JPH0687788B2 - システイン残基を含有する生理活性ペプチドの製造方法 - Google Patents
システイン残基を含有する生理活性ペプチドの製造方法Info
- Publication number
- JPH0687788B2 JPH0687788B2 JP63049723A JP4972388A JPH0687788B2 JP H0687788 B2 JPH0687788 B2 JP H0687788B2 JP 63049723 A JP63049723 A JP 63049723A JP 4972388 A JP4972388 A JP 4972388A JP H0687788 B2 JPH0687788 B2 JP H0687788B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- peptide
- fusion protein
- residue
- αhanp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、システイン残基を含有する生理活性ペプチド
（本発明において目的ペプチドと称する場合がある）の
製造方法に関する。
（本発明において目的ペプチドと称する場合がある）の
製造方法に関する。
これまで、組換えDNA技術を用いて、真核生物由来の生
理活性ペプチドまたは蛋白質を大腸菌等の微生物で生産
させようとする試みが多くなされている。
理活性ペプチドまたは蛋白質を大腸菌等の微生物で生産
させようとする試みが多くなされている。
例えば、大腸菌等の微生物内で分解を受け易い比較的分
子量の小さいペプチドを生産しようとする場合、目的と
するペプチドを他の蛋白質又はポリペプチドとの融合蛋
白として生産させた後、化学的あるいは酵素的な処理を
行い、その融合蛋白から目的とするペプチドを切り出し
精製する方法が、一般に用いられている。
子量の小さいペプチドを生産しようとする場合、目的と
するペプチドを他の蛋白質又はポリペプチドとの融合蛋
白として生産させた後、化学的あるいは酵素的な処理を
行い、その融合蛋白から目的とするペプチドを切り出し
精製する方法が、一般に用いられている。
融合蛋白から目的のペプチドを切り出す方法としては、
目的のペプチドがメチオニン残基を含まない場合には、
目的ペプチドをメチオニン残基を介した融合蛋白として
生産した後、臭化シアン（CNBr）処理によりメチオニン
残基を開裂させて目的のペプチドを切り出す方法（Scie
nce198、1059（1977）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76、
106（1978））が用いられており、目的のペプチドにア
ルギニン（Arg）やリジン（Lys）残基を含まない場合に
は、アルギニンやリジン残基のＣ末端（カルボキシ末
端）を特異的に切断するトリプシン処理で目的のペプチ
ドを切り出す方法（Nature、285、456（1980））などが
用いられている。また、リジン残基のＣ末端を特異的に
切断する酵素（リシルエンドペプチダーゼ）として知ら
れているアクロモバクター（Achromobacter）プロテア
ーゼＩ（以下APIと略す：特公昭54-135789参照）も、場
合により目的ペプチドの切り出しに用いることができ
る。
目的のペプチドがメチオニン残基を含まない場合には、
目的ペプチドをメチオニン残基を介した融合蛋白として
生産した後、臭化シアン（CNBr）処理によりメチオニン
残基を開裂させて目的のペプチドを切り出す方法（Scie
nce198、1059（1977）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76、
106（1978））が用いられており、目的のペプチドにア
ルギニン（Arg）やリジン（Lys）残基を含まない場合に
は、アルギニンやリジン残基のＣ末端（カルボキシ末
端）を特異的に切断するトリプシン処理で目的のペプチ
ドを切り出す方法（Nature、285、456（1980））などが
用いられている。また、リジン残基のＣ末端を特異的に
切断する酵素（リシルエンドペプチダーゼ）として知ら
れているアクロモバクター（Achromobacter）プロテア
ーゼＩ（以下APIと略す：特公昭54-135789参照）も、場
合により目的ペプチドの切り出しに用いることができ
る。
目的のペプチドとの融合の相手となるポリペプチド（本
発明においては付加ポリペプチドと称する場合がある）
には、用いる宿主微生物が本来的に生産する蛋白質の断
片がよく用いられている。この場合、通常、用いる宿主
微生物で高生産する蛋白質のＮ末端（アミノ末端）から
の適当な大きさ（長さ）をもつポリペプチド断片が用い
られているが、そのポリペプチド断片の大きさが、目的
のペプチドの生産性に影響を及ぼすことが考えられる。
例えば、該付加ポリペプチド領域を小さく（短かく）し
て融合蛋白質に対する目的のペプチドの割合をふやして
生産性を向上させることが考えられるが、必ずしも該ポ
リペプチド領域を小さくしても目的ペプチドの生産性が
向上するとは限らない。例えば、大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼを融合蛋白の相手として使用するインスリン生産
の場合、β−ガラクトシダーゼ領域の縮小により、目的
のペプチドの生産量が一旦上昇するが、さらに小さくす
ると生産量が低下することが報告されている（Gene、2
9、251（1984））。このように、融合蛋白としてある特
定のペプチドを生産しようとする場合、融合の相手とな
るポリペプチドがどれくらいの大きさであればよいかと
いう定説はない。
発明においては付加ポリペプチドと称する場合がある）
には、用いる宿主微生物が本来的に生産する蛋白質の断
片がよく用いられている。この場合、通常、用いる宿主
微生物で高生産する蛋白質のＮ末端（アミノ末端）から
の適当な大きさ（長さ）をもつポリペプチド断片が用い
られているが、そのポリペプチド断片の大きさが、目的
のペプチドの生産性に影響を及ぼすことが考えられる。
例えば、該付加ポリペプチド領域を小さく（短かく）し
て融合蛋白質に対する目的のペプチドの割合をふやして
生産性を向上させることが考えられるが、必ずしも該ポ
リペプチド領域を小さくしても目的ペプチドの生産性が
向上するとは限らない。例えば、大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼを融合蛋白の相手として使用するインスリン生産
の場合、β−ガラクトシダーゼ領域の縮小により、目的
のペプチドの生産量が一旦上昇するが、さらに小さくす
ると生産量が低下することが報告されている（Gene、2
9、251（1984））。このように、融合蛋白としてある特
定のペプチドを生産しようとする場合、融合の相手とな
るポリペプチドがどれくらいの大きさであればよいかと
いう定説はない。
以上、組換えDNA技術を用いてペプチドを生産する一般
方法について述べたが、この製造法で一番重要な点はい
かにして目的ペプチドに最適な付加ポリペプチドを選定
し、目的ペプチドを融合蛋白質として効率良く発現させ
目的ペプチドを融合蛋白質から回収するかである。しか
し、この点に関しては現在の技術では一般法は確立して
おらず、個々の目的ペプチドにおいて最適化せざるをえ
ない。
方法について述べたが、この製造法で一番重要な点はい
かにして目的ペプチドに最適な付加ポリペプチドを選定
し、目的ペプチドを融合蛋白質として効率良く発現させ
目的ペプチドを融合蛋白質から回収するかである。しか
し、この点に関しては現在の技術では一般法は確立して
おらず、個々の目的ペプチドにおいて最適化せざるをえ
ない。
以下、システイン残基を含有する生理活性ペプチド（目
的ペプチド）製造方法の対象として、α‐type human a
trial natriurctic poly peptide（以下α−hANPと略
す）及びhuman calcitonin precursor（以下HPCTと略
す）を示し、これらペプチドの組換えDNA技術を用いて
の製造方法における問題点をより具体的に述べる。
的ペプチド）製造方法の対象として、α‐type human a
trial natriurctic poly peptide（以下α−hANPと略
す）及びhuman calcitonin precursor（以下HPCTと略
す）を示し、これらペプチドの組換えDNA技術を用いて
の製造方法における問題点をより具体的に述べる。
α−hANP、次の式（Ｉ）： （このアミノ酸配列において（１）と（２）は直接つな
がっている）で表わされる28個のアミノ酸残基からなる
ペプチドで、７位と23位に存在する２個のシステイン残
基は分子内で−Ｓ−Ｓ−結合（ジスルフィド結合）を形
成している。α−hANPは松尾・寒川らによりヒト心房よ
り抽出・精製され、その構造が明らかにされ又このペプ
チドは顕著なナトリウム利尿作用や血圧降下作用を有し
ていることが判っている（Biochem.Biophys.Res.Commu
n.118,131〜139,1984）。
がっている）で表わされる28個のアミノ酸残基からなる
ペプチドで、７位と23位に存在する２個のシステイン残
基は分子内で−Ｓ−Ｓ−結合（ジスルフィド結合）を形
成している。α−hANPは松尾・寒川らによりヒト心房よ
り抽出・精製され、その構造が明らかにされ又このペプ
チドは顕著なナトリウム利尿作用や血圧降下作用を有し
ていることが判っている（Biochem.Biophys.Res.Commu
n.118,131〜139,1984）。
一方、HPCTは次の式（II）： 〔このアミノ酸配列において（１）と（２）及び（３）
と（４）は直接つながっている〕で表わされる36個のア
ミノ酸残基から成るペプチドで、１位と７位に存在する
２個のシステイン残基は分子内で−Ｓ−Ｓ−結合（ジス
ルフィド結合）を形成している。
と（４）は直接つながっている〕で表わされる36個のア
ミノ酸残基から成るペプチドで、１位と７位に存在する
２個のシステイン残基は分子内で−Ｓ−Ｓ−結合（ジス
ルフィド結合）を形成している。
HPCTはヒト・カルシトニン（式IIで示される１〜32位の
アミノ酸配列を有し、そのＣ末端Proのα位カルボキシ
ル基はアミド化されている。）が生成合される過程の中
間体として知られている（Nature295,345-347）。
アミノ酸配列を有し、そのＣ末端Proのα位カルボキシ
ル基はアミド化されている。）が生成合される過程の中
間体として知られている（Nature295,345-347）。
現在、これらのペプチドはいずれも化学合成により製造
されうるが、大量に最終精製品を得るには多くの労力と
時間を要する。したがって、特にこれらのペプチドを医
薬品に応用する場合、より簡便で大量に、しかも安価に
製造する方法の確立が強く望まれる。
されうるが、大量に最終精製品を得るには多くの労力と
時間を要する。したがって、特にこれらのペプチドを医
薬品に応用する場合、より簡便で大量に、しかも安価に
製造する方法の確立が強く望まれる。
最近、この問題を解決する方法として、組換えDNA技術
を用いてこれらのペプチドを製造しようとする試みもな
されている。例えばαhANPにおいては、αhANPを320〜3
40個のアミノ酸残基から成る大腸菌TrpE蛋白との融合蛋
白として発現させ、菌体破砕液から粗抽出した融合蛋白
をリシルエンドペプチダーゼや血液凝固因子ファクター
Xaで処理して、融合蛋白からαANPを遊離させている
（昭和60年生化学会大会要旨：生化学57（８）、854（1
984））。しかしながら、この方法は精製行程が複雑
で、融合蛋白質からの目的ペプチドの回収率も悪く、α
hANPの実質的製造法とは言えない。さらに、本発明者等
は先に、αhANPで代表されるリジン残基を含有しない生
理活性ペプチドを製造するに当り、目的とする生理活性
ペプチドの融合の相手ポリペプチドとしてリジン残基を
含有しない90〜220個のアミノ酸残基からなるポリペプ
チドを用い、これらを、リジン残基を介して目的ペプチ
ドと連結させた融合蛋白として発現させ、次にこれらを
リシルエンドペプチダーゼにより水解することにより、
目的の生理活性ペプチドをより効率的に製造することを
見出した（特願昭61-101100号）。しかしながら、この
ような改良された方法においても、最初に発現させた融
合蛋白から目的ペプチドを回収する効率はかならずしも
満足できるものではなかった。
を用いてこれらのペプチドを製造しようとする試みもな
されている。例えばαhANPにおいては、αhANPを320〜3
40個のアミノ酸残基から成る大腸菌TrpE蛋白との融合蛋
白として発現させ、菌体破砕液から粗抽出した融合蛋白
をリシルエンドペプチダーゼや血液凝固因子ファクター
Xaで処理して、融合蛋白からαANPを遊離させている
（昭和60年生化学会大会要旨：生化学57（８）、854（1
984））。しかしながら、この方法は精製行程が複雑
で、融合蛋白質からの目的ペプチドの回収率も悪く、α
hANPの実質的製造法とは言えない。さらに、本発明者等
は先に、αhANPで代表されるリジン残基を含有しない生
理活性ペプチドを製造するに当り、目的とする生理活性
ペプチドの融合の相手ポリペプチドとしてリジン残基を
含有しない90〜220個のアミノ酸残基からなるポリペプ
チドを用い、これらを、リジン残基を介して目的ペプチ
ドと連結させた融合蛋白として発現させ、次にこれらを
リシルエンドペプチダーゼにより水解することにより、
目的の生理活性ペプチドをより効率的に製造することを
見出した（特願昭61-101100号）。しかしながら、この
ような改良された方法においても、最初に発現させた融
合蛋白から目的ペプチドを回収する効率はかならずしも
満足できるものではなかった。
一方、HPCTの組換えDNA技術を用いる製造法に関して
は、本発明者等により、HPCTの誘導体〔式（II）で示さ
れるHPCTのアミノ酸配列で８位メチオニン残基がバリン
残基に変換した誘導体〕に関する製造法が報告されてい
る（特開昭58-203953）。この製造法においてはまず目
的ペプチドを大腸菌アルカリホスファターゼとの融合蛋
白質として発現させた後、この融合蛋白質を臭化シアン
処理することにより、目的ペプチドを得ている。しかし
ながら、この方法においても先に述べたαhANP製造法と
同様、最初に発現させた融合蛋白から、目的ペプチドを
回収する効率はかならずしも満足できるものではなかっ
た。一方、これらの例に対し、一般にシステイン残基を
含有しないペプチドの組換えDNA技術による製造におい
ては、融合蛋白質から目的ペプチドを回収する効率はシ
ステイン残基を含有するペプチドのそれに比べ良いこと
が知られている。したがって、組換えDNA技術を用いシ
ステイン残基を含有するペプチドを効率良く製造するた
めには、いかにして融合蛋白質から目的ペプチドを効率
良く回収するかが問題となっており、現在、この点に関
する解決策が望まれている。
は、本発明者等により、HPCTの誘導体〔式（II）で示さ
れるHPCTのアミノ酸配列で８位メチオニン残基がバリン
残基に変換した誘導体〕に関する製造法が報告されてい
る（特開昭58-203953）。この製造法においてはまず目
的ペプチドを大腸菌アルカリホスファターゼとの融合蛋
白質として発現させた後、この融合蛋白質を臭化シアン
処理することにより、目的ペプチドを得ている。しかし
ながら、この方法においても先に述べたαhANP製造法と
同様、最初に発現させた融合蛋白から、目的ペプチドを
回収する効率はかならずしも満足できるものではなかっ
た。一方、これらの例に対し、一般にシステイン残基を
含有しないペプチドの組換えDNA技術による製造におい
ては、融合蛋白質から目的ペプチドを回収する効率はシ
ステイン残基を含有するペプチドのそれに比べ良いこと
が知られている。したがって、組換えDNA技術を用いシ
ステイン残基を含有するペプチドを効率良く製造するた
めには、いかにして融合蛋白質から目的ペプチドを効率
良く回収するかが問題となっており、現在、この点に関
する解決策が望まれている。
従って本発明は、システイン残基を含有する生理活性ペ
プチドを効率的に大量生産することができる方法を提供
しようとするものであり、特に、本発明においては、こ
れらのペプチドに最適な付加ペプチドの選定に関する方
法を提供しようとするものである。
プチドを効率的に大量生産することができる方法を提供
しようとするものであり、特に、本発明においては、こ
れらのペプチドに最適な付加ペプチドの選定に関する方
法を提供しようとするものである。
本発明者等は、前記の問題点の解決方法を種々検討した
結果、目的ペプチドと付加ペプチドが共にシステインを
含有する場合に目的ペプチドの回収率が若干低くなるの
は、目的ペプチド中のシステインと付加ポリペプチド中
のシステインとの間にジスルフィド結合が形成されるた
めであることを初めて実験的に明らかにし、システイン
残基を含有しない付加ポリペプチドを用いることにより
前記の問題点が解決されると言う全く新しい知見を得、
この知見に基いてこの発明を完成した。
結果、目的ペプチドと付加ペプチドが共にシステインを
含有する場合に目的ペプチドの回収率が若干低くなるの
は、目的ペプチド中のシステインと付加ポリペプチド中
のシステインとの間にジスルフィド結合が形成されるた
めであることを初めて実験的に明らかにし、システイン
残基を含有しない付加ポリペプチドを用いることにより
前記の問題点が解決されると言う全く新しい知見を得、
この知見に基いてこの発明を完成した。
従って本発明は、システイン残基を含有する生理活性ペ
プチド（目的ペプチド）の製造方法であって、 Ａ）次の式で表わされる融合蛋白質： A-L-B 〔式中、 Ｂは目的ペプチドであって、次の式（Ｉ）： で表されるアミノ酸配列を有するペプチド（αhANP）で
あるか、あるいは次の式（II）： 〔このアミノ酸配列において（１）と（２）、及び
（３）と（４）は直接つながっている〕 で表わされるアミノ酸配列を有するヒトカルシトニン前
駆体であり； Ａは、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ−末端の90〜22
0個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであって、そ
れに含まれる生来のシステイン残基が他のアミノ酸残基
に置き換えられているもの（付加ポリペプチド）であ
り；そして Ｌは、該付加ポリペプチドのＣ−末端と該目的ペプチド
のＮ−末端との間に位置するアミノ酸残基（リンカー）
であり、該リンカーアミノ酸残基は該目的ポリペプチド
中には存在せず、且つ該融合蛋白質を酵素又は化学物質
により処理した場合に前記目的ペプチドが切り離される
様に選択されたものである〕 を大腸菌由来のプロモーターまたはファージ遺伝子由来
のプロモーターの支配下に発現することができるプラス
ミドにより形質転換された大腸菌を培養し、 Ｂ）該大腸菌形質転換体の培養菌体を破砕して不溶性画
分を得、次にこの不溶性画分を可溶化剤で処理すること
により前記融合蛋白質を可溶化し、そして Ｃ）該可溶化された融合蛋白質を、前記リンカーアミノ
酸残基のＣ−末端と前記目的ペプチドのＮ−末端との間
のペプチド結合を切断することができる酵素により処理
するか、又は前記リンカーアミノ酸残基を分解すること
ができる化学物質により処理することにより、前記目的
ペプチドを他のポリペプチドから切り離し、そして該目
的ペプチドを採取する、ことを特徴とする方法を提供す
るものである。
プチド（目的ペプチド）の製造方法であって、 Ａ）次の式で表わされる融合蛋白質： A-L-B 〔式中、 Ｂは目的ペプチドであって、次の式（Ｉ）： で表されるアミノ酸配列を有するペプチド（αhANP）で
あるか、あるいは次の式（II）： 〔このアミノ酸配列において（１）と（２）、及び
（３）と（４）は直接つながっている〕 で表わされるアミノ酸配列を有するヒトカルシトニン前
駆体であり； Ａは、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ−末端の90〜22
0個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであって、そ
れに含まれる生来のシステイン残基が他のアミノ酸残基
に置き換えられているもの（付加ポリペプチド）であ
り；そして Ｌは、該付加ポリペプチドのＣ−末端と該目的ペプチド
のＮ−末端との間に位置するアミノ酸残基（リンカー）
であり、該リンカーアミノ酸残基は該目的ポリペプチド
中には存在せず、且つ該融合蛋白質を酵素又は化学物質
により処理した場合に前記目的ペプチドが切り離される
