JPS62272976A - 変異組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−及びその製造 - Google Patents

変異組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−及びその製造

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JPS62272976A
JPS62272976A JP61272033A JP27203386A JPS62272976A JP S62272976 A JPS62272976 A JP S62272976A JP 61272033 A JP61272033 A JP 61272033A JP 27203386 A JP27203386 A JP 27203386A JP S62272976 A JPS62272976 A JP S62272976A
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protein
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gene
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ババトシュ　チャウドゥリ
ベルント　マイハック
ハイム ユッタ
ヤン　ファン　オーストルム
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Ciba Geigy AG
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 この発明は変形されたフィブリン溶解剤及び該フィブリ
ン溶解剤の製造方法に関する。さらに詳しくは、この発
明は脱グリコジル化されているか又は部分的に脱グリコ
ジル化されている組織プラスミノーゲンアクチベーター
、該組織ブラスミノーゲンアクチベーターをコードする
ＤＮＡ配列を含有するハイブリドベクター、及びこのハ
イブリドベクターにより形質転換された真核宿主細胞に
関する。この発明はさらに、前記ハイブリドベクター、
前記形質転換された宿主細胞及び前記組織プラスミノー
ゲンアクチベーターの製造方法に関する。
〔発明の青葉〕 血液凝固物は先進世界におけるヒトの病気及び死亡の主
要な原因である。血液凝固物は、酵素スロンビンの作用
により可溶性前駆体であるフィブリノーゲンから形成さ
れるフィブリンから成る。
血液の喪失を防止するために必要な時及び場所において
のみ凝固物が正常に形成されることが、一連の酵素及び
他の物質により保証される。
哺乳類の血漿は血液凝固物中のフィブリンを溶解するこ
とができる酵素系を含有する。フィブリン溶解系の１つ
の成分はプラスミノーゲンアクチベーターと称する一群
の酵素であり、このものはプラスミノーゲン（プラスミ
ンの不活性プロエンザイム形）を蛋白質分解酵素である
プラスミンに転換する０次に、プラスミンが凝血のフィ
ブリンネットワークを分解して可溶性生成物を形成する
。
体の血栓溶解能力が血管内血栓を除去するのに十分でな
い場合、例えば血栓塞栓症又は手術後合併症に罹ってい
る患者において、外部から投与される血栓溶解剤を使用
することは必須であろう。
ヒトの体液又は細胞から２つのタイプのプラスミノーゲ
ンアクチベーターを単離することができる。１つはウロ
キナーゼ、すなわち例えばヒトの尿及び腎細胞中に存在
するセリンプロテアーゼであり、他方は内皮細胞及び多
数の内分泌組織中に存在する組織プラスミノーゲンアク
チベーター（以後゛ｔ−ＰＡ゛と称する）である。組織
プラスミノーゲンアクチベーターは、その化学的及び免
疫学的性質に関して、フィブリンの存在下でのその非常
に増強されたフィブリン溶解活性において、及びフィブ
リンに対するその高い親和性において、ウロキナーゼと
異る。ｔ−ＰＡは２つの分子形で存在する。一方は活性
な２本鎖形であり、他方は前駆体１本鎖形（しばしば“
プロｔ−ＰＡパと称される）である。
この１本鎖形は、好ましくはフィブリンの存在下で触媒
量のプラスミンとインキュベートすることにより２本鎖
形に転換され得る。
ヒトｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
は決定されており、そしてこれからアミノ酸配列が推定
されているＣ　Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａ等、　Ｎａｔｕｒｅ
　。
３０１　、２１４（１９８３）　）　、　４個の可能性
あるＮ−グリコシル化部位が同定されており、その１つ
は炭水化物の付加のために使用されない様である（Ｇ、
Ｐｏｈｌ等、　Ｂｉｏｃｈｅｎｉｓｔｒ　２３　、３７
０１（１９８４）’ｌ　。
ヒトｔ−ＰＡ源には、例えば、ヒト組織の抽出物（これ
は商業的使用のためには入手できない）、及び種々の程
度でｔ−ＰＡを放出することが示されている種々のヒト
組繊細胞が包含される。すなわち、ヨー・ロッパ特許出
願Ｎｏ、　４１，７６６には、培養されたヒト黒色腫セ
ルラインから単離されなｔ−ＰＡが開示されている。ヒ
トｔ−ＰＡの製造のために組換ＤＮＡ技法も使用されて
いる。ヒト腫瘍細胞由来の２本で（ヨーロッパ特許出願
Ｎｏ、９３，６１９　）　、又は酵母（Ｓ、セレビシェ
−（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））細胞中で〔ヨーロッ
パ特許出願Ｎｏ、１２３，５４４及びＮｏ、１４３，０
８１）発現された。培養されたヒト黒色腫細胞から又は
形質転換されたＣＨＯ細胞から得られるｔ−ＰＡはおそ
らく真正なｔ−ＰＡ糖蛋白質に相当する。形質転換され
た酵母細胞から得られるｔ−ＰＡはおそらく酵母に特異
的な炭水化物鎖を有する。酵母の炭水化物鎖及びより高
等な真核生物の炭水化物鎖の構造の差異はよく説明され
ており、そしてマンノース残基の外部鎖付加及びコアー
炭水化物の変形に関する（ｎ、及びＳ、Ｋｏｒｎｆｅｌ
ｄ　、＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５４　、６
３１（１９８５）；　　Ｊ、Ｃ，［１ｙｒｄ等　、Ｊ、
Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、　　ζ５７．１４８５７（１９
８２）；　　Ｒ，Ｂ、Ｔｒｉｍｂｌｅ等　、Ｊ、［１ｉ
ｏ１　、Ｃｈｅｍ、　　２５８　．２５６２（１９８３
）　）　、　Ｅ　、コリ中で発現されたｔ−ＰＡはグリ
コジル化されていないが、しかしフィブリン溶解活性を
有する。但し、どちらかと言えば低い比活性を有する。
蛋白質のほとんどは不活性な形態で細胞質内に蓄積され
るが、これはおそらく分子の正しくない折りたたみに基
く、正しい折りたたみはｔ−ＰＡ分子中の多数の特異的
なジスルフィド橋の形成に依存し、このジスルフィド橋
は酵素活性のために必須である。
Ｌ−ＰＡの炭水化物残基が酸化剤、例えば過ヨウ素酸ナ
トリウムにより化学的に分解され得ることが示されてい
る（ＰＣＡ特許出願Ｎｏ、８４／　１７８６及び８４／
１９６０）、生ずるｔ−ＰＡ誘導体は未処理のｔ−ＰＡ
の生理的清掃（ｃｌｅａｒｏｎｃｅ　）速度に比べて低
い生理的清掃速度を有すると言われる。炭水化物基の化
学的分解の程度、変形されたｔ−ＰＡの比活性、及びｔ
−ＰＡ鎖の感受性アミノ酸基に対する酸化剤のおそらく
有害な化学的効果〔例えば、トリプトファン残基は過ヨ
ウ素酸塩により攻撃されることが予想される。＾、Ｓ、
Ｉｎｇｌ　ｉｓ等、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１０４　
、１１５　（１９７９）を参照のこと〕は開示されてい
ない。
Ｓ、Ｐ、Ｌｉｔｔｌｅ等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
２３　、６１９１（１９８４））は、ｔ−ＰＡ生産性黒
色腫細胞に対するグリコジル化阻害剤チュニカマイシン
（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ　）の作用を記載している。
彼等はグリコジル化が９０％阻害されることを見出しな
、同時に蛋白質合成も３０％阻害され、チュニカマイシ
ンは細胞中の活動過程を直接的に又は間接的に妨害する
ことが示される。生ずるｔ−ＰＡ蛋白質はフィブリン溶
解活性を維持している。しかしながら、痕跡量の不都合
なグリコジル化及び蛋白質生合成阻害害剤チュニカマイ
シンの潜在的存在が療法剤としてのこのｔ−ＰＡの使用
を必然的に制限するに違いない、同じ報告において、エ
ンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄ
ｏＨ）によるｔ−ＰＡの酵素的脱グリコジル化が記載さ
れている。　Ｅｎｄｏ）（処理は８５〜９０％の炭水化
物が除去されたｔ−ＰＡ種の混合物を導く、シかしなが
ら、約５０％のｔ−ＰＡはＥｎｄｏ　Ｈ処理に対して完
全に耐性であった。この生成物は、真正なし−ＰＡのフ
ィブリン指向性を維持していると言われる。
炭水化物残基の一部分又は全部を欠＜　ｔ−ＰＡ分子の
予想される有利な性質の観点から、このような化合物、
及びこのような化合物を便利に合成することができる方
法の必要性が存在する。形質転換されなＥ、コリ細胞か
ら単離される生成物（しかしながら、これは療法的目的
のなめには大きな価値を持たない様である。前記参照の
こと）を除く外、文献に記載されている脱グリコジル化
ｔ−ＰＡ種は化学的に定義されていない分子であり、そ
してその上、不明確な数の個々の分子種を含有する複雑
な混合物として存在する。Ｎ−リンク炭水化物鎖の１個
又はすべてが全体として除去されているｔ−ＰＡ種は従
来知られていない。
すべての真核生物は遺伝情報を発現するための共通の機
構を共有するので、Ｅ、コリにおけるより真核宿主にお
いて一層効率的に真核性遺伝子の発現が行われる。使用
するために適当な真核生物の内、酵母が最も取り扱いや
すい、酵母は微生物であるから、酵ｆｆｋ細胞を培養す
るのは容易である。
培養液の体積当り得られる細胞量はＥ、コリに比べて有
意に多く、そしてエンドトキシンを含有しない、さらに
、酵母の発酵的挙動はよく理解されており、そして大規
模発酵のための条件はすでに確立されている。酵母の分
泌経路はヒト細胞を包含する高等細胞のそれに類似して
いる。酵母細胞が対応するシグナル配列を開裂せしめる
ことによりそれら自身の蛋白質のみならず外来蛋白質を
もプロセシングすることができることが知られている。
さらに、真核宿主の分泌経路に入りそしてそこを通過す
る蛋白質は細胞質中の合成された蛋白質に比べて高度な
３次構造を形成するようである。
なお、Ｅ、コリのごとき原核生物は高次構造を有する大
形の蛋白質を有しない様である。
グリコジル化系は高等生物の分泌系と関連する。
グリコジル化の差異が蛋白質の類別に影響を与えると予
想される。すなわち、１３個のマンノース残基により単
にコアーグリコジル化される酵母カルボキシペプチダー
ゼＹは液胞（ｖａｃｕｏｌｅ）に移送され、他方約１０
０〜１５０個のマンノース残基から成る外部炭水化物類
を有する酵母インベルターゼは分泌小胞を通ってペリプ
ラズム空間に入る（Ｌ。
Ｌｅｈｌｅ等　、Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、　　ζ５
４　．１２２０９（１９〕９）；Ｃ，Ｈａｓｈｉｍｏｔ
ｏ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、υＳ
＾７８゜２２４４（１９８１））　、従って、炭水化物
鎖の変更がｔ−ＰＡの分泌挙動に影響を与え得ることは
言うまでムない。
〔発明の目的〕
この発明の１つの目的は、１スは複数のＮ−リンク炭水
化物鎖を欠いているがしがし価値ある生物学的性質、例
えばフィブリン溶解活性、天然り−ＰＡに比べて遅い生
理的清掃速度及び延長されたインビボ安定性を維持して
いる新規なヒトｔ−ＰＡ蛋白質を提供することである。
この発明の他の対象はこのようなｔ−ＰＡをコードする
ＤＮＡ配列及びこのＤＮＡ配列の発現を効果的に制御す
る強力なプロモーター系を含有するハイブリドベクター
である。
〔具体的な記載〕
この発明は、天然に存在するＮ−グリコシル化部位の１
個又は複数個が、これらの部位においてグリコジル化が
生じ得ない様な態様で変更されている新規なヒト変異ｔ
−ＰＡ蛋白質を提供する。この目的は、このようなｔ−
ＰＡ蛋白質をコードするＤＮＡ、このＤＮＡ配列を含有
するハイブリドベクター、及びこのハイブリドベクター
により形質転換されておりそして前記ｔ−ＰＡ蛋白質を
発現する宿主細胞を提供することにより達成される。
トリペプチド配列−＾５ｎ−Ｌ−Ｓｅｒ（又はＴｈｒ）
　−の存在が哺乳類細胞におけるＮ−リンク・グリコジ
ル化のための前提条件であり、ここでＡｓｎが受容体（
アクセプター）であり、そしてＬはグリコジル化を回避
するプロリンスはアスパラギン酸以外の２０種の遺伝的
にコードされたアミノ酸のいずれでもよいことがよく確
立されている（Ｄ、に、５ｔｒｕｃｋ及び詩、Ｊ、Ｌｅ
ｎｎａｒｔ　、　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　
ｏｒ　Ｇｌ　ｃｏ−ｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄヱｒｏｔｅ
ｏ　ｌ　ｃａｎｓ　、　Ｗ、Ｊ、Ｌｅｎｎａｒｚ編。
プレナムプレス１９８０　、３５頁；　Ｒ，Ｄ、Ｍａｒ
ｓｌ＋ａｌｌ　、　Ｂｌｏ−０９１汚ドづ７１ユ蚊、　
１７（１９７４）　）。ｔ−ＰＡ分子巾にはＮ−グリコ
シド結合のための４個の潜在的部位、すなわち−八ｓｎ
”’−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−１−＾ｓｎ”’　　（：１ｙ−
Ｓｅｒ　−１−Ａｓｎ””　　Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−１及び
−＾ｓ１４４ｍ−＾ｒｇ−Ｔｈｒ（番号はｔ−ＰＡのア
ミノ酸配列中のＡｓｎの位置を示す。第１図を参照のこ
と）が存在する。
配列−Ａｓｎ”＠−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ中にはＰｒｏが存在
するため、Ａｓｎ”’は哺乳類細胞中で炭水ｆヒ物の付
加のために使用されない（Ｇ、Ｐｏｈｌ、等、前掲）。
個々の（１個又は複数個の）Ｎ−グリコシルｆヒ部位に
おいてグリコジル化を回避するため、Ｎ−グリコシル化
のためのシグナルとして認識されるトリペプチド配列を
除去しなければならない、上記のトリペプチド配列中の
Ａｓｎ及び／又はＳｅｒ（もしくはＴｈｒ）の他のアミ
ノ酸による置き換えがこれらの部位におけるグリコジル
結合の形成を廃止するであろう０便宜上、ｔ−ＰＡ分子
の変形、すなわちＮ−グリコシル化部位の変更は蛋白質
レベルでは行われない、そうではなく、ｔ−ＰＡをコー
ドする遺伝子を変形して、宿主により前記変形された遺
伝子の発現の際に、１又は複数の天然に存在するＮ−グ
リコシル化部位がこれらの部位においてグリコジル化が
起り得ないように変えられている変異ｔ−ＰＡが生産さ
れるようにするのが有利である。
この発明は特に、次の式（■）： Ａ＋−ｚｉ　　Ｘ＋　　Ｓｅｒ　　Ｙ＋　　Ａ＋２ｏ−
＋ａｓ　　ｘ２−ｃｌｙ−Ｙ２　　　Ａ１１Ｂ？−２１
？　　　Ｘ３　　　Ｐｒｏ　　　Ｙコ　　ＡＢＩ−４４
ｔ−Ｘ４−Ａｒｇ　　Ｙ４　　Ａ４％＋−５２？（式中
、ＡＨ−１１１は成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸１−１１６か
ら成るＮ−末端アミノ酸配列であり；ＡＩ□。−１，コ
は成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸１２０−１８３から成るアミ
ノ酸配列であり；Ａｌ１７−２１？は成熟ｔ−ＰＡのア
ミノ酸１８フー２１７から成るアミノ酸配列であり−Ａ
２□ｌ−４４７は成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸２２１−４４
７６−ら成るアミノ酸配列であり；Ａ４ｓ＋−５２ｔは
成熟Ｌ−ＰＡのアミノ酸４５１−５２７から成るＣ−末
端アミノ酸配列であり；Ｘ３、Ｘ２、Ｘ、及びＸ４はそ
れぞれＡｓｎ、又は他の遺伝的にコードされたアミノ酸
でありＨＹ、、Ｙ２及びＹ、はそれぞれＳｅｒであるか
又はＴｈｒ以外の他の遺伝的にコードされたアミノ酸で
あり、そしてＹ、はＴｈｒであるか又はＳｅｔ以外の他
の遺伝的にコードされたアミノ酸であり；１本鎖形又は
２本鎖形であり；但し基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ、及びＸ４の内
の少なくとも１つはＡｓｎではなく、そして／又は基Ｙ
８、Ｙ２、Ｙ、及びＹ、の内の少なくとも１つはＳｅｒ
及びＴｈｒではない） で表わされるヒト変異ｔ−ＰＡに関する。
さらに詳しくは、この発明の次の式（１’）：％式％ （式中、Ａ　＋　−＋　＋　ａは成熟ｔ−ＰＡのアミノ
酸１−１１６から成るＮ−末端アミノ酸配列であり；Ａ
、２゜−８゜３は成熟Ｌ−ＰＡのアミノ酸１２０−１８
３から成るアミノ酸配列であり＋Ａ１１？−２１？は成
熟ｔ−ＰＡのアミノ酸１８７−２１７から成るアミノ酸
配列であり；Ａ２２ｌ−４４７は成熟ｔ−ＰＡのアミノ
酸２２１−４４７から成るアミノ酸配列であり；　Ａ４
５Ｉ−５２１は成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸４５１−５２７
