JP2535398B2 - アミド化ペプチドの製造方法 - Google Patents
アミド化ペプチドの製造方法Info
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明はヒトカルシトニン前駆体の製造方法に関す
る。
る。
〔従来の技術〕 一般に、真核細胞において、ある種のペプチドまたは
蛋白質はメッセンジャーRNA（mRNA）から翻訳された
後、細胞内酵素により、さらに修飾（ポスト・トランス
レーショナル・モディフィケーション）され、天然型の
ペプチドまたは蛋白質が生ずることが知られている。し
かしながら、現在遺伝子操作によって、真核細胞由来ペ
プチドまたは蛋白質を生産する宿主として広く用いられ
ている大腸菌のような原核細胞では、mRNA翻訳後のペプ
チドまたは蛋白質の修飾をおこなうことができない。
蛋白質はメッセンジャーRNA（mRNA）から翻訳された
後、細胞内酵素により、さらに修飾（ポスト・トランス
レーショナル・モディフィケーション）され、天然型の
ペプチドまたは蛋白質が生ずることが知られている。し
かしながら、現在遺伝子操作によって、真核細胞由来ペ
プチドまたは蛋白質を生産する宿主として広く用いられ
ている大腸菌のような原核細胞では、mRNA翻訳後のペプ
チドまたは蛋白質の修飾をおこなうことができない。
この真核細胞特有なペプチドまたは蛋白質の修飾の一
つに、ペプチドまたは蛋白質のカルボキシル基末端（Ｃ
−末端）α位がアミド化（−COOH基を−CONH2基へ変換
すること）される修飾反応がある。すでにこの修飾は、
真核細胞由来の多くの生理活性ペプチドまたは蛋白質に
起こっていることが知られており、又、しばしばこの修
飾はこれらペプチドまたは蛋白質の生理活性作用発現に
必須であることが知られている。一例を示せば、ヒト・
カルシトニンの場合、天然型のＣ−末端プロリンアミド
残基をプロリン残基に変換すると、生理活性が1600分の
１にも減少することが知られている。
つに、ペプチドまたは蛋白質のカルボキシル基末端（Ｃ
−末端）α位がアミド化（−COOH基を−CONH2基へ変換
すること）される修飾反応がある。すでにこの修飾は、
真核細胞由来の多くの生理活性ペプチドまたは蛋白質に
起こっていることが知られており、又、しばしばこの修
飾はこれらペプチドまたは蛋白質の生理活性作用発現に
必須であることが知られている。一例を示せば、ヒト・
カルシトニンの場合、天然型のＣ−末端プロリンアミド
残基をプロリン残基に変換すると、生理活性が1600分の
１にも減少することが知られている。
近年、真核細胞由来のＣ−末端α一位がアミド化され
たペプチドまたは蛋白質（以後アミド化ペプチドと略
す）の生合成機構を明らかにすることの重要性に加え、
遺伝子操作を用いてアミド化ペプチドを大量生産する手
段としても、真核細胞特有なアミド化ペプチドの詳細な
生合成機構に関する研究がなされてきた。まず、多くの
アミド化ペプチドのcDNAの解析から、これらアミド化ペ
プチドの前駆体構造が明らかにされた。この結果アミド
化ペプチドの共通の前駆体構造は、一般式Ｒ−Ｘ−Gly
（式中、ＸはＣ−末端α−アミド化される任意のアミノ
酸残基を示し、 Glyはグリシン残基を示し、そしてＲはペプチドの残
りの部分を示す）であることが推定された。一方、この
アミド化ペプチド前駆体をアミド化ペプチドに変換する
（Ｒ−Ｘ−Gly→Ｒ−Ｘ−NH2）酵素（Ｃ−末端α−アミ
ド化酵素）については、1982年Bradburyらにより初めて
報告された。すなわち彼らは、合成基質Ｄ−Tyr−Val−
GlyをＤ−Tyr−Val−NH2に変換する酵素活性が、ブタ、
下垂体中に存在することを示し、さらに基質のＣ−末端
グリシン残基がアミドの窒素（Ｎ）の供与体として必須
であることを示した（Bradbury,A.F.等;Nature,298,686
−688,1982）。次に、Eipperらは、この酵素活性がラッ
ト下垂体の前葉・中葉及び後葉に存在していることを報
告し、この酵素の最大酵素活性を得るためには、分子状
酵素のほかに、銅イオン（Cu2+）とアスコルビン酸が必
要であることを報告した（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,8
0,5144−5148,1983）。
たペプチドまたは蛋白質（以後アミド化ペプチドと略
す）の生合成機構を明らかにすることの重要性に加え、
遺伝子操作を用いてアミド化ペプチドを大量生産する手
段としても、真核細胞特有なアミド化ペプチドの詳細な
生合成機構に関する研究がなされてきた。まず、多くの
アミド化ペプチドのcDNAの解析から、これらアミド化ペ
プチドの前駆体構造が明らかにされた。この結果アミド
化ペプチドの共通の前駆体構造は、一般式Ｒ−Ｘ−Gly
（式中、ＸはＣ−末端α−アミド化される任意のアミノ
酸残基を示し、 Glyはグリシン残基を示し、そしてＲはペプチドの残
りの部分を示す）であることが推定された。一方、この
アミド化ペプチド前駆体をアミド化ペプチドに変換する
（Ｒ−Ｘ−Gly→Ｒ−Ｘ−NH2）酵素（Ｃ−末端α−アミ
ド化酵素）については、1982年Bradburyらにより初めて
報告された。すなわち彼らは、合成基質Ｄ−Tyr−Val−
GlyをＤ−Tyr−Val−NH2に変換する酵素活性が、ブタ、
下垂体中に存在することを示し、さらに基質のＣ−末端
グリシン残基がアミドの窒素（Ｎ）の供与体として必須
であることを示した（Bradbury,A.F.等;Nature,298,686
−688,1982）。次に、Eipperらは、この酵素活性がラッ
ト下垂体の前葉・中葉及び後葉に存在していることを報
告し、この酵素の最大酵素活性を得るためには、分子状
酵素のほかに、銅イオン（Cu2+）とアスコルビン酸が必
要であることを報告した（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,8
0,5144−5148,1983）。
さらに、最近では種々の組織から、Ｃ−末端α−アミ
ド化酵素の精製が試みられており、まずMizuno等はアフ
リカツメガエル（Xenopus laevis）の体皮より、Ｃ−末
端α−アミド化酵素を単一で純粋な状態まで精製するこ
とに成功し（Mizuno,k等、Biochem.Biophys.Res.Commu
n.137,984−991,1986.及び特願昭61−131089）、又、本
発明者らにより、この酵素のcDNAクローニングが成され
た。この結果、この酵素の全アミノ酸配列が明らかにさ
れ、さらにカエルには少なくとも種類の異なる２種類の
酵素が存在していることも明らかにされた（Mizuno,k
等、Biochem.Biophys.Res.Commun.148,546−552,1987.O
hsue,k等、Biochem.Biophys.Res.Commun.150,1275−128
1,1988.及び特願昭62−177184）。
ド化酵素の精製が試みられており、まずMizuno等はアフ
リカツメガエル（Xenopus laevis）の体皮より、Ｃ−末
端α−アミド化酵素を単一で純粋な状態まで精製するこ
とに成功し（Mizuno,k等、Biochem.Biophys.Res.Commu
n.137,984−991,1986.及び特願昭61−131089）、又、本
発明者らにより、この酵素のcDNAクローニングが成され
た。この結果、この酵素の全アミノ酸配列が明らかにさ
れ、さらにカエルには少なくとも種類の異なる２種類の
酵素が存在していることも明らかにされた（Mizuno,k
等、Biochem.Biophys.Res.Commun.148,546−552,1987.O
hsue,k等、Biochem.Biophys.Res.Commun.150,1275−128
1,1988.及び特願昭62−177184）。
一方、Eipperらは、牛脳下垂体由来のＣ−末端α−ア
ミド化酵素のcDNAクローニングを行い、牛脳下垂体由来
のＣ−末端α−アミド化酵素は前者（Xenopus由来）と
はアミノ酸配列上明らかに異なる酵素であることを明ら
かにした（Eipper,B.等Mol.Endo.1,777−790,1987）。
ミド化酵素のcDNAクローニングを行い、牛脳下垂体由来
のＣ−末端α−アミド化酵素は前者（Xenopus由来）と
はアミノ酸配列上明らかに異なる酵素であることを明ら
かにした（Eipper,B.等Mol.Endo.1,777−790,1987）。
これらの研究により現在までに、真核細胞ではＣ−末
端α−アミド化酵素が複数存在していることが明らかに
されてきた。このことは、個々のＣ−末端α−アミド化
酵素がそれぞれ異なる基質特異性を示す、言い換えれ
ば、生体内において個々のアミド化ペプチドの生合成に
関し、それぞれ固有のＣ−末端α−アミド化酵素が存在
している可能性を示しているが、現在までのところ、こ
の問題に関する詳細については明らかにされていない。
端α−アミド化酵素が複数存在していることが明らかに
されてきた。このことは、個々のＣ−末端α−アミド化
酵素がそれぞれ異なる基質特異性を示す、言い換えれ
ば、生体内において個々のアミド化ペプチドの生合成に
関し、それぞれ固有のＣ−末端α−アミド化酵素が存在
している可能性を示しているが、現在までのところ、こ
の問題に関する詳細については明らかにされていない。
以上述べた様に、現在までに解明されてきた真核細胞
のアミド化ペプチド生合成機構を考えれば、以下に示す
方法を用いてアミド化ペプチドを大量生産することが可
能と思われる。すなわち、まず、一般式Ｒ−Ｘ−Glyで
示されるアミド化ペプチド前駆体を遺伝子操作を用いて
大腸菌などの原核細胞で大量発現させ、大量かつ安価に
製造する方法を見いだし、次に、真核細胞由来のＣ−末
端α−アミド化酵素を何らかの方法で十分量確保し、さ
らに、in vitroでアミド化ペプチド前駆体と、Ｃ−末端
α−アミド化酵素とを用いて、アミド化ペプチドを生産
する至適反応条件を確立することができれば、アミド化
ペプチドを大量かつ安価に製造することが可能と思われ
る。事実、現在までに、この考え方に基づき、アミド化
ペプチドを製造しようとする試みが、数多くなされてき
た。
のアミド化ペプチド生合成機構を考えれば、以下に示す
方法を用いてアミド化ペプチドを大量生産することが可
能と思われる。すなわち、まず、一般式Ｒ−Ｘ−Glyで
示されるアミド化ペプチド前駆体を遺伝子操作を用いて
大腸菌などの原核細胞で大量発現させ、大量かつ安価に
製造する方法を見いだし、次に、真核細胞由来のＣ−末
端α−アミド化酵素を何らかの方法で十分量確保し、さ
らに、in vitroでアミド化ペプチド前駆体と、Ｃ−末端
α−アミド化酵素とを用いて、アミド化ペプチドを生産
する至適反応条件を確立することができれば、アミド化
ペプチドを大量かつ安価に製造することが可能と思われ
る。事実、現在までに、この考え方に基づき、アミド化
ペプチドを製造しようとする試みが、数多くなされてき
た。
まず第一に、アミド化ペプチド前駆体の製造に関して
は、大腸菌を用いた遺伝子操作による製造が数多く報告
されている。例えば、ベネット、アラン、デビット等
は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（CAT）蛋白質の活性部分とヒト・カルシトニン前駆体
（hCT−Gly）の融合タンパクを大腸菌を発現した後、ヒ
ト・カルシトニン前駆体を生産する方法について報告し
ている（特表昭60−501391）。
は、大腸菌を用いた遺伝子操作による製造が数多く報告
されている。例えば、ベネット、アラン、デビット等
は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（CAT）蛋白質の活性部分とヒト・カルシトニン前駆体
（hCT−Gly）の融合タンパクを大腸菌を発現した後、ヒ
ト・カルシトニン前駆体を生産する方法について報告し
ている（特表昭60−501391）。
しかし、この方法では融合蛋白質44mgからヒト・カル
シトニン前駆体（hCT−Gly）が約1.1〜2.0mgしか得られ
ず、hCT−Glyの生産系としては効率よい方法とは言えな
い。
シトニン前駆体（hCT−Gly）が約1.1〜2.0mgしか得られ
ず、hCT−Glyの生産系としては効率よい方法とは言えな
い。
一方、本発明者らは、β−ガラクトシターゼ由来の蛋
白とヒト・カルシトニン前駆体構造を含むペプチド（hC
T−Gly−Lys−Lys−Arg）との融合タンパクを大腸菌を
用いて発現させ、hCT−Gly−Lys−Lys−Argを極めて効
率よく生産する方法について報告している（特願昭63−
49723）。
白とヒト・カルシトニン前駆体構造を含むペプチド（hC
T−Gly−Lys−Lys−Arg）との融合タンパクを大腸菌を
用いて発現させ、hCT−Gly−Lys−Lys−Argを極めて効
率よく生産する方法について報告している（特願昭63−
49723）。