様に選択されたものである〕 を大腸菌由来のプロモーターまたはファージ遺伝子由来
のプロモーターの支配下に発現することができるプラス
ミドにより形質転換された大腸菌を培養し、 Ｂ）該大腸菌形質転換体の培養菌体を破砕して不溶性画
分を得、次にこの不溶性画分を可溶化剤で処理すること
により前記融合蛋白質を可溶化し、そして Ｃ）該可溶化された融合蛋白質を、前記リンカーアミノ
酸残基のＣ−末端と前記目的ペプチドのＮ−末端との間
のペプチド結合を切断することができる酵素により処理
するか、又は前記リンカーアミノ酸残基を分解すること
ができる化学物質により処理することにより、前記目的
ペプチドを他のポリペプチドから切り離し、そして該目
的ペプチドを採取する、ことを特徴とする方法を提供す
るものである。
本発明は、α‐hANP及びHPCTの製造方法に関する。
目的の生理活性ペプチドの融合の相手方ポリペプチド
（付加ポリペプチド）としては、例えば、天然ポリペプ
チド又はその部分に対応し、該天然ポリペプチド又はそ
の部分にシステイン残基が含まれる場合には該システイ
ン残基が他のアミノ酸残基により置き換えられており、
そして場合によってはさらに１個又は複数個のアミノ酸
残基が付加されたものを挙げることができ、例えば大腸
菌β−ガラクトシダーゼ蛋白質のＮ末端側の90〜220個
のアミノ酸残基から成るポリペプチドを挙げることがで
きる。具体例として、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ
末端から210位のアミノ酸残基までのポリペプチドと２
個の追加のアミノ酸残基、例えばグルタミン酸及びフェ
ニルアラニンとから成る付加ペプチド、及び大腸菌のβ
−ガラクトシダーゼのＮ末端から97位のアミノ酸残基ま
でのポリペプチドと２個の追加のアミノ酸残基、例えば
グルタミン及びフェニルアラニンとからなる付加ペプチ
ド、さらには大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端か
ら97位のアミノ酸残基までのポリペプチドと３個の追加
のアミノ酸残基、例えばグルタミン酸、フェニルアラニ
ン及びロイシンとからなる付加ペプチド、を挙げること
ができる。これらの追加のアミノ酸残基は、例えば遺伝
子操作においてリンカーDNAに対応するアミノ酸又はペ
プチドとして導入される。90〜220個のアミノ酸残基か
ら成るポリペプチドが好ましいことは、本発明者等によ
りすでに見出されている（特願昭61-101100号）。しか
しながら、このペプチド領域にはシステイン残基が含ま
れているから、これを除去するか又は他のアミノ酸と置
き換えなければならない。これはプライマーを用いる部
位特異的変異により容易に実施することができる。シス
テインに代るアミノ酸としては特に限定されないが、リ
ジンは好ましくなく、例えばセリンを用いるのが好まし
い。大腸菌β−ガラクトシダーゼ蛋白質由来のポリペプ
チド領域には天然形態においてはリジン残基が存在しな
いため、融合蛋白質をリシルエンドペプチダーゼにより
切断する場合に該ポリペプチドが細断されず、このため
目的のペプチドの単離・精製が極めて容易になるという
追加の利点が得られる。
（付加ポリペプチド）としては、例えば、天然ポリペプ
チド又はその部分に対応し、該天然ポリペプチド又はそ
の部分にシステイン残基が含まれる場合には該システイ
ン残基が他のアミノ酸残基により置き換えられており、
そして場合によってはさらに１個又は複数個のアミノ酸
残基が付加されたものを挙げることができ、例えば大腸
菌β−ガラクトシダーゼ蛋白質のＮ末端側の90〜220個
のアミノ酸残基から成るポリペプチドを挙げることがで
きる。具体例として、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ
末端から210位のアミノ酸残基までのポリペプチドと２
個の追加のアミノ酸残基、例えばグルタミン酸及びフェ
ニルアラニンとから成る付加ペプチド、及び大腸菌のβ
−ガラクトシダーゼのＮ末端から97位のアミノ酸残基ま
でのポリペプチドと２個の追加のアミノ酸残基、例えば
グルタミン及びフェニルアラニンとからなる付加ペプチ
ド、さらには大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端か
ら97位のアミノ酸残基までのポリペプチドと３個の追加
のアミノ酸残基、例えばグルタミン酸、フェニルアラニ
ン及びロイシンとからなる付加ペプチド、を挙げること
ができる。これらの追加のアミノ酸残基は、例えば遺伝
子操作においてリンカーDNAに対応するアミノ酸又はペ
プチドとして導入される。90〜220個のアミノ酸残基か
ら成るポリペプチドが好ましいことは、本発明者等によ
りすでに見出されている（特願昭61-101100号）。しか
しながら、このペプチド領域にはシステイン残基が含ま
れているから、これを除去するか又は他のアミノ酸と置
き換えなければならない。これはプライマーを用いる部
位特異的変異により容易に実施することができる。シス
テインに代るアミノ酸としては特に限定されないが、リ
ジンは好ましくなく、例えばセリンを用いるのが好まし
い。大腸菌β−ガラクトシダーゼ蛋白質由来のポリペプ
チド領域には天然形態においてはリジン残基が存在しな
いため、融合蛋白質をリシルエンドペプチダーゼにより
切断する場合に該ポリペプチドが細断されず、このため
目的のペプチドの単離・精製が極めて容易になるという
追加の利点が得られる。
本発明方法においては、目的生理活性ペプチドのＮ末端
が付加ポリペプチドのＣ末端にリンカーアミノ酸残基を
解して連結された融合蛋白質として該目的ペプチドを発
現せしめる。このリンカーアミノ酸としては、例えばリ
ジン、アルギニン、グルタミン酸、メチオニン等を挙げ
ることができる。このリンカーアミノ酸がリジンである
場合、目的ペプチドと該リジンとの間の結合をリシルエ
ンドペプチダーゼにより切断し、目的ペプチドを遊離せ
しめる。また、リンカーアミノ酸がアルギニンである場
合には、目的ペプチドと該アルギニンとの間の結合を例
えばクロストリパインにより切断し、目的ペプチドを遊
離せしめる。また、リンカーアミノ酸がグルタミン酸で
ある場合には、目的ペプチドと該グルタミン酸との間の
結合を、例えばV8プロテアーゼにより切断し、目的ペプ
チドを遊離せしめる。さらに、リンカーアミノ酸がメチ
オニンである場合、臭化シアンによって該メチオニンを
分解することにより目的ペプチドを遊離せしめる。
が付加ポリペプチドのＣ末端にリンカーアミノ酸残基を
解して連結された融合蛋白質として該目的ペプチドを発
現せしめる。このリンカーアミノ酸としては、例えばリ
ジン、アルギニン、グルタミン酸、メチオニン等を挙げ
ることができる。このリンカーアミノ酸がリジンである
場合、目的ペプチドと該リジンとの間の結合をリシルエ
ンドペプチダーゼにより切断し、目的ペプチドを遊離せ
しめる。また、リンカーアミノ酸がアルギニンである場
合には、目的ペプチドと該アルギニンとの間の結合を例
えばクロストリパインにより切断し、目的ペプチドを遊
離せしめる。また、リンカーアミノ酸がグルタミン酸で
ある場合には、目的ペプチドと該グルタミン酸との間の
結合を、例えばV8プロテアーゼにより切断し、目的ペプ
チドを遊離せしめる。さらに、リンカーアミノ酸がメチ
オニンである場合、臭化シアンによって該メチオニンを
分解することにより目的ペプチドを遊離せしめる。
リジン残基又はグルタミン酸残基を介して形成された融
合蛋白は、付加ポリペプチド、例えばβ‐gal断片、を
コードするDNA配列と目的ペプチドをコードするDNA配列
との間に、翻訳開始コドンからの読み枠が合うようにデ
ザインされたリジン又はグルタミン酸のコドンを含む合
成リンカー（二重鎖DNA）を挿入した遺伝子を発現させ
ることにより得られる。この場合、該リンカーは、リジ
ン又はグルタミン酸のコドンのすぐ下流に目的ペプチド
のＮ末端の一部のアミノ酸配列をコードするDNA配列を
有し、両端には連結しやすい塩基配列、例えば適当な制
限酵素サイトを含んでいるのが好ましい。
合蛋白は、付加ポリペプチド、例えばβ‐gal断片、を
コードするDNA配列と目的ペプチドをコードするDNA配列
との間に、翻訳開始コドンからの読み枠が合うようにデ
ザインされたリジン又はグルタミン酸のコドンを含む合
成リンカー（二重鎖DNA）を挿入した遺伝子を発現させ
ることにより得られる。この場合、該リンカーは、リジ
ン又はグルタミン酸のコドンのすぐ下流に目的ペプチド
のＮ末端の一部のアミノ酸配列をコードするDNA配列を
有し、両端には連結しやすい塩基配列、例えば適当な制
限酵素サイトを含んでいるのが好ましい。
β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の入手源とし
ては、例えば1acプロモーターのもとにβ−ガラクトシ
ダーゼの遺伝子を含有するプラスミドｐαNE2を使用す
ることができる。また、目的の生理活性ペプチドとして
のα‐hANPをコードする遺伝子の入手源としては、α‐
hANPの前駆体であるγ‐hANPをコードする遺伝子を含有
するプラスミドpS224-3を用いることができる。さら
に、HPCTをコードする遺伝子の作製にはプラスミドpAHP
CT38を用いることができる。
ては、例えば1acプロモーターのもとにβ−ガラクトシ
ダーゼの遺伝子を含有するプラスミドｐαNE2を使用す
ることができる。また、目的の生理活性ペプチドとして
のα‐hANPをコードする遺伝子の入手源としては、α‐
hANPの前駆体であるγ‐hANPをコードする遺伝子を含有
するプラスミドpS224-3を用いることができる。さら
に、HPCTをコードする遺伝子の作製にはプラスミドpAHP
CT38を用いることができる。
融合蛋白遺伝子を高発現させるためのプロモーターとし
ては、大腸菌或いはファージで高生産できる蛋白質の遺
伝子のプロモーターであれば限定はされないが、本発明
では、特に大腸菌ラクトース遺伝子由来のプロモーター
（1ac）、外膜リポタンパク質遺伝子由来の1ppプロモー
ター、或いはλファージ遺伝子由来のPLプロモーターが
好ましい。これらのプロモーター領域は、公知のプラス
ミドから通常の遺伝子組換え手法により容易に得ること
ができる。例えば、本発明ではPLプロモーターは、pPLl
acZ′210αhANPから（第８図参照）、1ppプロモーター
はpIN5T4（第９図参照）から容易に導入することができ
る。これらのプラスミドについては各々特願昭61-10110
0号、及び特開昭61-132186に記載され、pPLlacZ′210α
hANPの材料となるプラスミドpS20が組込まれた大腸菌
（N4830/pS20）は、微工研条菌第535号（FERM BP-535）
として、pIN5T4の材料となるプラスミドpINI-A2が組込
まれた大腸菌（JA221/pINI-A2）は微工研条寄第320号
（FERM-BP320）として、各々工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。
ては、大腸菌或いはファージで高生産できる蛋白質の遺
伝子のプロモーターであれば限定はされないが、本発明
では、特に大腸菌ラクトース遺伝子由来のプロモーター
（1ac）、外膜リポタンパク質遺伝子由来の1ppプロモー
ター、或いはλファージ遺伝子由来のPLプロモーターが
好ましい。これらのプロモーター領域は、公知のプラス
ミドから通常の遺伝子組換え手法により容易に得ること
ができる。例えば、本発明ではPLプロモーターは、pPLl
acZ′210αhANPから（第８図参照）、1ppプロモーター
はpIN5T4（第９図参照）から容易に導入することができ
る。これらのプラスミドについては各々特願昭61-10110
0号、及び特開昭61-132186に記載され、pPLlacZ′210α
hANPの材料となるプラスミドpS20が組込まれた大腸菌
（N4830/pS20）は、微工研条菌第535号（FERM BP-535）
として、pIN5T4の材料となるプラスミドpINI-A2が組込
まれた大腸菌（JA221/pINI-A2）は微工研条寄第320号
（FERM-BP320）として、各々工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。
融合蛋白は、その遺伝子の直後にトリプトファンオペロ
ンのアテニュエーターターミネーター（以下trp aと略
す）を挿入することによりさらに高発現させることがで
きる。例えば、実施例に示すように（第４図参照）1ac
プロモーター支配下に融合蛋白を発現するプラスミド p
GHα97（Ser）rop-のαhANP遺伝子の直後にtrp aを挿入
することにより（pGHα97S）、目的とする融合蛋白の生
産性を大巾に向上させることができる。
ンのアテニュエーターターミネーター（以下trp aと略
す）を挿入することによりさらに高発現させることがで
きる。例えば、実施例に示すように（第４図参照）1ac
プロモーター支配下に融合蛋白を発現するプラスミド p
GHα97（Ser）rop-のαhANP遺伝子の直後にtrp aを挿入
することにより（pGHα97S）、目的とする融合蛋白の生
産性を大巾に向上させることができる。
目的の生理活性ペプチドをコードする遺伝子は化学的に
合成してもよいし、そのペプチド（或いは、そのペプチ
ドの前駆体）を産生している細胞から得られるmRNAを逆
転写してつくられるcDNAを用いてもよい。
合成してもよいし、そのペプチド（或いは、そのペプチ
ドの前駆体）を産生している細胞から得られるmRNAを逆
転写してつくられるcDNAを用いてもよい。
なお本発明においてはα‐hANPをコードする遺伝子の入
手源として1acプロモーターのもとにα‐hANP遺伝子を
含有するプラスミドpGHα210rop-、及びプラスミドpGH
α439rop-を使用するが、これらのプラスミドの詳細は
特願昭61-101100明細書中に記載されており、また本明
細書において参考例として記載する。
手源として1acプロモーターのもとにα‐hANP遺伝子を
含有するプラスミドpGHα210rop-、及びプラスミドpGH
α439rop-を使用するが、これらのプラスミドの詳細は
特願昭61-101100明細書中に記載されており、また本明
細書において参考例として記載する。
本発明の製造法における融合蛋白からの目的ペプチドの
切り出しには、リンカーアミノ酸がリジンである場合、
リジン酸基のＣ末端を特異的に切断する酵素、すなわち
リシルエンドペプチダーゼが用いられる。特に、アクロ
モバクター・リティカス(Achromobacter lyticus)由来
のアクロモバクタープロテアーゼＩ（ASIと略す）と呼
ばれる酵素が好ましい〔和光純薬（株）より発売されて
いる。〕一方、リンカーアミノ酸がグルタミン酸である
場合、グルタミン酸残基のＣ−末端を特異的に切断する
酵素、すなわちV8プロテアーゼを用いることができる。
切り出しには、リンカーアミノ酸がリジンである場合、
リジン酸基のＣ末端を特異的に切断する酵素、すなわち
リシルエンドペプチダーゼが用いられる。特に、アクロ
モバクター・リティカス(Achromobacter lyticus)由来
のアクロモバクタープロテアーゼＩ（ASIと略す）と呼
ばれる酵素が好ましい〔和光純薬（株）より発売されて
いる。〕一方、リンカーアミノ酸がグルタミン酸である
場合、グルタミン酸残基のＣ−末端を特異的に切断する
酵素、すなわちV8プロテアーゼを用いることができる。
大腸菌内で生産される融合蛋白は、菌体破砕懸濁液の上
清から抽出される場合と、沈澱（不溶）画分から抽出さ
れる場合とが考えられるが、本発明では、目的融合蛋白
以外の夾雑蛋白又はペプチドの混在が少ない不溶画分か
ら可溶化剤、例えば5M〜10M濃度の尿素溶液で抽出され
る。不溶画分からの融合蛋白の抽出（可溶化）にはSDS
や塩酸グアニジンなどの試薬も考えられるが、5Mの濃度
でも融合蛋白が可溶化された状態であり且つAPI酵素活
性が失われない尿素の溶液で抽出するのが好ましい。例
えば、8M尿素溶液で不溶画分から目的融合蛋白を可溶化
後、適当な緩衝溶液で希釈するだけで、何ら精製工程を
経ることなくAPIを作用させ、目的ペプチド、例えば分
子内Ｓ−Ｓ結合を有したαhANPを遊離させることができ
る。遊離された目的ペプチドは、通常の方法で精製され
る。
清から抽出される場合と、沈澱（不溶）画分から抽出さ
れる場合とが考えられるが、本発明では、目的融合蛋白
以外の夾雑蛋白又はペプチドの混在が少ない不溶画分か
ら可溶化剤、例えば5M〜10M濃度の尿素溶液で抽出され
る。不溶画分からの融合蛋白の抽出（可溶化）にはSDS
や塩酸グアニジンなどの試薬も考えられるが、5Mの濃度
でも融合蛋白が可溶化された状態であり且つAPI酵素活
性が失われない尿素の溶液で抽出するのが好ましい。例
えば、8M尿素溶液で不溶画分から目的融合蛋白を可溶化
後、適当な緩衝溶液で希釈するだけで、何ら精製工程を
経ることなくAPIを作用させ、目的ペプチド、例えば分
子内Ｓ−Ｓ結合を有したαhANPを遊離させることができ
る。遊離された目的ペプチドは、通常の方法で精製され
る。
本発明では上記のように、目的融合蛋白を不溶画分か
ら抽出するため、該抽出液にはほとんど目的融合蛋白以
外の夾雑蛋白が存在せず、該抽出液に含まれる目的融
合蛋白を何ら精製することなくAPI処理し目的ペプチド
を遊離させることができ、さらに融合蛋白分子中に占
める目的ペプチド分子の割合が高いことなどから、従来
の方法に比べ、はるかに簡便で且つ効率よく目的ペプチ
ドとする生理活性ペプチドを製造できる。また、付加ポ
リペプチドがシステインを含有しないため、これらのペ
プチド間にジスルフィド結合が形成されることがないか
ら、目的の生理活性ペプチドの切り出しが極めて高収率
で行われる。また、前記付加ポリペプチドがリジン残基
を含有しない本発明の態様においては、リシルエンドペ
プチダーゼによる目的生理活性ペプチドの切り出しに際
して相手方ポリペプチドが切断されることがないから、
目的生理活性物質の単離・精製が極めて容易になる。
ら抽出するため、該抽出液にはほとんど目的融合蛋白以
外の夾雑蛋白が存在せず、該抽出液に含まれる目的融
合蛋白を何ら精製することなくAPI処理し目的ペプチド
を遊離させることができ、さらに融合蛋白分子中に占
める目的ペプチド分子の割合が高いことなどから、従来
の方法に比べ、はるかに簡便で且つ効率よく目的ペプチ
ドとする生理活性ペプチドを製造できる。また、付加ポ
リペプチドがシステインを含有しないため、これらのペ
プチド間にジスルフィド結合が形成されることがないか
ら、目的の生理活性ペプチドの切り出しが極めて高収率
で行われる。また、前記付加ポリペプチドがリジン残基
を含有しない本発明の態様においては、リシルエンドペ
プチダーゼによる目的生理活性ペプチドの切り出しに際
して相手方ポリペプチドが切断されることがないから、
目的生理活性物質の単離・精製が極めて容易になる。
次に、参考例及び実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
まず、本発明の方法に使用するプラスミドの作製のため
の出発材料となるプラスミド、すなわち、β−ガラクト
シダーゼ蛋白質の部分とα‐hANPとの融合蛋白質であっ
てβ−ガラクトシダーゼ蛋白質部分にシステイン残基を
含有しているもの（天然形態において存在するシステイ
ン残基がまだ他のアミノ酸残基により置き換えられてい
ないもの）をコードするDNAを含有するプラスミドpGHα
210rop-、pGHα439rop-、及びplacZ′210αhANPの作製
方法を記載する。
の出発材料となるプラスミド、すなわち、β−ガラクト
シダーゼ蛋白質の部分とα‐hANPとの融合蛋白質であっ
てβ−ガラクトシダーゼ蛋白質部分にシステイン残基を
含有しているもの（天然形態において存在するシステイ
ン残基がまだ他のアミノ酸残基により置き換えられてい
ないもの）をコードするDNAを含有するプラスミドpGHα
210rop-、pGHα439rop-、及びplacZ′210αhANPの作製
方法を記載する。
参考例1.pGHα1007の作製（第11図）：融合蛋白発現プ
ラスミドの作製 A.pBR322-SalIの作製 pBR322 5μｇをHindIII buffer（50mM NaCl、50mMトリ
ス−塩酸（pH8.0）、10mM MgCl2）50μｌ中で16ユニッ
トのEcoRIにより完全分解した後、エタノール沈澱によ
りDNAを回収し、次に25mM dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP
を含む）２μｌを含むTA緩衝液（33mMトリス酢酸pH7.