から成るＣ−末端アミノ酸配列であり；Ｙｌ、Ｙ２及び
Ｙ、はそれぞれＳｅｔであるか、又はＴｈｒ以外の他の
遺伝的にコードされたアミノ酸であり、そしてＹ４はＴ
ｈｒであるか、又はＳｅｒ以外の他の遺伝的にコードさ
れたアミノ酸であり、但し基Ｙ１．Ｙ２、Ｙ３及びＹ４
の内の少なくとも１つはＳｅｒ及びＴｈｒではない） で表わされるヒト変異ｔ−ＰＡに関する。
“成熟ｔ−ＰＡ”なる語は、プレー配列又はブロー配列
をなんら有しない１位のＳｅｒから始まるｔ−ＰＡを意
味する。成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸配列を示す第１図を参
照のこと。
遺伝的にコードされるアミノ酸は次のし一アミノ酸：＾
ｌａ　、　Ｓｅｒ　、　Ｔｈｒ　、　Ｖａｌ　、　Ｌｅ
ｕ　、　ｌｉｅ　、Ａ３１）＋＾ｓｎ。
Ｇｌｕ　、　Ｇｉｎ　、　Ｃｙｓ　、　Ｎｅｔ　、　Ａ
ｒｇ　、　Ｌｙｓ　、　ｌ１ｉｓ　、　Ｔｙｒ　、　ｐ
Ｈｅ。
Ｔｒｐ及びＰｒｏ　、そしてさらにアミノ酸Ｇｌｙであ
る。
置き換えのためには、置き換えられるべきアミノ酸に類
似する大きさ及び極性を有するアミノ酸が好ましい。Ａ
ｓｎ、Ｔｈｒ及び／又はＳｅｒＴＡ基の可能性ある置換
物の数は所与のヌクレオチド配列及び可能なコドンによ
り限定される（パラグラフ２を参照のこと）、すなわち
、位置Ｘ１．Ｘ２．Ｘ３及び／又はＸ４中のＡｓｎの置
き換えのなめにはアミノ酸Ｔｈｒ及びＳｅｒが好ましい
。Ｙｌ、Ｙ２及び／又はＹ３のＳｅｒの置き換えのため
、及びＹ４のＴｈｒの置き換えのためにはアミノ酸Ａｌ
ａ及びＡｓｎが好ましい。
この発明の１つや好ましい具体例においては、基Ｘ１及
びＹｌの一方のみ、及び／又は基Ｘ２及びＹ２の一方の
み、及び／又は基Ｘ、及びＹ３の一方のみ、及び／又は
基Ｘ、及びＹ４の一方のみが他のアミノ酸により置き換
えられる。
特に好ましい具体例においては、基Ｙ１、Ｙ２、Ｙ、及
び／又はＹ、のＳｅｒ又はＴｈｒの１又は複数が他のア
ミノ酸により置き換えられる。
この発明は特に、Ａ　Ｉ　−１１！、Ａ１□。−１，３
、Ａ１１１ｆｆ−２１’ｌ、Ａ２□ｌ−４４７及びＡ４
５ｌ−５２７が前記の意味を有し；基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ、
及びＸ、の１つ、２つ又は３つがＡｓｎを表わしそして
他がＴＩ＋ｒ及びＳｅｒから選択されたアミノ酸残基を
表わし；Ｙ５、Ｙ２及びＹ、がそれぞれＳｅｒを表わし
、そしてＹ、がＴ　ｂ　ｒを表わし；あるいは、Ｘ、、
Ｘ、、Ｘ３及びＸ、がそれぞれＡｓｎを表わし；基Ｙ１
．Ｙ２及びＹ。
の１つ又は２つがＳｅｒを表わし、そして他がＡｌａ及
びＡｓｎから成る群から選択され、そしてＹ、がＴＩ＋
ｒを表わし；あるいは、Ｘ　１．Ｘ　２、Ｘ、及びＸ。
がそれぞれＡｓｎを表わし、Ｙ、、Ｙ２及びＹ、がＳｅ
ｒを表わし、そしてＹ、がＡｌａ及びＡｓｎから成る群
から選択される式（１）の化合物に関する。
この発明は特に、Ａ　、　−、、＠、ＡＩ□。、。、。
Ａ１１１７−２１７、Ａ２２ｌ−４４７及びＡ４５Ｉ−
６２？が前記の意味を有し：Ｘ１、Ｘ２、Ｘ、及びＸ、
がそれぞれＡｓｎであり；そして基Ｙ１、Ｙ２、Ｙ、及
びＹ、の少なくとも１つがＡｌａ又はＡｓｎであり、そ
して他が５ｅｔ（Ｙｌ、Ｙ２及びＹ、）又はＴｈｒ（Ｙ
４）である式（１）の化合物に関する。
もとのｔ−ＰＡのＮ−グリコシル化部位の少なくとも１
つが維持されている式（１）の化合物、例えばトリペプ
チド残基Ｘ＋　　Ｓｅｒ　　ｙ＋がＡｓｎ　−Ｓｅｒ　
−Ｓｅｒであり、そして／又はＸ２−Ｇｌｙ−Ｙ２が＾
５ｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒであり、そして／又はＸ、−＾ｒ
ｇ−Ｙ、がＡｓｎ　−＾ｒｇ−Ｔｈｒである式（１）の
化合物はＮ−グリコシル化される。もとのｔ−ＰＡグリ
コジル化部位が全く維持されていない化合物はＮ−グリ
コシル化されない。
この発明のｔ−ＰＡ変異体の１本鎖形は前記の式（Ｉ）
に対応する。２本鎖形はＡｒｇ２７’　Ｉ　Ｉｅ”’ペ
プチド結合（第１図参照のこと）の開裂により生ずる。
２本鎖はジスルフィド橋により一緒に保持される。
この発明において使用する場合、特にことわらない限り
“ｔ−ＰＡ°°なる語は１本鎖形を意味し、これはこの
発明のｔ−ＰＡの好ましい形態である。
式（１）の化合物は好ましくは生物工学的手段により製
造される。
この発明の変異ｔ−ＰＡ蛋白買の製造方法は、天然に存
在するＮ−グリコシル化部位の１個又は複数個がそれら
の部位においてグリコジル化が起こり得ない様に変えら
れている変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を
含有する形質転換された真核宿主生物、又はこの宿主生
物の変異体を適切な栄養条件下で培養し、そして前記変
異ｔ−ＰＡ蛋白貫蛋白前し、そして所望により、得られ
た変異ｔ−ＰＡの１本鎖形及び２本鎖形の混合物を個々
の成分に分離し、１本鎖形を含有しない２本鎖形を製造
するために、生成した１本鎖形のｔ−ＰＡを２本鎖形に
転換する、ことを含んで成る。
この発明のｔ−ＰＡ遺伝子発現の一次生成物は１本鎖形
のｔ−ＰＡである。しかしながら、宿主細胞内又は培養
液内にプロテアーゼが存在すれば一次発現１本鎖ｔ−Ｐ
Ａは少なくとも部分的に２重鎖ｔ−ＰＡに転換される。
従って、実際に単離される生成物は変異１本ｆｉｔ−Ｐ
Ａ、変異２本鎖ｔ−ＰＡ、又はこれらの混合物から成る
であろう。
適当な真核宿主生物は高等生物、特に哺乳類の細胞、特
に樹立されたヒト又は動物のセルライン、例えばヒト［
ｌｏｗｅｓセルラインもしくはｌ１ｅＬａ細胞、又はチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルライン、及び
酵母、例えばサツカロミセス・セレビシェ−（鉢胚崩ニ
ジ閏狙ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、この発明の好ま
しい宿主生物はサツカロミセス・セレビシェ−である。
前記のＤＮＡ配列を含有する真核宿主細胞、特に酵母は
、既知の方法を用いて培養される。
すなわち、この発明の形質転換された酵母細胞は資化性
の炭素源、窒素源及び無機塩を含有する液体培地中で培
養される。
種々の炭素源を使用することが可能である。好ましい炭
素源の例として資化性炭水ｆヒ物、例えばグルコース、
マルトース、マンニトールもしくはラクトース、又は酢
酸ナトリウムのごとき酢酸塩であり、これらは単独で又
は適当な混合物として使用することができる。適当な窒
素源には例えばアミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド
及び蛋白質、並びにこれらの分解生成物、例えばトリプ
トン、ペプトン又は肉エキス、さらには酵母エキス、マ
ルトエキス、コーンステイープリカー、並びにアンモニ
ウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又
は硝酸アンモニウムが包含され、これらは単独で又は適
当な混合物として使用することができる。使用される無
機塩には、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム
及びカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩
が含まれる。さらに、栄養培地は増殖促進物質を含有す
ることができる。増殖を促進する物質には、例えば微量
元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、又は個々のアミノ
酸が含まれる。
自律複製プラスミド例えば酵母２μプラスミドＤＮＡ（
ｆＡ記）を含有するプラスミドにより形質転換された酵
母細胞は、導入されたバイブリドプラスミドを失う開化
を種々の程度に有する。この理由のため、このような酵
母細胞は選択的条件下、すなわちプラスミドによりコー
ドされているコード遺伝子の発現を増殖のために必要と
する条件下で酵母細胞を増殖せしめなければならない、
最近使用されておりそしてこの発明のハイブリドベクタ
ー中に存在するほとんどの選択マーカーはアミノ酸又は
プリン合成の酵素をコードする遺伝子である。これは、
対応するアミノ酸又はプリン塩基を欠く合成最少培地を
使用することを必要とする。
しかしながら、適当な殺生物剤に対する耐性〔例えば、
シクロへキシミド、アミノグリコシドＧ４１８、重金属
等に対する耐性〕を付与する幾つかの遺伝子も同様に使
用されよう。抗生物質耐性遺伝子を含有するベクターに
より形質転換された酵母細胞は対応する抗生物質を含有
する複合培地中で増殖し、これによりより速い増殖速度
及びより高い細胞濃度が達成される。
