TW201500369A - 具提高細胞轉導效率之重組蛋白質表現系統 - Google Patents

具提高細胞轉導效率之重組蛋白質表現系統 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種以宿主細胞生產具提高細胞轉導效率之重組蛋白質的表現系統，其包含一構築表現載體，該表現載體主要包含編碼DPV3之核苷酸序列及編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列，以及編碼重組蛋白質之核苷酸序列構成一核酸片段，其中該核酸片段可運作地連結在該宿主-特異性轉錄及轉譯調控單元。

Description

具提高細胞轉導效率之重組蛋白質表現系統
本發明關於一種蛋白質表現系統，具體而言，是關於具提高細胞轉導效率之重組蛋白質表現系統。
因應治療用生物製劑之需求，蛋白質生產成為生物科技產業的發展趨勢，從過去到現在真核細胞內發酵製程仍是生產重組蛋白質的主要工具。將蛋白質生產製程最佳化以降低生產成本、提高產率及維持產品品質是目前的重要研究課題。
2008年曾揭露一申請人提出之具提高產率及免疫原性之重組蛋白質表現系統，其為中華民國(台灣)第096115989號專利申請案，於2007年提出申請，已核准專利為第I328040號專利。該表現系統主要包含蛋白質轉導結構域(PTD)及Hsp40-J結構域，因而可提高欲表現之重組蛋白質之產率及免疫原性。
惟仍有開發不同特性之表現系統之需要，以符合不同蛋白質生物製劑之需求。
本發明提供一種重組蛋白質之表現系統，該表現系統為一表 現載體，該表現載體包含編碼Hsp40-J結構域及DPV3之核苷酸序列，並將編碼擬表現之重組蛋白質的核苷酸序列插入該表現載體中，其中該表現載體可轉形一宿主細胞以表現該重組蛋白質。本發明表現載體之特徵在於其生產之重組蛋白質具高細胞轉導效率之效，且該生產之重組蛋白質分泌培養液中，不需訊號細胞及其他複雜的步驟即可以單離之方式獲得。
一方面，本發明提供一種以宿主細胞生產具提高細胞轉導效率之重組蛋白質的表現系統，其包含一構築表現載體，該表現載體主要包含編碼DPV3之核苷酸序列、編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列及編碼重組蛋白質之核苷酸序列之核酸片段，其中該核酸片段可運作地連結在該宿主-特異性轉錄及轉譯調控單元。
依本發明實施例，用以表現生產之重組蛋白質之宿主細胞為原核細胞，例如大腸桿菌。
依本發明實施例，以該表現載體生產之重組蛋白質具高細胞轉導效率，可用以開發為疫苗。
另一方面，本發明提供一種生產具提高細胞轉導效率之重組蛋白質的方法，包含使用本發明之表現系統轉形一宿主細胞，自該宿主細胞分泌出所表現之重組蛋白質，再收集及單離該重組蛋白質。
根據本發明，使用包含一編碼DPV3之核苷酸序列及編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列或其表現之蛋白質作為傳送系統，可提高細胞轉導效率，因而在治療藥劑之傳輸提供了優於微脂粒的傳輸效果。
因此，在一方面，本發明提供一種傳送治療藥劑至受體細胞內的方法，包含使用一包含編碼DPV3之核苷酸序列及編碼Hsp40-J結構域之 核苷酸序列或其表現之蛋白質作為傳送系統，與治療藥劑混和，投予該受體，因而將該治療藥劑藉由該傳送系統帶入細胞內。
又一方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包含依前定義之本發明傳送系統，以及一治療藥劑。
根據本發明實施例，該治療藥劑為化學藥物、蛋白質藥物、核酸藥物、或疫苗。
本發明之其他目的及優點一部分記載於下述說明中，可由下述說明顯而易知，或者可經由本發明實施例而瞭解。應了解前文之發明內容及下文之實施方式僅為例示性及闡釋性之說明，而非如申請專利範圍般限定本發明。
