JPH0771498B2 - アミド酵素発現のための宿主および発現ベクタ - Google Patents
アミド酵素発現のための宿主および発現ベクタInfo
- Publication number
- JPH0771498B2 JPH0771498B2 JP2026989A JP2698990A JPH0771498B2 JP H0771498 B2 JPH0771498 B2 JP H0771498B2 JP 2026989 A JP2026989 A JP 2026989A JP 2698990 A JP2698990 A JP 2698990A JP H0771498 B2 JPH0771498 B2 JP H0771498B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- expression vector
- sequence
- dna sequence
- host
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/17—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced ascorbate as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.17)
- C12Y114/17003—Peptidylglycine monooxygenase (1.14.17.3)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Hardware Redundancy (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 この発明は組替えDNA技術を介するα−アミド化酵素の
生成に関し、かつ特定的には高い収率でかつ高い純度で
回収可能なα−アミド化酵素を発現することができる発
現ベクタおよび宿主に関する。
生成に関し、かつ特定的には高い収率でかつ高い純度で
回収可能なα−アミド化酵素を発現することができる発
現ベクタおよび宿主に関する。
核酸コード配列からの翻訳に続く天然蛋白質の前駆物体
の細胞内処理（切断および／または官能基修飾）が明確
にされてきている。
の細胞内処理（切断および／または官能基修飾）が明確
にされてきている。
一般的に、哺乳類細胞および他の真核生物は或る翻訳後
の処理を行ない得るが、一方で原核生物はこれを行なう
ことができない。E.coli等の、或る原核生物は、組替え
DNA（rDNA）技術を用いる哺乳動物蛋白質の生成のため
の宿主として広く用いられる。なぜならばそれらは回分
発酵法で容易に増殖され得て、かつそれらが遺伝的な特
徴づけを容易に行えるからである。しかしながら、多く
の哺乳動物蛋白質がいくつかの型の翻訳後の処理を必要
とする。もしこれらの蛋白質をたとえばE.coliの遺伝子
工学によって生成しようとすれば、翻訳後の処理をしば
しば生体外で複雑な化学的工程を用いることによって達
成しなければならず、それらを大規模生産に適用すると
法外に費用がかかる。
の処理を行ない得るが、一方で原核生物はこれを行なう
ことができない。E.coli等の、或る原核生物は、組替え
DNA（rDNA）技術を用いる哺乳動物蛋白質の生成のため
の宿主として広く用いられる。なぜならばそれらは回分
発酵法で容易に増殖され得て、かつそれらが遺伝的な特
徴づけを容易に行えるからである。しかしながら、多く
の哺乳動物蛋白質がいくつかの型の翻訳後の処理を必要
とする。もしこれらの蛋白質をたとえばE.coliの遺伝子
工学によって生成しようとすれば、翻訳後の処理をしば
しば生体外で複雑な化学的工程を用いることによって達
成しなければならず、それらを大規模生産に適用すると
法外に費用がかかる。
このような翻訳後の処理の１つとして、ペプチドまたは
蛋白質のカルボキシル末端アミノ酸の特異的アミド化が
ある。多くの天然由来のホルモンおよびペプチドはその
ような修飾を受けており、蛋白質が生物的に活性である
ためには、修飾はしばしば必要である。１つの例はカル
シトニンであり、カルシトニンにおいて、通常のアミド
化されたプロリンがアミド化されていないプロリン残基
に置換されると、生物活性が3000分の１になる。十分な
活性のために翻訳後のアミド化を必要とする他の生体ペ
プチドには成長ホルモン放出因子、他のカルシトニン、
およびカルシトニン遺伝子関連ペプチドがあるが、それ
らだけではない。
蛋白質のカルボキシル末端アミノ酸の特異的アミド化が
ある。多くの天然由来のホルモンおよびペプチドはその
ような修飾を受けており、蛋白質が生物的に活性である
ためには、修飾はしばしば必要である。１つの例はカル
シトニンであり、カルシトニンにおいて、通常のアミド
化されたプロリンがアミド化されていないプロリン残基
に置換されると、生物活性が3000分の１になる。十分な
活性のために翻訳後のアミド化を必要とする他の生体ペ
プチドには成長ホルモン放出因子、他のカルシトニン、
およびカルシトニン遺伝子関連ペプチドがあるが、それ
らだけではない。
蛋白質のカルボキシル末端アミノ酸の特異的アミド化は
α−アミド化酵素によって触媒される。最大活性のため
にアミド化を必要とする多くの重要な生体蛋白質に必要
なポリペプチド配列は、たとえば遺伝子工学の手法によ
って製造することができる。しかしながら、重要でかつ
時には本質的なカルボキシル末端のアミド化はしばしば
生体外で行なわなければならない。この点で費用がかか
りかつ厄介な化学的アミド化法を避けることが望まし
く、一方、特異的アミド化を行なうためにアミド化酵素
を用いることが望ましい。しかしながら、α−アミド化
酵素は自然界において容易に入手できない。
α−アミド化酵素によって触媒される。最大活性のため
にアミド化を必要とする多くの重要な生体蛋白質に必要
なポリペプチド配列は、たとえば遺伝子工学の手法によ
って製造することができる。しかしながら、重要でかつ
時には本質的なカルボキシル末端のアミド化はしばしば
生体外で行なわなければならない。この点で費用がかか
りかつ厄介な化学的アミド化法を避けることが望まし
く、一方、特異的アミド化を行なうためにアミド化酵素
を用いることが望ましい。しかしながら、α−アミド化
酵素は自然界において容易に入手できない。
特定の組織内でのアミド化されたペプチドの存在はα−
アミド化酵素の高いレベルとは必ずしも相関しない。た
とえば、ラットの下垂体前葉組織は高いα−アミド化活
性を有するが基質となるものが知られていない。「エイ
ッパー（Eipper）等、PNAS 80、5144−5148（198
3）］。またラットの下垂体後葉組織はアミド化された
ペプチド（オキシトシンおよびバソプレシン）を含む
が、α−アミド化活性がほとんどない。［エイッパー
等、Endo 116、2497−2504（1985）］。それゆえ、個
々の組織がα−アミド化活性をテストされるまで、酵素
の存在または潜在的レベルは予測できない。
アミド化酵素の高いレベルとは必ずしも相関しない。た
とえば、ラットの下垂体前葉組織は高いα−アミド化活
性を有するが基質となるものが知られていない。「エイ
ッパー（Eipper）等、PNAS 80、5144−5148（198
3）］。またラットの下垂体後葉組織はアミド化された
ペプチド（オキシトシンおよびバソプレシン）を含む
が、α−アミド化活性がほとんどない。［エイッパー
等、Endo 116、2497−2504（1985）］。それゆえ、個
々の組織がα−アミド化活性をテストされるまで、酵素
の存在または潜在的レベルは予測できない。
天然物から得られるアミド化酵素の利用可能性に対する
さらに大きな障害は、純度が通常は低いレベルにあるこ
とである。天然物から得ることができるアミド化酵素は
蛋白質分解酵素および他の夾雑物質で汚染されている。
アミド化された生成物の効果的な回収は、これらの夾雑
物につきまとわれる酵素でＬ−アミド酸を含む基質をア
ミド化しようとすると、大きく妨げられる。特に、蛋白
質分解酵素が基質および／またはアミド化された生成物
および／またはアミド化酵素それ自体を破壊するおそれ
がある。大抵の生物学的に重要なポリペプチドはＬ−ア
ミノ酸を含むので、この蛋白質分解による損傷やアミド
化酵素試薬内の夾雑物によって引き起こされるアミド化
の妨害を受けやすい。
さらに大きな障害は、純度が通常は低いレベルにあるこ
とである。天然物から得ることができるアミド化酵素は
蛋白質分解酵素および他の夾雑物質で汚染されている。
アミド化された生成物の効果的な回収は、これらの夾雑
物につきまとわれる酵素でＬ−アミド酸を含む基質をア
ミド化しようとすると、大きく妨げられる。特に、蛋白
質分解酵素が基質および／またはアミド化された生成物
および／またはアミド化酵素それ自体を破壊するおそれ
がある。大抵の生物学的に重要なポリペプチドはＬ−ア
ミノ酸を含むので、この蛋白質分解による損傷やアミド
化酵素試薬内の夾雑物によって引き起こされるアミド化
の妨害を受けやすい。
自然界には、α−アミド化酵素の供給源がわずかしかな
く、その発生量も低くかつ純度も不十分であるため、高
い収率でかつ高い純度で回収可能なα−アミド化酵素を
大量生産する効率的な方法が必要である。
く、その発生量も低くかつ純度も不十分であるため、高
い収率でかつ高い純度で回収可能なα−アミド化酵素を
大量生産する効率的な方法が必要である。
なお、ここで用いられる「アミド化酵素」および「α−
アミド化酵素」という用語は、ペプチドを基質として、
上記基質のＣ末端アミノ酸にアミノ基がついたペプチド
アミドの形成を触媒することができるものを指す。
アミド化酵素」という用語は、ペプチドを基質として、
上記基質のＣ末端アミノ酸にアミノ基がついたペプチド
アミドの形成を触媒することができるものを指す。
発明の簡単な説明 この発明の目的は、高い収率でかつ高い純度で回収可能
なα−アミド化酵素を提供することである。
なα−アミド化酵素を提供することである。
この発明の別の目的は、高い収率でかつ高い純度で回収
可能なα−アミド化酵素を発現できる宿主生物を提供す
ることである。
可能なα−アミド化酵素を発現できる宿主生物を提供す
ることである。
この発明の別の目的はα−アミド化酵素のためのDNA配
列コードを備える発現ベクタを提供することである。
列コードを備える発現ベクタを提供することである。
この発明の別の目的は、Ｌ−アミド酸を含むペプチドの
基質、たとえば天然物から精製されるもの、化学的に合
成されるもの、または組替えDNA技術によって生成され
るもののアミド化のために、効果的なレベルまで、発現
された酵素が容易に回収されかつ精製されることができ
るように、α−アミド化酵素を発現することができる発
現ベクタを提供することである。
基質、たとえば天然物から精製されるもの、化学的に合
成されるもの、または組替えDNA技術によって生成され
るもののアミド化のために、効果的なレベルまで、発現
された酵素が容易に回収されかつ精製されることができ
るように、α−アミド化酵素を発現することができる発
現ベクタを提供することである。
この発明の別の目的は、真核宿主内でのα−アミド化酵
素の発現を誘導するのに特に適する発現ベクタを提供す
ることである。
素の発現を誘導するのに特に適する発現ベクタを提供す
ることである。
この発明の別の目的は、原核宿主内でのα−アミド化酵
素の発現を誘導するために特に適する発現ベクタを提供
することである。
素の発現を誘導するために特に適する発現ベクタを提供
することである。
この発明の別の目的は、α−アミド化酵素の効率的で費
用効率の良い大量生産のための手段を提供することであ
る。
用効率の良い大量生産のための手段を提供することであ
る。
これらおよび他の目的は、α−アミド化酵素のポリペプ
チド配列を発現できる宿主を提供することによって達成
され、前記宿主は、転写プロモータとその下流にある前
記アミド化酵素をコードする前記宿主に対して外来性で
あるDNA配列とを有する発現ベクタを備え、前記ベクタ
は前記宿主内でのポリペプチドの発現を誘導することが
できる。
チド配列を発現できる宿主を提供することによって達成
され、前記宿主は、転写プロモータとその下流にある前
記アミド化酵素をコードする前記宿主に対して外来性で
あるDNA配列とを有する発現ベクタを備え、前記ベクタ
は前記宿主内でのポリペプチドの発現を誘導することが
できる。
１つの実施例においては、α−アミド化酵素のポリペプ
チド配列を発現することができる宿主が示され、前記宿
主は、転写プロモータとその下流にある前記宿主に対し
外来であるDNA配列とを有する発現ベクタを備え、そのD
NA配列はストリンジェントな状態の下で次に示すDNA配
列とハイブリダイズすることができる。
チド配列を発現することができる宿主が示され、前記宿
主は、転写プロモータとその下流にある前記宿主に対し
外来であるDNA配列とを有する発現ベクタを備え、そのD
NA配列はストリンジェントな状態の下で次に示すDNA配
列とハイブリダイズすることができる。
別の実施例において、α−アミド化酵素のポリペプチド
配列を発現することができる宿主が示され、前記宿主は
転写プロモータとその下流にある前記宿主に対し外来で
あるDNA配列とを有する発現ベクタを備え、そのDNA配列
はストリンジェントな状態下で次に示すDNA配列とハイ
ブリダイズすることができる。
配列を発現することができる宿主が示され、前記宿主は
