DE3852706T2

DE3852706T2 - Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Peptids mit einem Cysteinrest.

Info

Publication number: DE3852706T2
Application number: DE3852706T
Authority: DE
Inventors: Koji Magota; Takehiro Oshima; Shoji Tanaka
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 1987-03-04
Filing date: 1988-03-04
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2008-03-05
Also published as: GR3015328T3; HU210625B; EP0281418B1; DE3852706D1; JPH0687788B2; AU607973B2; ES2065907T3; EP0281418A3; US4987070A; JPS6410999A; EP0281418A2; DK114788D0; AU1272488A; DK175535B1; HUT46071A; DK114788A; CA1340830C; ATE117023T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Peptids, das mindestens einen Cysteinrest enthält (hier nachstehend als "Zielpeptid" bezeichnet).
Es ist vielfach versucht worden, von Eukaryoten stammende physiologisch aktive Peptide oder Proteine in mikrobiellen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli- Zellen, unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren herzustellen.
Zur Produktion eines relativ kleinen Peptids, das in mikrobiellen Zellen, beispielsweise in E. coli, leicht abgebaut wird, wird üblicherweise ein Verfahren verwendet, in dein ein gewünschtes Peptid oder Protein als Fusionsprotein mit einem anderen Peptid oder Protein in mikrobiellen Zellen produziert wird, wonach das produzierte Fusionsprotein zur Freisetzung des gewünschten Peptids oder Proteins chemisch oder enzymatisch gespalten und das gewünschte Peptid und Protein isoliert und gereinigt wird.
Es sind verschiedene Verfahren zur Freisetzung eines gewünschten Peptids aus einem Fusionsprotein bekannt. Wenn ein gewünschtes Peptid keinen Methioninrest enthält, wird das gewünschte Peptid als Fusionsprotein produziert, in dem es mit einem Partnerprotein über einen Methioninrest verknüpft und durch Bromcyan-Spaltung am Methioninrest aus dem Partnerprotein freigesetzt wird (Science 198 (1977), 1059, und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1978), 106). Wenn ein gewünschtes Peptid keinen Arginin- oder Lysinrest enthält, wird das gewünschte Peptid als Fusionsprotein produziert, in dem es mit einem Partnerprotein über den Arginin- oder Lysinrest verknüpft und durch proteolytische Spaltung am Arginin- oder Lysinrest mit Trypsin, das eine Peptidbindung am C-Terminus des Arginin- oder Lysinrestes spezifisch spaltet, aus dem Partnerprotein freigesetzt wird (Nature 285 (1980), 456). Ferner kann gegebenenfalls die Protease I von Achromobacter (hier nachstehend als API abgekürzt und gelegentlich als Lysylendopeptidase bezeichnet), die eine Peptidbindung am C-Terminus eines Lysinrestes spezifisch spaltet, verwendet werden.
Häufig wird ein Partnerprotein, das in Kombination mit einem gewünschten Peptid ein Fusionsprotein bildet, aus Proteinen, die von einem Wirtsorganismus natürlich produziert werden, ausgewählt. Das verwendete Partnerprotein ist üblicherweise ein Polypeptidfragment, das eine geeignete Größe aufweist und vom N-Terminus eines in großen Mengen durch den Wirt produzierten Proteins stammt. Dabei geht man davon aus, daß die Größe des Partnerproteins die Produktivität des gewünschten Peptids beeinflußt. Obwohl angenommen wird, daß unter Verwendung eines kleineren Partnerproteins eine größere Menge eines gewünschten Peptids erhalten wird (aufgrund eines hohen Anteils des gewünschten Peptids im Fusionsprotein), wird dies jedoch nicht immer beobachtet. Bei der Produktion von Insulin unter Verwendung der E. coli-β-Galactosidase als Partner in einem Fusionsprotein wird beispielsweise durch eine in einem bestimmten Umfang durchgeführte Verkleinerung der β-Galactosidaseregion eine erhöhte Produktion des Zielinsulins erhalten, durch eine weitere Verkleinerung der β-Galactosidase die Produktion von Insulin jedoch reduziert (Gene 29 (1984), 251). Dementsprechend gibt es keine Gesetzmäßigkeit, aus der die Größe eines Partnerproteins, bei der ein Maximum eines gewünschten Peptids produziert werden kann, zur Produktion eines bestimmten Peptids als Fusionsprotein abgeleitet werden kann.
Der wesentlichste Schritt für eine effiziente Produktion eines bestimmten Zielpeptids ist daher zunächst die Wahl des geeignetsten Partnerproteins für das Zielpeptid, um ein Fusionsprotein des Zielpeptids und des Partnerproteins effizient exprimieren und das Zielpeptid aus dem Fusionsprotein effizient gewinnen zu können. Da keine allgemeinen Kriterien für eine derartige Auswahl entwickelt worden sind, müssen die optimalen Bedingungen für bin bestimmtes Zielpeptid experimentell ermittelt werden.
Als Beispiele für ein Cysteinreste enthaltendes Zielpeptid werden außerdem ein menschliches atriales natriuretisches Polypeptid vom α-Typ (hier nachstehend als α- hANP bezeichnet) und ein menschlicher Calcitonin-Vorläufer (hier nachstehend als HPTC bezeichnet) beschrieben und Probleme bei der Herstellung dieser Peptide durch DNA-Rekombinationsverfahren beschrieben.
α-hANP ist ein aus 28 Aminosäureresten bestehendes Peptid, das zwei an den Positionen 7 und 23 liegende Cysteinreste, die eine intramolekulare Disulfidbindung bilden, enthält und die nachstehend beschriebene Formel (I)
aufweist, in der (1) und (2) direkt verbunden sind.
Das α-hANP wurde aus menschlichen Herzvorhöfen durch Matsua und Kangawa extrahiert und gereinigt (Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 147 193). Das α-hANP zeigt eine beträchtliche natriuretische und blutdrucksenkende Aktivität (Biochem. Biophys. Pes. Commun. 118 (1984), 131-139).
Andererseits ist HPCT ein aus 36 Aminosäureresten bestehendes Peptid, das an den Positionen 1 und 7 liegende zwei Cysteinreste, die eine intramolekulare Disulfidbindung enthält und die nachstehend beschriebene Formel (II)
aufweist, in der (1) direkt mit (2) und (3) direkt mit (4) verbunden ist.
HPCT ist ein Intermediat des menschlichen Calcitonins, das einer Sequenz von der 1. bis zur 32. Aminosäure in der Formel (II) entspricht (Nature 295 (1982), 345-347).
Obwohl diese Peptide heute chemisch synthetisiert werden können, ist das chemische Syntheseverfahren für eine große Menge dieser Peptide arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Da diese Peptide besonders zur Verwendung als Arzneimittel bestimmt sind, besteht daher ein großer Bedarf nach einem einfachen und kostengünstigen Verfahren für eine Produktion dieser Peptide in großem Maßstab.
Zur Lösung der vorstehend beschriebenen Probleme ist versucht worden, derartige Peptide unter Verwendung eines DNA-Pekombinationsverfahrens zu produzieren. Zur α-hANP- Produktion wird α-hANP beispielsweise als Fusionsprotein, das das α-hANP und Trp-E-Protein von E. coli umfaßt, exprimiert und ein Pohextrakt, der das Fusionsprotein enthält und aus dem aufgebrochenen Material der Zellen hergestellt wird, zur Freisetzung von α-hANP aus dem Fusionsprotein mit der Lysylendopeptidase oder einem Coagulationsfaktor Xa behandelt (Seikagaku 57(8) (1984), 854). Dies ist jedoch ein kompliziertes Herstellungsverfahren und das Verhältnis, in dem das Zielpeptid aus dem Fusionsprotein gewonnen wird, ist gering. Daher ist dieses Verfahren zur praktischen Verwendung nicht geeignet. Zur Lösung des Problems stellten die Erfinder ein Verfahren vor, in dem zur Produktion eines physiologisch aktiven Peptids ohne Lysinrest, beispielsweise α-hANP, das Zielpeptid als Fusionsprotein exprimiert wird, das das Zielpeptid und ein über einen Lysinrest gebundenes, 90 bis 220 Aminosäurereste enthaltendes Partnerpolypeptid ohne Lysinreste umfaßt, und das Fusionsprotein zur Freisetzung des Zielpeptids mit einer Lysylendopeptidase behandelt wird (japanische Patentanmeldung Nr. 61-101100). Durch dieses verbesserte Verfahren kann jedoch das Zielpeptid noch nicht ausreichend effizient gewonnen werden.
Andererseits beschrieben die Erfinder zur Produktion von HPCT ein Verfahren zur Herstellung eines HPCT-Derivats, in dem der achte Methioninrest der Formel (II) gegen einen Valinrest ausgetauscht ist (japanische Patentanmeldung Nr. 58-203953). In diesem Verfahren wird zuerst das Zielpeptid mit der alkalischen Phosphatase von E. coli als Fusionsprotein exprimiert und anschließend das Fusionsprotein mit Bromcyan behandelt, um das Zielpeptid zu erhalten. Wie für α-hANP beschrieben, kann jedoch auch durch dieses Verfahren das Zielpeptid nicht ausreichend effizient aus dem Fusionsprotein gewonnen werden. Im Gegensatz dazu ist es bekannt, daß bei einem durch ein DNA-Rekombinationsverfahren produzierten, keine Cysteinreste enthaltenden Peptid das Zielpeptid mit höherer Effizienz als bei einem Cysteinrest(e) enthaltenden Zielpeptid aus dem Fusionsprotein gewonnen werden kann. Ein wichtiger Faktor bei der effizienten Produktion eines Peptids mit (einem) Cysteinrest(en) ist daher die Steigerung der Gewinnungseffizienz des Zielpeptids aus dem Fusionsprotein. Eine Lösung dieses Problems wird gegenwärtig dringend gewünscht.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren bereit, das zur Produktion eines (einen) Cysteinrest(e) enthaltenden Peptids in großem Maßstab verwendet werden kann, und betrifft besonders die Wahl eines Partnerproteins und einer Linker-Aminosäure, die das Partnerprotein und das Zielpeptid im Fusionsprotein verknüpft.
Die Erfinder untersuchten detailliert die Ursachen der Nachteile des Stands der Technik und stellten fest, daß bei einem Fusionsprotein, das ein gewünschtes Peptid und ein Partnerprotein, die beide einen Cysteinrest enthielten, umfaßte, zwischen dem Cysteinrest im gewünschten Peptid und dem Cysteinrest im Partnerprotein eine Disulfidbindung gebildet wird, wodurch eine geringere Ausbeute des gewünschten Peptids erhalten wird. Es wurde ferner festgestellt, daß bei Verwendung eines keinen Cysteinrest enthaltenden Partnerproteins das Problem gelöst werden konnte.
Die Erfindung stellt daher insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven cysteinhaltigen Zielpeptids bereit, umfassend:
(1) Züchtung von Escherichia coli, der mit einem Plasmid transformiert ist, das unter der Kontrolle eines Promotors von E. coli oder von einem Phagen ein Fusionsprotein exprimieren kann, das die Formel
A - L - B
aufweist, wobei
B das Zielpeptid darstellt,
A ein cysteinfreies Partnerpolypeptid bedeutet, das 90 bis 220 Aminosäuren umfaßt, die einem N-terminalen Bereich von E. coli-β-Galactosidase entsprechen, wobei Nicht- Cystein-Aminosäurereste alle Cysteinstellen der nativen Sequenz ersetzen, und
L eine Aminosäureverknüpfung zwischen dem C-terminalen Ende des Partnerpolypeptids und dem N-terminalen Ende des Zielpeptids darstellt, die so ausgewählt ist, daß sie durch eine Protease spaltbar ist oder selektiv chemisch abbaubar ist, und nicht im Zielpeptid vorliegt,
(2) Aufbrechen der gezüchteten Zellen und Gewinnung einer unlöslichen Fraktion, die das Fusionsprotein enthält,
(3) Solubilisierung des Fusionsproteins mit einem Solubilisierungsmittel, Behandlung des solubilisierten Fusionsproteins mit der Protease oder einem geeigneten chemischen Stoff, um das Zielpeptid freizusetzen, und Isolierung des Zielpeptids.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pGHα210(Ser)rop&supmin; für ein Fusionsprotein dar, das α-hANP als Zielpeptid und βgal210(Ser) als Partnerprotein umfaßt. Das βgal210(Ser) ist ein Derivat eines βgal210-Proteins, in dem Cysteinreste durch Serinreste ersetzt sind.
Fig. 2 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pGHα97(Ser)rop&supmin; für ein Fusionsprotein dar, das α-hANP und βgal97(Ser) als Partnerprotein umfaßt. Das βgal97(Ser) ist ein Derivat eines βgal97-Proteins, in dem Cysteinreste von βgal97 durch Serinreste ersetzt sind.
Fig. 3 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pGHα97S für βgalα97(Ser)αhANP dar, wobei das Plasmid ein Derivat des Plasmids pGHα97(Ser)rop&supmin; ist, in das ein Tryptophanoperon-Attenuatorterminator (trp a) unmittelbar stromabwärts des α-hANP-Strukturgens im pGHα97(Ser)rop&supmin; inseriert und der 3'-nicht-codierende Bereich der α-hANP-cDNA entfernt ist.
Fig. 4 zeigt ein Ergebnis einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von Expressionsprodukten der Plasmide pGHα97(Ser)rop&supmin; (Bahn 2) und pGHα97S (Bahn 3), wobei dargestellt ist, wie sich die Entfernung des 3'-nichtcodierenden Bereichs des α-hANP-Gens und die Einführung von trp a unmittelbar stromabwärts des α-hANP-Gens auf die Produktion des Fusionsproteins auswirken.
Fig. 5 zeigt ein Ergebnis der SDS-PAGE der Expressionsprodukte von E. coli W3110/pGHα97S, wobei M den Molekulargewichtsstandard, T die Expressionsprodukte im aufgebrochenen Material von Zellkulturen, S Produkte in einem Überstand von aufgebrochenen Zellen und P Produkte in einem Niederschlag der aufgebrochenen Zellen darstellen.
Fig. 6 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pGHα97SE für βgal97(Ser)αhANP dar, in dem eine Verknüpfungsstelle zwischen βgal97(Ser) und α-hANP in Glu-Phe-Lys umgewandelt ist.
