DE69034179T2

DE69034179T2 - Expressionssysteme für ein amidierendes Enzym

Info

Publication number: DE69034179T2
Application number: DE69034179T
Authority: DE
Inventors: Arthur H. Betelsen; Nozer M. Mehta; Gary Agide Beaudry
Original assignee: Unigene Laboratories Inc
Current assignee: Unigene Laboratories Inc
Priority date: 1989-02-06
Filing date: 1990-02-01
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2010-02-02
Also published as: KR0157983B1; EP0382403A3; JPH0541982A; RU2129606C1; ATE283922T1; ES2235149T3; US5789234A; LT4077B; EP0382403A2; NO900531D0; CA2009306C; FI900554A0; JPH0771498B2; LTIP1829A; DK0382403T3; KR900013078A; EP0382403B1; FI110517B; CA2009306A1; DE69034179D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Herstellung von alpha-amidierenden Enzymen durch rekombinante DNA-Techniken und insbesondere Expressionsvektoren und Wirte, die in der Lage sind, alpha-amidierende Enzyme in hohen Ausbeuten und mit hoher zu erzielender Reinheit zu exprimieren.
Die intrazelluläre Prozessierung (Spaltung und/oder Modifikation funktioneller Gruppen) von Vorläuferformen nativer Proteine im Anschluss an ihre Translation ausgehend von Nukleinsäure-kodierenden Sequenzen wurde eindeutig dokumentiert.
Im Allgemeinen können Säugerzellen und andere Eukaryoten bestimmte posttranslationale Prozessierungsverfahren durchführen, während Prokaryoten dies nicht können. Bestimmte Prokaryoten, wie zum Beispiel E. coli, werden weithin als Wirte für die Herstellung von Säugerproteinen durch rekombinante DNA (rDNA)-Technologie verwendet, da sie einfach in Chargen-Fermentationsverfahren gezüchtet werden können und da sie genetisch gut charakterisiert sind. Viele Säugerproteine benötigen jedoch eine bestimmte Art der posttranslationalen Prozessierung, und wenn diese Proteine durch genetische Techniken beispielsweise von E. coli hergestellt werden, muss die posttranslationale Prozessierung häufig durch die Verwendung komplexer, in vitro chemischer Verfahren erfolgen, welche für Herstellungsanwendungen im großen Maßstab unerschwinglich teuer sind.
Eine Art der Prozessierungsaktivität betrifft die spezifische Amidierung der Carboxy-terminalen Aminosäure eines Peptids oder Proteins. Viele natürlich vorkommende Hormone und Peptide beinhalten eine solche Modifikation, welche häufig essentiell ist, wenn das Protein biologisch aktiv sein muss. Ein Beispiel ist Calcitonin, bei dem die Substitution eines nicht-amidierten Prolinrests für das amidierte Prolin der nativen Form in einer 3.000-fachen Reduktion der biologischen Aktivität resultiert. Andere biologische Peptide, die zur voll-ständigen Aktivität die posttranslationale Amidierung benötigen, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, den Growth hormone releasing factor, andere Calcitonine und Calcitonin-Gen-verwandte Peptide.
Die spezifische Amidierung der Carboxy-terminalen Aminosäure eines Proteins wird durch alpha-amidierende Enzyme katalysiert. Die Polypeptidsequenzen für viele wichtige biologische Proteine, welche die Amidierung für ihre maximale Wirksamkeit benötigen, können beispielsweise durch genetische Techniken hergestellt werden. Die wichtige und manchmal essentielle Carboxy-terminale Amidierung muss jedoch häufig in vitro durchgeführt werden. Es ist wünschenswert, an diesem Punkt kostspielige und mühsame chemische Amidierungstechniken zu vermeiden, und daher ist es wünschenswert, ein amidierendes Enzym zur Durchführung der spezifischen Amidierung zu verwenden. Alpha-amidierende Enzyme werden -jedoch nicht leicht in der Natur gefunden.
Das Vorhandensein amidierter Peptide in einem bestimmten Gewebe ist nicht notwendigerweise mit hohen Niveaus alpha-amidierender Enzyme gleichzusetzen. Zum Beispiel enthält das Hypophysenvorderlappen-Gewebe von Ratten hohe alpha-amidierende Aktivität, jedoch keine bekannten Substrate (Eipper et al., PNAS 80: 5144–5148 (1983)). Das Hypophysenhinterlappen-Gewebe von Ratten enthält amidierte Peptide (Oxytocin und Vasopressin), hat jedoch nur sehr geringe alpha-amidierende Aktivität (Eipper et al., Endo 116: 2497–2504 (1985)). Bis einzelne Gewebe auf ihre alpha-amidierende Aktivität getestet sind, kann daher das Vorhandensein oder das potentielle Niveau des Enzyms nicht vorhergesagt werden.
Ein noch größeres Hindernis für die Verfügbarkeit amidierender Enzyme, die aus natürlichen Quellen gewonnen werden, ist der üblicherweise geringe Grad an Reinheit. Aus natürlichen Quellen erhältliche amidierende Enzyme sind mit proteolytischen Enzymen und anderen Verunreinigungen kontaminiert. Die effektive Gewinnung eines amidierten Produkts ist stark beeinträchtigt, wenn diese von Verunreinigungen durchsetzten Enzyme zur Amidierung eines Substrats bestehend aus L-Aminosäuren verwendet werden. Vor allem das Vorhandensein von Proteasen kann zum Abbau des Substrats und/oder des amidierten Produkts und/oder des amidierenden Enzyms selbst führen. Die meisten biologisch wichtigen Polypeptide enthalten L-Aminosäuren und sind für diesen proteolytischen Abbau und für andere Amidierungsbehindernde Hindernisse anfällig, welche durch Verunreinigungen in Ansätzen mit amidierenden Enzymen verursacht werden.
