

180 185 190

Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu

195 200 205

Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val

210 215 220

Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys

225 230

<210>14

<211>699

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

atgtctcaga gcaaccggga gctggtggtt gactttctct cctacaagct ttcccagaaa 60

ggatacagct ggagtcagtt tagtgatgtg gaagagaaca ggactgaggc cccagaaggg 120

actgaatcgg agatggagac ccccagtgcc atcaatggca acccatcctg gcacctggca 180

gacagccccg cggtgaatgg agccactggc cacagcagca gtttggatgc ccgggaggtg 240

atccccatgg cagcagtaaa gcaagcgctg agggaggcag gcgacgagtt tgaactgcgg 300

taccggcggg cattcagtga cctgacatcc cagctccaca tcaccccagg gacagcatat 360

cagagctttg aacaggtagt gaatgaactc ttccgggatg gggtaaactg gggtcgcatt 420

gtggcctttg aacaggtagt gaatgaactc ttccgggatg gggtaaactg gggtcgcatt 480

gtggccgtga gtcggatcgc agcttggatg gccacttacc tgaatgacca cctagagcct 540

tggatccagg agaacggcgg ctgggatact tttgtggaac tctatgggaa caatgcagca 600

gccgagagcc gaaagggcca ggaacgcttc aaccgctggt tcctgacggg catgactgtg 660

gccggcgtgg ttctgctggg ctcactcttc agtcggaaa 699

Claims

1.一种蛋白片段，如1)、2)或3)所示：

1)氨基酸序列如SEQUENCE ID：5所示的蛋白片段；

2)氨基酸序列如SEQUENCE ID：7所示的蛋白片段；

3)氨基酸序列如SEQUENCE ID：9所示的蛋白片段。

2.一组蛋白片段，由蛋白片段I和蛋白片段II组成，所述蛋白片段I的氨基酸序列如SEQUENCE ID：1所示，所述蛋白片段II的氨基酸序列为SEQUENCE ID：5、SEQUENCEID：7或SEQUENCE ID：9所示；所述蛋白片段I和蛋白片段II分别独立包装。

3.权利要求1或2所述蛋白片段的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)、2)或3)的基因：

3)SEQUENCE ID：9所示蛋白片段的编码基因为SEQUENCE ID：10所示的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

6.权利要求1或2中所述蛋白片段在检测待测蛋白质A与待测蛋白质B是否相互作用中的应用；或权利要求3或4中所述编码基因在检测待测蛋白质A与待测蛋白质B是否相互作用中的应用。

7.权利要求1或2中所述蛋白片段在构建荧光互补系统中的应用；或权利要求3或4中所述编码基因在构建荧光互补系统中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述荧光互补系统是用于检测待测蛋白质A与待测蛋白质B是否相互作用的荧光互补系统。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述荧光互补为双分子荧光互补。