転写プロモータとその下流にある前記宿主に対し外来で
あるDNA配列とを有する発現ベクタを備え、そのDNA配列
はストリンジェントな状態下で次に示すDNA配列とハイ
ブリダイズすることができる。
ここにおいて用いられる「ストリンジェントな状態」と
いう用語は、62℃での２ ｘ SSC（0.3M塩化ナトリウ
ムおよび0.03Mクエン酸ナトリウム）を意味する。
いう用語は、62℃での２ ｘ SSC（0.3M塩化ナトリウ
ムおよび0.03Mクエン酸ナトリウム）を意味する。
この発明はまた、原核および真核細胞系の両方において
α−アミド化酵素の発現を誘導するための発現ベクタを
も提供する。例として、原核宿主内でα−アミド化酵素
のポリペプチド配列の発現を誘導することができる発現
ベクタが示され、前記ベクタは転写プロモータとその下
流にあるアミド化酵素コード領域を有する第１のDNA配
列とを備え、前記第１の配列は、アミド化酵素を発現す
るための本来のDNA配列に対して十分に相同であり、ス
トリンジェントな状態の下で本来の配列とハイブリダイ
ゼーションを受け、かつ前記第１の配列は前記酵素コー
ド領域の開始部分のおおよそ50ヌクレオチド以内に開始
メチオニンコドンを含む。
α−アミド化酵素の発現を誘導するための発現ベクタを
も提供する。例として、原核宿主内でα−アミド化酵素
のポリペプチド配列の発現を誘導することができる発現
ベクタが示され、前記ベクタは転写プロモータとその下
流にあるアミド化酵素コード領域を有する第１のDNA配
列とを備え、前記第１の配列は、アミド化酵素を発現す
るための本来のDNA配列に対して十分に相同であり、ス
トリンジェントな状態の下で本来の配列とハイブリダイ
ゼーションを受け、かつ前記第１の配列は前記酵素コー
ド領域の開始部分のおおよそ50ヌクレオチド以内に開始
メチオニンコドンを含む。
同様に、この発明の別の実施例において、真核宿主内で
α−アミド化酵素のポリペプチド配列の発現を誘導する
ことができる発現ベクタが示され、前記ベクタは、転写
プロモータとその下流に続くアミド化酵素コード領域を
有する第１のDNA配列とを備え、前記第１の配列は、ア
ミド化酵素を発現するための本来のDNA配列と十分に相
同であり、ストリンジェントな状態の下で本来の配列と
のハイブリダイゼーションを受け、かつ前記第１の配列
は、他の態様ではメンブレン・スパニング・ドメイン
（membrane spanning domain）をコードするであろう配
列から上流に停止コドンを含む。
α−アミド化酵素のポリペプチド配列の発現を誘導する
ことができる発現ベクタが示され、前記ベクタは、転写
プロモータとその下流に続くアミド化酵素コード領域を
有する第１のDNA配列とを備え、前記第１の配列は、ア
ミド化酵素を発現するための本来のDNA配列と十分に相
同であり、ストリンジェントな状態の下で本来の配列と
のハイブリダイゼーションを受け、かつ前記第１の配列
は、他の態様ではメンブレン・スパニング・ドメイン
（membrane spanning domain）をコードするであろう配
列から上流に停止コドンを含む。
この第１の配列には、前記プロモータからの転写によっ
て発生されるメッセンジャーRNAへのポリＡの付加を特
定する配列が続くべきである。
て発生されるメッセンジャーRNAへのポリＡの付加を特
定する配列が続くべきである。
ここで用いられる「メンブレン・スパニング・ドメイ
ン」（「membrane spanning domain」）という用語はDN
A配列であり、それは、カイトおよびドーリットル（Kyt
e＆Doolittle）のテキスト、J.Mo1.Bio1.、Vol.157、p
p.105−132（1982）によって規定されるように、（この
開示の全体にわたり、これを引用している）十分な疎水
性、長さ、構造的特性などの膜内に固定されるための性
質を備えるアミノ酸配列をコードする。たとえば、膜結
合リボソーム上で蛋白質が合成される際、これが存在す
るであろうし、またはその代わりに、メンブレン・スパ
ニング・ドメイン（membrane spanning domain）によっ
てコード化されるアミノ酸配列がそれが一部分である蛋
白質の他の領域と結合するようになるかもしれない。そ
れゆえにその配列が翻訳後に膜の疎水性環境内に挿入さ
れるようになる。フォン・ハイン（Von.Heijne）、 Sequence Analysis in Molecular Biology:Treasure Tr
ove or Trivial Pursuit、pp.81−121（Acad. Press
1987）においてメンブレン・スパニング・ドメイン（me
mbrane spanning domain）がより詳細に論じられ、その
教示はここに援用される。
ン」（「membrane spanning domain」）という用語はDN
A配列であり、それは、カイトおよびドーリットル（Kyt
e＆Doolittle）のテキスト、J.Mo1.Bio1.、Vol.157、p
p.105−132（1982）によって規定されるように、（この
開示の全体にわたり、これを引用している）十分な疎水
性、長さ、構造的特性などの膜内に固定されるための性
質を備えるアミノ酸配列をコードする。たとえば、膜結
合リボソーム上で蛋白質が合成される際、これが存在す
るであろうし、またはその代わりに、メンブレン・スパ
ニング・ドメイン（membrane spanning domain）によっ
てコード化されるアミノ酸配列がそれが一部分である蛋
白質の他の領域と結合するようになるかもしれない。そ
れゆえにその配列が翻訳後に膜の疎水性環境内に挿入さ
れるようになる。フォン・ハイン（Von.Heijne）、 Sequence Analysis in Molecular Biology:Treasure Tr
ove or Trivial Pursuit、pp.81−121（Acad. Press
1987）においてメンブレン・スパニング・ドメイン（me
mbrane spanning domain）がより詳細に論じられ、その
教示はここに援用される。
ここで用いられる塩基番号は、塩基番号を参照して明白
に述べられるいかなるDNA配列に対しても特定的に定め
られる番号である。塩基番号がこの文書内で明白に割当
てられないすべての配列に対しては、論じられている配
列によって発現される第１のコドンの第１の塩基を塩基
番号１として塩基が連続的に番号づけられ、またアミノ
酸の番号は塩基１から３によって発現されるアミノ酸を
１として連続的に番号づけられる。
に述べられるいかなるDNA配列に対しても特定的に定め
られる番号である。塩基番号がこの文書内で明白に割当
てられないすべての配列に対しては、論じられている配
列によって発現される第１のコドンの第１の塩基を塩基
番号１として塩基が連続的に番号づけられ、またアミノ
酸の番号は塩基１から３によって発現されるアミノ酸を
１として連続的に番号づけられる。
好ましい実施例の詳細な説明 この発明に従って、原核細胞系のための適切な発現ベク
タおよび真核細胞系のための適切な発現ベクタが調製さ
れる。これらのベクタ内に用いるアミド化酵素をコード
するDNAは、EPC出願第88307533.5号において教示される
ように分離されてもよく、かつその出願は公告番号第03
08067号として公告され、それの全体の開示がここに引
用により援用される。α−アミド化酵素はラットの延髄
甲状腺カルチノーマ組織またはラットの細胞系からの馴
らし培地から分離され、かつ均質なものに精製されてき
た。それは上述した親出願および現在は米国特許第４、
708,934号として発行されている、1984年９月27日出願
の親の親出願連続番号第655,366号において教示されて
おり、その優先権が請求されている。それら全体の開示
がここに引用により援用される。精製されたα−アミド
化酵素に対してアミノ酸配列が決定され、これらの配列
は、様々な放射性ラベルをつけられたオリゴヌクレオチ
ドプローブを形成するために用いられてきた。また、ア
ミド化酵素に対するcDNAを分離するためにも用いられて
きた。
タおよび真核細胞系のための適切な発現ベクタが調製さ
れる。これらのベクタ内に用いるアミド化酵素をコード
するDNAは、EPC出願第88307533.5号において教示される
ように分離されてもよく、かつその出願は公告番号第03
08067号として公告され、それの全体の開示がここに引
用により援用される。α−アミド化酵素はラットの延髄
甲状腺カルチノーマ組織またはラットの細胞系からの馴
らし培地から分離され、かつ均質なものに精製されてき
た。それは上述した親出願および現在は米国特許第４、
708,934号として発行されている、1984年９月27日出願
の親の親出願連続番号第655,366号において教示されて
おり、その優先権が請求されている。それら全体の開示
がここに引用により援用される。精製されたα−アミド
化酵素に対してアミノ酸配列が決定され、これらの配列
は、様々な放射性ラベルをつけられたオリゴヌクレオチ
ドプローブを形成するために用いられてきた。また、ア
ミド化酵素に対するcDNAを分離するためにも用いられて
きた。
分離されたcDNAは、調製されるライブラリをスクリーニ
ングするために用いられてきた。
ングするために用いられてきた。
ライブラリは、たとえばラットの延髄甲状腺カルチノー
マ組織、またはそれらより派生された細胞系の全RNA、
すなわちアミド化酵素を生成することが周知の細胞系、
たとえば、受託番号IVI 10028（メリーランド、リンチ
カム、イン・ビトロ・インターナショナル（In Vitro I
nternational,Linthicum,Maryland））（ラットのMTC組
織）またはそれより派生された細胞系IVI 10029の全RN
Aから調製される。全RNAが調製され、かつポリ−Ａ RN
Aの選別がオリゴDTセルロースを用いてなされた。cDNA
は、第１に逆転写酵素、次にDNAポリメラーゼを用いる
周知の方法によって調製された。cDNAがベクタλgt 11
においてcDNAライブラリを形成するために用いられ、か
つ組替えDNAは生体外でパッケージングされて感染性バ
クテリオファージ粒子を形成する。
マ組織、またはそれらより派生された細胞系の全RNA、
すなわちアミド化酵素を生成することが周知の細胞系、
たとえば、受託番号IVI 10028（メリーランド、リンチ
カム、イン・ビトロ・インターナショナル（In Vitro I
nternational,Linthicum,Maryland））（ラットのMTC組
織）またはそれより派生された細胞系IVI 10029の全RN
Aから調製される。全RNAが調製され、かつポリ−Ａ RN
Aの選別がオリゴDTセルロースを用いてなされた。cDNA
は、第１に逆転写酵素、次にDNAポリメラーゼを用いる
周知の方法によって調製された。cDNAがベクタλgt 11
においてcDNAライブラリを形成するために用いられ、か
つ組替えDNAは生体外でパッケージングされて感染性バ
クテリオファージ粒子を形成する。
パッケージングのための抽出物はたとえばプロメガ・バ
イオテック（Promega Biotech）またはクロンテック・
ラボラトリーズ（Clontech Laboratories）から商業的
に入手可能であり、または当該技術において周知の方法
に従って調製することができる。ファージは上記で述べ
られたように調製される放射性ラベルをつけられたオリ
ゴヌクレオチドプローブでスクリーニングされる。α−
アミド化酵素cDNA（“AE cDNA"と示す）を有するバク
テリオファージのスクリーニングは、バクテリオファー
ジのサンプルを培養し、さらにファージをニトロセルロ
ースフィルタディスク上に移すことによって達成され
た。２つまたはそれ以上の放射性ラベルをつけられたAE
特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼ
ーションにより特定を行なった。EPC出願第88307533.5
号および公告番号第0308067号として公告されたのの61
ないし64項においてAE4、AE5、AE8およびAE9で示される
オリゴヌクレオチドプローブは、上記受託番号IVI10029
から調製されたライブラリをスクリーニングするときに
特に好ましい。
イオテック（Promega Biotech）またはクロンテック・
ラボラトリーズ（Clontech Laboratories）から商業的
に入手可能であり、または当該技術において周知の方法
に従って調製することができる。ファージは上記で述べ
られたように調製される放射性ラベルをつけられたオリ
ゴヌクレオチドプローブでスクリーニングされる。α−
アミド化酵素cDNA（“AE cDNA"と示す）を有するバク
テリオファージのスクリーニングは、バクテリオファー
ジのサンプルを培養し、さらにファージをニトロセルロ
ースフィルタディスク上に移すことによって達成され
た。２つまたはそれ以上の放射性ラベルをつけられたAE
特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼ
ーションにより特定を行なった。EPC出願第88307533.5
号および公告番号第0308067号として公告されたのの61
ないし64項においてAE4、AE5、AE8およびAE9で示される
オリゴヌクレオチドプローブは、上記受託番号IVI10029
から調製されたライブラリをスクリーニングするときに
特に好ましい。