9、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジ
チオスレイトール）100μｌ中で４ユニットのT4 DNAポ
リメラーゼによりEcoRI粘着末端を平滑末端とした。そ
の後、エタノール沈澱によりDNAを回収し、SalIリンカ
ー 0.5μｇを加えたライゲーション反応液（20mMトリス−
塩酸pH7.4、10mM MgCl2 10mMジチオスレイトール、1mM
ATP）20μｌ中、１ユニットのT4 DNAリガーゼとともに
15℃18時間反応させた。この反応液を大腸菌W3110に形
質転換し、アンピシリン、テトラサイクリン薬剤耐性
（Apr,Tcr）クローンを得た。次に、これらのクローン
からプラスミドを分離して制限酵素による解析を行な
い、EcoRIサイトがSalIサイトに変わったpBR322-SalIを
得た。
ラスミドの作製 A.pBR322-SalIの作製 pBR322 5μｇをHindIII buffer（50mM NaCl、50mMトリ
ス−塩酸（pH8.0）、10mM MgCl2）50μｌ中で16ユニッ
トのEcoRIにより完全分解した後、エタノール沈澱によ
りDNAを回収し、次に25mM dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP
を含む）２μｌを含むTA緩衝液（33mMトリス酢酸pH7.
9、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジ
チオスレイトール）100μｌ中で４ユニットのT4 DNAポ
リメラーゼによりEcoRI粘着末端を平滑末端とした。そ
の後、エタノール沈澱によりDNAを回収し、SalIリンカ
ー 0.5μｇを加えたライゲーション反応液（20mMトリス−
塩酸pH7.4、10mM MgCl2 10mMジチオスレイトール、1mM
ATP）20μｌ中、１ユニットのT4 DNAリガーゼとともに
15℃18時間反応させた。この反応液を大腸菌W3110に形
質転換し、アンピシリン、テトラサイクリン薬剤耐性
（Apr,Tcr）クローンを得た。次に、これらのクローン
からプラスミドを分離して制限酵素による解析を行な
い、EcoRIサイトがSalIサイトに変わったpBR322-SalIを
得た。
B.pGHα201の作製 ５μｇのpBR322-SalIをSalI緩衝液（150mM NaCl 6mMト
リス−塩酸pH7.9、6mM MgCl2）50μｌ中で、８ユニット
のSalIで部分消化した後、24ユニットのBamHIで完全消
化を行ない、寒天ゲル電気泳動により、２番目に大きい
テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領域を含む
DNA断片（第11図の）を分離、回収した。また、ｐαN
E2（本プラスミドは特開昭58-63395に開示されている。
さらに本プラスミドによって形質転換された大腸菌WA80
2/pαNE2株は、SBM102と命名、工業技術院微生物工業技
術研究所に受託番号EERM P-6031として寄託されてい
る）５μｇをSalI緩衝液100μｌ中で、24ユニットのBam
HI、および24ユニットのEcoRIで完全消化した後、電気
泳動的に一番大きい1acプロモーターにて発現するβ‐g
a11007、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むDNA断片
（第11図の）を分離、回収した。さらにλhANP遺伝子
（その３′末側にαhANP構造遺伝子をもつ）を含むpS22
4-3（特開昭60-262592に開示）５μｇをSalI緩衝液100
μｌ中で24ユニットのPvuII、及び80ユニットのSalIで
完全消化した後、Ｎ末端を欠くαhANP遺伝子を含む電気
泳動的にもっとも小さいDNA断片（第11図の）を分
離、回収した。前述の〜のDNA断片及びLys残基とα
hANPのＮ末端領域の一部をコードする遺伝子を含み且つ
各々の末端にそれぞれEcoRI粘着部位およびPvuII平滑部
位を有する以下の塩基配列で示される化学合成DNA断片
（第11図の）： １μｇを混合し、前述の方法でライゲーションした後、
W3110への形質転換を行ないアンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性のクローンを得た。常法に従ってこれらの
クローンからプラスミドを分離して解析し、目的とする
pGHα201を得た。
リス−塩酸pH7.9、6mM MgCl2）50μｌ中で、８ユニット
のSalIで部分消化した後、24ユニットのBamHIで完全消
化を行ない、寒天ゲル電気泳動により、２番目に大きい
テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領域を含む
DNA断片（第11図の）を分離、回収した。また、ｐαN
E2（本プラスミドは特開昭58-63395に開示されている。
さらに本プラスミドによって形質転換された大腸菌WA80
2/pαNE2株は、SBM102と命名、工業技術院微生物工業技
術研究所に受託番号EERM P-6031として寄託されてい
る）５μｇをSalI緩衝液100μｌ中で、24ユニットのBam
HI、および24ユニットのEcoRIで完全消化した後、電気
泳動的に一番大きい1acプロモーターにて発現するβ‐g
a11007、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むDNA断片
（第11図の）を分離、回収した。さらにλhANP遺伝子
（その３′末側にαhANP構造遺伝子をもつ）を含むpS22
4-3（特開昭60-262592に開示）５μｇをSalI緩衝液100
μｌ中で24ユニットのPvuII、及び80ユニットのSalIで
完全消化した後、Ｎ末端を欠くαhANP遺伝子を含む電気
泳動的にもっとも小さいDNA断片（第11図の）を分
離、回収した。前述の〜のDNA断片及びLys残基とα
hANPのＮ末端領域の一部をコードする遺伝子を含み且つ
各々の末端にそれぞれEcoRI粘着部位およびPvuII平滑部
位を有する以下の塩基配列で示される化学合成DNA断片
（第11図の）： １μｇを混合し、前述の方法でライゲーションした後、
W3110への形質転換を行ないアンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性のクローンを得た。常法に従ってこれらの
クローンからプラスミドを分離して解析し、目的とする
pGHα201を得た。
C.pGHα1007の作製 ５μｇのpGHα201をSa1I緩衝液50μｌ中で24ユニットの
DraIで完全消化した後、電気泳動的に一番大きいDNA断
片を分離し、回収した。次に前述の方法でライゲーショ
ンした後、大腸菌W3110への形質転換を行ない、アンピ
シリン感受性でテトラサイクリン耐性のクローンを得
た。常法に従って解析し、目的とするpGHα1007を得
た。このpGHα1007は、β‐gal（1007個のアミノ酸から
なる蛋白）のＣ末端にLysを介してαhANPが連結された
融合蛋白（βgal1007 αhANPと呼ぶ）がラクトースプロ
モーター（plac）支配下に発現されるプラスミドであ
る。
DraIで完全消化した後、電気泳動的に一番大きいDNA断
片を分離し、回収した。次に前述の方法でライゲーショ
ンした後、大腸菌W3110への形質転換を行ない、アンピ
シリン感受性でテトラサイクリン耐性のクローンを得
た。常法に従って解析し、目的とするpGHα1007を得
た。このpGHα1007は、β‐gal（1007個のアミノ酸から
なる蛋白）のＣ末端にLysを介してαhANPが連結された
融合蛋白（βgal1007 αhANPと呼ぶ）がラクトースプロ
モーター（plac）支配下に発現されるプラスミドであ
る。
尚、本プラスミドが導入された大腸菌W3110/pGHα1007
はSBM284と命名され、微工研菌寄第8728号（FERM P-872
8）の受託番号のもとに工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託され、微工研条寄第1748号（FERM BP-1748）と
してブタペスト条約に基く国際寄託に移管された。
はSBM284と命名され、微工研菌寄第8728号（FERM P-872
8）の受託番号のもとに工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託され、微工研条寄第1748号（FERM BP-1748）と
してブタペスト条約に基く国際寄託に移管された。
参考例2.pGHα650、pGHα439及びpGHα210の作製（第12
図）−βgalの縮小化 ５μｇのpGHα1007をTA緩衝液50μｌ中で８ユニットのE
coRI及び24ユニットのSacIで完全消化した後、電気泳動
的に一番大きいDNA断片を分離し、回収した。次に前述
のようにしてEcoRI及びSacI粘着末端を平滑末端とした
後、ライゲーションし、大腸菌W3110への形質転換を行
ない、テトラサイクリン耐性のクローンを得た。常法に
従って解析し、目的とするpGHα650を得た。
図）−βgalの縮小化 ５μｇのpGHα1007をTA緩衝液50μｌ中で８ユニットのE
coRI及び24ユニットのSacIで完全消化した後、電気泳動
的に一番大きいDNA断片を分離し、回収した。次に前述
のようにしてEcoRI及びSacI粘着末端を平滑末端とした
後、ライゲーションし、大腸菌W3110への形質転換を行
ない、テトラサイクリン耐性のクローンを得た。常法に
従って解析し、目的とするpGHα650を得た。
pGH/α439、及びpGHα210の作製は、TA緩衝液をHindIII
緩衝液に、24ユニットのSacIをそれぞれ24ユニットのMl
uI及び24ユニットのAatIIに換え、同様に行なった。
緩衝液に、24ユニットのSacIをそれぞれ24ユニットのMl
uI及び24ユニットのAatIIに換え、同様に行なった。
尚、pGHα650、pGHα439、及びpGHα210は、各々β‐ga
l蛋白のＮ末端から650個、439個、210個のアミノ酸から
なるポリペプチドのＣ末端にGlu-Pheの２アミノ酸とLys
残基を介してαhANPが連結された融合蛋白（各々βgal6
50αhANP、βgal439αhANP、及びβgal210αhANPと呼
ぶ）をコードするDNA断片が含まれているプラスミドで
あることを示す。
l蛋白のＮ末端から650個、439個、210個のアミノ酸から
なるポリペプチドのＣ末端にGlu-Pheの２アミノ酸とLys
残基を介してαhANPが連結された融合蛋白（各々βgal6
50αhANP、βgal439αhANP、及びβgal210αhANPと呼
ぶ）をコードするDNA断片が含まれているプラスミドで
あることを示す。
参考例3.pGHα210rop-の作製（第13図） Ａ）pBR322ΔBalIの作製 ５μｇのpBR322をBalI緩衝液（10mMトリス塩酸pH7.6、1
2mM MgCl2）50μｌ中で、10ユニットのBalIで完全に消
化した後、エタノール沈澱によりDNAを回収した。次にD
NAをSalI緩衝液50μｌに溶解して24ユニットのPvuIIで
完全消化した後、電気泳動的に一番大きいDNA断片（Bal
I及びPvuII消化によりDNA断片の両端は、平滑末端とな
っている）を分離、回収した。前述のようにライゲーシ
ョン及び形質転換を行ない、テトラサイクリン及びアン
ピシリン耐性のクローンを得、PvuII-BalI622塩基DNA断
片の欠失したプラスミドpBR322ΔBalIを得た。
2mM MgCl2）50μｌ中で、10ユニットのBalIで完全に消
化した後、エタノール沈澱によりDNAを回収した。次にD
NAをSalI緩衝液50μｌに溶解して24ユニットのPvuIIで
完全消化した後、電気泳動的に一番大きいDNA断片（Bal
I及びPvuII消化によりDNA断片の両端は、平滑末端とな
っている）を分離、回収した。前述のようにライゲーシ
ョン及び形質転換を行ない、テトラサイクリン及びアン
ピシリン耐性のクローンを得、PvuII-BalI622塩基DNA断
片の欠失したプラスミドpBR322ΔBalIを得た。
Ｂ）pGHα210rop-の作製 ５μｇのpBR322ΔBalIをSalI緩衝液50μｌ中で、24ユニ
ットのDraI及び24ユニットのEcoRVで完全消化後、複製
起点を含む電気泳動的に一番大きいDNA断片を分離、回
収した。次に５μｇのpGHα210をSalI緩衝液50μｌ中で
24ユニットのEcoRVで完全消化した後、電気泳動的に２
番目に大きいβgal210αhANP融合蛋白をコードする遺伝
子を含むDNA断片を分離、回収した。これらのDNA断片を
前述のようにライゲーションした後、大腸菌W3110への
形質転換を行ない、テトラサイクリン耐性のクローンを
得た。常法に従って解析し、目的のクローンW3110/pGH
α210rop-を得た。本プラスミドpGHα210rop-はプラス
ミドの複製を制御（抑制）する領域（ropと呼ばれる）
の機能が欠如したプラスミドである。
ットのDraI及び24ユニットのEcoRVで完全消化後、複製
起点を含む電気泳動的に一番大きいDNA断片を分離、回
収した。次に５μｇのpGHα210をSalI緩衝液50μｌ中で
24ユニットのEcoRVで完全消化した後、電気泳動的に２
番目に大きいβgal210αhANP融合蛋白をコードする遺伝
子を含むDNA断片を分離、回収した。これらのDNA断片を
前述のようにライゲーションした後、大腸菌W3110への
形質転換を行ない、テトラサイクリン耐性のクローンを
得た。常法に従って解析し、目的のクローンW3110/pGH
α210rop-を得た。本プラスミドpGHα210rop-はプラス
ミドの複製を制御（抑制）する領域（ropと呼ばれる）
の機能が欠如したプラスミドである。
pGHα439についても同様にしてrop機能を欠如したプラ
スミドpGHα439rop-を作製し、そのプラスミドによって
形質転換された大腸菌W3110/pGHα439rop-およびpGHα2
10rop-によって形質転換された大腸菌W3110/pGHα210ro
p-について各々の融合蛋白すなわちβgal439αhANPとβ
gal210αhANP、の生産性をSDS PAGEによって調べた。そ
の結果、特に、pGHα210において、rop機能を欠失させ
ることにより、融合蛋白の生産性の大巾な上昇が観察さ
れた。尚、生産量が少ない場合、IPTG添加効果が顕著に
現われるが、rop機能を欠損させプラスミドコピー数を
増加させるとその効果はあまりないことがわかる。
スミドpGHα439rop-を作製し、そのプラスミドによって
形質転換された大腸菌W3110/pGHα439rop-およびpGHα2
10rop-によって形質転換された大腸菌W3110/pGHα210ro
p-について各々の融合蛋白すなわちβgal439αhANPとβ
gal210αhANP、の生産性をSDS PAGEによって調べた。そ
の結果、特に、pGHα210において、rop機能を欠失させ
ることにより、融合蛋白の生産性の大巾な上昇が観察さ
れた。尚、生産量が少ない場合、IPTG添加効果が顕著に
現われるが、rop機能を欠損させプラスミドコピー数を
増加させるとその効果はあまりないことがわかる。
参考例4.pPLlacZ′210αhANPの作製 次に、pGHα210のlacプロモーターをλファージ由来のP
Lプロモーターに変換したプラスミドpPLlacZ′210αhAN
Pの作製を行った。
Lプロモーターに変換したプラスミドpPLlacZ′210αhAN
Pの作製を行った。
Ａ）pGHα210-EcoRIの作製（第14図） Morinaga,Y.ら（Biotechnology2:636,1984）の方法に準
じて、pGHα210上のlacZ′遺伝子の直前にEcoRIサイト
を挿入したプラスミドpGHα210-EcoRIを作製した。即
ち、まず、５μｇのpGHα210をTA緩衝液50μｌ中で、24
ユニットのHpaIにより完全消化した後、電気泳動的に一
番大きいαhANP構造遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺
伝子（Tcr）を含むDNA断片（第14図中の）を分離、回
収する。その後、100mMトリス−塩酸（pH8.0）50μｌ中
でアルカリ性フォスファターゼ処理により、５′末端の
リン酸を除く。次に５μｇのpGHα210をSalI緩衝液50μ
ｌ中で、80ユニットのSalIで完全消化した後、電気泳動
的に一番大きいテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を欠
失したDNA断片（第14図中の）を分離、回収した。こ
の両DNA断片及びと、EcoRIサイトを有し、かつ以下
の塩基配列を有する５′末端がリン酸化された化学合成
一本鎖DNA（第14図中の）： ５′pGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCATGACCATGATTACGG
3′ とを混合し、95℃で二重鎖DNAを変性させて一本鎖のDNA
とした後、ゆっくり冷却し、アニーリング（対合）させ
ることにより二重鎖形成を行なった。この反応液にdNTP
SとDNAポリメラーゼ（Klenow断片）、およびT4 DNAリガ
ーゼとATPを加えて反応させることにより完全な環状二
重鎖DNAとした。この反応液を用いて大腸菌W3110を形質
転換し、テトラサイクリン耐性を示すクローンを得た。
常法に従って解析しlacZ′遺伝子の直前にEcoRI部位が
挿入された目的のプラスミドpGHα210-EcoRIを得た。
じて、pGHα210上のlacZ′遺伝子の直前にEcoRIサイト
を挿入したプラスミドpGHα210-EcoRIを作製した。即
ち、まず、５μｇのpGHα210をTA緩衝液50μｌ中で、24
ユニットのHpaIにより完全消化した後、電気泳動的に一
番大きいαhANP構造遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺
伝子（Tcr）を含むDNA断片（第14図中の）を分離、回
収する。その後、100mMトリス−塩酸（pH8.0）50μｌ中
でアルカリ性フォスファターゼ処理により、５′末端の
リン酸を除く。次に５μｇのpGHα210をSalI緩衝液50μ
ｌ中で、80ユニットのSalIで完全消化した後、電気泳動
的に一番大きいテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を欠
失したDNA断片（第14図中の）を分離、回収した。こ
の両DNA断片及びと、EcoRIサイトを有し、かつ以下
の塩基配列を有する５′末端がリン酸化された化学合成
一本鎖DNA（第14図中の）： ５′pGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCATGACCATGATTACGG
3′ とを混合し、95℃で二重鎖DNAを変性させて一本鎖のDNA
とした後、ゆっくり冷却し、アニーリング（対合）させ
ることにより二重鎖形成を行なった。この反応液にdNTP
SとDNAポリメラーゼ（Klenow断片）、およびT4 DNAリガ
ーゼとATPを加えて反応させることにより完全な環状二
重鎖DNAとした。この反応液を用いて大腸菌W3110を形質
転換し、テトラサイクリン耐性を示すクローンを得た。
常法に従って解析しlacZ′遺伝子の直前にEcoRI部位が
挿入された目的のプラスミドpGHα210-EcoRIを得た。
Ｂ）pPLlacZ′210αhANPの作製（第15図） 前述のプラスミドpGHα210-EcoRI5μｇをHindIII緩衝液
50μｌ中で0.2ユニットのEcoRIで部分消化した後、電気
泳動的にリニアーのDNA断片を分離、回収した。さら
に、このDNAをSalI緩衝液100μｌ中で、80ユニットのSa
lIで完全消化した後、電気泳動的に２番目に大きい、β
gal210αhANP構造遺伝子を含むDNA断片（第15図中の
）を分離、回収した。次に５μｇのpS224-3（前述）
をHindIII緩衝液50μｌ中で16ユニットのEcoRI及び24ユ
ニットのAvaIで完全消化した後、λファージのPLプロモ
ーター及びアンピシリン耐性遺伝子を含む電気泳動的に
一番大きいDNA断片（第15図中の）を分離、回収し
た。この両DNA断片及びと、各々の末端にSalI粘着
部位及びAvaI粘着部位を有し、かつ以下のDNA塩基配列
を有する化学合成DNA断片（ターミネーターtrpa）（第1
5図中の）： をライゲーションした後、大腸菌W3110/C1に形質転換、
アンピシリン及びカナマイシン耐性のクローンを得た。
常法に従って解析し、目的のクローンを得た。
50μｌ中で0.2ユニットのEcoRIで部分消化した後、電気
泳動的にリニアーのDNA断片を分離、回収した。さら
に、このDNAをSalI緩衝液100μｌ中で、80ユニットのSa
lIで完全消化した後、電気泳動的に２番目に大きい、β
gal210αhANP構造遺伝子を含むDNA断片（第15図中の
）を分離、回収した。次に５μｇのpS224-3（前述）
をHindIII緩衝液50μｌ中で16ユニットのEcoRI及び24ユ
ニットのAvaIで完全消化した後、λファージのPLプロモ
ーター及びアンピシリン耐性遺伝子を含む電気泳動的に
一番大きいDNA断片（第15図中の）を分離、回収し
た。この両DNA断片及びと、各々の末端にSalI粘着
部位及びAvaI粘着部位を有し、かつ以下のDNA塩基配列
を有する化学合成DNA断片（ターミネーターtrpa）（第1
5図中の）： をライゲーションした後、大腸菌W3110/C1に形質転換、
アンピシリン及びカナマイシン耐性のクローンを得た。
常法に従って解析し、目的のクローンを得た。
参考例5.β‐gal領域を縮小したプラスミドpGHαBalの
作製 続いて、pGHα439rop-を用いて融合蛋白中のβ‐gal領
域が縮小化したプラスミドを作製し、β‐gal領域の大
きさがどれくらいであればβgalαhANP融合蛋白の生産
に有効であるかを検討した。
作製 続いて、pGHα439rop-を用いて融合蛋白中のβ‐gal領
域が縮小化したプラスミドを作製し、β‐gal領域の大
きさがどれくらいであればβgalαhANP融合蛋白の生産
に有効であるかを検討した。
（Ａ）pGHαBalの作製（第16図） 10μｇのpGHα439rop-はHindIII緩衝液100μｌ中で、10
0ユニットのAatIIで完全に消化した後、エタノール沈澱
によりDNAを回収した。次に、DANをBal31緩衝液（12mM
CaCl2、12mM MgCl2、0.2M NaCl、20mM Tris/HC1、1mMED
TA（pH8.0））100μｌに溶解して10ユニットのBal31で
５分、10分、20分後に各々30μｌの溶液をとり同量のフ
ェノール−クロロホルム1:1を溶液で処理することによ
りBal31の反応を停止させた。次にフェノール層（下
層）を除いた後、残留するフェノールをエーテルで抽出
し、さらにエタノール沈澱によりDNAを回収した。続い
て各々のDNAをTA緩衝液30μｌに溶かしたのち、15ユニ
ットのEcoRIで完全に消化し、そのうち10μｌを２％ア
ガロースゲル電気泳動を行った。このうち400塩基対以
下のDNA断片が生じた10分、20分処理のサンプルの残り
の20μｌにTA緩衝液70μｌ及び25mM dNTP 2μｌ、100mM
ジチオスレイトール５μｌ、４ユニットのT4 DPaseを加
え反応させることによりDNA末端を平滑末端とした。次
に、エタノール沈澱により各々のDNAを集めた後、前述
のようにライゲーション及び大腸菌W3110株への形質転
換を行ない54株のW3110/pGHαBalクローンを分離した。
この内プラスミドpGHαBa143を本発明のプラスミドの作
製のため出発材料として使用した。
0ユニットのAatIIで完全に消化した後、エタノール沈澱
によりDNAを回収した。次に、DANをBal31緩衝液（12mM
CaCl2、12mM MgCl2、0.2M NaCl、20mM Tris/HC1、1mMED
TA（pH8.0））100μｌに溶解して10ユニットのBal31で
５分、10分、20分後に各々30μｌの溶液をとり同量のフ
ェノール−クロロホルム1:1を溶液で処理することによ
りBal31の反応を停止させた。次にフェノール層（下
層）を除いた後、残留するフェノールをエーテルで抽出
し、さらにエタノール沈澱によりDNAを回収した。続い
て各々のDNAをTA緩衝液30μｌに溶かしたのち、15ユニ
ットのEcoRIで完全に消化し、そのうち10μｌを２％ア
ガロースゲル電気泳動を行った。このうち400塩基対以
下のDNA断片が生じた10分、20分処理のサンプルの残り
の20μｌにTA緩衝液70μｌ及び25mM dNTP 2μｌ、100mM
ジチオスレイトール５μｌ、４ユニットのT4 DPaseを加
え反応させることによりDNA末端を平滑末端とした。次
に、エタノール沈澱により各々のDNAを集めた後、前述
のようにライゲーション及び大腸菌W3110株への形質転
換を行ない54株のW3110/pGHαBalクローンを分離した。
この内プラスミドpGHαBa143を本発明のプラスミドの作
製のため出発材料として使用した。
参考例6.プラスミドpIN5T4の作成（第17図） （１）プラスミドpIN4GIF54の作製 プラスミドpIN4GIF54は、第17図に示したように、プ
ラスミドpINIA2を制限酵素XbaIとPstIで消化して得られ
るリポプロテイン遺伝子のプロモーター領域（図中1pp
で示す）を含むDNA断片、XbaIおよびEcoRIの粘着末端
（cohesive end）をもつオリゴヌクレオチド、プラス
ミドpGIF54をEcoRIとPstIで消化して得られるhIFN-γ遺
伝子を含むDNA断片の３つの断片から以下のようにして
造成した。尚、制限酵素類は、いずれも宝酒造社製のも
のを用いた。
ラスミドpINIA2を制限酵素XbaIとPstIで消化して得られ
るリポプロテイン遺伝子のプロモーター領域（図中1pp
で示す）を含むDNA断片、XbaIおよびEcoRIの粘着末端
（cohesive end）をもつオリゴヌクレオチド、プラス
ミドpGIF54をEcoRIとPstIで消化して得られるhIFN-γ遺
伝子を含むDNA断片の３つの断片から以下のようにして
造成した。尚、制限酵素類は、いずれも宝酒造社製のも
のを用いた。
A.pINI-A2のXbaI-PstI DNA断片の調製 pINI-A2 DNA 3μｇを１×TA溶液（33mMトリス酢酸緩衝
液、pH7.6、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム
および0.5mMジチオスレイトル）150μｌ中でXbaI及びPs
tI各々15単位を加え37℃60分間反応させ、DNAを切断し
た。次に、1.0％寒天ゲル電気泳動を行った後、約980b.
p.に相当する位置のゲルを切り出し、透析チューブに入
れ電気泳動することによりXbaI-PstI DNA断片を溶出し
た。溶出液に等量のフェノールを加えエチジウムプロマ
イドを抽出除去した後、2.5倍量のエタノールを加え、
−80℃30分間放置し、10.000rpm 10分間遠心を行い、DN
A断片をエタノール沈澱物として得た。このエタノール
沈澱物に10μｌの蒸留水を加え、DNA断片を溶解した。
液、pH7.6、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム
および0.5mMジチオスレイトル）150μｌ中でXbaI及びPs
tI各々15単位を加え37℃60分間反応させ、DNAを切断し
た。次に、1.0％寒天ゲル電気泳動を行った後、約980b.
p.に相当する位置のゲルを切り出し、透析チューブに入
れ電気泳動することによりXbaI-PstI DNA断片を溶出し
た。溶出液に等量のフェノールを加えエチジウムプロマ
イドを抽出除去した後、2.5倍量のエタノールを加え、
−80℃30分間放置し、10.000rpm 10分間遠心を行い、DN
A断片をエタノール沈澱物として得た。このエタノール
沈澱物に10μｌの蒸留水を加え、DNA断片を溶解した。
B.pGIF54のEcoRI-PstI DNA断片の調製 プラスミドpGIF54は、特願昭57-86180号明細書に記載さ
れているプラスミドpGIF4と本質的に同一のプラスミド
であり、該プラスミドにより形質転換された大腸菌WA80
2/pGIF4 はSBMC105と命名され、工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第282号（FEMM BP-282）として
寄託されている。
れているプラスミドpGIF4と本質的に同一のプラスミド
であり、該プラスミドにより形質転換された大腸菌WA80
2/pGIF4 はSBMC105と命名され、工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第282号（FEMM BP-282）として
寄託されている。
pGIF54 DNA 3μｇを１×TA溶液30μｌ中でEcoRI及びPst
I5単位を加え37℃60分反応させDNAを切断した。次に0.7
％寒天ゲル電気泳動を行い、前述の如く電気泳動を行う
ことによりゲルより約3.4KbのECORI-PstI DNA断片を溶
出した。溶出液を前述の如くフェノール処理後、エタノ
ール沈澱を行い、エタノール沈澱物に10μｌの蒸留水を
加えDNA断片を溶解した。
I5単位を加え37℃60分反応させDNAを切断した。次に0.7
％寒天ゲル電気泳動を行い、前述の如く電気泳動を行う
ことによりゲルより約3.4KbのECORI-PstI DNA断片を溶
出した。溶出液を前述の如くフェノール処理後、エタノ
ール沈澱を行い、エタノール沈澱物に10μｌの蒸留水を
加えDNA断片を溶解した。
C.XbaI及びEcoRI粘着末端をもつオリゴヌクレオチドの
調製 完全なhIFN-γ蛋白を発現させる為、pINIA2のXbaI切断
部位から下流にリポプロテインのシャイン−ダルガーノ
（SD）配列をもち、EcoRI粘着末端をもつオリゴヌクレ
オチド 固相法で合成した。合成法の詳細は特願昭57-86180に開
示している。
調製 完全なhIFN-γ蛋白を発現させる為、pINIA2のXbaI切断
部位から下流にリポプロテインのシャイン−ダルガーノ
（SD）配列をもち、EcoRI粘着末端をもつオリゴヌクレ
オチド 固相法で合成した。合成法の詳細は特願昭57-86180に開
示している。
上記オリゴヌクレオチド100pmolを30μｌ中のキナーゼ
反応溶液（50mMトリス塩酸緩衝液、pH8.0、10mM MgC
l2、10mMジチスレイトール）中で２単位のT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え、37℃で60分間で
５′‐OHをリン酸化した。
反応溶液（50mMトリス塩酸緩衝液、pH8.0、10mM MgC
l2、10mMジチスレイトール）中で２単位のT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え、37℃で60分間で
５′‐OHをリン酸化した。
D.pIN4GIF54の造成 pIN4GIF54プラスミドの造成は、上記の如く調製した３
種のDNA断片を以下のようにしてライゲーションするこ
とにより行った。pINIA2のXbaI-PstI DNA断片５μｌ
（エタノール沈澱を10μｌの蒸留水に溶解したもの）、
pGIF54のEcoRI-PstI DNA断片５μｌ（エタノール沈澱を
10μｌの蒸留水に溶解したもの）及び、リン酸化したオ
リゴヌクレオチドの３μｌ（10pmol）に10倍濃度のライ
ゲーション反応液（20mMトリス塩酸緩衝液、pH7.6、10m
M MgCl2）２μｌ、4mM ATP 2μｌ及びT4 DNAリガーゼ
（ベーリンガーマンハイム社製）１μｌ（５単位）を混
ぜ、16℃一夜反応を行った。
種のDNA断片を以下のようにしてライゲーションするこ
とにより行った。pINIA2のXbaI-PstI DNA断片５μｌ
（エタノール沈澱を10μｌの蒸留水に溶解したもの）、
pGIF54のEcoRI-PstI DNA断片５μｌ（エタノール沈澱を
10μｌの蒸留水に溶解したもの）及び、リン酸化したオ
リゴヌクレオチドの３μｌ（10pmol）に10倍濃度のライ
ゲーション反応液（20mMトリス塩酸緩衝液、pH7.6、10m
M MgCl2）２μｌ、4mM ATP 2μｌ及びT4 DNAリガーゼ
（ベーリンガーマンハイム社製）１μｌ（５単位）を混
ぜ、16℃一夜反応を行った。
（２）大腸菌WA802への形質転換 大腸菌WA802をL-broth 2.0mlで37℃一夜培養後、その培
養液0.3mlを30mlのL-brothに加え、37℃で２時間振盪培
養を行った。その後3000rpm 10分間遠心を行い、得られ
た菌体に50mM CaCl2 10mlを加え、菌体を懸濁し、さら
に3000rpm 10分間遠心を行った。得られた菌体に1.0ml
の50mM CaCl2溶液を加え、氷中60分間放置した。このCa
処理菌0.2mlに、実施例I-Dで得られたライゲーション
反応液（ライゲーションされた前記３種のDNA断片を含
む）10μｌを加え、氷中60分間放置後、2mlのL-brothを
加え、37℃60分間培養を行った。培養液を40μl/mlのア
ンピシリンを含むNutrient寒天培地（BBL社）にプレー
ティングし、37℃一夜培養を行いアンピシリン耐性を示
す形質転換株を選択した。次に得られた形質転換株につ
いての１株からの常法（cleared lysate法）に従いプラ
スミドDNAを分離後、挿入したXbaI-EcoRI領域周辺のDNA
塩基配列をマキサム−ギルバート法（Methods.Enzymo
l.,65:499〜560,1980）により決定し、当初の目的のDNA
塩基配列を持つことを確認した。このプラスミドをpIN4
GIF54と命名し、その形質転換大腸菌をWA802/pIN4GIF54
と命名した。
養液0.3mlを30mlのL-brothに加え、37℃で２時間振盪培
養を行った。その後3000rpm 10分間遠心を行い、得られ
た菌体に50mM CaCl2 10mlを加え、菌体を懸濁し、さら
に3000rpm 10分間遠心を行った。得られた菌体に1.0ml
の50mM CaCl2溶液を加え、氷中60分間放置した。このCa
処理菌0.2mlに、実施例I-Dで得られたライゲーション
反応液（ライゲーションされた前記３種のDNA断片を含
む）10μｌを加え、氷中60分間放置後、2mlのL-brothを
加え、37℃60分間培養を行った。培養液を40μl/mlのア
ンピシリンを含むNutrient寒天培地（BBL社）にプレー
ティングし、37℃一夜培養を行いアンピシリン耐性を示
す形質転換株を選択した。次に得られた形質転換株につ
いての１株からの常法（cleared lysate法）に従いプラ
スミドDNAを分離後、挿入したXbaI-EcoRI領域周辺のDNA
塩基配列をマキサム−ギルバート法（Methods.Enzymo
l.,65:499〜560,1980）により決定し、当初の目的のDNA
塩基配列を持つことを確認した。このプラスミドをpIN4
GIF54と命名し、その形質転換大腸菌をWA802/pIN4GIF54
と命名した。
pIN4GIF54のプロモーター周辺の塩基配列を第17図に示
した。このpIN4GIF54ではシャイン−ダルガーノ（SD）
配列はpIN1A2と同一であり、又、SD配列からhIFN-γの
翻訳開始コドンATGまでの距離は9b.p.でありpINIA2のそ
れと同じである。しかしSD配列と翻訳開始コドンATGの
間にEcoRI切断部位を導入したことによりSD配列の変
換、SD配列から翻訳開始コドン間の距離の変換が容易に
行える為、hIFN-γ遺伝子のみならず、他の遺伝子の高
発現ベクターの造成に有利なベクターと考えられる。
した。このpIN4GIF54ではシャイン−ダルガーノ（SD）
配列はpIN1A2と同一であり、又、SD配列からhIFN-γの
翻訳開始コドンATGまでの距離は9b.p.でありpINIA2のそ
れと同じである。しかしSD配列と翻訳開始コドンATGの
間にEcoRI切断部位を導入したことによりSD配列の変
換、SD配列から翻訳開始コドン間の距離の変換が容易に
行える為、hIFN-γ遺伝子のみならず、他の遺伝子の高
発現ベクターの造成に有利なベクターと考えられる。
（３）pIN5GIF54プラスミドの造成（第17図参照） A. XbaI及びEcoRI粘着末端をもつオリゴヌクレオチド
の調製 AGGAGGTのSD配列をもち、５′末端にXbaI及びEcoRI粘着
末端をもつオリゴヌクレオチド5 ′CTAGGAGGTAG3′3 ′CTCCATCTTAA5′は前記した固相法（特願昭57-86180
参照）で合成された。上記オリゴヌクレオチド100pmol
を50μｌのキナーゼ反応溶液（実施例Ｉ−Ｃに記述）中
で２単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）
を加え前述の如く37℃60分間で５′‐OHをリン酸化し
た。
の調製 AGGAGGTのSD配列をもち、５′末端にXbaI及びEcoRI粘着
末端をもつオリゴヌクレオチド5 ′CTAGGAGGTAG3′3 ′CTCCATCTTAA5′は前記した固相法（特願昭57-86180
参照）で合成された。上記オリゴヌクレオチド100pmol
を50μｌのキナーゼ反応溶液（実施例Ｉ−Ｃに記述）中
で２単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）
を加え前述の如く37℃60分間で５′‐OHをリン酸化し
た。
B.pIN4GIF54のXbaI-EcoRI DNA断片の調製 pIN4GIF54 2.5μｇを１×TA溶液30μｌでXbaI及びEcoRI
各々５単位加え、37℃60分間反応させ、DNAを切断し
