CN108732359B - 一种检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域。特别地，本发明涉及一种荧光报告系统，其包含荧光蛋白的截短体和抗所述荧光蛋白的单域抗体，所述荧光蛋白的截短体在游离状态下不能发出荧光，但是在与所述单域抗体结合后能够发出荧光。此外，本发明还涉及所述荧光报告系统的各种应用。

Description

一种检测系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域。特别地，本发明涉及一种检测系统，其包含荧光蛋白的截短体和抗所述荧光蛋白的单域抗体，所述荧光蛋白的截短体在游离状态下不能发出荧光，但是在与所述单域抗体结合后能够发出荧光。此外，本发明还涉及所述检测系统的各种应用。
背景技术
绿色荧光蛋白(Green Fluorescence protein,GFP)及其他荧光蛋白(例如蓝色荧光蛋白(BFP)和黄色荧光蛋白(YFP))已经被广泛应用于蛋白的标记，例如用于在细胞内甚至在动物体内对目的蛋白进行定位。
之前已经描述过使用GFP片段的重组系统(参见Ozawa T.等人，Current Opinionin Chemical Biology,2001,5(5):578-83)。在此类系统中，将GFP蛋白拆分成不能自组装的两个片段，然后将这两个片段分别连接至两个不同的蛋白。若所述两个蛋白能够相互作用，则GFP的两个片段能够重组成完整的GFP，并发出荧光。因此，根据是否产生荧光，可以判断两个蛋白是否有相互作用。
还已经报道了一种基于荧光蛋白的互补片段的蛋白标签系统(参见StéphanieCabantous等人，Nature Biotechnology 23,102-107(2005))。此类系统可用于检测蛋白的可溶性，又被称为脱落GFP系统。在此类系统中，将目的蛋白与GFP的一个16个氨基酸的片段(氨基酸215-230，也被称为GFP11或G11)融合，并同时独立表达所述GFP片段的互补片段(氨基酸1-214)。这两个GFP片段在可溶状态下，能够自发折叠成完整的GFP，并发出荧光，由此可用于在体内和体外检测和定量蛋白的溶解性。此外，脱落GFP系统也被应用于蛋白的标记，并且已报道，多个GFP11的重复可以增强重组后的GFP的荧光强度(参见Kamiyama D.等人，Nature Communications,2016Mar 18；7:11046)。
与GFP类似的其他荧光蛋白也能够拆分成可以重组和不能重组的两个片段进行应用(参见Kamiyama D.等人，Nature Communications,2016Mar 18；7:11046)。
单域抗体是骆驼单链抗体的重链可变区。骆驼的单链抗体只包含重链，而不具有轻链。因此，单链抗体的重链可变区即可结合抗原。这类抗体具有分子量小，稳定性好，特异性高，易表达，组织渗透性好等优点，在生物技术研究与诊断应用领域已经得到广泛的关注。之前已经有多个团队报道，抗GFP的单域抗体在与GFP结合后，能够增强或减弱GFP的荧光(参见Kirchhofer A.等人，Nature Structural&Molecular Biology,2010Jan；17(1):133-8)。
在本申请中，发明人意外地发现，某些抗荧光蛋白(例如GFP)的单域抗体能够与本身不能发出荧光的荧光蛋白(例如GFP)的截短体特异性结合，并使之发出荧光。基于此，本申请的发明人设计和开发了一种新的检测系统，其基于荧光蛋白的不发光片段和抗荧光蛋白的单域抗体的联合使用，并且可广泛用于生物技术研究领域与诊断领域。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“荧光蛋白”是指，在某一激发光照射下能够发射特定波长的光(荧光)的蛋白。迄今为止，已发现了多种颜色的荧光蛋白，包括但不限于，绿色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，红色荧光蛋白等。已对各种颜色的荧光蛋白的结构及其发光机理进行了详细的阐释(参见例如，Yang F等人Nat Biotechnol.1996Oct；14(10):1246-51；Mark Wall等人Nat.Struct.Biol.7,1133–1138,2000；和Reid BG等人Biochemistry.1997Jun 3；36(22):6786-91)。在本申请中，绿色荧光蛋白的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:84所示；蓝色荧光蛋白的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示；黄色荧光蛋白的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:86所示。
之前已报道，各种颜色的荧光蛋白具有类似的氨基酸序列和结构，并且它们的主要差异在于，参与激发荧光的结构域(例如，绿色荧光蛋白的aa 65-67)由不同的氨基酸残基构成(参见例如，ROGER HEIM等人Biochemistry Vol.91,pp.12501-12504,December1994)。因此，本申请基于绿色荧光蛋白所证实的技术效果可被扩展至其他颜色的荧光蛋白(例如蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白)。
如本文中所使用的，表述“蛋白的C端被截短9-23个氨基酸残基”是指，蛋白C端的9-23个氨基酸残基被缺失。
根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽(例如，本发明的截短体)的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如，1-15个、1-10个、1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如氨基酸残基的添加、置换或缺失，例如保守置换)，或者具有至少85％，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本申请中，本发明的截短体的必要特性可以指，其在游离状态下不发出荧光，但是在与单域抗体结合后，能够发出荧光。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中使用的，术语“单域抗体”意指，包含抗体重链可变区，但不包含轻链可变区的抗体。已在骆驼科动物和鲨鱼的血清中发现了一种抗体(也被称为重链抗体)，其仅包含重链而不包含轻链，并且具有特异性结合抗原的能力。此外，还已发现，重链抗体的抗原结合区(即，重链可变区)通过铰链区与Fc区连接，并且，该抗原结合区(即，重链可变区)自重链抗体上分离后仍具有结合抗原的功能(参见例如，Hamers-Casterman C等人,Nature.1993Jun 3；363(6428):446-8)。因此，在本申请中，“单域抗体”意欲涵盖此类仅包含重链而不包含轻链的重链抗体，以及其抗原结合片段(例如，重链可变区)。例如，本申请中的“单域抗体”可以包含含有3个CDR的重链可变区，并且任选地，可以还包含铰链区、Fc区、或重链恒定区。在某些优选的实施方案中，所述单域抗体包含含有3个CDR的重链可变区。在某些优选的实施方案中，所述单域抗体包含，含有3个CDR的重链可变区以及铰链区、Fc区、或重链恒定区。
如本文中使用的，术语“载体”意指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
在申请中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
本申请至少部分基于本发明人的出人意料的发现：某些抗荧光蛋白(例如GFP)的单域抗体能够与本身不能发出荧光的荧光蛋白(例如GFP)的截短体特异性结合，并使之发出荧光。基于此，本申请的发明人设计和开发了一种新的检测系统，其基于荧光蛋白的不发光片段和抗荧光蛋白的单域抗体的联合使用，并且可广泛用于生物技术研究领域与诊断领域。
因此，在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含两种组分，其中，所述第一组分包含：
(a1)荧光蛋白的截短体，其与荧光蛋白的差异在于，荧光蛋白的C端被截短9-23个氨基酸残基；
(a2)如(a1)中定义的截短体的变体，所述变体与所述截短体具有至少85％的同一性，或者，所述变体与所述截短体的差异在于一个或多个氨基酸残基的添加、置换或缺失；或
(a3)核酸分子，其包含编码如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体的核苷酸序列；
并且，所述第二组分包含：
(b1)抗荧光蛋白的单域抗体；优选地，其包含选自下列的CDR1、CDR2和CDR3：
(1)分别如SEQ ID NO:47-49所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(2)分别如SEQ ID NO:50-52所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(3)分别如SEQ ID NO:53-55所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(4)分别如SEQ ID NO:56-58所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(5)分别如SEQ ID NO:59-61所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(6)分别如SEQ ID NO:62-64所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(7)分别如SEQ ID NO:65-67所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(8)分别如SEQ ID NO:68-70所示的CDR1、CDR2和CDR3；和
(9)分别如SEQ ID NO:71-73所示的CDR1、CDR2和CDR3；或
(b2)核酸分子，其包含编码如(b1)中定义的单域抗体的核苷酸序列；
其中，所述截短体和所述变体在游离状态下不发出荧光，但是在与所述单域抗体结合后，能够发出荧光。
在某些优选的实施方案中，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述绿色荧光蛋白具有如SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述蓝色荧光蛋白具有如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述黄色荧光蛋白具有如SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述截短体与荧光蛋白的差异在于，荧光蛋白的C端被截短9-23个氨基酸残基，例如被截短9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述截短体为绿色荧光蛋白的截短体，并且其与绿色荧光蛋白的差异在于，绿色荧光蛋白的C端被截短9-23个氨基酸残基，例如被截短9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，所述绿色荧光蛋白具有如SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述绿色荧光蛋白的截短体具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述截短体为蓝色荧光蛋白的截短体，并且其与蓝色荧光蛋白的差异在于，蓝色荧光蛋白的C端被截短9-23个氨基酸残基，例如被截短9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，所述蓝色荧光蛋白具有如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述截短体为黄色荧光蛋白的截短体，并且其与黄色荧光蛋白的差异在于，黄色荧光蛋白的C端被截短9-23个氨基酸残基，例如被截短9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，所述黄色荧光蛋白具有如SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述变体的氨基酸序列与所述截短体的氨基酸序列具有至少85％的同一性，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在某些优选的实施方案中，所述变体与所述截短体的差异在于一个或多个氨基酸残基的添加、置换或缺失，例如不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或1个氨基酸残基的添加、置换或缺失。
在某些优选的实施方案中，所述变体与所述截短体的差异在于一个或多个氨基酸残基的置换(例如保守置换)，例如不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或1个氨基酸残基的置换(例如保守置换)。
在某些优选的实施方案中，所述截短体或所述变体具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:31-46。
在某些优选的实施方案中，所述单域抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-9和87-88。在某些优选的实施方案中，所述单域抗体由所述重链可变区组成。在某些优选的实施方案中，所述单域抗体包含所述重链可变区，以及任选的铰链区、Fc区、或重链恒定区。
在某些优选的实施方案中，(a3)所述的核酸分子包含编码如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体的核苷酸序列，或者由编码如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体的核苷酸序列组成。在某些优选的实施方案中，(a3)所述的核酸分子为包含编码如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体的核苷酸序列的载体(例如表达载体)。
在某些优选的实施方案中，(b2)所述的核酸分子包含编码如(b1)中定义的单域抗体的核苷酸序列，或者由编码如(b1)中定义的单域抗体的核苷酸序列组成。在某些优选的实施方案中，(b2)所述的核酸分子为包含编码如(b1)中定义的单域抗体的核苷酸序列的载体(例如表达载体)。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含，如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体，以及如(b1)中定义的单域抗体。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含，如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体，以及(b2)所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含，(a3)所述的核酸分子，以及如(b1)中定义的单域抗体。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含，(a3)所述的核酸分子，以及(b2)所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含额外的试剂。此类额外的试剂包括但不限于，用于进行分子克隆或用于构建载体的试剂,例如用于进行核酸扩增的缓冲液、核酸聚合酶、核酸内切酶、连接酶、用于进行核酸纯化的试剂、用于进行核酸转化、转染或转导的试剂，和/或核酸载体(例如质粒或病毒载体)。
在一个方面，本发明提供了一种确定目的蛋白的位置或分布的方法，其包括，使用本发明的试剂盒。
在一个方面，本发明提供了一种确定目的蛋白的位置或分布的方法，其包括：
共表达(1)如上文所定义的截短体或突变体，和(2)包含如上所定义的单域抗体和所述目的蛋白的融合蛋白；或者
共表达(3)如上文所定义的单域抗体，和(4)包含如上所定义的截短体或突变体和所述目的蛋白的融合蛋白。
在某些优选的实施方案中，在细胞内共表达(1)如上文所定义的截短体或突变体，和(2)包含如上所定义的单域抗体和所述目的蛋白的融合蛋白，从而确定所述目的蛋白在细胞中的位置或分布。在某些优选的实施方案中，所述单域抗体连接至所述目的蛋白的N端或C端，任选地通过接头。在某些优选的实施方案中，所述接头为柔性接头(例如，如SEQ IDNO:82所示的柔性接头)。在某些优选的实施方案中，所述方法还包括，使用荧光显微镜观察所述细胞。
在某些优选的实施方案中，在细胞内共表达(3)如上文所定义的单域抗体，和(4)包含如上所定义的截短体或突变体和所述目的蛋白的融合蛋白，从而确定所述目的蛋白在细胞中的位置或分布。在某些优选的实施方案中，所述截短体或突变体连接至所述目的蛋白的N端或C端，任选地通过接头。在某些优选的实施方案中，所述接头为柔性接头(例如，如SEQ ID NO:82所示的柔性接头)。在某些优选的实施方案中，所述方法还包括，使用荧光显微镜观察所述细胞。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括下述步骤：
(1)提供包含编码如上文所定义的截短体或突变体的核苷酸序列的第一载体，以及包含编码含有如上所定义的单域抗体和所述目的蛋白的融合蛋白的核苷酸序列的第二载体；
(2)将所述第一载体和第二载体共同导入细胞中，从而在所述细胞中共表达所述截短体或突变体，以及所述融合蛋白；和