染色体に組み込まれるＤＮＡにより形質転換された酵母
細胞は選択的増殖条件を必要としない。
これらの形質転換された細胞は選択圧を伴わないで増殖
を行うのに十分に安定である。上記の理由のため、これ
らの細胞は複合培地中で増殖せしめるのが有利である。
構成的プロモーター（例えば皿、ＧＡＰＤＨ）を有する
バイブリドプラスミドを含有する酵母細胞は、誘導を伴
わないで、これらのプロモーターに取り付けられたｔ−
ＰＡＩＩ伝子を発現する。しかしながら、Ｌ−ＰＡ遺伝
子が制御されるプロモーター（例えばＰＧＫ又は肌性）
の制御のもとにある場合には、増殖培地の組成は最高レ
ベルのｌｌＲＮＡ転写物が得られるように適合されなけ
ればならない。すなわち、ＰＨ０５プロモーターを使用
する場合、増殖培地は、このプロモーターの抑制解除の
ために低濃度の無機リン酸塩を含有しなければならない
。
培養は常用技法を用いて行われる。培養条件、例えば温
度、培地のｐＨ１及び発酵時間は最高レベルのｔ−ＰＡ
が生産されるように選択される。！！択された酵母株は
好ましくは、好気的条件下で、液深培養で、振とう又は
撹拌を伴って、約り５℃〜約３５℃、好ましくは約３０
℃の温度にて、４〜８のｐＨ１例えばおよそｐＨ７にお
いて、そして約４〜２０時間、好ましくは蛋白質の最高
収量が達成されるまで、培養される。
生産されたｔ−ＰＡ蛋白質は酵母細胞中に蓄積すること
ができ、あるいはべりプラズム空間に又は培地に分泌さ
れ得る。　ｔ−ＰＡが細胞内に蓄積されている場合、ｔ
−ＰＡ蛋白質の回収のため第１段階は細胞内から蛋白質
を遊離せしめることから成る。はとんどの方法において
、まずグルコシダーゼによる酵素的分解により細胞壁を
除去する（セクション４）０次に、生じたスフ二ロプラ
ストを洗剤、例えばトリトンＸ−１００で処理する。こ
の方法に代えて、機械的力、例えば剪断力（例えばＸ−
プレス、フレンチプレス）又はガラスピーズとの振どう
が細胞を破壊するために適当である。得られた混合物を
、常用手段、例えばポリエチレンイミン処理によるほと
んどの非蛋白質物質の除去、硫酸アンモニウム又はトリ
クロロ酢酸を使用する蛋白質の沈澱、ゲル電気泳動、透
析、クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグ
ラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＩＰＬＣ又
は逆相１１ＰＬＣ１適当なセファデックスカラム上での
分子サイズ分離等により、変異ｔ−ＰＡについて濃縮す
る。前精製物の最終精製は、例えばアフィニティータロ
マドグラフィー、例えば抗体アフィニティータロマドグ
ラフィー、特に不溶性マトリクス上に固定されたモノク
ローナル抗−ｔ−ＰＡ抗木を用いるモノクローナル抗体
アフィニティークロマトグラフィー等により達成される
。
培養液から変異ｔ−ＰＡを単離するための他の方法は、
不溶性マトリクス、例えばデキストラン上に共有結合的
に固定された可溶性フィブリン断片の特異的親和性の支
持体上に、又は特にＤＥ−３セフロアース上にそれを選
択的に吸着せしめることからなる。ＤＥ−３は豆科エリ
スリナ・ラティッシマ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ　Ｉａｔｉ
ｓｓｉｍａ　）の種子中に含まれるトリプシン阻害剤で
ある（ヨーロッパ特許比１ｊＪＩＮｏ。
１１２．１２２）、　ＤＥ−３はまたｔ−ＰＡ活性を阻
害することができることが見出されている。そして、標
準的方法を用いて、精製されたＤＥ−３阻害剤を不溶性
マトリクス、例えばＢｒＣＮで活性化されたセファロー
スに結合せしめることができる。　ｔ−ＰＡ蛋白質は阻
害剤マトリクス上の吸着され、そしてチャオトロビック
剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔ）を含有するｍ
ｓ液により溶出され得るであろう。
この発明の好ましい態様においては、培養液は、場かに
よっては上記の１又は複数の精製段階を通した後、室温
にて、ＤＥ−３阻害剤が連結されているＢｒＣＮ活性化
セファロースで回分法により処理するか又はカラムに通
す。セファロース支持体を洗浄した後、約５．５〜６．
０のｐＨを有しそして約１．０〜約２．０Ｍ、好ましく
は１．２Ｍのチャオトロビック剤、例えばＮＨｌＳＣＮ
を含有する緩衝液、例えばリン酸緩衝化塩溶液で処理す
ることにより、吸着された組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターを溶出する。他の方法として、放出剤としてベ
ンズアミジン又はアルギニンを選択することができる。
好ましくは、容器表面への組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターの吸着を防止しそして安定性を改良するために
、精製段階で使用されるすべての緩衝液に洗剤、特に非
イオン性洗浄、例えばトリトンｘ　−ｔｏｏ又はトウィ
ーン８０を加える。洗剤は０．０１〜０．１％の最終濃
度に加えることができる。
組織ブラスミノーゲンアクチベーターが酵母細胞により
ペリプラズム空間に分泌される場合、単純化された方法
を用いることができる。すなわち、細胞壁の酵素的除去
により、又は細胞壁に損傷を与えて生産された変異ｔ−
ＰＡの放出を可能にする化学薬剤、例えばチオール試薬
スはＥＤＴ＾での処理により細胞溶解を行わないで、蛋
白質が回収される。
変異ｔ−ＰＡが培養液中に分泌される場合、ｔ−ＰＡは
培養液から直接回収され得る。
染色体に組み込まれたｔ−ＰＡ遺伝子を含有する酵母細
胞の培養、並びに発現されたｔ−ＰＡの単離及び精製は
上記の同様にして行われる。
この発明の好ましい酵母株、すなわちプロテアーゼ欠損
酵母株が使用される場合、単離される変異ｔ−ＰＡは大
部分１本鎖形である。蛋白質分解活性を示す酵母株が使
用される場合、ｔ−ＰＡ変異体の１本鎖形及び２本鎖形
から成る種々の比率の生成物混合物が得られる。
１本鎖形を実質的に含有しない２本鎖形のｔ−ＰＡ変異
体を調製するためには、プラスミン、又は１本鎖形のｔ
−ＰＡに対して同等の効果を有する酵素の作用によるＡ
、ｇ２１５　１　ｊｅ２１Ｇペプチド結合の開裂により
、１本鎖形を酵素的に２本鎖形に転換せしめる。
２本鎖形を実質的に含有しない変異ｔ−ＰＡの１本鎖形
の便利な調製のためには、存在するかもしれずそして１
本鎖形の２本鎖形への（部分的）転換を惹起するであろ
う痕跡量のプロテアーゼを阻害するために、プロテアー
ゼ阻害剤、例えばアプロチニン（トラシロール）又は塩
基性すい臓トリプシン阻害剤を精製工程中に使用する０
次に、ＤＥ−３のごとき選択的アフィニティー試薬を含
有するカラム上でのクロマトグラフィーにより最終精製
を行う。
この発明の形質転換された宿主生物は、次の段階すなわ
ち、 ◎　この発明の変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコードする構造遺
伝子を調製し； ◎　この得られたｒＲ構造遺伝子適切なベクターに導入
し； ◎　この造成されたハイブリドベクターにより適切な宿
主生物を形質転換し；そして ◎　形質転換されていない細胞から形質転換された細胞
を選択する； 段階を含んで成る組換ＤＮＡ技法により調製することが
できる。　　　　　　　　　　以下余白２、Ｎ−リン　
　　　　　の小ｔ　とも１つを列− この発明はさらに、天然に存在するＮ−グリコシル化部
位の１又は複数がこれらの部位においてグリコジル化が
起り得ない態様で変えられているヒト変異ｔ−ＰＡをコ
ードする配列を有するＤＮＡに関する。
この発明は特に、ｔ−ＰＡ蛋白質のＮ−グリコシル化の
なめに必須のアミノ酸をコードする少なくとも１個のコ
ドンがＮ−グリコシル化のための認識部位を廃止する異
るアミノ酸をコードする他のコドンにより置き換えられ
ていることを特徴とする、変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコード
する配列を有するＤＮＡに関する。
この発明は特に、次の式（ＩＩ）、 Ｎ＋−ｚ＊ａ二Ｚ、を−八にＣ−Ｗ、　　　Ｎ５５ｍ−
５＜ｓ　　　Ｚ２　　　Ｇにに　−Ｗ、−Ｎ、□−ａｓ
＋　　Ｚ３　　ＣＣＣＷ３　　Ｎｅａ＋−＋３４＋−２
４−へＣへ−Ｗ　４　　Ｎ　１３　Ｓ　ｌ　−１５１１
（Ｉｆ＞ （式中、Ｎ１−３４１は成熟ｔ−ＰＡの遺伝子のデオキ
シリボヌクレオチド１−３４８から成るデオキシリボヌ
クレオチド配列であり、Ｎ２５ａ−５４＠は成熟ｔ−Ｐ
への遺伝子のデオキシリボヌクレオチド３５８−５４９
から成るデオキシリボヌクレオチド配列であり、Ｎ、□
−６，１は成熟ｔ−ＰＡの遺伝子のデオキシリボヌクレ
オチド５５９−６５１から成るデオキシリボヌクレオチ
ド配列であり、Ｎ　１１１１＋−１３４１は成熟【−Ｐ