Fig. 7 zeigt ein Ergebnis einer SDS-PAGE von Expressionsprodukten der Plasmide pGHα97S und pGHα97SE, die mit API hydrolysiert wurden. Die SDS-PAGE zeigt einen Vergleich der unterschiedlich effizienten Hydrolyse von Fusionsproteinen, die durch die unterschiedliche Verknüpfungsstelle zwischen α-hANP und βgal97(Ser) bewirkt wird.
Fig. 8 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pPLlacZ'97(Ser)αhANP dar, das ein Fusionsprotein unter der Kontrolle eines PL-Promotors des λ- Phagen exprimiert.
Fig. 9 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pINlacZ'97(Ser)αhANP dar, das ein Fusionsprotein unter der Kontrolle eines lpp-Promotors von E. coli exprimiert.
Fig. 10 zeigt ein Elutionsprofil einer Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eines Zielpeptids α-hANP, das aus einem Fusionsprotein βgal97(Ser)αhANP gereinigt wurde.
Fig. 11 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pGHα1007 für ein Fusionsprotein βgalαhANP dar.
Fig. 12 stellt ein Verfahren zur Konstruktion der Expressionsplasmide pGHα650, pGHα439 und pGHα210 dar, die alle ein verkürztes Fusionsprotein βgalαhANP exprimieren.
Fig. 13 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids pGHα210rop&supmin; dar.
Fig. 14 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids pGHα210EcoRI dar und
Fig. 15 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids pLacZ'210αhANP dar, das ein Fusionsprotein unter der Kontrolle eines PL-Promotors eines λ-Phagen exprimiert.
Fig. 16 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids pGHαBal43 dar.
Fig. 17 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids pIN5GIF54 dar.
Fig. 18 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids pIN5T4 dar.
Fig. 19 stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids pG97SHPCT dar.
Fig. 20 stellt die Spaltung eines Fusionsproteins βGal97SHPCT mit der Protease V&sub8; dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von beliebigen physiologisch aktiven Peptiden, die mindestens einen Cysteinrest enthalten. Derartige Peptide schließen neben den hier genauer beschriebenen α-hANP und HPCT die A- und B-Kette von Insulin, nicht-menschliche Calcitonin-Vorläufer, Somatostatin und ähnliche ein.
Das Partnerprotein ist ein Protein, das keinen Cysteinrest enthält. Derartige Proteine schließen natürliche Proteine und einen Teil davon, der keinen Cysteinrest enthält, und modifizierte Proteine ein, wobei in den natürlichen Proteinen oder einem Teil davon Cysteinreste entfernt oder in andere Aminosäurereste umgewandelt werden. Das Partnerprotein kann neben dem vorstehend beschriebenen Protein einige, beispielsweise 1 bis 5, weitere Aminosäuren enthalten. Es werden erfindungsgemäß Polypeptide verwendet, die 90 bis 220 Aminosäurereste der E. coli-β-Galactosidase umfassen. Bestimmte Ausführungsformen des Partnerproteins schließen ein Polypeptid ein, das aus einem Polypeptid des E. coli-β-Galactosidaseproteins von der ersten Aminosäure am N-Terminus bis zur 210. Aminosäure, wobei von der N- terminalen Aminosäure gezählt wird, und zwei weiteren Aminosäuren, beispielsweise Glutaminsäure und Phenylalanin, besteht, ein Polypeptid, das aus einem Polypeptid der E. coli-β-Galactosidase von der ersten Aminosäure am N-Terminus bis zur 97. Aminosäure, wobei von der N-terminalen Aminosäure gezählt wird, und zwei weiteren Aminosäureresten, beispielsweise Glutamin und Phenylalanin, besteht, und ein Polypeptid, das aus einem Polypeptid der E. coli-β-Galactosidase von der ersten Aminosäure am N-Terminus bis zur 97. Aminosäure, wobei von der N-terminalen Aminosäure gezählt wird, und drei weiteren Aminosäureresten, beispielsweise Glutaminsäure, Phenylalanin und Leucin, besteht.
Diese zusätzlichen Aminosäuren werden beispielsweise während der rekombinanten DNA-Manipulation als eine von einer Linker-DNA codierten Aminosäure eingeführt.
Da die natürliche Form dieser Polypeptide jedoch Cysteinreste enthält, müssen die cysteinreste entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Dies ist durch eine ortsgerichtete Mutagenese einfach durchzuführen. Die Cysteinreste können durch jede Aminosäure ersetzt werden, Serin wird jedoch bevorzugt verwendet. Man beachte, daß Lysin nicht bevorzugt ist. Da die vorstehend beschriebenen Polypeptide aus natürlichem E. coli-β-Galactosidaseprotein keinen Lysinrest enthalten, erfolgt bei einer Spaltung des ein Zielpeptid und Partnerpolypeptid umfassenden Fusionsproteins mit der Lysylendopeptidase keine interne Spaltung des Partnerpolypeptids, und das Zielpeptid kann daher einfach isoliert und gereinigt werden.
Erfindungsgemäß wird ein physiologisch aktives Peptid, d. h., ein Zielpeptid, als Fusionsprotein, in dem über eine Aminosäureverknüpfung der C-Terminus des Partnerpolypeptids mit dem N-Terminus des Zielpeptids verbunden ist, exprimiert. Die Linker-Aminosäure ist vorzugsweise Lysin, Arginin, Glutaminsäure oder Methionin. Wenn Lysin als Linker-Aminosäure verwendet wird, wird zur Freisetzung des Zielpeptids die Peptidbindung zwischen einem Zielpeptid und der Lysinverknüpfung beispielsweise mit der Lysylendopeptidase proteolytisch gespalten. Wenn Arginin als Linker- Aminosäure verwendet wird, wird zür Freisetzung des Zielpeptids die Peptidbindung zwischen einem Zielpeptid und der Argininverknüpfung beispielsweise mit Clostripain proteolytisch gespalten. Wenn Glutaminsäure als Linker-Aminosäure verwendet wird, wird zur Freisetzung des Zielpeptids die Peptidbindung zwischen einem Zielpeptid und der Glutaminsäureverknüpfung beispielsweise mit der Protease V&sub8; proteolytisch gespalten. Andererseits wird bei einer Verwendung von Methionin als Linker-Aminosäure zur Freisetzung des Zielpeptids aus dem Partnerprotein die Methioninverknüpfung mit Bromcyan abgebaut.
Ein Fusionsprotein wird durch ein Gen exprimiert, das eine ein Partnerprotein, beispielsweise ein β-gal-Fragment, codierende DNA umfaßt, die im Leserahmen mit einer DNA verknüpft ist, die über einen synthetischen doppelsträngigen Oligonucleotidlinker, der ein Codon für eine Linker-Aminosäure, beispielsweise Lysin oder Glutaminsäure, enthält, ein Zielpeptid codiert. Dabei enthält der Oligonucleotidlinker vorzugsweise eine DNA-Sequenz, die einen Teil des N-Terminus des Zielpeptids unmittelbar stromabwärts des Codons für die Linker-Aminosäure, beispielsweise Lysin oder Glutaminsäure, codiert, und weist an beiden Termini die geeigneten Restriktionsstellen auf.
Das die β-Galactosidase codierende Gen stammt beispielsweise vom Plasmid pαNE2, das ein β-Galactosidasegen unter einem lac-Promotor enthält. Ein α-hANP-Zielpeptid codierendes Gen stammt beispielsweise von einem Gen, das γ- hANP, ein Vorläufer von α-hANP, codiert, und im Plasmid pS224-3 enthalten ist (europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 164 273).
Das HPCT codierende Gen stammt beispielsweise vom Plasmid pAHPC38.
Der Promotor, der zur effizienten Expression eines Fusionsproteingens verwendet wird, kann jeder Promotor eines Gens für ein in großer Menge in E. coli oder Phagen produziertes Protein sein. Ein vom E. coli-Lactosegen stammender lac-Promotor, ein vom E. coli-Außenmembran-Lipoproteingen stammender lpp-Promotor und ein vom λ-Phagengen stammender PL-Promotor sind bevorzugt. Diese Promotoren können aus bekannten Plasmiden durch übliche DNA-Rekombinationsverfahren erhalten werden. Beispielsweise kann ein PL-Promotor vom Plasmid pPLlacZ'210αhANP (Fig. 8) und ein lpp-Promotor von einem Plasmid pIN5T4 (Fig. 9) erhalten werden. Diese Plasmide sind in den japanischen Patentanmeldungen mit den Nrn. 61-101100 und 61-132186 offenbart. Das Plasmid pPL- lacZ'210αhANP stammte vom Plasmid pS20. E. coli (N4830/pS20), der das Plasmid pS20 enthält, wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 31. Mai 1984 als FERM BP-535 bei der Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRI), Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, hinterlegt. Das plasmid pIN5T4 stammte vom Plasmid pINI-A2. E. coli (JA221/pINI-A2) enthält das Plasmid pINI-A2 und wurde am 18. Juli 1983 als FERM BP- 320 bei der FRI hinterlegt.
Ein Fusionsprotein kann mit hoher Effizienz durch ein Expressionsplasmid exprimiert werden, in den ein Tryptophanoperon-Attenuatorterminator (trp a) unmittelbar stromabwärts eines Strukturgens für das Fusionsprotein inseriert ist. Wie in den Beispielen und in Fig. 4 dargestellt ist, kann beispielsweise durch Einführung des trp a in das Plasmid pGHα97(Ser)rop&supmin; unmittelbar stromabwärts des α-hANP- Strukturgens das Plasmid pGHα97S hergestellt und die Produktivität für das gewünschte Fusionsproteins stark erhöht werden.
Ein ein physiologisch aktives Zielpeptid codierendes Gen kann chemisch synthetisiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann cDNA aus mRNA hergestellt werden, die von Zellen erhalten wird, die das Zielpeptid oder dessen Vorläufer codieren.
Ein α-hANP codierendes Gen kann von den Plasmiden pGHα210rop&supmin; und pGHα439rop&supmin;, die das α-hANP-Gen mit dem lac- Promotor enthalten, erhalten werden. Die Verfahren zur Konstruktion dieser Plasmide sind in den Bezugsbeispielen 1 bis 3 genau beschrieben.
Das Spaltungsverfahren zwischen einem Zielpeptidbereich und einem Partnerproteinbereich in einem Fusionsprotein hängt von der Art der beide Bereiche verbindenden Linker-Aminosäure ab. Wenn Lysin als Linker-Aminosäure verwendet wird, wird die den C-Terminus des Lysinrestes spaltende Lysylendopeptidase verwendet. Vorzugsweise wird die von Achromobacter lyticus stammende Achromobacter-Protease I (API) verwendet. Diese ist im Handel von Wako Junyaku, Japan, erhältlich.
Um ein Zielpeptid zu erhalten, wird E. coli, der mit einem Expressionsplasmid transformiert ist, das ein Gen enthält, das ein das Zielpeptid und ein geeignetes Partnerprotein umfassendes Fusionsprotein codiert, in einem geeigneten Medium gezüchtet und die Expression des Fusionsproteins induziert. Zellen von E. coli werden anschließend gewonnen und aufgebrochen. Die Zentrifugation des aufgebrochenen Materials liefert einen das Fusionsprotein enthaltenden Niederschlag. Dieses Verfahren weist den Vorteil auf, daß der größte Teil der verunreinigenden Proteine und Peptide im Überstand verbleibt. Der Niederschlag wird anschließend vorzugsweise mit 5 bis 10 M Harnstoff behandelt, um das Fusionsprotein zu solubilisieren. Die Verwendung von Harnstoff wird anderen Solubilisierungsmitteln, beispielsweise Natriumdodecylsulfat (SDS), vorgezogen, da das Enzym API durch Harnstoff nicht gehemmt wird. Nach der Solubilisierung des Fusionsproteins mit Harnstoff, beispielsweise 8 N Harnstoff, wird das behandelte Gemisch mit einem geeigneten Puffer verdünnt und API dem Gemisch zugesetzt, um das Fusionsprotein zur Freisetzung des Zielpeptids zu spalten. Das freigesetzte Zielpeptid wird isoliert und gemäß einem üblichen Reinigungsverfahren für ein Peptid oder Protein gereinigt.
Da das Partnerprotein im Fusionsprotein keinen Cysteinrest enthält, wird zwischen dem Partnerprotein und dem Zielprotein keine Disulfidbindung gebildet. Daher wird das Zielpeptid in sehr hoher Ausbeute vom Partnerprotein isoliert. Ferner bewirkt in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, in dem das Partnerprotein keinen Lysinrest enthält, eine Spaltung des Fusionsproteins mit der Lysylendopeptidase, beispielsweise API, keine gleichzeitige Spaltung innerhalb des Partnerproteins. Daher kann das Zielpeptid sehr leicht isoliert und gereinigt werden.
Da ferner die Größe des Partnerproteins bei 90 bis 220 Aminosäureresten gehalten wird, ist der Anteil des Zielproteins in einem Fusionsprotein hoch, während die Stabilität des Fusionsproteins und damit des Zielpeptids in Wirtszellen erhalten bleibt.
Da gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren das gewünschte Fusionsprotein zunächst in einer ungelösten Fraktion, d. h., als Niederschlag aus dem aufgebrochenen Zellmaterial gewonnen und das Fusionsprotein aus der ungelösten Fraktion extrahiert wird, werden ferner Proteinverunreinigungen wirksam entfernt. Wenn ein Enzym, beispielsweise API, zur Freisetzung des Zielpeptids verwendet wird, kann dieser Schritt außerdem ohne eine weitere Reinigung des Fusionsproteins durchgeführt werden. Durch diese Verfahren kann das Zielpeptid wirksam und einfach hergestellt werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend weiter erläutert, ohne daß jedoch der Schutzbereich der Erfindung auf die nachstehend beschriebenen Beispiele beschränkt ist.
Zunächst werden in den Referenzbeispielen 1 bis 5 Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pGHα210rop&supmin;, pGHα439rop&supmin; und pPLlacZ'210αhANP beschrieben, die DNA enthalten, die das Fusionsprotein codiert, das α-hANP als Zielpeptid und einen Teil des noch Cysteinreste enthaltenden nativen β-Galactosidaseproteins umfaßt.