Da die Natur nur wenige Quellen, geringe Mengen und keine ausreichende Reinheit an alphaamidierenden Enzymen bereitstellt, besteht ein Bedarf an effizienten Methoden der Massenproduktion alpha-amidierender Enzyme, die mit hohem Ertrag und hoher Reinheit gewonnen werden. Die Herstellung amidierender Enzyme durch rekombinante Mittel könnte diesen Bedarf erfüllen. Stoffers et al. (Stoffers, D. A., Green, C. B.–R. und Eipper, B. A. (1989) PNAS, 86, 735–739) beschreiben die Isolierung und Sequenzierung von zwei cDNAs, welche die als rPAM-1 und rPAM-2 bezeichneten Rattenpolypeptide kodieren. Die verschiedenen Regionen der Sequenz und ihre Funktionen wurden ebenfalls identifiziert. EP-A-308067 offenbart aufgereinigte enzymatische Zusammensetzungen aus alpha-amidierenden Enzymen sowie Gene, die zur Expression derselben fähig sind. EP-A-299790, WO 89/02460 und WO 90/08190 offenbaren die Gesamtlängen-Aminosäuresequenzen, enthaltend Startkodons stromaufwärts der kodierenden Region, von amidierenden Enzymen aus Xenopus, Rind und Mensch. Trotzdem besteht weiterhin ein Bedarf an der verbesserten Expression alpha-amidierender Enzyme.
Die hier verwendeten Begriffe "amidierendes Enzym" und "alpha-amidierendes Enzym" beziehen sich auf jedes Agens, das zur Katalyse der Umsetzung eines Peptidylsubstrats in ein entsprechendes Peptidylamid mit einer Aminogruppe anstelle der C-terminalen Aminosäure des genannten Substrats fähig ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, alpha-amidierende Enzyme bereitzustellen, die in hohen Mengen und mit hoher Reinheit gewonnen werden können.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht im Bereitstellen von Wirtsorganismen, welche zur Expression alpha-amidierender Enzyme, die in hohen Mengen und mit hoher Reinheit gewonnen werden können, fähig sind.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht im Bereitstellen von Expressionsvektoren, enthaltend DNA-Sequenzen, die für alpha-amidierende Enzyme kodieren.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht im Bereitstellen von Expressionsvektoren, die zur Expression alpha-amidierender Enzyme in einer Weise fähig sind, durch die das exprimierte Enzym einfach gewonnen und zu einem solchen Grad aufgereinigt wird, der für die Amidierung von Peptidylsubstraten enthaltend L-Aminosäuren, z. B. aus natürlichen Quellen aufgereinigte Substrate, chemisch synthetisierte Substrate oder durch rekombinante DNA-Techniken hergestellte Substrate, wirksam ist.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht im Bereitstellen von Expressionsvektoren, die besonders zum Ausführen der Expression alpha-amidierender Enzyme in einem eukaryotischen Wirt geeignet sind.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht im Bereitstellen von Expressionsvektoren, die besonders zum Ausführen der Expression alpha-amidierender Enzyme in einem prokaryotischen Wirt geeignet sind.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht im Bereitstellen eines Mittels zur effizienten, kostengünstigen Massenproduktion alpha-amidierender Enzyme.
Diese und andere Ziele werden durch das Bereitstellen eines Wirts erreicht, der zur Expression der Polypeptidsequenz eines alpha-amidierenden Systems fähig ist, wobei besagter Wirt einen Expressionsvektor enthält, der einen Transkriptionspromotor enthält, stromabwärts gefolgt von einer dem genannten Wirt fremden DNA-Sequenz, welche für eine Peptidylglycin alpha-amidierende Monooxygenase kodiert und eine Sequenz hat, die ausgewählt ist aus:

wobei besagte DNA-Sequenz ein Stopkodon stromaufwärts einer Sequenz beinhaltet, welche ansonsten für eine Transmembranregion kodieren würde.
Der hier verwendete Begriff "stringente Bedingungen" bedeutet 2 × SSC (0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat) bei 62°C.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Expressionsvektoren aus genannten Wirten wie oben beschrieben bereit. Weitere Aspekte der Erfindung sind wie in den Ansprüchen beschrieben.
Der hier verwendete Begriff "Transmembrandomäne" ist eine DNA-Sequenz, welche gemäß des Tests von Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol., 157, 105–132 (1982) (dessen gesamte Offenbarung hiermit als Referenz eingefügt wird) für eine Aminosäuresequenz von ausreichender Hydrophobizität, Länge, strukturellem Charakter und ähnlichem kodiert, um in der Membran befestigt zu sein. Dies kann zum Beispiel erfolgen, wenn ein Protein an einem Membran-gebundenen Ribosom synthetisiert wird, oder die von der Transmembrandomäne kodierte Aminosäuresequenz kann alternativ mit anderen Regionen des Proteins, von dem sie ein Teil ist, assoziiert werden, so dass die Sequenz posttranslational in die hydrophobe Umgebung der Membran eingefügt wird. Transmembrandomänen werden detaillierter in Von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology: Treasure Trove or Trivial Pursuit, 81–121 (Acad. Press 1987) diskutiert, dessen Lehren hiermit als Referenz eingefügt werden.
Die hier verwendeten Basennummern sind diejenigen Nummern, die spezifisch für eine jegliche DNA-Sequenz festgelegt wurden, die ausdrücklich mit den Referenzen der Basennummern dargelegt werden. Bei allen Sequenzen, denen hier keine ausdrücklichen Basennummern zugeordnet sind, sollen die Basen fortlaufend nummeriert werden, wobei die Basennummer 1 die erste Base des durch die in Frage stehende Sequenz exprimierten ersten Kodons darstellt und die Aminosäurenummern fortlaufend nummeriert werden, wobei die erste Nummer diejenige Aminosäure ist, die von den Basen 1–3 exprimiert wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist ein Flussdiagramm zur Herstellung eines Säuger-Expressionsvektors für alphaamidierende Enzyme.
2 ist ein Flussdiagramm zur Herstellung eines prokaryotischen Expressionsvektors für alpha-amidierende Enzyme.
3 ist ein Coomassie-Blau gefärbtes SDS-PAGE Elektrophoretogramm der unlöslichen Proteinfraktion aus E. coli JM105 enthaltend die angegebenen Plasmide (welche die in Beispiel 1 dargelegten Merkmale haben) nach Kultivierung mit (+) oder ohne (–) dem Wachstumsmedium zugefügten IPTG (C = unlösliche Proteine von E. coli JM105 enthaltend pKK233-2).