圖1顯示以DsRed為欲表現之重組蛋白質，以本發明不同表現載體於大腸桿菌之表現情形，重組蛋白質之位置以括號顯示。圖1(a)顯示以SDS-PAGE分析表現重組蛋白質DPV3-DsRed(DPV3)、E162-DsRed(E162)、pVEC-DsRed(pVEC)、R11-DsRed(R11)及TP13-DsRed(TP13)之大腸桿菌細胞總溶裂物；圖1(b)顯示以SDS-PAGE分析TP13-DsRed(TP13)、E162-DsRed(E162)、DPV3-DsRed(DPV3)及pVEC-DsRed(pVEC)各組之培養基蛋白質成分，源自宿主細胞的38kDa蛋白質作為內部對照，並以箭號顯示重組蛋白質之位置；圖1(c)顯示將表現重組蛋白質TP13-DsRed(TP13)、E162-DsRed(E162)、DPV3-DsRed(DPV3)及pVEC-DsRed(pVEC)之大腸桿菌細胞總溶裂物(T)以離心分離獲得可溶性(S)及不可溶性(P)部分，以SDS-PAGE分析結果。
圖2顯示以DsRed為欲表現之重組蛋白質，以本發明不同表現載體於大腸桿菌之表現情形，重組蛋白質之位置以括號顯示。圖2(a)顯示以SDS-PAGE分析表現重組蛋白質DPV3-J-DsRed(DPV3)、E162-J-DsRed(E162)、pVEC-J-DsRed(pVEC)、R11-J-DsRed(R11)及TP13-J-DsRed(TP13)之大腸桿菌細胞總溶裂物；圖1(b)顯示以SDS-PAGE分析TP13-J-DsRed(TP13)、E162-J-DsRed(E162)、DPV3-J-DsRed(DPV3)及pVEC-J-DsRed(pVEC)各組之培養基蛋白質成分，源自宿主細胞的38kDa蛋白質作為內部對照，並以箭號顯示重組蛋白質之位置；圖1(c)顯示將表現重組蛋白質TP13-J-DsRed(TP13)、E162-J-DsRed(E162)、DPV3-J-DsRed(DPV3)及pVEC-J-DsRed(pVEC)之大腸桿菌細胞總溶裂物(T)以離心分離獲得可溶性(S)及不可溶性(P)部分，以SDS-PAGE分析結果。
圖3顯示以DsRed為欲表現之重組蛋白質，於大腸桿菌表現DsRed、J-DsRed、DPV3-DsRed及DPV3-J-DsRed之大腸桿菌細胞總溶裂物，以SDS-PAGE分析之結果，重組蛋白質之位置以括號顯示。
圖4顯示本發明表現系統之比較分析結果，於24孔盤中種植1.5×105 Huh7細胞，以波長557nm激發並於波長585nm偵測強度分析生產蛋白質之細胞轉導效率。圖4(a)是分別以不同含量(5、10、20及40μg/mL)之重組蛋白質表現系統DPV3-J-DsRed及DPV3-DsRed在與Huh7細胞反應2小時，接續偵測細胞中DsRed之螢光強度；圖4(b)是分別添加40μg/mL之重組蛋白質表現系統DPV3-J-DsRed及DPV3-DsRed反應0.5、1、2、4或6小時後偵測細胞中DsRed之螢光強度；圖4(c)分別以不同含量(0.05、0.5、2及5μg/mL)之重組蛋白質DPV3-J-DsRed及DPV3-DsRed與Huh7細胞反應2小時，接續偵 測細胞溶裂物中DsRed之螢光強度。
圖5顯示以40μg/mL本發明DPV3-J-DsRed與DsRed、J-DsRed及DPV3-DsRed與Huh7細胞反應30分鐘之比較分析結果，其中藍色表示Huh7細胞，而紅色訊號表示DsRed之螢光強度。DsRed確定無法進入細胞，但以DPV3-J-DsRed即發現細胞內有紅色螢光訊號，表示DPV3-J可將DsRed帶入細胞中。
在本文中所用之術語「重組蛋白質」意指重組分子且通常為藉由重組、化學或其他適當方法與依本發明設計用以最佳化表現之核苷酸序列共價連結(即融合)生產(表現)之蛋白質或肽序列。該重組分子可視需要經由肽連結子(peptide linker)序列在1個或數個部位進行融合。該肽序列可包括1個或多個由宿主細胞所誘導之蛋白酶斷裂之部位。
「多肽」係指較佳主要由任何20個天然胺基酸組成不論其大小之任何聚合物。雖然術語「蛋白質」常被用於指稱相對大型之蛋白質以及「肽」常被用於指稱小型多肽，但在本領域此等術語之使用常重疊。