Referenzbeispiel 1

Konstruktion des Expressionsplasmids pGHα1007 (Fig. 11)

A. Konstruktion von nBR322-SalI

5 ug des Plasmids pBR322 wurden mit 16 Einheiten EcoRI in 50 ul HindIII-Puffer, der 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl und 10 mM MgCl&sub2; umfaßte, 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und die gespaltene DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen. Anschließend wurden die EcoRI-Enden der DNA mit 2 ul 25 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP und dTPP) unter Verwendung von 4 Einheiten T4-DNA-Polymerase in 100 ul TA-Puffer, der 33 mM Tris-Acetat (pH 7,9), 66 mM CH&sub3;COONa, 10 mM (CH&sub3;COO)&sub2;Mg und 0,5 mM Dithiothreit umfaßt, in glatte Enden umgewandelt. Anschließend wurde die DNA durch Ethanolfällung gewonnen und in 20 ul eines Ligierungsgemisches, das 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit und 1 mM ATP umfaßte und mit 0,5 ug des nachstehend dargestellten SalI-Linkers
5'-GGGTCGACCC-3'
3'-CCCAGCTGGG-5'
versetzt war, 18 Stunden bei 15ºC mit 1 Einheit T4-DNA-Ligase inkubiert.
Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet, ein Clon mit einer Ampicillin- und Tetracyclinresistenz (Apr, Tcr) erhalten, ein Plasmid aus dem Clon isoliert und das Plasmid durch Restriktionsenzymspaltung analysiert, um die Umwandlung der EcoRI-Stelle in eine SalI-Stelle zu überprüfen. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pBR322-SalI.

B. Konstruktion von pGHα201

5 ug des Plasmids pBR322-SalI wurden mit 8 Einheiten SalI in 50 ul SalI-Puffer, der 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 150 mM NaCl und 6 mM MgCl&sub2; umfaßte, 60 Minuten bei 37ºC partiell und anschließend mit 24 Einheiten BamHI vollständig gespalten. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um das zweitgrößte DNA-Fragment (Fragment Nr. 1 in Fig. 11), das eine Promotorregion des Tetracyclinresistenzgens enthielt, zu erhalten.
Ferner wurden 5 ug des Plasmids pαNE2 mit 24 Einheiten BamHI und 24 Einheiten EcoRI in 100 ul SalI-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 2 in Fig. 11), das ein β-gal1007-Gen, das unter der Kontrolle des lac-Promotors exprimiert wurde und ein Ampicillinresistenzgen enthielt, zu erhalten. Das Plasmid pαNE2 ist in der japanischen, nichtgeprüften Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 58-63395 genauer beschrieben. E. coli WA 802/pαNE2 erhielt die Bezeichnung SBM 102 und wurde am 19. Juni 1981 als FERM P-6031 bei der FRI hinterlegt.
5 ug des Plasmids pS224-3, das das γ-hANP-Gen enthielt, wobei der 3'-terminale Teil einem α-hANP-Gen entspricht, das in der japanischen, nichtgeprüften Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 60-262592 und der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 164 273 beschrieben ist, wurden mit 24 Einheiten PvuII und 80 Einheiten SalI in 100 ul SalI-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend einer Agarose- Gelelektrophorese unterzogen, um das kleinste DNA-Fragment (Fragment Nr. 3 in Fig. 11) , das ein α-hANP-Gen ohne N- Terminus enthielt, zu erhalten.
Schließlich wurde ein DNA-Fragment mit der nachstehenden Struktur
EcoRI Lys -T αhANP (N-terminal) PvuII
5' AATTCAAGAGCCTGCGGAGATCCAG 3'
3' GTTCTCGGACGCCTCTAGGTC 5'
synthetisiert. Das DNA-Fragment enthält ein Codon für einen Lysinrest als Linker-Aminosäure und einen Teil des α-hANP- Gens, das den vorstehend beschriebenen, im Fragment Nr. 3 fehlenden Teil ergänzt, und weist eine EcoRI- bzw. PvuII- Stelle an den Enden auf. Das DNA-Fragment ist die Nr. 4 in Fig. 11.
Die vorstehend beschriebenen vier DNA-Fragmente wurden durch das gleiche, vorstehend beschriebene Verfahren ligiert, das Ligierungsgemisch zur Transformation von E. coli W3110 verwendet und Clone mit einer Ampicillin- und Tetracyclinresistenz erhalten. Aus den Clonen wurden Plasmide isoliert und durch Restriktionsenzymspaltung analysiert, um das gewünschtes Plasmid pGHα201 zu erhalten.

C. Konstruktion von pGHα1007

5 ug des Plasmids pGHα201 wurden mit 24 Einheiten DraI in 50 ul SalI-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment wurde durch Agarose- Gelelektrophorese gewonnen. Das DNA-Fragment wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren ligiert, das Ligierungsgemisch zur Transformation von E. coli W3110 verwendet und Ampicillin-empfindliche und Tetracyclin-resistente Clone erhalten. Die Plasmide der Clone wurden durch Restriktionsenzymspaltung analysiert, um das gewünschtes Plasmid pGHα1007 zu erhalten.
E. coli W3110/pGHα1007, der das Plasmid pGHα1007 enthält, erhielt die Bezeichnung SBM 284 und wurde am 3. April 1986 als FERM P-8728 bei der FRI hinterlegt und am 22. Februar 1988 zur Hinterlegung gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages in FERM BP-1748 umbenannt.

Referenzbeispiel 2

Konstruktion der Plasmide pGHα650. pGHα439 und pGHα210 (Abnehmende Größe des βgal-Gens) (Fig. 12)

5 ug des Plasmids pGHα1007 wurden mit 8 Einheiten EcoRI und 24 Einheiten SacI in 50 ul TA-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um das größte DNA-Fragment zu gewinnen. Die EcoRI- und SacI-Enden des DNA- Fragments wurden gemäß dem gleichen, vorstehend beschriebenen Verfahren in glatte Enden umgewandelt und das DNA-Fragment mit sich selbst ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet, um Tetracyclin-resistente Clone zu erhalten. Das plasmid wurde durch Restriktionsenzymspaltung gemäß einem üblichen Verfahren aus den Clonen isoliert, um das gewünschte Plasmid pGHα650 zu erhalten.
Plasmid pGHα439 wurde gemäß dem gleichen, vorstehend für die Konstruktion des Plasmids pGHα650 beschriebenen Verfahren konstruiert, ausgenommen, daß HindIII-Puffer anstelle des TA-Puffers und 24 Einheiten MluI anstelle von SacI verwendet wurden. Ferner wurde das Plasmid pGHα210 gemäß dem gleichen, vorstehend für die Konstruktion des Plasmids pGHα650 beschriebenen Verfahren konstruiert, ausgenommen, daß HindIII-Puffer anstelle des TA-Puffers und 24 Einheiten AatII anstelle von SacI verwendet wurden.
Plasmid pGHα650 enthält ein DNA-Fragment, das ein Fusionsprotein mit der Bezeichnung βgal650αhANP codiert, in dem der C-Terminus eines Polypeptids, der einem 650 Aminosäurereste umfassenden N-Terminus eines β-gal-Proteins entspricht, als Partnerprotein mit einem N-Terminus von α-hANP als Zielpeptid über die zwei zusätzlichen Aminosäurereste Glu-Phe und der Linker-Aminosäure Lysin verknüpft ist. Das Plasmid pGHα439 weist eine ähnliche Struktur wie pGHα650 auf, ausgenommen, daß pGHα439 ein DNA-Fragment enthält, das ein Fusionsprotein βgal439αhANP codiert, in dem das Partnerprotein dem N-Terminus eines β-gal-Proteins entspricht, das aus 439 Aminosäureresten besteht. Das Plasmid pGHα210 weist eine ähnliche Struktur wie pGHα650 auf, ausgenommen, daß pGHα210 ein DNA-Fragment enthält, das ein Fusionsprotein βgal210αhANP codiert, in dem das Partnerprotein dem aus 210 Aminosäureresten bestehenden N-Terminus eines β-gal-Proteins entspricht.

Referenzbeispiel 3

Konstruktion von nGHα210rop&supmin; (Fig. 13)

A. Konstruktion von nBR322ΔBalI

5 ug pBR322 wurden mit 10 Einheiten BalI in 50 ul BalI-Puffer, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 12 mM MgCl&sub2; umfaßte, 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und die gespaltene DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen. Anschließend wurde die gewonnene DNA in 50 ul SalI-Puffer gelöst, mit 24 Einheiten PvuII vollständig gespalten und das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um das größte DNA-Fragment mit glatten Enden zu gewinnen. Das DNA-Fragment wurde anschließend gemäß dem gleichen, vorstehend beschriebenen Verfahren mit sich selbst ligiert und das Reaktionsgemisch zur Transformation von E. coli W3110 verwendet. Von Tetracyclin- und Ampicillin-resistenten Clonen wurden Plasmide gewonnen und ein Plasmid, dem das 622 bp-PvuII-BalI-DNA-Fragment fehlte, mit der Bezeichnung pBR322ΔBalI erhalten.

B. Konstruktion von pGHα210rop&supmin;

5 ug pBR322ΔBalI wurden mit 24 Einheiten DraI und 24 Einheiten EcoRV in 50 ul SalI-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment, das einen Replikationsursprung enthielt, wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gewonnen. Andererseits wurden 5 ug Plasmid pGHα210, das im Referenzbeispiel 2 konstruiert wurde, mit 24 Einheiten EcoRV 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das zweitgrößte DNA-Fragment, das das Fusionsprotein βgal210αhANP codierende Gen enthielt, wurde durch eine Agarose-Gelelektrophorese gewonnen. Diese beiden DNA-Fragmente wurden gemäß dem gleichen, vorstehend beschriebenen Verfahren ligiert und das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet, um Tetracyclinresistente Clone zu erhalten. Von den Clonen erhaltene Plasmide wurden auf übliche Weise analysiert und ein gewünschter Clon E. coli W3110/pGHα210rop&supmin; erhalten. Diesem Plasmid pGHcL210rop&supmin; fehlte eine Funktion eines die Plasmidreplikation regulierenden Bereichs (mit der Bezeichnung "rop").
Gemäß dem gleichen, vorstehend beschriebenen Verfahren wurde das Plasmid pGHα439rop&supmin;, dem eine rop-Funktion fehlte, konstruiert, wobei jedoch mit dem Plasmid pGHα439 begonnen wurde.
Nach der Herstellung der Transformanten E. coli W3110/pGHα439rop&supmin;, die mit pGHα439rop&supmin; transformiert war, und E. coli W3110/pGHα210rop&supmin;, die mit pGHα210rop&supmin; transformiert war, wurden durch SDS-PAGE die produzierten Mengen der Fusionsproteine βgal439αANP und βgal210αhANP gemessen und mit den von den Plasmiden pGHα439 und pGHα210 erhaltenen verglichen. Es wurde so festgestellt, daß besonders bei pGHα210 eine fehlende rop-Funktion die Produktion des Fusionsproteins stark erhöhte. Es soll darauf hingewiesen werden, daß bei einer geringen Produktion des Fusionsproteins die Zugabe eines Induktors IPTG sehr wirksam und bei einer Erhöhung der Kopienzahl aufgrund der fehlenden rop-Funktion die Zugabe von IPTG weniger wirksam war.

