RU2380373C2 - ПЕПТИД DED И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И/ИЛИ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ВЕКТОР pDED - Google Patents
ПЕПТИД DED И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И/ИЛИ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ВЕКТОР pDED Download PDFInfo
- Publication number
- RU2380373C2 RU2380373C2 RU2007142850/13A RU2007142850A RU2380373C2 RU 2380373 C2 RU2380373 C2 RU 2380373C2 RU 2007142850/13 A RU2007142850/13 A RU 2007142850/13A RU 2007142850 A RU2007142850 A RU 2007142850A RU 2380373 C2 RU2380373 C2 RU 2380373C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- protein
- ded
- recombinant proteins
- identification
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 8
- 108050007496 Shikimate kinase 2 Proteins 0.000 claims description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 66
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 108050003998 Rabaptin-5 Proteins 0.000 description 13
- 102000014113 Rabaptin-5 Human genes 0.000 description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 102100034180 Protein AATF Human genes 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M Alexa Fluor 546 Chemical compound [H+].[Na+].CC1CC(C)(C)NC(C(=C2OC3=C(C4=NC(C)(C)CC(C)C4=CC3=3)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=C1C=C2C=3C(C(=C(Cl)C=1Cl)C(O)=O)=C(Cl)C=1SCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001130289 Mus musculus Rab GTPase-binding effector protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000002024 Rabaptin Human genes 0.000 description 1
- 108050009305 Rabaptin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии. Получают идентификационный пептид с аминокислотной последовательностью: Gly-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Asp-Glu-Asp-Leu-Lys-Arg-Gln. Полученный пептид применяют для идентификации, очистки или выделения содержащих его рекомбинантных белков. Для получения рекомбинантных белков с полипептидной меткой применяют экспрессирующий вектор pDED. Вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность идентификационного белка. Изобретение позволяет расширить спектр методов идентификации рекомбинантных белков. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.
Description
Область техники настоящего изобретения
Изобретение, главным образом, относится к области молекулярной биологии. В частности, настоящее изобретение относится к новому пептиду, применимому для идентификации, очистки или выделения содержащих его рекомбинантных белков. Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей указанную пептидную метку. Настоящее изобретение также относится к вектору для клонирования, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий рекомбинантный белок, слитую с сохранением одной рамки считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей указанный новый пептид.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
В ходе лабораторных, в частности молекулярно-биологических, исследований зачастую возникает необходимость детекции рекомбинантных белков. Для этой цели обычно используют специфичные антитела. Однако ввиду высокой вариабельности структуры белков такой подход к детекции требует получения специфичных антител для каждого конкретного белка.
Альтернативой является использование пептидной эпитопной метки, которую вводят в рекомбинантный белок, и антител, специфично узнающих эту метку, для детекции рекомбинантных белков, содержащих эту метку. Метка в комплексе с узнающими ее антителами также позволяет проводить и аффинную очистку содержащих ее рекомбинантных белков.
В качестве метки часто используют короткие пептиды. Использование коротких аминокислотных последовательностей позволяет минимизировать эффект присутствия посторонних аминокислот на свойства рекомбинантного белка. Размер таких эпитопных меток может варьироваться в пределах от нескольких аминокислотных остатков до десятков аминокислотных остатков. Метка может располагаться как на N-конце рекомбинантного белка (например, метка FLAGTM, 8 аминокислотных остатков, Sigma-Aldrich, Inc., каталожный номер F3290; Норр ТР et al. (1988) Bio/Technology 6:1204-10; Chubet R and Brizzard В (1996) BioTechniques 20:136-141; Hernan R et al. (2000) BioTechniques 28:789-93), так и на С-конце (например, метка recА, 144 аминокислотных остатка; Krivi GG et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:10263-7), однако возможно и расположение метки на 3'-конце. Кроме того, метка может быть встроена в неконцевых положениях аминокислотной последовательности рекомбинантного белка.