しかし、このペプチドは、そのままではＣ−末端α−
アミド化酵素の基質とはならず、何らかの方法でhCT−G
lyへ変換する必要がある。
アミド化酵素の基質とはならず、何らかの方法でhCT−G
lyへ変換する必要がある。
第二に、Ｃ−末端α−アミド化酵素の選択及び量の確
保に関しては、イートマン、マイケル等による、ブタ下
垂体より部分的に精製したＣ−末端α−アミド化酵素を
用いてヒト・カルシトニンを製造した例（特表昭63−50
1541）がある。
保に関しては、イートマン、マイケル等による、ブタ下
垂体より部分的に精製したＣ−末端α−アミド化酵素を
用いてヒト・カルシトニンを製造した例（特表昭63−50
1541）がある。
しかし、この方法も含め、天然の組織及び細胞から目
的とするＣ−末端α−アミド化酵素を十分量得ることは
困難であり、コストも高く、実際、産業上アミド化ペプ
チドを大量に生産するには実用的でないと考えられる。
この点に関し、本発明者らは、カエル体皮由来のＣ−末
端α−アミド化酵素及びこの誘導体を遺伝子操作を用
い、大腸菌内で大量に発現させ、この酵素を大量に確保
する方法を開発した（特願昭62−306867）。
的とするＣ−末端α−アミド化酵素を十分量得ることは
困難であり、コストも高く、実際、産業上アミド化ペプ
チドを大量に生産するには実用的でないと考えられる。
この点に関し、本発明者らは、カエル体皮由来のＣ−末
端α−アミド化酵素及びこの誘導体を遺伝子操作を用
い、大腸菌内で大量に発現させ、この酵素を大量に確保
する方法を開発した（特願昭62−306867）。
しかしながら、大腸菌内で発現させたカエル体皮由来
のＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体は、カエル
体皮より精製した酵素に比べ比活性が低く、アミド化ペ
プチドを大量生産するのに用いるためには、現在、より
比活性の高い酵素の供給方法が望まれている。
のＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体は、カエル
体皮より精製した酵素に比べ比活性が低く、アミド化ペ
プチドを大量生産するのに用いるためには、現在、より
比活性の高い酵素の供給方法が望まれている。
第三に、in vitroでアミド化ペプチド前駆体とＣ−末
端α−アミド化酵素とでアミド化ペプチドを製造する際
の至適反応条件に関しては、前記したように、この酵素
反応に銅イオン（Cu2+）、分子状酸素、アスコルビン
酸、及びカタラーゼが必要とされていることが判ってい
たが、例えば、特表昭63−501541で報告されているよう
に、ヒト・カルシトニン前駆体をブタ下垂体より部分的
に精製したＣ−末端α−アミド化酵素でヒト・カルシト
ニンを製造する場合、この酵素の至適反応条件ではヒト
・カルシトニン前駆体の溶解度が低く、反応が効率よく
起こらないこと知られている。従ってこの反応をin vit
roで効率よく行わせるためには、目的ペプチドに最適な
反応条件を見いだすことが必須と考えられる。
端α−アミド化酵素とでアミド化ペプチドを製造する際
の至適反応条件に関しては、前記したように、この酵素
反応に銅イオン（Cu2+）、分子状酸素、アスコルビン
酸、及びカタラーゼが必要とされていることが判ってい
たが、例えば、特表昭63−501541で報告されているよう
に、ヒト・カルシトニン前駆体をブタ下垂体より部分的
に精製したＣ−末端α−アミド化酵素でヒト・カルシト
ニンを製造する場合、この酵素の至適反応条件ではヒト
・カルシトニン前駆体の溶解度が低く、反応が効率よく
起こらないこと知られている。従ってこの反応をin vit
roで効率よく行わせるためには、目的ペプチドに最適な
反応条件を見いだすことが必須と考えられる。
以上述べたように、現在、アミド化ペプチドを大量か
つ安価に得るためには、少なくとも三つの技術的問題、
すなわち、アミド化ペプチド前駆体をいかに効率よく
生産するか。Ｃ−末端α−アミド化酵素をいかにして
十分量確保するか。in vitroで、アミド化ペプチド前
駆体とＣ−末端α−アミド化酵素でアミド化ペプチドを
製造する際の至適反応条件をいかに設定するか。以上三
つの技術的問題を解決しなければならず、現在、これら
の解決策が望まれている。
つ安価に得るためには、少なくとも三つの技術的問題、
すなわち、アミド化ペプチド前駆体をいかに効率よく
生産するか。Ｃ−末端α−アミド化酵素をいかにして
十分量確保するか。in vitroで、アミド化ペプチド前
駆体とＣ−末端α−アミド化酵素でアミド化ペプチドを
製造する際の至適反応条件をいかに設定するか。以上三
つの技術的問題を解決しなければならず、現在、これら
の解決策が望まれている。
従って本発明は、まず、一般式Ｒ−Ｘ−Glyで示され
るアミド化ペプチド前駆体を大量かつ安価に生産する方
法を提供し、次に、活性の高いＣ−末端α−アミド化酵
素を十分量確保する方法を提供し、さらには、アミド化
ペプチド前駆体とＣ−末端α−アミド化酵素を用い、in
vitroでアミド化反応の至適反応条件を設定することに
より、産業上有用なアミド化ペプチド（例えばヒト・カ
ルシトニン）を、大量かつ安価に製造することができる
方法を提供しようとするものである。
るアミド化ペプチド前駆体を大量かつ安価に生産する方
法を提供し、次に、活性の高いＣ−末端α−アミド化酵
素を十分量確保する方法を提供し、さらには、アミド化
ペプチド前駆体とＣ−末端α−アミド化酵素を用い、in
vitroでアミド化反応の至適反応条件を設定することに
より、産業上有用なアミド化ペプチド（例えばヒト・カ
ルシトニン）を、大量かつ安価に製造することができる
方法を提供しようとするものである。
本発明者等は、前記に述べた三つの課題の解決方法を
種々検討した結果、まず第一の課題、すなわち、アミド
化ペプチド前駆体の大量かつ安価な製造法としては、ア
ミド化されるべきアミノ酸のＣ−末端側にグリシン残基
を有しさらにこのグリシン残基のＣ−末端側に任意のア
ミノ酸又はオリゴペプチドを有するペプチド、例えばシ
ステイン残基を含有する生理活性ペプチドの製造方法
（特願昭63−49723）に従って製造されたヒト・カルシ
トニン前駆体構造を含むペプチド（hCT−Gly−Lys−Lys
−Arg又はHPCT）をカルボキシペプチダーゼＢ（CpB）で
処理することにより目的とするヒト・カルシトニン前駆
体（hCT−Gly）が大量かつ安価に製造できることを見い
だした。次に第二の課題、すなわち、比活性の高いＣ−
末端α−アミド化酵素をいかにして十分量確保するかに
関する解決策としては、本発明者等が報告したアフリカ
ツメガエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びそ
の誘導体を遺伝子操作し、動物細胞で発現させることに
より、比活性の高いＣ−末端α−アミド化酵素を十分量
生産できることを見いだした。さらに、第三の課題、す
なわち、in vitroでのアミド化反応の至適条件設定に関
しては、一例として、ヒト・カルシトニン前駆体と前記
した方法で生産したＣ−末端α−アミド化酵素とを用
い、アミド化反応の至適条件を種々検討した結果、きわ
めて効率の良い反応条件を見いだすことができ、本発明
を完成するに至った。
種々検討した結果、まず第一の課題、すなわち、アミド
化ペプチド前駆体の大量かつ安価な製造法としては、ア
ミド化されるべきアミノ酸のＣ−末端側にグリシン残基
を有しさらにこのグリシン残基のＣ−末端側に任意のア
ミノ酸又はオリゴペプチドを有するペプチド、例えばシ
ステイン残基を含有する生理活性ペプチドの製造方法
（特願昭63−49723）に従って製造されたヒト・カルシ
トニン前駆体構造を含むペプチド（hCT−Gly−Lys−Lys
−Arg又はHPCT）をカルボキシペプチダーゼＢ（CpB）で
処理することにより目的とするヒト・カルシトニン前駆
体（hCT−Gly）が大量かつ安価に製造できることを見い
だした。次に第二の課題、すなわち、比活性の高いＣ−
末端α−アミド化酵素をいかにして十分量確保するかに
関する解決策としては、本発明者等が報告したアフリカ
ツメガエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びそ
の誘導体を遺伝子操作し、動物細胞で発現させることに
より、比活性の高いＣ−末端α−アミド化酵素を十分量
生産できることを見いだした。さらに、第三の課題、す
なわち、in vitroでのアミド化反応の至適条件設定に関
しては、一例として、ヒト・カルシトニン前駆体と前記
した方法で生産したＣ−末端α−アミド化酵素とを用
い、アミド化反応の至適条件を種々検討した結果、きわ
めて効率の良い反応条件を見いだすことができ、本発明
を完成するに至った。
従って、本発明は、まず第一に一般式Ｒ−Ｘ−Gly−
Ｂ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を示し、Glyはグリ
シン残基を示し、Ｂは１個又は複数個のアルギニン残
基、リジン残基又はアルギニン残基とリジン残基から構
成される任意のアミノ酸配列を示し、そしてＲはペプチ
ド又は蛋白質の残りの部分を示す）で示されるペプチド
（原料ペプチド又は蛋白質）を、カルボキシペプチダー
ゼ（CpB）で処理することにより、一般式Ｒ−Ｘ−Gly
（式中、ＸはＣ−末端α−アミド化される任意のアミノ
酸残基を示し、そしてＲ及びGlyは前記の意味を有す
る）で示されるアミド化ペプチド前駆体を、大量にしか
も効率よく製造することを特徴とするアミド化ペプチド
前駆体の製造方法を提供しようとするものである。
Ｂ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を示し、Glyはグリ
シン残基を示し、Ｂは１個又は複数個のアルギニン残
基、リジン残基又はアルギニン残基とリジン残基から構
成される任意のアミノ酸配列を示し、そしてＲはペプチ
ド又は蛋白質の残りの部分を示す）で示されるペプチド
（原料ペプチド又は蛋白質）を、カルボキシペプチダー
ゼ（CpB）で処理することにより、一般式Ｒ−Ｘ−Gly
（式中、ＸはＣ−末端α−アミド化される任意のアミノ
酸残基を示し、そしてＲ及びGlyは前記の意味を有す
る）で示されるアミド化ペプチド前駆体を、大量にしか
も効率よく製造することを特徴とするアミド化ペプチド
前駆体の製造方法を提供しようとするものである。
第二に、第一の方法で得たアミド化ペプチド前駆体
と、Ｃ−末端α−アミド化酵素を用い、in vitroでアミ
ド化ペプチドを得る際の至適反応条件（基質濃度、アス
コルビン酸濃度、Cu2+濃度、Bufferの種類・濃度・pH、
及びカタラーゼ濃度）を設定することを特徴とするアミ
ド化ペプチドの製造方法を提供しようとするものであ
る。なお、本発明においては任意のＣ−末端α−アミド
化酵素を使用することができ、例えばアフリカツメガエ
ル体皮由来の酵素、ヒト甲伏腺由来の酵素（本特許出願
と同日に出願された「ヒト甲伏腺由来Ｃ−末端アミド化
酵素」と題する特許出願の明細書中に詳細に記載されて
いる。）等を挙げることができる。
と、Ｃ−末端α−アミド化酵素を用い、in vitroでアミ
ド化ペプチドを得る際の至適反応条件（基質濃度、アス
コルビン酸濃度、Cu2+濃度、Bufferの種類・濃度・pH、
及びカタラーゼ濃度）を設定することを特徴とするアミ
ド化ペプチドの製造方法を提供しようとするものであ
る。なお、本発明においては任意のＣ−末端α−アミド
化酵素を使用することができ、例えばアフリカツメガエ
ル体皮由来の酵素、ヒト甲伏腺由来の酵素（本特許出願
と同日に出願された「ヒト甲伏腺由来Ｃ−末端アミド化
酵素」と題する特許出願の明細書中に詳細に記載されて
いる。）等を挙げることができる。
第三に、前記第一の方法及び第二の方法を用いて原料
ペプチド又は蛋白質からアミド化ペプチド又は蛋白質を
製造する方法を提供するものである。
ペプチド又は蛋白質からアミド化ペプチド又は蛋白質を
製造する方法を提供するものである。
（１）ヒト・カルシトニン前駆体及び他のアミド化ペプ
チド前駆体の製造方法 本発明者らは、以前ヒト・カルシトニン前駆体構造を
含むペプチド（hCT−Gly−Lys−Lys−Arg又はHPCT）を
極めて効率よく、しかも大量に得る方法を報告した（特
願昭63−49723）。しかしながら、このペプチドは、直
接、Ｃ−末端α−アミド化酵素の基質とはなりえない。
したがって、ヒト・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）を
得るためには、何らかの方法を用いて、hCT−Gly−Lys
−Lys−ArgのＣ−末端部分に存在するLys−Lys−Argを
除去しなければならない。本発明者等は、hCT−Gly−Ly
s−Lys−ArgをカルボキシペプチダーゼＢ（CpB）で処理
すれば、hCT−Gly−Lys−Lys−Argから目的とするヒト
・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）が、極めて効率よく