Referenzbeispiel 4

Konstruktion von nPLlacZ'210αhANP

Das Plasmid pPLlacZ'210αhANP, in dem der lac-Promotor in pGHα210 durch einen PL-Promotor vom λ-Phagen ersetzt war, wurde konstruiert.

A. Konstruktion von pGHα210-EcoRI (Fig. 14)

Gemäß einem von Y. Morinaga in Biotechnology 2 (1984), 636, beschriebenen Verfahren wurde eine EcoRI-Stelle unmittelbar stromaufwärts des lacZ'-Gens in pGHα210 inseriert, um das Plasmid pGHα210-EcoRI zu konstruieren. Dabei wurden 5 ug pGHα210 mit 24 Einheiten HpaI in 50 ul TA-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 1 in Fig. 14), das ein α-hANP- Strukturgen und Tetracyclinresistenzgen (Tcr) enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen. Anschließend wurde das DNA-Fragment mit alkalischer Phosphatase in 50 ul 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) behandelt, um das Phosphat an den 5'-Enden zu entfernen. Anschließend wurden 5 ug pGHα210 mit 80 Einheiten SalI in 50 41 SalI-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 2 in Fig. 14), dem ein Teil des Tetracyclinresistenzgens fehlte, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen. Getrennt davon wurde ein einzelsträngiges Oligonucleotid (Fragment Nr. 3 und mit einer EcoRI-Stelle in Fig. 14), das die nachstehend beschriebene Sequenz

5' GGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCATGACCATGATTACGG 3'

und eine EcoRI-Stelle aufwies und an deren 5'-Ende phosphoryliert war, chemisch synthetisiert.
Jeweils 2 ug der wie vorstehend beschrieben hergestellten doppelsträngigen DNA-Fragmente und 1 ug des vorstehend beschriebenen, chemisch synthetisierten, einzelsträngigen DNA-Fragments wurden mit 36 ul P/L-Puffer, der 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 8 mM MgCl&sub2; und 1 mM β- Mercaptoethanol umfaßte, vermischt, und das Gemisch wurde auf 95ºC erhitzt, um das doppelsträngige DNA-Fragment zu denaturieren, so daß es in einzelsträngige DNA-Fragmente umgewandelt wird, und zur Durchführung des Annealing dieser Fragmente über einen Zeitraum von 60 Minuten allmählich auf 30ºC abgekühlt. Dem Reaktionsgemisch wurden 1 ul 25 mM dNTPs und 2 Einheiten Klenow-Fragment der DNA-Polymerase, sowie 2 ul 10 mM ATP und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt und zur Herstellung einer doppelsträngigen zirkulären DNA wurde inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet und Tetracyclin-resistente Clone wurden erhalten. Die Plasmide von den Clonen wurden in üblicher Weise analysiert, um ein gewünschtes Plasmid pGHα210-EcoRI, das eine neu hinzugefügte EcoRI-Stelle unmittelbar stromaufwärts des lacZ'-Gens enthielt, zu erhalten.

B. Konstruktion von pPLlacZ'210αhANP (Fig. 15)

5 ug des vorstehend beschrieienen Plasmids pGHα210- EcoRI wurden mit 0,2 Einheiten EcoRI in 50 ul HindIII-Puffer 60 Minuten bei 37ºC teilweise gespalten und das lineare DNA- Fragment wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen. Anschließend wurde das gewonnene DNA-Fragment mit 80 Einheiten SalI in 100 ul SalI-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das zweitgrößte DNA-Fragment (Fragment Nr. 1 in Fig. 15), das ein Strukturgen für βgal210αhANP enthielt, elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen.
Ferner wurden 5 g des vorstehend beschriebenen Plasmids pS224-3 mit 16 Einheiten EcoRI und 24 Einheiten AvaI in 50 ul HindIII-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 2 in Fig. 15), das den PL-Promotor vom λ-Phagen und ein Ampicillinresistenzgen enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen.
Ein doppelsträngiges DNA-Fragment (Fragment Nr. 3 in Fig. 15), das die nachstehend beschriebene Sequenz
ein überstehendes SalI-Ende und ein überstehendes AvaI-Ende aufwies, wurde durch chemische Synthese hergestellt.
Diese drei DNA-Fragmente wurden gemäß dem gleichen, vorstehend beschriebenen Verfahren ligiert, das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110/C&sub1; verwendet und Ampicillin- und Kenemycin-resistente clone wurden erhalten. Die Plesmide der Clone wurden in üblicher Weise analysiert, um das gewünschte Plasmid pPLlacZ'210αhANP zu erhalten.

Referenzbeispiel 5

Konstruktion des Plasmids pGHαBal mit einem verkürzten βgal- Bereich (Fig. 16)

10 ug des im Referenzbeispiel 3 konstruierten Plasmids pGHα439rop&supmin; wurden mit 100 Einheiten AatII in 100 ul HindIII-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und die gespaltene DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen. Anschließend wurde die gewonnene DNA in 100 ul Bal31-Puffer, der 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12 mM CaCl&sub2;, 12 mM MgCl&sub2;, 0,2 M NaCl und 1 mM EDTA umfaßte, gelöst und mit 10 Einheiten Bal31 behandelt. Nach 5, 10 und 20 Minuten wurden 30ul- Proben des Reaktionsgemisches entnommen und zur Beendigung der Umsetzung mit einem äquivalenten Volumen Phenol/Chloroform (1:1) vermischt. Nach der Entfernung der Phenolschicht (untere Schicht) wurde die wäßrige Schicht zur Entfernung des Phenolrückstands mit Ethylether extrahiert und die DNA durch Ethanolfällung gewonnen. Anschließend wurde das DNA-Fragment aus jeder Probe in 30 ul TA-Puffer gelöst, mit 15 Einheiten EcoRI vollständig gespalten und 10 ul des Reaktionsgemisches wurden einer 2 % Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Den verbleibenden 20 ul-Proben der 10-minütigen und 20-minütigen Umsetzung, die ein DNA- Fragment von weniger als 400 bp lieferten, wurden 70 ul TA- Puffer, 2 ul 25 mM dNTPs, 5 ul 100 mM Dithiothreit und 4 Einheiten T4-DPase zugesetzt und die Umsetzung 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt, um die überstehenden Enden des DNA- Fragments in glatte Enden umzuwandeln. Nach der Gewinnung jedes DNA-Fragments durch Ethanolfällung wurde das DNA- Fragment gemäß dem gleichen, vorstehend beschriebenen Verfahren mit T4-DNA-Ligase mit sich selbst ligiert, das Ligierungsgemisch zur Transformation von E. coli W3110 verwendet, und 54 E. coli W3110/pGHαBal-Clone wurden erhalten. Von den Plasmiden der 54 Clone wurde das Plasmid pGHαBal43 für weitere Experimente verwendet.

Referenzbeispiel 6

Konstruktion von Plasmid pIN5T4 (Fig. 17)

(1) Konstruktion von pIN4GIF54

Das Plasmid pIN4GIF54 wurde, wie in Fig. 17 dargestellt, aus (1) einem DNA-Fragment, das den Lipoproteingen- Promotorbereich (als lpp in der Figur angegeben) enthielt und durch Spaltung des Plasmids pINIA2 mit den Restriktionsenzymen XbaI und PstI erhalten wurde, (2) einem Oligonucleotid, das überstehende XbaI- und EcoRI-Enden aufwies, und (3) einem DNA-Fragment, das das hINF-γ-Gen enthielt und durch Spaltung des Plasmids pGIF54 mit EcoRI und PstI erhalten wurde, konstruiert. Das Verfahren ist nachstehend beschrieben. Sämtliche verwendeten Restriktionsenzyme stammten von Takara Shuzo KK.

A) Herstellung eines XbaI-PstI-DNA-Fragments von pINI-A2

Das Plasmid pINI-A2 ist ein Geschenk von Dr. Inoue von der New York State University. Ein Escherichia coli- Wirtsstamm, der durch Transformation mit diesem Plasmid erhalten wurde, erhielt die Bezeichnung JA221/pINI-A2 und wurde am 18. Juli 1983 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags unter der Hinterlegungsnr. FERM BP-320 beim Fermentation Research Institute, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, hinterlegt.
Die pINI-A2-DNA (3 ug) wurde mit jeweils 15 Einheiten XbaI und PstI in 150 ul 1 x TA-Lösung (33 mM Tris-Acetat- Puffer, pH 7,6, 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat und 0,5 mM Dithiothreit) 60 Minuten bei 37ºC gespalten. Das Reaktionsgemisch wurde einer 1,0 % Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, ein Bereich des Gels, der an der etwa 980 bp (Basenpaaren) entsprechenden Position lag, ausgeschnitten, in einen Dialyseschlauch gegeben und das XbaI-PstI-DNA- Fragment durch Elektrophorese eluiert. Nach der Entfernung des Ethidiumbromids aus dem Eluat durch Zugabe einer äquivalenten Menge Phenol wurden 2,5 Volumina Ethanol zugesetzt. Nachdem das Gemisch 30 Minuten bei -80ºC gestanden hatte, wurde es 10 Minuten mit 10 000 Upm zentrifugiert, wobei das DNA-Fragment als Ethanol-Niederschlag erhalten wurde. Diesem Ethanol-Niederschlag wurden zur Lösung des DNA-Fragments 10 ul destilliertes Wasser zugesetzt.

B) Herstellung des EcoRI-PstI-DNA-Fragments von pGIF54

Das Plasmid pGIF54 ist im wesentlichen das gleiche Plasmid wie pGIF4, das in der japanischen Patentanmeldung Nr. 86,180/1982 offenbart ist. Die Escherichia coli-Transformante WA802/pGIF4, die durch Transformation mit diesem Plasmid erhalten wurde, das das chemisch synthetisierte Gen enthält, das die Aminosäuresequenz von hIFN-γ codiert, wie es in Fig. 6 dargestellt ist, erhielt die Bezeichnung SBMG105 und wurde am 6. Mai 1982 beim Fermentation Research Institute, der Agency of Industrial Science and Technology, als FERM P-6522 hinterlegt und am 2. Mai 1983 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages in FERM BP-282 umbenannt.
Die pGIF54-DNA (3 ug) wurde mit jeweils 15 Einheiten EcoRI und PstI in 30 ul 1 x TA-Lösung 60 Minuten bei 37ºC gespalten und anschließend eine 0,7 % Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, wobei ein EcoRI-PstI-DNA-Fragment von etwa 3,4 kb aus dem Gel eluiert wurde. Das Eluat wurde wie vorstehend beschrieben einer Phenolbehandlung und einer Ethanolfällung unterzogen. Dem Ethanol-Niederschlag wurden zur Lösung des DNA-Fragments 10 ul destilliertes Wasser zugesetzt.

C) Herstellung des Oligonucleotids mit überstehenden XbaI- und EcoRI-Enden

Zur Expression eines vollständigen hINF-γ-Proteins wurde durch das Festphasenverfahrem ein Oligonucleotid synnetisiert, das die Shine-Dalgarno-(SD)-Sequenz stromabwärts der XbaI-Spaltstelle von pINIA2 und ferner ein überstehendes EcoRI-Ende aufwies, nämlich das Oligonucleotid:
S P
5' C T A G A G G T A G 3'
3' T C C A T C T T A A 5'
XbaI, überstehendes Ende EcoRI, überstehendes Ende
Das Syntheseverfahren ist in der japanischen Patentanmeldung Nr. 86,180/1982 genauer offenbart worden.
Das vorstehend beschriebene Oligonucleotid (100 Picomol) wurde in 30 ul einer Kinasereaktionslösung (50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithiothreit), der 2 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo KK) zugesetzt wurden, 60 Minuten bei 37ºC an 5'-OH- Ende phosphoryliert.

D) Konstruktion von pIN4GIF54

Das Plasmid pIN4GIF54 wurde durch Ligierung der drei DNA-Fragmente, die vorstehend hergestellt worden waren, gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren konstruiert. Einem Lösungsgemisch aus 5 ul XbaI-PstI-DNA-Fragment von pI- NIA2 (Lösung des Ethanol-Niederschlags in 10 ul destilliertem Wasser), 5 ul EcoRI-PstI-DNA-Fragment von pGIF54 (Lösung des Ethanol-Niederschlags in 10 ul destilliertem Wasser) und 3 ul phosphoryliertem Oligonucleotid (10 Picomol) wurden 2 ul Ligierungsreaktionsmedium mit einer 10fach höheren Konzentration (20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, und 10 mM Mgcl&sub2;), 2 ul 4 mm ATP und 1 ul T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) (5 Einheiten) zugesetzt und die Ligierung wurde über Nacht bei 16ºC durchgeführt.