Ａの遺伝子のデオキシリボヌクレオチド６６１−１３４
１から成るデオキシリボヌクレオチド配列であり、そし
てＮｌ３５＋−１１１は成熟ｔ−ＰＡの遺伝子のデオキ
シリボヌクレオチド１３５１−１５８１から成るデオキ
シリボヌクレオチド配列であり；Ｚｌ、Ｚ２、Ｚ、及び
Ｚ、はそれぞれＡｓｎ又は他のアミノ酸をコードするコ
ドンであり；Ｗｌ、Ｗ２及びＷ、はそれぞれ、Ｓｅｒを
コードするコドンであるか、又はＴｈｒ以外の他のアミ
ノ酸をコードするコドンであり、そしてＷ。
はＴｌ＋ｒをコードするコドンであるか、又はＳｅｒ以
外の他のアミノ酸をコードするコドンであり；但しコド
ン２．．２２、Ｚ３及びＺ、の内の少なくとも１つはＡ
ｓｎ以外のアミノ酸をコードし、そして／又はＷｌ、Ｗ
２、Ｗ３及びＷ、の内の少なくとも１つはＳｅｒ及びＴ
ｈｒ以外のアミノ酸をコードする）で表わされる配列を
有するＤＮＡに関する。
さらに詳しくは、この発明は次の式（■′）、Ｎ＋−３
４８−＾＾Ｃ−＾ＧＣＶＶ、　　Ｎ５ｓａ−ｓ−ｓ−＾
＾Ｔ−（：（：Ｇ−Ｗ　２　　Ｎ　５５　！　−６５１
−＾＾ＣＣＣＣＷ３　　Ｎ６ａｌ−＋３＜＋−＾＾Ｃ−
八Ｃ八−Ｗへ４へ　Ｎ　Ｉ　３５　ｌ　−Ｉ　５□（■
′） （式中、Ｎ１−３４１は成熟ｔ−ＰＡの遺伝子のデオキ
シリボヌクレオチド１−３４８から成るデオキシリボヌ
クレオチド配列であり、Ｎ３Ｓ＠−５４９は成熟ｔ−Ｐ
Ａの遺伝子のデオキシリボヌクレオチド３５８−５４９
から成るデオキシリボヌクレオチド配列であり、Ｎ５５
’ｌ−１ｉＳ＋は成熟ｔ−ＰＡの遺伝子のデオキシリボ
ヌクレオチド５５９−６５１から成るデオキシリボヌク
レオチド配列であり、Ｎａａ＋−＋ｓ＜＋は成熟ｔ−ｐ
への遺伝子のデオキシリボヌクレオチド６６１−１３４
１から成るデオキシリボヌクレオチド配列であり、そし
てＮ１３５Ｉ−１５８１は成熟ｔ−ＰＡの遺伝子のデオ
キシリボヌクレオチド１３５１−１５８１から成るデオ
キシリボヌクレオチド配列であり；そしてＷｌ、Ｗ２及
びＷ。
はそれぞれ、Ｓｅｒをコードするコドンであるが、又は
Ｔｈｒ以外の他のアミノ酸をコードするコドンであり、
そしてＷ４はＴｈｒをコードするコドンであるか、又は
Ｓｅｒ以外の他のアミノ酸をコードするコドンであり、
但しコドンＷ、、Ｗ２、Ｗｌ及びＷ４の内の少なくとも
１つはＳｅｒ及びＴｈｒ以外のアミノ酸をコードする）
で表わされる配列を有するＤＮＡに関する。
ヒト成熟ｔ−ＰＡをコードする遺伝子は知られており、
モしてＬ−ＰＡを生産する任意のヒト細胞から誘導する
ことができる。このような細胞は癌由来のもの又は非−
癌由来のものであり、そして好ましくは樹立されたセル
ラインから誘導される。この発明の好ましい態様におい
ては、ｔ−ＰＡの遺伝子はＨｅＬａ［胞に由来する。第
１図において、第１アミノ酸としてのＳｅｒをコードす
るＴＣＴから始まってデオキシリボヌクレオチドの番号
が付されている、１ｌｅＬａ細胞中に存在する成熟ｔ−
ＰＡのＤＮＡ配列が示されている。
野性型成熟ｔ−ＰＡにおいて、Ｚ、はＡＡＣであり、Ｚ
２はＡＡＴであり、Ｚ、はＡＡＣであり、Ｚ４はＡＡＣ
であり、Ｗ、はＡＧＣであり、Ｗ２はＴＣＡであり、Ｗ
、はＡＧＴであり、そしてＷ、はＡＣＡである０式（ｎ
）の化合物においては、これらのもとのコドンの少なく
とも１つが、Ｎ−グリコシル化のための認識部位を廃止
するアミノ酸をコードする様に変えられている。コドン
Ｚ１、Ｚ２、Ｚｌ、Ｚｌ、Ｗ７、Ｗ２、Ｗ、及び／又は
Ｗ、は、前記の但し書きを考慮してナンセンスコドン以
外の他の任意のコドンにより置き換えられ得る。上に詳
述した好ましいアミノ酸をコードしそして１個の、又は
多くの場合２個のデオキシリボヌクレオチドによりもと
のコドンと異る変化したコドンが好ましい。
式（ＩＩ）の化合物において、コドンＺ１、Ｚ２、Ｚｌ
、Ｚｌ、Ｗｌ、Ｗ２、Ｗ、及び／又はＷ、は好ましくは
次のように変更される。すなわちＡＡＣ（Ｚ、、Ｚ、及
びＺ４、＾ｓｎをコードする）は＾ＴＣ（Ｉｌｅをコー
ドする）、ＡＧＣ（Ｔｈｒ）又はＡＧＣ（Ｓｅｒ）に変
えられ；ＡＡＴ（Ｚ２、＾ｓｎをコードする）はＡＴＴ
（［ｌｅ）、八ＣＴ（Ｔｈｒ）又は八ＧＴ（Ｓｅｒ＞に
変えられ；ＡＧＣ（Ｗ、、Ｓｅｒをコードする）は＾Ｔ
Ｃ（Ｉｌｅ）又はＡＡＣ（＾ｓｎ）に変えられ、ＴＣＡ
（Ｗ２、Ｓｅｒをコードする）はＧＣＡ（＾ｌａ）又は
ＴＴ＾（Ｌｅｕ）に変えられ；ＡＧＴ（Ｗ、、Ｓｅｒを
コードする）はＡＡＴ（＾ｓｎ）又はＡＴＴ（Ｉｌｅ）
に変えられ；そしてＡＣＡ（Ｗ、　Ｔｌｔｒをコードす
る）は八Ｔ＾（Ｉｌｅ）、ＧＣＡ（八Ｉｍ）、ＡＡＣ（
＾ｓｎ）又はＡＡＴ（＾ｓｎ）に変えられる。
この発明の１つの好ましい態様においては、コドンＺ１
及びＷ、の内の一方のみ、及び／又はコドンＺｓ及びＷ
２の内の一方のみ、及び／又はコドンＺ２及びＷコの内
の一方のみ、及び／又はコドンＺ４及びＷ、の内の一方
のみが他のコドンにより置き換えられる。
他の好ましい態様においては、コドンＷ１及び／又はＷ
２及び／又はＷ、及び／又はＷ、のみが池のコドンによ
り置き換えられる。
式（ｎ）のＤＮＡ配列は、好ましくは、特に好ましいと
して前に記載した変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコードする配列
である。
式（ＩＩ）の配列を有するＤＮＡは既知の方法により製
造することができる。これらのＤＮＡの製造方法は、Ｄ
ＮＡを化学的に合成し、親成熟ｔ−ＰＡ遺伝子から不所
望のアミノ酸残基のコドンを含んで成るＤＮＡの部分を
切り出し、そしてこれを、前記コドンが好ましいアミノ
酸残基をコードするデオキシリボヌクレオチドトリプレ
ットで置き換えられているＤＮＡセグメントで置き換え
るが、又は部位特定変異誘発によりデオキシリボヌクレ
オチド置換を行うことを含んで成る。
ＤＮＡの化学合成は当業界においてよく知られており、
そして常法を使用する。適当な技法はＳ、＾、Ｎａｒａ
ｎｇ（Ｔｅｔｒａｂｅ　ｄｒｏｎ　３９　、３（１９８
３）　）により記載されている。特に、ヨーロッパ特許
出願Ｎｏ。
１４６．７８５に記載されている方法を使用することが
でき、そして引用によりこの明細書に組み入れる。
成熟ｔ−ＰＡ　ＤＮＡの部分の切り出しは制限酵素を用
いることにより行うことができる。この方法の前提条件
は、変えられるべきコドンの近傍で適切な制限部位を使
用することができることである。不所望のアミノ酸のた
めのコドンを含有する小制限断片をエンドヌクレアーゼ
開裂によって除去する。
所望のアミノ酸をコードするトリブレットが使用されて
いる対応する２本ｍＤＮＡ配列を例えば化学合成により
調製する。このＤＮＡ断片を、適切な方向に、残りの大
断片に連結して変異ｔ−ＰＡをコードする２本鎖ＤＮＡ
配列を得る０便宜上、そしてｔ−ＰＡＩＩ伝子の取り扱
いを容易にするため、後者は、有利には、クローニング
ベクターへのセグメントの挿入及びクローニングを許容
する適切なリンカ−を備えた一層大きなりＮＡ上セグメ
ント中含有される。
この発明の好ましい態様においては、式（ＩＩ）のＤＮ
Ａ配列を有するＤＮＡの調製は部位特定変異誘発によっ
て行われる。この方法はインビトロ変異誘発法であり、
この方法によりクローン化されたＤＮＡの領域内の特定
の部位を変形することができる（　Ｍ、Ｊ、Ｚｏｌ　Ｉ
ｅｒ及びＭ、Ｓｎ＋ｉｔｈ　、　Ｍｅｔｌ＋ｏｄｓ　旺
限−註１．１００　、４６８（１９８３）　；　Ｄ、Ｂ
ｏｔｓｔｅｉｎ及びり、Ｓｌ＋ｏｒｔｌｅ。
５ｃｉｅｎｃｅ　２２９　、１１９３（１９８５）　）
　。
野性型ｔ−ＰＡ遺伝子を変異せしめる方法は、１重鎖野
性型ｔ−ＰＡ３１！伝子又は野性型ｔ−ＰＡ遺伝子を含
んで成る１本鎖ＤＮＡを、変異を指令するミスマツチを
除くばか変異されるべきｔ−ＰＡ遺伝子の領域に相補的
であるオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーにハ
イブリダイズせしめ、このハイブリダイズしたオリゴデ
オキシリボヌクレオチドをプライマーとして使用して相
補的ＤＮＡｆｉの合成を開始し、生ずる（部分的）２本
鎖ＤＮＡを受容体微生物株に形質転換し、この微生物株
を培養し、そして変形されたｔ−ＰＡ遺伝子を有するＤ
ＮＡを含有する形質転換体を選択することを特徴とする
。
野性型ＩＰＡｉｆｉ伝子は好ましくは、プラスミド。
例えばヨーロッパ特許出願Ｎｏ、１４３，０８１中に記
載されているプラスミド中に含まれる。変異誘発のため
、Ｌ−１’Ａ３ｒｉ伝子をプラスミドから、例えば制限
エンドヌクレアーゼ消化により有利に単離して、１−Ｐ
Ａ遺伝子及び場合によってはそれに連結されている他の
機能部、例えばプロモーター、シグナルペプチドＤＮＡ
等を含んで成りそして接着末端を有する２本鎖ＤＮＡを
生じさせ、そして１本鎖ＤＮＡファージ、例えばファー
ジＭ１３の誘導体、例えばＭ１３ｗ＋ｐ８、又はＭ１３
ｍｐ９の複製形（ＲＦ）の適切な制限断片に連結する。