得られることを見いだした。なお、本発明の実施例に
は、hCT−Gly−Lys−Lys−ArgをCpBを用いhCT−Glyを製
造する方法について具体的に述べるが、この方法は、一
般式Ｒ−Ｘ−Gly（式中、R,X、及びGlyは前記の意味を
有する）で示されるアミド化ペプチド前駆体の製造方法
として、一般式Ｒ−Ｘ−Gly−Ｂ（式中、R,X,Gly、及び
Ｂは前記の意味を有する）で示されるアミド化ペプチド
前駆体構造を含むペプチドを、まず、化学合成又は遺伝
子操作で大腸菌などの原核細胞で大量かつ安価に製造
し、次にこれをCpBで処理すれば、目的とするアミド化
ペプチド前駆体（Ｒ−Ｘ−Gly）が容易に得ることがで
きることを示している。本発明におけるアミド化ペプチ
ドの製造法の有用性は、従来の技術（特表昭60−50139
1）に報告されているような、アミド化ペプチド前駆体
（Ｒ−Ｘ−Gly）が融合蛋白法を用いて、直接大腸菌内
で発現させ製造する方法に比べ、以下に述べる点におい
て優れている。
チド前駆体の製造方法 本発明者らは、以前ヒト・カルシトニン前駆体構造を
含むペプチド（hCT−Gly−Lys−Lys−Arg又はHPCT）を
極めて効率よく、しかも大量に得る方法を報告した（特
願昭63−49723）。しかしながら、このペプチドは、直
接、Ｃ−末端α−アミド化酵素の基質とはなりえない。
したがって、ヒト・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）を
得るためには、何らかの方法を用いて、hCT−Gly−Lys
−Lys−ArgのＣ−末端部分に存在するLys−Lys−Argを
除去しなければならない。本発明者等は、hCT−Gly−Ly
s−Lys−ArgをカルボキシペプチダーゼＢ（CpB）で処理
すれば、hCT−Gly−Lys−Lys−Argから目的とするヒト
・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）が、極めて効率よく
得られることを見いだした。なお、本発明の実施例に
は、hCT−Gly−Lys−Lys−ArgをCpBを用いhCT−Glyを製
造する方法について具体的に述べるが、この方法は、一
般式Ｒ−Ｘ−Gly（式中、R,X、及びGlyは前記の意味を
有する）で示されるアミド化ペプチド前駆体の製造方法
として、一般式Ｒ−Ｘ−Gly−Ｂ（式中、R,X,Gly、及び
Ｂは前記の意味を有する）で示されるアミド化ペプチド
前駆体構造を含むペプチドを、まず、化学合成又は遺伝
子操作で大腸菌などの原核細胞で大量かつ安価に製造
し、次にこれをCpBで処理すれば、目的とするアミド化
ペプチド前駆体（Ｒ−Ｘ−Gly）が容易に得ることがで
きることを示している。本発明におけるアミド化ペプチ
ドの製造法の有用性は、従来の技術（特表昭60−50139
1）に報告されているような、アミド化ペプチド前駆体
（Ｒ−Ｘ−Gly）が融合蛋白法を用いて、直接大腸菌内
で発現させ製造する方法に比べ、以下に述べる点におい
て優れている。
ヒト・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）を例に具体的
に示せば、このペプチドは、リジン残基とアスパラギン
酸残基をそれぞれ一残基含む、全体として33アミノ酸残
基から成るペプチドで、ペプチド全体としてpl（等電
点）は中性付近を示す。従って、このペプチドを融合蛋
白質として大腸菌などで発現させ、この融合蛋白質を、
適当なプロテアーゼを用いてhCT−Glyを回収する場合
に、hCT−GlyをhCT−Glyの相手方蛋白質、ならびに相手
方蛋白質より生ずるペプチドフラグメントと分離するこ
とが必要となるが、hCT−GlyのpIが中性付近を示す為
に、簡単なイオン交換クロマトグラフィーなどの分離操
作でhCT−Glyを完全に精製することが困難である。一
方、先に本発明者らにより開発された様に（特願昭63−
49723）hCT−GlyのＣ−末端にLys−Lys−Argを付加した
ペプチド（hCT−Gly−Lys−Lys−Arg）はこのペプチド
全体としてPIは塩基性を示し、簡単なイオン交換クロマ
トグラフィーを行うことにより、容易に精製することが
できる。さらに、このようにして精製したhCT−Gly−Ly
s−Lys−ArgをCpBで処理すれば、目的のアミド化ペプチ
ド前駆体（hCT−Gly）は、この反応で副生すると考えら
れるhCT−Gly−Lys、hCT−Gly−Lys−Lys、及び原料のh
CT−Gly−Lys−Lys−Argからは簡単なイオン交換クロマ
トグラフィー、または逆相クロマトグラフィーなどを用
い簡単に精製することができる。
に示せば、このペプチドは、リジン残基とアスパラギン
酸残基をそれぞれ一残基含む、全体として33アミノ酸残
基から成るペプチドで、ペプチド全体としてpl（等電
点）は中性付近を示す。従って、このペプチドを融合蛋
白質として大腸菌などで発現させ、この融合蛋白質を、
適当なプロテアーゼを用いてhCT−Glyを回収する場合
に、hCT−GlyをhCT−Glyの相手方蛋白質、ならびに相手
方蛋白質より生ずるペプチドフラグメントと分離するこ
とが必要となるが、hCT−GlyのpIが中性付近を示す為
に、簡単なイオン交換クロマトグラフィーなどの分離操
作でhCT−Glyを完全に精製することが困難である。一
方、先に本発明者らにより開発された様に（特願昭63−
49723）hCT−GlyのＣ−末端にLys−Lys−Argを付加した
ペプチド（hCT−Gly−Lys−Lys−Arg）はこのペプチド
全体としてPIは塩基性を示し、簡単なイオン交換クロマ
トグラフィーを行うことにより、容易に精製することが
できる。さらに、このようにして精製したhCT−Gly−Ly
s−Lys−ArgをCpBで処理すれば、目的のアミド化ペプチ
ド前駆体（hCT−Gly）は、この反応で副生すると考えら
れるhCT−Gly−Lys、hCT−Gly−Lys−Lys、及び原料のh
CT−Gly−Lys−Lys−Argからは簡単なイオン交換クロマ
トグラフィー、または逆相クロマトグラフィーなどを用
い簡単に精製することができる。
次に、この方法の第二の利点としては、本発明者等に
より開発された（特願昭63−49723）系において、hCT−
Gly−Lys−Lys−Arg生産に用いたのと基本的には同一発
現プラスミッドを用い、hCT−Glyを発現したところ、hC
T−Gly−Lys−Lys−Argの場合に比べ、hCT−Glyとβ−
ガラクトシターゼの部分構造を含む融合タンパクの生産
性が、hCT−Gly−Lys−Lys−Argのそれに比べ、著しく
減少すると言うまったく予測し得ない事実を見いだし
た。又、このキメラ蛋白質の生産性の減少は、hCT−Gly
のＣ−末端に塩基性アミノ酸残基、例えばArg残基を付
加したhCT−Gly−Arg、さらにhCT−Gly−Arg−Arg−Arg
などではhCT−Gly−Lys−Lys−Argと同じくらいの生産
性を示すと言うまったく新しい事実を発見した。従っ
て、これらの実験事実を考え合わせると、本発明で示す
アミド化ヘプチドの新規製造法が、従来法に比べいかに
優れているかが判る。
より開発された（特願昭63−49723）系において、hCT−
Gly−Lys−Lys−Arg生産に用いたのと基本的には同一発
現プラスミッドを用い、hCT−Glyを発現したところ、hC
T−Gly−Lys−Lys−Argの場合に比べ、hCT−Glyとβ−
ガラクトシターゼの部分構造を含む融合タンパクの生産
性が、hCT−Gly−Lys−Lys−Argのそれに比べ、著しく
減少すると言うまったく予測し得ない事実を見いだし
た。又、このキメラ蛋白質の生産性の減少は、hCT−Gly
のＣ−末端に塩基性アミノ酸残基、例えばArg残基を付
加したhCT−Gly−Arg、さらにhCT−Gly−Arg−Arg−Arg
などではhCT−Gly−Lys−Lys−Argと同じくらいの生産
性を示すと言うまったく新しい事実を発見した。従っ
て、これらの実験事実を考え合わせると、本発明で示す
アミド化ヘプチドの新規製造法が、従来法に比べいかに
優れているかが判る。
（２）Ｃ−末端α−アミド化酵素の製造法 すでに本発明者らは、カエル体皮由来のＣ−末端α−
アミド化酵素、及びこの誘導体を遺伝子操作を用い、大
腸菌内で大量に発現させ、この酵素を大量に発現させる
ことに成功している（特願昭62−306867）。しかし、こ
の方法で発現したＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘
導体は、大腸菌内でそのほとんどが変性（蛋白質のアミ
ノ酸配列は同一であるが、二次・三次構造が異なる）し
ており、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を示さない。従
って、この様な方法で製造した不活性な酵素は、何らか
の方法を用いて活性型に変換する（renaturation）こと
が必要となる。前記記載の発明においては、この問題を
解決するために、大腸菌で発現させた酵素を尿素または
グアニジン塩酸塩などの変性剤で処理した後、renatura
tionさせることにより部分的にこの問題を解決した。し
かし、この方法でもこれらの酵素活性は天然より精製し
たＣ−末端α−アミド化酵素の比活性には及ばないこと
が判った。本発明者らは、この原因の一つが、カエル体
皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びこの誘導体に複
数個存在しているシステイン残基（カエル体皮由来のＣ
−末端α−アミド化酵素の一つは分子内に10個のシステ
イン残基を有している）が、大腸菌内でこの酵素を発現
した場合、天然型と同様なシスチン結合（Ｓ−Ｓ結合）
を形成することができないと考えた。そこで、本発明者
らは、大腸菌で発現した酵素を前記した変性剤に加え、
還元剤（例えば、DTTまたは２−メルカプトエタノー
ル）などで処理した後、様々な方法を用いて酸化させる
ことにより、renaturationを試みたが、酵素活性を高め
ることはできなかった。そこで、本発明者らは、この問
題を解決する新たな手段として、先に得た、カエル体皮
由来のＣ−末端α−アミド化酵素cDNAを用い、２種類
（カエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びその
誘導体）のＣ−末端α−アミド化酵素を動物細胞で発現
させることにより、酵素活性の高いＣ−末端α−アミド
化酵素を、大量に得ることを計画した。すなわち、ま
ず、カエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素（XA45
7）としては、特願昭62−306867の第１−１図〜第１−
３図に記載されているpXA457cDNAにコードされているア
ミノ酸配列１から400番目までのアミノ酸一次配列をコ
ードするcDNAを、一方、その誘導体（XA 799 Bag II）
としては、特願昭62−306887の第16−１図〜第16−３図
に記載されているpXA799 cDANにコードされているアミ
ノ酸配列−39から692番目までのアミノ酸一次配列をＮ
−末端に、これにひき続くＣ−末端がロイシン残基が付
加したアミノ酸配列をコードする遺伝子を、それぞれSV
40プロモーター支配下、動物細胞内で発現されるように
デザインしたプラスミッド（このプラスミッドをそれぞ
れpKDPXA457大びpKDPXA799 Bal II）を作成する。次に
これらのプラスミッドを常法に従い、それぞれCHO細胞
（チャイニーズハムスター卵巣由来細胞）へ導入し、目
的遺伝子が導入された細胞（この細胞をそれぞれCHO/pK
DPXA457−α及びCHO/pKDPXA799 Bal II−αとする）を
得た。次に、このようにして得た細胞をメトトレキセー
ト（MTX）濃度を順次上昇させた培地で培養することに
より導入遺伝子が増幅された細胞株を得た。最終的に
は、pKDPXA799 Bal IIを導入した細胞集団から、クロー
ニング操作を行うことにより、大量のＣ−末端α−アミ
ド化酵素活性（2000unit/ml）を培養上清中へ分泌する
Ｃ−末端α−アミド化酵素（これをXA799 Bal IIとす
る）生産株CHO/10Cを樹立することができた。さらに、
本発明者らは、前記培養上清中に分泌されたＣ−末端α
−アミド化酵素は、この培養液を硫安（硫酸アンモニウ
ム）で処理すれば、特異的にこの酵素を沈澱させること
ができることを見いだした。以上の結果、本発明者ら
は、実用化しうるに十分量のＣ−末端α−アミド化酵素
を製造する方法を確立することができた。
アミド化酵素、及びこの誘導体を遺伝子操作を用い、大
腸菌内で大量に発現させ、この酵素を大量に発現させる
ことに成功している（特願昭62−306867）。しかし、こ
の方法で発現したＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘
導体は、大腸菌内でそのほとんどが変性（蛋白質のアミ
ノ酸配列は同一であるが、二次・三次構造が異なる）し
ており、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を示さない。従
って、この様な方法で製造した不活性な酵素は、何らか
の方法を用いて活性型に変換する（renaturation）こと
が必要となる。前記記載の発明においては、この問題を
解決するために、大腸菌で発現させた酵素を尿素または
グアニジン塩酸塩などの変性剤で処理した後、renatura
tionさせることにより部分的にこの問題を解決した。し
かし、この方法でもこれらの酵素活性は天然より精製し
たＣ−末端α−アミド化酵素の比活性には及ばないこと
が判った。本発明者らは、この原因の一つが、カエル体
皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びこの誘導体に複
数個存在しているシステイン残基（カエル体皮由来のＣ
−末端α−アミド化酵素の一つは分子内に10個のシステ
イン残基を有している）が、大腸菌内でこの酵素を発現
した場合、天然型と同様なシスチン結合（Ｓ−Ｓ結合）
を形成することができないと考えた。そこで、本発明者
らは、大腸菌で発現した酵素を前記した変性剤に加え、
還元剤（例えば、DTTまたは２−メルカプトエタノー
ル）などで処理した後、様々な方法を用いて酸化させる
ことにより、renaturationを試みたが、酵素活性を高め
ることはできなかった。そこで、本発明者らは、この問
題を解決する新たな手段として、先に得た、カエル体皮
由来のＣ−末端α−アミド化酵素cDNAを用い、２種類
（カエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びその
誘導体）のＣ−末端α−アミド化酵素を動物細胞で発現
させることにより、酵素活性の高いＣ−末端α−アミド
化酵素を、大量に得ることを計画した。すなわち、ま
ず、カエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素（XA45
7）としては、特願昭62−306867の第１−１図〜第１−
３図に記載されているpXA457cDNAにコードされているア
ミノ酸配列１から400番目までのアミノ酸一次配列をコ
ードするcDNAを、一方、その誘導体（XA 799 Bag II）
としては、特願昭62−306887の第16−１図〜第16−３図
に記載されているpXA799 cDANにコードされているアミ
ノ酸配列−39から692番目までのアミノ酸一次配列をＮ
−末端に、これにひき続くＣ−末端がロイシン残基が付
加したアミノ酸配列をコードする遺伝子を、それぞれSV
40プロモーター支配下、動物細胞内で発現されるように
デザインしたプラスミッド（このプラスミッドをそれぞ
れpKDPXA457大びpKDPXA799 Bal II）を作成する。次に
これらのプラスミッドを常法に従い、それぞれCHO細胞
（チャイニーズハムスター卵巣由来細胞）へ導入し、目
的遺伝子が導入された細胞（この細胞をそれぞれCHO/pK
DPXA457−α及びCHO/pKDPXA799 Bal II−αとする）を
得た。次に、このようにして得た細胞をメトトレキセー
ト（MTX）濃度を順次上昇させた培地で培養することに
より導入遺伝子が増幅された細胞株を得た。最終的に
は、pKDPXA799 Bal IIを導入した細胞集団から、クロー
ニング操作を行うことにより、大量のＣ−末端α−アミ
ド化酵素活性（2000unit/ml）を培養上清中へ分泌する
Ｃ−末端α−アミド化酵素（これをXA799 Bal IIとす
る）生産株CHO/10Cを樹立することができた。さらに、
本発明者らは、前記培養上清中に分泌されたＣ−末端α
−アミド化酵素は、この培養液を硫安（硫酸アンモニウ
ム）で処理すれば、特異的にこの酵素を沈澱させること
ができることを見いだした。以上の結果、本発明者ら
は、実用化しうるに十分量のＣ−末端α−アミド化酵素
を製造する方法を確立することができた。
（３）in vitroにおけるアミド化反応の至適反応条件の
設定 すでに述べた様に、真核細胞においては、種類の明ら
かに異なるＣ−末端α−アミド化酵素が存在しているこ
とが判っているが、これらの酵素の基質特異性に関する
詳細については、判ったいない。一方、一般にこれらの
酵素は、最大酵素活性を示すためには、分子状酵素、銅
イオン（Cu2+）、アスコルビン酸及びタラーゼが必要で
あることが、主に合成基質（例えばＤ−Tyr−val−Gl
y）を用いた実験により判っており、また、個々に部分
精製、または完全に精製された、Ｃ−末端α−アミド化
酵素についての至適pHについても報告されており、それ
ぞれの酵素について異なった至適pHが存在していること
も判っている。さらに、特表昭63−501541で報告されて
いるように、ヒト・カルシトニン前駆体を、ブタ・下垂
体より部分的に精製したＣ−末端α−アミド化酵素でヒ
ト・カルシトニンを製造する場合、この酵素の至適反応
条件ではヒト・カルトシトニン前駆体の溶解度が低く、
目的とするヒト・カルシトニンを得られないという例も
ある。従って、これらの事実を考え合わせると、in vit
roでアミド化ペプチド前駆体とＣ−末端α−アミド化酵
素を用いて、目的とするアミド化ペプチドを効率よく得
るためには、個々の、アミド化ペプチド前駆体及びＣ−
末端α−アミド化酵素を用いて、in vitroにおけるアミ
ド化反応の至適反応条件を設定することが重要となる。
設定 すでに述べた様に、真核細胞においては、種類の明ら
かに異なるＣ−末端α−アミド化酵素が存在しているこ
とが判っているが、これらの酵素の基質特異性に関する
詳細については、判ったいない。一方、一般にこれらの
酵素は、最大酵素活性を示すためには、分子状酵素、銅
イオン（Cu2+）、アスコルビン酸及びタラーゼが必要で
あることが、主に合成基質（例えばＤ−Tyr−val−Gl
y）を用いた実験により判っており、また、個々に部分
精製、または完全に精製された、Ｃ−末端α−アミド化
酵素についての至適pHについても報告されており、それ
ぞれの酵素について異なった至適pHが存在していること
も判っている。さらに、特表昭63−501541で報告されて
いるように、ヒト・カルシトニン前駆体を、ブタ・下垂
体より部分的に精製したＣ−末端α−アミド化酵素でヒ
ト・カルシトニンを製造する場合、この酵素の至適反応
条件ではヒト・カルトシトニン前駆体の溶解度が低く、
目的とするヒト・カルシトニンを得られないという例も
ある。従って、これらの事実を考え合わせると、in vit
roでアミド化ペプチド前駆体とＣ−末端α−アミド化酵
素を用いて、目的とするアミド化ペプチドを効率よく得
るためには、個々の、アミド化ペプチド前駆体及びＣ−
末端α−アミド化酵素を用いて、in vitroにおけるアミ
ド化反応の至適反応条件を設定することが重要となる。
そこで、本発明者等は、まず本発明で製造した、ヒト
・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）と、Ｃ−末端α−ア
ミド化酵素（XA799 Bal II）を用いて、ヒト・カルシト
ニンをin vitroで製造する場合の、至適反応条件、すな
わち、ａ）アスコルビン酸濃度、ｂ）カタラーゼ濃度、
ｃ）銅イオン（Cu2+）濃度、ｄ）緩衝液の種類・濃度・
pH、及びｅ）基質（hCT−Gly）濃度について個々の至適
条件を検討した。この結果、ａ）アスコルビン酸濃度は
１〜7mMで反応は効率よく進んだが、さらに濃度が高い
（20mM）と反応効率が逆に低下した。ｂ）カタラーゼ濃
度は、１μg/ml以上の濃度があればよいことが判った。
ｃ）銅イオン濃度は、0,1,10μＭと濃度が高くなるにつ
れて反応効率が高まるが10μＭ以上の濃度では、反応効
率が変わらなかった。ｄ）緩衝液の種類・濃度、及びpH
に関しては、酢酸アンモニウム、10mM、pH6〜７が良い
ことが判った。さらに、ｅ）基質濃度に関しては、5mg/
mlまで基質濃度を高めることができることが判った。な
お、本発明で見いだしたin vitroでのアミド化反応条件
を用いれば、特表昭63−501541に報告されているよう
な、ヒト・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）の溶解度が
悪く、アミド化反応が効率よくおこないと言う問題は、
起こらず、ヒト・シトニンを効率よく得ることができ
た。
・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）と、Ｃ−末端α−ア
ミド化酵素（XA799 Bal II）を用いて、ヒト・カルシト
ニンをin vitroで製造する場合の、至適反応条件、すな
わち、ａ）アスコルビン酸濃度、ｂ）カタラーゼ濃度、
ｃ）銅イオン（Cu2+）濃度、ｄ）緩衝液の種類・濃度・
pH、及びｅ）基質（hCT−Gly）濃度について個々の至適
条件を検討した。この結果、ａ）アスコルビン酸濃度は
１〜7mMで反応は効率よく進んだが、さらに濃度が高い
（20mM）と反応効率が逆に低下した。ｂ）カタラーゼ濃
度は、１μg/ml以上の濃度があればよいことが判った。
ｃ）銅イオン濃度は、0,1,10μＭと濃度が高くなるにつ
れて反応効率が高まるが10μＭ以上の濃度では、反応効
率が変わらなかった。ｄ）緩衝液の種類・濃度、及びpH
に関しては、酢酸アンモニウム、10mM、pH6〜７が良い
ことが判った。さらに、ｅ）基質濃度に関しては、5mg/
mlまで基質濃度を高めることができることが判った。な
お、本発明で見いだしたin vitroでのアミド化反応条件
を用いれば、特表昭63−501541に報告されているよう
な、ヒト・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）の溶解度が
悪く、アミド化反応が効率よくおこないと言う問題は、
起こらず、ヒト・シトニンを効率よく得ることができ
た。
次に、この様にして求めた反応条件を基に、実際、ヒ
ト・カルシトニン前駆体とＣ−末端α−アミド化酵素
（XA799 Bal II）を用い、ヒト・カルシトニン（hCT）
をin vitroで効率よく、安価に製造する方法を見いだし
た。
ト・カルシトニン前駆体とＣ−末端α−アミド化酵素
（XA799 Bal II）を用い、ヒト・カルシトニン（hCT）
をin vitroで効率よく、安価に製造する方法を見いだし
た。
本発明では、第一に、前記Ｒ−Ｘ−Gly−Ｂで表わさ
れる原料ペプチド又は蛋白質例えばヒト・カルシトニン
前駆体構造を含むペプチドhCT−Gly−Lys−Lys−Arg
を、カルボキシペプチターゼＢ（CpB）により、効率よ
く、前記Ｒ−Ｘ−Glyで表わされる前駆体、例えばヒト
・カルシトニン前駆体hCT−Glyに変換することができ
る。第二に、前記した方法で製造した前駆体Ｒ−Ｘ−Gl
yと、Ｃ−末端α−アミド化酵素とを用い、in vitro
で、目的とするＣ−末端アミド化ペプチドＲ−Ｘ−NH2
を製造することができる。第三に、カエル体皮由来のＣ
−末端α−アミド化酵素及びその誘導体に対応する遺伝
子を遺伝子操作を用い、動物細胞（CHO cell）で発現さ
せることにより、実用化しうるに十分量のＣ−末端α−
アミド化酵素を製造することができる。この結果、産業
上有用なＣ−末端がアミド化された生理活性ペプチドを
大量しかも安価に製造することができる。
れる原料ペプチド又は蛋白質例えばヒト・カルシトニン
前駆体構造を含むペプチドhCT−Gly−Lys−Lys−Arg
を、カルボキシペプチターゼＢ（CpB）により、効率よ
く、前記Ｒ−Ｘ−Glyで表わされる前駆体、例えばヒト
・カルシトニン前駆体hCT−Glyに変換することができ
る。第二に、前記した方法で製造した前駆体Ｒ−Ｘ−Gl
yと、Ｃ−末端α−アミド化酵素とを用い、in vitro
で、目的とするＣ−末端アミド化ペプチドＲ−Ｘ−NH2
を製造することができる。第三に、カエル体皮由来のＣ
−末端α−アミド化酵素及びその誘導体に対応する遺伝
子を遺伝子操作を用い、動物細胞（CHO cell）で発現さ
せることにより、実用化しうるに十分量のＣ−末端α−
アミド化酵素を製造することができる。この結果、産業
上有用なＣ−末端がアミド化された生理活性ペプチドを
大量しかも安価に製造することができる。
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例1.ヒト・カルシトニン前駆体（hCT−Gly）の製造
法 hCT−Gly−Lys−Lys−Arg（このペプチドは特願昭63
−49728の11頁に記載されているHPCTと同一化合物であ
り、この物に製造に関しては上記特許出願明細書に記載
の方法を用いて製造できる）280mgを、まず、0.1N酢酸3
0mlに完全に溶かし、次に、この溶液にTris・HCl（pH8.
