DE69019077T2

DE69019077T2 - Verfahren zur herstellung von c-terminalen alpha-amidierten peptiden.

Info

Publication number: DE69019077T2
Application number: DE69019077T
Authority: DE
Inventors: Koji Osaka 563 Magota; Kazuhiro Osaka 567 Ohsuye; Shoji Hyogo 659 Tanaka
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 1989-01-17
Filing date: 1990-01-17
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2010-01-18
Also published as: ATE122099T1; AU4948490A; ES2072422T3; DK0408764T3; KR960013618B1; JPH02190193A; AU630150B2; EP0408764B1; CA2025350C; DE69019077D1; JP2535398B2; EP0408764A1; CA2025350A1; KR910700351A; WO1990008194A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung einer Vorstufe eines C-Terminus α-amidierten Peptids, auf Verfahren zur Herstellung eines C-Terminus-α- amidierten Peptids sowie auf Verfahren zur Herstellung eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms, das zur Herstellung eines C-Terminus-α-amidierten Peptids verwendet wird.
Es ist allgemein bekannt, daß einige Peptid- oder Proteinarten nach der Translation von einer Messenger-RNA (mRNA) in eukaryontischen Zellen durch ein intrazelluläres Enzym modifiziert werden, um zu einem natürlichen Peptid oder Protein zu reifen (post-translationale Modifikation), aber da prokaryontische Wirte wie beispielsweise E. coli, die in großem Maße zur Herstellung von Peptiden oder Proteinen eukaryontischen Ursprungs verwendet werden, keine posttranslationale Modifikation eines exprimierten Peptids oder Proteins durchführen können, ist es manchmal schwierig, ein eukaryontisches Peptid oder Protein mittels einer rekombinierten DNA-Technik unter Verwendung prokaryontischer wirtszellen direkt herzustellen.
Eine post-translationale Modifikation, die von eukaryontischen Zellen für Peptide oder Proteine kennzeichnend ist, ist eine Modifikationsreaktion, bei der eine α-Position eines Carboxy-Terminus (C-Terminus) eines Peptids oder Proteins amidiert wird, i.e. -CCOH wird in -CONH&sub2; überführt, und es ist bekannt, daß viele physiologisch aktive Peptide oder Proteine einer solchen Modifikation unterzogen wurden und die oben genannte Modifikation der Peptide und Proteine in einigen Fällen für ihre physiologische Aktivität essentiell ist. So setzt beispielsweise eine Umwandlung einer Prolinamid-Gruppe am C-Terminus eines natürlichen menschlichen Calcitonins zu einer Prolingruppe dessen physiologische Aktivität auf 1/1.600 der ursprünglichen Aktivität herab.
Aufgrund der Wichtigkeit der Aufklärung des Mechanismus einer α-Amidbildung im Gewebe und der vielversprechenden Nützlichkeit des Enzyms zur Herstellung eines C-Terminus α- amidierten Peptids, beispielsweise unter Verwendung von rekombinierten DNA-Techniken, wurden viele Versuche unternommen, um einen detaillierten Mechanismus der Biosynthese C-Terminus-α-amidierter Peptide aufzuklären, der für eukaryontische Zellen charakteristisch ist. Bei dieser Aufklärung wird zunächst eine Struktur einer Vorstufe eines amidierten Peptids anhand einer cDNA-Analyse eines amidierten Peptids aufgeklärt, wobei als Ergebnis ein allgemeiner Biosynthesemechanismus solcher amidierter Peptide als derjenige verstanden wird, in welchem die RNA zu einer Vorstufe eines amidierten Peptids umcodiert wird, die dann an der α- Position ihres C-Terminus durch ein C-Terminus-α-amidierendes Enzym amidiert wird. Zu beachten ist, daß bei der oben genannten Reaktion die Vorstufe des C-Terminus-α-amidierten Peptids als Substrat für ein C-Terminus-α-amidierendes Enzym ein Peptid oder Protein ist, das durch eine allgemeine Formel R-X-Gly dargestellt wird, worin R eine Aminosäuresequenz der N-Terminus-Seite des Peptids oder Proteins darstellt, X eine Aminosäuregruppe darstellt, die an ihrem C- Terminus α-amidiert werden soll, und Gly einen Glycinrest darstellt.
Andererseits haben Bradburg, A.F. et al., Nature 298, 686- 688, 1982, zum ersten Mal die α-amidierende Aktivität bei der Umsetzung eines synthetischen Substrats D-Tyr-Val-Gly zum D-Tyr-Val-NH&sub2; in einer Schweinshypophyse charakterisiert und gezeigt, daß der C-Terminus Glycin im Substrat als ein Stickstoffdonor für die α-Amidierung dient. Außerdem haben Eipper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 80, 5144-5148, 1983, berichtet, daß die Aktivität des von der Hirnanhangdrüse einer Ratte abstammenden α-amidierenden Enzyms Kupferkationen, Ascorbinsäure und molekularen auerstoff benötigt. Husain, I. et al., FEBS Lett., 152, 227-281, 1983; und Kizer, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 81, 3228-3232, 1984, haben auch über ein C-Terminus-α-amidierendes Enzym berichtet, jedoch über kein gereinigtes Enzym. Kürzlich hat Murthy A.S.N. et al., J. Biol. Chem., 261, 1815-1822, 1986, ein C-Terminus-α-amidierendes Enzym aus der Rinderhirnanhangdrüse teilweise gereinigt und gezeigt, daß mehrere Enzymarten mit unterschiedlichen Molekulargewichten und elektrischen Ladungen vorliegen.
Kürzlich gelang Mizuno et al. die Isolierung eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms in einer homogenen und reinen Form aus der Haut von Xenopus laevis (siehe Mizuno, K. et al., Biochem. Biophys. Res Commun. 137, 984-991, 1988, sowie Japanische Patentanmeldung Nr. 60-131,089), wobei ihm darüberhinaus die Bestimmung der ganzen primären Aminosäuresequenz des C-Terminus-α-amidierenden Enzyms der Haut vom Xenopus laevis-Ursprung durch die Darstellung und Sequenzierung der cDNA gelang (siehe Mizuno, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 148, 546-552, 1987).
Unsere eigene EP-A-299790 (die nach Artikel 54(3) zum Stand der Technik der vorliegenden Offenbarung gehört, jedoch Dänemark nicht bezeichnet) beschreibt auch die Darstellung von Xenopus laevis C-Terminus-α-amidierenden Enzymen und offenbart darüberhinaus deren Verwendung bei der Umwandlung von R-Gly zu R-NH&sub2;.
Peptide Chemistry 1987, S. 427-430 (in den Chemical Abstracts 109: 124771r berichtet) beschreibt das Klonieren und die Expression von cDNA, die das C-Terminus-α-amidierende Enzym AE-I decodiert und die ursprünglich aus der Haut von Xenopus laevis erhalten wurde sowie die Wirksamkeit des Enzyms zur Umwandlung von Ac-Tyr-Phe-Gly zu Ac- Tyr-Phe-NH&sub2;.
Andererseits hat Eipper, B. et al., Mol. Endo. 1, 777-790, 1987 die cDNA eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms einer Rinderhirnanhangdrüse kloniert und gezeigt, daß sich das Enzym der Hirnanhangdrüse von dem oben genannten Enzym des Xenopus laevis-Ursprungs deutlich unterscheidet.
Die oben genannten Berichte zeigen, daß es viele C-Terminus-α-amidierenden Enzyme eukaryontischen Ursprungs gibt, wobei dies nahe legt, daß jedes Enzym eine von den anderen unterschiedliche, bestimmte Substratspezifität aufweist; daß nämlich für ein bestimmtes C-Terminus-α-amidiertes Peptid ein bestimmtes C-Terminus-α-amidierendes Enzym vorhanden ist, obwohl dies noch nicht vollständig nachgewiesen worden ist.
In Anbetracht des bis jetzt aufgeklärten Biosynthesemechanismus amidierter Peptide in eukaryontischen Zellen, wie oben beschrieben, ist zu erwarten, das eine große Anzahl eines amidierten Peptids durch eine Vorgehensweise, wie sie nachfolgend beschrieben wird, hergestellt werden kann. Es wird nämlich zunächst eine große Menge einer Vorstufe eines amidierten Peptids, das durch die Formel R-X-Gly dargestellt wird, wirtschaftlich durch Gentechnik in einem prokaryontischen Wirt, wie beipielsweise E. Coli. hergestellt; als nächstes wird eine große Menge eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms eines eukaryontischen Zellursprungs bereitgestellt; und schließlich wird die Vorstufe zu einem gewünschten C-Terminus-α-amidierten Peptid mittels des C- Terminus-α-amidierenden Enzyms unter einer Optimalbedingung umgewandelt.
Beruhend auf diesem Konzept gab es viele Versuche, amidierte Peptide herzustellen. Es wurden nämlich viele Berichte veröffentlicht, die sich auf die Herstellung von Vorstufen amidierter Peptide durch Gentechnik beziehen. So beschreibt beispielsweise Bennet A.D. et al. (PCT Japanische Nationalveröffentlichung No. 60-501391; WO 84/04756) ein Verfahren zur Herstellung einer Vorstufe von menschlichem Calcitonin (hCT-Gly) aus einem kondensierten Protein, das einen aktiveii Bereich eines Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Proteins und eine Vorstufe von menschlichem Calcitonin umfaßt, das in E. coli. exprimiert wird. Nach diesem Verfahren liefern 44 mg des kondensierten Proteins jedoch lediglich etwa 1,1 bis 2,0 mg der Vorstufe des menschlichen Calcitonins (hCT-Gly) und daher schafft dieses Verfahren keine effiziente Herstellung des hCT-Gly.
Andererseits haben die vorliegenden Erfinder (Japanische Patentanmeldung Nr. 63-49723, EP 0281418 A2) über ein effizientes Verfahren zur Herstellung von hCT-Gly-Lys-Lys- Arg, das einen Teil einer Vorstufe von menschlichem Calcitonin enthält, aus einem kondensierten Protein berichtet, das ein aus β-Galactosidase abstammendes Protein und das in E. coli. exprimierte Peptid hCT-Gly-Lys-Lys-Arg umfaßt. Dieses Peptid ist trotzdem an sich kein Substrat für ein C- Terminus-α-amidierendes Enzym und muß daher in die Vorstufe hCT-Gly überführt werden.
Außerdem hat in Anbetracht der Auswahl und des Verfahrens zur Herstellung einer Menge eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms, die für den industriellen Einsatz ausreichend ist, Eeton, M.A.W. et al. (PCT Japanische Nationalveröffentlichung No. 63-501541; WO 87/01729) über die Herstellung von menschlichem Calcitonin unter Verwendung eines aus der Schweinshirnanhangdrüse teilweise gereinigten C-Terminus-α- amidierenden Enzyms berichtet. Dennoch ist es nach diesem Verfahren und anderen bekannten Verfahren wirtschaftlich schwierig, eine ausreichende Menge eines C-Terminus-α- amidierenden Enzyms für den Einsatz bei der industriellen Herstellung von amidierten Peptiden zu erhalten. In diesem Zusammenhang haben die vorliegenden Erfinder (Japanische Patentanmeldung Nr. 62-306867; EP 0299790 A2) ein Verfahren entwickelt, das eine große Menge eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms des Xenopus laevis-Hautursprungs und seiner Derivate durch Gentechnik schafft. Das in E. coli. exprimierte C-Terminus-α-amidierende Enzym vom Xenopus laevis- Ursprung und dessen Derivate weisen jedoch eine niedrigere Aktivität als diejenigen auf, die von der Haut des Xenopus laevis gereinigt wurden, wobei deshalb ein C-Terminus-α- amidierendes Enzym mit einer höheren Aktivität für den Einsatz zur Herstellung einer großen Menge α-amidierter Peptide erwünscht wird.