上記のオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーショ
ンスクリーニングによって分離された多くのバクテリオ
フォージからのAE cDNAの分析は、cDNAが複数個の別の
型に分離され得ることを示した。１つの型の構造が下記
にＡ型として示され、そこにおいて開始メニオニンのた
めのコドンの第１縁切を塩基１としてヌクレオチドが番
号づけされている。また、ヌクレオチド配列には、遺伝
子配列の蛋白質への翻訳のための一文字のアミノ酸コー
ドが付与されている。線の端部での丸括弧内の数字はア
ミノ酸番号を示す。
ンスクリーニングによって分離された多くのバクテリオ
フォージからのAE cDNAの分析は、cDNAが複数個の別の
型に分離され得ることを示した。１つの型の構造が下記
にＡ型として示され、そこにおいて開始メニオニンのた
めのコドンの第１縁切を塩基１としてヌクレオチドが番
号づけされている。また、ヌクレオチド配列には、遺伝
子配列の蛋白質への翻訳のための一文字のアミノ酸コー
ドが付与されている。線の端部での丸括弧内の数字はア
ミノ酸番号を示す。
上述されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
スクリーニングによって分離された別の型のcDNA配列を
以下にＢ型として示す。番号づけおよび他の申し合わせ
は上記のＡ型と同じである。
スクリーニングによって分離された別の型のcDNA配列を
以下にＢ型として示す。番号づけおよび他の申し合わせ
は上記のＡ型と同じである。
原核細胞および真核細胞の発現ベクタの両方を構成する
ために、出願者は上記態様で分離されたcDNAを用い、多
くの宿主がα−アミド化酵素の効果的な発現のためにこ
れらのベクタでトランスフェクションされた。
ために、出願者は上記態様で分離されたcDNAを用い、多
くの宿主がα−アミド化酵素の効果的な発現のためにこ
れらのベクタでトランスフェクションされた。
この発明の好ましい実施例において、発現だけでなくア
ミド化酵素の回収をも最適化するために、前述のcDNAに
対して出願者は新規の修飾をした。修飾の性質および程
度は選択される宿主および／またはベクタによって様々
であってもよい。たとえば出願者は、好ましい実施例に
おいて、他の態様ではメンブレン・スパニング・ドメイ
ン（membrane spanning domain）のためにコードするで
あろう配列の上流に停止コドンを挿入する。これらのメ
ンブレン・スパニング・ドメイン（membrane spanning
domain）の存在は組替えDNA発現系に対してあまり望ま
しくない。なぜならばそれらは宿主生体または細胞系に
おいて、発現された蛋白質が膜と結合したり、非活性に
なったりするおそれがあるからである。メンブレン・ス
パニング・ドメイン（mebrane spanning domain）の例
が、上記のＡ型およびＢ型において述べられた２つのcD
NAに現われている。（Ａ型に示される配列の塩基2275−
2355について、およびＢ型において示される配列の塩基
2587−2667について）。Ａ型およびＢ型のcDNAはこれら
のトランスメンブレンドメインのコードするアミノ酸は
実質上同一であるが、Ｂ型のcDNAの塩基1178から塩基14
92までにはイントロン領域が存在している。
ミド化酵素の回収をも最適化するために、前述のcDNAに
対して出願者は新規の修飾をした。修飾の性質および程
度は選択される宿主および／またはベクタによって様々
であってもよい。たとえば出願者は、好ましい実施例に
おいて、他の態様ではメンブレン・スパニング・ドメイ
ン（membrane spanning domain）のためにコードするで
あろう配列の上流に停止コドンを挿入する。これらのメ
ンブレン・スパニング・ドメイン（membrane spanning
domain）の存在は組替えDNA発現系に対してあまり望ま
しくない。なぜならばそれらは宿主生体または細胞系に
おいて、発現された蛋白質が膜と結合したり、非活性に
なったりするおそれがあるからである。メンブレン・ス
パニング・ドメイン（mebrane spanning domain）の例
が、上記のＡ型およびＢ型において述べられた２つのcD
NAに現われている。（Ａ型に示される配列の塩基2275−
2355について、およびＢ型において示される配列の塩基
2587−2667について）。Ａ型およびＢ型のcDNAはこれら
のトランスメンブレンドメインのコードするアミノ酸は
実質上同一であるが、Ｂ型のcDNAの塩基1178から塩基14
92までにはイントロン領域が存在している。
上記のＡ型およびＢ型のcDNAはそれぞれ約94および105k
Dの蛋白質生成物をコードする。これらの蛋白質の両方
が、動物組織抽出物または細胞系分泌物から精製された
マチユアな活性のある酵素よりも大きい。これらの第１
次翻訳生成物の各々は、コード配列の３分の１のＣ末端
内にメンブレン・スパニング・ドメイン（membrane spa
nning domain）を含むプレプロ酵素である。Ａ型のcDNA
によって発現される場合は、発現された蛋白質が約75kD
の分子量を有するように（すなわち、停止コドンが塩基
2025と2275の間に置かれる）、またＢ型のcDNAによって
発現されるときは87kDの分子量を有するように（すなわ
ち停止がおおよそ塩基2340と2690の間に置かれる）停止
コドンが挿入されることが好ましい。この分子量の１つ
の天然由来のアミド化酵素が出願人によって精製され
た。
Dの蛋白質生成物をコードする。これらの蛋白質の両方
が、動物組織抽出物または細胞系分泌物から精製された
マチユアな活性のある酵素よりも大きい。これらの第１
次翻訳生成物の各々は、コード配列の３分の１のＣ末端
内にメンブレン・スパニング・ドメイン（membrane spa
nning domain）を含むプレプロ酵素である。Ａ型のcDNA
によって発現される場合は、発現された蛋白質が約75kD
の分子量を有するように（すなわち、停止コドンが塩基
2025と2275の間に置かれる）、またＢ型のcDNAによって
発現されるときは87kDの分子量を有するように（すなわ
ち停止がおおよそ塩基2340と2690の間に置かれる）停止
コドンが挿入されることが好ましい。この分子量の１つ
の天然由来のアミド化酵素が出願人によって精製され
た。
E.coli内のマチユアなα−アミド化酵素の細胞質発現に
対して、たとえば、隠れたシグナル配列をコードする遺
伝子配列が除去されること、α−アミド化酵素に相当す
るマチユアな蛋白質の開始をコードする遺伝子配列のお
およそ50のヌクレオチド内に開始コドンが挿入されるこ
と、およびｃ末端領域内のメンブレン・スパニング・ド
メイン（membrane spanning domain）をコードする遺伝
子配列が翻訳されないことが望ましい。開始コドンはも
ちろん、酵素をコードする配列とイン−フレーム（in−
frame）であり、かついくつかの好ましい実施例におい
ては、酵素のコード領域から上流、時にはすぐ上流とす
る。
対して、たとえば、隠れたシグナル配列をコードする遺
伝子配列が除去されること、α−アミド化酵素に相当す
るマチユアな蛋白質の開始をコードする遺伝子配列のお
およそ50のヌクレオチド内に開始コドンが挿入されるこ
と、およびｃ末端領域内のメンブレン・スパニング・ド
メイン（membrane spanning domain）をコードする遺伝
子配列が翻訳されないことが望ましい。開始コドンはも
ちろん、酵素をコードする配列とイン−フレーム（in−
frame）であり、かついくつかの好ましい実施例におい
ては、酵素のコード領域から上流、時にはすぐ上流とす
る。
AE cDNAがE.coliにおいて発現されるとき、本体の遺伝
子配列が、陰か性のE.coliリボソール結合部位（“RB
S"）および開始コドンを本来の開始配列の内側に含むこ
とが見い出された。これは、Ｎ末端側で切りつめられた
アミド化酵素蛋白質の生成をもたらした。これはE.coli
内での所望する生成物の生成を妨げない一方で、正しく
開始された生成物に内容から開始された生成物が混じる
ため、組替え生成物の有用な形への処理および精製が複
雑になり、かつそれゆえに好ましくない。予期されず好
ましくない生成物を除くために、リボソーム結合部位お
よび内部開始コドンのいずれかまたは両方を除くことが
必要であった。
子配列が、陰か性のE.coliリボソール結合部位（“RB
S"）および開始コドンを本来の開始配列の内側に含むこ
とが見い出された。これは、Ｎ末端側で切りつめられた
アミド化酵素蛋白質の生成をもたらした。これはE.coli
内での所望する生成物の生成を妨げない一方で、正しく
開始された生成物に内容から開始された生成物が混じる
ため、組替え生成物の有用な形への処理および精製が複
雑になり、かつそれゆえに好ましくない。予期されず好
ましくない生成物を除くために、リボソーム結合部位お
よび内部開始コドンのいずれかまたは両方を除くことが
必要であった。
たとえば、この発明の１つの好ましい実施例において、
原核細胞系において、開始メチオニンをコードするバリ
ンコドンは、点変異によって（Ａ型またはＢ型のcDNA
の）塩基661−663で、相当する非開始バリンコドンに変
更される。この点変更の代わりに、またはそれに加え
て、他の好ましい実施例において、出願者は内部開始部
位のすぐ上流で起こるリボソーム結合部位をコードする
領域、さらにより好ましくは、起こり得るすべてのリボ
ソーム結合部位をコードする領域を、消すかまたは実質
的に修飾する。これらの手法は実質的に内部開始を排除
するためになされ、それゆえ内部開始によって発現され
た蛋白質は電気泳動に従う別個のバンドとして観察され
なくなる。
原核細胞系において、開始メチオニンをコードするバリ
ンコドンは、点変異によって（Ａ型またはＢ型のcDNA
の）塩基661−663で、相当する非開始バリンコドンに変
更される。この点変更の代わりに、またはそれに加え
て、他の好ましい実施例において、出願者は内部開始部
位のすぐ上流で起こるリボソーム結合部位をコードする
領域、さらにより好ましくは、起こり得るすべてのリボ
ソーム結合部位をコードする領域を、消すかまたは実質
的に修飾する。これらの手法は実質的に内部開始を排除
するためになされ、それゆえ内部開始によって発現され
た蛋白質は電気泳動に従う別個のバンドとして観察され
なくなる。
組替え真核宿主細胞系から、分泌される活性α−アミド
化酵素蛋白質の発現を得るために、本体の遺伝子配列の
Ｃ末端領域内に見い出されるトランスメンブレンドメイ
ンをコードする遺伝子配列を除去することが必要であっ
た。そこでＡ型のcDNAに対しては、下記に詳細に説明さ
れるように、本来の系内で本来のアミド化酵素の翻訳が
終了される所か、またはその近くに、停止コドンを導入
することによって、蛋白質コード領域の切り詰めを行な
った。またＢ型cDNAに対しては、酸素蛋白質の領域内
で、本来のＢ型アミド酵素の翻訳が終了されるところ
に、新しい停止コドンを導入した（下記参照）。何らか
の宿主細胞系において本来の遺伝子配列全体を発現する
ことが好ましいかもしれないという場合、この方法はと
られるべきではない。Ｂ型cDNAは翻訳されないイントロ
ンの特性を有する配列を含むので、ある真核宿主細胞に
おいてはこのcDNAを発現することは困難であるかもしれ
ない。これらの細胞は、対にされたスプライス供与体と
受容体部位の存在のために、Ｂ型遺伝子から効率的にmR
ANを生成しないかもしれない。受容体部位の除去はそれ
ゆえＢ型AE cDNAの効率的発現を可能とするために必要
であろう。
化酵素蛋白質の発現を得るために、本体の遺伝子配列の
Ｃ末端領域内に見い出されるトランスメンブレンドメイ
ンをコードする遺伝子配列を除去することが必要であっ
た。そこでＡ型のcDNAに対しては、下記に詳細に説明さ
れるように、本来の系内で本来のアミド化酵素の翻訳が
終了される所か、またはその近くに、停止コドンを導入
することによって、蛋白質コード領域の切り詰めを行な
った。またＢ型cDNAに対しては、酸素蛋白質の領域内
で、本来のＢ型アミド酵素の翻訳が終了されるところ
に、新しい停止コドンを導入した（下記参照）。何らか
の宿主細胞系において本来の遺伝子配列全体を発現する
ことが好ましいかもしれないという場合、この方法はと
られるべきではない。Ｂ型cDNAは翻訳されないイントロ
ンの特性を有する配列を含むので、ある真核宿主細胞に
おいてはこのcDNAを発現することは困難であるかもしれ
ない。これらの細胞は、対にされたスプライス供与体と
受容体部位の存在のために、Ｂ型遺伝子から効率的にmR
ANを生成しないかもしれない。受容体部位の除去はそれ
ゆえＢ型AE cDNAの効率的発現を可能とするために必要
であろう。
天然由来の75kDα−アミド化酵素蛋白質のカルボキシル
末端は、アミノ酸位置709（Ｂ型は814）を越えているこ
とを我々は見い出した。組替えDNA宿主細胞内で75kD蛋
白質（Ｂ型は87kD）を生成するために、アミノ酸位置71
6（Ｂ型は821）のリジンに対するコドンの変異によって
停止コドンがcDNA内に導入された。このような修飾はオ
リゴヌクレオチドの誘導部位特異的突然変異誘発を用い
てなされた。そのような突然変異誘発は様々な方法で達
成され得る。その方法は分子生物学の文献において広く
論評されてきた。我々が用いた一般的方法は、テイラー
・ジェイ・ダブリュ（Taylor,J.W.）等（1985）、Nucl.