0）30mlと水を加え、全体として230ml（pH7.8）の反応
溶液を作製する。次に、この反応溶液にカルボキシペプ
チターゼＢ（Sigma社より購入）560μｇを加え、37℃で
30分間反応させた。この反応の進行は、反応液の一部を
YMC PackedカラムＡ−302（0.46cm X15cm・山村化学研
究所）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に
供し、目的とするhCT−Gly、反応中間体のhCT−Gly−Ly
s−Lys,hCT−Gly−Lys、及び原料のhCT−Gly−Lys−Lys
−Argを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）と0.1％TFA−50
％CH3CNを用いたの直線濃度勾配で溶出させ解析した。
この結果、上記反応は37℃30分間で完全に終了している
ことが判った（第１図参照）。hCT−Glyの単離は、上記
反応液をYMC PackedカラムＤ−ODS−５（2cm X25cm・山
村化学研究所）を用いたHPLCに供し、つづいて、hCT−G
lyを0.1％TFA−50％CH3CNで溶出させた。次に、溶出画
分を集め、凍結乾燥することにより、最終的にhCT−Gly
を235mg得た。このようにして得たhCT−Glyの同定は、
一部を6N塩酸で24時間加水分解した後のアミノ酸分析値
（日立製作所製835−20型アミノ酸分析機を用いた）が
理論値とよく一致すること、さらには、Protein Sequen
cer（Applied Biosystems社製470A Protein Seqencer）
を用いてアミノ酸配列を決定することによって行った。
なお、以下にhCT−Glyのアミノ酸分析の結果を示す。た
だし（ ）内は理論値。
法 hCT−Gly−Lys−Lys−Arg（このペプチドは特願昭63
−49728の11頁に記載されているHPCTと同一化合物であ
り、この物に製造に関しては上記特許出願明細書に記載
の方法を用いて製造できる）280mgを、まず、0.1N酢酸3
0mlに完全に溶かし、次に、この溶液にTris・HCl（pH8.
0）30mlと水を加え、全体として230ml（pH7.8）の反応
溶液を作製する。次に、この反応溶液にカルボキシペプ
チターゼＢ（Sigma社より購入）560μｇを加え、37℃で
30分間反応させた。この反応の進行は、反応液の一部を
YMC PackedカラムＡ−302（0.46cm X15cm・山村化学研
究所）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に
供し、目的とするhCT−Gly、反応中間体のhCT−Gly−Ly
s−Lys,hCT−Gly−Lys、及び原料のhCT−Gly−Lys−Lys
−Argを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）と0.1％TFA−50
％CH3CNを用いたの直線濃度勾配で溶出させ解析した。
この結果、上記反応は37℃30分間で完全に終了している
ことが判った（第１図参照）。hCT−Glyの単離は、上記
反応液をYMC PackedカラムＤ−ODS−５（2cm X25cm・山
村化学研究所）を用いたHPLCに供し、つづいて、hCT−G
lyを0.1％TFA−50％CH3CNで溶出させた。次に、溶出画
分を集め、凍結乾燥することにより、最終的にhCT−Gly
を235mg得た。このようにして得たhCT−Glyの同定は、
一部を6N塩酸で24時間加水分解した後のアミノ酸分析値
（日立製作所製835−20型アミノ酸分析機を用いた）が
理論値とよく一致すること、さらには、Protein Sequen
cer（Applied Biosystems社製470A Protein Seqencer）
を用いてアミノ酸配列を決定することによって行った。
なお、以下にhCT−Glyのアミノ酸分析の結果を示す。た
だし（ ）内は理論値。
Asx2.83（３）,Thr4.51（５）,Ser0.91（１）,Glx1.94
（２）,Pro2.04（２）,Gly4.83（５）,Ala1.78（２）,V
al0.98（１）,Met0.97（１）,Ile0.95（１）,Leu2.00
（２）,Tyr0.95（１）,Phe2.89（３）,Lys0.99（１）,H
is0.97（１）． 実施例2.C−末端α−アミド化酵素の製造法 （１）動物細胞発現プラスミッドpKDPXA457及びpKDPXA7
99 Bal IIの作製（第２図参照） pKDPXA457及びpKDPXA799 Bal IIは、それぞれ、本発
明者らによりクローニングされたアフリカツメガエル体
皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素cDNAの内、特願昭62
−306867の第１−１図〜第３−３図に記載されているpX
A457中のcDNAにコードされているアミノ酸配列１から40
0番目までのアミノ酸配列を持つ蛋白と、特願昭62−306
867の第16−１図〜第16−３図に記載されているpXA799
中のcDNAにコードされているアミノ酸配列−39から692
までのアミノ酸−次配列をＮ−末端に、これに引き続く
Ｃ−末端にロイシン残基が付加した蛋白を動物細胞で発
現させるようにデザインされたプラスミッドである。す
なわち、上記プラスミッドはいずれも、目的とする蛋白
（Ｃ−末端α−アミド化酵素）に対応するcDNA遺伝子
が、動物細胞内でSV40（Simian Virus 40）アーリープ
ロモーターの支配下転写され、しかも転写後、真核細胞
でmRNAが生成するために必要と考えられているスプライ
シング及びpoly Aの付加を行わせるために、SV40プロモ
ーターと、対応するcDNA遺伝子の５′末端の間にはウサ
ギβグロビン遺伝子由来のイントロンが、また、cDNAの
３′末端にはウサギβグロビン遺伝子由来のpoly A付加
シグナルが付加してある。さらに、これらのプラスミッ
ドは上記遺伝子以外に動物細胞へ目的遺伝子を導入した
後、目的遺伝子が増幅した細胞をクローン化するのに利
用されるdhfr（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子がSV40のア
ーリープロモーター支配下に発現されるようにデザイン
されている。なお、本発明で用いたプラスミッドpKDPX4
57、及びpKDPX799 Bal IIで形質転換した大腸菌は、そ
れぞれE.coli SBM 300、及びE.Coli SBM 301と命名さ
れ、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条奇第
2235号（FERM BP−2235）、及び微工研条奇第2236号（F
ERM BP−2236）として、寄託されている。
（２）,Pro2.04（２）,Gly4.83（５）,Ala1.78（２）,V
al0.98（１）,Met0.97（１）,Ile0.95（１）,Leu2.00
（２）,Tyr0.95（１）,Phe2.89（３）,Lys0.99（１）,H
is0.97（１）． 実施例2.C−末端α−アミド化酵素の製造法 （１）動物細胞発現プラスミッドpKDPXA457及びpKDPXA7
99 Bal IIの作製（第２図参照） pKDPXA457及びpKDPXA799 Bal IIは、それぞれ、本発
明者らによりクローニングされたアフリカツメガエル体
皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素cDNAの内、特願昭62
−306867の第１−１図〜第３−３図に記載されているpX
A457中のcDNAにコードされているアミノ酸配列１から40
0番目までのアミノ酸配列を持つ蛋白と、特願昭62−306
867の第16−１図〜第16−３図に記載されているpXA799
中のcDNAにコードされているアミノ酸配列−39から692
までのアミノ酸−次配列をＮ−末端に、これに引き続く
Ｃ−末端にロイシン残基が付加した蛋白を動物細胞で発
現させるようにデザインされたプラスミッドである。す
なわち、上記プラスミッドはいずれも、目的とする蛋白
（Ｃ−末端α−アミド化酵素）に対応するcDNA遺伝子
が、動物細胞内でSV40（Simian Virus 40）アーリープ
ロモーターの支配下転写され、しかも転写後、真核細胞
でmRNAが生成するために必要と考えられているスプライ
シング及びpoly Aの付加を行わせるために、SV40プロモ
ーターと、対応するcDNA遺伝子の５′末端の間にはウサ
ギβグロビン遺伝子由来のイントロンが、また、cDNAの
３′末端にはウサギβグロビン遺伝子由来のpoly A付加
シグナルが付加してある。さらに、これらのプラスミッ
ドは上記遺伝子以外に動物細胞へ目的遺伝子を導入した
後、目的遺伝子が増幅した細胞をクローン化するのに利
用されるdhfr（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子がSV40のア
ーリープロモーター支配下に発現されるようにデザイン
されている。なお、本発明で用いたプラスミッドpKDPX4
57、及びpKDPX799 Bal IIで形質転換した大腸菌は、そ
れぞれE.coli SBM 300、及びE.Coli SBM 301と命名さ
れ、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条奇第
2235号（FERM BP−2235）、及び微工研条奇第2236号（F
ERM BP−2236）として、寄託されている。
（２）pKDPXA457及びpKDPXA799 Bal IIのCHO細胞への導
入 pKDPXA457とpKDPXA799 Bal IIをそれぞれdihydrofola
te reductase遺伝子（dhft）の欠損したチャイニーズハ
ムスター卵巣由来細胞CHO（以下CHO dhfr-細胞と略す。
なお、この細胞はCHO dhfr（−）細胞Cell SBM 306と命
名され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条奇
第2241号（FERM BP−2241）として寄託されている。）
（Hanaka,S.等Mol.Cell.Biol.7 2578−2587,1987）にリ
ン酸カルシウム共沈法を用いて導入した。すなわち、ま
ず、核酸を含むMinimum Essential Medium（MEN）Alpha
Medium（GIBCO、α+MEN培地）に、10％ウシ胎児血清
（FBS）（Flow Lab.）と抗生物質としてペニシリンＧ
（50U/ml）とストレプトマイシン50μg/mlを含む培地で
継代培養したCHO dhfr-細胞を遺伝子導入12時間前に80c
m2のＴフラスコ（T80,Nunc）あたり1.6X106細胞/30ml/T
80になるようにまき直し、さらに遺伝子導入４時間前
に、新しいα+MEN培地（10％FBS、抗生物質を含む）30m
lで培地交換した。一方、プラスミッドpKDPXA457及びpK
DPXA799 Bgl IIをそれぞれ10μｇあたり240μの減菌
精製水に溶解し、等量のBuffer A（0.5M CaC12,0.1M HE
PES）を加え、混合し、10分間室温で放置した後、この