Was die Optimumbedingung für eine in-vitro-Herstellung eines amidierten Peptids aus einem Derivat davon durch ein C-Terminus-α-amidierendes Enzym, wie oben beschrieben, betrifft, so ist diese Enzymreaktion von Kupferkationen (Cu²&spplus;), molekularem Sauerstoff, Ascorbinsäure und Katalase abhängig. Wird jedoch meschliches Calcitonin aus einer Vorstufen davon mittels eines aus einer Schweinshirnanhangdrüse teilweise gereinigten C-Terminus-α-amidierenden Enzyms unter der Optimumbedinung für dieses Enzym hergestellt, so ist die Löslichkeit der Vorstufe für eine effiziente Enzymreaktion nicht ausreichend. Um eine ausreichende in-vitro-Enzymreaktion zu erhalten, muß eine Optimumbedingung für ein gewünschtes Peptid gefunden werden.
Wie oben beschrieben, müssen zur wirtschaftlichen Herstellung einer großen Menge eines amidierten Peptids mindestens drei technische Probleme gelöst werden, i.e. (1) effiziente Herstellung eines Vorstufenpeptids für ein gewünschtes amidiertes Peptid, (2) Herstellung einer ausreichenden Menge eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms mit einer hohen Wirksamkeit und (3) Bestimmung einer Optimalbedingungen für eine in-vitro-Überführung einer bestimmten Vorstufe zu einem gewünschten Peptid unter Verwendung des C-Terminus-α-amidierenden Enzyms. Dementsprechend wird gegewärtig intensiv nach einer Lösung dieser Probleme geforscht.
Ziel der Erfindung ist demnach ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung einer großen Menge an amidierten Peptidvorstufen, die durch die Formel R-X-Gly dargestellt werden, ein Verfahren zur Herstellung einer großen Menge eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms mit einer hohen Wirksamkeit sowie ein Verfahren zur Herstellung eines amidierten Peptids unter einer Optimumbedingung.
Insbesondere schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (II):
R-x-Gly (II)
worin X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt und R einen verbleibenden Teil des Peptids oder Proteins darstellt, das die Schritte umfaßt:
Hydrolyse eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (I):
R-X-Gly-B
worin X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, Gly einen Glycinrest darstellt, B einen Lysin- oder Argininrest, ein im wesentlichen aus Lysin- oder Argininresten bestehendes Oligopeptid oder eine Kombination von Lysin- und Argininresten darstellt, mit Carboxypeptidase B.
Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Calcitonin, das durch die Formel
R-NH&sub2;
dargestellt wird, in der die NH&sub2;-Gruppe von der α-amidierten C-Terminus Aminosäure des Calcitoninmoleküls abstammt, das die Umsetzung eines Peptids oder Proteins der Formel
R-Gly
umfaßt, in der Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt, mit einem C-Terminus-α-amidierenden Enzym von menschlichem Schilddrüsen-Ursprung oder einem Derivat davon.
Die vorliegende Erfindung schafft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (III):
R-X-NH&sub2; (III)
worin X-NH&sub2; eine C-Terminus-α-amidierte Aminosäure darstellt und R einen verbleibenden Teil des Peptids oder Proteins darstellt, das die Schritte umfaßt:
(1) Hydrolyse eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (I):
R-X-Gly-B (I)
worin X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, Gly einen Glycinrest darstellt, B einen Lysin- oder Argininrest, ein im wesentlichen aus Lysin- oder Argininresten bestehendes Oligopeptid oder eine Kombination aus Lysin- und Argininresten darstellt und R einen verbleibenden Teil des Peptids oder Proteins darstellt, mit Carboxypeptidase B, um ein Intermediatpeptid oder -protein zu erzeugen, dargestellt durch die Formel (II):
R-X-Gly (II)
worin X einen beliebigen Aminosäurerest, der α-amidiert werden soll, darstellt, Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt und R einen verbleibenden Teil des Peptids oder Proteins darstellt; und
(2) Behandeln des Peptid- oder Proteinintermediats, dargestellt durch die Formel (II), mit einem C-Terminus-α- amidierenden Enzym oder einem Derivat davon.
Die vorliegende Erfindung schafft darüberhinaus ein Verfahren zur Herstellung eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms oder eines Derivats davon, das die Schritte umfaßt:
Kultivierung tierischer Zellen, die mit einem Plasmid transfektiert waren, das eine DNA-Codierung für das Enzym oder ein Derivat davon enthielt, und fähig ist, dasselbe zu exprimieren; und
Aufarbeiten des Enzyms oder eines Derivats davon.
Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (II):
R-X-Gly (II)
worin X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt und R einen verbleibenden Teil eines Peptids oder Proteins darstellt, das die Schritte umfaßt:
(1) Erhalten eines kondensierten Proteins, dargestellt durch die Formel (0):
P-R-X-Gly-B (0)
worin P ein Partnerprotein des kondensierten Proteins darstellt, X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt; Gly einen Glycinrest dartellt, B einen C-Terminus Lysin- oder Argininrest oder ein im wesentlichen aus Lysin- oder Argininresten bestehendes Oligopeptid oder eine Kombination von Lysin- und Argininresten darstellt und R einen verbleibenden Teil des Proteins darstellt, durch Kultivierung eines Wirtes, der mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der eine DNA-Codierung für das kondensierte Protein enthält;
(2) Aufarbeitung des kondensierten Proteins;
(3) Spaltung des kondensierten Proteins durch ein konventionelles Verfahren, um ein Partnerprotein (P) und ein Peptid oder Protein zu bilden, dargestellt durch die Formel (I)
R-X-Gly-B (I)
worin R, X, Gly und B die gleiche Bedeutung wie unter Formel (0) definiert, haben;
(4) Abtrennen des Peptids oder Proteins (I) vom Partnerprotein (P) auf der Basis der Differenz deren isoelektrischer Punkte; und
(5) Hydrolyse des Peptids oder Proteins (I) mit Carboxypeptidase B, um das gewünschte Peptid oder Protein (II) zu bilden.
Die vorliegende Erfindung schafft darüberhinaus ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (III):
R-X-NH&sub2; (III)
worin X-NH&sub2; eine C-Terminus-α-amidierte Aminosäure darstellt und R einen verbleibenden Teil des Peptids oder Proteins darstellt, das die Schritte umfaßt:
(1) Erhalten eines kondensierten Proteins, dargestellt durch die Formel (0):
P-R-X-Gly-B (0)
worin P ein Partnerprotein des kondensierten Proteins darstellt, X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt; Gly einen Glycinrest dartellt, B einen C-Terminus Lysin- oder Argininrest oder ein im wesentlichen aus Lysin- oder Argininresten bestehendes Oligopeptid oder eine Kombination von Lysin- und Argininresten darstellt und R einen verbleibenden Teil des Proteins darstellt, durch Kultivieren eines Wirtes, der mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der eine DNA-Codierung für das kondensierte Protein enthält;
(2) Aufarbeitung des kondensierten Proteins;
(3) Spalten des kondensierten Proteins durch ein konventionelles Verfahren, um ein Partnerprotein (P) und ein Peptid oder Protein zu bilden, dargestellt durch die Formel (I)
R-X-Gly-B (I)
worin R, X, Gly und B die gleichen Bedeutungen wie unter der Formel (0) definiert haben;
(4) Abtrennen des Peptids oder Proteins (I) vom Partnerprotein (P) auf der Basis der Differenz deren isoelektrischer Punkte; und
(5) Hydrolyse des Peptids oder Proteins (I) mit Carboxypeptidase B, um ein Intermediatpeptid oder -protein zu bilden, dargestellt durch die Formel (II):
R-X-Gly (II)
worin X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt und R einen verbleibenden Teil eines Peptids oder Proteins darstellt; und
(6) Behandeln des Peptids oder Proteins (II) mit einem C-Terminus-α-amidierenden Enzym oder einem Derivat davon.
Die vorliegende Erfindung schafft außerdem ein C-Terminus- α-amidierendes Enzym mit einer Aminosäuresequenz, die mit der -37. Aminosäure beginnt und an der 363. Aminosäure endet, wie in den Fig. 13-1 bis 13-3 gezeigt ist; und ein C-Terminus-α-amidierendes Enzymderivat mit einer Aminosäuresequenz, die mit der 39. Aminosäure beginnt und an der 692. Aminosäure aufhört, wie in den Fig. 14-1 bis 14-3 gezeigt ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt ein Elutionsprofil von hCH-Gly dar, das durch Behandeln von hCT-Gly-Lys-Lys-Arg mit Carboxypeptidase B(CpB) gebildet wurde;
Fig. 2 stellt eine Struktur eines Plasmids pKDPXA457 oder pKDPXA799 BglII, das ein C-Terminus-α-amidierendes Enzym XA457 oder XA799 BglII in tierischen Zellen exprimiert;
Fig. 3 stellt die Reinigung des XA799 BglII durch Ammoniumsulfatausfällung dar;
Fig. 4 ist ein Graph, der einen Effekt von Ascorbinsäure auf eine in-vitro-Amidierung von hCT-Gly durch das XA799 BglII zeigt;
Fig. 5 ist ein Graph, der einen Effekt einer Katalasekonzentration auf eine in-vitro-Amidierung von hCT- Gly durch das XA799 BglII zeigt;
Fig. 6 ist ein Graph, der einen Effekt von Kupferkationen (Cu²&spplus;) auf eine in-vitro-Amidierung von hCT-Gly durch das XA799 BglII zeigt;
Fig. 7 ist ein Graph, der einen Effekt von Pufferlösungen und deren pH auf eine in-vitro-Amidierung von hCT- Gly durch das xA799 BglII zeigt;
Fig. 8 ist ein Graph, der einen Effekt einer Pufferkonzentration auf eine in vitro Amidierung von hCT- Gly durch das XA799 BglII zeigt;
Fig. 9 ist ein Graph, der einen Effekt einer Substrat- (hCT-Gly)-Konzentration auf eine in-vitro-Amidierung von hCT-Gly durch das XA799 BglII zeigt;
Fig. 10 stellt die Elutionsdiagramme von C18HPLC für Proben dar, die durch eine in-vitro-Reaktion zur Überführung von hCT-Gly in hCT durch das XA799 BglII bei 0, 30 und 120 Minuten erhalten wurden;
Fig. 11 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids mit einer Gencodierung für ein oder drei chimäre Proteine mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen basischer Aminosäuren dar;
Fig. 12 stellt ein Ergebnis einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, die die Produktivität vier chimärer Proteine mit unterschiedlichen C-Terminus-Aminosäurensequenzen in E. coli. zeigt;
Fig. 13-1 bis 13-4 stellen eine Nukleotidsequenz einer cDNA, die im Plasmid pXA 457 vorliegt sowie eine durch die cDNA decodierte Aminosäuresequenz dar; und
Fig. 14-1 bis 14-3 stellen eine Nukleotidsequenz einer cDNA, die in einem Plasmid pXA799 vorliegt sowie eine durch die cDNA decodierte Aminosäuresequenz dar.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSPORMEN

(1) Vorstufe zur Amidierung und Verfahren zu deren Herstellung

Um eine Vorstufe für die Amidierung effizient herzustellen, dargestellt durch die Formel R-X-Gly, worin X einen beliebigen zu amidierenden Aminosäurerest darstellt, Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt R einen verbleibenden Teil eines Peptids oder Proteins darstellt, wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Peptid oder Protein, dargestellt durch die Formel (I):
R-X-Gly-B (I)
worin X eine beliebige Aminosäure, die schließlich amidiert werden soll, darstellt, Gly einen Glycinrest darstellt, B einen C-Terminus Arginin- oder Lysinrest oder ein im wesentlichen aus Arginin- und Lysinresten bestehendes Oligopeptid oder eine Kombination aus Arginin- und Lysinresten darstellt und R einen verbleibenden Teil des Peptids oder Proteins darstellt, mit einer Carboxypeptidase B (CpB) behandelt.
Eine Vorstufe von menschlichem Calcitonin wird als ein bestimmtes Beispiel beschrieben.
Die vorliegenden Erfinder haben über ein Verfahren zur effizienten Herstellung einer großen Menge eines Peptids hCT-Gly-Lys-Lys-Arg, der einen Teil einer Vorstufe von menschlichem Calcitonin enthält (Japanische Patentanmeldung Nr. 63-49723; EP 0281418 A2), berichtet, aber dieses Peptid ist kein Substrat für ein C-Terminus-α-amidierendes Enzym. Daher muß zur Herstellung einer Vorstufe von meschlichem Calcitonin (hCT-Gly) das C-Terminus-Peptid Lys-Ly-Arg aus dem Peptid hCT-Gly-Lys-Lys-Arg eliminiert werden. Die vorliegenden Erfinder haben festgestellt, daß die Vorstufe von menschlichem Calcitonin hCT-Gly extrem effizient aus dem Peptid hCT-Gly-Lys-Lys-Arg durch Behandeln des peptids mit Carboxypeptidase B (CpB) hergestellt werden kann.
Zu beachten ist, daß dieses Verfahren auf die Überführung eines Peptids, dargestellt durch die Formel (I) zu einer Vorstufe für Amidierung, dargestellt durch die Formel (II) allgemein verwendet werden kann, und daß das Peptid (I) durch chemische Synthese oder Gentechnik gemäß einer konventionellen Vorgehensweise hergestellt werden kann.
Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung einer Vorstufe für Amidierung ist dem konventionellen Verfahren überlegen, worin die Vorstufe R-X-Gly direkt als kondensiertes Protein mittels eines E. coli. Wirtes hergestellt wird.
So ist beispielsweise die Vorstufe von menschlichem Calcitonin hCT-Gly ein Peptid, das aus 33 Aminosäureresten einschließlich eines Asparaginsäurerests und eines Lysinrests besteht und daher einen isoelektrischen Punkt (pI) nahezu am neutralen Punkt zeigt. Demnach ist es schwierig, die Vorstufe vom Partnerprotein nach der Spaltung des kondensierten Proteins durch eine einzige Ionenaustauschsäulenchromatographie abzutrennen, weil das hCT-Gly in den meisten Fällen einen neutralen isoelektrischen Punkt aufweist. Da die Vorstufe hCT-Gly-Lys-Lys-Arg einen basischen PI aufweist, kann es umgekehrt durch eine einfache Ionenaustauschchromatographie leicht von einem Partnerprotein, das ein kondensiertes protein bildet, abgetrennt werden. Darüber hinaus kann die Vorstufe hCT-Gly, die durch Spaltung des peptids hCT-Gly-Lys-Lys-Arg mit CpB gebildet wurde, durch eine einfache Ionenaustauschchromatographie leicht von möglichen Nebenprodukten hCT-Gly-Lys und hCT- Gly-Lys-Lys als auch vom Ausgangsmaterial hCT-Gly-Lys-Lys- Arg abgetrennt werden, da die Vorstufe hCT-Gly einen neutralen pl aufweist, aber die Nebenprodukte und das Ausgangsmaterial einen basischen pI haben.
Überraschenderweise wurde als zweiter Vorteil des vorliegenden Verfahrens, worin die Vorstufe hCT-Gly aus dem Peptid hCT-Gly-Lys-Lys-Arg hergestellt wird, festgestellt, daß ein kondensiertes Protein, das einen Teil β-Galactosidase und hCT-Gly-Lys-Lys-Arg umfaßt, im Vergleich zu einem kondensierten Protein, das einen Teil β-Galactosidase und hCT-Gly umfaßt, in einer bemerkenswert hohen Ausbeute in einem E. coli. Wirt hergestellt wird. Darüber hinaus hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß ein kondensiertes Protein, das hCT-Gly-Arg, hCT-Gly-Arg-Arg oder ähnliches enthält, im Vergleich zu dem kondensierten Protein, das hCT-Gly-Lys-Lys-Arg umfaßt, in einer hohen Ausbeute hergestellt werden kann. Demnach ist das vorliegende Verfahren gegenüber einem konventionellen Verfahren bemerkenswert vorteilhaft, worin die Vorstufe hCT-Gly als kondensiertes Protein exprimiert wird, in welchem hCT-Gly an ein Partnerprotein gebunden ist.
Zu beachten ist, daß das B in der Formel R-X-Gly-B eine beliebige basische Aminosäure, wie beispielsweise Arginin oder Lysin, oder ein beliebiges im wesentlichen aus zwei bis etwa zehn basischen Aminosäuren, wie beispielsweise Argininresten oder Lysinresten bestehendes Oligopeptid oder eine beliebige Kombination von Arginin- und Lysinresten sein kann, was aus dem oben angeführten klar ist.