Acids.Res.,13:8749−8764;テイラー・ジェイ・ダブリ
ュ等（1985）,Mucl.Acids Res,13:8764−8785:ナカマ
エ・ケイ（Nakamaya,K）およびエクステイン・エフ（Ec
kstein,F.）（1986）,Nucl.Acids,Res.,14:9679−9698
によって示されるものである。この方法を実現するため
に必要とされる試薬は、アマシャム・コーポレーション
（Amersham Corporation）から突然変異誘発キットの形
で入手可能である。
末端は、アミノ酸位置709（Ｂ型は814）を越えているこ
とを我々は見い出した。組替えDNA宿主細胞内で75kD蛋
白質（Ｂ型は87kD）を生成するために、アミノ酸位置71
6（Ｂ型は821）のリジンに対するコドンの変異によって
停止コドンがcDNA内に導入された。このような修飾はオ
リゴヌクレオチドの誘導部位特異的突然変異誘発を用い
てなされた。そのような突然変異誘発は様々な方法で達
成され得る。その方法は分子生物学の文献において広く
論評されてきた。我々が用いた一般的方法は、テイラー
・ジェイ・ダブリュ（Taylor,J.W.）等（1985）、Nucl.
Acids.Res.,13:8749−8764;テイラー・ジェイ・ダブリ
ュ等（1985）,Mucl.Acids Res,13:8764−8785:ナカマ
エ・ケイ（Nakamaya,K）およびエクステイン・エフ（Ec
kstein,F.）（1986）,Nucl.Acids,Res.,14:9679−9698
によって示されるものである。この方法を実現するため
に必要とされる試薬は、アマシャム・コーポレーション
（Amersham Corporation）から突然変異誘発キットの形
で入手可能である。
我々が生成した配列の変異はAAAリジンコドンをTAA停止
コドンに変える。突然変異誘発のために用いられるオリ
ゴヌクレオチドはこの変異を組入れたが、他の態様で
は、それぞれの酵素（Ａ型またはＢ型）のための変異さ
れるべき天然由来のcDNA配列と配列が同一であった。
コドンに変える。突然変異誘発のために用いられるオリ
ゴヌクレオチドはこの変異を組入れたが、他の態様で
は、それぞれの酵素（Ａ型またはＢ型）のための変異さ
れるべき天然由来のcDNA配列と配列が同一であった。
我々はまた、α−アミド化酵素蛋白質の天然由来の短縮
形が、Ｂ型酵素蛋白質に特有である蛋白質の内部領域
で、生成されることを見い出した。これは、分子質量が
約43kDである酵素生成物をもたらす。理論に制限される
ことをしないならば、イントロン領域から上流であるDN
A配列が、この著しいα−アミド化活性を示すことがで
きるポリペプチドをコードするのに十分であると考えら
れる。したがって、回収することが容易でありかつα−
アミド化活性を発現することができるポリペプチドは、
Ｂ型cDNAのイントロン領域内でどこかに位置する停止コ
ドンによって顕著に切り詰められたcDNAでコードされる
ことができる。切り詰められる位置は、イントロンのな
いＡ型のcDNAの相当する位置の前後であろう。好ましい
切り詰めは、イントロン領域の初めからおおよそ30の塩
基内に、好ましくはそこからすぐ下流に、停止コドンを
置くことからもたらされる。組替え宿主細胞内でα−ア
ミド化酵素蛋白質の１つの好ましい短縮形の生成を可能
とするために、Ｂ型cDNAについて、アミノ酸位置436に
おいてリジンコドンの代わりに停止コドンを有する修飾
されたcDNAが作られる。この変異は、Ｂ型AEcDNAのオリ
ゴヌクレオチドの誘導部位特異的突然変異誘発によって
達成された。
形が、Ｂ型酵素蛋白質に特有である蛋白質の内部領域
で、生成されることを見い出した。これは、分子質量が
約43kDである酵素生成物をもたらす。理論に制限される
ことをしないならば、イントロン領域から上流であるDN
A配列が、この著しいα−アミド化活性を示すことがで
きるポリペプチドをコードするのに十分であると考えら
れる。したがって、回収することが容易でありかつα−
アミド化活性を発現することができるポリペプチドは、
Ｂ型cDNAのイントロン領域内でどこかに位置する停止コ
ドンによって顕著に切り詰められたcDNAでコードされる
ことができる。切り詰められる位置は、イントロンのな
いＡ型のcDNAの相当する位置の前後であろう。好ましい
切り詰めは、イントロン領域の初めからおおよそ30の塩
基内に、好ましくはそこからすぐ下流に、停止コドンを
置くことからもたらされる。組替え宿主細胞内でα−ア
ミド化酵素蛋白質の１つの好ましい短縮形の生成を可能
とするために、Ｂ型cDNAについて、アミノ酸位置436に
おいてリジンコドンの代わりに停止コドンを有する修飾
されたcDNAが作られる。この変異は、Ｂ型AEcDNAのオリ
ゴヌクレオチドの誘導部位特異的突然変異誘発によって
達成された。
Ｂ型cDNAのアミノ酸位置436に停止コドンを導入するこ
とによるアミド化酵素蛋白質の短縮が、１次翻訳産物の
加水分解により切断（または生合成経路内の何らかの他
の切断）によって自然に生成されるものに最も近い蛋白
質を与える一方で、アミド化酵素蛋白質のさらなる短縮
によっても、組替えDNA宿主細胞内に活性物の生成をも
たらすことができる。我々はいくつかの他の方法でAE
cDNAを修飾して蛋白質のそのようなより短い形を作っ
た。１つの例において、我々はオリゴヌクレオチドの誘
導部位特異的突然変異誘発を用いて、Ｂ型cDNAのアミノ
酸位置396でのチロシンコドンを停止コドンに変換し
た。この変化は、cDNAが翻訳されかつ蛋白質が合成され
るとき、約39kDの蛋白質をもたらすであろう。第２の場
合において、我々はＢ型cDNAの天然由来Bam H1酵素の
認識部位を利用して、リンカー突然変異誘発によって停
止コドンを導入した。この方法は分子生物学において周
知であり、cDNAの切断に続いて２本鎖合成リンカーフラ
グメントを結合させるものである。このフラグメントは
切断されたcDNAの一方の端部に対して相補的でありかつ
切断部位のすぐ向こうにイン・フレーム（in frame）停
止コドンを導入する。我々はこの修飾を達成するために
以下の配列のオリゴヌクレオチドフラグメントを用い
た。
とによるアミド化酵素蛋白質の短縮が、１次翻訳産物の
加水分解により切断（または生合成経路内の何らかの他
の切断）によって自然に生成されるものに最も近い蛋白
質を与える一方で、アミド化酵素蛋白質のさらなる短縮
によっても、組替えDNA宿主細胞内に活性物の生成をも
たらすことができる。我々はいくつかの他の方法でAE
cDNAを修飾して蛋白質のそのようなより短い形を作っ
た。１つの例において、我々はオリゴヌクレオチドの誘
導部位特異的突然変異誘発を用いて、Ｂ型cDNAのアミノ
酸位置396でのチロシンコドンを停止コドンに変換し
た。この変化は、cDNAが翻訳されかつ蛋白質が合成され
るとき、約39kDの蛋白質をもたらすであろう。第２の場
合において、我々はＢ型cDNAの天然由来Bam H1酵素の
認識部位を利用して、リンカー突然変異誘発によって停
止コドンを導入した。この方法は分子生物学において周
知であり、cDNAの切断に続いて２本鎖合成リンカーフラ
グメントを結合させるものである。このフラグメントは
切断されたcDNAの一方の端部に対して相補的でありかつ
切断部位のすぐ向こうにイン・フレーム（in frame）停
止コドンを導入する。我々はこの修飾を達成するために
以下の配列のオリゴヌクレオチドフラグメントを用い
た。
このリンカーはアミノ酸469でのヒスチジンコドンに続
く停止コドンを導入する。cDNAの翻訳および蛋白合成
は、それが一旦この態様で修飾されてしまうと、約46kD
の蛋白質の合成をもたらす。
く停止コドンを導入する。cDNAの翻訳および蛋白合成
は、それが一旦この態様で修飾されてしまうと、約46kD
の蛋白質の合成をもたらす。
切り詰め用停止コドンの配置は、連続する塩基性残基
（通常はLys−Lys）をコードするDNA配列の約15塩基以
内が好ましく、特にそこからすぐ上流が好ましい。理論
に縛られることを意図しないならば、Ｂ型のcDNAによっ
てコードされる本来のポリペプチドは、連続する塩基残
基上またはその近くで、アミド化酵素が通常通り発現さ
れている間に、翻訳後の修飾が起こって、形成されると
考えられる。このような連続する塩基残基は、たとえ
ば、Ｂ型cDNAのイントロン領域内にリジンの連続として
見られる。また、停止コドンを挿入して上述したように
発現されたポリペプチドを切り詰めることを意図しない
ときでも、連続する塩基性アミノ酸残基をコードするDN
A配列から好ましくはすぐ上流に、通常は約20塩基以内