混合液に、Buffer B（0.2M NaCl,0.05M HEPES,0.75mM N
aH2PD4,0.75mM Na2HPO4）を480μ加え、Vortex Mixer
で数秒攪拌後、室温で20〜30分放置することにより、プ
ラスミッドを含むリン酸カルシウムゲルを形成させた。
次に、この様にして得られた、プラスミッドを含むリン
酸カルシウムゲル960μを前記した方法で調製したCHO
dhfr-細胞（1.6X106細胞/30ml/T80）に加え、４時間放
置した。次にこの細胞をFBSを含まない新しいα+MEN培
地10mlで一回洗浄した後、10％FBSを含むα+MEN培地：
グリセロール＝4:1の混液をT80フラスコあたり5mlを加
え、正確に１分後、吸収除去し、再び10％FBSを含むα+
MEN培地30mlを加え、５％CO2存在下で、37℃で培養し
た。次に、この細胞を４日間培養した後、0.25％トリプ
シン液（千葉血清）で細胞を剥離し、この細胞をもう一
度、核酸を含まないMEN Medium（α-MEN）10％透析ウシ
胎児血清（FBSd,HAZELTON）を加えた培地で1.6X106細胞
/30ml/T80になるようにまきなおした。つづいて、この
細胞を10日間培養した後、この培地で生存している細胞
を目的のプラスミッドが導入された細胞（pKDPXA457を
導入した細胞をCHO/pKDPXA457−α、pKDPXA799 Bgl II
を導入した細胞をCHO/pKDPXA799 Bgl II−αとする）と
して以下の実験に用いた。
入 pKDPXA457とpKDPXA799 Bal IIをそれぞれdihydrofola
te reductase遺伝子（dhft）の欠損したチャイニーズハ
ムスター卵巣由来細胞CHO（以下CHO dhfr-細胞と略す。
なお、この細胞はCHO dhfr（−）細胞Cell SBM 306と命
名され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条奇
第2241号（FERM BP−2241）として寄託されている。）
（Hanaka,S.等Mol.Cell.Biol.7 2578−2587,1987）にリ
ン酸カルシウム共沈法を用いて導入した。すなわち、ま
ず、核酸を含むMinimum Essential Medium（MEN）Alpha
Medium（GIBCO、α+MEN培地）に、10％ウシ胎児血清
（FBS）（Flow Lab.）と抗生物質としてペニシリンＧ
（50U/ml）とストレプトマイシン50μg/mlを含む培地で
継代培養したCHO dhfr-細胞を遺伝子導入12時間前に80c
m2のＴフラスコ（T80,Nunc）あたり1.6X106細胞/30ml/T
80になるようにまき直し、さらに遺伝子導入４時間前
に、新しいα+MEN培地（10％FBS、抗生物質を含む）30m
lで培地交換した。一方、プラスミッドpKDPXA457及びpK
DPXA799 Bgl IIをそれぞれ10μｇあたり240μの減菌
精製水に溶解し、等量のBuffer A（0.5M CaC12,0.1M HE
PES）を加え、混合し、10分間室温で放置した後、この
混合液に、Buffer B（0.2M NaCl,0.05M HEPES,0.75mM N
aH2PD4,0.75mM Na2HPO4）を480μ加え、Vortex Mixer
で数秒攪拌後、室温で20〜30分放置することにより、プ
ラスミッドを含むリン酸カルシウムゲルを形成させた。
次に、この様にして得られた、プラスミッドを含むリン
酸カルシウムゲル960μを前記した方法で調製したCHO
dhfr-細胞（1.6X106細胞/30ml/T80）に加え、４時間放
置した。次にこの細胞をFBSを含まない新しいα+MEN培
地10mlで一回洗浄した後、10％FBSを含むα+MEN培地：
グリセロール＝4:1の混液をT80フラスコあたり5mlを加
え、正確に１分後、吸収除去し、再び10％FBSを含むα+
MEN培地30mlを加え、５％CO2存在下で、37℃で培養し
た。次に、この細胞を４日間培養した後、0.25％トリプ
シン液（千葉血清）で細胞を剥離し、この細胞をもう一
度、核酸を含まないMEN Medium（α-MEN）10％透析ウシ
胎児血清（FBSd,HAZELTON）を加えた培地で1.6X106細胞
/30ml/T80になるようにまきなおした。つづいて、この
細胞を10日間培養した後、この培地で生存している細胞
を目的のプラスミッドが導入された細胞（pKDPXA457を
導入した細胞をCHO/pKDPXA457−α、pKDPXA799 Bgl II
を導入した細胞をCHO/pKDPXA799 Bgl II−αとする）と
して以下の実験に用いた。
（３）遺伝子増幅 上記方法で得た細胞CHO/pKDPXA457−αとCHO/pKDPXA7
99 Bgl II−αに含まれる遺伝子（pKDPXA457またはpKDP
XA799 Bgl II）を増幅させるために、上記細胞を、それ
ぞれメトトレキセート（MTX,Sigma）濃度を30nM,100nM,
300nM,1000nMと順次上昇させた培地で培養し、各段階で
MTX耐性を示す細胞を得た。次に、このようにして得た1
000nM MTX耐性を獲得した細胞（この細胞をそれぞれCHO
/pKDPXA457−１及びCHO/pKDPXA799 Bgl II−１とする）
をそれぞれ1.6X106細胞/30ml/T80になるようにまきなお
し、５％CO2存在下、４日間、37℃で培養した。次に、
これらの培養液の一部を取り、Ｃ−末端α−アミド化酵
素活性を合成基質［125I］−Ac−Tyr−Phe−Glyを用い
て測定した（Ｃ−末端α−アミド化酵素活性の測定方法
及びunitの定義については本発明者らによる特願昭62−
306867に詳細に記載してある）。この結果、CHO/pKDPXA
457−１、CHO/pKDPXA799 Bgl II−１の培養液中にそれ
ぞれ、1unit及び310unitの酵素活性があることが判っ
た。
99 Bgl II−αに含まれる遺伝子（pKDPXA457またはpKDP
XA799 Bgl II）を増幅させるために、上記細胞を、それ
ぞれメトトレキセート（MTX,Sigma）濃度を30nM,100nM,
300nM,1000nMと順次上昇させた培地で培養し、各段階で
MTX耐性を示す細胞を得た。次に、このようにして得た1
000nM MTX耐性を獲得した細胞（この細胞をそれぞれCHO
/pKDPXA457−１及びCHO/pKDPXA799 Bgl II−１とする）
をそれぞれ1.6X106細胞/30ml/T80になるようにまきなお
し、５％CO2存在下、４日間、37℃で培養した。次に、
これらの培養液の一部を取り、Ｃ−末端α−アミド化酵
素活性を合成基質［125I］−Ac−Tyr−Phe−Glyを用い
て測定した（Ｃ−末端α−アミド化酵素活性の測定方法
及びunitの定義については本発明者らによる特願昭62−
306867に詳細に記載してある）。この結果、CHO/pKDPXA
457−１、CHO/pKDPXA799 Bgl II−１の培養液中にそれ
ぞれ、1unit及び310unitの酵素活性があることが判っ
た。
（４）Ｃ−末端α−アミド化酵素高生産株の樹立 上記実験により、pKDPXA799 Bgl IIを導入した細胞の方
が、pKDPXA457を導入した細胞より高い酵素活性を示す
ことが判ったので、本発明者らは、さらに高い、Ｃ−末
端α−アミド化酵素生産株を樹立する為に、前記実施例
２−（３）で得た、MTX 100nM耐性株CHO/pKDPXA799 Bgl
IIについて、限界希釈法により、クローニングを行っ
た。すなわち、96穴平底プレート（corning）にMTX100n
M耐性CHO/pKDPXA799 Bgl II細胞が、平均３個、1.5個、
0.75個、又は0.375個/Wellになるようにまき、これらの
細胞を１％FBSを含むα-MEN培地100μ/wellで一週間
培養した。一週間後、顕微鏡下に単一のコロニーを形成
して増殖してきたと認められる30wellに100μのα-ME
N培地を加え、さらに一週間培養した。これら30の細胞
について、細胞をまいてから二週間後、培養上清の酵素
活性を測定した。この結果、CHO/9Cと名付けた細胞が、
これらの細胞の内で最も高い酵素活性（910unit/ml）を
示すことが判った。次に、最も高い酵素活性を示したCH
O/9Cを、さらにMTX濃度を0.1,0.3,1,3,10,30μＭと、順
次上昇させながら培養し、それぞれ各段階のMTX耐性株
を得た。この様にして得たMTX耐性株をそれぞれ10％FBS
を含むむα-MEN培地を用いて、1.6X106細胞/30ml/T80の
条件で４日間培養した後、培養上清中の酵素活性を測定
した結果、MTX 3μＭ耐性株が、最も高い酵素活性値（2
860unit/ml）を示すことが判った。本発明者らは、この
ようにして得られたMTX 3μＭ耐性株9C株から、さらに
高生産株を樹立するために、この細胞株より、前記した
方法を用いてクローニングを行った。この結果、最終的
には、2000unit/ml以上のＣ−末端α−アミド化酵素活
性を示すCHO株（この生産株をCHO/10Cとする）を樹立す
ることができた。
が、pKDPXA457を導入した細胞より高い酵素活性を示す
ことが判ったので、本発明者らは、さらに高い、Ｃ−末
端α−アミド化酵素生産株を樹立する為に、前記実施例
２−（３）で得た、MTX 100nM耐性株CHO/pKDPXA799 Bgl
IIについて、限界希釈法により、クローニングを行っ
た。すなわち、96穴平底プレート（corning）にMTX100n
M耐性CHO/pKDPXA799 Bgl II細胞が、平均３個、1.5個、
0.75個、又は0.375個/Wellになるようにまき、これらの
細胞を１％FBSを含むα-MEN培地100μ/wellで一週間
培養した。一週間後、顕微鏡下に単一のコロニーを形成
して増殖してきたと認められる30wellに100μのα-ME
N培地を加え、さらに一週間培養した。これら30の細胞
について、細胞をまいてから二週間後、培養上清の酵素
活性を測定した。この結果、CHO/9Cと名付けた細胞が、
これらの細胞の内で最も高い酵素活性（910unit/ml）を
示すことが判った。次に、最も高い酵素活性を示したCH
O/9Cを、さらにMTX濃度を0.1,0.3,1,3,10,30μＭと、順
次上昇させながら培養し、それぞれ各段階のMTX耐性株
を得た。この様にして得たMTX耐性株をそれぞれ10％FBS
を含むむα-MEN培地を用いて、1.6X106細胞/30ml/T80の
条件で４日間培養した後、培養上清中の酵素活性を測定
した結果、MTX 3μＭ耐性株が、最も高い酵素活性値（2
860unit/ml）を示すことが判った。本発明者らは、この
ようにして得られたMTX 3μＭ耐性株9C株から、さらに
高生産株を樹立するために、この細胞株より、前記した
方法を用いてクローニングを行った。この結果、最終的
には、2000unit/ml以上のＣ−末端α−アミド化酵素活
性を示すCHO株（この生産株をCHO/10Cとする）を樹立す
ることができた。
（５）カエル体皮由来Ｃ−末端α−アミド化酵素誘導体
（XA799 Bal II）生産株の培養 実施例２−（４）で得たカエル体皮由来Ｃ−末端α−