根據本發明，本發明提供一種以宿主細胞生產具提高細胞轉導效率之重組蛋白質的表現系統，其包含一構築表現載體，該表現載體主要包含編碼DPV3之核苷酸序列、編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列及編碼重組蛋白質之核苷酸序列之核酸片段，其中該核酸片段可運作地連結在該宿主-特異性轉錄及轉譯調控單元。如本發明實施例所示，本發明表現載體之特徵在於其生產之重組蛋白質具高細胞轉導效率之效，且該生產之重組蛋白質分泌培養液中，不需訊號細胞及其他複雜的步驟即可以單離之方式獲 得。
如本發明實施例中，DPV3之胺基酸序列如序列編號：1，其中編碼DPV3之核苷酸序列之一例為如序列編號：2之核苷酸序列；或DPV3之胺基酸序列如序列編號：5，其中編碼DPV3之核苷酸序列之一例為如序列編號：6之核苷酸序列。本發明所指的DPV3胺基酸序列或編碼DPV3的核苷酸序列，亦可為序列編號：1、2、5或6的等同或等效序列。而HSP40 J結構域可選自亞型A、B及C之HSP40 J結構域所組成之族群。例如，人類基因組中41種DnaJ/HSP40蛋白質所含之J結構域或J-類似性結構域(Qiu et al.,Cell.Mol.Life Sci.63：2560-2570(2006))。依照本發明之一特定實施例，該HSP40 J結構域之胺基酸序列如序列編號：3，其中一編碼4HSP40 J結構域之核苷酸序列為序列編號：4之核苷酸序列。
本發明表現載體之特徵在於其生產之重組蛋白質具高細胞轉導效率之效，且該生產之重組蛋白質分泌培養液中，不需訊號細胞及其他複雜的步驟即可以單離之方式獲得。
本發明之表現系統，其包含一構築表現載體，該表現載體主要包含編碼DPV3之核苷酸序列、編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列及編碼重組蛋白質之核苷酸序列之核酸片段，其中該核酸片段可運作地連結在該宿主-特異性轉錄及轉譯調控單元。
因此，本發明亦提供一種生產具提高細胞轉導效率之重組蛋白質的方法，包含使用本發明之表現系統轉形一宿主細胞，自該宿主細胞分泌出所表現之重組蛋白質，再收集及單離該重組蛋白質。
根據本發明實施例，僅包含編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序 列者不具細胞穿透能力，必須同時包含編碼DPV3之核苷酸序列及編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列，所表現之重組蛋白質始具有細胞轉導效率，因而在治療藥劑之傳輸提供了優於微脂粒的傳輸效果。
因此，本發明可提供一種傳送治療藥劑至受體細胞內的方法以及醫藥組合物，利用包含編碼DPV3之核苷酸序列及編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列或其表現之蛋白質作為傳送系統，將治療藥劑送至目標細胞內。
可用於本發明之核苷酸序列，尤其是編碼本發明重組蛋白質之DNA序列，包含但不限於可由適於染色體外複製之載體所攜帶，該等載體諸如噬菌體、病毒、質體、噬質體(phagemid)、黏質體(cosmid)、酵母菌人造染色體YAC或附加體(episome)。更特定而言，編碼所期望之重組蛋白質之DNA載體，有助於本文所述之製備方法之實施及得到顯著量之重組蛋白質。該DNA序列可被插入適當載體(即含有被插入之蛋白質-編碼序列之轉錄及轉譯所需之單元之載體)。各種宿主-載體系統可被用於本發明，其中一實施例為真核細胞，例如大腸桿菌。此等亦包括用病毒感染之哺乳動物細胞系統；用病毒感染之昆蟲細胞系統；微生物諸如含酵母菌載體之酵母菌，或用噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA轉形之細菌。視所用之宿主-載體系統，可使用許多適當的轉錄及轉譯單元之一。例如，該載體可含有啟動子諸如細菌T7啟動子及可誘導之操縱子(operator)諸如lac操縱子以調控轉錄。