Для получения рекомбинантных белков с меткой используют плазмидные или другие векторы, которые содержат кодирующую метку нуклеотидную последовательность. Клонирование в такие векторы кДНК интересующего белка с сохранением одной рамки считывания белка и метки позволяет экспрессировать рекомбинантный белок с меткой. Как правило, для этих целей в различных экспрессирующих системах (например, в клетках Е.coli или млекопитающих с использованием различных контролирующих экспрессию вспомогательных последовательностей) используют различные векторы. Альтернативой является введение нуклеотидной последовательности, кодирующей метку, в кДНК с использованием олигонуклеотидов с помощью полимеразной цепной реакции с последующим клонированием продукта полимеразной цепной реакции в желаемый вектор для продукции рекомбинантных белков.
В качестве ближайшего аналога технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести метку FLAGTM.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Приведены нуклеотидная последовательность района полилинкера вектора pDED (фиг.1А) и для сравнения - аналогичного района вектора pBluescript SKII(+) (фиг.1Б). Показана рамка считывания кДНК lacZ, которая не нарушается в результате вставки нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид DED. Для вектора pDED нуклеотидная последовательность, комплементарная последовательности, кодирующей идентификационный пептид DED, выделена строчными буквами.
Фиг.2. Фрагмент последовательности белка Рабаптин-5-гамма мыши, включающий последовательность, идентичную последовательности пептида DED, и фрагмент последовательности белка Рабаптин-5, в котором последовательность, идентичная последовательности пептида DED, разделена на две части 43 аминокислотными остатками. Последовательность, идентичная последовательности пептида DED в белке Рабаптин-5-гамма, и фрагменты последовательности, идентичной последовательности пептида DED в белке Рабаптин-5, показаны жирным шрифтом.
Фиг.3. Вестерн-блот анализ с моноклональными антителами мыши, специфически узнающими пептид DED (А) и поликлональными анти-FLAG антителами кролика (Sigma) (Б) лизатов клеток линии COS-7 (1), лизатов клеток линии COS-7, продуцирующих белок Рабаптин-5 с С-концевым FLAG-эпитопом (2), и лизатов клеток линии COS-7, продуцирующих белок Рабаптин-5-гамма с С-концевым FLAG-эпитопом (3). Белки разделяли в 7,5% ДСН-полиакриламидном геле. Детекцию первичных антител мыши проводили с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител против иммуноглобулинов мыши (GE Healthcare, Великобритания) и системы ECL+ (GE Healthcare), детекцию первичных антител кролика проводили с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител против иммуноглобулинов кролика (GE Healthcare,) и системы ECL+(GE Healthcare). Слева показаны положения маркеров молекулярных весов белков в кДа. Эндогенно продуцируемый клетками линии COS-7 белок Рабаптин-5-гамма отмечен стрелкой.
Фиг.4. Результаты иммуноцитохимической детекции химер зеленого флуоресцентного белка с Рабаптином-5-гамма (А-А') и Рабаптина-5 (Б-Б'), продуцируемых клетками линии ВНК-21, с помощью моноклональных антител, специфически узнающих пептид DED, и химеры зеленого флуоресцентного белка с Рабаптином-5-гамма с помощью моноклональных антител, специфически узнающих пептид DED, которые были предварительно проинкубированы с 10-кратным молярным избытком пептида DED (В-В'). Показана флуоресценция зеленого флуоресцентного белка (А, Б, В) и флуоресценция вторичных антител, связанных с иммобилизованными антителами к пептиду DED (А', Б', В').