アミド化酵素誘導体生産株CHO/10Cを用いて、以下に示
す方法でカエル体皮由来Ｃ−末端α−アミド化酵素誘導
体の生産を行った。すなわち、CHO/10C、1x107と10％FB
Sを含むα-MEN培値500mlを1850cm2のRoller Bottle（Fa
lon）に入れ37℃条件下一週間培養した。
（XA799 Bal II）生産株の培養 実施例２−（４）で得たカエル体皮由来Ｃ−末端α−
アミド化酵素誘導体生産株CHO/10Cを用いて、以下に示
す方法でカエル体皮由来Ｃ−末端α−アミド化酵素誘導
体の生産を行った。すなわち、CHO/10C、1x107と10％FB
Sを含むα-MEN培値500mlを1850cm2のRoller Bottle（Fa
lon）に入れ37℃条件下一週間培養した。
次に、この細胞を順次新しい10％FBSを含むα-MEN、
３％FBSを含むα-MEN及び1FBSを含むα-MEN培地で37
℃、24時間培養した。最終的には１％FBSを含むα-MEN
培地で24時間培養した培養上清を回収し、以下の実験に
用いた。なお、ここで得られた培養上清は、約400unit/
mlの酵素活性を示し、この様にして得たＣ−末端α−ア
ミド化酵素を以後XA799 Bal IIとする。
３％FBSを含むα-MEN及び1FBSを含むα-MEN培地で37
℃、24時間培養した。最終的には１％FBSを含むα-MEN
培地で24時間培養した培養上清を回収し、以下の実験に
用いた。なお、ここで得られた培養上清は、約400unit/
mlの酵素活性を示し、この様にして得たＣ−末端α−ア
ミド化酵素を以後XA799 Bal IIとする。
（６）XA799 Bal IIの精製 実施例３−（５）で得られた培養上清１に、最終硫
酸アンモニウム濃度が45％になるように硫酸アンモニウ
ムを加え、生じた沈澱を遠心分離で集め、この沈澱を50
mM Tirs・HCl Buffer（pH7.0）20mlに溶かした。次に、
このようにして得た各画分の酵素活性を合成基質を用い
て測定したところ、ほとんどすべての酵素活性が沈澱画
分に回収されることが判った。さらに、各画分をSDS−P
AGEを用いて解析したところ第３図に示すように、この
沈澱画分は培地由来の多くの蛋白質（主にBSA）が除か
れていることが判った。以後、この様にして得たXA799
Bal IIを用い、in vitroでのアミド化反応の条件を検討
した。
酸アンモニウム濃度が45％になるように硫酸アンモニウ
ムを加え、生じた沈澱を遠心分離で集め、この沈澱を50
mM Tirs・HCl Buffer（pH7.0）20mlに溶かした。次に、
このようにして得た各画分の酵素活性を合成基質を用い
て測定したところ、ほとんどすべての酵素活性が沈澱画
分に回収されることが判った。さらに、各画分をSDS−P
AGEを用いて解析したところ第３図に示すように、この
沈澱画分は培地由来の多くの蛋白質（主にBSA）が除か
れていることが判った。以後、この様にして得たXA799
Bal IIを用い、in vitroでのアミド化反応の条件を検討
した。
実施例3.in vitroにおけるアミド化反応の条件検討 実施例１で製造したhCT−Glyと実施例２−（６）で精
製したXA799 Bal IIを用いて、in vitroにおけるアミド
化反応の至適条件を検討した。反応は、反応液1mlを37
℃でインキュベートし、0.5,1,2及び４時間後に50μ
をサンプリングし、これに950μの5N酢酸に加え、こ
のうち20μをC18−HPLC（カラム:YMC A−302 4.6x150
mm緩衝液:10％酢酸アンモニウムをベースにアセトニト
リル濃度を24％から45％まで18分の直線勾配で上げる）
に適用し、hCT−Glyの残量と新しく生じたhCTの量を調
べた。尚、反応条件は、合成基質［125I］Ac−Tyr−Phe
−Gly→［125I］Ac−Tyr−Phe−NH2の条件（特願昭62−
306867）をもとに、（１）アスコルビン酸、（２）カタ
ラーゼ、（３）硫酸銅、（４）緩衝液（pH）、（５）緩
衝液（濃度）、（６）hCT−Gly濃度について検討した。
製したXA799 Bal IIを用いて、in vitroにおけるアミド
化反応の至適条件を検討した。反応は、反応液1mlを37
℃でインキュベートし、0.5,1,2及び４時間後に50μ
をサンプリングし、これに950μの5N酢酸に加え、こ
のうち20μをC18−HPLC（カラム:YMC A−302 4.6x150
mm緩衝液:10％酢酸アンモニウムをベースにアセトニト
リル濃度を24％から45％まで18分の直線勾配で上げる）
に適用し、hCT−Glyの残量と新しく生じたhCTの量を調
べた。尚、反応条件は、合成基質［125I］Ac−Tyr−Phe
−Gly→［125I］Ac−Tyr−Phe−NH2の条件（特願昭62−
306867）をもとに、（１）アスコルビン酸、（２）カタ
ラーゼ、（３）硫酸銅、（４）緩衝液（pH）、（５）緩
衝液（濃度）、（６）hCT−Gly濃度について検討した。
（１）アスコルビン酸濃度の検討（第４図参照） 0,1.0,3.5,7,20mMのアスコルビン酸濃度でのアミド化
効率を調べた。他の組成は以下に示した。
効率を調べた。他の組成は以下に示した。
2.5mg/ml hCT−Gly 100mM トリス塩酸（pH7.0） 25μml カタラーゼ 70μM 硫酸銅 1860U/ml XA799 Bgl II 反応１時間後の変換率（100xhCT/hCT＋hCT−Gly）を
第４図に示した。アスコルビン酸非存在下では、全く反
応が進まず、１〜7mMでは、効率よく反応が進んだ。し
かし、さらに濃度を上げるとき（20mM）、変換率は低下
した。
第４図に示した。アスコルビン酸非存在下では、全く反
応が進まず、１〜7mMでは、効率よく反応が進んだ。し
かし、さらに濃度を上げるとき（20mM）、変換率は低下
した。
（２）カタラーゼ濃度の検討（第５図参照） 0.2,1,2,25,125μg/mlのカタラーゼ濃度でのアミド化
効率を調べた。他の組成は以下に示す。
効率を調べた。他の組成は以下に示す。
2.5mg/ml hCT−Gly 100mM トリス塩酸（pH7.0） 3.5mM アスコルビン酸 70μM 硫酸銅 1500U/ml XA799 Bgl II 反応１時間後の変換率（100xhCT/hCT＋hCT−Gly）
は、60〜75％とほぼ変らなかったが（第５図）、１μg/
ml以上では、２時間で変換率が100％なのに比べ、0.2μ
g/mlでは４時間でも93％であった。
は、60〜75％とほぼ変らなかったが（第５図）、１μg/
ml以上では、２時間で変換率が100％なのに比べ、0.2μ
g/mlでは４時間でも93％であった。
（３）硫酸銅（Cu2+イオン）濃度の検討（第６図参照） 0,1,10,70,150μＭの硫酸銅濃度でのアミド化効率を
調べた。他の組成は以下に示す。
調べた。他の組成は以下に示す。
2.5mg/ml hCT−Gly 100mM トリス塩酸（pH7.0） 25μg/mlカタラーゼ 3.5mM アスコルビン酸 1500U/ml XA799 Bgl II 反応１時間後の変換率（100xhCT/hCT＋hCT−Gly）を
第６図に示した。硫酸銅の濃度が、0,1,10μＭと増える
に従いアミド化効率が良くなるが、それ以上では変らな
かった。
第６図に示した。硫酸銅の濃度が、0,1,10μＭと増える
に従いアミド化効率が良くなるが、それ以上では変らな
かった。
（４）緩衝液（pH）の検討（第７図参照） 100mMトリス塩酸（pH7.0,0,7.5,8.0,8.5） 100mM MPOS（pH6.5,7.0,7.5,8.0） 100mM酢酸アンモニウム（pH6.0,6.5,7.0） の11種類の緩衝液についてアミド化効率を調べた。他の
組成は以下に示す。
組成は以下に示す。
2.5mg/ml hCT−Gly 20μg/mlカタラーゼ 2.0mM アスコルビン酸 10μM 硫酸銅 1000U/ml XA799 Bgl II 反応１時間後の変換率（100xhCT/hCT＋hCT−Gly）を
第７図に示す。至適pHは６〜７であることがわかった。
また、酢酸アンモニウムを用いた場合に反応速度が速か
った。
第７図に示す。至適pHは６〜７であることがわかった。
また、酢酸アンモニウムを用いた場合に反応速度が速か
った。
（５）緩衝液（濃度）の検討（第８図参照） 10,50及び100mMの酢酸アンモニウム濃度でのアミド化
効率を調べた。他の組成は以下に示す。
効率を調べた。他の組成は以下に示す。
2.5mg/ml hCT−Gly 20μg/mlカタラーゼ 10μM 硫酸銅 2.0mM アスコルビン酸 1000U/ml XA799 Bgl II 反応１時間後の変換率（100xhCT/hCT＋hCT−Gly）を
第８図に示す。変換率は緩衝液の濃度によらず、ほぼ80
％で同じだが、低いほうが若干高かった。
第８図に示す。変換率は緩衝液の濃度によらず、ほぼ80
％で同じだが、低いほうが若干高かった。
（６）基質（hCT−Gly）濃度の検討（第９図参照） 2.5及び5mg/mlのhCT−Gly濃度でのアミド化効率を調
べた。他の組成は以下に示す。
べた。他の組成は以下に示す。
10mM 酢酸アンモニウム（pH6.0） 20μg/ml カタラーゼ 10μM 硫酸銅 2.0mM アスコルビン酸 1000U/ml XA799 Bgl II 経過時間のそれぞれのhCT−Gly濃度での変換率（100x
hCT/hCT＋hCT−Gly）を第９図に示す。2.5mg/mlでは２
時間で、5mg/mlでは４時間で、すべてアミド化される。
XA799 Bgl IIの濃度が同じなのでhCT−Gly当りのXA799
Bgl IIの量はhCT−Gly濃度5mg//mlでは2.5ml/mlの半分
になる。
hCT/hCT＋hCT−Gly）を第９図に示す。2.5mg/mlでは２
時間で、5mg/mlでは４時間で、すべてアミド化される。
XA799 Bgl IIの濃度が同じなのでhCT−Gly当りのXA799
Bgl IIの量はhCT−Gly濃度5mg//mlでは2.5ml/mlの半分
になる。
実施例4.hCTの製造（第10図参照） 以上の条件検討をもとにhCT−Glyのアミド化反応を行
い、hCTの製造を行った。アミド化反応の条件は以下に
示す。
い、hCTの製造を行った。アミド化反応の条件は以下に
示す。
2.5mg/ml hCT−Gly 10mM 酢酸アンモニウム（pH6.0） 20μg/ml カタラーゼ 10μM 硫酸銅 2.0mM アスコルビン酸 1000U/ml XA799 Bgl II 反応前、反応後0.5時間、及び２時間のC18−HPLCのチ
ャートを第10図に示す。時間経過に伴い、hCT−Glyのピ
ーク（11.8分）が減少し、hCTのピーク（12.9分）が増
えるのがわかる。反応２時間後、このサンプルをC18−H
PLCに供し、hCTを分離、精製した。この結果、hCTが93.
5％の収率で得られることが判った。なお、収率は、分
取したhCTをアミノ酸分析することにより求めた。
ャートを第10図に示す。時間経過に伴い、hCT−Glyのピ
ーク（11.8分）が減少し、hCTのピーク（12.9分）が増
えるのがわかる。反応２時間後、このサンプルをC18−H
PLCに供し、hCTを分離、精製した。この結果、hCTが93.