(2) Verfahren zur Herstellung des C-Terminus-α-amidierenden Enzyms

Den vorliegenden Erfindern gelang die Expression eines C- Terminus-α-amidierenden Enzyms vom Xenopus laevis-Hautursprung und Derivaten davon in einem E. coli. Wirt in einer großen Menge (Japanische Patentanmeldung Nr. 62- 306867; EP 0299790 A2). Es wurde jedoch festgestellt, daß das C-Terminus-α-amidierende Enzym oder dessen Derivate in diesem Verfahren in E. coli. Zellen denaturiert werden und daher keine C-Terminus-α-amidierende Aktivität aufweisen. Demnach sollte eine inaktive Form des so hergestellten Enzyms renaturiert werden. Dieses Problem wurde durch eine Renaturierung der inaktiven Form durch Behandeln mit einem denaturierenden Mittel wie beispielsweise Harnstoff oder Guanidin-Hydrochlorid, und anschließender Renaturierungteilweise gelöst, aber dieses Verfahren schaffte ein renaturiertes Enzym, das eine niedrigere Aktivität als ein natives, aus der Xenopus laevis-Haut extrahiertes Enzym zeigt. Die vorliegenden Erfinder erwägen, daß der Grund für die oben genannte niedrigere Aktivität des in E. coli. erzeugten Enzyms wie folgt ist: da das C-Terminus-α- amidierende Enzym vom Xenopus laevis-Hautursprung und dessen Derivate viele Cysteinreste haben (beispielsweise hat ein natives Enzym vom Xenopus laevis-Hautursprung 10 Cysteinreste), können sie keine korrekten Disulfidbindungen, die die gleichen wie die im nativen Enzym sind, bilden, wenn diese Proteine in E. coli. Zellen exprimiert werden. Demnach haben die vorliegenden Erfinder versucht, die Enzymaktivität durch Behandeln des in E. coli. exprimierten Enzyms mit einem Reduktionsmittel, wie beispielsweise Dithiothreitol oder 2-Mercaptoethanol, in Kombination mit dem oben erwähnten denaturierenden Mittel und anschließender Oxidation des reduzierten Proteins zu erhöhen, aber dieses Verfahren führte zu keiner Erhöhung der Enzymaktivität.
Um die oben genannte Schwierigkeit zu beseitigen, schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms oder dessen Derivaten, worin das Enzym oder dessen Derivat in eukaryontischen Zellen wie beispielsweise tierischen Zellen exprimiert wird.
Die DNA-Codierung für zwei Typen C-Terminus-α-amidierender Enzyme (XA457 und XA799) vom Xenopus laevis-Ursprung wurden in Plasmide pXA457 bzw. pXA799 kloniert (Japanische Patentanmeldung Nr. 62-306867; EP 0299790 A2). Die Nukleotidsequenz der cDNA-Codierung für das Enzym XA457 und die entsprechende Aminosäuresequenz werden in den Fig. 13-1 bis 13-4 (Fig. 1-1 bis Fig. 1-3 der oben genannten Patentanmeldung) beschrieben, und die Nukleotidsequenz der cDNA-Codierung für das Enzym XA799 und die entsprechende Aminosäuresequenz werden in Fig. 14-1 bis 14-4 (Fig. 16-1 bis 16-3 der oben genannten patentanmledung beschrieben). Deshalb kann für den vorliegenden Zweck eine DNA-Codierung für ein beliebiges Enzym oder dessen Derivaten ausgehend von den oben genannten klonierten cDNAs hergestellt werden.
Als ein Beispiel eines nativen Enzyms kann ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von der 37. Aminosäure zur 363. Aminosäure, die durch die cDNA decodiert und in den Fig. 13-1 bis 13-3 beschrieben wird, genannt werden und als ein Beispiel eines Enzymderivats kann ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von der 39. Aminosäure zur 692. Aminosäure, decodiert durch die cDNA, die in den Fig. 14-1 bis 14-3 beschrieben wird, sowie ein zusätzlicher C-Terminus Leucin genannt werden. Um die oben genannten Polypeptide zu exprimieren, wurden Expressionsplasmide pKDPXA457 und pKDPXA799 BglII konstruiert, in denen eine DNA-Codierung für ein gewünschtes Polypeptid unter der Kontrolle eines SV40-Promotors insertiert ist. Diese Plasmide wurden anschließend verwendet, um CHO-(Chinesische Hamsterovarien)-Zellen zu transfektieren, um Transfektate CHO/pKDPXA457-α und CHO/pKDPXA799 BglII-α zu erhalten. Die transfektierten Zellen wurden sequentiell in einem Medium mit zunehmenden Methotrexatkonzentrationen kultiviert, um die transfektierten Gene zu replizieren und die Zellen, die der Amplifikation unterzogen wurden, wurden anschließend ge-screent, um einen Klon zu erhalten, der eine große Menge eines gewünschten Proteins abscheidet, wobei hierbei ein Klon CHO/10C erhalten wurde, der ein C-Terminus-α-amidierendes Enzym in einem Kulturmedium in einer Menge von 2.000 Einheiten/ml ausscheidet. Das ausgeschiedene C-Terminus-α- amidierende Enzym, das als XA799 BglII bezeichnet wird, kann durch Ammoniumsulfat selektiv ausgefällt werden.
Dementsprechend wurde ein neuartiges Verfahren zur Herstellung eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms geschaffen, das für die industrielle Herstellung einer großen Menge des Enzyms brauchbar ist.

(3) Bestimmung der optimalen Bedingung für die Amidierungsreaktion

Obwohl eukaryontische Zellen unterschiedliche Typen an C- Terminus-α-amidierenden Enzymen enthalten, wurden, wie oben beschrieben, keine detaillierte Substratspezifität und eine optimale Bedingung für eine Reaktion aufgeklärt.
Normalerweise benötigen C-Terminus-α-amidierende Enzyme molekularen Sauerstoff, Kupferkationen (Cu²&spplus;), Ascorbinsäure und Katalase, um ihre maximale Aktivität zu erlangen. Diese essentiellen Anforderungen wurden hauptsächlich mittels eines synthetischen Substrats, wie beispielsweise D-Tyr-Val-Gly, bestimmt.
Andererseits wurde festgestellt, daß einige Arten teilweise oder vollständig gereinigter C-Terminus-α-amidierender Enzyme bestimmte Optimumbedinungen einschließlich eines Optimum-pH haben.
Folglich ist eine Optimumbedinung eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms, das in-vitro verwendet wird, um eine Vorstufe eines gewünschten Proteins zu einem entsprechenden amidierten Protein umzuwandeln, nicht die gleiche wie die Optimumbedinung für die Vorstufe als Substrat für das Enzym. Wird beispielsweise, wie oben beschrieben, ein C- Terminus-α-amidierendes Enzym, das teilweise aus der Schweinshirnanhangdrüse gereinigt wurde, zur Herstellung von menschlichem Calcitonin verwendet, führt die Optimumbedingung für die Enzymreaktion dazu, daß die Löslichkeit der Vorstufe von menschlichem Calcitonin zu gering ist, um menschliches Calcitonin zu erhalten.
Um demnach ein gewünschtes amidiertes Protein oder Peptid effizient herzustellen, muß eine Optimumbedingung für eine in-vitro-Enzymreaktion in Abhängigkeit einer bestimmten Kombination des C-Terminus-α-amidierenden Enzyms, das verwendet wird, und des gewünschten Proteins oder Peptids bestimmt werden.
Demnach haben wir eine Optimumbedinung für den Fall bestimmt, worin das Enzym XA799 BglII zur Herstellung von menschlichem Calcitonin aus einer Vorstufe davon, i.e. hCT- Gly verwendet wird. Die ermittelte Bedingung schließt a) eine Konzentration an Ascorbinsäure, b) eine Konzentration an Katalase, c) eine Konzentration an Kupferkationen (Cu²&spplus;) , d) einen Puffer sowie dessen Konzentration und pH, und e) eine Konzentration einer Vorstufe, i.e. eines Substrats, ein. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß a) eine Optimumkonzentration an Ascorbinsäure 1 bis 7 mM beträgt und daß die Effizient der Amidierung bei einer Konzentration, die höher als 20 mM ist, herabgesetzt ist;
b) die Katalase in einer Konzentration von wenigstens 1 ug/ml benötigt wird; c) wenn die Kupferkonzentration von 0 auf 10 uM zunahm, nahm die Effizienz der Amidierungsreaktion zu und daß eine Konzentration von mehr als 10 uM diese keinen Effekt auf die Wirksamkeit der Amidierungsreaktion hat; d) für den Typ, die Konzentration und den pH des Puffers das Optimum 10 mM Ammoniumacetat bei einem pH von 6 bis 7 ist; und e) eine Konzentration des Substrats von bis zu 5 mg/ml annehmbar ist. Zu beachten ist, daß die Löslichkeit der Vorstufe von menschlichem Calcitonin hCT- Gly unter den oben genannten Bedingungen ausreichend ist, um menschliches Calcitonin zu erzeugen.
Folglich kann auf der Basis der oben genannten Bedingung menschliches Calcitonin aus der Vorstufe hCT-Gly mittels des Enzyms XA799 BglII hergestellt werden.
Mittels der hier beschriebenen Techniken kann eine Vorstufe eines amidierten Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel R-X-Gly, wie beispielsweise die Vorstufe hCT-Gly von menschlichem Calcitonin, effizient aus einem Ausgangspeptid oder -protein, dargestellt durch die Formel R-X-Gly- B, das eine Vorstufenkomponente enthält, wie beispielsweise einem Ausgangspeptid für die Vorstufe von menschlichem Calcitonin hCT-Gly-Lys-Lys-Arg unter Verwendung von Carboxypeptidase B (CpB) hergestellt werden; ein C-Terminus-α- amidierendes Enzym kann mittels eines eukaryontischen Wirts wie beispielswiese tierischen Zellen effizient hergestellt werden; und ein gewünschtes amidiertes Peptid oder Protein kann mittels eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms unter einer Optimumbedingung für eine Enzymreaktion effizient hergestellt werden.
Die Enzymaktivität wird anhand einer Reaktion erprobt, worin ein Substrat, allgemein durch R-X-Gly dargestellt, in R-X-NH&sub2; überführt wird, wie beispielsweise eine Reaktion, worin ein synthetisches Substrat [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-Gly in [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-NH&sub2; überführt wird.
Ein markiertes Substrat (markiertes R-X-Gly) wird nämlich einer Reaktion mit einer Testenzymlösung in einem TrisHCl- Puffer unterworfen, wobei TrisHCl-Puffer und Ethylacetat diesem Reaktionsgemisch zugesetzt werden und das Ganze nach dem Rühren zentrifugiert wird, um die organische Phase und die wäßrige Phase aufzutrennen. Da ein Hauptanteil des nicht umgesetzten markierten Substrats (markiertes R-X-Gly) in der wäßrigen Phase verbleibt und ein amidiertes markiertes Produkt (markiertes R-X-NH&sub2;) in eine organische Phase übergeht, kann das Substrat und das Produkt leicht aufgetrennt werden.
In den Beispielen der vorliegenden Erfindung wurde ein erfindungsgemäßes C-Terminus-α-amidierendes Enzym mittels eines synthetischen Peptids [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-Gly als einem Substrat gemäß der folgenden Vorgehensweise erprobt. [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-Gly (1 pMol, 70.000 bis 150.000 cpm) wurde in einem Endvolumen von 250 ul, das einen 0,2 M TrisHCl-Puffer (pH 7,0), 2 uM CuSO&sub4;, 0,25 mM Ascorbinsäure, 25 ug Katalase (Boehringer) und 0,1% Lubrol (PX-Typ, Nakarai Chemicals) enthielt, mit einem Enzympräparat inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde für 1 bis 4 Stunden auf 37ºC gehalten und anschließend 0,75 ml 1 M TrisHCl- Puffer (pH 7,0) und 2 ml der organischen Phase eines Ethylacetat/Wasser-Gemisches zugesetzt. Das so hergestellte Reaktionsgemisch wurde kräftig an einem Vortex-Mischer gemischt, wobei nach dem Zentrifugieren bei 3.000 U/min für 3 Minuten die so abgetrennte organische Phase in ein anderes Teströhrchen eingebracht wurde. Die Radioaktivität der organischen und wäßrigen Schichten wurde mittels eines γ-Szintillationsmeßzählers gemessen. Unter den oben beschriebenen Bedingungen wurde in einer wäßrigen Phase über 98% der Radioaktivität des authentischen [¹²&sup5;I]-Ac- Tyr-Phe-Gly erhalten, wobei über 98% der Radioaktivität des authentischen [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-NH&sub2; in eine organische Phase übergeführt wurden.
Die Umwandlungsausbeute wird aus dem Verhältnis der Radioaktivität in einer organischen Phase, wie beispielsweise einer Ethylacetatphase zur gesamten Radioaktivität errechnet. In dieser Probe ist eine Einheit als diejenige Enzymaktivität definiert, die eine 50%ige Überführung eines pMols Substrat, wie beispielsweise [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-Gly in [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-NH&sub2; in 1 Stunde angibt.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht, ist jedoch keineswegs auf diese beschränkt.