其他載體及構築體包括染色體DNA序列、非染色體DNA序列及合成DNA序列；細菌性質體；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母菌質體；酵母菌人造染色體(YACs)；衍生自質體與噬菌體DNA之組合之載體；衍生 自質體與病毒DNA之組合之穿梭載體(shuttle vectors)；病毒DNA諸如牛痘病毒(vaccinia)、腺病毒(adenovirus)、禽流感病毒(Avian influenza virus)及假性狂犬病病毒(pseudorabies)。不過，任何其他載體只要在所欲宿主細胞中可以複製及存活，即可用於製備核酸表現構築體。該核酸序列可於側面相接許多供單離及選殖入任何期望載體之限制核酸內切酶部位。亦加入蛋白質鑑定或純化用標籤諸如EE、(His)6、HA或MYC，以促進重組蛋白質接下來之純化。此外，該核酸表現構築體亦可含有轉錄終止子。例如，該載體可含有終止核酸序列之轉錄用之T7終止子。
依據本發明之特定實施例，重組蛋白質可藉由使用包含編碼DPV3之核苷酸序列(例如序列編號：2之核苷酸序列)、編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列(例如序列編號：4之核苷酸序列)及編碼重組蛋白質(例如紅色螢光蛋白質)之核苷酸序列，可運作地連結在宿主特異性轉錄及轉譯調控單元中構築成一表現載體，轉形宿主細胞而表現。
在另一實施例中，重組蛋白質可藉由使用包含編碼DPV3之核苷酸序列(例如序列編號：6之核苷酸序列)、編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列(例如序列編號：4之核苷酸序列)及編碼重組蛋白質(例如紅色螢光蛋白質)之核苷酸序列，可運作地連結在宿主特異性轉錄及轉譯調控單元中構築成一表現載體，轉形宿主細胞而表現。
攜帶本發明重組蛋白質之表現載體可有效率地轉導入目標細胞或該等細胞群中。轉導效率可藉由一種不同策略或不同策略之組合來監測及定量。
舉例言之，一涉及試管內檢定之途徑測量重組蛋白質被細胞 攝入之量。該檢定包括用例如放射活性原子、螢光、磷光或冷光標示物(例如螢光素、若單明、FITC)可偵測性地標記重組蛋白質，然後測量經標記之重組蛋白質之攝入量。另一選擇為將該重組蛋白質用能形成可脫離標記之酶諸如山葵過氧化酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶或螢光素酶來標記。攝入量可藉由數種習知方法來測量，該等習知方法諸如在標準細胞篩選器(例如FACS)中藉由螢光顯微鏡檢法或放射自顯影法來定量經標記之細胞。
如上文所總述，宿主細胞可用於製備目的以增殖編碼所期望之重組蛋白質之核酸。因此宿主細胞可為較高等的真核細胞諸如哺乳動物細胞或較低等的真核細胞諸如酵母菌細胞；或者宿主細胞可為原核細胞諸如細菌細胞。根據本發明之適當宿主細胞之代表例包括，但非限於，細菌細胞諸如大腸桿菌、鏈黴菌(Streptomyces)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌細胞，諸如酵母菌；昆蟲細胞，諸如果蠅(Drosophila)S2及夜蛾(Spodoptera)Sf9；動物細胞，諸如MDCK、Hep-2、CHO或COS；人類細胞，諸如Jurkat或293細胞；腺病毒；植物細胞，或者任何已適應於在試管中增殖或原樣再生之其他細胞。熟習本技術者可藉由本文之教示明白適當宿主細胞之選擇。
此外，編碼所欲重組蛋白質之核酸可藉由轉形或轉染細胞之標準技術引進宿主細胞。包括可將核酸引進宿主細胞之所有習用技術，該等習用技術包括磷酸鈣共沉澱法、由DEAE葡聚糖介導之轉染、脂質轉染法、電穿孔、顯微注射、病毒轉導及/或其組合。
本發明之重組蛋白質可藉由已知技術之適當組合而分離及 純化。此等方法包括，例如，利用溶解度之方法諸如鹽沉澱及溶劑沉澱、利用分子量差異之方法諸如透析、超過濾、凝膠過濾及SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳；利用電荷差異之方法諸如離子交換管柱層析法；利用特異性親和性之方法諸如親和性層析；利用疏水性差異之方法諸如逆向高效液相層析法；以及利用等電點差異之方法諸如等電點聚焦電泳法、金屬親和性管柱諸如Ni-NTA。