5％の収率で得られることが判った。なお、収率は、分
取したhCTをアミノ酸分析することにより求めた。
実施例5.hCTの同定 実施例４で製造した、ヒト・カルシトニン（hCT）の
同定は以下に示す方法で行った。すなわち、１）本発明
で製造したhCTはHPLC（実施例３に記載した条件）での
溶出位置が、化学合成で製造されたヒト・カルシトニン
（ペプチド研究所より入手）と完全に一致した。２）ア
ミノ酸分析の結果は、下記に示す値を示し、理論値
（ ）とよく一致した。
同定は以下に示す方法で行った。すなわち、１）本発明
で製造したhCTはHPLC（実施例３に記載した条件）での
溶出位置が、化学合成で製造されたヒト・カルシトニン
（ペプチド研究所より入手）と完全に一致した。２）ア
ミノ酸分析の結果は、下記に示す値を示し、理論値
（ ）とよく一致した。
Asx2.99（３）,Thr4.72（５）,Ser0.91（１）， Glx2.00（２）,Pro1.97（２）,Gly3.96（４）， Ala1.97（２）,Val1.00（１）,Met0.98（１）， Ile0.97（１）,Leu2.00（２）,Tyr1.02（１）， Phe2.95（３）,Lys1.00（１）,His0.97（１）． ３）アミノ酸配列はＣ−末端のPro−NH2を除く全アミノ
酸配列を確認できた。４）hCTのＣ−末端、pro−NH2の
最終構造は、hCTをLysyl Endopeptidase（和光純薬工業
株式会社）で処理することにより得られるＣ−末端ペプ
チドフラグメント（hCT［19−32］）をHPLCを用いて単
離し（hCTは18位にリジンが残基が１残基存在してい
る）、このものの分子量をFast Atom Bombartment（FA
B）質量分析で測定したところ、分子量が理論値と一致
することから、hCTのＣ−末端Pro−NH2であることが確
認された。以上の結果より、本発明で述べた方法により
製造したhCTの構造は、ヒト・カルシトニンと同一であ
ることを確認できた。
酸配列を確認できた。４）hCTのＣ−末端、pro−NH2の
最終構造は、hCTをLysyl Endopeptidase（和光純薬工業
株式会社）で処理することにより得られるＣ−末端ペプ
チドフラグメント（hCT［19−32］）をHPLCを用いて単
離し（hCTは18位にリジンが残基が１残基存在してい
る）、このものの分子量をFast Atom Bombartment（FA
B）質量分析で測定したところ、分子量が理論値と一致
することから、hCTのＣ−末端Pro−NH2であることが確
認された。以上の結果より、本発明で述べた方法により
製造したhCTの構造は、ヒト・カルシトニンと同一であ
ることを確認できた。
実施例6.C−末端塩基性アミノ酸がβgal97 SHPCTの生産
量に与える影響 Ｃ−末端塩基性アミノ酸がβgal97SHPCTの生産量に与
える影響をみるためにβgal97S（LE）［GKKR］のＣ−末
端のアミノ酸を変えた以下のキメラ蛋白質をデザイン
し、その生産量を調べた。
量に与える影響 Ｃ−末端塩基性アミノ酸がβgal97SHPCTの生産量に与
える影響をみるためにβgal97S（LE）［GKKR］のＣ−末
端のアミノ酸を変えた以下のキメラ蛋白質をデザイン
し、その生産量を調べた。
βgal97S（LE）HPCT［GRRR］ βgal97S（LE）HPCT［GR］ βgal97S（LE）HPCT［Ｇ］ （LE）はβgal97SとHPCTがLeu−Gluを介して結合して
おり、［GRRR］，［GR］及び［Ｇ］はhCTのＣ−末端に
それぞれGly−Arg−Arg−Arg,Gly−Arg又はGlyが付加し
てある。
おり、［GRRR］，［GR］及び［Ｇ］はhCTのＣ−末端に
それぞれGly−Arg−Arg−Arg,Gly−Arg又はGlyが付加し
てある。
以上のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を発現するプ
ラスミッドを作製した後、それぞれのプラスミッドで大
腸菌を形質転換し、各々の菌を得、それぞれの菌のキメ
ラ蛋白質の生産性を調べた。
ラスミッドを作製した後、それぞれのプラスミッドで大
腸菌を形質転換し、各々の菌を得、それぞれの菌のキメ
ラ蛋白質の生産性を調べた。
（１）種々のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を持つプ
ラスミドの作製（第11図参照） プラスミッドPG97SHPCT（特願昭63−49723、実施例８
第19図）をSal Iで部分消化し、アガロース電気泳動に
より、3.9kbのDNA断片を切り出した。次に、このDNA断
片をSma Iで完全に消化しアガロース電気泳動により、
3.8kbのDNA断片を切りだした。このDNA断片と両端にS
ma I及びSal I切断部位をもつ３組の合成リンカー Sma I Sal I ５′ GGGCCGGCGCCGTTAAG ３′ ３′ CCCGGCCGCGGCAATTCAGCT ５′ ５′ GGGCCGCTAAG ３′ ３′ CCCGGCGATTCAGCT ５′ ５′ GGGCTAAG ３′ ３′ CCCGATTCAGCT ５′ をそれぞれライゲーションし、それぞれ、pG97SHPCT（L
E）［GRRR］,pG97SHPCT（LE）［GR］,pG97SHPCT（LE）
［Ｇ］を得た（第11図）。これのDNA溶液で大腸菌W3110
株を各々形質転換し、それぞれW3110/pG97SHPCT（LE）
［GRRR］、W3110/pG97SHPCT（LE）［GR］、及びW3110/p
G97SHPCT（LE）［Ｇ］を得た。
ラスミドの作製（第11図参照） プラスミッドPG97SHPCT（特願昭63−49723、実施例８
第19図）をSal Iで部分消化し、アガロース電気泳動に
より、3.9kbのDNA断片を切り出した。次に、このDNA断
片をSma Iで完全に消化しアガロース電気泳動により、
3.8kbのDNA断片を切りだした。このDNA断片と両端にS
ma I及びSal I切断部位をもつ３組の合成リンカー Sma I Sal I ５′ GGGCCGGCGCCGTTAAG ３′ ３′ CCCGGCCGCGGCAATTCAGCT ５′ ５′ GGGCCGCTAAG ３′ ３′ CCCGGCGATTCAGCT ５′ ５′ GGGCTAAG ３′ ３′ CCCGATTCAGCT ５′ をそれぞれライゲーションし、それぞれ、pG97SHPCT（L
E）［GRRR］,pG97SHPCT（LE）［GR］,pG97SHPCT（LE）
［Ｇ］を得た（第11図）。これのDNA溶液で大腸菌W3110
株を各々形質転換し、それぞれW3110/pG97SHPCT（LE）
［GRRR］、W3110/pG97SHPCT（LE）［GR］、及びW3110/p
G97SHPCT（LE）［Ｇ］を得た。
（２）生産量の検討（第12図参照） （１）で作製した３種の大腸菌、すなわち、 W3110/pG97SHPCT（LE）［GRRR］,W3110/pG97HPCT（LE）
［GR］、W3110/pG97SHPCT（LE）［Ｇ］、及びW3110/pG9
7SHPCTをテトラサイクリンを含む倍地（2.4％トリプト
ン、1.2％酵母エキス、0.5％グリセロール）で16時間培
養し、各々のサンプルのSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動を行った（第12図）。この結果、キメラ蛋白質の生
産性は、Ｃ−末端に塩基性アミノ酸が付加したものの方
が、付加していないものに比べ、明らかに高いことがわ
かった。
［GR］、W3110/pG97SHPCT（LE）［Ｇ］、及びW3110/pG9
7SHPCTをテトラサイクリンを含む倍地（2.4％トリプト
ン、1.2％酵母エキス、0.5％グリセロール）で16時間培
養し、各々のサンプルのSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動を行った（第12図）。この結果、キメラ蛋白質の生
産性は、Ｃ−末端に塩基性アミノ酸が付加したものの方
が、付加していないものに比べ、明らかに高いことがわ
かった。
第１図は、hCT−Gly−Lys−Lys−ArgをCpBで処理して得
たhCT−GlyのCl8HPCによる溶出パターンを示す。 第２図は、動物細胞でＣ−末端α−アミド化酵素（XA45
7,XA799 Bal II）発現するためのプラスミッドの構造を
示す。 第３図は、硫酸アンモニウム沈殿によるXA799 Bal IIの
精製を示す。 第４図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対するアスコルビン酸濃度の影響を示
す。 第５図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対するカタラーゼ濃度の影響を示す。 第６図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対する銅イオン濃度の影響を示す。 第７図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対する緩衝液（pH）の影響を示す。 第８図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対する緩衝濃度の影響を示す。 第９図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対する基質（hCT−Gly）濃度の影響を示
す。 第10図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT→Gly→
hCT変換反応の０分、30分、及び２時間後のサンプルのC
18HPLCのチャートを示す。 第11図は、Ｃ−末端に付加した塩基性アミノ酸を変換し
た３種のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を持つプラス
ミッドの作製過程を示す。 第12図は、Ｃ−末端塩基性アミノ酸の異なる４種のキメ
ラ蛋白質の大腸菌での生産性を示すSDS−ポリアクリル
アミド電気泳動である。
たhCT−GlyのCl8HPCによる溶出パターンを示す。 第２図は、動物細胞でＣ−末端α−アミド化酵素（XA45
7,XA799 Bal II）発現するためのプラスミッドの構造を
示す。 第３図は、硫酸アンモニウム沈殿によるXA799 Bal IIの
精製を示す。 第４図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対するアスコルビン酸濃度の影響を示
す。 第５図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対するカタラーゼ濃度の影響を示す。 第６図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対する銅イオン濃度の影響を示す。 第７図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対する緩衝液（pH）の影響を示す。 第８図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対する緩衝濃度の影響を示す。 第９図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT−Glyの
アミド化反応に対する基質（hCT−Gly）濃度の影響を示
す。 第10図は、XA799 Bal IIによるin vitroでのhCT→Gly→
hCT変換反応の０分、30分、及び２時間後のサンプルのC
18HPLCのチャートを示す。 第11図は、Ｃ−末端に付加した塩基性アミノ酸を変換し
た３種のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を持つプラス
ミッドの作製過程を示す。 第12図は、Ｃ−末端塩基性アミノ酸の異なる４種のキメ
ラ蛋白質の大腸菌での生産性を示すSDS−ポリアクリル
アミド電気泳動である。
フロントページの続き (72)発明者 大末 和廣 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社生物医学研究所 内 (72)発明者 孫田 浩二 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社生物医学研究所 内 (56)参考文献 特開 昭62−289184（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−10999（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−226998（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500560（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−501541（ＪＰ，Ａ) 特表 昭58−501121（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】基質である蛋白又はペプチドにアミド化酵
素を作用させてアミド化蛋白又はアミド化ペプチドを製
造する方法において、反応液中に酢酸アンモニウム緩衝
液を存在させることを特徴とする該方法。 - 【請求項２】基質がヒト・カルシトニン前駆体（hCT−G
ly）である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】酢酸アンモニウム緩衝液を少なくとも10mM
存在させることを特徴とする請求項１又は２記載の方
法。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1005879A JP2535398B2 (ja) | 1989-01-17 | 1989-01-17 | アミド化ペプチドの製造方法 |
| CA002025350A CA2025350C (en) | 1989-01-17 | 1990-01-17 | Process for production of c-terminal .alpha.-amidated peptide |
| KR1019900702063A KR960013618B1 (ko) | 1989-01-17 | 1990-01-17 | C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 생산방법 |
| PCT/JP1990/000041 WO1990008194A1 (en) | 1989-01-17 | 1990-01-17 | PROCESS FOR PRODUCTION OF C-TERMINAL α-AMIDATED PEPTIDE |
| DE69019077T DE69019077T2 (de) | 1989-01-17 | 1990-01-17 | Verfahren zur herstellung von c-terminalen alpha-amidierten peptiden. |
| ES90901896T ES2072422T3 (es) | 1989-01-17 | 1990-01-17 | Procedimiento para la produccion de peptidos amidados en alfa en el terminal c. |
| EP90901896A EP0408764B1 (en) | 1989-01-17 | 1990-01-17 | Process for production of c-terminal alpha-amidated peptides |
| DK90901896.2T DK0408764T3 (da) | 1989-01-17 | 1990-01-17 | Fremgangsmåde til fremstilling af alfa-amiderede peptider |
| AT90901896T ATE122099T1 (de) | 1989-01-17 | 1990-01-17 | Verfahren zur herstellung von c-terminalen alpha- amidierten peptiden. |
| AU49484/90A AU630150B2 (en) | 1989-01-17 | 1990-01-17 | Process for production of c-terminal alpha-amidated peptide |
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|---|---|
| JPH02190193A JPH02190193A (ja) | 1990-07-26 |
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| JP (1) | JP2535398B2 (ja) |
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