Beispiel 1. Herstellung der Vorstufe von menschlichem Calcitonin (hCT-Gly)

Das Ausgangspeptid hCT-Gly-Lys-Lys-Arg ist die gleiche Verbindung, wie das HPCT, das in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 63-49723 (EP 0281418 A2) beschrieben ist, wobei ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung in der genannten Anmeldung beschrieben wird.
Zunächst wurden 280 mg des Peptids hCT-Gly-Lys-Lys-Arg in 30 ml 0,1 n Essigsäure vollständig aufgelöst und die Lösung mit 30 ml TrisHCL (pH 8,0) und Wasser versetzt, um 230 ml Reaktionsgemisch (pH 7,8) herzustellen. Als nächstes wurde das Reaktionsgemischt mit 560 ug Carboxypeptidase B (Sigma) versetzt und eine Reaktions bei 37ºC für 30 Minuten durchgeführt. Um das Fortschreiten der Reaktion zu beobachten, wurden Teilmengen des Reaktionsgemisches entnommen und einer HPLC mittels einer YMC-gepackten Säule A-302 (0,46 cm x 15 cm; Murayama Kagaku Kenkyusho) unterworfen und durch einen linearen Gradienten, der durch 0,1%ige Trifluoressigsäure (TFA) und 50% CH&sub3;CN in 0,1% TFA gebildet wurde, eluiert, um als Ergebnis ein Zielpeptid hCT-Gly, ein Reaktic> nsintermediat hCT-Gly-Lys-Lys und hCT-Gly-Lys und das Ausgangsmaterial hCT-Gly-Lys-Lys-Arg auf zutrennen, wobei die Reaktion bei 37ºC in 30 Minuten beendet war (siehe Fig. 1). Durch Aufbringen des Reaktionsgemisches auf eine YMC-gepackte Säule D-ODS-5 (2 cm x 25 cm; Murayama Kagaku Kenkyusho) für HPLC und Elution mit 0,1% TFA-50% CH&sub3;CN wurde das hCT-Gly isoliert. Danach wurden Fraktionen, die das hCT-Gly enthielten, kombiniert und lyophilisiert, um 235 mg des hCT-Gly zu erhalten. Durch Hydrolyse des Produktes in 6 N Salzsäure für 24 Stunden und Analyse des Hydrolysats durch einen Aminosäureanalysator (Hitachi Seisaku Sho 835-20) wurde das Produkt bestätigt, um eine Aminosäurezusammensetzung zu erhalten, die mit einem theoretischen Wert übereinstimmt. Darüberhinaus wurde eine Aminosäuresequenz des Produktes teilweise mit einem Proteinsequenzgerät (Applied Biosystems; 470A Proteinsequenzgerät) bestimmt, wobei die erhaltene Sequenz mit derjenigen von hCT-Gly übereinstimmte. Die Ergebnisse der Aminosäureanalysen sind nachfolgend angegeben; die Zahlen in Klammern geben die theoretischen Werte an.
Asx 2,83 (3), Thr 4,51 (5), 5er 0,91 (1),
Glx 1,94 (2), Pro 2,04 (2), Gly 4,83 (5),
Ala 1,78 (2), Val 0,98 (1), Met 0,97 (1),
Ile 0,95 (1), Leu 2,00 (2), Tyr 0,95 (1),
Phe 2,89 (3), Lys 0,99 (1), His 0,97 (1)

Beispiel 2. Herstellung des C-Terminus-α-amidierenden Enzyms

(1) Konstruktion von Expressionsplasmiden pKDPXA457 und pKDPXA799 BglII tierischer Zellen

Die Plasmide pKDPXA457 und pKDPXA799 BglII enthalten eine cDNA-Codierung für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz von der 37. Aminosäure bis zur 363. Aminosäure, die in den Fig. 13-1 bis 13-3 gezeigt ist, sowie eine cDNA-Codierung für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz von der 39. Aminosäure bis zur 692. Aminosäure in Fig. 14-1 bis 14-3 bzw. eine zusätzliche C-Terminus Aminosäure Leu. Die cDNA befindet sich vom SV40 Promotor abwärts, wobei ihr ein Poly-A-Additionssignal folgt, das von einem Kaninchen-β- Globin-Gen abstammt. Aufgrund dieser Konstruktion wird die cDNA unter der Kontrolle des SV40 Promotors transkribiert, wobei die resultierende mRNA gespleißt wird und Poly-A zu der gespleißten mRNA zugefügt wird. Außerdem enthält das Expressionsplasmid ein dhfr (Dihydrofolatreduktase)-Gen unter der Kontrolle eines SV40 Frühpromotors, wobei das insertierte Gen in tierischen Zellen repliziert wird.
Zu beachten ist, daß das mit dem Plasmid pKDPXA457 transformierte E. coli. als E. coli SBM-300 bezeichnet wurde und an der Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRl), 1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan als FERM BP-2235 nach dem Budapester Abkommen am 11. Januar 1989 hinterlegt wurde und daß das mit dem Plasmid pKDPXA799 BglII transformierte E. coli. als E. coli SBM 301 bezeichnet und am FRI als FERM BP-2236 nach dem Budapester Abkommen am 11. Januar 1989 hinterlegt wurde.

(2) Die Transfektion von pKDPXA457 und pKDPXA799 BglII in CHO- Zellen

Das Plamid pKDPXA457 oder pKDPXA799 BglII wurde in CHO- Zellen, in denen kein dhfr (Dihydrofolatreduktase)-Gen vorhanden war, durch ein Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren transfektiert. Zu beachten ist, daß die CHO- Zellinie, die kein dhfr-Gen aufwies, als CHO dhfr&supmin; Zelle SBM 306 bezeichnet und am FRI als FERM BP-2241 nach dem Budapester Abkommen am 11. Januar 1989 hinterlegt wurde.
Zunächst wurden die CHO dhfr&supmin; Zellen in einem Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium (GIBCO, α&spplus; MEM), welchem Nukleinsäuren enthielt, die mit 10%igem fötalem Rinderserum (FBS) (Flow. Lab.), 50 U/ml Penicillin G und 50 ug/ml Streptomycin ergänzt waren, kultiviert. Anschließend wurden die kultivierten Zellen 12 Stunden vor der Transfektion in einen 80 cm² T-Kolben (T80; Nunc) bei einer Dichte von 1,6 x 10&sup6; Zellen/30 ml/T80 Kolben eingebracht, wobei das Medium 4 Stunden vor der Transfektion durch 30 ml frisches α&spplus; MEM, das mit 10% FBS und den Antibiotika ergänzt war, ersetzt wurde.
Andererseits wurden 10 ug des Plasmids pKDPXA457 oder pKDPXA799 BglII in 240 ul sterilisiertem Wasser aufgelöst und die Lösung mit dem gleichen Volumen Puffer A (0,5 M CaCl&sub2;, 0,1 M HEPES) versetzt und das Ganze gemischt. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur für 10 Minuten wurde das Gemisch mit 480 ul eines Puffers B (0,28 M NaCl, 0,05 HEPES, 0,75 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 0,75 mM Na&sub2;HPO&sub4;) versetzt und das Gemisch in einem Vortex-Mischer für mehrere Sekunden gerührt. Das Gemisch wurde anschließend für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um ein Calciumphosphatgel zu bilden, welches das Plasmid enthielt.
Als nächstes wurden 960 ul des Calciumphsophatgels, welches das Plasmid enthielt, zu den oben genannten CHO dhfr&supmin; Zellen (1,6 x 10&sup6; Zellen/30 ml/T80 Kolben) zugefügt und der Kolben für 4 Stunden stehengelassen. Anschließend wurden die Zellen einmal mit 10 ml α&spplus; MEM ohne FBS gewaschen und mit 5 ml/T80 Kolben eines Gemisches aus α&spplus; MEM/Glycerol (4:1), welches 10% FBS enthielt, versetzt. Nach exakt 1 Minute wurde das Medium durch Absaugen entfernt und 30 ml α&spplus; MEM, das 10% FBS enthielt, den Zellen zugefügt, die dann bei 37ºC in der Gegenwart von 5% CO&sub2; gehalten wurden. Nach Kultivierung für 4 Tage wurden die Zellen in einer 0,25% Trypsinslösung (Chiba Kessei) dispergiert und in einem nukleinsäurefreiem MEM Medium (a MEM), das mit 10% dialysiertem fötalem Rinderserum (FBSd, HAZELTON) ergänzt war, bei einer Dichte von 1,6 x 10&sup6; Zellen/30 ml/T80-Kolben geimpft. Die Zellen wurden für 10 Tage kultiviert, wobei die Zellen, die dieses Medium überlebt haben, als transfektierte Zellen aussortiert wurden. Die mit dem pKDPXA457 infektierten Zellen wurden als CHO/pKDPXA457-α bezeichnet und die mit dem pKDPXA799 BglII infektierten Zellen wurden als CHO/pKDPXA799 BglII-α bezeichnet, wobei sie für die folgenden Experimente verwendet wurden.