Фиг.5. Вестерн-блот анализ с анти-FLAG антителами кролика (А) и моноклональными антителами мыши к пептиду DED (Б) белков, очищенных с помощью антител к пептиду DED, иммобилизованных на Протеин G-Сефарозе из лизатов клеток линии COS-7, продуцирующих белок Рабаптин-5-гамма мыши (1) или белок Рабаптин-5 мыши (2) с С-концевыми FLAG-эпитопами. Белки разделяли в 7,5% ДСН-полиакриламидном геле. Детекцию первичных антител мыши проводили с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител против иммуноглобулинов мыши и системы ECL+, детекцию первичных антител кролика проводили с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител против иммуноглобулинов кролика и системы ECL+. Положения тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов отмечены звездочками, положение белка Рабаптин-5-гамма с С-концевым FLAG-эпитопом отмечено стрелкой.
Фиг.6. Детекция белка hVEGF-165 с С-концевым идентификационным пептидом DED в кондиционной среде клеток линии СНО, трансфицированных плазмидой pVEGF-DED. Аликвоты кондиционных сред клеток линии СНО, трансфицированных плазмидой pVEGF-DED (1) и нетрансфицированных клеток линии СНО (2), а также осажденные из них белки (3 и 4, соответственно), разделяли в 12,5% ДСН-полиакриламидном геле, белки переносили на поливинилхлоридную мембрану и проводили Вестерн-блот анализ с использованием моноклональных антител мыши, специфически узнающих идентификационный пептид (А) или поликлональных антител козы к белку hVEGF-165 (Sigma) (Б). Детекцию первичных моноклональных антител мыши проводили с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител против иммуноглобулинов мыши и системы ECL+, детекцию первичных антител козы проводили с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител против иммуноглобулинов козы и системы ECL+. Слева показаны положения маркеров молекулярных весов белков в кДа.
Раскрытие настоящего изобретения
Существует несколько необходимых условий для создания эффективной системы детекции и очистки на основе гибридных полипептидов. Первым основным требованием к добавляемой маркерной последовательности является отсутствие влияния метки на нативную укладку белка, к которому эта метка присоединяется. Во-вторых, маркерная пептидная последовательность должна быть гидрофильной и экспрессироваться по существу на поверхности белка с тем, чтобы она могла надежно взаимодействовать со своим лигандом (например, антителом). Кроме того, желательно, чтобы использование метки позволяло применять для аффинной очистки относительно простую и недорогую методику. И наконец, также предпочтительно, чтобы пептидная метка при необходимости могла быть легко удалена с получением нативного белка (Einhauer A. and Jungbauer A. (2001) J. Biochem. Biophys. Methods 49:455-465).
В соответствии с настоящим изобретением пептидная метка рекомбинантного белка представляет собой пептид DED, характеризующийся аминокислотной последовательностью Gly-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Asp-Glu-Asp-Leu-Lys-Arg-Gln.
Два содержащихся в пептиде DED высокогидрофильных трипептида определяют общее высокое значение гидрофильности С-конца пептида по широко известным шкалам (Норр Т.Р. and Woods K.R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-8; Kyte J. and Doolittle R.F. (1982) J. Mol. Biol. 157(6):105-142). Было показано, что при трехмерной укладке белка такие гидрофильные последовательности занимают положение на поверхности белковой молекулы, что определяет, помимо прочего, высокую антигенность гибридной молекулы (Норр Т.Р. (1986) J. Immunol. Methods 88:1-18).
Олигопептид согласно настоящему изобретению может кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более чем одним триплетным нуклеотидным кодоном (см. таблицу). Все эти вырожденные кодирующие молекулы нуклеиновых кислот подпадают под объем настоящего изобретения.