現參照下列特別的非限定性實施例更詳細地說明本發明。
實施例1：pET22b-PTD1-J-DsRed表現載體之構築
使用pET22b質體(Novagen,Madison,Wis.)建立pET22b-PTD1-J載體，其包括將PTD轉導結構域之核苷酸序列、與Hsp40-J結構域之核苷酸序列及編碼重組蛋白質DsRed之核苷酸序列。編碼大腸桿菌用之PTD1之寡核苷酸之5’端在黏接(annealing)成雙股形式之前，藉由聚核苷酸激酶而被磷醯化以插入已用NdeI及BamHI消化且藉由牛腸鹼性磷酸酯酶(CIAP)去磷醯化之pET22b質體，形成pET22b-PTD1。
HSP40-J結構域之核苷酸序列藉由使用將PCR產物選殖入pGEM-T Easy載體(Promega)中以進行單一群落選擇及DNA定序。具有HSP40-J結構域J結構域核苷酸序列之質體以BamHI及EcoRI一起消化，從pGEM-T Easy載體除去0.2kb插入之DNA片段。然後將該DNA片段插入經由BamHI/EcoRI及CIAP處理之pET22b-PTD1載體，建立pET22b-PTD1-J1表現載體。
組合式PCR
利用寡核苷酸套組合成密碼子經最適化之cDNA。在PCR反 應混合物中調整成0.5μM F1及R1以及0.05μM之F2、F3、R3、R2等等。反應條件為94℃歷2分鐘，繼而20個循環之94℃歷20秒/40℃歷40秒/72℃歷20秒以及於72℃進行延長歷5分鐘。將PCR產物選殖入供質體DNA單離及DNA定序用之pGEM-T Easy。
擴增pDsRed monomer N1(Clontech)質體上編碼DsRed蛋白質之核苷酸序列。將PCR產物選殖入pGEM-TEasy載體(Promega)中以進行單一群落選擇及DNA定序。此等編碼DsRed蛋白質之DNA側面與EcoRI及XhoI部位接合，以便於插入pET22b-PTD1-J1載體中，並構築成pET22b-PTD1-J1-DsRed表現載體(以下簡稱為pET22b-PTD-J-DsRed)。
實施例2：pET22b-CPP-DsRed及pET22b-CPP-J-DsRed表現載體之構築
選用DPV3(序列編號：1或5)、E162、pVEC、R11及TP13共5種CPP蛋白質進行表現載體之構築。將成對引子之寡核苷酸於溶液中(10mMTris-HCl,pH8.0/1mM EDTA,pH 8.0/0.3M NaCl)以60℃處理30分鐘，接續靜置60分鐘緩慢降至室溫以形成雙股，隨後插入已用NdeI及EcoRI消化pET22b質體，分別形成pET22b-DPV3、pET22b-E162、pET22b-pVEC3、pET22b-R11及pET22b-TP13。
接著將pET22b-DPV3、pET22b-E162、pET22b-pVEC3、pET22b-R11及pET22b-TP13以EcoRI及XhoI消化，並將前述之DsRed的DNA片段插入，分別形成pET22b-DPV3-DsRed、pET22b-E162-DsRed、pET22b-pVEC3-DsRed、pET22b-R11-DsRed及pET22b-TP13-DsRed。
將pET22b-DPV3、pET22b-E162、pET22b-pVEC3、 pET22b-R11及pET22b-TP13以BamHI及XhoI消化，並以相同酵素消化pET22b-PTD-J-DsRed所獲得J-DsRed之DNA片段插入，分別形成pET22b-DPV3-J-DsRed、pET22b-E162-J-DsRed、pET22b-pVEC3-J-DsRed、pET22b-R11-J-DsRed及pET22b-TP13-J-DsRed。
實施例3：重組蛋白質之表現
將實施例2製備所得之pET22b-CPP-DsRed及pET22b-CPP-J-DsRed表現載體轉形入大腸桿菌羅塞塔菌株(Novagen)勝任細胞，以2×YT培養基(0.4%葡萄糖、30μg/mL氯黴素及50μg/mL胺苄青黴素)於37℃進行培養及擴增至OD600=0.6，隨後以1mM IPTG誘導並接續培養4小時。