(2) Transformation von Escherichia coli

A) Transformation von Escherichia coli WA802

Escherichia coli WA802 wurde in 2,0 ml L-Brühe über Nacht bei 37ºC gezüchtet, 0,3 ml der Nährlösung wurden 30 ml L-Brühe zugesetzt, und 2 Stunden bei 37ºC wurde eine Schüttelkultur durchgeführt, wonach 10 Minuten mit 3 000 Upm zentrifugiert wurde. Den so erhaltenen Zellen wurden 10 ml 50 mM CaCl&sub2; zur Herstellung einer Suspension der Zellen zugesetzt und 10 Minuten wurde mit 3 000 Upm zentrifugiert. Den so erhaltenen Zellen wurde 1,0 ml 50 mM CaCl&sub2;-Lösung zugesetzt und das Gemisch 60 Minuten in einem Eisbad stehengelassen. 0,2 ml dieser Suspension von Ca²&spplus;-behandelten Zellen wurden 10 ul des in Beispiel I-D erhaltenen Ligierungsreaktionsgemisches (das die ligierten vorstehend beschriebenen drei DNA-Fragmente enthielt) zugesetzt, das Gemisch wurde 60 Minuten in einem Eisbad stehengelassen, anschließend wurden 2 ml L-Brühe zugesetzt und 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Nährlösung wurde zur Plattierung auf einem 40 ug/ml Ampicillin enthaltenden Nähragarmedium (BBL) verwendet. Nachdem über Nacht bei 37ºC inkubiert worden war, wurden Ampicillin-resistente Transformanten selektiert. Aus einer der erhaltenen Transformanten wurde durch das übliche Verfahren ("cleared lysate"-Verfahren) Plasmid-DNA gewonnen. Die Basensequenz der DNA am oder um den inserierten XbaI- EcoRI-Bereich wurde durch das Maxam-Gilbert-Verfahren (Methods in Enzymology 65 (1980), 499-560) ermittelt, und es bestätigte sich, daß die DNA die gewünschte DNA-Basensequenz aufwies. Das plasmid erhielt die Bezeichnung pIN4GIF54 und der es tragende transformierte Escherichia coli-Stamm die Bezeichnung WA802/pIN4GIF54.

(3) Konstruktion des Plasmids pIN5GIF54 (Fig. 17)

A) Herstellung des Oligonucleotids mit überstehenden XbaI- und EcoRI-Enden

Das Oligonucleotid mit der SD-Sequenz AGGAGGT und überstehenden XbaI- und EcoRI-Enden an den 5'-Termini, nämlich
5' C T A G G A G G T A G 3'
3' C T C C A T C T T A A 5'
wurde durch das vorstehend beschriebene Festphasenverfahren synthetisiert (vgl. japanische Patentanmeldung Nr. 86,180/1982) synthetisiert. Das vorstehend beschriebene Oligonucleotid (100 Picomol) wurde in 50 ul Kinasereaktionslösung, der wie vorstehend beschrieben 2 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase (Takara Shuzo) zugesetzt worden waren, 60 Minuten bei 37ºC am 5'-OH-Ende phosphoryliert.

B) Herstellung des XbaI-EcoRI-DNA-Fragments von pIN4GIF54

pIN4GIF54-DNA (2,5 ug) wurde mit jeweils 5 Einheiten XbaI und EcoRI in 30 ul 1 x TA-Lösung 60 Minuten bei 37ºC gespalten. Nach der Spaltung wurde eine 0,7 % Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein XbaI-EcoRI-DNA-Fragment von etwa 4,3 kb (SD-Sequenz-freies längeres Fragment), wie vorstehend beschrieben, durch Elektrophorese aus dem Gel eluiert. Das Eluat wurde, wie vorstehend beschrieben, einer Phenolbehandlung und Ethanolfällung unterzogen und dem Ethanol-Niederschlag wurden 10 ul destilliertes Wasser zur Lösung des DNA-Fragments zugesetzt.

C) Konstruktion von pIN5GIF54

Das plasmid pIN5GIF54 wurde durch Ligierung der beiden vorstehend beschriebenen DNA-Fragmente in der nachstehend beschriebenen Weise konstruiert. Der 5 ul-Lösung des phosphorylierten Oligonucleotids (10 Picomol) wurden 3 ul der Ligierungsreaktionslösung mit der 10fachen Konzentration (hier vorstehend beschrieben), 10 ul 100 mM DTT, 4 mM ATP in destilliertem Wasser und 1 ul (5 Einheiten) T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert.

(4) Transformation von Escherichia coli

A) Transformation von Escherichia coli WA802

Wie vorstehend beschrieben (Beispiel II-A) wurden in L-Brühe gezüchtete Zellen von Escherichia coli WA802 mit CaCl&sub2; behandelt und 0,2 ml Zellsuspension zur Durchführung der Transformation von Escherichia coli WA802 mit dem Ligierungsreaktionsgemisch, das im Beispiel IV-C erhalten wurde, vermischt. Die Selektion der Transformanten wurde unter Verwendung eines 40 ug/ml Ampicillin enthaltenden Nähragarmediums (BBL) durchgeführt. Aus einer der so erhaltenen Transformanten wurden die Plasmide durch das übliche Verfahren (vgl. Beispiel II-A) gewonnen und die Basensequenz der DNA am und um den Insertionsbereich, d. h., dem XbaI- EcoRI-Bereich, wurde analysiert. Wie in Fig. 5 dargestellt ist, muß im pIN5GIF54 die ursprünglich in pIN4GIF54 enthaltene XbaI-Spaltstelle (Fig. 3) fehlen. Daher wurde das erhaltene Plasmid mit XbaI behandelt, wonach eine 0,7 % Agarose-Gelelektrophorese und eine Bestimmung der Plasmid- DNA, die durch XbaI nicht gespalten wurde, an der und um die Oligonucleotidfragment-Insertion durch das Maxam-Gilbert- Verfahren durchgeführt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten, daß die erwartete Basensequenz der DNA vorhanden war. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pIN5GIF54 und der damit transformierte Stamm WA802 die Bezeichnung WA802/pIN5GIF54.

(5) Herstellung von pIN5T4 (Fig. 18)

Ein Teil (5 ug) von pIN5GIF54 wurde mit 20 Einheiten AatII und 20 Einheiten SalI vollständig gespalten. Das überstehende AatII-Ende (3'-Terminus) und SalI-Ende (5'- Terminus) wurden unter Verwendung der T4-DNA-Polymerase und 4 dNTPs (einschließlich dATP, dGTP, dCTP und dTTP) mit glatten Enden versehen. Das AatII-Ende wurde verkürzt, während das SalI-Ende aufgefüllt wurde. Das gespaltene Plasmid wurde durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt und ein DNA-Fragment (etwa 750 bp), das den Lipoproteinpromotor (lppP) und das GIF-Gen enthielt, durch eine Elektrophorese aus dem Gel elektroeluiert. Die DNA wurde anschließend durch Ausfällung mit Ethanol gewonnen.
Ein Teil (5 ug) von pBR322 wurde mit 20 Einheiten EcoRI vollständig gespalten und das erhaltene überstehende Ende durch das vorstehend beschriebene Auffüllverfahren mit glatten Enden versehen. Das Plasmid wurde anschließend mit 20 Einheiten AhaIII vollständig gespalten. Das gespaltene Plasmid wurde durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt und ein DNA-Fragment (etwa 3,3 kbp), das den DNA-Replikationsinitiationsursprung und ein Tetracyclinresistenzgen enthielt, durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten.
Die beiden DNA-Fragmente wurden vermischt und das Gemisch wurde unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (1 Einheit) in einer Ligierungslösung (20 ul), die aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT (Dithiothreit) und 1 mM ATP bestand, 18 Stunden bei 15ºC ligiert. Nach einer Behandlung mit 0,3 ml CaCl&sub2; wurde E. coli W3110 durch Zugabe von 10 ul der Ligierungslösung transformiert. Tetracyclin-resistente Clone der Transformanten wurden durch übliche Verfahren analysiert, um pIN5T4 enthaltende Clone von W3110 zu erhalten.

Beispiel 1

Erhöhung der Ausbeute an α-hANP durch Hydrolyse von βgal210αhANP in Gegenwart des Reduktionsmittels DTT

A. Ausbeute an α-hANP durch Hydrolyse von βgal210αhANP mit API

Wie im Referenzbeispiel 2 beschrieben, ist βgal210αhANP ein Fusionsprotein, das α-hANP und ein Polypeptid mit 210 Aminosäureresten der β-Galactosidase umfaßt.
E. coli W3110/pGHα210rop&supmin; wurde in einem Medium, das 0,5 % Glycerin, 2,4 % Hefeextrakt, 1,2 % Trypton, 100 mM Kaliumphosphat (pH 7,5) und Tetracyclin enthielt, 14 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die bakteriellen Zellen wurden anschließend geerntet, in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,3) suspendiert und durch Ultraschall aufgebrochen. Das aufgebrochene Produkt wurde eine Minute mit 10 000 g zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten. Der Niederschlag wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und in einem 5 M Harnstoff enthaltenden gleichen Puffer solubilisiert. Ein Aliquot des Gemisches wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen, um die Menge an produziertem Fusionsprotein zu ermitteln. Das restliche Reaktionsgemisch wurde mit API (Achromobacter-Protease I, Wako Junyaku, Japan) hydrolysiert und ein Aliquot des Reaktionsgemisches einer SDS-PAGE unterzogen, um den Abschluß der Hydrolyse zu bestätigen. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch HPLC unter Verwendung einer YMC-A-3020DS- Säule analysiert, um die Menge an freigesetztem α-hANP zu ermitteln. Die Menge des durch HPLC ermittelten α-hANP war etwa ein Viertel der durch SDS-PAGE bestimmten Menge, woraus erkennbar ist, daß das an das Partnerprotein βgal210 gebundene α-hANP nicht freigesetzt werden kann. Als Ursache für dieses Phänomen kann angenommen werden, daß mindestens einer von drei Cysteinresten, die im βgal210-Protein, das aus 210 von der β-Galactosidase stammenden Aminosäureresten besteht, vorhanden sind, und mindestens einer von zwei im α- hANP vorhandenen Cysteinresten eine Disulfidbindung(en) bildet und daher ein α-hANP-Molekül, das durch Spaltung einer Peptidbindung, die einer Linker-Aminosäure benachbart ist, vom βgal210-Molekül getrennt wird, über die Disulfidbindung(en) an das βgal210-Molekül gebunden bleibt.
Zur Bestätigung dieser Überlegung wurden die nachstehend beschriebenen Experimente durchgeführt.

B. Erhöhung der Ausbeute von α-hANP aus hydrolysiertem βgal210αhANP durch eine Reduktion mit DTT

Zur Untersuchung der Beteiligung von Disulfidbindungen wurde das mit API hydrolysierte βgal210αhANP-Präparat mit DTT reduziert und durch HPLC die Menge an α-hANP gemessen. Das in Tabelle 1 dargestellte Ergebnis zeigte eine vierfache Erhöhung der Menge an freigesetztem α-hANP im Vergleich zur Menge, die vor der Reduktion mit DTT davon erhalten wurde. Die Menge an freigesetztem α-hANP nach der DTT-Reduktion ist etwa die gleiche, wie sie als Ergebnis einer SDS-PAGE erhalten wurde. Das vorstehend beschriebene Ergebnis legt nahe, daß die niedrige Ausbeute an α-hANP aus βgal210αhANP nach der API-Hydrolyse durch vorhandene Disulfidbindungen zwischen dem βgal210- und α-hANP-Molekül bewirkt wird.

Beispiel 2

Umwandlung von Cysteinresten im βgal210 in Serinreste

Zur Bestätigung der Beteiligung von Disulfidbindungen an der geringen Ausbeute von α-hANP aus βgal210αhANP nach der API-Hydrolyse und zur Verbesserung des nativen βgal210 als ein Partner in einem Fusionsprotein wurden sämtliche im nativen βgal210 vorhandenen Cysteinreste durch Serinreste ersetzt. Das modifizierte βgal210-Protein, in dem sämtliche Cysteinreste durch Serinreste ersetzt sind, erhielt die Bezeichnung βgal210(Ser) und ein Fusionsprotein, das α-hANP und βgal210(Ser) umfaßte, die Bezeichnung βgal210(Ser)αhANP.