(3)使用荧光显微镜观察所述细胞，并根据荧光的位置确定所述目的蛋白在所述细胞内的分布和位置，其中，所述荧光因所述截短体或突变体与所述融合蛋白包含的所述单域抗体之间的相互作用而产生。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括下述步骤：
(1)提供包含编码如上文所定义的单域抗体的核苷酸序列的第一载体，以及包含编码含有如上所定义的截短体或突变体和所述目的蛋白的融合蛋白的核苷酸序列的第二载体；
(2)将所述第一载体和第二载体共同导入细胞中，从而在所述细胞中共表达所述单域抗体，以及所述融合蛋白；和
(3)使用荧光显微镜观察所述细胞，并根据荧光的位置确定所述目的蛋白在所述细胞内的分布和位置，其中，所述荧光因所述单域抗体与所述融合蛋白包含的所述截短体或突变体之间的相互作用而产生。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括下述步骤：
(1)提供稳定表达如上文所定义的截短体或突变体的细胞，以及包含编码含有如上所定义的单域抗体和所述目的蛋白的融合蛋白的核苷酸序列的载体；
(2)将所述载体导入所述细胞中，从而在所述细胞中共表达所述截短体或突变体，以及所述融合蛋白；和
(3)使用荧光显微镜观察所述细胞，并根据荧光的位置确定所述目的蛋白在所述细胞内的分布和位置，其中，所述荧光因所述截短体或突变体与所述融合蛋白包含的所述单域抗体之间的相互作用而产生。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括下述步骤：
(1)提供稳定表达含有如上所定义的单域抗体和所述目的蛋白的融合蛋白的细胞，以及包含编码如上文所定义的截短体或突变体的核苷酸序列的载体；
(2)将所述载体导入所述细胞中，从而在所述细胞中共表达所述截短体或突变体，以及所述融合蛋白；和
(3)使用荧光显微镜观察所述细胞，并根据荧光的位置确定所述目的蛋白在所述细胞内的分布和位置，其中，所述荧光因所述截短体或突变体与所述融合蛋白包含的所述单域抗体之间的相互作用而产生。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括下述步骤：
(1)提供稳定表达如上文所定义的单域抗体的细胞，以及包含编码含有如上所定义的截短体或突变体和所述目的蛋白的融合蛋白的核苷酸序列的载体；
(2)将所述载体导入所述细胞中，从而在所述细胞中共表达所述单域抗体，以及所述融合蛋白；和
(3)使用荧光显微镜观察所述细胞，并根据荧光的位置确定所述目的蛋白在所述细胞内的分布和位置，其中，所述荧光因所述单域抗体与所述融合蛋白包含的所述截短体或突变体之间的相互作用而产生。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括下述步骤：
(1)提供稳定表达含有如上所定义的截短体或突变体和所述目的蛋白的融合蛋白的细胞，以及包含编码如上文所定义的单域抗体的核苷酸序列的载体；
(2)将所述载体导入所述细胞中，从而在所述细胞中共表达所述单域抗体，以及所述融合蛋白；和
(3)使用荧光显微镜观察所述细胞，并根据荧光的位置确定所述目的蛋白在所述细胞内的分布和位置，其中，所述荧光因所述单域抗体与所述融合蛋白包含的所述截短体或突变体之间的相互作用而产生。
可通过各种合适的方式将载体导入细胞中。此类方式包括但不限于转化(例如原生质体转化法)、转染(例如脂质体转染)、电穿孔、转导(例如噬菌体转导法)等。此外，在细胞中稳定表达目的蛋白的方法是本领域技术人员已知的。例如，可通过将编码目的蛋白的外源核苷酸序列整合入细胞的基因组中，从而在细胞中稳定表达目的蛋白。将外源核苷酸序列整合入目标细胞的基因组中的方法也是本领域技术人员已知的(参见例如，Oberbek A等人，Biotechnol Bioeng.2011Mar；108(3):600-10)。
在一个方面，本发明提供了一种确定是否发生细胞融合的方法，其包括，使用本发明的试剂盒。
在一个方面，本发明提供了一种确定是否发生细胞融合的方法，其包括：
(1)在第一细胞中表达如上文所定义的截短体或突变体，并且在第二细胞中表达如上所定义的单域抗体；
(2)将所述第一细胞和第二细胞共同培养，并使用荧光显微镜进行观察。
在此类方法中，如果在细胞内观察到因所述截短体或突变体与所述单域抗体之间的相互作用而产生的荧光，那么可确定第一细胞与第二细胞发生了细胞融合。反之，如果未在细胞内观察到所述荧光，那么可确定第一细胞与第二细胞未发生细胞融合。
在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，在将所述第一细胞和第二细胞共同培养之后，任选地，使所述第一细胞和第二细胞经历处理，然后再使用荧光显微镜观察是否出现了荧光。利用此类实施方案，可以判断所述处理是否诱导或抑制了细胞融合。例如，如果与未进行处理的情况相比，在所述第一细胞和第二细胞经历处理的条件下，在更短的时间内观察到荧光，或者在相同的时间点观察到更强的荧光，那么可确定所述处理诱导或促进了细胞融合。反之，如果与未进行处理的情况相比，在所述第一细胞和第二细胞经历处理的条件下，需要更长的时间才能观察到荧光，或者在相同的时间点观察到较弱的荧光，那么可确定所述处理阻止或抑制了细胞融合。
所述处理可以是任何期望的操作，例如物理刺激(例如热刺激，辐射等)，化学刺激(例如与候选药物或试剂接触)，或生物学刺激(例如与病原体(例如病毒或细菌)接触)。相应地，所述方法可以用于筛选能够诱导或抑制细胞融合的刺激方式、药物、试剂、或病原体(例如病毒或细菌)等。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明提供了确定一种试剂或病原体(例如病毒或细菌)诱导或抑制细胞融合的能力的方法，其包括下述步骤：
(1)在第一细胞中表达如上文所定义的截短体或突变体，并且在第二细胞中表达如上所定义的单域抗体；
(2)将所述第一细胞和第二细胞共同培养，并使用荧光显微镜进行观察；
(3)将所述共同培养的第一细胞和第二细胞与所述试剂或病原体接触并继续培养，然后再使用荧光显微镜进行观察。
在此类实施方案中，如果在步骤(2)中未观察到荧光，而在步骤(3)中观察到荧光，那么可以确定所述试剂或病原体具有诱导细胞融合的能力。
在某些优选的实施方案中，本发明提供了确定一种试剂或病原体(例如病毒或细菌)诱导或抑制细胞融合的能力的方法，其包括下述步骤：
(1)在第一细胞中表达如上文所定义的截短体或突变体，并且在第二细胞中表达如上所定义的单域抗体；
(2)将所述第一细胞和第二细胞共同培养，并与所述试剂或病原体接触，用作实验组培养物；并且，将所述第一细胞和第二细胞共同培养，且不与所述试剂或病原体接触，用作对照组培养物；
(3)使用荧光显微镜观察所述实验组培养物和对照组培养物。
在此类实施方案中，与对照组培养物相比，如果在更短的时间内在实验组培养物中观察到荧光，或者在相同的时间点实验组培养物展示出更强的荧光，那么可以确定所述试剂或病原体具有诱导或促进细胞融合的能力。反之，与对照组培养物相比，如果需要更长的时间才能在实验组培养物中观察到荧光，或者在相同的时间点实验组培养物展示出较弱的荧光，那么可以确定所述试剂或病原体具有阻止或抑制细胞融合的能力。
可以通过各种合适的方式，使得第一细胞表达所述截短体或突变体，且使得第二细胞表达所述单域抗体。在某些优选的实施方案中，通过将包含编码所述截短体或突变体的核苷酸序列的载体导入第一细胞，使得第一细胞表达所述截短体或突变体。在某些优选的实施方案中，通过将编码所述截短体或突变体的核苷酸序列整合入第一细胞的基因组中，使得第一细胞稳定表达所述截短体或突变体。在某些优选的实施方案中，通过将包含编码所述单域抗体的核苷酸序列的载体导入第二细胞，使得第二细胞表达所述单域抗体。在某些优选的实施方案中，通过将编码所述单域抗体的核苷酸序列整合入第二细胞的基因组中，使得第二细胞稳定表达所述单域抗体。
可通过各种合适的方式将载体导入细胞中。此类方式包括但不限于转化(例如原生质体转化法)、转染(例如脂质体转染)、电穿孔、转导(例如噬菌体转导法)等。此外，将外源核苷酸序列整合入目标细胞的基因组中的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Oberbek A等人，Biotechnol Bioeng.2011Mar；108(3):600-10)。
在一个方面，本发明提供了一种评估试剂促进或抑制多肽穿过细胞膜的能力的方法，其包括，使用本发明的试剂盒。
在一个方面，本发明提供了一种评估试剂促进或抑制多肽穿过细胞膜的能力的方法，其包括：
(1)在细胞中表达如上文所定义的截短体或突变体；
(2)将所述细胞与如上所定义的单域抗体和所述试剂接触，用作实验组细胞；并且，将所述细胞与如上所定义的单域抗体接触，用作对照组细胞；和
(3)使用荧光显微镜观察所述实验组细胞和对照组细胞。
在根据本发明的方法中，与对照组细胞相比，如果在更短的时间内在实验组细胞中观察到荧光，或者在相同的时间点实验组细胞展示出更强的荧光，那么可以确定所述试剂具有促进多肽穿过细胞膜的能力。反之，与对照组细胞相比，如果需要更长的时间才能在实验组细胞中观察到荧光，或者在相同的时间点实验组细胞展示出较弱的荧光，那么可以确定所述试剂具有阻止多肽穿过细胞膜的能力。
可以通过各种合适的方式，使得细胞表达所述截短体或突变体。在某些优选的实施方案中，通过将包含编码所述截短体或突变体的核苷酸序列的载体导入细胞，使得细胞表达所述截短体或突变体。在某些优选的实施方案中，通过将编码所述截短体或突变体的核苷酸序列整合入细胞的基因组中，使得细胞稳定表达所述截短体或突变体。
在一个方面，本发明提供了一种评估试剂促进或抑制多肽穿过细胞膜的能力的方法，其包括：
(1)在细胞中表达如上文所定义的单域抗体；
(2)将所述细胞与如上所定义的截短体或突变体和所述试剂接触，用作实验组细胞；并且，将所述细胞与如上所定义的截短体或突变体接触，用作对照组细胞；和
(3)使用荧光显微镜观察所述实验组细胞和对照组细胞。
在根据本发明的方法中，与对照组细胞相比，如果在更短的时间内在实验组细胞中观察到荧光，或者在相同的时间点实验组细胞展示出更强的荧光，那么可以确定所述试剂具有促进多肽穿过细胞膜的能力。反之，与对照组细胞相比，如果需要更长的时间才能在实验组细胞中观察到荧光，或者在相同的时间点实验组细胞展示出较弱的荧光，那么可以确定所述试剂具有阻止多肽穿过细胞膜的能力。
可以通过各种合适的方式，使得细胞表达所述单域抗体。在某些优选的实施方案中，通过将包含编码所述单域抗体的核苷酸序列的载体导入细胞，使得细胞表达所述单域抗体。在某些优选的实施方案中，通过将编码所述单域抗体的核苷酸序列整合入细胞的基因组中，使得细胞稳定表达所述单域抗体。
可通过各种合适的方式将载体导入细胞中。此类方式包括但不限于转化(例如原生质体转化法)、转染(例如脂质体转染)、电穿孔、转导(例如噬菌体转导法)等。此外，将外源核苷酸序列整合入目标细胞的基因组中的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Oberbek A等人，Biotechnol Bioeng.2011Mar；108(3):600-10)。
发明的有益效果
之前已报道，单域抗体GBP1能够增强GFP的荧光。然而，从未报道，单域抗体GBP1能够使已经丧失发出荧光能力的GFP截短体恢复发光能力。在本申请中，发明人首次证实，某些抗GFP单域抗体(例如GBP1)能够使荧光蛋白(例如GFP)的不能发光的截短体恢复发光的能力。此类单域抗体(例如GBP1)的这一性质是特别有利的。特别地，基于该性质，可利用所述单域抗体(例如GBP1)和荧光蛋白(例如GFP)的截短体的组合来构建各种检测系统，从而可方便地进行各种生物学检测，例如蛋白质的定位，细胞融合的检测，穿膜能力的评估等等。
此外，与之前报道的脱落GFP系统(sfGFP1-10+G11)相比，本发明的包含单域抗体(例如GBP1)和荧光蛋白(例如GFP)的截短体的检测系统还具有以下优势：
(1)脱落GFP系统中的G11与目的蛋白的融合方式受到了限制。例如，当将G11连接至目的蛋白的N端时，其使sfGFP1-10恢复荧光的能力可能会受到影响，甚至丧失。相比之下，本发明检测系统中的单域抗体(例如GBP1)则不存在这一问题，其可通过各种连接方式融合至目的蛋白的N端或C端，而不影响其功能的发挥。
(2)G11分子量很小，因此，当其在细胞内游离表达时，易于被降解。相比之下，本发明检测系统中的单域抗体(例如GBP1)则不存在这一问题，其在细胞内是相对稳定的。
因此，本发明的包含单域抗体(例如GBP1)和荧光蛋白(例如GFP)的截短体的检测系统可更加广泛、方便、灵活地进行应用。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示，共转染了编码单域抗体的表达质粒和pTT22M-sfGFP1-10的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，对于每一个实验组的细胞，上图显示了红光通道的观察结果(用于指示转染效率)，下图显示了绿光通道的观察结果(用于显示细胞是否发出绿色荧光)；“vector”组表示转染了空载体pTT5和pTT22M-sfGFP1-10的Hela细胞。
图2显示，共转染了编码sfGFP的C端截短变体的表达质粒以及PTT5(图2A)或pTT5-GBP1(图2B)的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，“WT”组表示共转染了编码荧光蛋白sfGFP的表达质粒以及pTT5(图2A)或pTT5-GBP1(图2B)的Hela细胞。
图3显示，共转染了pTT5-GBP1和编码sfGFP1-10变体的表达质粒的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，“Negative”组表示共转染了pTT5-GBP1和编码无关蛋白的表达质粒的Hela细胞。
图4显示，共转染了pTT5-GBP1与pTT22M-BFP1-10或pTT22M-YFP1-10的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，“B/Y”表示蓝光/黄光通道的观察结果；“R”表示红光通道的观察结果；“Merge”表示两种通道的观察结果的合并。
图5显示，共转染了各种表达质粒组合的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，对于每一个实验组的细胞，上图显示了Hela细胞中的绿色荧光(由融合蛋白中的GBP1+sfGFP1-10产生)的分布和位置；中图显示了Hela细胞中的蓝色荧光(由融合蛋白中的BFP产生)的分布和位置；下图显示了，上图和中图的合并。
图6显示了，Hep2-GBP1细胞悬液、Hep2-Mbcd38细胞悬液以及含有Hep2-GBP1和Hep2-Mbcd38的细胞悬液在感染RSV病毒48h后的荧光显微镜观察结果。
图7显示，表达Mdc2-26的U2OS细胞在与GBP1或者GBP1+穿膜肽pep1一起温育6h、8h、10h或12h后的荧光显微镜观察结果。
图8显示，共转染了各种表达质粒组合的293细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果。
图9显示，共转染了Mdc2-26以及GBP1或GBPMT1或GBPMT2的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果。
序列信息
本申请所涉及的序列的信息概述于表1中。
表1：序列信息
Figure BDA0001618533420000101
Figure BDA0001618533420000111
Figure BDA0001618533420000121
SEQ I D NO:1
MADVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYSNVNVGFEYWGQGTQVTVSS
SEQ I D NO:2
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SEQ I D NO:3
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SEQ I D NO:4
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SEQ I D NO:5
MAQVQLQESGGGSVQAGEALRLSCVGSGYTS INPYMAWFRQAPGKEREGVAAISSGGVYTYYAESVKDRFTISRDNAKNTVYLQMPSLKPEDSAKYYCAADFRRGGSWNVDPLRYDYEHWGQGTQVTVSS
SEQ I D NO:6
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SEQ I D NO:7
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SEQ I D NO:8
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SEQ I D NO:9
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SEQ I D NO:10
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SEQ I D NO:11
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SEQ I D NO:12
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SEQ I D NO:13
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SEQ I D NO:14
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SEQ I D NO:15