4 ist ein Western Blot des in 3 gezeigten Gels, wobei im Anschluss an den Proteintransfer auf Nitrocellulose der Filter mit Kaninchen-Anti-AE-Antiserum und dem Alkaline Phosphatase-konjugierten Anti-Kaninchen-Ig behandelt wurde, gefolgt von einem chromogenen Substrat für die Alkaline Phosphatase.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Gemäß der Erfindung werden für prokaryotische Systeme geeignete Expressionsvektoren und für eukaryotische Systeme geeignete Expressionsvektoren hergestellt. DNA kodierend für in diesen Vektoren verwendbare amidierende Enzyme kann isoliert werden, wie in der EPÜ-Anmeldung Nr. 88307533.5 gelehrt und als Veröffentlichungsnummer 0308067 veröffentlicht, deren gesamte Offenbarung hiermit als Referenz eingefügt wird. Alpha-amidierende Enzyme wurden aus dem Schilddrüsenmark-Karzinomgewebe von Ratten oder konditioniertem Medium einer Rattenzelllinie isoliert und bis zur Homogenität aufgereinigt, wie gelehrt in der oben genannten Teilanmeldung und in der Stammanmeldung mit der Stammnummer 655,366, angemeldet am 27. September 1984, jetzt herausgegeben als US-Patent 4,708,934, dessen Priorität beansprucht und dessen gesamte Offenbarung hier als Referenz eingefügt wurde. Für die aufgereinigten alpha-amidierenden Enzyme wurden die Aminosäuresequenzen ermittelt, und diese Sequenzen wurden verwendet, um eine Vielzahl an Oligonukleotidsonden zu entwerfen, welche radioaktiv markiert und zur Isolierung von cDNAs für amidierende Enzyme verwendet wurden.
Die isolierten cDNAs wurden zum Screening von Banken verwendet, die z. B. aus der Gesamt-RNA von Schilddrüsenmark-Karzinomgewebe von Ratten, den daraus abgeleiteten Zelllinien oder aus Zelllinien hergestellt wurden, die bekannt dafür sind, amidierende Enzyme herzustellen, beispielsweise die biologische Hinterlegung IVI 10028 (In Vitro International, Linthicum, Maryland) (Ratten MTC-Gewebe) oder die abgeleitete Zelllinie IVI 10029. Es wurde Gesamt-RNA gewonnen und Poly A-RNA mittels Oligo-DT-Cellulose selektiert. cDNAs wurden durch bekannte Methoden, unter Verwendung von zunächst reverser Transkriptase und anschließend einer DNA-Polymerase, hergestellt. Die cDNA wurde zur Generierung von cDNA-Banken im Vektor λgt 11 verwendet, und die rekombinanten DNAs wurden in vitro zur Bildung von infektiösen Bakteriophagenpartikeln verpackt.
Extrakte zum Verpacken sind beispielsweise bei Promega Biotech oder Clontech Laboratories kommerziell erhältlich oder können gemäß im Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt werden. Die Phagen wurden mit radioaktiv markierten Oligonukleotidsonden gescreent, welche wie oben dargelegt hergestellt wurden. Das Screening auf Bakteriophagen enthaltend alpha-amidierende Enzym-cDNA ("AE-cDNA") wurde durch das Ausplattieren von Bakteriophagenproben und das Übertragen der Phagen auf Nitrocellulose-Filterscheiben durchgeführt. Die Hybridisierung mit zwei oder mehr radioaktiv markierten AE-spezifischen Oligonukleotidsonden bestätigte die Spezifität.
Die als AE4, AE5, AE8 und AE9 bezeichneten Oligonukleotidsonden auf den Seiten 61–64 der EPÜ-Anmeldung Nr. 88307533.5 und als Veröffentlichungsnummer 0308067 veröffentlichten Anmeldung werden besonders für das Screening von Banken bevorzugt, welche aus der oben genannten biologischen Hinterlegung IVI 10029 hergestellt wurden.
Die Analyse der AE-cDNAs aus vielen Bakteriophagen, die durch das oben genannte Oligonukleotid-Hybridisierungs-Screening-Verfahren isoliert wurden, wies darauf hin, dass die cDNAs in eine Vielzahl verschiedener Typen eingeteilt werden konnten. Die Struktur eines Typs ist unten als Darstellung A angegeben, wobei die Nukleotide derart nummeriert wurden, dass die Base 1 als die erste Base des Kodons für den Initiator Methionin bezeichnet wurde.
Unter der Nukleotidsequenz ist der Einbuchstaben-Aminosäurecode zur Translation der Gensequenz in ein Protein angegeben. Die Nummern in Klammern am Ende der Zeilen geben die Aminosäurenummern an:
Ein anderer Typ einer cDNA-Sequenz, die durch das oben dargelegte Oligonukleotid-Hybridisierungs-Screening isoliert wurde, ist durch die unten angegebene Darstellung B aufgezeigt, wobei die Nummerierung und andere Angaben denen entsprechen, wie sie oben für Typ A angegeben wurden:
Die Anmelder haben cDNAs verwendet, welche auf die oben angegebene Weise isoliert wurden, um sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Expressionsvektoren herzustellen, und eine Anzahl von Wirten wurden mit diesen Vektoren zur effizienten Expression alphaamidierender Enzyme transfiziert.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung haben die Anmelder den vorhergehenden cDNAs neuartige Modifikationen zugefügt, um nicht nur die Expression, sondern auch die Gewinnung amidierender Enzyme zu optimieren. Die Natur und das Ausmaß der Modifikation können in Abhängigkeit vom gewählten Wirt und/oder Vektor variieren. In einigen Ausführungsformen der Erfindung wurde stromaufwärts der Sequenz, welche andernfalls für eine Transmembrandomäne kodieren würde, ein Stopkodon eingefügt. Die Gegenwart dieser Transmembrandomänen kann für ein rekombinantes DNA-Expressionssystem unerwünscht sein, da sie dazu führen können, dass das exprimierte Protein Membran-assoziiert und möglicherweise im Wirtsorganismus oder der Zelllinie inaktiv ist. Beispiele für Transmembrandomänen erscheinen in den beiden Beispielen für cDNAs, die in den obigen Darstellungen A und B dargelegt sind (ungefähr Basen 2275–2355 der in Darstellung A gezeigten Sequenz und ungefähr Basen 2587–2667 der in Darstellung B gezeigten Sequenz). Die cDNAs der Darstellungen A und B sind auf der Aminoseite dieser Transmembrandomänen im Wesentlichen identisch, mit der Ausnahme einer scheinbaren Intronregion von Base 1178 bis Base 1492 der Typ B cDNA.