(3) Amplifikation des Gens

Um die Gene (pKDPXA457 und pKDPXA799 BglII) in den Zellen CHO/pKDPXA457-α bzw. CHO/pKDPXA799 BglII-α zu amplifizieren, wurden die Zellen nacheinander in einem Medium, das zunehmende Konzentration, i.e. 30 nM, 100 nM, 300 nM und 1.000 nM Methotrexat (MTX) (Sigma) enthielt, kultiviert, während eine MTX-resistente Zelle bei jedem Schritt aussortiert wurde. Als nächstes wurden die Zellen, die Resistenz auf 1.000 nM MTX erlangt haben, die als CHO/pKDPXA4578-1 bzw. CHO/pKDPXA799 BglII-1 bezeichnet wurden, in ein frisches Medium bei einer Dichte von 1,6 x 10&sup6; Zellen/30 ml/T80 Kolben geimpft und bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; für 4 Tage kultiviert. Anschließend wurde ein Teil der überstehenden Kulturflüssigkeit dazu bestimmt, die Aktivität des C-Terminus-α-amidierenden Enzyms zu bestimmen, wobei ein synthetisches Substrat [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-Gly verwendet wurde. Als Ergebnis zeigten die Kulturüberstände von CHO/pKDPXA4578-1 und CHO/pKDPXA799 BglII-1 eine Aktivität von 1 Einheit/ml bzw. 310 Einheiten/ml.

(4) Einrichtung von Klonen mit größerer Fähigkeit zur Herstellung eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms

Da das oben genannte Experiment zeigte, daß die mit dem pKDPXA799 BglII transfektierten Zellen eine höhere Enzymaktivität aufwiesen, als diejenige, die von denen mit pKDPXA457 transfektierten geschaffen wurde, wurden die MTX 100 nM-resistenten Zellen CHO/pKDPXA799 BglII zur Einrichtung eines Klons mit einer höheren Enzymproduktivität einem Grenzverdünnung-Klonierungsverfahren unterworfen. Das heißt, CHO/pKDPXA799 Bglil-Zellen wurden in Vertiefungen einer Platte in einer solche Weise verteilt, daß jede Vertiefung einen Durchschnitt an 3, 1,5, 0,75 oder 0,375 Zellen enthielt, wobei die Zellen in einer 100 ul/Vertiefung α&supmin; MEM für eine Woche kultiviert wurden. Nach der Kultivierung wurden 30 Vertiefungen, in denen eine Entwicklung einer einzigen Kolonie mikroskopisch beobachtet wurde, ausgewählt, wobei den Vertiefungen 100 ul α-MEM zugefügt wurde und eine weitere Kultivierung für eine Woche fortgesetzt wurde. Diese Überstände aus den 30 Vertiefungen wurden geprüft, um deren Enzymaktivität zu bestimmen, wobei festgestellt wurde, daß ein als CHO/10C bezeichnetes Klon die höchste Enzymaktivität bei 910 Einheiten/ml aufwies.
Als nächstes wurde der Klon CHO/10C nacheinander in Medien, welche zunehmende Konzentrationen, i.e. 0,1, 0,3, 1, 3, 10 und 30 [LM an MTX enthielten, kultiviert, wobei an jeder Stufe MTX-resistente Klone erhalten wurden, um Zellklone mit einer höheren Resistenz gegen MTX herzustellen. Die so erhaltenen MTX-resistenten Zellen wurden für 4 Tage bei einer Dichte von 1,6 x 10&sup6; Zellen/30 ml/T80-Kolben kultiviert, die Überstände zur Bestimmung deren Enzymaktivität untersucht, und es wurde festgestellt, daß MTX 3 uM- resistente Zellen die höchste Enzymaktivität bei 2.860 Einheiten/ml aufwiesen. Um einen Klon mit einer höheren Enzymproduktivität einzurichten, wurden die MTX 3 uM- resistenten 9C-Zellen weiterhin einem Klonierungsverfahren, wie oben beschrieben, unterzogen, wobei als Ergebnis ein Klon gegründet wurde, der eine um mehr als 2.000 Einheiten/ml C-Terminus-α-amidierende Enzymaktivität aufwies und als CHO/10C bezeichnet wurde.

(5) Kultivierung von Zellklon CHO/10C-Zellen

Der Zellklon CHO/10C, der in Beispiel 2(4) gegründet wurde, wurde kultiviert, um ein C-Terminus-α-amidierendes Enzymderivat herzustellen. 1 x 10&sup6; CHO/10C-Zellen und 500 ml α&supmin; MEM wurden in eine 1.850 cm² Zylinderflasche (Falcon) eingebracht und die Kultivierung bei 37ºC für eine Woche vorgenommen. Als nächstes wurden die Zellen nacheinander in einem α&supmin; MEM, welches 10% FBS enthielt, α&supmin; MEM, welches 3% FBS enthielt und in α&supmin; MEM, welches 1% FBS enthielt, bei 37ºC für 24 Stunden kultiviert. Ein Überstand wurde aus der Kultur, die 1% FBS enthilet, aufgearbeitet und für das folgende Experiment verwendet. Zu beachten ist, daß dieser Überstand eine Enzymaktivität von etwa 4.000 Einheiten/ml Enzymaktivität aufwies, wobei das Enzym als XA799 BglII bezeichnet wurde.

(6) Reinigung des Enzyms XA799 BglII

1 l des in Beispiel 3(5) hergestellten Überstands wurde mit Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 45% versetzt und das entstandene Präzipitat durch Zentrifugieren gesammelt und in 20 ml 50 mM TrisHCl-Puffer (pH 7,0) wieder aufgelöst. Als nächstes wurde die so erhaltene Enzymfraktion geprüft, um deren Enzymaktivität zu bestimmen, wobei ein synthetisches Substrat verwendet wurde, und es wurde festgestellt, daß die meiste Enzymaktivität in der präzipitierten Fraktion wiedergefunden wurde. Darüber hinaus zeigte eine SDS-PAGE-Analyse jeder Fraktion, daß das meiste an Proteinen (hauptsächlich BSA), das vom Medium abstammt, aus der ausgewählten Fraktion eliminiert war, wie aus Fig. 3 zu ersehen ist.
Das so erhaltene XA799 BglII wurde in den folgenden Experimenten dazu verwendet, die Bedingung zu untersuchen, die für eine in-vitro-Amidierung erforderlich ist.

Beispiel 3. Studium der Bedingung für eine in vitro Amidierung

Zum Studium der Bedingung, die für eine in vitro Amidierung erforderlich ist, wurden das in Beispiel 1 erhaltene hCT- Gly und das in Beispiel 32(6) gereinigte XA799 BglII verwendet. Bei der Reaktion wurden 1 ml des Reaktionsgemisches bei 37ºC inkubiert, wobei 50 ul Probe bei 0,5, 1, 2 und 4 Stunden Reaktion erhalten wurden. Anschließend wurden die Proben mit 950 ul 5 N Essigsäure versetzt und 20 111 des Gemisches einer C8-HPLC unter Verwendung einer Säule YMC A-302 (4,5 x 150 mm) unterworfen und mit einem Gradienten von 24 bis 45 Acetonitril in 10%igem Ammoniumacetat für 18 Minuten eluiert, um das entstandene hCT und das verbleibende hCT-Gly zu bestimmen. Zu beachten ist, daß als Reaktionsbedingungen (1) Ascorbinsäurekonzentration, (2) Katalasekonzentration, (3) Kupferkationen (Cu²&spplus;) Konzentration, (4) pH des Puffers und (5) eine Pufferkonzentration und die hCT-Gly-Konzentration untersucht wurden, wobei die entsprechenden Bedingungen, die zur Umwandlung eines synthetischen Substrats [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-Gly zu [¹²&sup5;I]-Ac-Tyr-Phe-HN&sub2; erhalten wurden, in Betracht gezogen wurden (siehe Japanische Patentanmeldung Nr. 62-306867; EP 0 299 790 A2).

(1) Ascorbinsäurekonzentration (Fig. 4)

Der Effekt der Ascorbinsäurekonzentration auf die Amidierungsreaktion wurde bei 0, 1,0, 3,5, 7 und 20 mM Ascorbinsäure geprüft. Die restlichen Komponenten waren wie folgt:
2,5 mg/ml hCT-Gly
100 mM TrisHCl (pH 7,0)
25 ug/ml Katalyse
70 uM CuSO&sub4;
1.860 U/ml XA799 BglII
Das Umwandlungsverhältnis [100 x hCT/(hCT + hCT-Gly)] bei einer Stunde Reaktion ist in Fig. 4 gezeigt. In Abwesenheit von Ascorbinsäure schreitet die Reaktion nicht fort, aber sie erfolgt in zufriedenstellender Weise bei 1 bis 7 mM Ascorbinsäure. Bei 20 mM Ascorbinsäure nahm jedoch das umwandlungsverhältnis ab.