A. Konstruktion des Plasmids pGHα210(Ser)rop&supmin; (Fig. 1)

Das βgal210-Protein enthält drei Cysteinreste an den vom N-Terminus berechneten Positionen 76, 122 und 154. pGHα210(Ser)rop&supmin; ist ein Plasmid, das ein Gen enthält, das ein Fusionsprotein codiert, das α-hANP und das modifizierte βgal210, in dem die vorstehend beschriebenen drei Cysteinreste durch Serinreste ersetzt sind, umfaßt. Die Umwandlung Cys -T Ser liefert die Restriktionsenzymspaltstellen BglII, BamHI und AvaII.
3 ug des in Referenzbeispiel 3 konstruierten Plasmids pGHα210rop&supmin; wurden mit 20 Einheiten PvuI und 12 Einheiten EcoRI in 50 ul H-Puffer, der 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl umfaßte, 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 1 in Fig. 1), das ein Tetracyclingen enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen. Entsprechend wurden 3 ug des Plasmids pGHα210rop&supmin; mit 20 Einheiten AvaI und 20 Einheiten BamHI in 50 ul H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 2 in Fig. 1), das ein lacZ'210αhANP-Gen enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen.
Getrennt davon wurden drei Oligonucleotid-Primer mit den nachstehend beschriebenen Sequenzen
chemisch synthetisiert. Jedes Oligonucleotid enthält ein Codon für Serin anstelle eines Codons für Cystein und eine Spaltstelle für das Restriktionsenzym BglII, BamHI oder AvaII und ist an den 5'-Enden phosphoryliert.
Jeweils 2 ug der vorstehend hergestellten doppelsträngigen DNA-Fragmente und jeweils 1 ug der drei Oligonucleotid-Primer wurden mit 30 ul P/L-Puffer, der 6 mM Tris- HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 8 mM MgCl&sub2; und 1 mM β- Mercaptoethanol umfaßte, vermischt und das Gemisch wurde auf 5ºC erhitzt um die doppelsträngigen DNA-Fragmente unter Bildung von einzelsträngigen DNA-Fragmenten zu denaturieren, und zur Durchführung des Annealing der DNA-Fragmente wurde uber einen Zeitraum von 60 Minuten allmählich auf 30ºC abgekühlt. Dem Reaktionsgemisch wurden 1 ug dNTPs und 2 Einheiten Klenow-Fragment der DNA-Polymerase, sowie 2 Einheiten T4-DNA-Ligase und 2 ul 10 mM ATP zugesetzt um eine zirkuläre doppelsträngige DNA herzustellen. Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet um Tetracyclin-resistente Clone zu erhalten. Die Plasmide der Clone wurden in üblicher Weise analysiert, wobei ein gewünschtes Plasmid pGHα210(Ser)rop&supmin;, das die neu eingeführten Restriktionsstellen BglII, BamHI und AvaII enthielt, erhalten wurde.

B. Gewinnung von α-hANP aus βgal210(Ser)αhANP

E. coli W3110/pGHα210(Ser)rop&supmin; wurde in einem Medium, das 0,5 % Glycerin, 2,4 % Hefeextrakt, 1,2 % Trypton, 100 mM Kaliumphosphat (pH 7,5) und Tetracyclin enthielt, 14 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden anschließend geerntet, in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,3) suspendiert und durch Ultraschall aufgebrochen. Das aufgebrochene Produkt wurde 5 Minuten mit 10 000 g zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten. Der Niederschlag wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und in einem 5 M Harnstoff enthaltenden gleichen Puffer solubilisiert. Ein Aliquot des Gemisches wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen, um die Menge an produziertem Fusionsprotein zu ermitteln. Das restliche Reaktionsgemisch wurde mit API (Achromobacter-Protease I, Wako Junyaku, Japan) hydrolysiert und ein Aliquot des Reaktionsgemisches einer SDS-PAGE unterzogen, um den Abschluß der Hydrolyse zu bestätigen. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch HPLC unter Verwendung einer YMC-A-3020DS-Säule analysiert, um die Menge an freigesetztem α-hANP zu ermitteln. Die durch HPLC ermittelte Menge an freigesetztem α-hANP entsprach etwa der durch SDS-PAGE bestimmten Menge, und die DTT-Reduktion der durch API hydrolysierten Probe erhöhte die freigesetzte Menge α-hANp nicht, wie es in Tabelle 1 dargestellt ist. Dieses Ergebnis zeigt, daß eine niedrigere Ausbeute an α- hANP aus βgal210αhANP durch im βgal210-Protein vorhandene Cysteinreste bewirkt wird. Ferner zeigt das vorstehend beschriebene Ergebnis, daß α-hANP aus dem Fusionsprotein βgal210(Ser)αhANp ohne DTT-Reduktion und daher ohne anschließende Oxidation leicht isoliert werden kann. Tabelle 1 Fusionsprotein Menge an freigesetztem α-hANP
Ein Verfahren zur Herstellung von α-hANP durch ein Fusionsprotein βgal210(Ser)αhANP ist außerdem deshalb vorteilhaft, da (1) α-hANP in einer großen Menge produziert, (2) aufgrund der Ausfällung des Fusionsproteins, während verunreinigende Proteine im Überstand verbleiben, das Fusionsprotein bei der Verwendung von βgal210αhANP leicht gereinigt und (3) aufgrund der Abwesenheit eines Cysteinrestes im βgal210(Ser) und der deswegen fehlenden Bildung einer Disulfidbindung zwischen α-hANP und βgal210(Ser) α-hANP fast vollständig aus API-hydrolysiertem Fusionsprotein ohne DTT-Reduktion und anschließende Oxidation gewonnen werden kann. Bei der industriellen Produktion von α- hANP gibt es jedoch einige Probleme. Da nämlich (a) das Fusionsprotein βgal210(Ser)αhANP eine geringe Löslichkeit in einer wäßrigen Harnstofflösung aufweist, ist eine niedrige Konzentration des Fusionsproteins, d. h., eine hohe Verdünnung eines Reaktionsgemisches, für das API-Hydrolyseverfahren erforderlich, und da (b) die Effizienz der API- Hydrolyse bei βgal210(Ser)αhANP ziemlich niedrig ist, sind eine große Menge API-Enzym pro Substrat und eine lange Reaktionszeit erforderlich, wobei eine unerwünschte Modifikation des Zielprodukts α-hANP erfolgen kann.
Unter Berücksichtigung der vorstehend beschriebenen Situation experimentierten die Erfinder mit einem kürzeren Partnerprotein, um die Probleme (a) und (b) bei Beibehaltung der Vorteile (1), (2) und (3) zu lösen. Dazu wurde ein Plasmid konstruiert, das eine DNA enthielt, die ein Fusionsprotein codierte, das α-hANP und ein Partnerpeptidderivat mit 97 Aminosäuren umfaßte, das dem N-Terminus eines β-Galactosidase-Proteins entsprach, in dem das Cystein an Position 76 durch Serin ersetzt wurde. Das Peptid, das aus 97 Aminosäureresten der β-Galactosidase besteht, wird als βgal97 und das α-hANP und βgal97 umfassende Fusionsprotein als βgal97αhANP bezeichnet. Ferner erhält das Peptid, das aus 97 Aminosäureresten der β-Galactosidase besteht, in dem das Cystein an Position 76 durch Serin ersetzt ist, die Bezeichnung βgal97(Ser) und das α-hANP und βgal97(Ser) umfassende Fusionsprotein die Bezeichnung βgal97(Ser)αhANP.

Beispiel 3

Konstruktion des Plasmids nGHα97S

A. Konstruktion des Plasmids pGH97(Ser)rop&supmin;

Plasmid pGHα97(Ser)rop&supmin;, das ein Gen für βgal97(Ser)αhANP enthielt, in dem im Fusionsprotein βgal97αhANP die Aminosäure Cystein in Position 76 durch Serin ersetzt worden ist, wurde konstruiert.
10 ug des in Referenzbeispiel 5 konstruierten Plasmids pGHαBal43 wurden mit 50 Einheiten PstI und 50 Einheiten DdeI in 70 ul H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das Spaltprodukt wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein 283 bp-DNA-Fragment (Fragment Nr. 1 in Fig. 2), das das α-hANP-Gen enthielt, abzutrennen und zu gewinnen. Getrennt davon wurden 3 ug des in Beispiel 1 konstruierten Plasmids pGHα210(Ser)rop&supmin; mit 20 Einheiten PvuI und 20 Einheiten PstI in 50 ul H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 2 in Fig. 2), das ein Tetracyclinresistenzgen enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen. Ferner wurden 10 ug pGHα210(Ser)rop&supmin; mit 50 Einheiten PvuI und 50 Einheiten DdeI in 70 ul H-Puffer vollständig gespalten und ein 101 bp-DNA-Fragment (Fragment Nr. 3 in Fig. 2), das einen Teil des lacZ'-Gens enthielt, wurde durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt und gewonnen.
Diese drei DNA-Fragmente wurden in 20 ul eines Ligierungsgemisches, das 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithiothreit umfaßte, 18 Stunden bei 15ºC mit 1 Einheit T4-DNA-Ligase inkubiert und das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet, um Tetracyclin-resistente Clone zu erhalten. Die Plasmide aus den Clonen wurden durch übliche Verfahren analysiert, um ein gewünschtes Plasmid pGHα97(Ser)rop&supmin; zu selektieren, das ein lacZ'-Gen enthielt, das ein Fusionsprotein βgal97(Ser)αhANP codierte, in dem das Cystein in Position 76 durch Serin ersetzt war.
Escherichia coli SBM288, der das Plasmid pGHα97(Ser)rop&supmin; enthielt, wurde am 9. Januar 1987 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages als FERM BP-1253 bei der FRI hinterlegt.

B. Konstruktion von pGHα97S

Die Produktivität für βgal97(Ser)αhANP war bei einer Züchtung von E. coli W3110/pGHα97(Ser)rop&supmin;, d. h., der mit dem Plasmid pGHα97(Ser)rop&supmin; transformierte E. coli W3110, 14 Stunden bei 37ºC in einem Medium, das 0,5 % Glycerin, 2,4 % Hefeextrakt, 1,2 % Trypton und 100 mM Kalium-H-phosphat (pH 7,5) enthielt und mit Tetracyclin versetzt worden war, niedriger als die für βgal97αhANP. Daher wurde zur Verbesserung der Produktivität für βgal97(Ser)αhANP das Plasmid pGHα97S konstruiert, bei dem ein Attenuatorterminator des Tryptophanoperons (trp a) unmittelbar stromabwärts des α-hANP-Strukturgens inseriert wurde.
10 ug des Plasmids pGHα97(Ser)rop&supmin; wurden mit 50 Einheiten BglII und 50 Einheiten RsaI in 100 ul H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und ein 154 bp-DNA- Fragment (Fragment Nr. 1 in Fig. 3), das den C-terminalen Bereich des βgal97(Ser)-Gens und den N-terminalen Bereich des α-hANP-Gens enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen. Anschließend wurden 3 ug pGHα97(Ser)rop&supmin; mit 20 Einheiten BglII und 40 Einheiten SalI in 50 ul S-Puffer, der 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl und mM MgCl&sub2; enthielt, 63 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 2 in Fig. 3), das einen Replikationsursprung enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen. Getrennt davon wurden 3 ug pBR322 mit Einheiten EcoRI und 40 Einheiten SalI in 50 ul S-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und ein Kleineres DNA-Fragment (Fragment Nr. 3 in Fig. 3), das eine Promotorregion eines Tetracyclinresistenzgens enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen.
Ferner wurde ein chemisch synthetisiertes doppelstrangiges DNA-Fragment (Fragment Nr. 4 in Fig. 3), das die nachstehend beschriebene Sequenz
ein glattes RsaI-Ende und ein überstehendes EcoRI-Ende aufwies, hergestellt.
Die vorstehend hergestellten vier DNA-Fragmente wurden durch das gleiche, vorstehend beschriebene Verfahren ligiert und das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet. Tetracyclin-resistente Clone wurden erhalten und Plasmide der Clone durch ein übliches Verfahren analysiert, wobei das gewünschte Plasmid pGHα97S erhalten wurde.

C. Herstellung von βgal97(Ser)αhANP

E. coli W3110/pGHα97(Ser)rop&supmin; und E. coli W3110/pGHα97S, d. h., der mit pGHα97S transformierte E. coli W3110, wurden 14 Stunden bei 37ºC in einem Medium, das 0,5 % Glycerin, 2,4 % Hefeextrakt, 1,2 % Trypton und 100 mM Kalium-H-phosphat (pH 7,5) enthielt und mit Tetracyclin versetzt worden war, gezüchtet und die produzierten Mengen βgal97(Ser)αhANP durch SDS-PAGE gemäß dem gleichen, vorstehend in Beispiel 2. B beschriebenen Verfahren zur Analyse des Fusionsproteins verglichen. Wie der Fig. 4 zu entnehmen ist, ist durch Einführung von trp a unmittelbar stromabwärts des α-hANP-Gens die Produktivität für βgal97(Ser)αhANP deutlich erhöht worden. E. coli W3100/pGHα97S produziert etwa die gleiche Menge βgal97(Ser)αhANP wie E. coli W3110/pGHα210(Ser)rop&supmin; βgal210(Ser)αhANP. Daraus folgt, daß W3110/pGHα97S im Vergleich zu W3110/pGHα210(Ser)rop&supmin; etwa die doppelte α-hANP-Produktivität im jeweiligen Kulturmedium aufweist. Das Fusionsprotein βgal97(Ser)αhANP wird neben βgal210αhANp und βgal210(Ser)αhANP ebenfalls durch Zentrifugation des aufgebrochenen Zellmaterials ausgefällt, während die E. coli-Proteine in die Überstandsfraktion übergehen (vgl. Fig. 5).
Wie der Tabelle 2 zu entnehmen ist, wurde die aus API-hydrolysiertem βgal97(Ser)αhANP freigesetzte Menge αhANP durch DTT-Reduktion nicht wie bei βgal210(Ser)αhANP erhöht, obwohl die aus API-hydrolysiertem βgal97αhANP freigesetzte Menge α-hANP durch DTT-Reduktion wie bei βgal210αhANP erhöht war. Tabelle 2 Fusionsprotein Menge an freigesetztem α-hANP
Ferner zeigt das Fusionsprotein βgal97(Ser)αhANP in einer 5 M wäßrigen Harnstofflösung im Vergleich zu βgal210(Ser)αhANP eine etwa zehnfache Löslichkeit. Daraus folgt unter Berucksichtigung der Tatsache eines im Vergleich zu βgal210(Ser)αhANP etwa doppelt so hohen Anteils von α- hANP in βgal97(Ser)αhANP, daß die Konzentration von α-hANP in in 5 M Harnstoff gelöstem βgal97(Ser)αhANP etwa 20fach höher als die in βgal210(Ser)αhANP ist.
βgal97(Ser)αhANP zeigte eine im Vergleich zu βgal210(Ser)αhANP etwa 100fach höhere (etwa 200fach für α- hANP) Empfindlichkeit gegen eine Hydrolyse durch API.
Dementsprechend wurde im nachstehenden Beispiel die Ursache für die hohe Empfindlichkeit von βgal97(Ser)αhANP gegen eine Hydrolyse durch API untersucht.