Die cDNAs der obigen Darstellungen A und B kodieren für Proteinprodukte von ungefähr 94 bzw. 105 kD. Beide Proteine sind größer als reife, aktive Enzyme, welche aus tierischen Gewebeextrakten oder Zellliniensekretionen aufgereinigt wurden. Bei jedem dieser primären Translationsprodukte handelt es sich um Prä-Proenzyme, welche im C-terminalen Drittel der kodierenden Sequenz Transmembrandomänen enthalten. Vorzugsweise wird das Stopkodon so platziert, dass das exprimierte Protein ein Molekulargewicht von ungefähr 75 besitzt, wenn es von der cDNA der Darstellung A exprimiert wird (d. h. der Stop wird zwischen den Basen 2025 und 2275 platziert), und 87 kD, wenn es von der cDNA von Darstellung B exprimiert wird (d. h. das Stop ist ungefähr zwischen Basen 2340 und 2587 platziert). Das Gewicht eines von den Anmeldern aufgereinigten reifen, natürlichen amidierenden Enzyms.
Für die cytoplasmatische Expression des reifen alpha-amidierenden Enzyms beispielsweise in E. coli wird es bevorzugt, dass die Gensequenzen, welche die natürliche sekretorische Signalsequenz kodieren, entfernt werden, dass ein Initiationskodon innerhalb von etwa 50 Nukleotiden der Gensequenzen platziert wird, welche den Start des reifen, dem alpha-amidierenden Enzym entsprechenden Proteins kodieren, und dass die die Transmembrandomäne im C-terminalen Bereich kodierenden Gensequenzen durch die Insertion eines Stopkodons nicht translatiert werden, wie es gemäß der Erfindung erforderlich ist. Das Initiationskodon liegt natürlich im Leserahmen mit der das Enzym kodierenden Sequenz und befindet sich in einigen bevorzugten Ausführungsformen stromaufwärts dieses Bereichs, manchmal unmittelbar stromaufwärts.
Als die AE-cDNA in E. coli exprimiert wurde, wurde entdeckt, dass die natürliche Gensequenz eine kryptische E. coli-Ribosomenbindungsstelle ("RBS") sowie ein Initiationskodon enthielten, welches innerhalb der natürlichen Initiationssequenzen lag. Dies führte zur Generierung eines N-terminal verkürzten amidierenden Enzymproteins. Während dies nicht die Produktion des gewünschten Produkts in E. coli verhinderte, erschwert die Ko-Existenz der korrekt initiierten und der intern initiierten Produkte die Prozessierung und Aufreinigung des rekombinanten Produkts zu einer nützlichen Form und ist daher unerwünscht. Um das unerwartete, unerwünschte Produkt zu entfernen, war es nötig, die Ribosomenbindungsstelle, das interne Initiationskodon oder beide zu entfernen.
Beispielsweise wird in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ein Valinkodon, welches in prokaryotischen Systemen ein initiierendes Methionin kodiert, durch eine Punktmutation in ein äquivalentes nicht-initiierendes Valinkodon bei den Basen 661–663 (der cDNAs von entweder Darstellung A oder B) umgewandelt. Anstelle oder zusätzlich zu dieser Punktmutation haben die Anmelder in anderen bevorzugten Ausführungsformen jegliche Region entfernt oder stark modifiziert, welche für eine Ribosomenbindungsstelle kodiert, die genau stromaufwärts einer internen Initiationsstelle auftritt, und noch mehr bevorzugt jegliche Ribosomenbindungsstelle, wann auch immer sie auftritt. Diese Modifikationen werden durchgeführt, um die interne Initiation wesentlich zu eliminieren, so dass das aufgrund der internen Initiation exprimierte Protein nicht als eine separate Bande nach der Elektrophorese auftritt.
Um die Expression eines sekretierten, aktiven alpha-amidierenden Enzymproteins zu erreichen, war es notwendig, die die Transmembran-Domäne in der C-terminalen Region der natürlichen Gensequenzen kodierenden Gensequenzen aus einer rekombinanten eukaryotischen Wirtszelllinie zu entfernen. Für die Typ A cDNA wurde dies durch das Verkürzen der das Protein kodierenden Region durch das Einführen eines Stopkodons an oder in der Nähe der Position erreicht, an der das natürliche amidierende Enzym, wie später detailliert beschrieben, in einigen natürlichen Systemen posttranslational prozessiert wird. Für die Typ B cDNA wurde dies ebenfalls durch das Einführen eines neuen Stopkodons in der. Region des Enzymproteins erreicht, an der das natürliche Typ B amidierende Enzym posttranslational prozessiert wird (siehe unten). Dies sollte nicht so verstanden werden, dass die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass in einigen Wirtszellsystemen vorzugsweise die gesamte natürliche vorkommende Gensequenz exprimiert wird. Da die Typ B cDNA Sequenzen mit den Merkmalen eines unprozessierten Introns enthält, könnte eine Schwierigkeit darin bestehen, diese cDNA in einigen eukaryotischen Wirtszellen zu exprimieren. Aufgrund der Gegenwart der paarweisen Splice-Donor- und -Akzeptorstellen könnten diese Zellen eine mRNA vom Typ B nicht effizient herstellen. Um eine effiziente Expression der Typ B AE-cDNA zu gewährleisten, könnte daher das Entfernen der Akzeptorstelle nötig sein.
Wir haben entdeckt, dass das Carboxy-Ende des natürlich vorkommenden 75 kD alpha-amidierenden Enzymproteins hinter der Aminosäureposition 709 (814 vom Typ B) auftritt. Für die Herstellung des 75 kD Proteins (87 kD vom Typ B) in einer rekombinanten DNA-Wirtszelle wurde durch Mutation des Kodons für das Lysin an Aminosäureposition 716 (821 vom Typ B) ein Stopkodon in die cDNA eingefügt. Diese Modifikation wurde durch Verwendung von Oligonukleotid-gerichteter Positions-spezifischer Mutagenese erzielt. Diese Mutagenese kann durch eine Vielzahl von Wegen ausgeführt werden. Die Methoden wurden ausführlich in der molekularbiologischen Literatur diskutiert. Die von uns verwendete allgemeine Methode wurde in Taylor, J. W. et al. (1985), Nucl. Acids Res., 13: 8749–8764; Taylor, J. W. et al. (1985), Nucl. Acids Res., 13: 8764–8785; Nakamaye, K. und Eckstein, F. (1986), Nucl. Acids Res., 14: 9679–9698 beschrieben. Die zur Anwendung dieser Methode benötigten Reagenzien sind in Form eines Mutagenesekits bei Amersham Corporation erhältlich.