た。切断後0.7％寒天ゲル電気泳動を行い、ゲルより約
4.3KbのXbaI-EcoRI DNA断片（SD配列を含まない長い方
の断片）を前記の如く電気泳動で溶出した。溶出液を前
述の如くフェノール処理後、エタノール沈澱を行い、エ
タノール沈澱物に10μｌの蒸留水を加え、DNA断片を溶
解した。
各々５単位加え、37℃60分間反応させ、DNAを切断し
た。切断後0.7％寒天ゲル電気泳動を行い、ゲルより約
4.3KbのXbaI-EcoRI DNA断片（SD配列を含まない長い方
の断片）を前記の如く電気泳動で溶出した。溶出液を前
述の如くフェノール処理後、エタノール沈澱を行い、エ
タノール沈澱物に10μｌの蒸留水を加え、DNA断片を溶
解した。
C.pIN5GIF54の造成 pIN5GIF54のプラスミドの造成は、上記の２種のDNA断片
を以下に示すようにライゲーションすることにより行っ
た。pIN4GIF54のXbaI-EcoRI DNA断片５μｌ（エタノー
ル沈澱を10μｌの蒸留水に溶解したもの）、及びリン酸
化したオリゴヌクレオチドの５μｌ（10pmol）に10倍濃
度のライゲーション反応液（前述）３μｌ、100mM DT
T、4mM ATP、蒸留水10μｌ及びT4 DNAリガーゼ（ベーリ
ンガー・マンハイム社製）１μｌ（５単位）を混ぜ16℃
一夜反応を行った。
を以下に示すようにライゲーションすることにより行っ
た。pIN4GIF54のXbaI-EcoRI DNA断片５μｌ（エタノー
ル沈澱を10μｌの蒸留水に溶解したもの）、及びリン酸
化したオリゴヌクレオチドの５μｌ（10pmol）に10倍濃
度のライゲーション反応液（前述）３μｌ、100mM DT
T、4mM ATP、蒸留水10μｌ及びT4 DNAリガーゼ（ベーリ
ンガー・マンハイム社製）１μｌ（５単位）を混ぜ16℃
一夜反応を行った。
（４）大腸菌WA802への形質転換 前述（実施例II-A）の如く、L-brothで培養した大腸菌W
A802の菌体をCaCl2処理し、その菌体懸濁液0.2mlと実施
例IV-Cで得られたライゲーション反応液とを混合するこ
とにより、大腸菌WA802の形質転換を行った。形質転換
株の選択は、40μg/mlのアンピシリンを含むNutrient寒
天培地で（BBL社）行い、アンピシリン耐性を示す形質
転換株を得た。得られた形質転換株の１株について、常
法（実施例II-A参照）に従いプラスミドを分離し、挿入
したXbaI-EcoRI領域周辺のDNA塩基配列を解析した。pIN
5GIF54には、図５に示したように、pIN4GIF54（図３）
にあったXbaI切断部位が消失しているはずである。そこ
で、分離した該プラスミドをXbaIと処理後、0.7％寒天
ゲル電気泳動を行い、XbaIで切断されないプラスミドDN
Aについて挿入したオリゴヌクレオチド断片近傍のDNA配
列をマキサム−ギルバート法で決定した。その結果、図
５に示すように目的のDNA塩基配列をもつことが確認で
きた。このプラスミドをpIN5GIF54と命名し、それによ
って形質転換されたWA802株をWA802/pIN5GIF54と命名し
た。
A802の菌体をCaCl2処理し、その菌体懸濁液0.2mlと実施
例IV-Cで得られたライゲーション反応液とを混合するこ
とにより、大腸菌WA802の形質転換を行った。形質転換
株の選択は、40μg/mlのアンピシリンを含むNutrient寒
天培地で（BBL社）行い、アンピシリン耐性を示す形質
転換株を得た。得られた形質転換株の１株について、常
法（実施例II-A参照）に従いプラスミドを分離し、挿入
したXbaI-EcoRI領域周辺のDNA塩基配列を解析した。pIN
5GIF54には、図５に示したように、pIN4GIF54（図３）
にあったXbaI切断部位が消失しているはずである。そこ
で、分離した該プラスミドをXbaIと処理後、0.7％寒天
ゲル電気泳動を行い、XbaIで切断されないプラスミドDN
Aについて挿入したオリゴヌクレオチド断片近傍のDNA配
列をマキサム−ギルバート法で決定した。その結果、図
５に示すように目的のDNA塩基配列をもつことが確認で
きた。このプラスミドをpIN5GIF54と命名し、それによ
って形質転換されたWA802株をWA802/pIN5GIF54と命名し
た。
（５）pIN5T4の作製（第18図） pIN5GIF54 5μｇを20unitのAatII、20unitのSalIを用い
て完全に分解後、T4 DNAポリメラーゼ及び4dNTP（dATP,
dGTP,dCTP,TTPを含む）、を用いてAatII（３′末端を有
する粘着末端）SalI（５′末端を有する粘着末端）によ
って生じた粘着末端を平滑末端とした（AatIIの場合は
粘着末端を取りのぞくトリミング（triming）を行い、S
alIの場合は粘着末端を満たすフイルイン（fillin）を
行った）。次に寒天電気泳動で分離しリポプロテインプ
ロモーター（1ppP）及びGIF遺伝子を含む約750bpに相当
するDNA断片を前述の方法により得た。一方pBR322 ５
μｇを20unitのEcoRIを用いて完全に分解後、生じた粘
着末端を前述の方法でfillinし平滑末端とした。次に20
unitのAhaIIIを用いて完全に分解した後寒天電気泳動で
分離し、DNA複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子
を含む約3.3Kdに相当するDNA断片を前述の方法により得
た。両DNA断片を混合しライゲーションを行い前述の方
法によりpIN5T4を得た。
て完全に分解後、T4 DNAポリメラーゼ及び4dNTP（dATP,
dGTP,dCTP,TTPを含む）、を用いてAatII（３′末端を有
する粘着末端）SalI（５′末端を有する粘着末端）によ
って生じた粘着末端を平滑末端とした（AatIIの場合は
粘着末端を取りのぞくトリミング（triming）を行い、S
alIの場合は粘着末端を満たすフイルイン（fillin）を
行った）。次に寒天電気泳動で分離しリポプロテインプ
ロモーター（1ppP）及びGIF遺伝子を含む約750bpに相当
するDNA断片を前述の方法により得た。一方pBR322 ５
μｇを20unitのEcoRIを用いて完全に分解後、生じた粘
着末端を前述の方法でfillinし平滑末端とした。次に20
unitのAhaIIIを用いて完全に分解した後寒天電気泳動で
分離し、DNA複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子
を含む約3.3Kdに相当するDNA断片を前述の方法により得
た。両DNA断片を混合しライゲーションを行い前述の方
法によりpIN5T4を得た。
実施例1.DTT還元によるβgal210αhANPAPI水解サンプル
からのαhANP回収率の増加 A.API加水分解によるβgal210αhANPからのαhANPの回
収 以下の実施例において、β−ガラクトシダーゼ由来の21
0個のアミノ酸残基からなるポリペプチドとα‐hANPと
の融合蛋白質をβgal210αhANPと略称する。
からのαhANP回収率の増加 A.API加水分解によるβgal210αhANPからのαhANPの回
収 以下の実施例において、β−ガラクトシダーゼ由来の21
0個のアミノ酸残基からなるポリペプチドとα‐hANPと
の融合蛋白質をβgal210αhANPと略称する。
W3110/pGHα210rop-（参考例３）をテトラサイクリンを
含む培地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エキス、1.2％
トリプトン、100mMリン酸水素カリウム（pH7.5））で、
37℃14時間培養した。次に、遠心集菌後10mM Tris/HC1
緩衝液（pH9.3）に懸濁し、超音波処理で菌体を破砕後1
0000g、１分の遠心により沈澱を得た。沈澱は同緩衝液
で洗浄後、5M尿素を含む同緩衝液に可溶化した。可溶化
したサンプルの一部についてはSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行ない、融合蛋白の生産量
を調べた。残りはAPI（アクロモバクタープロテアーゼ
I;和光純薬工業株式会社製）による加水分解後、一部SD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を行な
い、水解が十分に行なわれていることを確認後、YMC-A-
3020DSカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）により解析し、αhANPの量を測定した。HPLCの
結果から見積られるαhANPの量は、SDS-PAGEの結果予想
される量の約1/4であり、αhANPは、融合蛋白の相手で
あるβgal210になんらかの形で保持され、遊離できない
と考えられる。その原因としてβ−ガラクトシダーゼの
210個のアミノ酸残基から成るポリペプチド（βgal21
0）にある３個のシステイン残基のいずれかとαhANPに
ある２個のシステイン残基のいずれかとの間にＳ−Ｓ結
合生じ、αhANPが遊離されないことが予想され、これら
を確かめるために以下の実験を行なった。
含む培地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エキス、1.2％
トリプトン、100mMリン酸水素カリウム（pH7.5））で、
37℃14時間培養した。次に、遠心集菌後10mM Tris/HC1
緩衝液（pH9.3）に懸濁し、超音波処理で菌体を破砕後1
0000g、１分の遠心により沈澱を得た。沈澱は同緩衝液
で洗浄後、5M尿素を含む同緩衝液に可溶化した。可溶化
したサンプルの一部についてはSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行ない、融合蛋白の生産量
を調べた。残りはAPI（アクロモバクタープロテアーゼ
I;和光純薬工業株式会社製）による加水分解後、一部SD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を行な
い、水解が十分に行なわれていることを確認後、YMC-A-
3020DSカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）により解析し、αhANPの量を測定した。HPLCの
結果から見積られるαhANPの量は、SDS-PAGEの結果予想
される量の約1/4であり、αhANPは、融合蛋白の相手で
あるβgal210になんらかの形で保持され、遊離できない
と考えられる。その原因としてβ−ガラクトシダーゼの
210個のアミノ酸残基から成るポリペプチド（βgal21
0）にある３個のシステイン残基のいずれかとαhANPに
ある２個のシステイン残基のいずれかとの間にＳ−Ｓ結
合生じ、αhANPが遊離されないことが予想され、これら
を確かめるために以下の実験を行なった。
B.DTT還元によるαhANPのAPI水解サンプルからの回収率
の増加 Ｓ−Ｓ結合の関与を調べるために、βgal210αhANPのAP
I水解後のサンプルをDTTで還元後、HPLCでαhANP量を測
定した。その結果αhANPの量は、DTTで還元する前に比
べて約４倍に増加し（後記第１表）、実施例１のＡでSD
S-PAGEの結果から予想された量とほぼ一致した。以上の
結果より、API水解後のβgal210αhANPからのαhANPの
回収率の低さは、βgal210とαhANPの間にＳ−Ｓ結合が
存在するためであると推定される。
の増加 Ｓ−Ｓ結合の関与を調べるために、βgal210αhANPのAP
I水解後のサンプルをDTTで還元後、HPLCでαhANP量を測
定した。その結果αhANPの量は、DTTで還元する前に比
べて約４倍に増加し（後記第１表）、実施例１のＡでSD
S-PAGEの結果から予想された量とほぼ一致した。以上の
結果より、API水解後のβgal210αhANPからのαhANPの
回収率の低さは、βgal210とαhANPの間にＳ−Ｓ結合が
存在するためであると推定される。
実施例2.βgal210のシステイン残基のセリン残基への変
換 API水解後のβgal210αhANPからのαhANPの回収率の低
さにβgal210とαhANPの間のＳ−Ｓ結合が関与している
ことを積極的に示すために、またβgal210を、αhANPの
回収率がさらに良くなる融合蛋白の相手とするためにβ
gal210のシステイン残基をすべてセリン残基に置換し
た。なお、β−ガラクトシダーゼの210個のアミノ酸残
基からなりその中のシステイン残基がすべてセリン残基
に変えられているポリペプチドをβgal210（Ser）と称
し、これとα‐hAPNとの融合蛋白質をβgal210（Ser）
αhANPと称する。
換 API水解後のβgal210αhANPからのαhANPの回収率の低
さにβgal210とαhANPの間のＳ−Ｓ結合が関与している
ことを積極的に示すために、またβgal210を、αhANPの
回収率がさらに良くなる融合蛋白の相手とするためにβ
gal210のシステイン残基をすべてセリン残基に置換し
た。なお、β−ガラクトシダーゼの210個のアミノ酸残
基からなりその中のシステイン残基がすべてセリン残基
に変えられているポリペプチドをβgal210（Ser）と称
し、これとα‐hAPNとの融合蛋白質をβgal210（Ser）
αhANPと称する。
A.プラスミドpGHα210（Ser）rop-の作製 βgal210にはＮ末端から76番目、122番目、154番目にシ
ステイン残基が存在する。この３つのシステイン残基
（Cys）がセリン残基（Ser）に変わった融合蛋白質をコ
ードしており且つlacZ′遺伝子をもつプラスミドpGHα2
10（Ser）rop-を作製した。このCys→Serの変換に伴
い、それぞれBglII,BamHI,AvaII制限酵素切断部位を生
じるようにした。
ステイン残基が存在する。この３つのシステイン残基
（Cys）がセリン残基（Ser）に変わった融合蛋白質をコ
ードしており且つlacZ′遺伝子をもつプラスミドpGHα2
10（Ser）rop-を作製した。このCys→Serの変換に伴
い、それぞれBglII,BamHI,AvaII制限酵素切断部位を生
じるようにした。
３μｇのpGHα210rop-を、Ｈ緩衝液〔10mM Tris-HCl（p
H8.0）、7mMMgCl2、100mM NaCl〕50μｌ中で20ユニット
のPvuIと12ユニットのEcoRIにより完全消化した後、電
気泳動的に１番大きいテトラサイクリン耐性遺伝子を含
むDNA断片（第１図中の）を分離し、回収した。同様
に３μｇのpGHα210rop-のDNAをＨ緩衝液50μｌ中で20
ユニットのAvaIと20ユニットのBamHIで完全消化したあ
と、電気泳動的に一番大きいlacZ′210-αhANP遺伝子を
含むDNA断片（第１図中の）を分離回収した。この両D
NA断片とと、各々BalII,BamHI,AvaII切断部位を有
し、システインをコードするコドンがセリンをコードす
るコドンに変わっている以下の塩基配列を有する５′末
端がリン酸化された化学合成一本鎖DNA（第１図
に対応する）： とを混合し、95℃で二重鎖DNAを変性させて一本鎖のDNA
とした後、ゆっくり冷却してアニーリング（対合）させ
ることにより二重鎖形成を行なった。この反応液にdNTP
SとDNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）、およびT4 DNAリ
ガーゼとATPを加えて反応させることにより完全な環状
二重鎖DNAとした。この反応液を用いて大腸菌W3110を形
質転換し、テトラサイクリン耐性を示すクローンを得
た。常法に従って解析し、BglII,BamHI及びAvaII部位が
新たに挿入された目的のプラスミドpGHα210（Ser）rop
-を得た。
H8.0）、7mMMgCl2、100mM NaCl〕50μｌ中で20ユニット
のPvuIと12ユニットのEcoRIにより完全消化した後、電
気泳動的に１番大きいテトラサイクリン耐性遺伝子を含
むDNA断片（第１図中の）を分離し、回収した。同様
に３μｇのpGHα210rop-のDNAをＨ緩衝液50μｌ中で20
ユニットのAvaIと20ユニットのBamHIで完全消化したあ
と、電気泳動的に一番大きいlacZ′210-αhANP遺伝子を
含むDNA断片（第１図中の）を分離回収した。この両D
NA断片とと、各々BalII,BamHI,AvaII切断部位を有
し、システインをコードするコドンがセリンをコードす
るコドンに変わっている以下の塩基配列を有する５′末
端がリン酸化された化学合成一本鎖DNA（第１図
に対応する）： とを混合し、95℃で二重鎖DNAを変性させて一本鎖のDNA
とした後、ゆっくり冷却してアニーリング（対合）させ
ることにより二重鎖形成を行なった。この反応液にdNTP
SとDNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）、およびT4 DNAリ
ガーゼとATPを加えて反応させることにより完全な環状
二重鎖DNAとした。この反応液を用いて大腸菌W3110を形
質転換し、テトラサイクリン耐性を示すクローンを得
た。常法に従って解析し、BglII,BamHI及びAvaII部位が
新たに挿入された目的のプラスミドpGHα210（Ser）rop
-を得た。
B.API水解によるβgal210（Ser）αhANPからのαhANPの
回収 前述のW3110/pGHα210（Ser）rop-株をテトラサイクリ
ンを含む培地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エキス、1.
2％トリプトン、100mMリン酸水素カリウム（pH7.5））
で、37℃14時間培養した。次に、遠心集菌後10mM Tris/
HC1緩衝液（pH9.3）に懸濁し、超音波処理で菌体を破砕
後10000g、５分の遠心により沈澱を得た。沈澱は同緩衝
液で洗浄後、5M尿素を含む同緩衝液に可溶化した。可溶
化したサンプルの一部についてはSDS-PAGEを行ない、融
合蛋白の生産量を調べた。残りはAPI水解後、一部SDS-P
AGEを行ない、水解が十分に行なわれていることを確認
した後、HPLCを用いて解析し、αhANPの量を測定した。
HPLCの結果から見積られるαhANPの量は、SDS-PAGEの結
果予想される量とほぼ一致し、また水解後のサンプルを
DTT還元してもほとんど増加しなかった（第１表）。以
上の結果は、API水解後のαhANPの回収率の低さがβgal
210のシステイン残基に原因があることを示すものであ
る。さらにβgal210（Ser）はDTT還元及びその後の酸化
の操作を経ることなくαhANPを効率よく回収できるαhA
NPとの融合蛋白であることがわかった。
回収 前述のW3110/pGHα210（Ser）rop-株をテトラサイクリ
ンを含む培地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エキス、1.