Beispiel 4

Untersuchung der hohen Empfindlichkeit von βgal97(Ser)αhANP gegen eine Hydrolyse durch API

Im βgal97(Ser)αhANP ist βgal97(Ser) über Gln-Phe-Lys mit α-hANP verknüpft, wobei Gln die 98. Aminosäure im βgal97(Ser)αhANP ist, und API hydrolysiert eine Peptidbindung an der C-terminalen Seite von Lys. Andererseits ist βgal210(Ser) in βgal210(Ser)αhANP über Glu-Phe-Lys mit α- hANP verknüpft, wobei Glu die 211. Aminosäure in βgal210(Ser)αhANP ist. Die Erfinder stellten die Hypothese auf, daß βgal97(Ser)αhANP gegen eine Hydrolyse durch API empfindlicher als βgal210(Ser)αhANP ist, da im Gegensatz zur negativen Ladung an der -carboxylgruppe von Glu in βgal210(Ser)αhANP, die mit der positiven Ladung am Lys interferiert, das -carboxyamid von Gln in βgal97(Ser)αhANP keine entsprechende negative Ladung aufweist und es daher keine Interferenz mit einer entsprechenden positiven Ladung am Lys gibt.
Zur Bestätigung der Hypothese wurde Plasmid pGHα97SE konstruiert, das ein Gen enthielt, das ein Fusionsprotein βgalα97(Ser)αhANP codierte, in dem die 97. Aminosäure Gln in βgal97(Ser)αhANP durch Glu ersetzt war (das heißt, Gln-Phe- Lys am Verknüpfungsteil ist in Glu-Phe-Lys umgewandelt worden), und die Empfindlichkeiten der Fusionsproteine von den Plasmiden pGHα97S und pGHα97SE wurden verglichen.

A. Konstruktion des Plasmids pGHα97SE

3 ug des in Beispiel 3 konstruierten Plasmids pGHα97S wurden mit 20 Einheiten BamHI und 20 Einheiten AvaI in 50 ul H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 1 in Fig. 6), das das α- hANP-Gen enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen. Ferner wurden 3 ug pGHα97S mit 20 Einheiten BglII und 20 Einheiten EcoRI in 50 ul H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 2 in Fig. 6), das ein Tetracyclinresistenzgen enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gewonnen.
Getrennt davon wurde ein einzelsträngiges Oligonucleotid (Fragment Nr. 3 in Fig. 6), das die nachstehend beschriebene Sequenz
aufwies, ein Codon für Glutaminsäure anstelle eines Codons für Glutamin enthielt und am 5'-Ende phosphoryliert war, chemisch synthetisiert.
Die beiden vorstehend hergestellten doppelsträngigen DNA-Fragmente und das einzelsträngige Oligonucleotid wurden in P/L-Puffer vermischt und das Gemisch wurde auf 95ºC erhitzt, um die doppelsträngigen DNA-Fragmente unter Bildung von einzelsträngigen DNA-Fragmenten zu denaturieren, und zur Durchführung des Annealing der DNA-Fragmente zu doppelsträngiger DNA wurde über einen Zeitraum von 60 Minuten allmählich auf 30ºC abgekühlt. Dem Reaktionsgemisch wurden dNTPs und das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase sowie T4- DNA-Ligase und ATP zugesetzt und eine Umsetzung zur Herstellung einer geschlossenen zirkulären DNA durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet. Tetracyclin-resistente Clone wurden erhalten und Plasmide der Clone durch ein übliches Verfahren analysiert, wobei das gewünschte Plasmid pGHα97SE selektiert wurde, das ein Gen enthielt, das βgalα97(Ser)EαhANP codierte, in dem Aminosäurereste am Verknüpfungsbereich Gln- Phe-His in Glu-Phe-Lys umgewandelt worden waren. B. Vergleich von βgal97(Ser)αhANP und βgal97(Ser)EαhANP im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit gegen API
E. coli W3100/pGHα97S und E. coli W3100/pGHα97ES wurden 14 Stunden bei 37ºC in einem Medium, das 0,5 % Glycerin, 2,4 % Hefeextrakt, 1,2 % Trypton und 100 mM Kalium-H-phosphat (pH 7,5) enthielt und mit Tetracyclin versetzt worden war, gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu ernten, die anschließend in 10 mM Tris-HCl (pH 9,3) suspendiert und durch Ultraschall aufgebrochen wurden. Das aufgebrochene Zellmaterial wurde anschließend eine Minute mit 10 000 g zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten, der anschließend mit dem gleichen Puffer gewaschen wurde. Der gewaschene Niederschlag wurde im gleichen, 5 M Harnstoff enthaltenden Puffer solubilisiert und das solubilisierte Präparat in vier Teile geteilt. Diesen Präparaten wurden 0, 1, 5 bzw. 25 ng API/5 ug αhANP zugesetzt. Jedes Gemisch wurde 45 Minuten bei 30ºC inkubiert und durch SDS-PAGE analysiert.
Wie der Fig. 7 zu entnehmen ist, wiesen βgal97(Ser)EαhANP und βgal97(Ser)αhANP keine unterschiedlichen Hydrolyse-Empfindlichkeiten gegen API auf. Daher wurde die vorstehend beschriebene Hypothese aufgegeben. Wahrscheinlich wird die hohe Hydrolyse-Empfindlichkeit von βgal97(Ser)αhANP gegen API durch die Struktur von βgal97(Ser)αhANP per se bewirkt.

Beispiel 5

Konstruktion von pPLlacZ'97(Ser)αhANP

Plasmid pPLlacZ'97(Ser)αhANP wurde konstruiert, indem der lac-Promotor in pGHα97S gegen einen PL-Promotor des λ- Phagen ausgetauscht wurde.
10 ug des in Fig. 4 konstruierten Plasmids pPL- lacZ'210αhANP wurden mit 50 Einheiten EcoRI und 50 Einheiten PvuI in 100 ul H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das Reaktionsgemisch wurde einer 5 % Acrylamid- Gelelektrophorese unterzogen, um ein 143 bp-DNA-Fragment (Fragment Nr. 1 in Fig. 8), das das lacZ'-Gen enthielt, das den N-Terminus der β-Galactosidase codierte, abzutrennen und zu reinigen. Ferner wurden 3 ug pPLlacZ'210αhANP mit 20 Einheiten EcoRI und 20 Einheiten Aval in 50 ul H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA- Fragment (Fragment Nr. 2 in Fig. 8), das einen PL-Promotor und ein Ampicillinresistenzgen enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gereinigt. Getrennt davon wurden 3 ug pGHα97S mit 10 Einheiten PvuI und 10 Einheiten AvaI in 50 ul H-Puffer vollständig gespalten und ein DNA-Fragment (Fragment Nr. 3 in Fig. B), das ein α-hANP-Gen und ein Tetracyclinresistenzgen enthielt, wurde erhalten.
Diese drei DNA-Fragmente wurden durch die gleichen, vorstehend beschriebenen Verfahren ligiert und das Ligierungsgemisch zur Transformation von E. coli W3110/C&sub1; (E. coli W3110, der ein das C&sub1;875-Gen und Kanamycinresistenzgen tragendes Plasmid enthielt) verwendet. Tetracyclin-, Ampicillin- und Kanamycin-resistente Clone wurden erhalten. Die Plasmide der Clone wurden durch ein übliches Verfahren analysiert, wobei das gewünschte Plasmid pPLlacZ'97(Ser)αhANP selektiert wurde.

Beispiel 6

Konstruktion von pINlacZ'97(Ser)αhANP

Plasmid pINlacZ'97(Ser)αhANP wurde durch Austausch des PL-Promotors im Plasmid pPLlacZ'97(Ser)αhANP gegen den lpp-Promotor des Gens der äußeren Lipoproteinmembran von E. coli konstruiert.
10 ug pPLlacZ'97(Ser)αhANP wurden mit 50 Einheiten BamHI in 100 ug H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten anschließend mit 5 Einheiten EcoRI partiell gespalten und das Spaltprodukt wurde einer 1 % Agarose- Gelelektrophorese unterzogen, um ein 809 bp-EcoRI-BamHI-DNA- Fragment (Fragment Nr. 1 in Fig. 9), das das β- gal97(Ser)αhANP-Gen und eine Promotorregion des Tetracyclin- Resistenzgens enthielt, abzutrennen und zu reinigen. Außerdem wurden 3 ug des Plasmids pIN5T4 mit 20 Einheiten EcoRI und 20 Einheiten BamHI in 50 ul H-Puffer 60 Minuten bei 37ºC vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (Fragment Nr. 2 in Fig. 9), das den Ipp-Promotor enthielt, wurde elektrophoretisch abgetrennt und gereinigt.
Diese beiden DNA-Fragmente wurden durch die gleichen, vorstehend beschriebenen Verfahren ligiert und das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet. Tetracyclin-resistente Clone wurden erhalten und die Plasmide der Clone durch ein übliches Verfahren analysiert, wobei das gewünschte Plasmid pINlacZ'97(Ser)αhANP erhalten wurde.

Beispiel 7

Reinigung von α-hANP

E. coli W3110/pGEα97S, der in Beispiel 3 hergestellt wurde, wurde 18 Stunden bei 37ºC in einem 30 Liter Flaschenfermenter in 20 Litern eines Mediums, das 0,4 % Hefeextrakt, 0,4 % KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 % K&sub2;HPO&sub4;, 0,3 % Na&sub2;HPO&sub4;, 0,02 % NH&sub4;Cl, 0,12 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 % MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 1,5 % Glucose, 2 % Glycerin (4mal zugesetzt) (pH 7,0) enthielt und mit Tetracyclin versetzt war, gezüchtet, wobei belüftet und geschüttelt wurde. Mit der Kulturbrühe wurde zum Aufbrechen der Zellen eine Hochdruckhomogenisierung (Laborhomogenisator 15M-8TA von Manton Gaulin) mit 8 000 psi durchgeführt. Das Homogenisat wurde zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten, der das anschließend mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,3) gewaschene Fusionsprotein enthielt. Der gewaschene Niederschlag wurde in 8 M Harnstofflösung solubilisiert. Der Harnstofflösung wurden 27 mM Tris-HCl (pH 9,3) zugesetzt, um die Harnstoffkonzentration auf 5 M einzustellen. Diese Harnstofflösung wurde mit 40 AU (Amidase-Einheiten) API (Wako Junyaku, Japan) 60 Minuten bei 30ºC behandelt und das Reaktionsgemisch durch einen Kerzenfilter CWSC (Nippon Millipore Ltd.) filtriert.
Anschließend wurde das Filtrat durch eine Zeta-prep- QAE-Säule (Nippon Millipore Ltd.), die freigesetztes βgal97(Ser) und intaktes βgal97(Ser)αhANP über den βgal97(Ser)-Teil adsorbiert, chromatographiert. Eine freigesetztes Material enthaltende Eluatfraktion wurde erhalten und diese Fraktion durch Zugabe von Essigsäure auf einen pH- Wert von 5,0 eingestellt. Anschließend wurde die Fraktion auf eine CM-Toyopearl-650M-Säule, die mit 5 M Harnstoff in 10 mM Ammoniumformiat (pH 5,0) äquilibriert war, aufgetragen. α-hANP wurde schrittweise mit 225 mM NaCl und 400 mM NaCl eluiert, um eine α-hANP enthaltende Fraktion zu erhalten. Die α-hANP-Fraktian wurde zur Entsalzung auf eine SPW- C-ODS-Säule (Chemco) zur Flüssigkeitschromatographie mit einer mittleren Leistung (MPLC) (Murayama Kagaku) aufgetragen. Schließlich wurde durch C&sub1;&sub8;-HPLC das α-hANP gereinigt.
Das schließlich erhaltene α-hANP-Präparat lieferte in der unter Verwendung einer YMC-A-302OD5-Säule durchgeführten Umkehrphasen-HPLC (Waters) einen einzelnen Peak, wie es in Fig. 10 dargestellt ist. Die Aminosäurezusammensetzung des so erhaltenen α-hANP-Präparats, wie sie durch einen automatischen Aminosäure-Analysator (Hitachi Seisakusho, 835-50) ermittelt wurde, entsprach der aus der Aminosäuresequenz von α-hANP bestimmten. Ferner entsprach die Aminosäureseguenz des vorstehend beschriebenen α-hANP-Präparats, wie sie durch ein Gasphasen-Proteinsequenziergerät vom Modell 470A (Applied Biosystem) ermittelt wurde, der von α-hANP.
Ferner entsprach das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte α-hANP-Präparat einem chemisch synthetisierten α-hANP-Präparat (Peptide Research) im Hinblick auf die (1) natriuretische und blutdrucksenkende Wirkung in SD-Ratten, (2) Relaxationsaktivität im Rektalgewebe von Küken und (3) immunologische Kreuzreaktivität im Radio- Immuntest.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden etwa 5 g Fusionsprotein (etwa 1 g α-hANP) aus 1 Liter Kulturbrühe erhalten, und die Ausbeute nach der Gewinnung und Reinigung ist etwa 50 %, wenn reines α-hANP erhalten werden soll. Eine derartige hohe Produktivität und hohe Ausbeute sind sehr vorteilhaft bei der industriellen Produktion von α-hANP.
Es sei darauf hingewiesen, daß E. coli W3110/C&sub1;/PPLlacZ'97(Ser)αhANP, der das in Beispiel 5 konstruierte Plasmid pPLlacZ'97(Ser)αhANP enthielt, sowie E. coli W3110/pINlacZ'97(Ser)αhANP, der das in Beispiel 6 konstruierte Plasmid pINlacZ'97(Ser)αhANP enthielt, das Fusionsprotein βgal97(Ser)αhANP in einer Menge produzierten, die etwa 30 % der durch die Transformante insgesamt produzierten Proteine entsprach, und das Fusionsprotein aus der ausgefällten Fraktion isoliert wurde.