に、停止コドンを挿入した方がよい。これらの位置への
停止コドンの挿入によって、それらが翻訳後の蛋白合成
の後に、本来のアミド化酵素に類似するポリペプチドの
発現をおそらくもたらすであろう。
（通常はLys−Lys）をコードするDNA配列の約15塩基以
内が好ましく、特にそこからすぐ上流が好ましい。理論
に縛られることを意図しないならば、Ｂ型のcDNAによっ
てコードされる本来のポリペプチドは、連続する塩基残
基上またはその近くで、アミド化酵素が通常通り発現さ
れている間に、翻訳後の修飾が起こって、形成されると
考えられる。このような連続する塩基残基は、たとえ
ば、Ｂ型cDNAのイントロン領域内にリジンの連続として
見られる。また、停止コドンを挿入して上述したように
発現されたポリペプチドを切り詰めることを意図しない
ときでも、連続する塩基性アミノ酸残基をコードするDN
A配列から好ましくはすぐ上流に、通常は約20塩基以内
に、停止コドンを挿入した方がよい。これらの位置への
停止コドンの挿入によって、それらが翻訳後の蛋白合成
の後に、本来のアミド化酵素に類似するポリペプチドの
発現をおそらくもたらすであろう。
原核細胞系での細胞質発現のために、いかなるシグナル
配列コード領域（たとえば、前に示さたＡ型およびＢ型
cDNAの最初の塩基配列）でも除去するのが好ましく、ま
たメチオニンイニシエータコドンを、アミド化酵素をコ
ードする領域の始まりのおおよそ50ヌクレオチド以内に
挿入する。原核細胞の発現のための他の実施例は、シグ
ナル配列またはプロ酵素配列のためのいかなるコード配
列をも除去し、かつアミド化酵素をコードする領域の初
めの約50ヌクレオチド以内にイニシエータメチオニンコ
ドンを挿入する。多くの天然のAE cDNAにおいて、これ
は、ser−ｘ−ser（Ｘはpheまたはleu）をコードする領
域の初めに対応する。たとえば、Ａ型またはＢ型cDNAに
対する配列の塩基124ないし132を参照されたい。いくつ
かの実施例において、α−アミド化酵素が分泌が所望さ
れるかもしれない。この場合、シグナル配列コード領域
を保つこと、またはその代わりには同じ機能を有するヘ
テロジニアスな配列とそれを置換えることが好ましく、
それはたとえば細菌性OMP Ａ蛋白質のシグナル配列で
ある。
配列コード領域（たとえば、前に示さたＡ型およびＢ型
cDNAの最初の塩基配列）でも除去するのが好ましく、ま
たメチオニンイニシエータコドンを、アミド化酵素をコ
ードする領域の始まりのおおよそ50ヌクレオチド以内に
挿入する。原核細胞の発現のための他の実施例は、シグ
ナル配列またはプロ酵素配列のためのいかなるコード配
列をも除去し、かつアミド化酵素をコードする領域の初
めの約50ヌクレオチド以内にイニシエータメチオニンコ
ドンを挿入する。多くの天然のAE cDNAにおいて、これ
は、ser−ｘ−ser（Ｘはpheまたはleu）をコードする領
域の初めに対応する。たとえば、Ａ型またはＢ型cDNAに
対する配列の塩基124ないし132を参照されたい。いくつ
かの実施例において、α−アミド化酵素が分泌が所望さ
れるかもしれない。この場合、シグナル配列コード領域
を保つこと、またはその代わりには同じ機能を有するヘ
テロジニアスな配列とそれを置換えることが好ましく、
それはたとえば細菌性OMP Ａ蛋白質のシグナル配列で
ある。
アミド化酵素をコードするための、ここで述べられた多
くの変異およびDNA配列の切り詰めがこの発明の範囲内
で可能であること、およびそのような修飾された配列は
アミド化酵素として機能することができるポリペプチド
をコードするであろうことは、当業者には容易に明らか
となるであろう。したがって、出願者の特許請求の範囲
は特定的に述べられたDNA配列、発現ベクタおよび宿主
細胞のすべての機能的均等物を含むように解釈されるべ
きである。
くの変異およびDNA配列の切り詰めがこの発明の範囲内
で可能であること、およびそのような修飾された配列は
アミド化酵素として機能することができるポリペプチド
をコードするであろうことは、当業者には容易に明らか
となるであろう。したがって、出願者の特許請求の範囲
は特定的に述べられたDNA配列、発現ベクタおよび宿主
細胞のすべての機能的均等物を含むように解釈されるべ
きである。
この発明に従うアミド化酵素をコードするDNA配列を有
するように好ましい形に変えることができる原核細胞の
発現ベクタの例には、pKK233−,pKK322−2,pPROK−1,pk
T279,280,287,pPL lambda,pYEJ0001,pKC30,およびpPRO
K−Ｃがあるがそれらに限定されず、これらはすべて商
業的に入手可能である。この発明に従う発現ベクタでト
ランスフェクションされてもよい原核宿主には、商業的
に入手可能であるC600、LE392、RR1、DH1、およびSF8が
あるがそれらに限定されない。
するように好ましい形に変えることができる原核細胞の
発現ベクタの例には、pKK233−,pKK322−2,pPROK−1,pk
T279,280,287,pPL lambda,pYEJ0001,pKC30,およびpPRO
K−Ｃがあるがそれらに限定されず、これらはすべて商
業的に入手可能である。この発明に従う発現ベクタでト
ランスフェクションされてもよい原核宿主には、商業的
に入手可能であるC600、LE392、RR1、DH1、およびSF8が
あるがそれらに限定されない。
この発明に従うアミド化酵素をコードするDNA配列を有
するように好ましい形に変えることができる真核細胞発
現ベクタには、すべて商業的に入手可能であるpMAMNeo,
pdBPVMMTNeo,pRSV,peuk−Cl,およびpCH110があるがそれ
らに限定されない。適切な酵母ベクタもまた用いられて
もよい。好ましい真核宿主はこの発明に従う発現ベクタ
でトランスフェクションされることができ、それらには
IVI受託番号10029、Hela、CV1、C127、CHO（チャイニー
ズ・ハムスター・オーバリー）（Chinese Hamster Ovar
y）およびCOSがあるがそれらに限定されない。
するように好ましい形に変えることができる真核細胞発
現ベクタには、すべて商業的に入手可能であるpMAMNeo,
pdBPVMMTNeo,pRSV,peuk−Cl,およびpCH110があるがそれ
らに限定されない。適切な酵母ベクタもまた用いられて
もよい。好ましい真核宿主はこの発明に従う発現ベクタ
でトランスフェクションされることができ、それらには
IVI受託番号10029、Hela、CV1、C127、CHO（チャイニー
ズ・ハムスター・オーバリー）（Chinese Hamster Ovar
y）およびCOSがあるがそれらに限定されない。
例１ E.coli内でのα−アミド化酵素蛋白質の発現 E. coli
内でα−アミド化酵素を発現するために（第２図のフロ
ーチャート参照）、上記Ａ型の配列を有するcDNAフラグ
メントがKpn ＩおよびHind IIIで切断され、約2.1kb
のフラグメントが分離された。天然由来の酵素に対応す
るアミノ末端を形成し直すために、以下の配列のオリゴ
ヌクレオチドリンカーがこのDNAフラグメントに結合さ
れた。
内でα−アミド化酵素を発現するために（第２図のフロ
ーチャート参照）、上記Ａ型の配列を有するcDNAフラグ
メントがKpn ＩおよびHind IIIで切断され、約2.1kb
のフラグメントが分離された。天然由来の酵素に対応す
るアミノ末端を形成し直すために、以下の配列のオリゴ
ヌクレオチドリンカーがこのDNAフラグメントに結合さ
れた。
結果としてのフラグメントは１つのNco Ｉに適合する
接着末端および１つのHind III接着末端を有した。E.
coli発現ベクタpKK233−２はファーマシア（Pharmaci
a）から商業的に得られ、かつ制限酵素Nco ＩおよびHi
nd IIIで切断された。大きな線状フラグメントが分離
され、かつリンカーが取付けられたcDNAフラグメントに
結合された。結合した物E. coliJM105を形質転換する
ために用いられた。形質転換体はアンピシリン耐性によ
って選択され、分離されたクローンについて、制限酵素
およびDNA配列の解析により組替えプラスミドを解析
し、発現ベクタの構造（以後“pAE12"と示す）を確かめ
た。発現ベクタはハイブリッドtrp−lacプロモータを含
み、プロモータはlacリプレッサによって抑制され、ま
たイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）によって誘導
される。またイニシエータメチオニンから上流に、ベク
タはリボソームに強く結合する部位の配列を含む。
接着末端および１つのHind III接着末端を有した。E.