Die von uns generierte Mutation der Sequenz wandelt das AAA Lysin-Kodon in ein TAA Stopkodon um. Das für diese Mutagenese verwendete Oligonukleotid enthielt diesen Aus tausch, war aber ansonsten in seiner Sequenz identisch zur natürlich vorkommenden cDNA-Sequenz für das entsprechende zu mutierende Enzym (Typ A oder Typ B).
Wir haben ebenfalls entdeckt, dass eine natürlich vorkommende verkürzte Form des alphaamidierenden Enzymproteins durch Prozessierung des Typ B Proteins an der internen Region des Proteins, welche einzigartig für das Typ B Enzymprotein ist, generiert wird. Dies führt zu einem Enzymprodukt mit einem Molekulargewicht von ungefähr 43 kD. Es wird angenommen, ohne sich durch die Theorie binden zu wollen, dass die DNA-Sequenz stromaufwärts der Intronregion für die Kodierung eines Polypeptids ausreicht, welches fähig ist, signifikante alpha-amidierende Aktivität aufzuweisen. Entsprechend können Polypeptide, die einfach zu gewinnen und in der Lage sind, alpha-amidierende Aktivität zu exprimieren, von cDNAs kodiert werden, welche durch das Einfügen eines Stopkodons irgendwo in der Intronregion der Typ B cDNA direkt vor oder hinter der entsprechenden Stelle, an der dieses Intron in der Typ A cDNA fehlt, signifikant verkürzt sind. Eine bevorzugte Verkürzung resultiert aus dem Einfügen eines Stopkodons innerhalb von etwa 30 Basen ab dem Beginn der Intronregion, vorzugsweise unmittelbar stromabwärts hiervon. Um die Herstellung einer bevorzugten kurzen Form eines alpha-amidierenden Enzymproteins in rekombinanten Wirtszellen zu ermöglichen, wird eine modifizierte cDNA mit einem Stopkodon anstelle des Lysinkodons an Aminosäureposition 436 der Typ B cDNA hergestellt. Diese Mutation wurde durch Oligonukleotid-gerichtete Positions-spezifische Mutagenese der Typ B AE-cDNA ausgeführt.
Während das Verkürzen des amidierenden Enzymproteins durch das Einführen des Stopkodons an Aminosäureposition 436 der Typ B cDNA zu einem Protein führt, das am ehesten demjenigen entspricht, welches durch das proteolytische Spalten des primären Translationsprodukts (oder eines anderen Spaltungsintermediats im Biosyntheseweg) hergestellt wird, kann eine weitere Verkürzung des amidierenden Enzymproteins ebenfalls zur Generierung eines aktiven Produkts in rekombinanten DNA-Wirtszellen führen. Wir haben die AE-cDNA auf verschiedene andere Arten modifiziert, um solche kürzeren Formen des Proteins herzustellen. In einem Beispiel haben wir die Oligonukleotid-gerichtete Positions-spezifische Mutagenese verwendet, um ein Tyrosinkodon an Aminosäureposition 396 der Typ B cDNA in ein Stopkodon umzuwandeln. Diese Änderung resultiert in einem Protein, das nach Translation der cDNA und Prozessierung ungefähr 39 kD hat. In einem zweiten Fall haben wir die natürlich vorkommende Bam H1-Enzymerkennungsstelle der Typ B cDNA verwendet, um durch Linkermutagenese ein Stopkodon einzuführen. Diese Methode ist in der Molekularbiologie altbekannt und beinhaltet einfach das Spalten der cDNA, gefolgt von der Ligation an ein doppelsträngiges synthetisches Linkerfragment, das komplementär zu einem Ende der gespaltenen cDNA ist und im Leserahmen direkt hinter der Spaltstelle ein Stopkodon einführt. Um diese Modifikation durchzuführen, haben wir ein Oligonukleotidfragment mit der folgenden Sequenz verwendet:
Dieser Linker führt ein Stopkodon im Anschluss an das Histidinkodon der Aminosäure 469 ein. Die Translation und Prozessierung der auf diese Weise modifizierten cDNA führt zur Synthese eines Proteins von ungefähr 46 kD.
Das bevorzugte Einfügen eines verkürzenden Stopkodons findet innerhalb von ungefähr 15 Basen einer DNA-Sequenz statt, die für aufeinanderfolgende basische Reste (üblicherweise ein Lys-Lys) und insbesondere direkt stromaufwärts hiervon kodiert. Es wird angenommen, ohne sich durch die Theorie binden zu wollen, dass das von den cDNAs vom Typ B kodierte natürliche Polypeptid während posttranslationaler Modifikationen, die während der natürlichen Expression des amidierenden Enzyms auftreten, an oder in der Nähe solcher aufeinanderfolgender basischer Reste prozessiert wird, beispielsweise an den aufeinanderfolgenden Lysinen, die innerhalb der Intronregion der cDNA der Darstellung B kodiert werden. Selbst wenn die eingefügten Stopkodons nicht dazu dienen sollen, das exprimierte Polypeptid in der oben beschriebenen Weise zu verkürzen, ist es bevorzugt, dass das eingefügte Stopkodon innerhalb von ungefähr 20 Basen inseriert wird, und vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts von DNA-Sequenzen, die für aufeinanderfolgende basische Aminosäurereste kodieren. Das Einfügen von Stopkodons an diesen Positionen führt voraussichtlich zur Expression eines Polypeptids, das bestimmten natürlichen amidierenden Enzymen ähnelt, nachdem sie eine posttranslationale Prozessierung durchlaufen haben.