2％トリプトン、100mMリン酸水素カリウム（pH7.5））
で、37℃14時間培養した。次に、遠心集菌後10mM Tris/
HC1緩衝液（pH9.3）に懸濁し、超音波処理で菌体を破砕
後10000g、５分の遠心により沈澱を得た。沈澱は同緩衝
液で洗浄後、5M尿素を含む同緩衝液に可溶化した。可溶
化したサンプルの一部についてはSDS-PAGEを行ない、融
合蛋白の生産量を調べた。残りはAPI水解後、一部SDS-P
AGEを行ない、水解が十分に行なわれていることを確認
した後、HPLCを用いて解析し、αhANPの量を測定した。
HPLCの結果から見積られるαhANPの量は、SDS-PAGEの結
果予想される量とほぼ一致し、また水解後のサンプルを
DTT還元してもほとんど増加しなかった（第１表）。以
上の結果は、API水解後のαhANPの回収率の低さがβgal
210のシステイン残基に原因があることを示すものであ
る。さらにβgal210（Ser）はDTT還元及びその後の酸化
の操作を経ることなくαhANPを効率よく回収できるαhA
NPとの融合蛋白であることがわかった。
βgal210（Ser）αhANPは、βgal210αhANPと同様に
大腸菌で大量に産生され、菌体破砕後の遠心で特異的
に沈澱画分に移行するため融合蛋白質としての精製が容
易であるという利点に加え、βgal210（Ser）にはシス
テイン残基がなくαhANPとのＳ−Ｓ結合が生じないた
め、βgal210に比べAPI加水分解後のαhANPがDTT還元及
びその後の酸化の操作なしに完全に回収できる利点を持
つ。しかし、αhANPを工業的に大量且つ簡便に製造する
には、尿素溶液への溶解度が小さいため、API水解容
量が大きくなる。βgal210（Ser）αhANPのAPI水解の
効率が若干悪いため、多量のAPIを必要とし、またAPI水
解時間が長くなり、αhANPの修飾が行なわれる可能性が
あるという問題点があった。そこで、次にβgal210（Se
r）αhANPを介してのαhANP製造における長所をもち、
且つ前記問題点を解決するため、融合蛋白質を構成
する相手ポリペプチドの探索の一つとしてβ−ガラクト
シダーゼ領域をさらに短くしたW3110/pGHαBa143により
産生されるβgal97αhANPのＮ末端から76番目のシステ
イン残基をセリン残基に置換したβgal97（Ser）αhANP
の検討を行なった。ここで、β−ガラクトシダーゼの97
個のアミノ酸残基からなるペプチドをβgal97と称し、
このペプチドとα‐hAPNとの融合ペプチドをβgal97αh
ANPと称する。また、このβ−ガラクトシダーゼ由来ペ
プチド中のシステイン残基がセリン残基に変ったものを
βgal97（Ser）と称し、これとα‐hAPNとの融合蛋白質
をβgal97（Ser）αhANPと称する。
大腸菌で大量に産生され、菌体破砕後の遠心で特異的
に沈澱画分に移行するため融合蛋白質としての精製が容
易であるという利点に加え、βgal210（Ser）にはシス
テイン残基がなくαhANPとのＳ−Ｓ結合が生じないた
め、βgal210に比べAPI加水分解後のαhANPがDTT還元及
びその後の酸化の操作なしに完全に回収できる利点を持
つ。しかし、αhANPを工業的に大量且つ簡便に製造する
には、尿素溶液への溶解度が小さいため、API水解容
量が大きくなる。βgal210（Ser）αhANPのAPI水解の
効率が若干悪いため、多量のAPIを必要とし、またAPI水
解時間が長くなり、αhANPの修飾が行なわれる可能性が
あるという問題点があった。そこで、次にβgal210（Se
r）αhANPを介してのαhANP製造における長所をもち、
且つ前記問題点を解決するため、融合蛋白質を構成
する相手ポリペプチドの探索の一つとしてβ−ガラクト
シダーゼ領域をさらに短くしたW3110/pGHαBa143により
産生されるβgal97αhANPのＮ末端から76番目のシステ
イン残基をセリン残基に置換したβgal97（Ser）αhANP
の検討を行なった。ここで、β−ガラクトシダーゼの97
個のアミノ酸残基からなるペプチドをβgal97と称し、
このペプチドとα‐hAPNとの融合ペプチドをβgal97αh
ANPと称する。また、このβ−ガラクトシダーゼ由来ペ
プチド中のシステイン残基がセリン残基に変ったものを
βgal97（Ser）と称し、これとα‐hAPNとの融合蛋白質
をβgal97（Ser）αhANPと称する。
実施例3.pGHα97Sの作製 A.pGHα97（Ser）rop-の作製 βgal97αhANPのＮ末端から76番目のアミノ酸であるシ
ステインをセリンにかえたβgal97（Ser）αhANPの遺伝
子を持つプラスミドpGHα97（Ser）rop-を作製した。
ステインをセリンにかえたβgal97（Ser）αhANPの遺伝
子を持つプラスミドpGHα97（Ser）rop-を作製した。
10μｇのpGHαBal43（参考例５）をＨ緩衝液70μｌ中で
50ユニットのPstI及び50ユニットのDdeIで完全消化した
後、アガロースゲル電気泳動を行ない、283塩基対から
なるαhANP遺伝子を含むDNA断片（第２図中の）を分
離、回収した。次に３μｇのpGHα210（Ser）rop-（実
施例１）を50μｌのＨ緩衝溶液中、20ユニットのPvuI及
び20ユニットのPstIで完全消化後電気泳動的に一番大き
いテトラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA断片（第２図
中の）を分離、回収した。さらに10μｇのpGHα210
（Ser）rop-をＨ緩衝液70μｌ中で50ユニットのPvuI及
び50ユニットのDdeIで完全消化後、アガロースゲル電気
泳動を行ない、101塩基対から成るlacZ′遺伝子の一部
を含むDNA断片（第２図中の）を分離、回収した。こ
れらののDNA断片をライゲーション後、この反応
液で大腸菌W3110を形質転換し、テトラサイクリン耐性
のクローンを得た。常法に従って解析し、制限酵素BglI
I切断部位が新たに挿入された、すなわち、Ｎ末端から7
6番目のアミノ酸システインがセリンに変わった融合蛋
白質をコードするlacZ′遺伝子を持つ目的のプラスミド
pGHα97（Ser）rop-を得た。
50ユニットのPstI及び50ユニットのDdeIで完全消化した
後、アガロースゲル電気泳動を行ない、283塩基対から
なるαhANP遺伝子を含むDNA断片（第２図中の）を分
離、回収した。次に３μｇのpGHα210（Ser）rop-（実
施例１）を50μｌのＨ緩衝溶液中、20ユニットのPvuI及
び20ユニットのPstIで完全消化後電気泳動的に一番大き
いテトラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA断片（第２図
中の）を分離、回収した。さらに10μｇのpGHα210
（Ser）rop-をＨ緩衝液70μｌ中で50ユニットのPvuI及
び50ユニットのDdeIで完全消化後、アガロースゲル電気
泳動を行ない、101塩基対から成るlacZ′遺伝子の一部
を含むDNA断片（第２図中の）を分離、回収した。こ
れらののDNA断片をライゲーション後、この反応
液で大腸菌W3110を形質転換し、テトラサイクリン耐性
のクローンを得た。常法に従って解析し、制限酵素BglI
I切断部位が新たに挿入された、すなわち、Ｎ末端から7
6番目のアミノ酸システインがセリンに変わった融合蛋
白質をコードするlacZ′遺伝子を持つ目的のプラスミド
pGHα97（Ser）rop-を得た。
このプラスミドを含有する大腸菌Escherichiacoli SBM2
88は、微工研条寄第1253号（FERM BP-1253）として、工
業技術院微生物工業技術研究所にブタペスト条件に基き
国際寄託されている。
88は、微工研条寄第1253号（FERM BP-1253）として、工
業技術院微生物工業技術研究所にブタペスト条件に基き
国際寄託されている。
B.pGHα97Sの作製 W3110/pGHα97（Ser）rop-をテトラサイクリンを含む培
地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エキス、1.2％トリプ
トン、100mMリン酸水素カリウムpH7.5）で37℃14時間培
養した場合、βgal97（Ser）αhANPの産生はβgal97αh
ANPに比べてかなり少なく、SDS-PAGEでわずかに対応す
るバンドが検出できる程度であった。そこで生産性を増
加させることを目的としてαhANPの構造遺伝子の直後に
トリプトファンオペロンのアテニュエーターターミネー
ター（以後trp aと略す）を挿入したプラスミドpGHα97
Sを作製した。
地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エキス、1.2％トリプ
トン、100mMリン酸水素カリウムpH7.5）で37℃14時間培
養した場合、βgal97（Ser）αhANPの産生はβgal97αh
ANPに比べてかなり少なく、SDS-PAGEでわずかに対応す
るバンドが検出できる程度であった。そこで生産性を増
加させることを目的としてαhANPの構造遺伝子の直後に
トリプトファンオペロンのアテニュエーターターミネー
ター（以後trp aと略す）を挿入したプラスミドpGHα97
Sを作製した。
10μｇのpGHα97（Ser）rop-をＨ緩衝液100μｌ中で50
ユニットのBglII及び50ユニットのRsaIで完全消化した
後、電気泳動により154塩基対（bp）からなる、βgal97
（Ser）のＣ末端及びαhANPのＮ末端をコードする遺伝
子を含むDNA断片（第３図）を分離、回収した。次に
３μg pGHα97（Ser）rop-をＳ緩衝溶液〔150mM NaCl、
7mMMgCl2、10mM Tris-HCl（pH8.0）〕50μｌ中で20ユニ
ットのBglII及び40ユニットのSalIで完全消化した後、
電気泳動的に一番大きい複製開始点を含むDNA断片（第
３図の）を分離、回収した。さらに、３μｇのpBR322
をＳ緩衝溶液50μｌ中で10ユニットのEcoRI及び40ユニ
ットのSalIで完全消化した後、電気泳動的に、小さい方
のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領域を含
むDNA断片（第３図の）を分離、回収した。これらのD
NA断片、と、それぞれの末端にRsaI平滑末端とEc
oRI粘着末端を有し、かつ以下の塩基配列を有する化学
合成DNA断片（trp a）（第３図中の）： をライゲーションした後、この反応液で大腸菌W3110を
形質転換し、テトラサイクリン耐性のクローンを得た。
これらを常法に従って解析し、目的のクローンを得た。
ユニットのBglII及び50ユニットのRsaIで完全消化した
後、電気泳動により154塩基対（bp）からなる、βgal97
（Ser）のＣ末端及びαhANPのＮ末端をコードする遺伝
子を含むDNA断片（第３図）を分離、回収した。次に
３μg pGHα97（Ser）rop-をＳ緩衝溶液〔150mM NaCl、
7mMMgCl2、10mM Tris-HCl（pH8.0）〕50μｌ中で20ユニ
ットのBglII及び40ユニットのSalIで完全消化した後、
電気泳動的に一番大きい複製開始点を含むDNA断片（第
３図の）を分離、回収した。さらに、３μｇのpBR322
をＳ緩衝溶液50μｌ中で10ユニットのEcoRI及び40ユニ
ットのSalIで完全消化した後、電気泳動的に、小さい方
のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領域を含
むDNA断片（第３図の）を分離、回収した。これらのD
NA断片、と、それぞれの末端にRsaI平滑末端とEc
oRI粘着末端を有し、かつ以下の塩基配列を有する化学
合成DNA断片（trp a）（第３図中の）： をライゲーションした後、この反応液で大腸菌W3110を
形質転換し、テトラサイクリン耐性のクローンを得た。
これらを常法に従って解析し、目的のクローンを得た。
C.βgal97（Ser）αhANPの産生、 W3110/pGHα97（Ser）rop-及びW3110/pGHα97Sをテトラ
サイクリンを含む培地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エ
キス、1.2％トリプトン、100mMリン酸水素カリウムpH7.
5）で37℃14時間培養後、SDS-PAGEを行ない、βgal97
（Ser）αhANPの生産性を比較した。その結果、αhANP
遺伝子の直後にtrP aを挿入することによりβgal97（Se
r）αhANPの産生を著しく増加することができた（第４
図）。W3110/pGHα97Sを用いて産生したβgal97（Ser）
αhANPの量は、W3110/pGHα210（Ser）rop-を用いて産
生したβgal210（Ser）αhANPの量とほぼ等しく、αhAN
Pに換算するとき、培地当たり約２倍の生産性を示し
た。また、βgal97（Ser）αhANPも、βgal210αhANPや
βgal210（Ser）αhANPと同様、菌体破砕後の遠心で、
大腸菌由来の蛋白質の少ない沈澱画分に移行した（第５
図）。βgal97αhANPのAPI水解後のサンプルをDTTで還
元するときβgal210αhANPの場合と同様にαhANPの量が
増加するのに比べ、βgal97（Ser）αhANPのAPI水解後
のサンプルは、βgal210（Ser）αhANPの場合と同様DTT
還元によりαhANPの量はあまり増えなかった（第２
表）。さらに、βgal97（Ser）αhANPは、βgal210（Se
r）αhANPと比べて5M尿素溶液への溶解度が約10倍（αh
ANP換算約21倍）大きくAPI水解の感受性は、約100倍
（αhANP換算約200倍）高かった。
サイクリンを含む培地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エ
キス、1.2％トリプトン、100mMリン酸水素カリウムpH7.
5）で37℃14時間培養後、SDS-PAGEを行ない、βgal97
（Ser）αhANPの生産性を比較した。その結果、αhANP
遺伝子の直後にtrP aを挿入することによりβgal97（Se
r）αhANPの産生を著しく増加することができた（第４
図）。W3110/pGHα97Sを用いて産生したβgal97（Ser）
αhANPの量は、W3110/pGHα210（Ser）rop-を用いて産
生したβgal210（Ser）αhANPの量とほぼ等しく、αhAN
Pに換算するとき、培地当たり約２倍の生産性を示し
た。また、βgal97（Ser）αhANPも、βgal210αhANPや
βgal210（Ser）αhANPと同様、菌体破砕後の遠心で、
大腸菌由来の蛋白質の少ない沈澱画分に移行した（第５
図）。βgal97αhANPのAPI水解後のサンプルをDTTで還
元するときβgal210αhANPの場合と同様にαhANPの量が
増加するのに比べ、βgal97（Ser）αhANPのAPI水解後
のサンプルは、βgal210（Ser）αhANPの場合と同様DTT
還元によりαhANPの量はあまり増えなかった（第２
表）。さらに、βgal97（Ser）αhANPは、βgal210（Se
r）αhANPと比べて5M尿素溶液への溶解度が約10倍（αh
ANP換算約21倍）大きくAPI水解の感受性は、約100倍
（αhANP換算約200倍）高かった。
実施例4.βgal97（Ser）αhANPのAPI水解高感受性の原
因追求 βgal97（Ser）αhANP中のβgal97（Ser）とαhANPとは
Gln‐Phe-Lysで結合しており、API水解によりLysのＣ末
端側のペプチド結合が切られる。一方βgal210（Ser）
αhANPの場合はGlu‐Phe-Lysで結合している。βgal97
（Ser）αhANPがβgal210（Ser）αhANPに比べ、API水
解を受けやすいのは、フェニルアラニンのＮ末端側にお
けるGlu→Glnの変化に伴いσ位のカルボキシル基がカル
ボキシアミドに変わってマイナスの電荷がなくなり、リ
ジンのプラス電荷との干渉がなくなったためであると仮
定して、βgal97（Ser）とαhANPとの結合部位をGlu-Ph
e-Lysに換えたβgal97（Ser）αhANPの遺伝子をもつpGH
α97SEを作製し、検討した。
因追求 βgal97（Ser）αhANP中のβgal97（Ser）とαhANPとは
Gln‐Phe-Lysで結合しており、API水解によりLysのＣ末
端側のペプチド結合が切られる。一方βgal210（Ser）
αhANPの場合はGlu‐Phe-Lysで結合している。βgal97
（Ser）αhANPがβgal210（Ser）αhANPに比べ、API水
解を受けやすいのは、フェニルアラニンのＮ末端側にお
けるGlu→Glnの変化に伴いσ位のカルボキシル基がカル
ボキシアミドに変わってマイナスの電荷がなくなり、リ
ジンのプラス電荷との干渉がなくなったためであると仮
定して、βgal97（Ser）とαhANPとの結合部位をGlu-Ph
e-Lysに換えたβgal97（Ser）αhANPの遺伝子をもつpGH
α97SEを作製し、検討した。
A.pGHα97SEの作製 ３μｇのpGHα97S（実施例３）をＨ緩衝液50μｌ中で20
ユニットのBamHIと20ユニットのAvaIにより完全消化し
た後、電気泳動的に１番大きいαhANP遺伝子を含むDNA
断片（第６図中の）を分離、回収した。同様に３μｇ
のpGHα97SをＨ緩衝液50μｌ中で20ユニットのBglII及
び20ユニットのEcoRIで完全に消化した後、電気泳動的
に一番大きいテトラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA断
片（第６図中の）を分離、回収した。この両DNA断片
と、EcoRI切断部位を有し、グルタミンをコードす
るコドンがグルタミン酸をコードするコドンに変わった
以下の塩基配列を有する５′末端がリン酸化された化学
合成一本鎖DNA（第６図中の） とを混合し、95℃で二重鎖DNAを変性させて一本鎖DNAと
した後、ゆっくり冷却し、アニーリング（対合）させる
ことにより、二重鎖形成を行なった。この反応液にdNTP
SとDNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）、およびT4DNAリ
ガーゼとATPを加えて反応させることにより完全な二重
鎖DNAを形成させた。この反応液を用いて大腸菌W3110を
形質転換し、テトラサイクリン耐性を示すクローンを得
た。常法に従って解析し、新たにEcoRI切断部位が挿入
された、すなわちβgalα97（Ser）とαhANPの連結部位
のアミノ酸がGlnPhe LysからGlu Phe Lysに変わったβg
alα97（Ser）αhANPの遺伝子を持つプラスミドβgalα
97SEを得た。
ユニットのBamHIと20ユニットのAvaIにより完全消化し
た後、電気泳動的に１番大きいαhANP遺伝子を含むDNA
断片（第６図中の）を分離、回収した。同様に３μｇ
のpGHα97SをＨ緩衝液50μｌ中で20ユニットのBglII及
び20ユニットのEcoRIで完全に消化した後、電気泳動的
に一番大きいテトラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA断
片（第６図中の）を分離、回収した。この両DNA断片
と、EcoRI切断部位を有し、グルタミンをコードす
るコドンがグルタミン酸をコードするコドンに変わった
以下の塩基配列を有する５′末端がリン酸化された化学
合成一本鎖DNA（第６図中の） とを混合し、95℃で二重鎖DNAを変性させて一本鎖DNAと
した後、ゆっくり冷却し、アニーリング（対合）させる
ことにより、二重鎖形成を行なった。この反応液にdNTP
SとDNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）、およびT4DNAリ
ガーゼとATPを加えて反応させることにより完全な二重
鎖DNAを形成させた。この反応液を用いて大腸菌W3110を
形質転換し、テトラサイクリン耐性を示すクローンを得
た。常法に従って解析し、新たにEcoRI切断部位が挿入
された、すなわちβgalα97（Ser）とαhANPの連結部位
のアミノ酸がGlnPhe LysからGlu Phe Lysに変わったβg
alα97（Ser）αhANPの遺伝子を持つプラスミドβgalα
97SEを得た。
B.βgal97α（Ser）hANPとβgal97（Ser）ＥαhANPのAP
I効率の比較 W3110/pGHα97S及びW3110/pGHα97SEをテトラサイクリ
ンを含む培地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エキス、1.
2％トリプトン、100mMリン酸水素カリウム（pH7.5））
で、37℃14時間培養した。次に、遠心集菌後10mM Tris/
HCl緩衝液（pH9.3）に懸濁し、超音波処理で菌体を破砕
後10000g、１分の遠心により沈澱を得た。沈澱は同緩衝
液で洗浄後、5M尿素を含む同緩衝液に可溶化した。可溶
化したサンプルは、４つに分けそれぞれ0,1,5,25ng/5μ
ｇαhANPのAPIを加え、30℃45分処理後、調整し、SDS-P
AGEを行なった。その結果、βgal97（Ser）とαhANPの
結合部位がGln-Phe-LysでもGlu-Phe-LysでもAPI水解の
効率は変わらなかった（第７図）。
I効率の比較 W3110/pGHα97S及びW3110/pGHα97SEをテトラサイクリ
ンを含む培地（0.5％グリセリン、2.4％酵母エキス、1.