Одна из возможных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих пептид DED согласно настоящему изобретению, представляет собой 5'- ggcccggctc cccagcctga cgaggatctg aagaggcaa-3' (SEQ ID NO:1).
| Универсальная таблица кодирования аминокислот | ||
| Ala | gcu gcc gca gcg | аланин |
| Arg | aga agg cgu cgc cga egg | аргинин |
| Asn | aau aac | аспаргин |
| Asp | gau gac | аспаргиновая кислота |
| Cys | ugu ugc | цистеин |
| Gln | caa cag | глутамин |
| Glu | gaa gag | глутаминовая кислота |
| Gly | ggu ggc gga ggg | глицин |
| His | cau cac | гистидин |
| Ile | auu auc aua | изолейцин |
| Leu | uua uug cuu cue cua cug | лейцин |
| Lys | aaa aag | лизин |
| Met | aug | метионин |
| Phe | uuu uuc | фенилаланин |
| Pro | ccu ccc cca ccg | пролин |
| Ser | agu agc ucu ucc uca ucg | серин |
| Thr | acu асc аса acg | треонин |
| trm | uaa uag uga | стоп-кодон |
| Trp | ugg | триптофан |
| Tyr | uau uac | тирозин |
| Val | guu guc gua gug | валин |
В соответствии с настоящим изобретением вспомогательным вектором для получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих интересующий рекомбинантный белок с пептидной меткой, является вектор pDED. Вектор pDED позволяет путем простого клонирования в него кДНК интересующего белка с сохранением одной рамки считывания получить химерную кДНК, кодирующую рекомбинантный белок с меткой. Далее эта кДНК может быть переклонирована в любой желаемый вектор для продукции рекомбинантного белка. При этом нет необходимости использовать набор векторов, кодирующих метку, для различных систем экспрессии, а также синтезировать олигонуклеотиды и использовать полимеразную цепную реакцию для введения метки в состав рекомбинантного белка.
Преимуществом плазмиды pDED является то, что клонирование в нее кДНК может сопровождаться использованием так называемой «бело-голубой» селекции, удобного инструмента отбора колоний клеток, содержащих клонированную кДНК. Селекция основана на том, что сайты узнавания рестриктаз для клонирования в вектор находятся внутри последовательности, кодирующей фермент β-галактозидазу. Если плазмида не содержит вставки, то в E.coli при определенных условиях продуцируется β-галактозидаза, которая способна конвертировать хромогенный субстрат (Х-gal), что приводит к сине-голубой окраске колоний. При наличии вставки рамка считывания кДНК β-галактозидазы нарушается, фермент не продуцируется, и колонии не синеют, а сохраняют белую окраску. При проведении клонирования это позволяет по цвету колоний определить, в клетках каких из них содержится требуемая плазмида, содержащая вставку. Вектор pDED создан на основе вектора для клонирования pBluescript II SK(+), который позволяет использовать бело-голубую селекцию.
Итак, вектор предназначен для клонирования интересующих кДНК с целью получения кДНК, кодирующих рекомбинантный белок с меткой Gly-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Asp-Glu-Asp-Leu-Lys-Arg-Gln. При этом нуклеотидная последовательность, содержащаяся в векторе pDED и кодирущая метку, не сдвигает рамку считывания β-галактозидазы и не влияет на ее активность. Это позволяет при клонировании в вектор pDED интересующих кДНК проводить бело-голубую селекцию, что обеспечивает легкую идентификацию колонии с плазмидами, содержащими вставки кДНК.