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SEQ I D NO:16
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SEQ I D NO:17
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SEQ I D NO:18
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SEQ I D NO:19
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SEQ I D NO:20
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SEQ I D NO:21
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SEQ I D NO:22
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SEQ I D NO:23
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SEQ I D NO:25
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SEQ I D NO:26
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SEQ I D NO:27
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SEQ I D NO:28
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SEQ I D NO:29
MAQVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASRYIDSNYYLGWFRQAPGKEREGVAAITDGGGSTYYADSVKGRFTISQDNAKSTVYLLMNSLKPEDTAIYYCAADPWGISPMTSLNREWYNYWGQGTQVTVSS
SEQ I D NO:30
MAQVQLQESGGGSVQAGEALRLSCVGSGYTS INPYMAWFRQAPGKEREGVAAISSGGVYTYYADSVKGRFTISRDNVKNTMYLQMPTLKPEDSGKYYCAADFRRGGSWNVDPLRYDYQHWGQGTQVTVSS
SEQ I D NO:31
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SEQ I D NO:32
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SEQ I D NO:33
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SEQ I D NO:34
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SEQ I D NO:35
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SEQ I D NO:36
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SEQ I D NO:37
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SEQ I D NO:38
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SEQ I D NO:39
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SEQ I D NO:40
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SEQ I D NO:41
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SEQ I D NO:42
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SEQ I D NO:43
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SEQ I D NO:44
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SEQ I D NO:45
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SEQ I D NO:46
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SEQ ID NO:84
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SEQ ID NO:85
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SEQ ID NO:86
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SEQ ID NO:87
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SEQ ID NO:88
MADVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDHMVLHEYVNMNSLKPEDTAVYYSNVNVGFEYWGQGTQVTVSS
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.编码抗GFP单域抗体的表达质粒的构建
根据之前的文献报道(参见Kirchhofer A.等人，Nature Structura l&MolecularBiology,2010Jan；17(1):133-8；Fleetwood,F.等人,Cellular&Molecular LifeSciences,2013.70(6):p.1081-93；Ryckaert S.等人,Journal of biotechnology,2010Jan 15；145(2):93-8；Aya Twai r等人，Molecular Biology Reports,October 2014,Volume 41,Issue 10,pp 6887-6898)，获得了30种不同的抗GFP单域抗体的序列(SEQ IDNO:1-30)。随后，由上海生工生物工程股份有限公司分别合成了编码这30种单域抗体的DNA片段。分别以这30种合成的DNA片段为模板，利用引物VHHF和VHHR进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR反应的条件为：98℃，10min；30个循环的(98℃，30s；58℃，30s；68℃，30s)；68℃，5min。引物VHHF和VHHR的序列如表2所示。
表2：引物的序列
Figure BDA0001618533420000161
Figure BDA0001618533420000171
PCR反应后，回收大小为约400bp的产物。通过下述步骤，将回收的PCR产物分别连接入可商购获得的pTT5载体：将pTT5载体用BamHⅠ/HindⅢ进行酶切，然后用NEB公司的Gibson Assembly试剂将回收的PCR产物和经酶切的pTT5载体连接在一起。用所获得的连接产物转化DH5α感受态细胞，并在37℃培养箱中培养12小时。随后，挑取单克隆菌落，提取质粒，并进行测序，从而获得编码抗GFP单域抗体的表达质粒。
共获得了如下30种表达质粒：
pTT5-GBP1，其编码抗GFP单域抗体GBP1(SEQ ID NO:1)；
pTT5-NbsfGFP08，其编码抗GFP单域抗体NbsfGFP08(SEQ ID NO:2)；
pTT5-S-Nb2，其编码抗GFP单域抗体S-Nb2(SEQ ID NO:3)；
pTT5-S-Nb3，其编码抗GFP单域抗体S-Nb3(SEQ ID NO:4)；
pTT5-S-Nb6，其编码抗GFP单域抗体S-Nb6(SEQ ID NO:5)；
pTT5-S-Nb7，其编码抗GFP单域抗体S-Nb7(SEQ ID NO:6)；
pTT5-S-Nb17，其编码抗GFP单域抗体S-Nb17(SEQ ID NO:7)；
pTT5-S-Nb21，其编码抗GFP单域抗体S-Nb21(SEQ ID NO:8)；
pTT5-S-Nb25，其编码抗GFP单域抗体S-Nb25(SEQ ID NO:9)；
pTT5-GBP4，其编码抗GFP单域抗体GBP4(SEQ ID NO:10)；
pTT5-GBPSR1，其编码抗GFP单域抗体GBPSR1(SEQ ID NO:11)；
pTT5-GBPSR2，其编码抗GFP单域抗体GBPSR2(SEQ ID NO:12)；
pTT5-LAG2，其编码抗GFP单域抗体LAG2(SEQ ID NO:13)；
pTT5-LAG9，其编码抗GFP单域抗体LAG9(SEQ ID NO:14)；
pTT5-LAG14，其编码抗GFP单域抗体LAG14(SEQ ID NO:15)；
pTT5-GBP1，其编码抗GFP单域抗体LAG16(SEQ ID NO:16)；
pTT5-LAG26，其编码抗GFP单域抗体LAG26(SEQ ID NO:17)；
pTT5-LAG27，其编码抗GFP单域抗体LAG27(SEQ ID NO:18)；
pTT5-LAG30，其编码抗GFP单域抗体LAG30(SEQ ID NO:19)；
pTT5-LAG41，其编码抗GFP单域抗体LAG41(SEQ ID NO:20)；
pTT5-NbsfGFP01，其编码抗GFP单域抗体NbsfGFP01(SEQ ID NO:21)；
pTT5-NbsfGFP02，其编码抗GFP单域抗体NbsfGFP02(SEQ ID NO:22)；
pTT5-NbsfGFP03，其编码抗GFP单域抗体NbsfGFP03(SEQ ID NO:23)；
pTT5-NbsfGFP04，其编码抗GFP单域抗体NbsfGFP04(SEQ ID NO:24)；
pTT5-NbsfGFP06，其编码抗GFP单域抗体NbsfGFP06(SEQ ID NO:25)；
pTT5-NbsfGFP07，其编码抗GFP单域抗体NbsfGFP07(SEQ ID NO:26)；
pTT5-P-Nb1，其编码抗GFP单域抗体P-Nb1(SEQ ID NO:27)；
pTT5-S-Nb1，其编码抗GFP单域抗体S-Nb1(SEQ ID NO:28)；
pTT5-S-Nb5，其编码抗GFP单域抗体S-Nb5(SEQ ID NO:29)；
pTT5-S-Nb27，其编码抗GFP单域抗体S-Nb27(SEQ ID NO:30)。
实施例2.编码sfGFP1-10的表达质粒的构建
以合成的sfGFP序列(Stéphanie Cabantous等人，Nature Biotechnology 23,102-107(2005))为模板，利用引物HdGFPF和BmGFP1-10R进行PCR反应，以获得编码sfGFP1-10(SEQ ID NO:31，其为sfGFP蛋白的aa 1-214(即C端截短了16个氨基酸残基的sfGFP蛋白))的DNA片段。PCR反应的条件为：98℃，10min；30个循环的(98℃，30s；58℃，30s；68℃，30s)；68℃，5min。引物HdGFPF和BmGFP1-10R的序列如表3所示。
表3：引物的序列
SEQ ID NO: 引物名称 引物序列(5'-3')
76 HdGFPF gagggcccgtttctgctagcaagcttatggtttcgaaaggcgaggag
77 BmGFP1-10R gccagaggtcgaggtcgggggatccttatttctcgtttgggtctt
按照实施例1描述的方法，将如上获得的PCR扩增产物连接入pTT22M载体(其为经改造的PTT22载体，其中PTT22载体中的嘌呤霉素基因被替换成编码红色荧光蛋白mCherry的基因)中，从而获得编码sfGFP1-10(SEQ ID NO:31)的表达质粒pTT22M-sfGFP1-10。
实施例3.能够使sfGFP1-10恢复荧光的单域抗体的鉴定
以每孔10000个细胞的密度，将Hela细胞悬液铺板到96孔细胞培养板中，培养体积为每孔100μL。培养20h后，依照试剂盒的说明书，使用
Figure BDA0001618533420000181
LTX with PlusReagent(Invitrogen公司)，将编码单域抗体的表达质粒和pTT22M-sfGFP1-10共同转染至Hela细胞中。另外，还将空载体pTT5和pTT22M-sfGFP1-10共同转染至Hela细胞中，用作阴性对照。
转染48h后，用荧光显微镜观察各个孔中的细胞的状态和荧光。结果如图1所示。图1显示，共转染了编码单域抗体的表达质粒和pTT22M-sfGFP1-10的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，对于每一个实验组的细胞，上图显示了红光通道的观察结果(用于指示转染效率)，下图显示了绿光通道的观察结果(用于显示细胞是否发出绿色荧光)；“vector”组表示转染了空载体pTT5和pTT22M-sfGFP1-10的Hela细胞。
图1的结果显示，转染后，所有实验组的细胞都能够发出红色荧光，这表明pTT22M-sfGFP1-10(其携带编码红色荧光蛋白mCherry的基因)已被成功转染入Hela细胞，并表达出红色荧光蛋白mCherry。进一步，图1的结果显示，单独表达sfGFP1-10的Hela细胞不能发出绿色荧光(“vector”组)；并且，共表达sfGFP1-10和单域抗体GBP4、GBPSR1、GBPSR2、LAG2、LAG9、LAG14、LAG16、LAG26、LAG27、LAG30、LAG41、NbsfGFP01、NbsfGFP02、NbsfGFP03、NbsfGFP04、NbsfGFP06、NbsfGFP07、P-Nb1、S-Nb1、S-Nb5或S-Nb27的Hela细胞也不能够发出绿色荧光；但是，共表达sfGFP1-10和单域抗体GBP1、NbsfGFP08、S-Nb2、S-Nb3、S-Nb6、S-Nb7、S-Nb17、S-Nb21或S-Nb25的Hela细胞则能够发出绿色荧光。
图1的实验结果表明，单域抗体GBP1、NbsfGFP08、S-Nb2、S-Nb3、S-Nb6、S-Nb7、S-Nb17、S-Nb21和S-Nb25能够与sfGFP1-10发生特异性相互作用，并使之发出绿色荧光。另外，图1的结果还显示，共表达sfGFP1-10和单域抗体GBP1的Hela细胞的绿色荧光最强。因此，在某些情况下，单域抗体GBP1是能够使sfGFP1-10发出绿色荧光的优选抗体。
另外，还通过本领域熟知的Kabat方法(Kabat EA,Wu TT,Perry HM,GottesmanKS,Coeller K.Sequences of proteins of immunological interes t,U.S Departmentof Heal th and Human Services,PHS,NIH,Bethesda,1991)，确定了单域抗体GBP1、NbsfGFP08、S-Nb2、S-Nb3、S-Nb6、S-Nb7、S-Nb17、S-Nb21和S-Nb25的互补决定区(CDR)序列。结果如表4所示。
表4：9株单域抗体的CDR序列
Figure BDA0001618533420000191
实施例4.sfGFP的其他截短体的验证
如上所述，已在实施例3中证实，sfGFP1-10能够与9株单域抗体相互作用，并发出荧光。在本实施例中，评估了sfGFP的其他截短体是否具有与sfGFP1-10相同的性质。
简言之，基本上按照实施例2中描述的方案，制备了编码下述sfGFP截短体的表达质粒：
CM5：其与sfGFP相比，C端截短了5个氨基酸残基；
CM9：其与sfGFP相比，C端截短了9个氨基酸残基；
CM10：其与sfGFP相比，C端截短了10个氨基酸残基；
CM11：其与sfGFP相比，C端截短了11个氨基酸残基；
CM16(即sfGFP1-10)：其与sfGFP相比，C端截短了16个氨基酸残基；
CM21：其与sfGFP相比，C端截短了21个氨基酸残基；
CM22：其与sfGFP相比，C端截短了22个氨基酸残基；
CM23：其与sfGFP相比，C端截短了23个氨基酸残基；
CM24：其与sfGFP相比，C端截短了24个氨基酸残基；
CM26：其与sfGFP相比，C端截短了26个氨基酸残基；
CM28：其与sfGFP相比，C端截短了28个氨基酸残基；
CM32：其与sfGFP相比，C端截短了32个氨基酸残基。
随后，按照实施例3中描述的方法，在Hela细胞中表达sfGFP的各种截短体，或者共表达sfGFP的各种截短体和单域抗体GBP1，并使用荧光显微镜观察Hela细胞的状态和荧光。
简言之，以每孔10000个细胞的密度，将Hela细胞悬液铺板到96孔细胞培养板中，培养体积为每孔100μL。培养20h后，依照试剂盒的说明书，使用
Figure BDA0001618533420000201
LTX withPlus Reagent(Invitrogen公司)，将PTT5载体和编码sfGFP截短体的表达质粒(用于指示sfGFP截短体本身是否发出荧光)，或者将pTT5-GBP1和编码sfGFP截短体的表达质粒(用于指示GBP1是否能够使本身不发出荧光的sfGFP截短体恢复荧光)，共同转染至Hela细胞中。