coli発現ベクタpKK233−２はファーマシア（Pharmaci
a）から商業的に得られ、かつ制限酵素Nco ＩおよびHi
nd IIIで切断された。大きな線状フラグメントが分離
され、かつリンカーが取付けられたcDNAフラグメントに
結合された。結合した物E. coliJM105を形質転換する
ために用いられた。形質転換体はアンピシリン耐性によ
って選択され、分離されたクローンについて、制限酵素
およびDNA配列の解析により組替えプラスミドを解析
し、発現ベクタの構造（以後“pAE12"と示す）を確かめ
た。発現ベクタはハイブリッドtrp−lacプロモータを含
み、プロモータはlacリプレッサによって抑制され、ま
たイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）によって誘導
される。またイニシエータメチオニンから上流に、ベク
タはリボソームに強く結合する部位の配列を含む。
E. coli内でα−アミド化酵素の発現を得るために、組
替え細胞は、LB−培地で、37℃で、OD600が0.4まで振と
う培養された。IPTGは最終濃度1mMまで培養液に加えら
れ、３ないし５時間の間、37℃で振とう培養された。細
胞は遠心分離によって回収され、上清は捨てられた。細
胞は、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液内に再度懸濁さ
れ、リゾチームで処理された後、超音波処理され、細胞
膜が溶解された。その後、細胞の可溶性および不溶性の
フラクションを分離するために、12,000x ｇで遠心分
離された。各フラクションはSDS−PAGEおよび蛋白染色
によって分析された。α−アミド化酵素蛋白質は不溶性
蛋白質フラクション内のIPTG誘導可能な生成物として容
易に識別された。最初の発現プラスミドはα−アミド化
酵素遺伝子配列を特定する停止コドンを含まないので、
形成された誘導可能な生成物は、α−アミド化酵素蛋白
質配列のＣ末端にベクタDNAの下流によって特定される
配列を含んでいる。加えて、誘導された不溶性蛋白質は
また、本来のアミド化酵素が小さくなったものに相当す
る蛋白質を含み、それは隠れたRBSおよび開始コドンで
蛋白質合成が内部より開始されて形成された生成物であ
った（開始コドンはα−アミド化酵素配列のアミノ酸位
置221）。
替え細胞は、LB−培地で、37℃で、OD600が0.4まで振と
う培養された。IPTGは最終濃度1mMまで培養液に加えら
れ、３ないし５時間の間、37℃で振とう培養された。細
胞は遠心分離によって回収され、上清は捨てられた。細
胞は、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液内に再度懸濁さ
れ、リゾチームで処理された後、超音波処理され、細胞
膜が溶解された。その後、細胞の可溶性および不溶性の
フラクションを分離するために、12,000x ｇで遠心分
離された。各フラクションはSDS−PAGEおよび蛋白染色
によって分析された。α−アミド化酵素蛋白質は不溶性
蛋白質フラクション内のIPTG誘導可能な生成物として容
易に識別された。最初の発現プラスミドはα−アミド化
酵素遺伝子配列を特定する停止コドンを含まないので、
形成された誘導可能な生成物は、α−アミド化酵素蛋白
質配列のＣ末端にベクタDNAの下流によって特定される
配列を含んでいる。加えて、誘導された不溶性蛋白質は
また、本来のアミド化酵素が小さくなったものに相当す
る蛋白質を含み、それは隠れたRBSおよび開始コドンで
蛋白質合成が内部より開始されて形成された生成物であ
った（開始コドンはα−アミド化酵素配列のアミノ酸位
置221）。
発現された生成物のＣ末端部分から必要でない配列を除
去するために、Ａ型配列の位置716でのリジンコドンを
変異し、この位置にTAA停止コドンを発生させた。変異
されたcDNAはkpn ＩおよびEco R1で切断され、最初の
発現ベクタpAE12内の元のKpn Ｉ−Eco R1フラグメン
トと置換えられた。類似の態様で、Ｂ型cDNA配列は相当
する位置で変異されて（アミノ酸821）、停止コドンが
形成され、変異されたＢ型cDNAからのKpn Ｉ−Eco R1
フラグメントがpAE12内で対応するフラグメントに置換
えられた。そのようにして形成された２つの発現プラス
ミドpAE24（Ａ型）およびpAE25（Ｂ型）はJM105を形質
転換するために用いられた。得られた株は、pAE12株で
上述したと同様に発現のため培養された。pAE24は約75k
Dおよび55kDの２つのIPTG誘導可能な不溶性蛋白質を生
成することが見い出され、一方pAE25は約87kDおよび67k
Dの２つのIPTG誘導可能な不溶性蛋白質を生成すること
が見い出された。再び、これらの各々に小さくなった蛋
白質が認められ、この蛋白質はＡ型またはＢ型のcDNAの
それぞれから、不必要にアミノ末端が切り取られてでき
たものであった。
去するために、Ａ型配列の位置716でのリジンコドンを
変異し、この位置にTAA停止コドンを発生させた。変異
されたcDNAはkpn ＩおよびEco R1で切断され、最初の
発現ベクタpAE12内の元のKpn Ｉ−Eco R1フラグメン
トと置換えられた。類似の態様で、Ｂ型cDNA配列は相当
する位置で変異されて（アミノ酸821）、停止コドンが
形成され、変異されたＢ型cDNAからのKpn Ｉ−Eco R1
フラグメントがpAE12内で対応するフラグメントに置換
えられた。そのようにして形成された２つの発現プラス
ミドpAE24（Ａ型）およびpAE25（Ｂ型）はJM105を形質
転換するために用いられた。得られた株は、pAE12株で
上述したと同様に発現のため培養された。pAE24は約75k
Dおよび55kDの２つのIPTG誘導可能な不溶性蛋白質を生
成することが見い出され、一方pAE25は約87kDおよび67k
Dの２つのIPTG誘導可能な不溶性蛋白質を生成すること
が見い出された。再び、これらの各々に小さくなった蛋
白質が認められ、この蛋白質はＡ型またはＢ型のcDNAの
それぞれから、不必要にアミノ末端が切り取られてでき
たものであった。
隠れた内部リボソーム結合部位および開始コドン（アミ
ノ酸位置221）で蛋白質合成が開始されるのを排除する
ために、GTG開始コドンが（GTGは細菌内でイニシエータ
metコドンとして働く）、蛋白質合成を開始できないGTT
コドン変換された。GTTコドンはその代わりに、本来の
遺伝子によってコードされるα−アミド化酵素蛋白質内
のこの位置で通常見い出されるバリンをコードする。発
現ベクタpAE24およびpAE25内で本来の配列が、変異され
たcDNAの配列に置換されて、２つの新しいベクタ、pAE3
1およびpAE32が形成された。E. coli JM105をこれら
の修飾された発現ベクタで形質転換し、得られた組替え
株からの蛋白質生成物をテストした結果、このように突
然変異を起こすことによって必要でない内部開始を効果
的に除去することが示された。pAE31を保持する宿主細
胞からのIPTG誘導生成物は75kDであることが見い出さ
れ、一方でpAE32で形質転換された細胞からのそれは87k
Dであることが見い出された。
ノ酸位置221）で蛋白質合成が開始されるのを排除する
ために、GTG開始コドンが（GTGは細菌内でイニシエータ
metコドンとして働く）、蛋白質合成を開始できないGTT
コドン変換された。GTTコドンはその代わりに、本来の
遺伝子によってコードされるα−アミド化酵素蛋白質内
のこの位置で通常見い出されるバリンをコードする。発
現ベクタpAE24およびpAE25内で本来の配列が、変異され
たcDNAの配列に置換されて、２つの新しいベクタ、pAE3
1およびpAE32が形成された。E. coli JM105をこれら
の修飾された発現ベクタで形質転換し、得られた組替え
株からの蛋白質生成物をテストした結果、このように突
然変異を起こすことによって必要でない内部開始を効果
的に除去することが示された。pAE31を保持する宿主細
胞からのIPTG誘導生成物は75kDであることが見い出さ
れ、一方でpAE32で形質転換された細胞からのそれは87k
Dであることが見い出された。
我々は、Ｂ型cDNAからの天然由来のアミド化酵素が翻訳
完了後のプロセスで約43kDの蛋白質を与えることを見い
出したので、本来、合成される酵素が終わる位置または
その近くで終端となる蛋白質の発現を可能とするＢ型
AE cDNA内の一連の変異を我々は調製した。これらの変
異のうちの２つはオリゴヌクレオチド突然変異誘発によ
って調製され、一方第３のものは上述されたようなアダ
プターリンカー変異によって作られた。これらの変異を
保持するcDNAがpAE32の対応するセグメントと置換えら
れ、JM105内に形質転換され、かつ上述したと同様の実
験において蛋白質の生成を分析した結果、切り詰められ
たα−アミド化酵素蛋白質が検出された。本来のチロシ
ンコドンを停止コドンに変えるＢ型cDNAのアミノ酸位置
396での変異によって（pAE36）、39kD酵素蛋白質が見い
出され、一方、翻訳をアミノ酸464のヒスチジンコドン
で終わらせるリンカー突然変異誘発が施されたベクタpA
E51についてはE. coliJM105の形質転換および誘導を行
なった結果、46kDの組替えα−アミド化酵素蛋白質が生
成された。
完了後のプロセスで約43kDの蛋白質を与えることを見い
出したので、本来、合成される酵素が終わる位置または
その近くで終端となる蛋白質の発現を可能とするＢ型
AE cDNA内の一連の変異を我々は調製した。これらの変
異のうちの２つはオリゴヌクレオチド突然変異誘発によ
って調製され、一方第３のものは上述されたようなアダ
プターリンカー変異によって作られた。これらの変異を
保持するcDNAがpAE32の対応するセグメントと置換えら
れ、JM105内に形質転換され、かつ上述したと同様の実
験において蛋白質の生成を分析した結果、切り詰められ
たα−アミド化酵素蛋白質が検出された。本来のチロシ
ンコドンを停止コドンに変えるＢ型cDNAのアミノ酸位置
396での変異によって（pAE36）、39kD酵素蛋白質が見い
出され、一方、翻訳をアミノ酸464のヒスチジンコドン
で終わらせるリンカー突然変異誘発が施されたベクタpA
E51についてはE. coliJM105の形質転換および誘導を行
なった結果、46kDの組替えα−アミド化酵素蛋白質が生
成された。
上述されたE. coli内で生成されたすべての組替えα−
アミド化酵素蛋白質は、細胞抽出物の不溶性フラクショ
ンで分離することができた。得られた酵素は、50mM Tr
is−HC1 pH7で速やかに希釈された後、8M尿素の処理に
よって、可溶性かつ活性にされた。pAE12を保持するE.
coliJM105が培養されかつ上述したようにIPTGで誘導
されたとき、α−アミド化酵素蛋白質は培養液１リット
ルあたり少なくとも30mgのレベルにあった。
アミド化酵素蛋白質は、細胞抽出物の不溶性フラクショ
ンで分離することができた。得られた酵素は、50mM Tr
is−HC1 pH7で速やかに希釈された後、8M尿素の処理に
よって、可溶性かつ活性にされた。pAE12を保持するE.
coliJM105が培養されかつ上述したようにIPTGで誘導
されたとき、α−アミド化酵素蛋白質は培養液１リット
ルあたり少なくとも30mgのレベルにあった。
AE発現プラスミドを保持するE. coliより生成される誘
導された不溶性蛋白質の代表的なサンプルは第３図およ
び第４図において示される。
導された不溶性蛋白質の代表的なサンプルは第３図およ
び第４図において示される。
例２ 哺乳類発現ベクタpd BPV−MMTNEO−AEA75の形成 哺乳動物細胞から、75kD Ａ型αアミド化酵素を発現し
かつ連続的に分泌する、哺乳動物発現ベクタを形成する
ために（第１図のフローチャート参照）、以下のことが
行なわれた。
かつ連続的に分泌する、哺乳動物発現ベクタを形成する
ために（第１図のフローチャート参照）、以下のことが
行なわれた。
１） 中間発現ベクタpdMMTNeo（アメリカン・タイプ・
カルチャー・コクレクション（American Type Culture
Collection）から商業的に入手可能である）（図示され
るように）がBg1 IIで切断された。線状のDANが分離さ
れかつ精製された。
カルチャー・コクレクション（American Type Culture
Collection）から商業的に入手可能である）（図示され
るように）がBg1 IIで切断された。線状のDANが分離さ
れかつ精製された。
２） 完全プレプロ配列および位置2146−2148で人為的
に形成された停止コドンTAAを含む組替えＡ型cDNAがBg1
ＩおよびXho Ｉによるシーケンシャルな切断によっ
て分離された。α−アミド化酵素に対応するフラグメン
トが、その後、分離されかつ精製された。
に形成された停止コドンTAAを含む組替えＡ型cDNAがBg1
ＩおよびXho Ｉによるシーケンシャルな切断によっ
て分離された。α−アミド化酵素に対応するフラグメン
トが、その後、分離されかつ精製された。
３） 挿入部位（Ａ型α−アミド化酵素に対応する）お
よびベクタ（pdMMTNeo）が混合され、また対応する端部
がDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて
平滑にされた。５′が突出したセグメントは、dNTPが添
加されて埋められ、３′が突出したセグメントは戻し切
断されて、それぞれ平滑末端が形成された（その代わり
としてシーケンシャルなS1ヌクレアーゼおよびクレノウ
＋dNTPを平滑末端を形成するために用いることができ
る）。平滑末端分子は、その後15℃、16時間で結合され
た。
よびベクタ（pdMMTNeo）が混合され、また対応する端部
がDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて
平滑にされた。５′が突出したセグメントは、dNTPが添
加されて埋められ、３′が突出したセグメントは戻し切
断されて、それぞれ平滑末端が形成された（その代わり
としてシーケンシャルなS1ヌクレアーゼおよびクレノウ
＋dNTPを平滑末端を形成するために用いることができ
る）。平滑末端分子は、その後15℃、16時間で結合され
た。
４） 結合されたものは次にE. coliRR I内に形質転換
された。組替えクローンが、50ug/mlアンピシリン下で
選択された。組替えクローン内の挿入の配向は１組の制
限酵素を用いて検証された。pdMMTNeo α−AEA75で示
される１つのクローン（クローン11）が、MMTプロモー
タに関して正しい配向のＡ型cDNAを有すると判断され
た。
された。組替えクローンが、50ug/mlアンピシリン下で
選択された。組替えクローン内の挿入の配向は１組の制
限酵素を用いて検証された。pdMMTNeo α−AEA75で示
される１つのクローン（クローン11）が、MMTプロモー
タに関して正しい配向のＡ型cDNAを有すると判断され
た。
５） 組替えpdMMTNeo α−AEA75（クローン11）から
のプラスミドDNAがBamH Iで切断された。線状にされた
ベクタが分離され、かつ精製され、それから５′リン酸
塩を除去するために37℃で２時間、細菌性アルカリpdBP
VMMTNeoのＢおよびBamH Iによる切断の後、分離されか
つ精製された。約8.0kbである、BPV−１ DNAのBmaH I
フラグメントは、その後、BamH Iで線状にされかつB.A.