(2) Katalasekonzentration (Fig. 5)

Der Effekt der Katalasekonzentration auf die Amidierungsreaktion wurde bei 0,2, 1, 2, 25 sowie 125 ug/ml Katalase geprüft. Die restlichen Komponenten waren wie folgt:
2,5 mg/ml hCT-Gly
100 mM TrisHCl (pH 7,0)
3,5 mM Ascorbinsäure
70 uM CuSO&sub4;
1.500 U/ml XA799 BglII
Das Umwandlungsverhältnis bei einer Stunde Reaktion betrug 60 bis 75%, wobei es sich mit der Katalasekonzentration nicht unterschied (Fig. 5), aber bei 1 ug/ml oder mehr Katalasekonzentration erreichte das Umwandlungsverhältnis 100% in 2 Stunden, wobei es bei 0,2 ug/ml Katalase nur 93% in 4 Stunden erreichte.

(3) CuSo&sup4; (Cu²&spplus; Kation) Konzentration (Fig. 6)

Der Effekt der CuSO&sub4;-Konzentration auf die Amidierungsreaktion wurde bei 0, 1, 10, 70 und 150 uM CuSO&sub4; geprüft. Die restlichen Komponenten waren wie folgt:
2,5 mg/ml hCT-Gly
100 mM TrisHCl (pH 7,0)
25 ug/ml Katalase
3,5 mM Ascorbinsäure
1.500 U/ml XA799 BglII
Das Umwandlungsverhältnis [100 x hCT/(hCT + hCT-Gly)] bei einer Stunde Reaktion ist in Fig. 6 gezeigt. Die Amidierungsreaktion nahm mit der Zunahme der CuSO&sub4;-Konzentration von 1 auf 10 uM zu, aber eine weitere Zunahme der CuSO&sub4;- Konzentration führte zu keiner Verbesserung des Amidierungsverhältnisses.

(4) Puffer (pH) (Fig. 7)

Die Amidierungsreaktion wurde für 100 mM TrisHCl (pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5), 100 mM MOPS (pH 6,5, 7,0, 7,5 und 8,0) und 100 mM Ammoniumacetat (pH 6,0, 6,5 und 7,0) geprüft. Die restlichen Komponenten des Reaktionsgemisches waren wie folgt:
2,5 mg/ml hCT-Gly
20 ug/ml Katalase
2,0 mM Ascorbinsäure
10 uM CuSO&sub4;
1.000 U/ml XA799 BglII
Das Umwandlungsverhältnis [100 x hCT/(hCT + hCT-Gly)] bei einer Stunde Reaktion ist in Fig. 7 gezeigt. Der optimale pH betrug 6 bis 7, wobei in Ammoniumacetat die Reaktionsrate höher als die in MOPS war.

(5) Puffer (Konzentration) (Fig. 8)

Der Effekt von Ammoniumacetat auf die Amidierungsreaktion wurde bei 10, 50 und 100 mM Ammoniumacetat geprüft. Die restlichen Komponenten im Reaktionsgemisch waren wie folgt:
2,5 mg/ml hCT-Gly
20 ug/ml Katalase
10 uM CuSO&sub4;
2,0 mM Ascorbinsäure
1.000 U/ml XA799 BglII
Das Umwandlungsverhältnis [100 x hCT/(hCT + hCT-Gly)] bei einer Stunde Reaktion ist in Fig. 8 gezeigt. Das Umwandlungsverhältnis betrug etwa 80% und wies in Übereinstimmung mit der Ammoniumacetatkonzentration keine Unterschiede auf, wobei aber bei einer niedrigeren Ammoniumacetatkonzentration die Umwandlungsrate etwas höher war.

(6) Substrat (hCT-Gly)-Konzentration

Der Effekt der hCT-Gly-Konzentration auf die Amidierungsreaktion wurde bei 2,5 und 5 mg/ml hCT-Gly geprüft. Die restlichen Komponenten im Reaktionsgemisch waren wie folgt:
10 mM Ammoniumacetat (pH 6,0)
20 ug/ml Katalase
10 uM CuSO&sub4;
2,0 mM Ascorbinsäure
1.000 U/ml XA799 BglII
Die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und dem Umwandlungsverhältnis [100 x hCT/(hCT + hCT-Gly)] für jede hCT- Gly-Konzentration ist in Fig. 9 gezeigt. Bei 2,5 mg/ml Substrat wurde die Amidierung in 2 Stunden beendet, wobei bei 5,0 mg/ml Substrat die Amidierung in 4 Stunden vollständig war. Da die XA799 BglII die gleiche war, ist die Menge an XA799 BglII pro hCT-Gly bei 5 mg/ml hCT-Gly die Hälfte derjeniger eines 2,5 mg/ml hCT-Gly.

Beispiel 4. Herstellung von hCT (Fig. 10)

Eine Amidierungsreaktion wurde durchgeführt, um hCT herzustellen, und zwar unter folgender Bedingung:
2,5 mg/ml hCT-Gly
10 mM Ammoniumacetat (pH 6,0)
20 ug/ml Katalase
10 uM CuSO&sub4;
2,0 mM Ascorbinsäure
1.000 U/ml XA799 BglII
Vor Beginn der Reaktion, 0,5 Stunden nach Beginn der Reaktion und 2 Stunden nach Beginn der Reaktion wurden Proben entnommen und einer C18-HPLC unterworfen. Die tionsdiagraninie sind in Fig. 10 gezeigt. Mit dem Verstreichen der Zeit nahm ein Peak, der das Substrat hCT-Gly (Retentionszeit 11,8 Minuten) darstellt, ab, wobei ein Peak, der das Produkt hCT (Retentionszeit 12,9 Minuten) darstellt, zunahm. Nach einer Reaktion von 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch einer C18-HPLC unterzogen und das hCT isoliert und gereinigt. Das hCT wurde in einer Ausbeute von 93,5% erhalten, was durch eine Aminosäureanalyse des hCT bestimmt wurde.

Beispiel 5. Bestätigung des hCT

Menschliches Calcitonin (hCT), hergestellt in Beispiel 4, wurde wie folgt bestätigt.
1) Die Retentionszeit im HPLC unter der in Beispiel 3 beschriebenen Bedingung für das in Beispiel 4 hergestellte hCT war exakt die gleiche wie diejenige von synthetischem menschlichem Calcitonin, das vom Peptide Institute, Osaka, Japan, erhalten wurde.
2) Die Aminosäurezusammensetzung des in Beispiel 4 hergestellten hCT, erhalten durch eine Aminosäureanalyse, bestätigte die theoretischen Werte, die in Klammern gezeigt sind.
Asx 2,99 (3), Thr 4,72 (5), Ser 0,91 (1),
Glx 2,00 (2), Pro 1,97 (2), Gly 3,96 (4),
Ala 1,97 (2), Val 1,00 (1), Met 0,98 (1),
Ile 0,97 (1), Leu 2,00 (2), Tyr 1,02 (1),
Phe 2,95 (3), Lys 1,00 (1), His 0,97 (1).
3) Die gesamte Aminosäuresequenz, außer für den C-Terminus Pro-NH&sub2;, des Produkts in Beispiel 4 wurde als die gleiche wie das von menschlichem Calcitonin bestätigt.
4> Zur Bestätigung der C-Terminus Pro-NH&sub2; Struktur des in Beispiel 4 hergestellten hCT wurde dieses mit Lysyl-Endoprotease (Wako Junyaku Kogyo, Japan) behandelt, um ein C- terminales Fragment hCT[19-32] zu erhalten. Zu beachten ist, daß die Lysyl-Endoprotease das hCT zwischen der 18. Aminosäure und der 19. Aminosäure spaltet, da hCT in der 18-Position einen Lysinrest aufweist. Das Molekulargewicht des Fragments hCT[19-32] wurde durch Fast Bombardement (FAB)-Massenspektrometrie bestimmt, wobei als Ergebnis festgestellt wurde, daß das Mulekulargewicht das gleiche des theoretischen Molekulargewichts betrug, wodurch die Anwesenheit des C-Terminus Pro-NH&sub2; gezeigt wurde.
Aus den obigen Ergebnissen wurde bestätigt, daß das in Beispiel 4 erhaltene Produkt menschliches Calcitonin war.

Beispiel 6. Effekt C-Terminus-Aminosäuren auf die Herstellung von kondensiertem Protein βga197 SHPCT

Um den Effekt von C-Terminus-Aminosäuren auf die Herstellung eines kondensierten Proteins βga197HPCT zu untersuchen, wurde die Produktivität folgender kondensierter Proteine bestimmt, worin das in Beispiel 1 verwendete βgal197S(LE) [GKKR] an dessen C-Terminus modifiziert wurde:
βga197S (LE) HPCT [GRRR]
βga197S (LE) HPCT [GR]
βga197S (LE) HPCT [G].
Zu beachten ist, daß das [LE] in der obigen Formel bedeutet, daß βgal197S und HPCT über Leu-Glu gebunden sind und daß [GRRR], [GR] und [G] bedeutet, daß die kondensierten Proteine zusätzliche Aminosäuren Gly-Arg-Arg-Arg, Gly-Arg bzw. Gly haben.
Plasmide, die Gen-Codierungen für die jeweiligen oben genannten Proteine enthielten, wurden konstruiert, und dazu verwendet, E. coli. zu transformieren und die Transformate wurde geprüft, um deren Produktivität des kondensierten Proteins zu bestimmen.