转染48h后，用荧光显微镜观察各个孔中的细胞的荧光。结果如图2所示。图2显示，共转染了编码sfGFP的C端截短变体的表达质粒以及PTT5(图2A)或pTT5-GBP1(图2B)的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，“WT”组表示共转染了编码荧光蛋白sfGFP的表达质粒以及pTT5(图2A)或pTT5-GBP1(图2B)的Hela细胞。
图2A的实验结果显示，截短体CM5本身能够显示明显的绿色荧光，截短体CM9仅能够显示极其微弱的绿色荧光，而其他截短体均不能显示绿色荧光。这些结果表明，当sfGFP蛋白的C端截短9个或更多个氨基酸残基时，所产生的截短体基本上丧失了发出绿色荧光的能力。
进一步，图2B的实验结果显示，共表达GBP1和CM9，CM10,CM11,CM16,CM21,CM22或CM23的Hela细胞能够发出绿色荧光；但共表达GBP1和CM24，CM26,CM28或CM32的Hela细胞不能发出绿色荧光。这些结果表明，GBP1能够与CM9,CM10,CM11,CM16,CM21,CM22或CM23相互作用，并使其恢复发出绿色荧光的能力。
上述实验结果表明，C端截短了9-23个氨基酸残基的sfGFP蛋白截短体具有与sfGFP1-10相同的性质：即，其本身不能发出荧光，但是在所筛选的单域抗体(例如GBP1)的作用下，能够发出荧光。
实施例5.sfGFP1-10的突变
本实验考察了sfGFP1-10对突变的耐受程度，并获得了能够与单域抗体GBP1组合使用的优选GFP片段。
对sfGFP1-10的序列进行随机突变，以获得sfGFP1-10的变体。随后，按照实施例3中描述的方法，在Hela细胞中共表达sfGFP1-10的变体和单域抗体GBP1，并使用荧光显微镜观察Hela细胞的状态和荧光。
简言之，以每孔10000个细胞的密度，将Hela细胞悬液铺板到96孔细胞培养板中，培养体积为每孔100μL。培养20h后，依照试剂盒的说明书，使用
Figure BDA0001618533420000202
LTX withPlus Reagent(Invitrogen公司)，将pTT5-GBP1和编码sfGFP1-10变体的表达质粒共同转染至Hela细胞中。另外，还将pTT22M-sfGFP1-10和pTT5-GBP1共同转染至Hela细胞中，用作阳性对照；将pTT5-GBP1和编码无关蛋白的表达质粒共同转染至Hela细胞中，用作阴性对照。
转染48h后，用荧光显微镜观察各个孔中的细胞的荧光。结果如图3所示。图3显示，共转染了pTT5-GBP1和编码sfGFP1-10变体的表达质粒的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，“Negative”组表示共转染了pTT5-GBP1和编码无关蛋白的表达质粒的Hela细胞。
图3的结果显示，共表达单域抗体GBP1和sfGFP1-10或其变体(Mdc2-26、Mdc24、Mbcd3、Mbcd4、Mbcd36、Mbcd37、Mbcd38、Mbcd39、Mbcd41、Mbcd44、Mbcd52、Test3-3或Test5-3)的Hela细胞能够发出绿色荧光；但是，共表达单域抗体GBP1和无关蛋白的Hela细胞不能够发出荧光。
Mdc2-26、Mdc24、Mbcd3、Mbcd4、Mbcd36、Mbcd37、Mbcd38、Mbcd39、Mbcd41、Mbcd44、Mbcd52、Test3-3和Test5-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:32-44所示，它们与sfGFP1-10的比较如表5所示。
表5：sfGFP1-10变体与sfGFP1-10的比较
名称 突变残基的数目 同一性(％)
sfGFP1-10 0 100
Mdc2-26 5 97.67
Mdc24 1 99.53
test3-3 4 98.14
test5-3 3 98.60
Mbcd3 10 95.35
Mbcd39 9 95.81
Mbcd41 8 96.28
Mbcd52 6 97.21
Mbcd36 10 95.35
Mbcd4 12 94.42
Mbcd37 12 94.42
Mbcd38 14 93.49
Mbcd44 13 93.95
图3的实验结果表明，sfGFP1-10能够耐受一定程度的突变，而不影响其与GBP1相互作用并发出荧光的能力。因此，可通过各种已知的方法(例如定点诱变法和随机突变法)，对sfGFP1-10的序列进行各种突变和改造，并通过如上所述的方法，筛选获得能够与GBP1相互作用并发出荧光的各种变体。本申请意欲涵盖所有的此类变体。
此外，图3的实验结果还显示，共表达某些sfGFP1-10变体与GBP1的Hela细胞的荧光强度显著高于共表达sfGFP1-10与GBP1的Hela细胞的荧光强度。例如，共表达Mbcd38与GBP1的Hela细胞具有最高的荧光强度。此外，还发现，当将Mdc2-26与GBP1组合使用时，能获得最佳的信噪比：即，单独表达Mdc2-26的Hela细胞的荧光背景极低，并且共表达Mdc2-26与GBP1的Hela细胞的荧光强度增加最为显著。此类sfGFP1-10变体在某些情况下可能是特别有利的。
实施例6.编码BFP1-10或YFP1-10的表达质粒的构建
绿色荧光蛋白与其他颜色的荧光蛋白的主要差异在于，参与激发荧光的结构域(特别是aa 65-67)具有不同的氨基酸残基。在本实施例中，基于编码Mbcd38的核酸序列，构建了编码BFP1-10或YFP1-10的表达质粒，并验证了GBP1与BFP1-10或YFP1-10之间的相互作用。
简言之，以编码Mbcd38的表达质粒(pTT22M-Mbcd38)为模板，利用引物HdGFPF与DrFPbR进行PCR扩增，以获得DNA片段YFPa，且利用引物DrFPbF与BmGFP1-10R进行PCR扩增，以获得DNA片段YFPb。随后，以DNA片段YFPa和YFPb为模板，利用引物HdGFPF与BmGFP1-10R进行PCR扩增，以获得编码YFP1-10(SEQ ID NO:46)的DNA片段。
类似地，以编码Mbcd38的表达质粒(pTT22M-Mbcd38)为模板，利用引物HdGFPF与DrFPcR进行PCR扩增，以获得DNA片段BFPa，且利用引物DrFPcF与BmGFP1-10R进行PCR扩增，以获得DNA片段BFPb。随后，以DNA片段BFPa和BFPb为模板，利用引物HdGFPF与BmGFP1-10R进行PCR扩增，以获得编码BFP1-10(SEQ ID NO:45)的DNA片段。
上述PCR反应所使用的引物的序列如表6所示。
表6：引物的序列
SEQ ID NO: 引物名称 引物序列(5'-3')
76 HdGFPF gagggcccgtttctgctagcaagcttatggtttcgaaaggcgaggag
77 BmGFP1-10R gccagaggtcgaggtcgggggatccttatttctcgtttgggtctt
78 DrFPbF ggctacggcctgcagtgcttcgccagatatccggaccacatg
79 DrFPbR ggcgaagcactgcaggccgtagcccagtgttgtcactagtgttggcca
80 DrFPcF agccacggcgtgcagtgcttcgccagatatccggaccacatg
81 DrFPcR ggcgaagcactgcacgccgtggctcagtgttgtcactagtgttggcca
按照实施例1描述的方法，将如上获得的PCR扩增产物分别连接入pTT22M载体中，从而获得编码BFP1-10(SEQ ID NO:45)的表达质粒(将其命名为pTT22M-BFP1-10)和编码YFP1-10(SEQ ID NO:46)的表达质粒(将其命名为pTT22M-YFP1-10)。
随后，按照实施例3描述的方法，验证GBP1与BFP1-10或YFP1-10之间的相互作用。简言之，以每孔10000个细胞的密度，将Hela细胞悬液铺板到96孔细胞培养板中，培养体积为每孔100μL。培养20h后，依照试剂盒的说明书，使用
Figure BDA0001618533420000221
LTX with PlusReagent(Invitrogen公司)，将编码单域抗体GBP1的表达质粒(pTT5-GBP1)与pTT22M-BFP1-10或pTT22M-YFP1-10共同转染至Hela细胞中。另外，还将空载体pTT5与pTT22M-BFP1-10或pTT22M-YFP1-10共同转染至Hela细胞中，用作阴性对照。
转染48h后，用荧光显微镜观察各个孔中的细胞的状态和荧光。结果如图4所示。图4显示，共转染了pTT5-GBP1与pTT22M-BFP1-10或pTT22M-YFP1-10的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，“B/Y”表示蓝光/黄光通道的观察结果；“R”表示红光通道的观察结果；“Merge”表示两种通道的观察结果的合并。
图4的结果显示，单独表达BFP1-10或YFP1-10的Hela细胞不能发出荧光(“BFP1-10”组和“YFP1-10”组)；而共表达BFP1-10和单域抗体GBP1的Hela细胞能够发出蓝色荧光，共表达YFP1-10和单域抗体GBP1的Hela细胞能够发出黄色荧光。
这些结果表明，GBP1不仅能够使不发荧光的GFP片段恢复荧光，而且能够使不发荧光的BFP片段和YFP片段恢复荧光。因此，本发明的原理和方法可适用于各种荧光蛋白。
实施例7.GBP1/sfGFP1-10在蛋白定位中的应用
在本实施例中，以7种目的蛋白(ACTB1,TUBB3,MAPRE3,H2B,LMNB1,PAXILLIN,EndoG)为例，验证了GBP1/sfGFP1-10在蛋白定位中的应用。简言之，在细胞中共表达含有GBP1和目的蛋白的融合蛋白以及sfGFP1-10，随后通过GBP1和sfGFP1-10之间的相互作用，确定目的蛋白在细胞内的分布和位置。ACTB1,TUBB3,MAPRE3,H2B,LMNB1,PAXILLIN,EndoG的氨基酸序列均可参见GeneBank(GeneBank登录号分别如下：ACTB1,NM_001101；TUBB3,NM_006086；MAPRE3,XM_004028974；H2B,AK311849；LMNB1,BC012295；PAXILLIN,XM_015275216；EndoG,BC004922)。
按照一般的分子克隆方案，构建了下述表达质粒：
pTT5-GBP-ACTB1，其编码包含GBP1和ACTB1的融合蛋白GBP-ACTB1，其中GBP1连接至ACTB1的N端；
pTT5-BFP-ACTB1，其编码包含全长BFP和ACTB1的融合蛋白BFP-ACTB1，其中BFP连接至ACTB1的N端；
pTT5-TUBB3-GBP，其编码包含GBP1和TUBB3的融合蛋白TUBB3-GBP，其中GBP1连接至TUBB3的C端；
pTT5-TUBB3-BFP，其编码包含全长BFP和TUBB3的融合蛋白TUBB3-BFP，其中BFP连接至TUBB3的C端；
pTT5-GBP-MAPRE3，其编码包含GBP1和MAPRE3的融合蛋白GBP-MAPRE3，其中GBP1连接至MAPRE3的N端；
pTT5-BFP-MAPRE3，其编码包含全长BFP和MAPRE3的融合蛋白BFP-MAPRE3，其中BFP连接至MAPRE3的N端；
pTT5-GBP-H2B，其编码包含GBP1和H2B的融合蛋白GBP-H2B，其中GBP1连接至H2B的N端；
pTT5-BFP-H2B，其编码包含全长BFP和H2B的融合蛋白BFP-H2B，其中BFP连接至H2B的N端；
pTT5-GBP-LMNB1，其编码包含GBP1和LMNB1的融合蛋白GBP-LMNB1，其中GBP1连接至LMNB1的N端；
pTT5-BFP-LMNB1，其编码包含全长BFP和LMNB1的融合蛋白BFP-LMNB1，其中BFP连接至LMNB1的N端；
pTT5-Paxillin-GBP，其编码包含GBP1和Paxillin的融合蛋白Paxillin-GBP，其中GBP1连接至Paxillin的C端；
pTT5-Paxillin-BFP，其编码包含全长BFP和Paxillin的融合蛋白Paxillin–BFP，其中BFP连接至Paxillin的C端；
pTT5-EndoG–GBP，其编码包含GBP1和EndoG的融合蛋白EndoG–GBP，其中GBP1连接至EndoG的C端；
pTT5-EndoG-BFP，其编码包含全长BFP和EndoG的融合蛋白EndoG-BFP，其中BFP连接至EndoG的C端。
随后，按照实施例3描述的方法，在Hela细胞中分别共转染下述表达质粒的组合：
(1)pTT5-GBP-ACTB1+pTT5-BFP-ACTB1+pTT22M-sfGFP1-10；
(2)pTT5-TUBB3-GBP+pTT5-TUBB3-BFP+pTT22M-sfGFP1-10；
(3)pTT5-GBP-MAPRE3+pTT5-BFP-MAPRE3+pTT22M-sfGFP1-10；
(4)pTT5-GBP-H2B+pTT5-BFP-H2B+pTT22M-sfGFP1-10；
(5)pTT5-GBP-LMNB1+pTT5-BFP-LMNB1+pTT22M-sfGFP1-10；
(6)pTT5-Paxillin-GBP+pTT5-Paxillin-BFP+pTT22M-sfGFP1-10；或
(7)pTT5-EndoG-GBP+pTT5-EndoG-BFP+pTT22M-sfGFP1-10。
转染48h后，用荧光显微镜观察Hela细胞的荧光。结果如图5所示。图5显示，共转染了各种表达质粒组合的Hela细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果；其中，对于每一个实验组的细胞，上图显示了Hela细胞中的绿色荧光(由融合蛋白中的GBP1+sfGFP1-10产生)的分布和位置；中图显示了Hela细胞中的蓝色荧光(由融合蛋白中的BFP产生)的分布和位置；下图显示了，上图和中图的合并。
从图5的实验结果可以看出，对于每一个实验组的Hela细胞，蓝色荧光与绿色荧光的分布是一致的。这表明，与全长BFP一样，本发明的GBP1/sfGFP1-10组合也能够用于准确确定各种目的蛋白(例如ACTB1,TUBB3,MAPRE3,H2B,LMNB1,PAXILLIN,EndoG)在细胞内的分布和位置。另外，图5的实验结果还表明，GBP1可以以各种方式与目的蛋白相连接。例如，可以将GBP1连接至目的蛋白的N端或C端，而不影响其与sfGFP1-10之间的相互作用。
实施例8.GBP1/Mbcd38在指示细胞融合中的应用
在本实施例中，以喉癌细胞Hep2为例，验证了GBP1/Mbcd38在指示细胞融合中的应用。
简言之，使用本领域熟知的慢病毒感染法，将编码Mbcd38和BFP(蓝色荧光蛋白)的核苷酸序列稳定地整合入喉癌细胞Hep2的基因组中，从而构建获得稳定表达Mbcd38和BFP的细胞株Hep2-Mbcd38。另外，将编码单域抗体GBP1和iRFP(近红外荧光蛋白)的核苷酸序列稳定地整合入喉癌细胞Hep2的基因组中，从而构建获得稳定表达GBP1和iRFP的细胞株Hep2-GBP1。
随后，以每孔30000个细胞的密度，将Hep2-GBP1细胞悬液、Hep2-Mbcd38细胞悬液、含有Hep2-GBP1和Hep2-Mbcd38的细胞悬液(两种细胞的比例为1:1)分别铺板到96孔细胞培养板中。培养24h后，用RSV病毒(呼吸道合胞病毒；MOI＝1)分别感染培养板中的细胞。感染48h后，用荧光显微镜观察各个孔中的细胞的状态和荧光。结果如图6所示。图6显示了，Hep2-GBP1细胞悬液、Hep2-Mbcd38细胞悬液以及含有Hep2-GBP1和Hep2-Mbcd38的细胞悬液在感染RSV病毒48h后的荧光显微镜观察结果。
图6的结果显示，在感染RSV病毒后，在含有单独的Hep2-Mbcd38的培养物中，能够观察到蓝色荧光(由BFP蛋白产生)，而无法观察到近红外荧光或绿色荧光；在含有单独的Hep2-GBP1的培养物中，能够观察到近红外荧光(由iRFP蛋白产生)，而无法观察到蓝色荧光或绿色荧光；在含有Hep2-GBP1和Hep2-Mbcd38的培养物中，能够观察到蓝色荧光(由BFP蛋白产生)，近红外荧光(由iRFP蛋白产生)，以及绿色荧光(由GBP1+Mbcd38产生)。这些结果表明：(1)Hep2-Mbcd38已稳定整合了编码Mbcd38和BFP的核苷酸序列，能够表达Mbcd38和BFP，从而能够发出蓝色荧光；(2)Hep2-GBP1已稳定整合了编码GBP1和iRFP的核苷酸序列，能够表达GBP1和iRFP，从而能够发出近红外荧光；(3)在感染RSV病毒后，混合培养的Hep2-GBP1和Hep2-Mbcd38发生了细胞融合，由此这两种细胞各自表达的GBP1和Mbcd38发生了相互作用，产生了绿色荧光。因此，这些实验结果证实，本发明的GBP1/Mbcd38组合可用于指示细胞融合，例如由RSV感染引起的细胞融合。
实施例9.GBP1/Mdc2-26在指示穿膜肽的穿膜作用中的应用
在本实施例中，以穿膜肽pep1(参见Manceur A.等人，Analytical Biochemistry,2007,364(1):51-59)为例，验证了GBP1/Mdc2-26在指示穿膜肽的穿膜作用中的应用。
如实施例3所述，使用
Figure BDA0001618533420000241
LTX with Plus Reagent(Invitrogen公司)，将编码Mdc2-26的表达质粒转染入U2OS细胞中，以使得U2OS细胞表达Mdc2-26。
转染后36h，去除U2OS细胞培养物的培养液，并添加新鲜培养基，所述新鲜培养基含有80μg GBP1蛋白或者80μg GBP1蛋白与10μg穿膜肽pep1的混合物。随后，用荧光显微镜观察U2OS细胞。结果如图7所示。图7显示，表达Mdc2-26的U2OS细胞在与GBP1或者GBP1+穿膜肽pep1一起温育6h、8h、10h或12h后的荧光显微镜观察结果。
图7的实验结果显示，与不使用pep1的情况相比，在使用pep1的情况下，在U2OS细胞培养物中观察到显著更强的荧光。这些结果表明，pep1能够促进GBP1蛋白进入U2OS细胞中，从而U2OS细胞中具有更多的GBP1蛋白，能够与Mdc2-26产生更强的相互作用，发出更强的绿色荧光。因此，这些结果进一步表明，本发明的GBP1/Mdc2-26能够用于指示穿膜肽(例如pep1)的穿膜作用。