為分析釋放至培養基的重組蛋白質，將大腸桿菌以20,000g離心30分鐘，收集上清液並使用Centricon(Y3,Millipore)進行10倍濃縮。取30μL之蛋白質樣本，藉由12% SDS-PAGE分離。為進行細胞內之重組蛋白質之分析，以10,000g離心10分鐘收集細胞，以超音波震盪處理，並取對應至0.1 OD600單位之可溶性與不溶性蛋白質以12% SDS-PAGE分離，並以考馬斯亮藍R250染色而顯色。可溶性之CPP-DsRed及CPP-J-DsRed重組蛋白質進一步以Ni-Sepharose 6 Fast Flow親和性管柱(17-5318-02,GE)依照廠商之使用手冊進行純化。
CPP-DsRed重組蛋白質於大腸桿菌之表現情形如圖1所示，其中於大腸桿菌之細胞溶裂產物中幾乎無法偵測到R11-DsRed重組蛋白質的表現(圖1(a))，因此於後續僅分析其餘5種重組蛋白質。以超音波震盪進行均質化後，可經由離心將細胞溶裂產物區分為可溶性(S)及不溶性(P)部分， 可溶性部分發現大量DPV3-DsRed重組蛋白質之存在，另一方面，TP13-DsRed、E162-DsRed及pVEC-DsRed重組蛋白質多存在於不可溶性部分(圖1(c))。
此外，為分析IPTG誘導後培養基中蛋白質成分，以離心及0.22μm膜過濾之方式移除細胞，並以SDS-PAGE分析。如圖1(b)所示，38-kDa之蛋白質條帶(如箭頭指示)係源自宿主細胞並作為內部對照，重組蛋白質之位置則以括號顯示。
另一方面，CPP-J-DsRed重組蛋白質之表現特性與CPP-DsRed重組蛋白質近似(圖2)，兩者主要之差異在於，相較於DPV3-DsRed重組蛋白質，可在培養基中偵測到DPV3-J-DsRed，重組蛋白質表現更為顯著(圖2(b))。此分泌型之重組蛋白質可經由Ni-NTA親和性管柱分離純化且與DPV3-J-DsRed相同之N端胺基酸序列比較，顯示所測得之分泌型重組蛋白質具有完整的N端與C端序列。此分泌型之重組蛋白質約占重組蛋白質含量之10%。
又，DsRed、J-DsRed、DPV3-DsRed及DPV3-J-DsRed重組蛋白質之分析結果如圖3。
實施例4：重組蛋白質細胞轉導效率
為測量DsRed、J-DsRed、DPV3-DsRed及DPV3-J-DsRed重組蛋白質之轉導效率，進行試驗前一天於24孔培養盤每孔種植1.5×105 Huh7細胞，添加含有10% FCS之DMEM/F12培養基進行培養。試驗前將細胞之培養基移除，以不含有血清之培養基清洗2次，接續與不同濃度之重組蛋白質於不含血清之培養基中共同培養至指定時間。將未穿透進入細胞之重組蛋 白質以PBS清洗2次去除，以含有1% Triton X-100之PBS溶裂細胞而釋出進入細胞內的重組蛋白質，並以10,000g離心5分鐘以移除細胞不溶部分，取上清液，並以螢光偵測儀測量DsRed蛋白質之表現量圖4。
於24孔盤中種植1.5×105 Huh7細胞，以波長557nm激發並於波長585nm偵測強度分析生產蛋白質之細胞轉導效率。圖4(a)顯示以不同含量(5、10、20及40μg/mL)之重組蛋白質表現系統DPV3-J-DsRed及DPV3-DsRed在與Huh7細胞反應2小時，接續偵測細胞中DsRed之螢光強度；圖4(b)顯示添加40μg/mL之重組蛋白質表現系統DPV3-J-DsRed及DPV3-DsRed反應0.5、1、2、4或6小時後偵測細胞中DsRed之螢光強度；圖4(c)顯示以不同含量(0.05、0.5、2及5μg/mL)之重組蛋白質DPV3-J-DsRed及DPV3-DsRed與Huh7細胞反應2小時，接續偵測細胞溶裂物中DsRed之螢光強度。
實施例5：DPV3-J對重組蛋白質細胞轉導之作用
以40μg/mL之DPV3-J-DsRed與DsRed、J-DsRed及DPV3-DsRedDPV3與Huh7細胞反應30分鐘，以螢光顯微鏡偵測重組DsRed蛋白質穿透進入細胞的情形如圖5，其中藍色表示Huh7細胞，而紅色訊號表示DsRed之螢光強度。DsRed確定無法進入細胞，但以DPV3-J-DsRed即發現細胞內有紅色螢光訊號，表示DPV3-J可將DsRed帶入細胞中。