Примеры
Пример 1
Конструирование вектора pDED
Нуклеотидная последовательность фрагмента вектора pDED для получения кДНК, кодирующих белки с идентификационным пептидом DED и позволяющего осуществлять цветную бело-голубую селекцию в клетках Е.coli для выявления клонов, содержащих плазмиды с кДНК, кодирующими рекомбинантные белки с идентификационным пептидом. Вектор pDED получен путем встраивания нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, кодирующей пептид DED, дополненной на 5'-конце нуклеотидной последовательностью ggagga, кодирующей дипептид глицина, и фланкированной фрагментами сайтов узнавания рестрикционных эндонуклеаз XbaI на 5'-конце и NotI на 3'-конце, в вектор pBluescript SKII(+) (Stratagene, США) между сайтами узнавания рестрикционных эндонуклеаз XbaI и NotI. При этом сохраняется открытая рамка считывания гена lacZ, кодирующего β-галактозидазу, что позволяет, как и в исходном векторе pBluescript SKII(+), осуществлять идентификацию рекомбинантных ДНК, содержащих вставку в полилинкере, на основании цветной бело-голубой селекции колоний E.coli; кДНК, кодирующая белки с идентификационным пептидом DED, полученные в векторе pDED, может быть вырезана из вектора по любому присутствующему сайту в полилинкере между сайтами узнавания между XbaI и KpnI с 5'-конца и любому сайту между NotI и SacI с 3'-конца и вставлена в любой желаемый вектор для продукции рекомбинантного белка с идентификационным пептидом DED на его С-конце (см. Пример 5). Приведены нуклеотидная последовательность района полилинкера вектора pDED (фиг.1А) и для сравнения - аналогичного района вектора pBluescript SKII(+) (фиг.1Б). Структура вектора pDED подробно проиллюстрирована на фиг.1.
Пример 2
Демонстрация специфической детекции белка, имеющего в своем составе идентификационный пептид DED, методом Вестерн-блот анализа
Для демонстрации специфической детекции белков, содержащих последовательность, идентичную последовательности пептида DED, методом Вестерн-блот анализа был использован белок Рабаптин-5-гамма мыши (последовательность кДНК GeneBank Асc. No. AF248289), который содержит внутри полипептидной цепи последовательность, идентичную последовательности пептида DED, и белок Рабаптин-5 мыши (последовательность кДНК GeneBank Асc. № D86066), который содержит внутри полипептидной цепи последовательность, идентичную последовательности пептида DED, первые 7 аминокислотных остатков которого отделены от последующих 6 аминокислотных остатков 43 аминокислотными остатками (фиг.2). Белки Рабаптин-5-гамма и Рабаптин-5 были продуцированы в клетках линии COS-7 с С-концевыми FLAG-эпитопами для возможности мониторинга присутствия белков, для чего клетки линии COS-7 были транзиторно трансфицированы плазмидными векторами для экспрессии соответствующих белков. Через 48 часов после трансфекции клетки подвергали лизису в буфере для нанесения на ДСН-полиакриамидный гель и аликвоты лизатов анализировали методом Вестерн-блоттинга с анти-FLAG антителами (Sigma, США) или с моноклональными антителами, специфически узнающими пептид DED. Анти-FLAG антитела выявили белки Рабаптин-5 и Рабаптин-5-гамма с FLAG-эпитопами в лизатах трансфицированных, но не в лизате нетрансфицированных клеток (фиг.3Б). При этом моноклональные антитела, специфически узнающие пептид DED, уверенно детектировали только белок Рабаптин-5-гамма, но не белок Рабаптин-5, в лизатах трансфицированных клеток (фиг.3А). Незначительный сигнал в лизатах клеток, продуцирующих Рабаптин-5, обусловлен присутствием эндогенного белка Рабаптин-5-гамма в клетках линии COS-7, о чем позволяет сделать вывод присутствие сигнала аналогичной интенсивности в лизатах нетрансфицированных клеток.
Пример 3
Демонстрация возможности специфической детекции белка, имеющего в своем составе идентификационный пептид DED, иммуноцитохимическими методами
Для анализа использовали клетки линии ВНК-21, транзиторно продуцирующие в результате трансфекции соответствующими плазмидами белки Рабаптин-5-гамма или Рабаптин-5, экспрессирующимися как химеры с зеленым флуоресцентным белком на N-концах. Клетки фиксировали метанолом при -20°С и после фиксации окрашивали моноклональными антителами мыши, специфически узнающими пептид DED, с их последующей детекцией антителами к иммуноглобулинам мыши, меченными флуорофором AlexaFluor546 (Invitrogen, США). Клетки, продуцирующие белки-химеры Рабаптина-5-гамма или Рабаптина-5 с зеленым флуоресцентым белком, идентифицировали по зеленому свечению (фиг.4А, Б, В). Окраску моноклональными антителами к пептиду DED выявляли по красному свечению (фиг.4А', Б', В'). Моноклональные антитела к пептиду DED способны узнавать только химеру зеленого флуоресцентного белка с Рабаптином-5-гамма (фиг.4А, А'), но не с Рабаптином-5 (фиг.4Б, Б'). О специфичности окраски антителами к пептиду DED свидетельствует полное отсутствие окраски антителами химеры белка Рабаптин-5-гамма с зеленым флуоресцентным белком при инкубации антител перед детекцией с 10-кратным молярным избытком синтетического пептида DED (фиг.4В, В').