P.処理されたpdMMTNeo α AEA75ベクタに、14℃にお
いて３時間で結合された。結合物は、E. coli RR1内
に形質転換された後、組替えクローンは50ug/mlアンピ
シリンLB寒天接地上で選択された。組替えプラスミドが
BPV DNAのための分析され、またＡ型AE cDNAのために
も分析された。制限酵素によるマッピングは、クローン
21が約17kbであることを示し、かつ予期されたように制
限酵素地図がもたらされた。この発現プラスミドは次に
マウスC127細胞内のαAEA75の発現のために用いられ
た。
のプラスミドDNAがBamH Iで切断された。線状にされた
ベクタが分離され、かつ精製され、それから５′リン酸
塩を除去するために37℃で２時間、細菌性アルカリpdBP
VMMTNeoのＢおよびBamH Iによる切断の後、分離されか
つ精製された。約8.0kbである、BPV−１ DNAのBmaH I
フラグメントは、その後、BamH Iで線状にされかつB.A.
P.処理されたpdMMTNeo α AEA75ベクタに、14℃にお
いて３時間で結合された。結合物は、E. coli RR1内
に形質転換された後、組替えクローンは50ug/mlアンピ
シリンLB寒天接地上で選択された。組替えプラスミドが
BPV DNAのための分析され、またＡ型AE cDNAのために
も分析された。制限酵素によるマッピングは、クローン
21が約17kbであることを示し、かつ予期されたように制
限酵素地図がもたらされた。この発現プラスミドは次に
マウスC127細胞内のαAEA75の発現のために用いられ
た。
６） マウスC127細胞は標準CaPO4沈降法によってpdBPV
−MMTNeo αAEA7520ugでトランスフェクションされ
た。トランスフェクションの後約２週間、形質転換され
た細胞が個々に採取され、かつ抗生物質G418を含む増殖
培地で培養された。ダルベコ変更型イーグル培地（Dulb
ecco′s Modified Eagle Meium）に10％のウシ胎児血清
（FCS）を添加したものの中で十分な活性を示すまで培
養した後、標準放射性ラベルおよび免疫沈降法を用いて
培地内のα−アミド化酵素の免疫反応性を測定するとと
もに、調製された細胞培地内の酵素活性を測定すること
によって、クローンはα−アミド化酵素を分泌する能力
が評価された。活性があり免疫反応性を有する75kDα−
アミド化酵素を分泌するクローンは大量培養され（血清
が減じしたがって外因性蛋白質のレベルを減じた細胞培
養培地に切換えられ）、細胞用に調製された培地から大
量の活性組替え酵素を生成するために用いられた。
−MMTNeo αAEA7520ugでトランスフェクションされ
た。トランスフェクションの後約２週間、形質転換され
た細胞が個々に採取され、かつ抗生物質G418を含む増殖
培地で培養された。ダルベコ変更型イーグル培地（Dulb
ecco′s Modified Eagle Meium）に10％のウシ胎児血清
（FCS）を添加したものの中で十分な活性を示すまで培
養した後、標準放射性ラベルおよび免疫沈降法を用いて
培地内のα−アミド化酵素の免疫反応性を測定するとと
もに、調製された細胞培地内の酵素活性を測定すること
によって、クローンはα−アミド化酵素を分泌する能力
が評価された。活性があり免疫反応性を有する75kDα−
アミド化酵素を分泌するクローンは大量培養され（血清
が減じしたがって外因性蛋白質のレベルを減じた細胞培
養培地に切換えられ）、細胞用に調製された培地から大
量の活性組替え酵素を生成するために用いられた。
なお、ここで用いられた用語および説明は例示としての
み述べられた実施例であり、かつ前掲の特許請求の範囲
によって規定されること発明を実施するとき、当業者が
可能であると理解するであろう多くの変更に対する制限
であるとは意図されない。
み述べられた実施例であり、かつ前掲の特許請求の範囲
によって規定されること発明を実施するとき、当業者が
可能であると理解するであろう多くの変更に対する制限
であるとは意図されない。
第１図はα−アミド化酵素のための哺乳類発現ベクタ形
成のためのフローチャートである。 第２図はα−アミド化酵素のための原核細胞発現ベクタ
形成のためのフローチャートである。 第３図は、上述したプラスミド（例１で述べられた性質
を有するもの）を保持するE. coli JM105を、培地にI
PTGを添加して（＋）培養した場合、およびIPTGを添加
せず（−）培養した場合、得られる不溶性蛋白質フラク
ションのクマーシーブルー染色SDS−PAGE電気泳動クロ
マトグラムを示す写真である。（図中Ｃは、pKK233−２
を保持するE. coli JM105の不溶性蛋白質を示す。）
第４図は第３図に示されるゲルのウェスタンブロットを
示す写真であり、蛋白質がニトロセルロースへ移され、
そのフィルムがウサギの抗AE抗血清およびアルカリ性ホ
スファターゼ複合抗ウサギIgで処理され、アルカリ性ホ
スファターゼのための色素染色が行なわれたものであ
る。
成のためのフローチャートである。 第２図はα−アミド化酵素のための原核細胞発現ベクタ
形成のためのフローチャートである。 第３図は、上述したプラスミド（例１で述べられた性質
を有するもの）を保持するE. coli JM105を、培地にI
PTGを添加して（＋）培養した場合、およびIPTGを添加
せず（−）培養した場合、得られる不溶性蛋白質フラク
ションのクマーシーブルー染色SDS−PAGE電気泳動クロ
マトグラムを示す写真である。（図中Ｃは、pKK233−２
を保持するE. coli JM105の不溶性蛋白質を示す。）
第４図は第３図に示されるゲルのウェスタンブロットを
示す写真であり、蛋白質がニトロセルロースへ移され、
そのフィルムがウサギの抗AE抗血清およびアルカリ性ホ
スファターゼ複合抗ウサギIgで処理され、アルカリ性ホ
スファターゼのための色素染色が行なわれたものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ゲアリ・アージディ・ボードリー アメリカ合衆国、ニュー・ジャージー州モ ントクレアー インウッド・アベニュー、 81 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，86（1989）Ｐ．735−739
Claims (16)
- 【請求項１】α−アミド化酵素のポリペプチド配列を発
現することができる宿主であって、 転写プロモータと、その下流に続く、ストリンジェント
な状態下で下記に示すＡ型DNA配列およびＢ型DNA配列か
らなる群から選択されるDNA配列とハイブリッド形成す
ることができる前記宿主に対して外来性であるDNA配列
とを有する発現ベクタを備え、 前記宿主に対して外来性であるDNA配列は、他の態様で
はメンブレン・スパニング・ドメイン（membrane spann
ing domain）をコードするような配列から上流に停止コ
ドンを含む、宿主。 - 【請求項２】原核細胞においてα−アミド化酵素のポリ
ペプチド配列の発現を誘導することができる発現ベクタ
であって、 転写プロモータと、その下流に続く、アミド化酵素コー
ド領域を有する第１のDNA配列とを備え、 前記第１の配列は、天然のアミド化酵素を発現するため
の天然のDNA配列と十分に相同であり、ストリンジェン
トな状態の下で下記に示すＡ型DNA配列およびＢ型DNA配
列からなる群から選択されるDNA配列とハイブリッド形
成することができ、 前記第１の配列は、前記酵素コード領域の開始部分の約
50ヌクレオチド以内に開始メチオニンコドンを含む、発
現ベクタ。 - 【請求項３】前記酵素コード領域が、他の態様ではメン
ブレン・スパニング、ドメイン（membrane spanning do
main）をコードするような配列から上流において停止コ
ドンにより切り詰められていることを特徴とする、請求
項２記載の発現ベクタ。 - 【請求項４】内部開始部位が、前記開始メチオニンコド
ンと前記酵素コード領域の終点との間に存在しないこと
を特徴とする、請求項２記載の発現ベクタ。 - 【請求項５】前記第１のDNA配列が、ストリンジェント
な状態下で、前記Ａ型DNA配列とハイブリッド形成する
ことを特徴とする、請求項２記載の発現ベクタ。 - 【請求項６】前記第１のDNA配列が、ストリンジェント
な状態下で、前記Ｂ型DNA配列とハイブリッド形成する
ことを特徴とする、請求項２記載の発現ベクタ。 - 【請求項７】前記酵素コード領域の塩基2025と2275の間
に停止コドンを含む、請求項５記載の発現ベクタ。 - 【請求項８】真核細胞においてα−アミド化酵素のポリ
ペプチド配列の発現を誘導することができる発現ベクタ
であって、 転写プロモータと、その下流に続く、アミド化酵素コー
ド領域を有する第１のDNA配列とを備え、 前記第１の配列は、天然のアミド化酵素を発現するため
の天然のDNA配列と十分に相同であり、ストリンジェン
トな状態の下で下記に示すＡ型DNA配列およびＢ型DNA配
列からなる群から選択されるDNA配列とハイブリッド形
成することができ、 前記第１の配列は、他の態様ではメンブレン・スパニン
グ・ドメイン（membrane spanning domain）をコードす
るような配列から上流において停止コドンを含む、発現
ベクタ。 - 【請求項９】前記第１のDNA配列が、ストリンジェント
な状態下で、前記Ａ型DNA配列とハイブリッド形成する
ことを特徴とする、請求項８記載の発現ベクタ。 - 【請求項１０】前記第１のDNA配列が、ストリンジェン
トな状態下で、前記Ｂ型DNA配列とハイブリッド形成す
ることを特徴とする、請求項８記載の発現ベクタ。 - 【請求項１１】前記酵素コード領域が、塩基2025と2275
の間に停止コドンを含む、請求項９記載の発現ベクタ。 - 【請求項１２】pdBPVMMTNeo、pSV2、pRSV、pMAMNeo、pe
uK−Cl、pCH110およびこれらの誘導体からなる群から選
択される発現系内に、前記第１のDNA配列を結合するこ
とによって形成されることを特徴とする、請求項８記載
の発現ベクタ。 - 【請求項１３】請求項２の発現ベクタを備える、原核細
胞宿主。 - 【請求項１４】請求項９の発現ベクタを備える、真核細
胞宿主。 - 【請求項１５】前記宿主が、IVI受託番号10029、Hela、
CV1、C127、CHO（チャイニーズ・ハムスター・オーバリ
ー）およびCOSからなる群から選択される、請求項14記
載の宿主。 - 【請求項１６】前記酵素コード領域が、塩基2340と2690
の間に停止コドンを含む、請求項６または10記載の発現
ベクタ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/307,366 US5789234A (en) | 1987-08-14 | 1989-02-06 | Expression systems for amidating enzyme |
| US307,366 | 1989-02-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0541982A JPH0541982A (ja) | 1993-02-23 |
| JPH0771498B2 true JPH0771498B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=23189439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2026989A Expired - Lifetime JPH0771498B2 (ja) | 1989-02-06 | 1990-02-06 | アミド酵素発現のための宿主および発現ベクタ |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5789234A (ja) |
| EP (1) | EP0382403B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0771498B2 (ja) |
| KR (1) | KR0157983B1 (ja) |
| AT (1) | ATE283922T1 (ja) |
| CA (1) | CA2009306C (ja) |
| DE (1) | DE69034179T2 (ja) |
| DK (1) | DK0382403T3 (ja) |
| ES (1) | ES2235149T3 (ja) |
| FI (1) | FI110517B (ja) |
| HU (1) | HU220464B1 (ja) |
| LT (1) | LT4077B (ja) |
| NO (1) | NO900531L (ja) |
| RU (1) | RU2129606C1 (ja) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5789234A (en) * | 1987-08-14 | 1998-08-04 | Unigene Laboratories, Inc. | Expression systems for amidating enzyme |
| US5912014A (en) * | 1996-03-15 | 1999-06-15 | Unigene Laboratories, Inc. | Oral salmon calcitonin pharmaceutical products |
| ATE522598T1 (de) | 1997-04-16 | 2011-09-15 | Unigene Lab Inc | Direkte expression von peptiden in nährmedien |
| US8088734B2 (en) | 2003-01-21 | 2012-01-03 | Unigene Laboratories Inc. | Oral delivery of peptides |
| AU2004282492B2 (en) * | 2003-09-25 | 2011-02-10 | Monsanto Technology Llc | Prevention of incorporation of non-standard amino acids into protein |
| US7648965B2 (en) * | 2004-05-14 | 2010-01-19 | Unigene Laboratories Inc. | Method for fostering bone formation and preservation |
| US7531518B2 (en) * | 2004-05-14 | 2009-05-12 | Unigene Laboratories Inc. | Method for fostering bone formation and preservation |
| US20060089723A1 (en) * | 2004-10-25 | 2006-04-27 | Murphy Kieran P | Method for bone augmentation |
| US7445911B2 (en) | 2004-11-24 | 2008-11-04 | Unigene Laboratories Inc. | Enzymatic reactions in the presence of keto acids |
| DE102004058306A1 (de) * | 2004-12-01 | 2006-07-27 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Carboxy-terminal amidierten Peptiden |
| US20080160577A1 (en) * | 2005-02-04 | 2008-07-03 | Glaxo Group Limited | Optimization of Heterologous Polypeptide Expression |
| PA8660701A1 (es) | 2005-02-04 | 2006-09-22 | Pfizer Prod Inc | Agonistas de pyy y sus usos |
| US20060293667A1 (en) * | 2005-05-19 | 2006-12-28 | Agnes Vignery | Bone implant device and methods of using same |
| WO2007002532A2 (en) * | 2005-06-24 | 2007-01-04 | Unigene Laboratories, Inc. | Cell lines for expressing enzyme useful in the preparation of amidated products |
| US8377863B2 (en) | 2007-05-29 | 2013-02-19 | Unigene Laboratories Inc. | Peptide pharmaceutical for oral delivery |
| BRPI1006943A2 (pt) | 2009-01-22 | 2021-06-15 | Unigene Laboratories Inc. | peptídeo, composição farmacêutica que compreende o peptídeo e método para supressão do apetite, prevenção ou tratamento de uma condição de sobrepeso ou obesidade, ou para tratar diabetes |
| US9096843B2 (en) | 2009-12-01 | 2015-08-04 | Novo Nordisk A/S | Peptidyl α-hydroxyglycine α-amidating lyases |
| TW201138808A (en) | 2010-05-03 | 2011-11-16 | Bristol Myers Squibb Co | Serum albumin binding molecules |
| CA2839298C (en) | 2011-06-15 | 2021-05-18 | Angelo P. Consalvo | Anti-inflammatory pharmaceutical products |