(1) Konstruktion von Plasmiden mit Gen-Codierung für chimäre Proteine (Fig. 11)

Ein Plasmid pG97SHPCT (Japanische patentanmeldung Nr. 63- 49723; EP 2 081 418, Beispiel 8, Fig. 19) wurde teilweise mit Sall aufgeschlossen und ein 3,9 kb DNA Fragment durch Agarosegelelektrophorese erhalten. Als nächstes wurde dieses DNA Fragment vollständig mit SmaI aufgeschlossen und durch eine Agarosegelelektrophorese ein 3,8 kb DNA Fragment (1) erhalten. Das DNA Fragment (1) wurde mit 3 Paaren synthetischer Linker mit jeweils SmaI und SalI Enden ligiert:
um Plasmide pG97SHPCT(LE) [GRRR], pG97HPCT(LE) [GR] bzw. pG97SHPCT(LE) [G] zu erhalten. Diese Plasmide wurden verwendet, um E. coli W3110 zu transformieren, um die Transformanten W3110/pG97SHPCT (LE) [GRRR], W3110/pG97SHPCT(LE) [GR] und W3110/pG97SHPCT(LE) [G] zu erhalten.

(2) Produktivitätstest (Fig. 12)

Die so hergestellten Transformate W3110/pG97SHPCT(LE) [GRRR], W3110/pG97SHPCT(LE) [GR] und W3110/pG97SHPCT(LE) [G] und eine Kontrolle W3110/pG97SHPCT wurden separat in einem Medium (2,4% Trypton, 1,2% Hefeextrakt und 0,5% Glycerol), ergänzt mit Tetracyclin, für 16 Stunden kultiviert und jede Kultur einer SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Wie in Fig. 12 gezeigt, ist die Produktivität des kondensierten Proteins bei kondensierten Proteinen mit (einer) C-Terminus basischen Aminosäure(n) deutlich höher als für kondensierte Proteine ohne C-Terminus basische(r) Aminosäure(n).
Referenz nach Regel 13-2 nach dem Budapester Abkommen bezüglich hinterlegter Mikroorganismen:
Hinterlegungsinstitut: Fementation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology;
Adresse: 1-3, Tsukuba-shi 1-chome, Ibaraki-ken, 301 Japan;
Identifizierung der hinterlegten Mikroorganismen, Hinterlegungsnummern und Hinterlegungsdatum:
1. E. coli SBM 300 FERM BP-2235 11. Januar 1989.
2. E. coli SBM 301 FERM BP-2236 11. Januar 1989.
3. CHO dhfr(-) Zelle SBM 306 FERM BP-2241 11. Januar 1989.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins dargestellt durch die Formel (II):

R-X-Gly (II)

worin X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt und R einen restlichen Teil des Peptids oder Proteins darstellt, das die Schritte umfaßt:

Hydrolyse eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (I):

R-X-Gly-B

worin X einen beliebigen Aminosäurerest, Gly einen Glycinrest, B einen Lysin- oder Argininrest oder ein Oligopeptid, das im wesentlichen aus Lysin- oder Argininresten besteht oder eine Kombination von Lysin- und Argininresten darstellt, mit Carboxypeptidase B.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peptid oder Protein, dargestellt durch die Formel (II), eine Vorstufe von menschlichem Calcitonin ist.

3. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Calcitonin, dargestellt durch die Formel

R-NH&sub2;

worin die NH&sub2;-Gruppe von der α-amidierten C-Terminus Aminosäure des Calcitoninmoleküls abstammt, das das Behandeln eines Peptids oder Proteins der Formel

R-Gly

worin Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt, mit einem C-Terminus-α-amidierenden Enzym vom menschlichen Schilddrüsenursprung oder einem Derivat davon umfaßt.

4. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (III):

R-X-NH&sub2; (III)

worin X-NH&sub2; eine C-Terminus-α-amidierte Aminosäure darstellt und R einen restlichen Teil des Peptids oder Proteins darstellt, das die Schritte umfaßt:

(1) Hydrolyse eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (I):

R-X-Gly-B (I)

worin X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, Gly einen Glycinrest darstellt, B einen Lysin- oder Argininrest, ein Oligopeptid, das im wesentlichen aus Lysin- oder Argininresten besteht oder eine Kombination aus Lysin- und Argininresten darstellt und R einen restlichen Teil des Peptids oder Proteins darstellt, mit Carboxypeptidase B, um ein Intermediatpeptid oder -protein zu erzeugen, dargestellt durch die Formel (II):

R-X-Gly (II)

worin X einen beliebigen Aminosäurerest, der α- amidiert werden soll, darstellt, Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt und R einen restlichen Teil des Peptids oder Proteins darstellt; und

(2) Behandeln des intermediatpeptids oder-proteins, dargestellt durch die Formel (II), mit einem C- Terminus-α-amidierenden Enzym oder einem Derivat davon.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das durch die Formel (III) dargestellte Peptid oder Protein menschliches Calcitonin ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin das C-Terminus-α- amidierende Enzym vom Xenopus laevis- oder von menschlichem Schilddrüsen-Ursprung ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines C-Terminus-α-amidierenden Enzyms oder eines Derivats davon, das die Schritte umfaßt:

Kultivierung tierischer Zellen, die mit einem Plasmid transfektiert sind, das eine DNA-Codierung für das Enzym oder einem Derivat davon enthält und dieses exprimieren kann; sowie

Aufarbeitung des Enzyms oder eines Derivats davon.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das C-Terminus-α- amidierende Enzym XA457 mit einer Aminosäuresequenz ist, die mit der 37. Aminosäure beginnt und mit der 363. Aminosäure endet, dargestellt in Fig. 13-1 bis 13-3.

9. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Derivat des C- Terminus-α-amidierenden Enzyms XA799 BglII mit einer Aminosäuresequenz ist, die mit der 39. Aminosäure beginnt und mit der 692. Aminosäure endet, dargestellt in den Fig. 14-1 bis 14-3, sowie einem C-Terminus Leucin.

10. Verfahren nach Anspruch 7, worin die transfektierten tierischen Zellen CHO dhfr(-) Zellen sind, die mit einem Plasmid transfektiert sind, der einen SV40 Promotor, eine DNA-Codierung für eine Aminosäuresequenz, die mit der 39. Aminosäure beginnt und mit der 692. Aminosäure endet, dargestellt in den Fig. 14- 1 bis 14-3 und einen C-Terminus Leucin umfaßt, wobei die DNA mit dem SV40 Promotor operabel verbunden ist, und darüberhinaus ein dhfr-Gen umfaßt, und die transfektierten tierischen Zellen durch eine sequentielle Kultivierung in Medien, die Methatorexat in bis zu 3 uM steigender Konzentration enthalten, einer Genamplifikation unterzogen werden, um das Enzymderivat in einer Menge von 2.000 Einheiten/ml Überstand herzustellen.

11. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (II):

R-X-Gly (II)

worin X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt und R einen restlichen Teil eines Peptids oder Proteins darstellt, das die Schritte umfaßt:

(1) Erhalten eines kondensierten Proteins, dargestellt durch die Formel (0):

P-R-X-Gly-B (0)

worin P ein Partnerprotein des kondensierten Proteins darstellt, X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt; Gly einen Glycinrest dartellt, B einen C- Terminus Lysin- oder Argininrest oder ein im wesentlichen aus Lysin- oder Argininresten bestehendes Oligopeptid oder eine Kombination von Lysin- und Argininresten darstellt und R einen restlichen Teil des Proteins darstellt, durch Kultivierung eines Wirtes, der mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der einen DNA-Codierung für das kondensierte Protein enthält;

(2) Aufarbeitung des kondensierten Proteins;

(3) Spaltung des kondensierten Proteins durch ein konventionelles Verfahren, um ein Partnerprotein (P) und ein Peptid oder Protein zu bilden, dargestellt durch die Formel (I):

R-X-Gly-B

worin R, X, Gly und B die gleiche Bedeutung wie unter Fcrmel (0) definiert haben;

(4) Abtrennen des Peptids oder Proteins (I) vom Partnerprotein (P) auf der Basis der Differenz deren isoelektrischer Punkte; und

(5) Hydrolyse des Peptids oder Proteins (I) mit Carboxypeptidase B, um das gewünschte Peptid oder Protein (II) zu bilden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das durch die Formel (II) dargestellte Peptid oder Protein eine Vorstufe von menschlichem Calcitonin ist.

13. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins, dargestellt durch die Formel (III):

R-X-NH&sub2; (III)

worin X-NH&sub2; eine C-Terminus-o:-amidierte Aminosäure darstellt und R einen restlichen Teil des Peptids oder Proteins darstellt, das die Schritte umfaßt:

(1) Herstellen eines kondensierten Proteins, dargestellt durch die Formel (0):

P-R-X-Gly-B (0)

worin P ein Partnerprotein des kondensierten Proteins darstellt, X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt; Gly einen Glycinrest dartellt, B einen C- Terminus Lysin- oder Argininrest oder ein im wesentlichen aus Lysin- oder Argininresten bestehendes Oligopeptid oder eine Kombination von Lysin- und Argininresten darstellt und R einen restlichen Teil des Proteins darstellt, durch Kultivieren eines Wirtes, der mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der eine DNA-Codierung für das kondensierte Protein enthält;

(2) Aufarbeitung des kondensierten Proteins;

(3) Spalten des kondensierten Proteins durch ein konventionelles Verfahren, um ein Partnerprotein (P) und ein Peptid oder Protein zu bilden, dargestellt durch die Formel (I):

R-X-Gly-B (I)

worin R, X, Gly und B die gleichen Bedeutungen wie unter der Formel (0) definiert haben;

(5) Hydrolyse des Peptids oder Proteins (I) mit Carboxypeptidase B, um ein intermediatpeptid oder - protein zu bilden, dargestellt durch die Formel (II):

R-X-Gly (II)

worin X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, Gly einen C-Terminus Glycinrest darstellt und R einen restlichen Teil eines Peptids oder Proteins darstellt; und

(6) Behandeln des Peptids oder Proteins (II) mit einem C-Terminus-α-amidierenden Enzym oder einem Derivat davon.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das durch die Formel (III) dargestellte Peptid oder Protein menschliches Calcitonin ist.