Пример 4
Демонстрация очистки белка, имеющего в своем составе пептид DED, с помощью моноклональных антител, специфически узнающих пептид DED
Клетки линии COS-7, продуцирующих белок Рабаптин-5-гамма мыши, который содержит внутри полипептидной цепи последовательность, идентичную последовательности пептида DED, или белок Рабаптин-5 мыши, который содержит внутри полипептидной цепи последовательность, идентичную последовательности пептида DED, первые 7 аминокислотных остатка которого отделены от последующих 6 аминокислотных остатков 43 аминокислотными остатками, с С-концевыми FLAG-эпитопами (описаны в Примере 2) использовали для приготовления лизатов. Для этого клетки лизировали в трис-солевом буфере, содержащем 1% Тритона Х-100, 0,5% Нонидента Р-40 и ингибиторы протеаз, и после центрифугирования лизаты инкубировали с Протеин G-Сефарозой (GE Healthcare) с иммобилизованными на ней моноклональными антителами, специфически узнающими пептид DED, в течение 3 часов при 4°С. После инкубации Сефарозу промывали 3 раза холодным трис-солевым буфером, добавляли буфер для нанесения на ДСН-полиакриламидный гель и кипятили 5 минут для элюции белков и последующего анализа методом Вестерн-блоттинга с поликлональными анти-FLAG антителами кролика или с моноклональными антителами мыши к пептиду DED. В результате анализа было установлено, что в то время как оба белка - Рабаптин-5-гамма и Рабаптин-5 с С-концевыми FLAG-эпитопами - присутствовали в лизатах (фиг.3Б), только белок Рабаптин-5-гамма, но не Рабаптин-5, оказывался связанным с Протеин G-Сефарозой с иммобилизованными антителами к пептиду DED (фиг.5).
Пример 5
Использование вектора pDED для получения плазмиды для продукции белка с идентифицирующим пептидом на С-конце
Фрагмент кДНК фактора роста эндотелия сосудов-165 человека (hVEGF-165), содержащий 16 пар оснований 5'-нетранслируемой области и всю открытую рамку считывания, был амплифицирован в полимеразной цепной раекции с праймерами 5'-agctgaattcgggcctccgaaacc-3' и 5'-taatctagaccgcctcggcttgtcacat-3', с помощью которых были введены уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз EcoRI и XbaI на 5'- и 3'-концах кДНК, соответственно, а также кодон терминации трансляции TGA заменен на ТСТ, кодирующий остаток серина. Положение сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазы XbaI на 3'-конце кДНК было подобрано таким образом, чтобы рамка считывания кДНК hVEGF-165 и пептида DED в векторе pDED совпадали. Полученный продукт амплификации был обработан рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и XbaI и лигирован в вектор pDED, обработанный теми же ферментами. После трансформации в клетки E.coli штамма XL1Blue MRF' (Stratagene) были высеяны на селективную среду, содержащую IPTG и X-gal. Колонии E.coli, содержащие клонированную в вектор pDED кДНК hVEGF-165, были идентифицированы по белой окраске, и наличие вставке в плазмиде было подтверждено рестрикционным анализом изолированных плазмидных ДНК. Затем кДНК, кодирующая hVEGF-165 с С-концвым идентификационным пептидом DED, была субклонирована по сайтам EcoRI и NotI в вектор для экспрессии белков в клетках эукариот (плазмида pVEGF-DED).