2％トリプトン、100mMリン酸水素カリウム（pH7.5））
で、37℃14時間培養した。次に、遠心集菌後10mM Tris/
HCl緩衝液（pH9.3）に懸濁し、超音波処理で菌体を破砕
後10000g、１分の遠心により沈澱を得た。沈澱は同緩衝
液で洗浄後、5M尿素を含む同緩衝液に可溶化した。可溶
化したサンプルは、４つに分けそれぞれ0,1,5,25ng/5μ
ｇαhANPのAPIを加え、30℃45分処理後、調整し、SDS-P
AGEを行なった。その結果、βgal97（Ser）とαhANPの
結合部位がGln-Phe-LysでもGlu-Phe-LysでもAPI水解の
効率は変わらなかった（第７図）。
以上の結果よりβgal97（Ser）αhANPのAPI水解がβgal
210（Ser）αhANPのそれに比べて効率的であるのは、局
所的な電荷の干渉のためではないと結論できた。βgal9
7（Ser）αhANP自身の構造によりリジン残基がAPIによ
りアタックされやすいと思われる。
210（Ser）αhANPのそれに比べて効率的であるのは、局
所的な電荷の干渉のためではないと結論できた。βgal9
7（Ser）αhANP自身の構造によりリジン残基がAPIによ
りアタックされやすいと思われる。
実施例5.pPLlacZ′97（Ser）αhANPの作製 pGHα97Sの1acプロモーターをλファージ由来のPLプロ
モーターに変換したpPLlacZ′97（Ser）αhANPを作製し
た。
モーターに変換したpPLlacZ′97（Ser）αhANPを作製し
た。
10μｇのpPLlacZ′210αhANP（参考例４）を100μｌの
Ｈ緩衝液中で50ユニットのEcoRI及び50ユニットのPvuI
で完全消化後、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行な
い143塩基対からなるβガラクトシダーゼのＮ末端をコ
ードするlacZ′遺伝子を含むDNA断片（第８図中の）
を分離、精製した。同様に３μｇのpPLlacZ′210αhANP
を50μｌのＨ緩衝液中の20ユニットのEcoRIと20ユニッ
トでAvaIで完全に消化した後、電気泳動的に一番大きい
PLプロモーター及びアンピシリン耐性遺伝子を含むDNA
断片（第８図中の）を分離、精製した。この２つのDN
A断片及び、並びに３μｇのpGHα97SをＨ緩衝液50
μｌ中で10ユニットのPvuIと10ユニットのAva Iで完全
消化した後のDNA断片をライゲーションした後、この
反応液で大腸菌W3110/CI（CI857遺伝子及びカナマイシ
ン耐性遺伝子を含むプラスミドを保持するW3110株）を
形質転換し、テトラサイクリン、アンピシリン及びカナ
マイシン耐性のクローンを得た。これらを常法に従って
解析し、目的のクローンを得た。
Ｈ緩衝液中で50ユニットのEcoRI及び50ユニットのPvuI
で完全消化後、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行な
い143塩基対からなるβガラクトシダーゼのＮ末端をコ
ードするlacZ′遺伝子を含むDNA断片（第８図中の）
を分離、精製した。同様に３μｇのpPLlacZ′210αhANP
を50μｌのＨ緩衝液中の20ユニットのEcoRIと20ユニッ
トでAvaIで完全に消化した後、電気泳動的に一番大きい
PLプロモーター及びアンピシリン耐性遺伝子を含むDNA
断片（第８図中の）を分離、精製した。この２つのDN
A断片及び、並びに３μｇのpGHα97SをＨ緩衝液50
μｌ中で10ユニットのPvuIと10ユニットのAva Iで完全
消化した後のDNA断片をライゲーションした後、この
反応液で大腸菌W3110/CI（CI857遺伝子及びカナマイシ
ン耐性遺伝子を含むプラスミドを保持するW3110株）を
形質転換し、テトラサイクリン、アンピシリン及びカナ
マイシン耐性のクローンを得た。これらを常法に従って
解析し、目的のクローンを得た。
実施例6.pINlacZ′97（Ser）αhANPの作製 プラスミドpPLlacZ′97（Ser）αhANPのPLプロモーター
を大腸菌外膜タンパクリポプロテインの1ppプロモータ
ーに変換したプラスミドpINlacZ′97（Ser）αhANPを作
製した。
を大腸菌外膜タンパクリポプロテインの1ppプロモータ
ーに変換したプラスミドpINlacZ′97（Ser）αhANPを作
製した。
10μｇのpPLlacZ′97（Ser）αhANPをＨ緩衝液100μｌ
中で50ユニットのBamHIで完全消化後、５ユニットのEco
RIで部分消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行な
い、809塩基対からなるβgal97（Ser）‐αhANP構造遺
伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領
域を含むEcoRI-BamHI DNA断片（第９図中の）を、分
離、精製した。次に３μｇのプラスミドpIN5T4（特開昭
S61-132186及び参考例６）をＨ緩衝液50μｌ中で20ユニ
ットのEcoRI及び20ユニットのBamHIで完全消化後、電気
泳動的に一番大きい1ppプロモーターを含むDNA断片（第
９図中の）を分離精製した。これらの２つのDNA断片
，をライゲーションした後、大腸菌W3110に形質転
換し、テトラサイクリン耐性のクローンを得た。常法に
従って解析し目的のクローンを得た。
中で50ユニットのBamHIで完全消化後、５ユニットのEco
RIで部分消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行な
い、809塩基対からなるβgal97（Ser）‐αhANP構造遺
伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領
域を含むEcoRI-BamHI DNA断片（第９図中の）を、分
離、精製した。次に３μｇのプラスミドpIN5T4（特開昭
S61-132186及び参考例６）をＨ緩衝液50μｌ中で20ユニ
ットのEcoRI及び20ユニットのBamHIで完全消化後、電気
泳動的に一番大きい1ppプロモーターを含むDNA断片（第
９図中の）を分離精製した。これらの２つのDNA断片
，をライゲーションした後、大腸菌W3110に形質転
換し、テトラサイクリン耐性のクローンを得た。常法に
従って解析し目的のクローンを得た。
実施例7.αhANPの精製 実施例３で作製したW3110/pGHα97S株をテトラサイクリ
ンを含む培地（0.4％酵母エキス、0.4％KH2PO4、0.4％K
2HPO4、0.3％Na2HPO4、0.02％NH4Cl、0.12％(NH4)2S
O4、0.1％Mg2SO4・7H2O、1.5％グリコース、pH7.0、２
％グリセリン４回添加）で37℃18時間、30l容量（実容
量20l）のジャーファーメンターを用いて培養した。次
に培養液を高圧ホモジナイザー（Manton Gaulin Labora
tory Homogenizer 15M-8TA）を用い、8000psiで破砕し
た後、遠心分離により沈澱画分を得た。沈澱画分を10mM
Tris-HCl（pH9.3）で洗浄した後、8M尿素溶液で可溶化
し、さらに27mM Tris-HCl（pH9.3）を加え、5M尿素溶液
とした。これを、40AUのAPI（和光純薬工業株式会社
製）を30℃、60分間処理したのち、カートリッジフィル
ター（日本ミリポアリミテッドCWSC）でろ過し、次に、
Zeta prep QAE（日本ミリポアリミテッド）社製を用い
るカラムクロマトグラフィーにかけた。このとき、融合
蛋白の相手であるβgal97（Ser）はQAEに吸着し除かれ
る。素通り画分に酢酸を加えてpH5.0としたのち、10mM
ギ酸アンミニウム（pH5.0）5M尿素で平衡化したCMトヨ
パール650Mを用いるカラムクロマトグラフィーにかけ
た。αhANPは、225mM及び400mMのNaClで段階的に溶出し
た。αhANP画分に酢酸を加え、SPW-C-ODS（ケムコ社）
カラムを用いたMPLC（山村化学）で脱塩後、C18‐HPLC
にかけ、αhANP標品を得た。
ンを含む培地（0.4％酵母エキス、0.4％KH2PO4、0.4％K
2HPO4、0.3％Na2HPO4、0.02％NH4Cl、0.12％(NH4)2S
O4、0.1％Mg2SO4・7H2O、1.5％グリコース、pH7.0、２
％グリセリン４回添加）で37℃18時間、30l容量（実容
量20l）のジャーファーメンターを用いて培養した。次
に培養液を高圧ホモジナイザー（Manton Gaulin Labora
tory Homogenizer 15M-8TA）を用い、8000psiで破砕し
た後、遠心分離により沈澱画分を得た。沈澱画分を10mM
Tris-HCl（pH9.3）で洗浄した後、8M尿素溶液で可溶化
し、さらに27mM Tris-HCl（pH9.3）を加え、5M尿素溶液
とした。これを、40AUのAPI（和光純薬工業株式会社
製）を30℃、60分間処理したのち、カートリッジフィル
ター（日本ミリポアリミテッドCWSC）でろ過し、次に、
Zeta prep QAE（日本ミリポアリミテッド）社製を用い
るカラムクロマトグラフィーにかけた。このとき、融合
蛋白の相手であるβgal97（Ser）はQAEに吸着し除かれ
る。素通り画分に酢酸を加えてpH5.0としたのち、10mM
ギ酸アンミニウム（pH5.0）5M尿素で平衡化したCMトヨ
パール650Mを用いるカラムクロマトグラフィーにかけ
た。αhANPは、225mM及び400mMのNaClで段階的に溶出し
た。αhANP画分に酢酸を加え、SPW-C-ODS（ケムコ社）
カラムを用いたMPLC（山村化学）で脱塩後、C18‐HPLC
にかけ、αhANP標品を得た。
最終的に得られたαhANP標品は、YMC-A-3020DSカラムを
用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（Waters社製）
の結果、一本のピークであった（第10図）。また、自動
アミノ酸分析器（日立製作所製835-50）による、アミノ
酸分析の結果得られたαhANP標品のアミノ酸組成はαhA
NPのアミノ酸配列から予想される値と一致し、さらに、
気相プロテインシークエンサーModel 470A（Applied Bi
osystem社製）により得られた標品のアミノ酸配列は、
αhANPのそれに完全に一致した。
用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（Waters社製）
の結果、一本のピークであった（第10図）。また、自動
アミノ酸分析器（日立製作所製835-50）による、アミノ
酸分析の結果得られたαhANP標品のアミノ酸組成はαhA
NPのアミノ酸配列から予想される値と一致し、さらに、
気相プロテインシークエンサーModel 470A（Applied Bi
osystem社製）により得られた標品のアミノ酸配列は、
αhANPのそれに完全に一致した。
さらに、このαhANP標品は、SD系ラットにおける利尿
・降圧活性、ヒヨコの直腸弛緩活性、ラジオイムノ
アッセイによる免疫交叉活性に関して化学的に合成した
αhANP標品（ペプチド研製）と等価であった。
・降圧活性、ヒヨコの直腸弛緩活性、ラジオイムノ
アッセイによる免疫交叉活性に関して化学的に合成した
αhANP標品（ペプチド研製）と等価であった。
本発明における方法を用いれば、１の培養液から約5g
の融合蛋白（αhANP約1gに相当）が得られ、精製効率約
50％で純粋なαhANPを得ることができる。この様な高生
産性及び精製効率は、本発明の製造法が如何に秀れてい
るかを物語っており、工業的に極めて有用である。
の融合蛋白（αhANP約1gに相当）が得られ、精製効率約
50％で純粋なαhANPを得ることができる。この様な高生
産性及び精製効率は、本発明の製造法が如何に秀れてい
るかを物語っており、工業的に極めて有用である。
尚、実施例５で作製したpPLlacZ′97（Ser）αhANPで形
質転換したW3110/C1／pPLlacZ′97（Ser）αhANPおよび
実施例６で作製したpINlacZ′97（Ser）αhANPで形質転
換したW3110/pINlacZ′97（Ser）αhANPを用いても菌体
蛋白の約30％に当たるβgal97（Ser）αhANPを、沈澱
（不溶）画分から得ることができる。
質転換したW3110/C1／pPLlacZ′97（Ser）αhANPおよび
実施例６で作製したpINlacZ′97（Ser）αhANPで形質転
換したW3110/pINlacZ′97（Ser）αhANPを用いても菌体
蛋白の約30％に当たるβgal97（Ser）αhANPを、沈澱
（不溶）画分から得ることができる。
実施例8.pG97SHPCTの作製 A.pG97S18の作製 ５μｇのプラスミドpGHα97SEを100μｌのＳ緩衝液中で
12ユニットのEcoRIと80ユニットのSalIで完全消化した
後アガロースゲル電気泳動により一番大きいDNA断片
を分離、精製した。次に５μｇのプラスミドpGHα97SE
を100μｌのＳ緩衝液中で80ユニットのSalIで完全消化
した後アガロースゲル電気泳動により２番目に大きいテ
トラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領域を含むDN
A断片を分離、精製した。次に１μｇのプラスミドpUC
18（宝酒造より購入）を100μｌのＳ緩衝液中で12ユニ
ットのEcoRIと80ユニットのSalIで完全消化した後、フ
ェノール処理で酵素を失活、エタノール沈澱によりフェ
ノール及び塩を除いた。先に精製したDNA断片，
とpUC18をEcoRIとSalIで消化したものを混合してライ
ゲーションした後、この溶液で大腸菌W3110株を形質転
換、テトラサイクリン耐性のクローンを得た。常法に従
って解析し、pGHα97SEのαhANP遺伝子をコードするEco
RI-SalI DNA断片が以下に示すpUC18のポリリンカー部位
のEcoRI-SalI DNA断片、 に置換されたプラスミドpG97S18を得た。
12ユニットのEcoRIと80ユニットのSalIで完全消化した
後アガロースゲル電気泳動により一番大きいDNA断片
を分離、精製した。次に５μｇのプラスミドpGHα97SE
を100μｌのＳ緩衝液中で80ユニットのSalIで完全消化
した後アガロースゲル電気泳動により２番目に大きいテ
トラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領域を含むDN
A断片を分離、精製した。次に１μｇのプラスミドpUC
18（宝酒造より購入）を100μｌのＳ緩衝液中で12ユニ
ットのEcoRIと80ユニットのSalIで完全消化した後、フ
ェノール処理で酵素を失活、エタノール沈澱によりフェ
ノール及び塩を除いた。先に精製したDNA断片，
とpUC18をEcoRIとSalIで消化したものを混合してライ
ゲーションした後、この溶液で大腸菌W3110株を形質転
換、テトラサイクリン耐性のクローンを得た。常法に従
って解析し、pGHα97SEのαhANP遺伝子をコードするEco
RI-SalI DNA断片が以下に示すpUC18のポリリンカー部位
のEcoRI-SalI DNA断片、 に置換されたプラスミドpG97S18を得た。
B.pG97SHPCTの作製 ５μｇのプラスミドpG97S18を50μｌのＨ緩衝液中で12
ユニットのEcoRIと12ユニットBamHIで完全消化した後、
アガロースゲル電気泳動により一番大きなDNA断片を
分離、精製した。次に５μｇのプラスミドpGH97S18を50
のＨ緩衝液中で12ユニットのBamHIで完全消化後、テト
ラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領域を含むDNA
断片をアガロースゲル電気泳動により分離、精製し
た。次に10μｇのプラスミドpAHPCT38をＭ緩衝液中で12
ユニットのBamHIと24ユニットのKpnIで完全消化した
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ヒトカル
シトニンのＮ末端から７番目のTyrから32番目のPro及び
これに続くGlyLysLysArgをコードする、81bpからなるKp
nI-BamHI DNA断片を分離、精製した。このDNA断片
，及びと、各々の末端にEcoRI粘着部位とKpnI粘
着部位を有し、かつ以下のDNA塩基配列を有する５′末
端をリン酸化された合成DNA断片、 を混合してライゲーションした後、この溶液で大腸菌W3
110株を形質転換、テトラサイクリン耐性のクローンを
得た。常法に従って解析し、目的のプラスミドpG97SHPC
Tを得た（第19図参照）。
ユニットのEcoRIと12ユニットBamHIで完全消化した後、
アガロースゲル電気泳動により一番大きなDNA断片を
分離、精製した。次に５μｇのプラスミドpGH97S18を50
のＨ緩衝液中で12ユニットのBamHIで完全消化後、テト
ラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター領域を含むDNA
断片をアガロースゲル電気泳動により分離、精製し
た。次に10μｇのプラスミドpAHPCT38をＭ緩衝液中で12
ユニットのBamHIと24ユニットのKpnIで完全消化した
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ヒトカル
シトニンのＮ末端から７番目のTyrから32番目のPro及び
これに続くGlyLysLysArgをコードする、81bpからなるKp
nI-BamHI DNA断片を分離、精製した。このDNA断片
，及びと、各々の末端にEcoRI粘着部位とKpnI粘
着部位を有し、かつ以下のDNA塩基配列を有する５′末
端をリン酸化された合成DNA断片、 を混合してライゲーションした後、この溶液で大腸菌W3
110株を形質転換、テトラサイクリン耐性のクローンを
得た。常法に従って解析し、目的のプラスミドpG97SHPC
Tを得た（第19図参照）。
なお、プラスミドpAHPCT38については、特開昭58-20395
3に記載され、pAHPCT38を持つ大腸菌（E15/pAHPCT38）S
BMC138は工業技術院微生物工業研究所に微工研菌寄第65
23号（FERM P-6523）として寄託され、微工研条寄第283
号（FERM BP-283）としてブダペスト条約に基く国際寄
託に移管された。
3に記載され、pAHPCT38を持つ大腸菌（E15/pAHPCT38）S
BMC138は工業技術院微生物工業研究所に微工研菌寄第65
23号（FERM P-6523）として寄託され、微工研条寄第283
号（FERM BP-283）としてブダペスト条約に基く国際寄
託に移管された。
実施例9.ヒトカルシトニン前駆体の精製 前述のpG97SHPCTによって形質転換された大腸菌W3110/p
G97SHPCT株をテトラサイクリンを含む培地（0.5％グリ
セロール、2.4％酵母エキス、1.2％トリプトン、100mM
リン酸カリウム（pH7.5））で37℃、16時間培養した。
次に、培養液を遠心して得た菌を10mMトリス塩酸（pH7.
8）に懸濁後、フレンチプレス細胞破砕機（SLM-AMINCO
社製）を用い8000psiで破砕、10000g、10分の遠心を行
った。この上清画分と沈澱画分についてSDS-PAGEを行っ
たところβgal97SHPCTは、βgal97（Ser）αhANPと同程
度に生産され、同様に特異的に沈澱画分に回収されるこ
とがわかった。この沈澱画分を8M尿素水溶液に懸濁した
後、３容量の67mMトリス塩酸（pH7.8）を加え、2M尿素
水溶液とした。これに基質の1/2000（W/W）量のV8プロ
テアーゼ（Boehringer Mannheim社より購入）を加え、3
7℃、10分間処理した。一部をとりYMC-A-0020DSをつけ
た逆相高速液体クロマトグラフィ（島津製作所）で解析
したところβgal97SHPCTに存在する全部で10個のグルタ
ミン酸のうちβgal97SとHPCTの間のグルタミン酸が最も
切断されやすく、特異的にHPCTが切りだされ、その回収
率は約70％であった（第20図）。さらに、この溶液を2M
尿素を含む50mMトリス塩酸（pH7.8）で平衡化したZeta-
Prep QAE クロストを行い、素通り画分に約95％純度のH
PCTをほぼ100％の回収率で得ることができた。
G97SHPCT株をテトラサイクリンを含む培地（0.5％グリ
セロール、2.4％酵母エキス、1.2％トリプトン、100mM
リン酸カリウム（pH7.5））で37℃、16時間培養した。
次に、培養液を遠心して得た菌を10mMトリス塩酸（pH7.