熟悉本技術者當知道可在不偏離廣義的本發明概念下修飾上述具體例。應了解本發明不侷限於所揭示之特定具體實施例，而意欲涵蓋如所附申請專利範圍所界定之本發明之精神及範圍內之修飾。
<110> 財團法人台灣動物科技研究所
<120> 具提高細胞轉導效率之重組蛋白質表現系統
<160>
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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Claims (19)

  1. 一種以宿主細胞生產具提高細胞轉導效率之重組蛋白質的表現系統，其包含一構築表現載體，該表現載體主要包含編碼DPV3之核苷酸序列及編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列，以及編碼重組蛋白質之核苷酸序列構成一核酸片段，其中該核酸片段可運作地連結在該宿主-特異性轉錄及轉譯調控單元。
  2. 如申請專利範圍第1項之表現系統，其中該DPV3包含序列編號：1之肽。
  3. 如申請專利範圍第1項之表現系統，其中該HSP40 J結構域選自亞型A、B及C之HSP 40 J結構域所組成之族群。
  4. 如申請專利範圍第1項之表現系統，其中該HSP40 J結構域包含序列編號：3之肽。
  5. 如申請專利範圍第1項之表現系統，其中該宿主細胞為真核細胞。
  6. 如申請專利範圍第5項之表現系統，其中該真核細胞為大腸桿菌。
  7. 如申請專利範圍第1項之表現系統，其中以該表現系統生產之重組蛋白質做為疫苗。
  8. 一種生產具提高細胞轉導效率之重組蛋白質的方法，包含使用如申請專利範圍第1至7項中任一項之表現系統轉形一宿主細胞，自該宿主細胞分泌出所表現之重組蛋白質，再收集及單離該重組蛋白質。
  9. 一種傳送治療藥劑至受體細胞內的方法，包含使用一包含編碼DPV3之核苷酸序列及編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列或其表現之蛋白質作為傳送系統，與治療藥劑混和，投予該受體，因而將該治療藥劑藉由該傳送系統帶入細胞內。
  10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該DPV3包含序列編號：1之肽。
  11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該HSP40 J結構域選自亞型A、B及C之HSP 40 J結構域所組成之族群。
  12. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該HSP40 J結構域包含序列編號：3之肽。
  13. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該宿主細胞為真核細胞。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該真核細胞為大腸桿菌。
  15. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該治療藥劑為化學藥物、蛋白質藥物、核酸藥物、或疫苗。
  16. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該治療藥劑併入該傳送系統構築為一表現載體。
  17. 一種醫藥組合物，包含一如申請專利範圍第9至15項中任一項中定義之傳送系統，以及一治療藥劑。
  18. 如申請專利範圍第17項之醫藥組合物，其中該治療藥劑為化學藥物、蛋白質藥物、核酸藥物、或疫苗。
  19. 如申請專利範圍第17項之醫藥組合物，其中該治療藥劑併入該編碼DPV3之核苷酸序列及編碼Hsp40-J結構域之核苷酸序列構築為一表現載體。
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