此外，相比于使用FITC或者EGFP来检测穿膜肽的穿膜作用的常规方法(参见Manceur A.等人，Analytical Biochemistry,2007,364(1):51-59)而言，本发明的使用GBP1/Mdc2-26的检测方法的本底更低，并且不需要把残余的FITC或者EGFP清洗掉，操作更为简单。
实施例10.GBP1/sfGFP1-10与G11/sfGFP1-10的比较
之前已报道，G11(GFP的氨基酸215-230)能够与sfGFP1-10相互作用，并恢复sfGFP1-10的荧光。因此，G11与sfGFP1-10可用作蛋白标签系统。在本实施例中，以6种目的蛋白(Agr2,HBc,NTCP,NP,TUBB3,hGBP1)为例，比较了GBP1/sfGFP1-10与G11/sfGFP1-10的性能和效果。Agr2,HBc,NTCP,NP,TUBB3,hGBP1的氨基酸序列均可参见GenBank(GenBank登录号分别如下：Agr2,KJ767789；HBc,AB818694；NTCP,BC074724；NP,EU330203；TUBB3,NM_006086；hGBP1,BC002666)。
简言之，按照一般的分子克隆方案，构建了下述表达质粒：
pTT5-Agr2-G11，其编码包含Agr2和G11的融合蛋白Agr2-G11，其中G11通过柔性接头(GSSGGSSG；SEQ ID NO:82)连接至Agr2的C端；
pTT5-G11-Agr2，其编码包含Agr2和G11的融合蛋白G11-Agr2，其中G11通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至Agr2的N端；
pTT5-G11-2A-Agr2，其编码包含Agr2和G11的融合蛋白G11-2A-Agr2，其中G11通过自切割接头(GSSGGSSGGSGATNFSLLKQAG DVEENPGP；SEQ ID NO:83)连接至Agr2的N端；
pTT5-Agr2-GBP1，其编码包含Agr2和GBP1的融合蛋白Agr2-GBP1，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至Agr2的C端；
pTT5-GBP1-Agr2，其编码包含Agr2和GBP1的融合蛋白GBP1-Agr2，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至Agr2的N端；
pTT5-GBP1-2A-Agr2，其编码包含Agr2和GBP1的融合蛋白GBP1-2A-Agr2，其中GBP1通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至Agr2的N端；
pTT5-HBc-G11，其编码包含HBc和G11的融合蛋白HBc-G11，其中G11通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至HBc的C端；
pTT5-G11-HBc，其编码包含HBc和G11的融合蛋白G11-HBc，其中G11通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至HBc的N端；
pTT5-G11-2A-HBc，其编码包含HBc和G11的融合蛋白G11-2A-HBc，其中G11通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至HBc的N端；
pTT5-HBc-GBP1，其编码包含HBc和GBP1的融合蛋白HBc-GBP1，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至HBc的C端；
pTT5-GBP1-HBc，其编码包含HBc和GBP1的融合蛋白GBP1-HBc，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至HBc的N端；
pTT5-GBP1-2A-HBc，其编码包含HBc和GBP1的融合蛋白GBP1-2A-HBc，其中GBP1通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至HBc的N端；
pTT5-NTCP-G11，其编码包含NTCP和G11的融合蛋白NTCP-G11，其中G11通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至NTCP的C端；
pTT5-G11-NTCP，其编码包含NTCP和G11的融合蛋白G11-NTCP，其中G11通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至NTCP的N端；
pTT5-G11-2A-NTCP，其编码包含NTCP和G11的融合蛋白G11-2A-NTCP，其中G11通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至NTCP的N端；
pTT5-NTCP-GBP1，其编码包含NTCP和GBP1的融合蛋白NTCP-GBP1，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至NTCP的C端；
pTT5-GBP1-NTCP，其编码包含NTCP和GBP1的融合蛋白GBP1-NTCP，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至NTCP的N端；
pTT5-GBP1-2A-NTCP，其编码包含NTCP和GBP1的融合蛋白GBP1-2A-NTCP，其中GBP1通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至NTCP的N端；
pTT5-NP-G11，其编码包含NP和G11的融合蛋白NP-G11，其中G11通过柔性接头(SEQID NO:82)连接至NP的C端；
pTT5-G11-NP，其编码包含NP和G11的融合蛋白G11-NP，其中G11通过柔性接头(SEQID NO:82)连接至NP的N端；
pTT5-G11-2A-NP，其编码包含NP和G11的融合蛋白G11-2A-NP，其中G11通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至NP的N端；
pTT5-NP-GBP1，其编码包含NP和GBP1的融合蛋白NP-GBP1，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至NP的C端；
pTT5-GBP1-NP，其编码包含NP和GBP1的融合蛋白GBP1-NP，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至NP的N端；
pTT5-GBP1-2A-NP，其编码包含NP和GBP1的融合蛋白GBP1-2A-NP，其中GBP1通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至NP的N端；
pTT5-hGBP1-G11，其编码包含hGBP1和G11的融合蛋白hGBP1-G11，其中G11通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至hGBP1的C端；
pTT5-G11-hGBP1，其编码包含hGBP1和G11的融合蛋白G11-hGBP1，其中G11通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至hGBP1的N端；
pTT5-G11-2A-hGBP1，其编码包含hGBP1和G11的融合蛋白G11-2A-hGBP1，其中G11通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至hGBP1的N端；
pTT5-hGBP1-GBP1，其编码包含hGBP1和GBP1的融合蛋白hGBP1-GBP1，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至hGBP1的C端；
pTT5-GBP1-hGBP1，其编码包含hGBP1和GBP1的融合蛋白GBP1-hGBP1，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至hGBP1的N端；
pTT5-GBP1-2A-hGBP1，其编码包含hGBP1和GBP1的融合蛋白GBP1-2A-hGBP1，其中GBP1通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至hGBP1的N端；
pTT5-TUBB3-G11，其编码包含TUBB3和G11的融合蛋白TUBB3-G11，其中G11通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至TUBB3的C端；
pTT5-G11-TUBB3，其编码包含TUBB3和G11的融合蛋白G11-TUBB3，其中G11通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至TUBB3的N端；
pTT5-G11-2A-TUBB3，其编码包含TUBB3和G11的融合蛋白G11-2A-TUBB3，其中G11通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至TUBB3的N端；
pTT5-TUBB3-GBP1，其编码包含TUBB3和GBP1的融合蛋白TUBB3-GBP1，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至TUBB3的C端；
pTT5-GBP1-TUBB3，其编码包含TUBB3和GBP1的融合蛋白GBP1-TUBB3，其中GBP1通过柔性接头(SEQ ID NO:82)连接至TUBB3的N端；
pTT5-GBP1-2A-TUBB3，其编码包含TUBB3和GBP1的融合蛋白GBP1-2A-TUBB3，其中GBP1通过自切割接头(SEQ ID NO:83)连接至TUBB3的N端。
随后，按照实施例3描述的方法，在293细胞中共转染表达质粒pTT22M-sfGFP1-10以及如上制备的36种表达质粒中的任一种。转染48h后，用荧光显微镜观察293细胞的荧光。结果如图8所示。图8显示，共转染了各种表达质粒组合的293细胞在转染后48h的荧光显微镜观察结果。
图8的实验结果显示，当G11连接至目的蛋白的C端时，G11与sfGFP1-10的共表达能够产生较强的绿色荧光；但是，当G11通过柔性接头连接至Agr2,HBc,NTCP或通过自切割接头连接至任一目的蛋白的N端时，G11与sfGFP1-10的共表达只能产生很弱的绿色荧光。相比之下，对于所有6种蛋白以及所有3种连接方式，GBP1与sfGFP1-10的共表达均能够产生强绿色荧光。GBP1与sfGFP1-10的之间的相互作用不受目的蛋白的种类和连接方式的影响。
这些实验结果表明，当使用G11/sfGFP1-10来标记蛋白时，应当将G11连接至目的蛋白的C端；而本发明的GBP1/sfGFP1-10系统则不受连接方式的限制，可以以各种方式进行应用。例如，可以将GBP1游离表达，或融合至目的蛋白的N端或者C端，而基本上不影响本发明的GBP1/sfGFP1-10系统的标记功能。
实施例11.GBP1抗体FR区的突变
在本实施例中，对GBP1抗体的FR区进行了随机突变，获得了2个突变体。这2个突变体分别被命名为GBPMT1和GBPMT2，并且其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示。
合成编码GBPMT1的基因和编码GBPMT2的基因，并按照上文描述的方法，将它们分别克隆入PTT5载体。
随后，按照实施例3描述的方法，将表达质粒pTT22M-Mdc2-26以及携带编码GBPMT1或GBPMT2的基因的表达质粒共转染入Hela细胞中。另外，将表达质粒pTT22M-Mdc2-26和携带编码GBP1的基因的表达质粒共转染入Hela细胞中，用作对照。转染48h后，用荧光显微镜观察Hela细胞的荧光。结果如图9所示。
图9显示，共转染了Mdc2-26以及GBP1或GBPMT1或GBPMT2的Hela细胞都能展示出绿色荧光。这个结果说明，GBP1或GBPMT1或GBPMT2均能够使Mdc2-26恢复荧光。这进一步说明：单域抗体(例如GBP1)的功能/性质(即，使荧光蛋白截短体(例如Mdc2-26)恢复荧光的功能/性质)主要由其CDR1-3决定；单域抗体(例如GBP1)的FR区的突变不影响其功能/性质。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种检测系统
<130> IDC170090
<150> CN 201710263512.0
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<212> PRT
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<223> 单域抗体GBP1的可变区
<400> 1
Met Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn
20 25 30
Arg Tyr Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Thr
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Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Ser Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP08的可变区
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser
20 25 30
Ile Tyr Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Cys Glu
35 40 45
Leu Val Ser Leu Ile Ile Pro Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ser Thr Ala Gly Asn Trp Pro Arg Ala Cys Thr Asp Phe
100 105 110
Val Tyr Gln Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb2的可变区
<400> 3
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Glu Ala Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Ile
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85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Arg Arg Ser Gly Ser Trp Asn Val Asp Pro
100 105 110
Leu Arg Tyr Asp Tyr Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 4
<211> 130
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb3的可变区
<400> 4
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Glu Ala Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Ile
20 25 30
Asn Pro Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Val Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr
65 70 75 80
Met Tyr Leu Gln Met Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Lys Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Arg Arg Gly Gly Asn Trp Asn Val Asp Pro
100 105 110
Phe Arg Tyr Asp Tyr Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb6的可变区
<400> 5
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Glu Ala Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Ile
20 25 30
Asn Pro Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Val Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Lys Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Arg Arg Gly Gly Ser Trp Asn Val Asp Pro
100 105 110
Leu Arg Tyr Asp Tyr Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 6
<211> 133