コンピテント微生物、例えばＥ、コリ株のＣａ処理した
細胞をバイブリドファージベクターにより形質転換し、
そして挿入されたｔ−１’Ａｊｇｌ伝子を含有する１本
顕ファージＤＮＡを培ｆＲａ胞の上清から単離する。こ
の鋳型にミスマツチ（変異原的）オリゴデオキシリボヌ
クレオチドプライマーをハイブリダイズせしめる。
文献に記載されている方法の幾つかは、環状鋳形にそっ
ての変異原プライマー（ｍｕＬａｇｅｎｉｃ　ｐｒｉｍ
ｅｒ）の酵素的延長、及びこれに続く、新しく合成され
た鎖中に変異を有する共有結合的に閉じられた２本鎖分
子の形成のための連結による。この方法は一般的に効率
が低いため、第２ブライマーを使用する変法が開発され
ている〔に、Ｎｏｒｒｉｓ等、Ｎｕｃｌ。
＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　、５１０３（１９８３）
、）　Ｍ１３ファージベクターの場合、ユニバーサルＭ
１３シーケンシングプライマー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
　ｐｒｉｍｅｒ）を使用するのが好ましい。
従って、リン酸化された変異原プライマー及びＭ１３シ
ーケンシングプライマーを同時に環状１重鎖ｔ−ＰＡｉ
型ＤＮＡにアニールせしめる。アニーリングは５５℃に
て５分間、そして次に室温にて５分間で急速に起こる。
有利には、プライマー−鋳型モル比を約２０＝１とする
０両プライマーの延長はＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ（
に１ｅｎｏ−断片）により行われる。シーゲンシングプ
ライマーから新たに合成されたＤＮＡ鎖はＴ４　ＤＮ＾
リガーゼにより変異原プライマーの５′リン酸化末端に
連結される。この方法が、所望のミスマツチを担持する
部分的２本鎖分子を形成する。
変異原プライマー及びＭ１３シーゲンシングプライマー
は化学的に合成することができる（前記参照のこと）、
ＤＮＡ合成を室温以上において申し分なく開始するため
、約１４〜２２ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを使用するのが好ましい。さらに
、このようなオリゴデオキシリボヌクレオチドはユニー
ク標的部位を一層容易に認識するようである。特に、１
個のミスマツチを有する変異原オリゴデオキシリボヌク
レオチドは１４〜１８ヌクレオチドの範囲の長さを有し
、他方２個のミスマツチを有する変異原オリゴデオキシ
リボヌクレオチドは約１７〜３０ヌクレオチドの範囲の
長さを有する。変異原プライマーは、ミスマツチが分子
の中央付近に位置するように設計される。このことが、
完全にマツチしたデュプレックスとミスマツチデュプレ
ックスとの間の最大の結合の差をもたらす（下記参照の
こと）。
この発明の好ましい態様においては、変異原オリゴデオ
キシリボヌクレオチドは、グリコジル化を防止しそして
特に好ましいものとして前記したアミノ酸残基をコード
する１個又は２個のミスマツチを有するトリプレットを
含有する。
所望のミスマツチを担持する部分的２本鎖ＤＮＡを直接
使用して受容体微生物、特にＥ、コリの株をトランスフ
ェクトすることができる。このＤＮＡによるトランスフ
ェクションが、野性型ｔ−ＰＡ遺伝子を含有するファー
ジと変異したｔ−ＰＡ遺伝子を含有するファージの混合
物をもたらす、得られたファージを、変異したｔ−ＰＡ
遺伝子を含有するファージＤＮＡについてスクリーニン
グする。
野性型ｔ−ＰＡ遺伝子を有するファージと導入された変
異ｔ−ＰＡ遺伝子を有するファージとの得られた混合物
から変異ｔ−ＰＡ遺伝子を含有するファージＤＮＡを選
択するための好ましい方法は、いわゆるドツトプロット
ハイブリダイゼーション（Ｈ，Ｊ。
Ｚｏｌｌｅｒ及びＭ、Ｓｍ１ｔｈ　、前掲、を参照のこ
と）である。
この方法は、完全にマツチしたＤＮＡデュプレックス及
び１個又は複数個のミスマツチを有するＤＮＡデュプレ
ックスの熱安定性の差に基＜、１本鎖ファージＤＮＡを
固体支持体、例えば濾紙又はニトロセルロースシート上
に、上昇した温度、例えば８０℃においてベーキングす
ることにより固定化し、そして３２ｐラベル化変異原オ
リゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（前記参照の
こと）にハイブリダイズせしめる。低温においては、変
異ｔ−ＰＡ　ＤＮＡ及び野性型ｔ−ＰＡ　ＤＮＡはいず
れもデュプレックスを形成することにより作用する０次
に、段々高くなる温度（例えば１０℃間隔）において洗
浄を行う、これにより、プライマーは野性型ｔ−ＰＡＤ
Ｎ＾から選択的に解離し、完全にマツチした変異体分子
のみがハイブリダイズしたままとなる。変異体分子をオ
ートラジオグラフィーにより同定する。必要な最終温度
を理論的に計算することができる。好ましくは、融点Ｔ
、（プライマーの５０％解離点）を４〜８℃越える温度
が選択される。このＴ０温度は、オリゴデオキシリボヌ
クレオチドと変異ｔ−ＰＡ遺伝子との間の完全に塩基対
合したプライマー−変異ｔ−ＰＡ遺伝子デュプレックス
の各ＡＴ塩基対について２℃の増加及び各ＧＣ塩基対に
ついて４℃の増加を加えることにより計算される。
同定された１次変異ファージにより受容体微生物、例え
ばＥ、ユリ株を再度トランスフェクトし、そして上記の
変異原オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（３
２Ｐラベル化したもの）を用いるドツト・プロット・ハ
イブリダイゼーションにより変異ｔ−ＰＡ遺伝子を含有
するファージＤＮＡについてプラークを再度スクリーニ
ングすることにより、純粋な変異ファージが得られる。
変異ｔ−ＰＡＩｔ伝子を複製形のファージから適切な制
限エントムヌクレアーゼにより切り出し、そしてハイブ
リドベクター中にクローン化するために使用する。
この発明はさらに、ハイブリドベクターに関し、このハ
イブリドベクターはプロモーター、及び天然に存在する
Ｎ−グリコシル化部位の１個又は複数個がそれらの部位
においてグリコジル化が起り得ない様な態様で変化して
いるヒト変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を
含んでなり、このＤＮＡ配列は前記プロモーターの転写
制御のらとにある。
この発明のハイブリドベクターはバイブリドプラスミド
及び線状ＤＮＡベクターから成る群から選択され、そし
てさらに形質転換のために予想される宿主生物に依存し
て選択される。
哺乳類細胞のプロモーターは例えばウィルスプロモータ
ー、例えばＨＴＬＶプロモーター、ＳＶ４０プロモータ
ー、ワクチニアプロモーター等である。
この発明の最も好ましい宿主生物である酵母のプロモー
ターは、酵母、特にサツカロミセス・セレビシェ−のゲ
ノムＤＮＡに由来する。好ましくは、高度に発現される
酵母遺伝子のプロモーターがｔ−ＰＡ変異体の発現のた
めに使用される。すなわち、ＴＲＰ　１遺伝子、＾ＤＩ
　Ｉ又は＾ＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ
０５）ｆｆｉ伝子、イソチトクロームＣ遺伝子の各プロ
モーター、あるいは解糖系酵素をコードする遺伝子のプ
ロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−
３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＩ＋　）
、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソ
キナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラ
クトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラ
ーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキ
ナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホ
グルコースイソメラーゼ、インベルターゼ及びグルコキ
ナーゼの遺伝子のプロモーター、あるいはａ−ファクタ
ー又はα−ファクターをコードする酵母接合フェロモン
遺伝子のプロモーターを使用することができる。この発
明の好ましいベクターは転写調節を伴うプロモーターを
含有する。このタイプのプロモーター、例えばＰＩＩ０
５３ｆｉ伝子のプロモーターは増殖条件の変化によりタ
ーンオン又はターンオフすることができる０例えば、Ｐ
ＩＩ０５プロモーターは培地中の無機リン酸塩の濃度を
上昇せしめ又は低下せしめるのみで意のままに抑制又は
抑制解除され得る。すなわち、酵母の対数増殖期の間プ
ロモーターを抑制することができ、そして最高細胞濃度