8）に懸濁後、フレンチプレス細胞破砕機（SLM-AMINCO
社製）を用い8000psiで破砕、10000g、10分の遠心を行
った。この上清画分と沈澱画分についてSDS-PAGEを行っ
たところβgal97SHPCTは、βgal97（Ser）αhANPと同程
度に生産され、同様に特異的に沈澱画分に回収されるこ
とがわかった。この沈澱画分を8M尿素水溶液に懸濁した
後、３容量の67mMトリス塩酸（pH7.8）を加え、2M尿素
水溶液とした。これに基質の1/2000（W/W）量のV8プロ
テアーゼ（Boehringer Mannheim社より購入）を加え、3
7℃、10分間処理した。一部をとりYMC-A-0020DSをつけ
た逆相高速液体クロマトグラフィ（島津製作所）で解析
したところβgal97SHPCTに存在する全部で10個のグルタ
ミン酸のうちβgal97SとHPCTの間のグルタミン酸が最も
切断されやすく、特異的にHPCTが切りだされ、その回収
率は約70％であった（第20図）。さらに、この溶液を2M
尿素を含む50mMトリス塩酸（pH7.8）で平衡化したZeta-
Prep QAE クロストを行い、素通り画分に約95％純度のH
PCTをほぼ100％の回収率で得ることができた。
このことは、βgal97SがαhANPのみならず、ヒトカルシ
トニン前駆体（HPCT）生産のための付加ペプチドとして
秀れていることを示している。
トニン前駆体（HPCT）生産のための付加ペプチドとして
秀れていることを示している。
第１図は、βgal210のシステイン残基をセリン残基にか
えたβgal210（Ser）とαhANPの融合蛋白の発現プラス
ミドpGHα210（Ser）rop-の作製プロセスの概略を示
す。図中■は、αhANPをコードするDNA領域を示す。 第２図は、βgal97（Cys）のシステイン残基をセリン残
基にかえたβgal97（Ser）とαhANPの融合蛋白発現プラ
スミドpGHα97（Ser）rop-の作製プロセスの概略を示
す。 第３図はpGHα97（Ser）rop-のαhANP遺伝子の直後に
３′−非翻訳領域を欠失させトリプトファンオペロンの
アテニュエーターターミネーター（trp a）を挿入した
βgal97（Ser）αhANPの発現プラスミドpGHα97Sの作製
のプロセスの概略を示す。 第４図は、αhANP遺伝子の３′非翻訳領域の欠失び直後
へのtrp a挿入による融合蛋白の産生能への効果を示すS
DS-PAGEである。 第５図は、W3110/pGHα97Sの培養菌体処理物についての
SDS-PAGEを示す。図中、Ｔは破砕培養菌体全体、Ｓは遠
心後の上清画分、Ｐは沈澱画分を示す。 第６図は、融合蛋白質中のβgal97（Ser）とαhANPの結
合部をGlu-Phe-Lysに変換したβgal97（Ser）αhANP発
現プラスミドpGHα97SE作製のプロセスの概略を示す。 第７図は、融合蛋白質中のβgal97（Ser）とαhANPの連
結部の違いによるAPI水解の効率の差を示すSDS-PAGEで
ある。 第８図は、融合蛋白がλファージのPLプロモーター支配
下に発現されるプラスミドpPLlacZ′97（Ser）αhANPの
作製のプロセスの概略を示す。 第９図は融合蛋白が大腸菌の1ppプロモーター支配下に
発現されるプラスミドpINlacZ′97（Ser）αhANP作製の
プロセスの概略を示す。 第10図は、βgal97（Ser）αhANPから精製したαhANPの
逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の結果を示
す。 第11図は、βgalαhANP融合蛋白発現プラスミドの１つp
GHα1007の作製プロセスの概略を示す。図中■部はαhA
NPをコードするDNA領域を示す。 第12図は、β−ガラクトシダーゼ（β‐gal）が縮小化
された３種のβgalαhANP融合蛋白発現プラスミドの作
製プロセスの概略を示す。 第13図は、pGHα210rop-の作製プロセスの概略を示す。 第14図は、pGHα210EcoRIの作製プロセスの概略を示
す。 第15図は、融合蛋白がλファージのPLプロモーター支配
下に発現されるプラスミドplacZ′210αhANPの作製プロ
セスの概略を示す。 第16図は、βgal領域を縮小したプラスミドpGHαBalの
作製プロセスの概略を示す。 第17図は、プラスミドpIN5GIF54の作製プロセスの概略
図を示す。 第18図は、プラスミドpIN5T4の作製プロセスの概略図を
示す。 第19図は、プラスミドpG97SHPCTの作製プロセスの概略
図を示す。 第20図は、βgal97SHPCTから精製したHPCTの逆相HPLCの
結果を示す。
えたβgal210（Ser）とαhANPの融合蛋白の発現プラス
ミドpGHα210（Ser）rop-の作製プロセスの概略を示
す。図中■は、αhANPをコードするDNA領域を示す。 第２図は、βgal97（Cys）のシステイン残基をセリン残
基にかえたβgal97（Ser）とαhANPの融合蛋白発現プラ
スミドpGHα97（Ser）rop-の作製プロセスの概略を示
す。 第３図はpGHα97（Ser）rop-のαhANP遺伝子の直後に
３′−非翻訳領域を欠失させトリプトファンオペロンの
アテニュエーターターミネーター（trp a）を挿入した
βgal97（Ser）αhANPの発現プラスミドpGHα97Sの作製
のプロセスの概略を示す。 第４図は、αhANP遺伝子の３′非翻訳領域の欠失び直後
へのtrp a挿入による融合蛋白の産生能への効果を示すS
DS-PAGEである。 第５図は、W3110/pGHα97Sの培養菌体処理物についての
SDS-PAGEを示す。図中、Ｔは破砕培養菌体全体、Ｓは遠
心後の上清画分、Ｐは沈澱画分を示す。 第６図は、融合蛋白質中のβgal97（Ser）とαhANPの結
合部をGlu-Phe-Lysに変換したβgal97（Ser）αhANP発
現プラスミドpGHα97SE作製のプロセスの概略を示す。 第７図は、融合蛋白質中のβgal97（Ser）とαhANPの連
結部の違いによるAPI水解の効率の差を示すSDS-PAGEで
ある。 第８図は、融合蛋白がλファージのPLプロモーター支配
下に発現されるプラスミドpPLlacZ′97（Ser）αhANPの
作製のプロセスの概略を示す。 第９図は融合蛋白が大腸菌の1ppプロモーター支配下に
発現されるプラスミドpINlacZ′97（Ser）αhANP作製の
プロセスの概略を示す。 第10図は、βgal97（Ser）αhANPから精製したαhANPの
逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の結果を示
す。 第11図は、βgalαhANP融合蛋白発現プラスミドの１つp
GHα1007の作製プロセスの概略を示す。図中■部はαhA
NPをコードするDNA領域を示す。 第12図は、β−ガラクトシダーゼ（β‐gal）が縮小化
された３種のβgalαhANP融合蛋白発現プラスミドの作
製プロセスの概略を示す。 第13図は、pGHα210rop-の作製プロセスの概略を示す。 第14図は、pGHα210EcoRIの作製プロセスの概略を示
す。 第15図は、融合蛋白がλファージのPLプロモーター支配
下に発現されるプラスミドplacZ′210αhANPの作製プロ
セスの概略を示す。 第16図は、βgal領域を縮小したプラスミドpGHαBalの
作製プロセスの概略を示す。 第17図は、プラスミドpIN5GIF54の作製プロセスの概略
図を示す。 第18図は、プラスミドpIN5T4の作製プロセスの概略図を
示す。 第19図は、プラスミドpG97SHPCTの作製プロセスの概略
図を示す。 第20図は、βgal97SHPCTから精製したHPCTの逆相HPLCの
結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭58−69897（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−69029（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−92696（ＪＰ，Ａ)
Claims (9)
- 【請求項１】システイン残基を含有する生理活性ペプチ
ド（目的ペプチド）の製造方法であって、 Ａ）次の式で表わされる融合蛋白質： A-L-B 〔式中、 Ｂは目的ペプチドであって、次の式（Ｉ）： で表されるアミノ酸配列を有するペプチド（αhANP）で
あるか、あるいは次の式（II）： 〔このアミノ酸配列において（１）と（２）及び（３）
と（４）は直接つながっている〕 で表わされるアミノ酸配列を有するヒトカルシトニン前
駆体であり； Ａは、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ−末端の90〜22
0個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであって、そ
れに含まれる生来のシステイン残基が他のアミノ酸残基
に置き換えられたもの（付加ポリペプチド）であり；そ
して Ｌは、該付加ポリペプチドのＣ−末端と該目的ペプチド
のＮ−末端との間に位置するアミノ酸残基（リンカー）
であり、該リンカーアミノ酸残基は該目的ポリペプチド
中には存在せず、且つ該融合蛋白質を酵素又は化学物質
により処理した場合に前記目的ペプチドが切り離される
様に選択されたものである〕 を大腸菌由来のプロモーターまたはファージ遺伝子由来
のプロモーターの支配下に発現することができるプラス
ミドにより形質転換された大腸菌を培養し、 Ｂ）該大腸菌形質転換体の培養菌体を破砕して不溶性画
分を得、次にこの不溶性画分を可溶化剤で処理すること
により前記融合蛋白質を可溶化し、そして Ｃ）該可溶化された融合蛋白質を、前記リンカーアミノ
酸残基のＣ−末端と前記目的ペプチドのＮ−末端との間
のペプチド結合を切断することができる酵素により処理
するか、又は前記リンカーアミノ酸残基を分解すること
ができる化学物質により処理することにより、前記目的
ペプチドを付加ポリペプチドから切り離し、そして該目
的ペプチドを採取する、ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記付加ポリペプチドが、大腸菌β−ガラ
クトシダーゼのＮ−末端の210個のアミノ酸残基に所望
により１個又は複数個のアミノ酸残基が追加されたポリ
ペプチドであって、それに含まれる生来のシステイン残
基が他のアミノ酸残基により置き換えられているもので
ある、請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項３】前記付加ポリペプチドが、大腸菌β−ガラ
クトシダーゼのＮ−末端の97個のアミノ酸残基に所望に
より１個又は複数個のアミノ酸残基が追加されたポリペ
プチドであって、それに含まれる生来のシステイン残基
が他のアミノ酸残基により置き換えられているものであ
る、請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項４】前記他のアミノ酸残基がセリン残基である
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】前記リンカーアミノ酸残基がリジン残基で
あり、そして前記酵素がリシルエンドペプチダーゼであ
る請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】前記リンカーアミノ酸残基がアルギニン残
基であり、そして前記酵素がクロストリパインである請
求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】前記リンカーアミノ酸残基がグルタミン酸
残基であり、そして前記酵素がV8プロテアーゼである請
求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】前記リンカーアミノ酸残基がメチオニン残
基であり、そして前記化学物質が臭化シアンである請求
項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】前記プロモーターが大腸菌ラクトース遺伝
子由来のプロモーター、ラムダ（λ）ファージ遺伝子由
来のPLプロモーターまたは、大腸菌外膜リポタンパク質
遺伝子由来の1ppプロモーターである請求項１〜８のい
ずれか１項に記載の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4779687 | 1987-03-04 | ||
| JP62-47796 | 1987-03-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6410999A JPS6410999A (en) | 1989-01-13 |
| JPH0687788B2 true JPH0687788B2 (ja) | 1994-11-09 |
Family
ID=12785332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63049723A Expired - Lifetime JPH0687788B2 (ja) | 1987-03-04 | 1988-03-04 | システイン残基を含有する生理活性ペプチドの製造方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4987070A (ja) |
| EP (1) | EP0281418B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0687788B2 (ja) |
| AT (1) | ATE117023T1 (ja) |
| AU (1) | AU607973B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340830C (ja) |
| DE (1) | DE3852706T2 (ja) |
| DK (1) | DK175535B1 (ja) |
| ES (1) | ES2065907T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015328T3 (ja) |
| HU (1) | HU210625B (ja) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3686365T3 (de) * | 1985-06-20 | 2000-07-27 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Herstellungsverfahren für humanes atriales natriuretisches Polypeptid. |
| DE3805150A1 (de) * | 1987-04-11 | 1988-10-20 | Hoechst Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von polypeptiden |
| DE3716722A1 (de) * | 1987-05-19 | 1988-12-01 | Hoechst Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| JP2535398B2 (ja) * | 1989-01-17 | 1996-09-18 | サントリー株式会社 | アミド化ペプチドの製造方法 |
| CA2051375C (en) * | 1989-05-04 | 2000-09-12 | Dennis J. Henner | Process and compositions for the isolation of human relaxin |
| US5202239A (en) * | 1990-08-07 | 1993-04-13 | Scios Nova Inc. | Expression of recombinant polypeptides with improved purification |
| US6077694A (en) * | 1990-09-21 | 2000-06-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method for over-expression and rapid purification of biosynthetic proteins |
| US5525491A (en) * | 1991-02-27 | 1996-06-11 | Creative Biomolecules, Inc. | Serine-rich peptide linkers |
| ATE253639T1 (de) * | 1991-08-19 | 2003-11-15 | Daiichi Suntory Pharma Co Ltd | Verfahren zur herstellung von peptiden |
| JP3531947B2 (ja) * | 1991-08-19 | 2004-05-31 | 第一サントリーファーマ株式会社 | ペプチドの製造方法 |
| US5795776A (en) * | 1994-03-22 | 1998-08-18 | Bio-Technology General Corp. | Expression plasmids regulated by an OSMB promoter |
| EP0816510A4 (en) * | 1995-12-22 | 2001-04-11 | Toray Industries | PROCESS FOR PRODUCING BIOLOGICALLY ACTIVE FUSED PROTEINS |
| JP4741076B2 (ja) * | 1998-07-10 | 2011-08-03 | サイオス インコーポレイテッド | ８より上または５未満のｐＩを有するペプチドを産生するための方法 |
| JP2002534059A (ja) * | 1998-10-13 | 2002-10-15 | ザ ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチファウンデーション，インコーポレイティド | 安定化された生物活性ペプチドおよび同定、合成および使用方法 |
| US20030190740A1 (en) * | 1998-10-13 | 2003-10-09 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use |
| US20020090646A1 (en) * | 2000-05-03 | 2002-07-11 | Amgen Inc. | Calcitonin-related molecules |
| CN100402649C (zh) | 2000-05-10 | 2008-07-16 | 阿斯比奥制药株式会社 | 在基因重组多肽的生产中抑制副产物生成的方法 |
| EP1417237B1 (en) * | 2001-07-26 | 2011-04-06 | Advanced Protein Technologies Corp. | Process for preparation of polypeptides of interest from fusion peolypeptides |
| US7795384B2 (en) | 2003-06-03 | 2010-09-14 | Shanghai Centre Of Research & Development Of New Drugs | Fusion protein suitable for high efficiency expression and the production method thereof |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RO80052B (ro) * | 1977-11-08 | 1985-03-30 | Genetech | Procedeu pentru prepararea unui vehicul recombinat de clonare pentru transformarea unei gazde bacteriene pentru a deveni generator de polipeptida heterologa |
| SE7811458L (sv) * | 1977-11-08 | 1979-05-09 | Genentech Inc | Forfarande och medel for polypeptidbildning via mikrober |
| EP0001931A3 (en) * | 1977-11-08 | 1979-06-13 | Genentech, Inc. | Synthetic dna, process for preparing it and recombinant microbial cloning vehicle containing such dna |
| US4431739A (en) * | 1979-11-05 | 1984-02-14 | Genentech, Inc. | Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein |
| US4769326A (en) * | 1980-02-29 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Expression linkers |
| CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
| JPS5869897A (ja) * | 1981-10-20 | 1983-04-26 | Gakuzo Tamura | Ｄｎａ遺伝子 |
| FI82266C (fi) * | 1982-10-19 | 1991-02-11 | Cetus Corp | Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein. |
| SE8300693L (sv) * | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta |
| US4711844A (en) * | 1983-03-09 | 1987-12-08 | Cetus Corporation | Modified signal peptides |
| GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
| GB2140810B (en) * | 1983-05-24 | 1987-07-08 | Celltech Ltd | Polypeptide and protein products, and process for their production |
| IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| US4549986A (en) * | 1983-12-23 | 1985-10-29 | The Salk Institute For Biological Studies | Human CGRP |
| US4736023A (en) * | 1983-12-23 | 1988-04-05 | The Salk Institute For Biological Studies | DNA encoding human CGRP |
| JPH0672155B2 (ja) * | 1984-08-24 | 1994-09-14 | 塩野義製薬株式会社 | α−ｈＡＮＰ抗血清作製用ポリペプチド |
| GB8600754D0 (en) | 1986-01-14 | 1986-02-19 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Human atrial natriuretic polypeptide |
| GB8515686D0 (en) * | 1985-06-20 | 1985-07-24 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Production of-human atrial natriuretic polypeptide |
| DE3686365T3 (de) * | 1985-06-20 | 2000-07-27 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Herstellungsverfahren für humanes atriales natriuretisches Polypeptid. |
| US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
| DE3805150A1 (de) * | 1987-04-11 | 1988-10-20 | Hoechst Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von polypeptiden |
-
1988
- 1988-03-03 DK DK198801147A patent/DK175535B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-03-03 US US07/163,548 patent/US4987070A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-04 JP JP63049723A patent/JPH0687788B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-04 CA CA000560605A patent/CA1340830C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-04 AU AU12724/88A patent/AU607973B2/en not_active Expired
- 1988-03-04 DE DE3852706T patent/DE3852706T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-04 ES ES88301924T patent/ES2065907T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-04 HU HU881065A patent/HU210625B/hu unknown
- 1988-03-04 AT AT88301924T patent/ATE117023T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-04 EP EP88301924A patent/EP0281418B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-07 GR GR950400506T patent/GR3015328T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK114788D0 (da) | 1988-03-03 |
| DK114788A (da) | 1988-09-05 |
| EP0281418B1 (en) | 1995-01-11 |
| ATE117023T1 (de) | 1995-01-15 |
| GR3015328T3 (en) | 1995-06-30 |
| DK175535B1 (da) | 2004-11-29 |
| CA1340830C (en) | 1999-11-30 |
| ES2065907T3 (es) | 1995-03-01 |
| JPS6410999A (en) | 1989-01-13 |
| HU210625B (en) | 1995-06-28 |
| DE3852706T2 (de) | 1995-05-24 |
| US4987070A (en) | 1991-01-22 |
| EP0281418A2 (en) | 1988-09-07 |
| AU607973B2 (en) | 1991-03-21 |
| AU1272488A (en) | 1988-09-15 |
| HUT46071A (en) | 1988-09-28 |
| DE3852706D1 (de) | 1995-02-23 |
| EP0281418A3 (en) | 1989-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0687788B2 (ja) | システイン残基を含有する生理活性ペプチドの製造方法 | |
| JP2686090B2 (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| US5212058A (en) | Nucleic acid encoding ubiquitin-specific proteases | |
| JP2545686B2 (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| CA2237296C (en) | Process for the preparation of peptides by way of streptavidin fusion proteins | |
| EP0531404B1 (en) | Ubiquitin-specific protease | |
| WO2024087761A1 (zh) | 一种重组融合蛋白生产多肽的方法及其应用 | |
| JP4624495B2 (ja) | ヒト・インスリンの生成 | |
| JPS62272976A (ja) | 変異組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−及びその製造 | |
| JPH11503002A (ja) | 酵素的に活性な組換えカルボキシペプチダーゼｂの製造 | |
| NO308543B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av hirudinderivater, samt rekombinant DNA og rekombinant vektor | |
| US7892787B2 (en) | Method for production of recombinant growth hormone in form of hybrid protein | |
| EP0797671B1 (en) | A process of producing extracellular proteins in bacteria | |
| FI93125C (fi) | Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa | |
| KR900001014B1 (ko) | 소 성장 호르몬 유도체 발현 벡터의 제조방법 | |
| KR900001015B1 (ko) | 재조합체 dna 발현 벡터의 제조방법 | |
| JPH0371112B2 (ja) | ||
| JPS62259595A (ja) | 生理活性ペプチドの製造方法 | |
| JP2500312B2 (ja) | ヒト成長ホルモンの生産法 | |
| JPH02234679A (ja) | ヒトラミニンｂ１鎖ポリペプチド断片及びこれを生産するための発現ベクター | |
| KR100202958B1 (ko) | 인슐린 융합단백질로부터 인슐린을 생산하는데 있어서 효소적 절단을 가능케하는 인슐린 융합단백질 유전자를 가진 발현벡터 및 이를 이용한 사람 인슐린의 제조방법 | |
| KR100473443B1 (ko) | 단백질의 생산방법 | |
| JP2584213B2 (ja) | フラジエリンをコ−ドするｄｎａおよび該ｄｎａを有するベクタ− | |
| CA1200775A (en) | Expression linkers | |
| JP3007919B2 (ja) | ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タンパク質（▲ｉｉ▼） |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081109 Year of fee payment: 14 |