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb7的可变区
<400> 6
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Tyr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Val Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Thr Thr Leu Pro Leu Tyr Ala Ala Ile Met Ala Met
100 105 110
Thr Ser Arg Ser Glu Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 7
<211> 130
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb17的可变区
<400> 7
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Glu Ala Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Ile
20 25 30
Asn Pro Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Val His Thr Tyr Phe Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Lys Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Arg Arg Gly Gly Ser Trp Asn Val Asp Pro
100 105 110
Leu Arg Tyr Asp Tyr Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 8
<211> 133
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb21的可变区
<400> 8
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ile Asp Arg Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Met Tyr Leu Gln Met Asn Glu Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Thr Thr Leu Pro Leu Tyr Ala Ala Ile Met Ala Met
100 105 110
Thr Ser Arg Ser Glu Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 9
<211> 130
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb25的可变区
<400> 9
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Glu Ala Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Ile
20 25 30
Asn Pro Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Val Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Met Tyr Leu His Met Pro Asn Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Lys Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Arg Arg Ser Gly Ser Trp Asn Val Asp Pro
100 105 110
Leu Arg Tyr Asp Tyr Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 10
<211> 133
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体GBP4的可变区
<400> 10
Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Cys Glu
35 40 45
Leu Val Ser Asn Ile Leu Arg Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Gly Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Val Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Ser Gly Thr Gln Leu Gly Tyr Val Gly Ala Val Gly
100 105 110
Leu Ser Cys Leu Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 11
<211> 127
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体GBPSR1的可变区
<400> 11
Met Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Val Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly
20 25 30
Arg Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Thr Asn Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Gln Gly Ala Leu Gly Trp His Met Ala Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
115 120 125
<210> 12
<211> 134
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体GBPSR2的可变区
<400> 12
Met Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Val Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Tyr
20 25 30
Thr Ala Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Asp
35 40 45
Phe Val Ala Gly Ile Thr Trp Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Arg Gly Phe Thr Leu Ala Pro Thr Arg Ala
100 105 110
Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
His His His His His His
130
<210> 13
<211> 135
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体LAG2的可变区
<400> 13
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Thr Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Val Gln Met Asn Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Val Arg Ala Arg Ser Phe Ser Asp Thr Tyr Ser Arg
100 105 110
Val Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser His His His His His His
130 135
<210> 14
<211> 134
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体LAG9的可变区
<400> 14
Met Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Thr Ser Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Arg Ile Thr Trp Ser Ala Gly Tyr Thr Ala Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ser Arg Ser Ala Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Thr Arg Arg
100 105 110
Glu Asp Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
His His His His His His
130
<210> 15
<211> 134
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体LAG14的可变区
<400> 15
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Ser
20 25 30
Ile Ser Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Gly Ile Ser Arg Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Arg Ala Arg Gly Trp Thr Thr Phe Pro Ala Arg Glu
100 105 110
Ile Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
His His His His His His
130
<210> 16
<211> 135
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体LAG16的可变区
<400> 16
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Thr Ser Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Thr Val Gly Asn Thr Ile Leu Gly Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Val Leu Ser Val Leu Arg Ser
100 105 110
Val Asp Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser His His His His His His
130 135
<210> 17
<211> 133
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体LAG26的可变区
<400> 17
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Ala Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser
20 25 30
Leu Tyr His Trp Val Trp Phe Arg Gln Ala Ala Gly Arg Glu His Glu
35 40 45
Phe Val Ala Gly Ile Ile Arg Ser Gly Gly Glu Thr Leu Ser Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Met Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Thr His Arg Ala Asp Trp Tyr Ser Ser Ala Phe Arg
100 105 110
Glu Tyr Ile Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His
115 120 125
His His His His His
130
<210> 18
<211> 133
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体LAG27的可变区
<400> 18
Met Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser
20 25 30
Thr Tyr Asn Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Gly Ile Ile Ile Arg Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Val Lys Pro Ala Asp Ala Ala Val Tyr
85 90 95
Ser Cys Gly Ala Thr Val Arg Ala Gly Ala Ala Ala Glu Gln Tyr Asn
100 105 110
Ser Tyr Ile Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His
115 120 125
His His His His His
130
<210> 19
<211> 135
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体LAG30的可变区
<400> 19
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Thr Ser Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Thr Val Gly Asn Thr Ile Tyr Gly Asp
50 55 60
Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg Thr Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Asp Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Arg Ser Arg Gly Phe Val Leu Ser Asp Leu Arg Ser
100 105 110
Val Asp Ser Phe Asp Tyr Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser His His His His His His
130 135
<210> 20
<211> 129
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体LAG41的可变区
<400> 20
Met Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Gly Ala
20 25 30
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Gly
35 40 45
Gly Ile Ser Gly Ser Glu Thr Asp Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Asp Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Ile Thr Leu Phe Thr Ser Arg Thr Asp Tyr Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His
115 120 125
His
<210> 21
<211> 128
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP01的可变区
<400> 21
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ala Tyr Arg
20 25 30
Asn Ala Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ile Ile Asn Ser Val Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Val Ala Arg Val Val Cys Pro Gly Asp Lys Leu Gly Ala
100 105 110
Ser Gly Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 22
<211> 130
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP02的可变区
<400> 22
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Tyr Ser
20 25 30