Пример 6
Продукция белка hVEGF-165 с идентификационным пептидом DED, расположенным на С-конце, и демонстрация его идентификации с помощью моноклональных антител, специфически узнающих идентификационный пептид DED
Белок hVEGF-165 является секреторным белком, и его секреция обуславливается наличием сигнального пептида на N-конце предшественника белка. Для продукции белка hVEGF-165-DED в культуральную среду клетки линии СНО были трансфицированы плазмидой pVEGF-DED. Через 24 часа после трансфекции среда заменялась на среду, не содержащую сыворотку (бессывороточная среда). Клетки инкубировались в бессывороточной среде в течение 48 часов, после чего среда собиралась и фильтровалась через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм для удаления клеток и дебриса. Белки из полученной кондиционной среды концентрировались путем их осаждения метанолом. Для этого к аликвоте среды добавляли 3 объема метанола, и после инкубации в течение ночи при -20°С белки осаждались центрифугированием и растворялись в буфере для нанесения на ДСН-полиакриламидный гель. Аликвоты кондиционной среды и осажденных из нее белков анализировали методом Вестерн-блот анализа с моноклональными антителами, специфически узнающими идентификационный пептид DED. Для контроля использовали кондиционную среду и осажденные из нее белки нетрансфицированных клеток линии СНО. Антитела к пептиду DED детектировали белок с молекулярным весом около 25 кДа, что соответствует молекулярному весу белка hVEGF-165, продуцируемого эукариотическими клетками, только в кондиционной среде клеток, трансфицированных плазмидой pVEGF-DED и осажденных из нее белков, но не нетрансфицированных клеток (фиг.6А), что свидетельствует о продукции белка, содержащего идентификационный пептид. Для подтверждения того, что белок, содержащий идентификационный пептид, действительно является hVEGF-165, те же образцы были проанализировали методом Вестерн-блот анализа с антителами, специфически узнающими белок hVEGF-165. При использовании антител против белка hVEGF-165 был выявлен тот же характер окраски, что и с антителами к пептиду DED (фиг.6Б), что свидетельствует о том, что белок, содержащий идентификационный пептид DED, является белком hVEGF-165.
Claims (14)
1. Идентификационный пептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью Gly-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Asp-Glu-Asp-Leu-Lys-Arg-Gln.
2. Нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность идентификационного пептида по п.1.
3. Применение пептида по п.1 для идентификации рекомбинантных белков.
4. Применение по п.3, причем пептид находится на С-конце или N-конце рекомбинантного белка.
5. Применение по п.3, причем пептид находится в составе рекомбинантного белка в положении, отличном от С-конца или N-конца.
6. Применение по п.3, причем идентификация рекомбинантных белков осуществляется методом вестерн-блоттинга.
7. Применение по п.3, причем идентификация рекомбинантных белков осуществляется иммуноцитохимическими методами.
8. Применение пептида по п.1 для очистки рекомбинантных белков.
9. Применение по п.8, причем пептид находится на С-конце или N-конце рекомбинантного белка.
10. Применение по п.8, причем пептид находится в составе рекомбинантного белка в положении, отличном от С-конца или N-конца.
11. Применение по п.8, причем очистка рекомбинантных белков осуществляется с использованием метода вестерн-блоттинга.
12. Применение по п.8, причем очистка рекомбинантных белков осуществляется с использованием иммуноцитохимических методов.
13. Применение по п.8, причем при очистке рекомбинантных белков моноклональные антитела иммобилизованы на неподвижной фазе.