となる定常期初期の間のみターンオン（抑制解除）して
岨垣プロモーターにより制御される遺伝子の発現を可能
にすることができる。この性質が、高レベルの転写と相
まって、ＰＨ０５プロモーターをこの発明の好ましいプ
ロモーターにしている。
この発明のハイブリドベクターにおいて、プロモーター
が変異ｔ−ＰＡコード領域に作用可能に（ｏｐｅｒａｂ
ｌｙ）ｉ！結され、変異ｔ−ＰＡの効率的な発現が確保
される。この発明の１つの好ましい態様においては、プ
ロモーターは、連結部に挿入される翻訳開始シグナル（
ＡＴＧ）を伴って成熟ｔ−ＰＡ変異体のコード領域に直
接連結される。この発明の他の好ましい態様においては
、特に宿主生物として酵母を使用する場合、シグナル配
列が造成物中に含められる。適当なシグナル配列は、使
用されるプロモーター、特にＰ　ＩＩ　０５に天然に連
結されているシグナル配列又はインベルターゼシグナル
配列、又はｔ−ＰＡシグナル配列である。他のシグナル
配列、例えば酵母インベルターゼ遺伝子又はα−ファク
ター遺伝子のシグナル配列を使用することもできる。他
方、使用されるプロモーターに天然に連結されている遺
伝子のシグナル配列の一部分をｔ−ＰＡシグナル配列の
一部分と連結することにより融合シグナル配列を造成す
ることができる。シグナル配列を成熟ｔ−ＰＡアミノ酸
配列との間の正確な開裂を許容する組合わせが好ましい
、追加の配列、例えば、特異的プロセシングシグナルを
担持するか又は担持しないプロ配列又はスペーサー配列
を造成物中に含有せしめることにより、前駆体分子の正
確なプロセシングを促進することもできる。他の方法と
して、適切なインビボ又はインビトロ成熟を可能にする
内部プロセシングシグナルを含有する融合蛋白買を生じ
させることができる。好ましくは、プロセシングシグナ
ルはＬｙｓ−＾ｒｇ残基を含有し、このものはゴルジ膜
中に位置する酵母エンドペプチダーゼにより認識される
。変異ｔ−ＰＡ遺伝子の発現の後、遺伝子生成物は分泌
経路に入り、そしてペリプラズム空間に輸送される。細
胞壁を通して培地へのその後の分泌が達成される場合、
収量のかなりの増加が可能なはずである。また、細胞を
破砕する必要がなく、回収工程を単純化することができ
る。
好ましくは、この発明のハイブリドベクターはまた、転
写停止及びポリアゾニレ−ジョンのための適切なシグナ
ルを含有する、遺伝子の３′−フランキング配列を含有
する。′ａ当な３′−フランキング配列は例えば使用さ
れるプロモーターに天然に連結されている遺伝子のそれ
、酵母の場合特にＰＩＩ０５遺伝子のフランキング配列
である。
この発明は特に線状ＤＮＡベクターに関し、このベクタ
ーは天然に存在するＮ−グリコシル化部′位の１個又は
複数個がこれらの部位においてグリコジル化が起り得な
い態様で変えられているヒト変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列から成り、場合によってはシグナル配
列を含み、染色林道（云子中に天然に存在する配列、例
えば宿主染色体遺伝子のプロモーター領域を５′−末端
に有し、そしてこの遺伝子の３′−フランキング領１ｉ
４（の部分）を３′−末端に有する。特に、この発明は
、酵母Ｐｆ１０５プロモーター、変異ｔ−ＰＡコニド領
域及び則咀３′−フランキング領域を含んで成る線状Ｄ
ＮＡに関する。
相同な３′及び５′フランキング配列のため、変異ｔ−
ＰＡ遺伝子を含有する全体線状ＤＮＡベクターは対応す
る宿主染色体に、すなわち酵母ＰＩ（０５プロモーター
及び酵母１’ＨＯ５３ｆｉ伝子の３′−フランキング配
列の場合酵母染色体■のＰＨ０５座に、安定に組み込ま
れる。
この発明はまた特に環状バイブリドプラスミドに関し、
このプラスミドは、プロモーター、天然に存在するＮ−
グリコシル化部位の１個又は複数個がこれらの部位にお
いてグリコジル化が起こり得ない態様で変えられている
ヒト変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコードするＤＮＡ配列、及び
３′フランキング配列のほかに追加のＤＮＡ配列を含有
し、この追加のＤＮＡ配列は、プロモーターの機能のた
め、すなわち変形されたｔ−ＰＡコード領域の発現のた
めには必須ではなく又は重要ではないが、しかし例えば
このバイブリドプラスミドにより形質転換された細胞の
増殖において重要な機能を行うものである。追加のＤＮ
Ａ配列は原核細胞及び／又は真核細胞に由来することが
でき、そして染色体ＤＮＡ配列及び／又は染色体外ＤＮ
Ａ配列を含むことができる０例えば、該追加のＤＮＡ配
列は、プラスミドＤＮＡ、例えば細菌性もしくは真核性
プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ及び／又は染色体Ｄ
ＮＡ、例えば細面、酵母又は高等真核生物の染色体ＤＮ
Ａに由来する（又はこれらから成る）ことができる、好
ましいバイブリドプラスミドは、細菌プラスミド、特に
ニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）プラスミドｐＢＲ３２２もしくは関連プラスミド
、バクテリオファージλ、酵母２μプラスミド、及び／
又は酵母染色体ＤＮＡに由来する追加のＤＮＡ配列を含
有する。
この発明の好ましいバイブリドプラスミドにおいては、
追加のＤＮＡ配列が酵母複製開始点及び酵母のための選
択遺伝マーカーを担持する。酵母複製開始点、例えば自
律複製セグメント（ａｒｓ　）を含有するバイブリドプ
ラスミドは形質転換後酵母細胞内に染色体外で維持され
そして有糸分裂の際に自律的に複製される。酵母２μプ
ラスミドＤＮＡと相同な配列を含有するバイブリドプラ
スミドを同様に使用することができる。これらのプラス
ミドは、細胞内にすでに存在する２μプラスミドに組換
（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　）により組み込まれる
か、又は自律複製するであろう。２μ配列は高頻度形質
転換プラスミドのために特に適当であり、そして高コピ
ー数をもならす。
さらに、この発明の好ましいプラスミドは宿主酵母染色
体中に存在する遺伝子（例えばＰＨ０５遺伝子又は変異
ｔ−ＰＡコード領域に連結されたそのプロモーター）の
部分としてのＤＮＡ配列を含有することができる。約２
０〜１００デオキシヌクレオチドの長さにわたるべき相
同配列のため、全体プラスミド又はその線状断片は組換
により宿主染色体に安定に組み込まれ得る。従って、増
殖の間、子孫細胞は選択圧がなくても導入された遺伝物
質を維持するであろう。
酵母のための選択遺伝マーカーとして、該マーカーの表
現型発現により形質転換体の選択を促進する任意のマー
カーを使用することができる。酵母のために適当なマー
カーは特に抗生物質耐性を発現するマーカーであり、又
は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主の欠損を補完す
る遺伝子である。対応する遺伝子は例えば抗生物質シク
ロへキシミドに対する耐性を付与するもの又は栄養要求
酵母変異株に原栄養性を提供するものであり、例えばＵ
ＲＡ　３、ＬＥＤ　２、ＨＩＳ　３又ハＴＲＰ　１遺伝
子である。さらに、形質転換されるべき宿主がマーカー
により発現される生成物について栄養要求性であれば、
マーカーとして、自律複製セグメントと関連する構造遺
伝子を使用することもできる。
有利には、この発明のバイブリドプラスミド中に存在す
る追加のＤＮＡ配列はまた、細菌宿主、特にニジエリシ
ャ・コリのための複製開始点及び選択遺伝マーカーを含
有する。酵母バイブリドプラスミド中にＥ、コリ複製開
始点及びＥ、コリのマーカーが存在することに関連する
有用な特徴が存在する。第１に、Ｅ、コリの増殖及びそ
の中での増幅により大量のバイブリドプラスミドＤＮＡ
を得ることができ、そして第２に、Ｅ、コリに基礎を置
くクローニング技法のすべてを使用してＥ。
コリ中でバイブリドプラスミドの造成を行うことができ
る。Ｅ、コリのプラスミド、例えばｐＢＲ３２２等はＥ
、コリ複製開始点、及び抗生物質例えばテトラサイクリ
ン及びアンピシリンに対する耐性な付与するＥ、コリ遺
伝マーカーを含有し、そして酵母ハイブリドベクターの
部分として有利に使用される。
例えば酵母及び細菌宿主（前記参照のこと）のための複
製開始点及び遺伝マーカーを含有する追加のＤＮＡ配列
を今後“ベクターＤＮＡ”と称し、このものは酵母プロ
モーター及び変異ｔ−ＰＡコード領域と一緒になってこ
の発明のバイブリドプラスミドを形成する。
好ましい態様において、この発明は酵母宿主採中で自律
複製することができそして選択マーカーを有するバイブ
リドプラスミド、及び宿主染色体に組み込まれる線状Ｄ
ＮＡに関し、これらは酵母プロモーター、及び天然に存
在するＮ−グリコシル化部位の１個又は複数個がこれら