| US9533022B2 (en) | 2011-11-02 | 2017-01-03 | KeyBioscience A/S | Peptide analogs for treating diseases and disorders |
| BR112014010701A2 (pt) | 2011-11-02 | 2020-06-23 | Keybioscience Ag | Uso de um peptídeo |
| EP2773365B1 (en) | 2011-11-02 | 2016-07-20 | KeyBioscience AG | Peptide analogs for treating diseases and disorders |
| CN105101950B (zh) | 2013-03-05 | 2019-10-11 | 安特里斯生物制药公司 | 口服递送的药物 |
| HUE044465T2 (hu) | 2013-11-14 | 2019-10-28 | Keybioscience Ag | Kalcitonin mimetikumok betegségek és rendellenességek kezelésére |
| JP2016540762A (ja) | 2013-12-02 | 2016-12-28 | ステルス バイオセラピューティックス コープ | 白斑の治療のための組成物及び方法 |
| US10576124B2 (en) | 2014-05-28 | 2020-03-03 | Stealth Biotherapeutics Corp | Therapeutic compositions including frataxin, lactoferrin, and mitochondrial energy generating enzymes, and uses thereof |
| CA2950410A1 (en) | 2014-05-28 | 2015-12-03 | D. Travis Wilson | Therapeutic compositions including therapeutic small molecules and uses thereof |
| WO2015195737A1 (en) | 2014-06-17 | 2015-12-23 | Stealth Peptides International, Inc. | Methods of identifying and monitoring mitochondrial dysfunction using monocyte screening |
| GB201500263D0 (en) | 2015-01-08 | 2015-02-25 | Keybioscience Ag | Calcitonin analogues for treating diseases and disorders |
| EP3244878B1 (en) | 2015-01-12 | 2022-08-10 | Enteris BioPharma, Inc. | Solid oral dosage forms |
| GB201704429D0 (en) | 2017-03-21 | 2017-05-03 | Keybioscience Ag | Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders |
| GB201707955D0 (en) | 2017-05-18 | 2017-07-05 | Keybioscience Ag | Dual amylin and calcitonin receptor agonists for treating diseases and disorders |
| GB201813678D0 (en) | 2018-08-22 | 2018-10-03 | Keybioscience Ag | Acylated calcitonin mimetics |
| GB201813677D0 (en) | 2018-08-22 | 2018-10-03 | Keybioscience Ag | Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders |
| WO2021026854A1 (zh) * | 2019-08-15 | 2021-02-18 | 中国科学院微生物研究所 | 一种酶催化的蛋白质c-端选择性酰肼化修饰方法 |
| GB202001024D0 (en) | 2020-01-24 | 2020-03-11 | Key Bioscience Ag | Oxyntomodulin mimetics |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3484377D1 (de) * | 1983-06-15 | 1991-05-08 | Celltech Ltd | Peptide, pharmazeutische zusammensetzungen, gene, vektoren, wirtorganismen, verfahren zu deren herstellung und diagnostische reagenzien. |
| DE3327007A1 (de) * | 1983-07-27 | 1985-02-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Herstellung von polypeptiden mit einem saeureamid-carboxyterminus |
| US6319685B1 (en) * | 1984-09-27 | 2001-11-20 | Unigene Laboratories, Inc. | Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use |
| US4708934A (en) * | 1984-09-27 | 1987-11-24 | Unigene Laboratories, Inc. | α-amidation enzyme |
| JPS6229997A (ja) * | 1985-04-08 | 1987-02-07 | Sankyo Co Ltd | Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法 |
| JPS62177184A (ja) * | 1986-01-29 | 1987-08-04 | Toyota Motor Corp | 鋳鉄製内燃機関用シリンダヘツドおよびその製造方法 |
| JPH0775541B2 (ja) * | 1986-06-07 | 1995-08-16 | 壽之 松尾 | Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法 |
| AU7410987A (en) * | 1986-06-12 | 1988-01-07 | Immunex Corp. | Polypeptides devoid of hydrophobic amino acids |
| JP2598050B2 (ja) * | 1987-07-17 | 1997-04-09 | サントリー株式会社 | Ｃ−末端α−アミド化酵素 |
| US5789234A (en) * | 1987-08-14 | 1998-08-04 | Unigene Laboratories, Inc. | Expression systems for amidating enzyme |
| US6255067B1 (en) * | 1987-09-15 | 2001-07-03 | The Johns Hopkins University | cDNA encoding peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase (PAM) |
| JP2535398B2 (ja) * | 1989-01-17 | 1996-09-18 | サントリー株式会社 | アミド化ペプチドの製造方法 |
| JP2845468B2 (ja) * | 1989-01-17 | 1999-01-13 | サントリー株式会社 | ヒト甲状腺由来Ｃ―末端α―アミド化酵素 |
-
1989
- 1989-02-06 US US07/307,366 patent/US5789234A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-01-22 HU HU26/90A patent/HU220464B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-02-01 AT AT90301034T patent/ATE283922T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-02-01 DK DK90301034T patent/DK0382403T3/da active
- 1990-02-01 ES ES90301034T patent/ES2235149T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-01 EP EP90301034A patent/EP0382403B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-01 DE DE69034179T patent/DE69034179T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-05 CA CA002009306A patent/CA2009306C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-05 RU SU4743221A patent/RU2129606C1/ru active
- 1990-02-05 FI FI900554A patent/FI110517B/fi active IP Right Grant
- 1990-02-05 NO NO90900531A patent/NO900531L/no unknown
- 1990-02-06 KR KR1019900001434A patent/KR0157983B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-02-06 JP JP2026989A patent/JPH0771498B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-01-28 LT LTIP1829A patent/LT4077B/lt not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６（１９８９）Ｐ．７３５−７３９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69034179T2 (de) | 2005-12-01 |
| DK0382403T3 (da) | 2005-03-21 |
| US5789234A (en) | 1998-08-04 |
| LTIP1829A (en) | 1995-08-25 |
| EP0382403A3 (en) | 1991-04-10 |
| KR0157983B1 (ko) | 1998-11-16 |
| HU220464B1 (hu) | 2002-02-28 |
| NO900531D0 (no) | 1990-02-05 |
| HUT54414A (en) | 1991-02-28 |
| RU2129606C1 (ru) | 1999-04-27 |
| DE69034179D1 (de) | 2005-01-05 |
| LT4077B (en) | 1996-12-27 |
| CA2009306A1 (en) | 1990-08-06 |
| HU900226D0 (en) | 1990-03-28 |
| FI110517B (fi) | 2003-02-14 |
| NO900531L (no) | 1990-08-07 |
| ES2235149T3 (es) | 2005-07-01 |
| CA2009306C (en) | 2002-04-09 |
| JPH0541982A (ja) | 1993-02-23 |
| KR900013078A (ko) | 1990-09-03 |
| EP0382403B1 (en) | 2004-12-01 |
| FI900554A0 (fi) | 1990-02-05 |
| EP0382403A2 (en) | 1990-08-16 |
| ATE283922T1 (de) | 2004-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0771498B2 (ja) | アミド酵素発現のための宿主および発現ベクタ | |
| JP2528849B2 (ja) | 置換されたプロモ−タ−を使用する宿主による異種起原蛋白質の増強された分泌 | |
| JPH0759578A (ja) | 組換えｄｎａ技術によるヒトｉｇｆの製造 | |
| CN108610398B (zh) | 一段功能序列及在分泌蛋白表达中的应用 | |
| JPH0832244B2 (ja) | ヘテロポリマ−系蛋白質 | |
| KR950001992B1 (ko) | 배양된 세포내에서 바쿨로바이러스 벡터를 이용한 펩타이드의 제조방법 | |
| EP0111389A2 (en) | Substantially pure porcine growth hormone, DNA sequences therefor, and expression vehicles and transfected microorganisms for the production of porcine growth hormone | |
| EP0390252B1 (en) | Purification of recombinant human interleukin-3 | |
| Gray et al. | Pseudomonas aeruginosa secretes and correctly processes human growth hormone | |
| AU675919B2 (en) | Production of proteins using 7B2 protein | |
| US5552302A (en) | Methods and compositions for production of human recombinant placental ribonuclease inhibitor | |
| AU674741B2 (en) | Methods and DNA expression systems for over-expression of proteins in host cells | |
| EP2305815B1 (en) | Method for producing a natriuretic peptide with a pI above 8 or below 5 | |
| US6165746A (en) | Preventing endogenous aminopeptidase mediated n-terminal amino acid cleavage during expression of foreign genes in bacteria | |
| EP0199018B1 (en) | Expression in e.coli of hybrid polypeptides containing the growth hormone releasing factor sequence | |
| JP4180112B2 (ja) | 酵母細胞におけるｎ末端を伸長されたタンパクの発現のためのベクター | |
| EP0422217B1 (en) | Human recombinant placental ribonuclease inhibitor and method of production | |
| EP0361956A2 (en) | Increased expression of small molecular weight recombinant proteins | |
| NZ238989A (en) | Activation of proteins chemically and production of fusion proteins biologically | |
| EP1913143A1 (en) | Improved protein expression | |
| JPH07163379A (ja) | シグナル配列ペプチドをコードするｄｎａ断片の探索法及びそのためのベクター | |
| CA2529282C (en) | Recombinant igf expression systems | |
| CA2192942C (en) | Synthetic leader peptide sequences | |
| EP0188555A1 (en) | Yeast cloning vehicle | |
| JPS6137099A (ja) | 蛋白質の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080802 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090802 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090802 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100802 Year of fee payment: 15 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100802 Year of fee payment: 15 |