Zur cytoplasmatischen Expression in prokaryotischen Systemen werden vorzugsweise jegliche für Signalsequenzen kodierende Regionen (z. B. die ersten Basen sowohl vom Typ A als auch vom Typ B der cDNAs der vorherigen Darstellungen) entfernt und ein Methionin-Initiatorkodon innerhalb von ungefähr 50 Nukleotiden ab dem Beginn der für die amidierenden Enzyme kodierenden Region eingefügt.
Die Sequenzen der Erfindung zur prokaryotischen Expression können ferner verändert werden, um durch das Einfügen eines Initiator-Methioninkodons innerhalb von ungefähr 50 Nukleotiden ab dem Beginn der für das amidierende Enzym kodierenden Region jegliche für eine Signalsequenz der Proenzymsequenz kodierende Sequenzen zu entfernen. In vielen natürlichen AE-cDNAs entspricht dies dem Beginn der Region, welche Ser-X-Ser (X = Phe oder Leu) kodiert. Siehe z. B. Basen 124 bis 132 der Sequenz für die Typ A oder Typ B cDNA. In einigen Ausführungsformen kann die Sekretion des alpha-amidierenden Enzyms erwünscht sein. In diesem Fall werden die für die Signalsequenz kodierenden Regionen vorzugsweise erhalten oder alternativ durch heterologe Sequenzen ersetzt, die dem gleichen Zweck dienen können, z. B. die Signalsequenzen des bakteriellen OMP A-Proteins.
Für den Fachmann ist es klar ersichtlich, dass im Rahmen der Erfindung eine Vielzahl von Mutationen und Verkürzungen der hier dargelegten DNA-Sequenzen zum Kodieren amidierender Enzyme möglich sind und dass solche modifizierenden Sequenzen für Polypeptide kodieren würden, die in der Lage wären, als amidierende Enzyme zu funktionieren. Entsprechend sollen die Ansprüche des Anmelders so ausgelegt werden, dass sie alle funktionalen Äquivalente von spezifisch dargelegten DNA-Sequenzen, Expressionsvektoren und Wirtszellen beinhalten.
Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren, welche wünschenswerterweise so modifiziert werden können, dass sie erfindungsgemäße für amidierende Enzyme kodierende DNA-Sequenzen enthalten, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, pKK233-, pKK322-2, pPROK-1, pkT279, 280, 287, pPL Lambda, pYEJ001, pKC30, pPROK-C, alle kommerziell erhältlich. Prokaryotische Wirte, die mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transfiziert werden können, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, C600, LE392, RR1, DH1, SF8, alle kommerziell erhältlich.
Eukaryotische Expressionsvektoren, die wünschenswerterweise so modifiziert werden können, dass sie erfindungsgemäße, für amidierende Enzyme kodierende DNA-Sequenzen enthalten, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, pMAMNeo, pdBPVMMTNeo, pRSV, peuK-C1, pCH110, alle kommerziell erhältlich. Geeignete Hefevektoren können ebenfalls verwendet werden. Bevorzugte eukaryotische Wirte, die mit erfindungsgemäßen Expressions vektoren transfiziert werden können, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, IVI Hinterlegung 10029, Hela, CV1, C127, CHO (Chinese Hamster Ovary) und COS.
BEISPIEL 1
Expression eines alpha-amidierenden Enzymproteins in E. coli
Zur Expression eines alpha-amidierenden Enzyms in E. coli (siehe das Flussdiagramm in 2) wurde ein cDNA-Fragment mit der in obiger Darstellung A gezeigten Sequenz mit KpnI und Hind III verdaut und das Fragment von ungefähr 2,1 kb isoliert. Um wieder einen Aminoterminus entsprechend einem natürlichen, reifen Enzym zu bilden, wurde ein Oligonukleotidlinker mit der Sequenz
an dieses DNA-Fragment ligiert. Das entstehende Fragment enthielt ein Nco I-kompatibles klebriges Ende sowie ein Hind III klebriges Ende. Der E. coli-Expressionsvektor pKK233-2 wurde kommerziell von Pharmacia erworben und mit den Restriktionsenzymen Nco I und Hind III verdaut. Das große lineare Fragment wurde isoliert und an das Linker-angepasste cDNA-Fragment ligiert. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation kompetenter E. coli JM105 verwendet. Die Transformanten wurden über Ampicillin-Resistenz ausgewählt, und die isolierten Klone wurden durch Restriktionsenzyme und DNA-Sequenzanalyse auf das rekombinante Plasmid analysiert, um die Struktur des Expressionsvektors (nachstehend "pAE12"), den sie enthielten, zu bestätigen. Der Expressionsvektor enthält den hybriden trp-lac-Promotor, der durch den lac-Repressor reprimiert und durch Behandlung der Zellen mit Isopropylthiogalaktosid (IPTG) induziert wird. Stromaufwärts vom Initiator-Methionin enthält der Vektor auch die Sequenzen einer starken Ribosomenbindungsstelle.
Um eine Expression des alpha-amidierenden Enzyms in E. coli zu erzielen, wurden die rekombinanten Zellen unter Schütteln in LB-Medium bei 37°C auf eine OD₆₀₀ von 0,4 gezüchtet. IPTG wurde der Kultur zu einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt, und das Wachstum wurde bei 37°C unter Schütteln für drei bis fünf Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation der Kultur geerntet und der Überstand verworfen. Die Zellen wurden in einem Puffer mit einem Cocktail an Proteaseinhibitoren resuspendiert, mit Lysozym behandelt und dann zur Lyse der Zellmembranen mit Ultraschall behandelt. Zur Trennung der löslichen und unlöslichen Fraktionen der Zellen wurden die Lysate bei 12.000 × g zentrifugiert. Jede Fraktion wurde durch SDS-PAGE und Proteinfärbung analysiert. Das alpha-amidierende Enzymprotein ließ sich einfach in der unlöslichen Proteinfraktion als IPTG-induzierbares Produkt identifizieren. Da das initiale Expressionsplasmid kein durch die Gensequenz für das alpha-amidierende Enzym spezifiziertes Stopkodon enthielt, enthält das induzierte gebildete Produkt Sequenzen, die durch die Fusion der Vektor-DNA stromabwärts mit den C-terminalen Proteinsequenzen des alpha-amidierenden Enzyms spezifiziert waren. Zusätzlich enthielt das induzierte unlösliche Protein ebenfalls ein kleineres spezifisches Amidierungs-Enzymprotein, welches ein Produkt darstellte, das durch die interne Initiation der Proteinsynthese an einer kryptischen RBS und das Initiationskodon (Aminosäureposition 221 der alpha-amidierenden Enzymsequenz) gebildet wurde.