Ser Tyr Phe Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ser Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Thr Leu Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gly Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Lys Phe Leu Leu Leu Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Leu Arg Arg Arg Gly Trp Ser Asn Thr Ser Gly Trp Lys
100 105 110
Gln Pro Gly Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 23
<211> 124
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP03的可变区
<400> 23
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Pro Gly Tyr Thr Phe Ser
20 25 30
Asp Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Glu Val Ala Arg Ile Ser Gly Gly Lys Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser
50 55 60
Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Tyr Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Trp Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Thr Thr Gly Val Cys Ala Gly Gly Phe Asn
100 105 110
Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 128
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP04的可变区
<400> 24
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr His Ile
20 25 30
Thr Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Val Phe Ile Tyr Thr Ser Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Ala Gly Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Thr Arg Ser Val Arg Pro Gly Gly Arg Ile Asp Pro
100 105 110
Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 25
<211> 129
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP06的可变区
<400> 25
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Asp Ser Gly Tyr Thr Phe Ser
20 25 30
Asp Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ile Ile Ser Asn Gly Gly Leu Ile Thr Arg Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Lys Gly Ser Tyr Thr Cys Asn Pro Asp Arg Trp Ser Gln
100 105 110
Val Ser Asp Tyr Lys Tyr Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP07的可变区
<400> 26
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Gly Met Thr Phe Ser
20 25 30
Val Tyr Asn Leu Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Cys Glu
35 40 45
Leu Val Ser Thr Ile Thr Arg Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Gly Val Gly Val Val Asp Cys Thr Glu Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 129
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体P-Nb1的可变区
<400> 27
Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Asp Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ile Thr Asp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Trp Gly Ile Ser Thr Met Thr Ser Leu Asn
100 105 110
Arg Glu Trp Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 28
<211> 127
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb1的可变区
<400> 28
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser
20 25 30
Arg Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ala Ile Asn Thr Gly Asp Ser Ser Thr His Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Met
65 70 75 80
Met Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Trp Gly Tyr Cys Ser Gly Gly Leu Gly Met Ser
100 105 110
Asp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 29
<211> 129
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb5的可变区
<400> 29
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1 5 10 15
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Asn Tyr Tyr Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
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Gly Val Ala Ala Ile Thr Asp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
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Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Trp Gly Ile Ser Pro Met Thr Ser Leu Asn
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Ser
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<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb27的可变区
<400> 30
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
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<213> artificial
<220>
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<213> artificial
<220>
<223> Mbcd52
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<213> artificial
<220>
<223> test3-3
<400> 43
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<213> artificial
<220>
<223> test5-3
<400> 44
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<213> artificial
<220>
<223> BFP1-10
<400> 45
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<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> YFP1-10
<400> 46
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Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Thr Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asp His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Leu Asn Glu Lys
210 215
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体GBP1的CDR1
<400> 47
Gly Phe Pro Val Asn Arg Tyr Ser Met Arg
1 5 10
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体GBP1的CDR2
<400> 48
Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体GBP1的CDR3
<400> 49
Asn Val Gly Phe Glu Tyr
1 5
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP08的CDR1
<400> 50
Gly Leu Thr Phe Ser Ile Tyr Arg Met Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP08的CDR2
<400> 51
Leu Ile Ile Pro Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体NbsfGFP08的CDR3
<400> 52
Ser Thr Ala Gly Asn Trp Pro Arg Ala Cys Thr Asp Phe Val Tyr
1 5 10 15
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb2的CDR1
<400> 53
Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Pro Tyr
1 5
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb2的CDR2
<400> 54
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Val Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb2的CDR3
<400> 55
Asp Phe Arg Arg Ser Gly Ser Trp Asn Val Asp Pro Leu Arg Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr Gln His
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb3的CDR1
<400> 56
Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Pro Tyr
1 5
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb3的CDR2
<400> 57
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Val Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 58
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb3的CDR3
<400> 58
Asp Phe Arg Arg Gly Gly Asn Trp Asn Val Asp Pro Phe Arg Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr Gln His
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb6的CDR1
<400> 59
Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Pro Tyr
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb6的CDR2
<400> 60
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Val Tyr Thr
1 5
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb6的CDR3
<400> 61
Ala Ala Asp Phe Arg Arg Gly Gly Ser Trp Asn Val Asp
1 5 10
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb7的CDR1
<400> 62
Gly Phe Ser Tyr Ser Tyr Tyr Cys
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb7的CDR2
<400> 63
Val Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb7的CDR3
<400> 64
Ala Ala Thr Thr Leu Pro Leu Tyr Ala Ala Ile Met Ala Met Thr Ser
1 5 10 15
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb17的CDR1
<400> 65
Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Pro Tyr
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb17的CDR2
<400> 66
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Val His Thr
1 5
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb17的CDR3
<400> 67
Ala Ala Asp Phe Arg Arg Gly Gly Ser Trp Asn Val Asp
1 5 10
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb21的CDR1
<400> 68
Gly Phe Ala Ile Ser Asn Tyr Cys
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb21的CDR2
<400> 69
Ala Ile Asp Arg Gly Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb21的CDR3
<400> 70
Ala Ala Thr Thr Leu Pro Leu Tyr Ala Ala Ile Met Ala Met Thr Ser
1 5 10 15
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb25的CDR1
<400> 71
Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Pro Tyr
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb25的CDR2
<400> 72
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Val Tyr Thr
1 5
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 单域抗体S-Nb25的CDR3
<400> 73
Ala Ala Asp Phe Arg Ser Gly Ser Trp Asn Val Asp
1 5 10
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 74
gctagcaagc ttgccaccat ggcc 24
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 75
gtcgaggtcg ggggatcctt a 21
<210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 76
gagggcccgt ttctgctagc aagcttatgg tttcgaaagg cgaggag 47
<210> 77
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 77
gccagaggtc gaggtcgggg gatccttatt tctcgtttgg gtctt 45
<210> 78
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 78
ggctacggcc tgcagtgctt cgccagatat ccggaccaca tg 42
<210> 79
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 79
ggcgaagcac tgcaggccgt agcccagtgt tgtcactagt gttggcca 48
<210> 80
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 80
agccacggcg tgcagtgctt cgccagatat ccggaccaca tg 42
<210> 81
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 81
ggcgaagcac tgcacgccgt ggctcagtgt tgtcactagt gttggcca 48
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 柔性接头
<400> 82
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly
1 5
<210> 83
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 自切割接头
<400> 83
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
1 5 10 15
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25 30
<210> 84
<211> 231
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 绿色荧光蛋白
<400> 84
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Val
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Thr Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Thr Val Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr
225 230
<210> 85
<211> 231
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 蓝色荧光蛋白
<400> 85
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Ser His Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Asn Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Thr Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asp His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Leu Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr
225 230
<210> 86
<211> 231
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 黄色荧光蛋白
<400> 86
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Thr Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asp His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Leu Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr
225 230
<210> 87
<211> 117
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> GBPMT1
<400> 87
Met Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn
20 25 30
Arg Tyr Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asp His
65 70 75 80
Met Val Leu His Glu Tyr Val Asn Ala Ala Gly Ile Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Ser Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 88
<211> 117
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> GBPMT2
<400> 88
Met Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn
20 25 30
Arg Tyr Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Met Val Leu His
65 70 75 80
Glu Tyr Val Asn Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Ser Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (37)

1.一种试剂盒，其包含两种组分，即，第一组分和第二组分，其中，所述第一组分包含：
(a1)荧光蛋白的截短体，其与荧光蛋白的差异在于，荧光蛋白的C端被截短9-23个氨基酸残基；其中，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白或其他颜色的荧光蛋白，并且，所述其他颜色的荧光蛋白与所述绿色荧光蛋白的区别在于参与激发荧光的结构域不同；
(a2)如(a1)中定义的截短体的变体，所述变体与所述截短体的差异在于不超过14个氨基酸残基的置换；或
(a3)核酸分子，其包含编码如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体的核苷酸序列；
并且，所述第二组分包含：
(b1)抗荧光蛋白的单域抗体，其包含选自下列的CDR1、CDR2和CDR3：
(1)分别如SEQ ID NO:47-49所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(2)分别如SEQ ID NO:50-52所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(3)分别如SEQ ID NO:53-55所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(4)分别如SEQ ID NO:56-58所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(5)分别如SEQ ID NO:59-61所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(6)分别如SEQ ID NO:62-64所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(7)分别如SEQ ID NO:65-67所示的CDR1、CDR2和CDR3；
(8)分别如SEQ ID NO:68-70所示的CDR1、CDR2和CDR3；和
(9)分别如SEQ ID NO:71-73所示的CDR1、CDR2和CDR3；或
(b2)核酸分子，其包含编码如(b1)中定义的单域抗体的核苷酸序列；
其中，所述截短体和所述变体在游离状态下不发出荧光，但是在与所述单域抗体结合后，能够发出荧光。
2.权利要求1的试剂盒，其中，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
3.权利要求2的试剂盒，其中，所述绿色荧光蛋白具有如SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列；和/或，所述蓝色荧光蛋白具有如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列；和/或，所述黄色荧光蛋白具有如SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
4.权利要求1的试剂盒，其中，所述截短体为绿色荧光蛋白的截短体，并且其与绿色荧光蛋白的差异在于，绿色荧光蛋白的C端被截短9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基；或者，所述截短体为蓝色荧光蛋白的截短体，并且其与蓝色荧光蛋白的差异在于，蓝色荧光蛋白的C端被截短9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基；或者，所述截短体为黄色荧光蛋白的截短体，并且其与黄色荧光蛋白的差异在于，黄色荧光蛋白的C端被截短9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基。
5.权利要求4的试剂盒，其中，所述绿色荧光蛋白的截短体具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
6.权利要求1的试剂盒，其中，所述置换为保守置换。
7.权利要求1的试剂盒，其中，所述截短体或所述变体具有选自下列的氨基酸序列：SEQID NO:31-46。
8.权利要求1的试剂盒，其中，所述单域抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-9和87-88。
9.权利要求8的试剂盒，其中，所述单域抗体由所述重链可变区组成，或者包含所述重链可变区，以及任选的铰链区、Fc区、或重链恒定区。
10.权利要求1的试剂盒，其中，(a3)所述的核酸分子包含编码如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体的核苷酸序列，或者由编码如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体的核苷酸序列组成。
11.权利要求10的试剂盒，其中，(a3)所述的核酸分子为包含编码如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体的核苷酸序列的载体。
12.权利要求11的试剂盒，其中，所述载体为表达载体。
13.权利要求1的试剂盒，其中，(b2)所述的核酸分子包含编码如(b1)中定义的单域抗体的核苷酸序列，或者由编码如(b1)中定义的单域抗体的核苷酸序列组成。
14.权利要求13的试剂盒，其中，(b2)所述的核酸分子为包含编码如(b1)中定义的单域抗体的核苷酸序列的载体。
15.权利要求14的试剂盒，其中，所述载体为表达载体。
16.权利要求1的试剂盒，其中，所述试剂盒包含：
如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体，以及如(b1)中定义的单域抗体；或者
如(a1)中定义的截短体或如(a2)中定义的变体，以及(b2)所述的核酸分子；或者
如(a3)所述的核酸分子，以及如(b1)中定义的单域抗体；或者
如(a3)所述的核酸分子，以及(b2)所述的核酸分子。
17.权利要求1的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含额外的试剂。
18.权利要求17的试剂盒，其中，所述额外的试剂包含用于进行分子克隆或用于构建载体的试剂。
19.权利要求17的试剂盒，其中，所述额外的试剂选自用于进行核酸扩增的缓冲液，核酸聚合酶，核酸内切酶，连接酶，用于进行核酸纯化的试剂，用于进行核酸转化，转染或转导的试剂，核酸载体，或其任何组合。
20.一种确定目的蛋白的位置或分布的方法，其包括，使用权利要求1-19任一项的试剂盒。
21.一种确定目的蛋白的位置或分布的方法，其包括：
共表达(1)如权利要求1所定义的截短体或突变体，和(2)包含如权利要求1所定义的单域抗体和所述目的蛋白的融合蛋白；或者
共表达(3)如权利要求1所定义的单域抗体，和(4)包含如权利要求1所定义的截短体或突变体和所述目的蛋白的融合蛋白。
22.权利要求21的方法，其中，所述方法包括，在细胞内共表达(1)如权利要求1所定义的截短体或突变体和(2)包含如权利要求1所定义的单域抗体和所述目的蛋白的融合蛋白。
23.权利要求22的方法，其中，所述单域抗体连接至所述目的蛋白的N端或C端。
24.权利要求23的方法，其中，所述单域抗体通过接头或者不通过接头连接至所述目的蛋白的N端或C端。
25.权利要求22的方法，其中，所述方法还包括，使用荧光显微镜观察所述细胞。
26.权利要求21的方法，其中，所述方法包括，在细胞内共表达(3)如权利要求1所定义的单域抗体，和(4)包含如权利要求1所定义的截短体或突变体和所述目的蛋白的融合蛋白。
27.权利要求26的方法，其中，所述截短体或突变体连接至所述目的蛋白的N端或C端。
28.权利要求27的方法，其中，所述截短体或突变体通过接头或者不通过接头连接至所述目的蛋白的N端或C端。
29.权利要求26的方法，其中，所述方法还包括，使用荧光显微镜观察所述细胞。
30.一种确定是否发生细胞融合的方法，其包括，使用权利要求1-19任一项的试剂盒。
31.一种确定是否发生细胞融合的方法，其包括：
(1)在第一细胞中表达如权利要求1所定义的截短体或突变体，并且在第二细胞中表达如权利要求1所定义的单域抗体；
(2)将所述第一细胞和第二细胞共同培养，并使用荧光显微镜进行观察。
32.确定一种试剂或病原体诱导或抑制细胞融合的能力的方法，其包括下述步骤：
(1)在第一细胞中表达如权利要求1所定义的截短体或突变体，并且在第二细胞中表达如权利要求1所定义的单域抗体；
(2)将所述第一细胞和第二细胞共同培养，并使用荧光显微镜进行观察；
(3)将所述共同培养的第一细胞和第二细胞与所述试剂或病原体接触并继续培养，然后再使用荧光显微镜进行观察。
33.确定一种试剂或病原体诱导或抑制细胞融合的能力的方法，其包括下述步骤：
(1)在第一细胞中表达如权利要求1所定义的截短体或突变体，并且在第二细胞中表达如权利要求1所定义的单域抗体；
(2)将所述第一细胞和第二细胞共同培养，并与所述试剂或病原体接触，用作实验组培养物；并且，将所述第一细胞和第二细胞共同培养，且不与所述试剂或病原体接触，用作对照组培养物；
(3)使用荧光显微镜观察所述实验组培养物和对照组培养物。
34.权利要求32或33的方法，其中，所述病原体为病毒或细菌。
35.一种评估试剂促进或抑制多肽穿过细胞膜的能力的方法，其包括，使用权利要求1-19任一项的试剂盒。
36.一种评估试剂促进或抑制多肽穿过细胞膜的能力的方法，其中，所述方法包括下述步骤：
(1)在细胞中表达如权利要求1所定义的截短体或突变体；
(2)将所述细胞与如权利要求1所定义的单域抗体和所述试剂接触，用作实验组细胞；并且，将所述细胞与所述单域抗体接触，用作对照组细胞；和
(3)使用荧光显微镜观察所述实验组细胞和对照组细胞。
37.一种评估试剂促进或抑制多肽穿过细胞膜的能力的方法，其中，所述方法包括下述步骤：
(1)在细胞中表达如权利要求1所定义的单域抗体；
(2)将所述细胞与如权利要求1所定义的截短体或突变体和所述试剂接触，用作实验组细胞；并且，将所述细胞与如权利要求1所定义的截短体或突变体接触，用作对照组细胞；和
(3)使用荧光显微镜观察所述实验组细胞和对照组细胞。
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