Beispiel 8

Plasmidkonstruktion

A. Konstruktion von pG97SHPCT aus nG97518

5 ug des Plasmids pGHα97SE wurden mit 12 Einheiten EcoRI und 80 Einheiten SalI in 100 ul S-Puffer vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (1) wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert und gereinigt. Ferner wurden 5 ug des Plasmids pGHα97SE mit 80 Einheiten SalI in 100 ul S-Puffer vollständig gespalten und das zweitgrößte DNA- Fragment (2), das eine Promotorregion des Tetracyclimresistenzgens enthielt, durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert und gereinigt. Getrennt davon wurde 1 ug des Plasmids pUC18 (Takara Shuzo) mit 12 Einheiten EcoRI and 80 Einheiten SalI in 100 ul S-Puffer vollständig gespalten und das Reaktionsgemisch mit Phenol behandelt, um das Enzym zu inaktivieren, und mit Ethanol extrahiert, um das Phenol und die Salze zu entfernen (3). Die vorstehend beschriebenen DNA- Fragmente (1), (2) und (3) wurden vermischt, ligiert, das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet und Tetracyclin-resistente Clone wurden erhalten. Der Clon wurde durch ein übliches Verfahren analysiert, wobei das Plasmid pG97S18 selektiert wurde, in dem ein EcoRI-SalI-DNA-Fragment, das das α-hANP-Gen in pGHα97SF codierte, durch ein EcoRI-SalI-DNA-Fragment einer Polylinkerregion von pUC18 mit der nachstehend dargestellten Formel
ersetzt war.

B. Konstruktion von pG97SHPCT

5 ug des Plasmids pG97S18 wurden mit 12 Einheiten EcoRI und 12 Einheiten BamHI in 50 ul H-Puffer vollständig gespalten und das größte DNA-Fragment (4) wurde durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt und gereinigt. Ferner wurden 5 ug des Plasmids pGH97S18 mit 12 Einheiten BamHI in 50 ul H-Puffer vollständig gespalten und ein DNA-Fragment (7), das einen Promotor des Tetracyclingens enthielt, wurde durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt und gereinigt. Ferner wurden 10 ug des Plasmids pAHPCT38 mit 12 Einheiten BamHI und 24 Einheiten KpnI in M-Puffer vollständig gespalten, und ein 81 bp-Kpnl-BamHI-DNA-Fragment (6), das die Aminosäuresequenz vom Tyr in Position 7 bis zum Pro in Position 32, bezogen auf den N-Terminus von Calcitonin, codierte, worauf Gly-Lys-Lys-Arg folgten, wurde durch Folyacrylamid-Gelelektrophorese abgetrennt und gereinigt. Getrennt davon wurde ein doppelsträngiges Oligonucleotid (7), das die nachstehend beschriebene Sequenz
ein überstehendes EcoRI-Ende und ein überstehendes KpnI-Ende aufwies, hergestellt. Die vorstehend beschriebenen DNA-Fragmente (4), (5), (6) und (7) wurden vermischt und ligiert und das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet, um Tetracyclin-resistente Clone zu erhalten. Diese Clone wurden durch ein übliches Verfahren analysiert, wobei das gewünschte Plasmid pG97SHPCT (Fig. 19) erhalten wurde.
Es soll darauf hingewiesen werden, daß das vorstehend beschriebene Plasmid pAHPCT38 in der japanischen nicht-geprüften Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 58-203953 genauer beschrieben ist, und der E. coli-Stamm, der das Plasmid pAHPCT38 enthält, d. h., Escherichia coli E15/pAHPCT38, am 10. Juni 1982 unter der Bezeichnung SBMC138 bei der FRI als FERM P-6523 hinterlegt und am 2. Mai 1983 zur internationalen Hinterlegung nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages in FERM BP-282 umbenannt wurden.

Beispiel 9

Reinigung des menschlichen Calcitonin-Vorläufers

E. coli W3110/pG97SHPCT, der mit dem vorstehend beschriebenen Plasmid pG97SHPCT transformiert worden war, wurde 16 Stunden bei 37ºC in einem Medium, das 0,5 % Glycerin, 2,4 % Hefeextrakt, 1,2 % Trypton und 100 mM Kaliumphosphat (pH 7,5) enthielt und mit Tetracyclin versetzt worden war, gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde anschließend zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu erhalten, die anschließend in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8) suspendiert und mit 8 000 psi mit einer "French-Press" (SLM- AMINCO) aufgebrochen wurden. Das aufgebrochene Material wurde 10 Minuten mit 1 000 g zentrifugiert, um sowohl einen Überstand als auch einen Niederschlag zu erhalten, die anschließend durch SDS-PAGE analysiert wurden. Es wurde festgestellt, daß βgal97SHPCT in etwa der gleichen Menge wie βgal97SαhANP produziert und wie βgal97SαhANP in der Niederschlagsfraktion gewonnen wurde. Der Niederschlag wurde in einer wäßrigen 8 M Harnstofflösung suspendiert und der Suspension wurden drei Volumina 67 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8) zugesetzt, um eine Konzentration von 2 M Harnstoff zu erhalten. Der verdünnten Suspension wurde Protease V&sub8; (Boehringer Mannheim) in einer auf das Substrat bezogenen Menge von 1/2000 (Gew./Gew.) zugesetzt und das Ganze 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Ein Aliquot des Reaktionsgemisches wurde durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von YMC-A302ODS (Shimazu) analysiert. Es wurde so festgestellt, daß unter den 10 in βgal97SHPCT vorhandenen Glutaminsäureresten eine Bindung am Glutaminsäurerest zwischen βgal97s und HPCT am leichtesten gespalten wird. Ferner wurde das Reaktionsgemisch einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer Zeta-Prep-QAE- Säule, die mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8), der 2 M Harnstoff enthielt, unterzogen, und so wurden etwa 100 % HPCT in einer Eluatfraktion mit einer Reinheit von etwa 95 % gewonnen.
βgal97S ist daher als ein Partnerprotein nicht nur zur Produktion von α-hANP, sondern auch zur Produktion des menschlichen Calcitonin-Vorläufers (HPCT) geeignet.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines physiologisch wirksamen cysteinhaltigen Zielpeptids, umfassend:

(1) Züchtung von Escherichia coli, der mit einem Plasmid transformiert ist, das unter der Kontrolle eines Promotors von E. coli oder von einem Phagen ein Fusionsprotein exprimieren kann, das die Formel

A-L-B

aufweist, wobei

B das Zielpeptid darstellt,

A ein cysteinfreies Partnerpolypeptid bedeutet, das 90 bis 220 Aminosäuren umfaßt, die einem N-terminalen Bereich von E. coli-β-Galactosidase entsprechen, wobei Nicht-Cystein-Aminosäurereste alle Cysteinstellen der nativen Sequenz ersetzen, und

L eine Aminosäureverknüpfung zwischen dem C-terminalen Ende des Partnerpolypeptids und dem N-terminalen Ende des Zielpeptids darstellt, die so ausgewählt ist, daß sie durch eine Protease spaltbar ist oder selektiv chemisch abbaubar ist, und nicht im Zielpeptid vorliegt;

(2) Aufbrechen der gezüchteten Zellen und Gewinnung einer unlöslichen Fraktion, die das Fusionsprotein enthält;

(3) Solubilisierung des Fusionsproteins mit einem Solubilisierungsmittel, Behandlung des solubilisierten Fusionsproteins mit der Protease oder einem geeigneten chemischen Stoff, um das Zielpeptid freizusetzen, und Isolierung des Zielpeptids.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Serin der Ersatz an den Cysteinstellen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Partnerpolypeptid Glutaminsäure-Phenylalanin oder Glutamin-Phenylalanin umfaßt, in Ergänzung zu der Sequenz, die E. coli-β-Galactosidase entspricht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aminosäureverknüpfung Lysin und die Protease Lysylendopeptidase ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aminosäureverknüpfung Arginin und die Protease Clostripain ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aminosäureverknüpfung Glutaminsäure und die Protease Protease V&sub8; ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aminosäureverknüpfung Methionin und der geeignete chemische Stoff zu ihrem Abbau Bromcyan ist.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Zielpeptid ein menschliches atriales Peptid mit natriuretischer Wirkung ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Zielpeptid ein menschliches atriales natriuretisches Polypeptid vom α-Typ (α-hANP) mit der folgenden Struktur ist:

in der (1) direkt an (2) gebunden ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Zielpeptid HPCT mit der folgenden Struktur ist:

in der (1) direkt an (2) und (3) direkt an (4) gebunden ist.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Partnerpolypeptid aus (i) Aminosäuren, die den Aminosäuren 1 bis 210 des N-terminalen Bereichs von E. coli-β-Galactosidase entsprechen, wobei Nicht-Cystein- Aminosäuren die Cysteinreste an den Positionen 76, 122 und 154 der nativen Sequenz ersetzen, und (ii) zwei oder drei zusätzlichen Aminosäureresten besteht.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Partnerpolypeptid aus (i) Aminosäuren, die den Aminosäuren 1 bis 97 des N-terminalen Bereichs von E. coli-β-Galactosidase entsprechen, wobei Nicht-Cystein-Aminosäuren den Cysteinrest in Position 76 der nativen Sequenz ersetzen, und (ii) zwei oder drei zusätzlichen Aminosäureresten besteht.

13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Promotor ausgewählt ist aus dem vom E. coli-Lactosegen stammenden Promotor, dem vom Phagen abstammenden Promotor und dem Ipp-Promotor, der vom Lipoprotein der äußeren Membran von E. coli stammt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Plasmid ein Plasmid ist, das erhältlich ist vom Plasmid pGHα1007 (FERM BP- 1748) und dem Plasmid pBR322 durch ein Verfahren, umfassend

(1) (a) Spaltung des Plasmids pGHα1007 mit EcoRI und AatII und Ligierung der EcoRI- und AatII- Stellen, so daß man ein Plasmid erhält, das DNA enthält, die ein Fusionsprotein mit einem 210 Aminosäuren umfassenden Anteil vom N-terminalen Bereich der β-Galactosidase codiert, und

(b) Spaltung des Plasmids, das die Fusionsprotein- DNA enthält, mit EcoRV und Auswahl des zweitgrößten erhaltenen DNA-Fragments, das die Fusionsprotein-DNA enthält;

(2) (a) Spaltung des Plasmids pBR322 mit BalI und PvuII und Ligierung der entsprechenden Stellen des größten erhaltenen DNA-Fragments, so daß man ein modifiziertes pBR322 erhält, dem das 622bp große PvuII-BalI-Fragment fehlt;

(b) Spaltung des modifizierten pBR322 mit EcoRV und DraI und Auswahl des größten erhaltenen DNA- Fragments mit einem Replikationsursprung;

(3) Ligierung der Fragmente von (1) (b) und (2) (b), so daß man ein Plasmid erhält, das DNA enthält, die das Fusionsprotein codiert und keinen Bereich für die Replikation des Plasmids aufweist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das plasmid pGHα97(Ser)rop&supmin; (FERM BP-1253) ist.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielpeptid (α-hANP) die folgende Formel aufweist:

(in der (1) und (2) direkt gebunden sind) und das Plasmid ein Plasmid ist, das vom plasmid pGHα97(Ser)rop&supmin; (FERM BP-1253) erhältlich ist, welches das Strukturgen für α-hANP enthält, durch Insertion eines Tryptophanoperon-Attenuators unmittelbar stromabwärts vom α-hANP-Strukturgen.