Um die unerwünschten Sequenzen aus dem C-terminalen Bereich des exprimierten Produkts zu entfernen, wurde eine Mutation des Lysinkodons an Position 716 der Typ A Sequenz eingeführt, um an dieser Position ein TAA Stopkodon zu generieren. Die mutierte cDNA wurde dann mit Kpn I und Eco R1 verdaut und zum Ersetzen des ursprünglichen Kpn I-Eco R1-Fragments im initialen Expressionsvektor pAE12 verwendet. In ähnlicher Weise wurden die Typ B cDNA-Sequenzen an der vergleichbaren Position (Aminosäre 821) mutiert, um ein Stopkodon herzustellen, und das Kpn I-Eco R1-Fragment der mutierten Typ B cDNA wurde zum Ersetzen des entsprechenden Fragments in pAE12 verwendet. Die beiden so hergestellten Expressionsplasmide pAE24 (Typ A) und pAE25 (Typ B) wurden dann zur Transformation von JM105 verwendet. Die resultierenden Stämme wurden wie zuvor die pAE12-enthaltenden Stämme zur Expression kultiviert. pAE24 produzierte zwei IPTG-induzierbare, unlösliche Proteine von etwa 75 kD und 55 kD, während pAE25 zwei IPTG-induzierbare, unlösliche Proteine von etwa 87 kD und 67 kD produzierte. Erneut stellt das kleine Protein in jedem dieser Paare das unerwünschte, aminoterminal verkürzte Produkt entweder der Typ A oder der Typ B cDNA dar.
Um die Initiation der Proteinsynthese an der kryptischen internen Ribosomenbindungsstelle und dem Initiationskodon (Aminosäureposition 221) auszuschalten, wurde das GTG Startkodon (GTG kann als Initiator-Met-Kodon in Bakterien dienen) in ein GTT Kodon umgewandelt, das keine Proteinsynthese initiieren kann, aber weiterhin das Valin kodiert, welches normalerweise an dieser Position in alpha-amidierenden Enzymproteinen gefunden wird, die von natürlichen Genen kodiert werden. Als die mutierte Region der cDNA in den Expressionsvektoren pAE24 und pAE25 durch die natürliche Sequenz ersetzt wurde, entstanden zwei neue Vektoren pAE31 und pAE32. Die Transformation von E. coli JM105 mit diesen modifizierten Expressionsvektoren und das Analysieren der Proteinherstellung in den resultierenden rekombinanten Stämmen deutete darauf hin, dass diese Mutagenese zum Eliminieren der unerwünschten internen Initiation effektiv war. Das IPTG-induzierte Produkt der Wirtszellen mit pAE31 hatte 75 kD, während das Produkt aus den mit pAE32 transformierten Zellen 87 kD hatte.
Da wir zeigen konnten, dass ein natürlich vorkommendes amidierendes Enzym der Typ B cDNA posttranslational prozessiert wird und zu Proteinen mit etwa 43 kD führt, haben wir eine Reihe von Mutationen in die Typ B AE-cDNA eingefügt, welche die Expression von Proteinen ermöglichen, die an oder nahe der Position terminieren, an der das natürlich prozessierte Enzym endet. Zwei dieser Mutationen wurden durch Oligonukleotid-Mutagenese hergestellt, während eine dritte wie oben beschrieben durch Adapter-Linker-Mutation generiert wurde. Wenn cDNAs mit diesen Mutationen zum Ersetzen der entsprechenden Segmente von pAE32 verwendet, in JM105 transformiert und in Experimenten ähnlich zu den oben beschriebenen auf ihre Proteinproduktion analysiert wurden, wurden verkürzte alphaamidierende Enzymproteine gefunden. Mittels einer Mutation an Aminosäureposition 396 der Typ B cDNA, die ein natürliches Tyrosinkodon in ein Stopkodon umwandelt (pAE36), wurde ein 39 kD Enzymprotein gefunden, während eine Linker-Mutagenese, welche die Translation am Histidinkodon der Aminosäure 464 beendete, in einem Vektor pAE51 resultierte, der nach Transformation und Induktion von E. coli JM105 ein rekombinantes alpha-amidierendes Enzymprotein von 46 kD produzierte.
Alle oben beschriebenen, in E. coli produzierten, rekombinanten alpha-amidierenden Enzymproteine segregierten mit der unlöslichen Fraktion der Zellextrakte. Die Enzyme konnten durch Behandlung mit 8 M Harnstoff, gefolgt von schneller Lösung in 50 mM Tris-HCl pH 7 löslich und aktiv gemacht werden. Wenn E. coli JM105 enthaltend pAE12 wie beschrieben gezüchtet und mit IPTG induziert wurde, waren die alpha-amidierenden Enzymproteine in Konzentrationen von mindestens 30 mg pro Liter der Bakterienkultur vorhanden.
Repräsentative Proben des induzierten, unlöslichen Proteins, das in E. coli enthaltend AE-Expressionsplasmide hergestellt wurde, sind in den 3 und 4 gezeigt.
BEISPIEL 2
Herstellung des Säuger-Expressionsvektors pd BPV-MMTNEO-AE_A75
Zur Herstellung eines Säuger-Expressionsvektors, der ein 75 kD Typ A alpha-amidierendes Enzym aus Säugerzellen exprimiert und konstitutiv sekretiert (siehe das Flussdiagramm in 1), wurde Folgendes durchgeführt:

1) Der intermediäre Expressionsvektor pdMMTNeo (kommerziell erhältlich bei American Type Culture Collection) (wie gezeigt) wurde mit Bgl II verdaut. Die lineare Form wurde isoliert und aufgereinigt.
2) Die rekombinante Typ A cDNA enthaltend die gesamte Prä-Prosequenz sowie ein künstliches Stopkodon TAA an Position 2146–2148 wurde durch sequentiellen Verdau mit Bgl I und Xho I isoliert. Das dem alpha-amidierenden Enzym korrespondierende Fragment wurde anschließend isoliert und aufgereinigt.