14. Экспрессирующий вектор pDED на основе вектора pBluescript SKII(+) для получения рекомбинантных белков, включающих в себя пептид по п.1, причем указанный вектор содержит нуклеотидную последовательность по п.2, дополненную нуклеотидной последовательностью ggagga, кодирующей дипептид глицина, на 5'-конце и фланкированную сайтами рестрикции вектора pBluescript SKII(+) ХbаI на 5'-конце и NotI на 3'-конце.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007142850/13A RU2380373C2 (ru) | 2007-11-21 | 2007-11-21 | ПЕПТИД DED И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И/ИЛИ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ВЕКТОР pDED |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007142850/13A RU2380373C2 (ru) | 2007-11-21 | 2007-11-21 | ПЕПТИД DED И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И/ИЛИ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ВЕКТОР pDED |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007142850A RU2007142850A (ru) | 2009-05-27 |
| RU2380373C2 true RU2380373C2 (ru) | 2010-01-27 |
Family
ID=41022817
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007142850/13A RU2380373C2 (ru) | 2007-11-21 | 2007-11-21 | ПЕПТИД DED И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И/ИЛИ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ВЕКТОР pDED |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2380373C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2493251C1 (ru) * | 2012-07-16 | 2013-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | Линия клеток cho[v3d], секретирующих рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов (vegf) человека, изоформа а165, с экзогенным 3×ded-эпитопом |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2182155C2 (ru) * | 1996-09-09 | 2002-05-10 | РМФ Диктажен С.А. | Получение очищенных (поли)пептидов |
-
2007
- 2007-11-21 RU RU2007142850/13A patent/RU2380373C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2182155C2 (ru) * | 1996-09-09 | 2002-05-10 | РМФ Диктажен С.А. | Получение очищенных (поли)пептидов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Бюллетень Российского Общества медицинских генетиков №2 (16). М.2002. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2493251C1 (ru) * | 2012-07-16 | 2013-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | Линия клеток cho[v3d], секретирующих рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов (vegf) человека, изоформа а165, с экзогенным 3×ded-эпитопом |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007142850A (ru) | 2009-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6316856B2 (ja) | 高収量の組換えタンパク質発現を得るためのｍｇｍｔに基づく方法 | |
| US8481492B2 (en) | Fusion protein and use thereof | |
| KR101915740B1 (ko) | 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질 | |
| ES2315022T3 (es) | Metodo para la produccion de fvii. | |
| JPH0771498B2 (ja) | アミド酵素発現のための宿主および発現ベクタ | |
| CN113195521A (zh) | Mtu ΔI-CM内含肽变体和其应用 | |
| EP1220933B1 (en) | Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes | |
| EP3334755B1 (en) | Improved cell-permeable reprogramming factor (icp-rf) recombinant protein and use thereof | |
| RU2380373C2 (ru) | ПЕПТИД DED И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И/ИЛИ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ВЕКТОР pDED | |
| EP0518933A1 (en) | Leukaemia inhibitory factor | |
| US7994148B2 (en) | Transmembrane delivery peptide and bio-material comprising the same | |
| JP3529423B2 (ja) | 抗菌性ペプチドの製造方法 | |
| US20040033603A1 (en) | Biotinylation of proteins | |
| KR102516595B1 (ko) | N-말단 아르기닌화된 단백질과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이의 용도 | |
| WO2002036762A1 (fr) | Procede de fabrication de peptides | |
| CN114195878A (zh) | 泛素突变体及其制备方法和用途 | |
| JP2026013251A (ja) | 一次繊毛タンパク質の同定方法および細胞 | |
| KR20220159110A (ko) | Hax1을 포함하는 신경세포 분화 조절용 조성물 및 신경세포 분화 탐지용 바이오마커 | |
| CN114057893A (zh) | 一种编码线粒体定位的豆蔻酰化多肽及其制备方法与应用 | |
| Gao et al. | Polyclonal antibodies to LIM proteins CRP2 and CRIP2 reveal their subcellular localizations in olfactory precursor cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL: 3-2010 FOR TAG: (73) |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20091207 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20110720 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20170503 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191122 |