3) Das Insert (Typ A alpha-amidierendes Enzym) und der Vektor (pdMMTNeo) wurden gemischt und die korrespondierenden Enden unter Verwendung des Klenowfragments der DNA-Polymerase I geglättet. Die 5'-überhängenden Segmente wurden durch Zugabe von dNTP ausgefüllt, und die 3'-überhängenden Segmente wurden zur Generierung eines glatten Endes verdaut (alternativ könnten zur Generierung glatter Enden die sequentielle S1-Nuklease und Klenow + dNTP verwendet werden). Die Moleküle mit den geglätteten Enden wurden dann für 16 Stunden bei 15°C ligiert.
4) Das ligierte Material wurde anschließend in E. coli RRI transformiert. Rekombinante Klone wurden in Gegenwart von 50 μg/ml Ampicillin selektiert. Die Orientierung des Inserts in den rekombinanten Klonen wurde durch die Verwendung einer Batterie an Restriktionsenzymen verifiziert. Ein als pdMMTNeo α-AE_A75 bezeichneter Klon (Klon 11) enthielt ermittlungsgemäß die Typ A cDNA in der richtigen Orientierung bezüglich des MMT-Promotors.
5) Plasmid-DNA des rekombinanten pdMMTNeo α-AE_A75 (Klon 11) wurde mit BamHI verdaut. Der linearisierte Vektor wurde isoliert und aufgereinigt und anschließend zum Entfernen der 5'-Phosphate für zwei Stunden bei 37°C mit bakterieller alkaliner Phosphatase (B. A. P.) behandelt. Im Anschluss an B und BamHI- Verdau des Vektors pdBPVMMTNeo wurde das BPV-1-Genom isoliert und auf gereinigt. Dieses BamHI-Fragment der BPV-1-DNA von ungefähr 8,0 kb wurde anschließend in den BamHI-linearisierten und B. A. P.-behandelten pdMMTNeo α-AE_A75-Vektor für drei Stunden bei 14°C ligiert. Nachdem die Ligationsmischung in E. coli RR1 transformiert wurde, wurden die rekombinanten Klone wurden auf 50 μg/ml Ampicillin-LB-Agarplatten selektiert. Die rekombinanten Plasmide wurden auf BPV-DNA und ebenfalls auf Typ A AE-cDNA analysiert. Die Restriktionskartierung ließ erkennen, dass Klon 21 ungefähr 17 kb hatte und eine erwartungsgemäße Restriktionskarte produzierte. Dieses Expressionsplasmid wurde dann zur Expression von α-AE_A75 in murinen C127-Zellen verwendet.
6) Marine C127-Zellen wurden durch das Standard CaPO₄-Präzipitationsverfahren mit 20 μg pdBPV-MMTNeo α-AE_A75 transfiziert. Ungefähr zwei Wochen nach der Transfektion wurden transformierte Foci einzeln gepickt und in Wachstumsmedium enthaltend das Antibiotikum G418 gezüchtet. Sobald die Zellen zu einer ausreichenden Kapazität in Dulbecco's Modified Eagle Medium plus 10% fötalem Kälberserum angewachsen waren, wurden die Klone auf ihre Fähigkeit zur Sekretion des alpha-amidierenden Enzyms analysiert, und zwar durch Messung der enzymatischen Aktivität im konditionierten Zellkulturmedium, sowie durch die Messung der alpha-amidierenden Enzym-Immunreaktivität im Medium unter Verwendung von Standard-Radiomarkierungs- und Immunopräzipitations-Techniken. Klone, die aktives, immunreaktives 75 kD alpha-amidierendes Enzym sekretierten, wurden zu großen Zellzahlen expandiert (Wechsel zu einem Zellkulturmedium mit reduziertem Serum und daher reduzierter Menge an exogenem Protein) und sind zur Herstellung großer Mengen an aktivem rekombinanten Enzym aus dem konditionierten Zellmedium in Verwendung.

Die hier verwendeten Begriffe und Beschreibungen sind Ausführungsformen, die nur der Illustration dienen sollen und nicht beabsichtigen, eine Einschränkung der vielen Variationen darzustellen, die der Fachmann als durchführbar erkennt, wenn er die vorliegende Erfindung praktiziert, wie in den folgenden Ansprüchen definiert.

Claims

Wirt, der zur Expression der Polypeptidsequenz eines alpha-amidierenden Enzyms befähigt ist, wobei der Wirt einen Expressionsvektor umfasst, der einen transkriptionalen Promotor, stromabwärts gefolgt von einer DNA-Sequenz umfasst, welche für den Wirt fremd ist und für Peptidylglycin-α-amidierende Monooxygenase kodiert und eine Sequenz, ausgewählt unter (Typ A)

aufweist, worin die DNA-Sequenz ein Stopkodon stromaufwärts von einer Sequenz enthält, die anderenfalls für eine Membran-überspannende Region kodiert.
Wirt nach Anspruch 1, wobei das Stopkodon zwischen den Basen 2025 und 2275 für die Typ A-Sequenz oder zwischen den Basen 2340 und 2587 für die Typ B-Sequenz enthalten ist.
Expressionsvektor gemäß der Definition in Anspruch 1 oder 2.
Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei die DNA-Sequenz vom Typ A ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei die DNA-Sequenz vom Typ B ist.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei der Vektor gebildet wird, indem man die erste DNA-Sequenz in ein Expressionssystem ligiert, ausgewählt unter pdBPVMMTNeo, pSV₂, pRSV, pMAMNeo, pueK-C1, pCH110 und den Derivaten davon.
Prokaryotischer Wirt, umfassend den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 6.
Eukaryotischer Wirt, umfassend den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 6.
Wirt nach Anspruch 8, wobei der Wirt ausgewählt ist unter IVI mit der Hinterlegungsnummer 10029 (ATTC CRL 10919), Hela, CV1, C127, CHO (Meerschweinchenovarialzellen) und COS.
Rekombinante Peptidylglycin-α-amidierende Monooxygenase, welche produziert wird durch Expression des Vektors nach einem der Ansprüche 3 bis 6 oder durch Expression dieses Enzyms mit einem Wirt nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 7 bis 9.
Verfahren zur Amidierung eines Substrats, wobei man das Substrat mit rekombinanter Peptidylglycin-α-amidierender Monooxygenase nach Anspruch 10 in Kontakt bringt.