の部位においてグリコジル化が起こり得ない態様で変え
られているヒト変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコードするＤＮＡ
配列を含んで成り、このＤＮＡ配列は、転写開始及び停
止シグナル並びにコードされた翻訳開始及び終止シグナ
ルと共に前記ハイブリドベクター中で前記プロモーター
の制御のもとに配置されており、こうして、形質転換さ
れた酵母菌株中で発現されて前記変異体組織ブラスミノ
ーゲンアクチベーターが生産される。
この発明の好ましいハイブリドベクターは当業界におい
て知られている方法により、例えば酵母プロモーター、
変異ｔ−ＰＡコード領域、酵母遺伝子の３′フランキン
グ配列、及び場合によってはベクターＤＮＡを連結する
ことによって調製される。
バイブリドプラスミドの調製のため、便利には、少なく
とも１個の制限部位、好ましくは２個又はそれより多く
の制限部位を有するマツプされた環状ベクターＤＮＡ、
例えば細菌プラスミドＤＮＡ等（前記参照のこと）を使
用することができる。有利には、ベクターＤＮＡは酵母
及び／又は細菌宿主のための遺伝子マーカーをすでに含
有する。ベクターＤＮＡを適当な制限酵素により開裂せ
しめる。制限酵素処理されたこのＤＮＡを酵母プロモー
ターを含有するＤＮＡ断片及び変異ｔ−ＰＡをコードす
るＤＮＡセグメントに連結する。プロモーターと変異ｔ
−ＰＡコード領域とを連結する前又は後に（あるいは同
時に）、酵母又は細菌宿主のための複製開始点及び／又
はマーカーを導入することが可能である。いずれの場合
にも、制限酵素処理条件及び連結条件は、ベクターＤＮ
Ａ及びプロモーターの本質的機能を妨害しない様に選択
する。ハイブリドベクターは、逐次的に、又は注目のす
べての配列を含んで成る２個のＤＮＡセグメントを連結
することにより造成することができる。
ＤＮＡセグメントをインビトロで連結するために種々の
技法を用いることができる。ある種の制限エンドヌクレ
アーゼによって形成される平滑末端（十分に塩基対合し
たＤＮＡデュプレックス）はＴ４　ＤＮＡリガーゼによ
り直接連結することができる。
さらに普通には、ＤＮＡセグメントはそれらの単鎖接着
末端を介してリンクされ、そしてＤＮＡリガーゼ、例え
ば７４　ＤＮＡリガーゼにより共有結合的に閉じられる
。このような単鎖“接着末端′°は、不ぞろい末端を形
成する他のクラスのエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの
開裂（ＤＮＡデュプレックスの２本の鎖が数個のヌクレ
オチドの距離を１いて異る点で開裂される）により形成
される。単鎖はまた、ターミナルトランスフェラーゼを
用いて平滑末端又は接着末端にヌクレオチドを１１加す
る（“ホモポリマーテーリング°）ことにより、又は適
当なエキソヌクレアーゼ、例えばλエキソヌクレアーゼ
により平滑末端ＤＮＡセグメントの一方の鎖を単にチュ
ーバックすることにより形成することができる。接着末
端を形成するための他の方法は、平滑末端ＤＮＡセグメ
ントに、接着末端形成エンドヌクレアーゼのための認識
部位を含有する化学的に合成されたリンカ−ＤＮＡを連
結し、そして生ずるＤＮＡを対応するエンドヌクレアー
ゼにより消化することから成る。
この発明のハイブリドベクターの構成成分、例えば酵母
プロモーター、場合によってはシグナル配列を含む変異
ｔ−ＰＡのための構造遺伝子、転写ターミネータ−１複
製系等は、適切な機能を保証するように所定の順序に連
結される。これらの成分は共通の制限部位を介して、又
は合成リンカ−分子により連結して該成分の適切な方向
及び順序が保証されるようにする。
線状ＤＮＡは当業界において既知の方法により、例えば
前記の酵母プロモーターを変異ｔ−ＰＡコード領域がこ
のプロモーターにより制御されるような態様で変異ｔ−
ＰＡコード領域に連結し、そして生じたＤＮＡに酵母遺
伝子由来の転写停止シグナルを含有するＤＮＡセグメン
トを設けることにより造成される。
ＤＮＡセグメントの連結は前に詳述し、たようにして、
すなわち平滑末端連結に゛より、接着末端を介して、又
は化学的に合成されたリンカ−ＤＮＡを介して行うこと
ができる。
特に、効率的に発現されるなめには、変異Ｌ−ＰＡ３１
！伝子は転写機能（酵母プロモーター）及び翻訳機能（
リボゾーム結合部位）を含む配列に対して適切に位置し
なければならない、第１に、プロモーターを含むＤＮＡ
セグメントと変異ｔ−ＰＡコード領域との連結は適切な
方向で達成されなければならない、２つの方向が可能な
場合、常用の制限分析により正しい方向を決定する。誤
って方向付けられた変異ｔ−１’Ａ３ｆｔ伝子挿入部を
含有するハイブリドベクターは、適当な制限エンドヌク
レアーゼにより遺伝子挿入部を切り出し、そして遺伝子
をハイブリドベクター断片に再連結することによって再
度方向付けされる。多くの場合、末端に異る制限部位を
有する２つのＤＮＡセグメントを連結することにより誤
まった方向付けが回避される。さらに、ハイブリドベク
ターの造成は正しい転写開始及び停止を可能にするよう
に行われなければならない。
後の点に関して、転写物は好ましくは酵母染色体ＤＮＡ
又は酵母２μプラスミド由来のＤＮＡ配列中で終るべき
である。第２に、゛適切なリーディングフレームが確立
されなければならない０通常、プロモーター領域及び変
異体ｔ−ＰＡコード領域のヌクレオチド配列は連結の前
に知られており、あるいは正しいリーディングフレーム
を確立するために問題がないように容易に決定すること
ができる。
細胞質内での蓄積のために成熟変異ｔ−ＰＡの発現が所
望される場合、場合によってはプロモーター領域に続き
そして／又は場合によっては成熟ｔ−ＰＡコード領域に
先行するシグナル配列又はその部分は、例えばエキソヌ
クレアーゼ、例えばＢ　ａ１３１を用いる消化によって
除去されなければならない。
酵母プロモーターを変異ｔ−ＰＡコード配列に直接連結
するための好ましい領域は、大ｍＲＮＡ出発部と酵母プ
ロモーターに天然に連結されている遺伝子のＡ　Ｔ　Ｇ
との間である。この領域中での連結のため、変異ｔ−Ｐ
Ａコード配列は翻訳開始のためのそ　−れ自身のＡＴＧ
を有すべきであり、あるいはそれは追加の合成オリゴヌ
クレオチドにより提供されなければならない、酵母プロ
モーターはまた、連結分、子としての合成オリゴデオキ
シリボヌクレオチドにより変異ｔ−ＰＡコード配列に連
結されることもできる。すなわち、プロモーター領域は
、可能であれば、それが所定数の塩基対を欠くように、
その３′−末端の近傍で制限切断される。同様に、変異
ｔ−ＰＡコード配列はその５′−末端の近傍で制限切断
される。そして、合成オリゴデオキシヌクレオチドを、
該連結オリゴデオキシヌクレオチドを介して酵母プロモ
ーターと変異ｔ−ＰＡコード配列とを連結した場合にＡ
ＴＧ翻訳開始シグナルを含む欠けている塩基対が再生さ
れそして変異トＰＡコード配列がＡＴＧ開始コドンに対
して適切なリーディングフレーム中にあるように造成す
ることができる。
この発明の他の観点は、天然に存在するＮ−グリコシル
化部位の１個又は複数個がこれらの部位においてグリコ
ジル化が起り得ないように変えられている変異ｔ−ＰＡ
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含有する形質転換され
た真核宿主生物、及びその変異体に関する。
適当な真核宿主生物は特に前に記載したもの、さらに詳
しくはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｃｒｏ＋５ｙｅｅ
ｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトル
ラ（叶庄屋−ｔｏｒｕｌａ）属、サツカロミセス（Ｓａ
ｃｃｌｔａｒｏｍ　ｃｅｓ）属、シツオサツカロミセス
（Ｓｃｂｉｚｏｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トル
ロープシス（隙組抜旺恒）属、及び類縁属の種を包含す
る酵母（Ｊ、Ｌｏｄｄｅｒ、Ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔｓ　、
アムステルダム、１９７１を参照のこと）、特にサツカ
ロミセス・セレビシェ−の株である。
形質転換された真核宿主生物は、バイブリドプラスミド
により形質転換された宿主生物（このプラスミドは、プ
ロモーター、及び天然に存在するＮ−グリコシル化部位
の１個又は複数個がこれらの部位においてグリコジル化
が起こり得ないように変えられているヒト変異ｔ−ＰＡ
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含んでなり、このＤＮ
Ａ配列は前記プロモーターの転写制御のちとにある）、
及び前記ＤＮＡ配列が宿主染色体中に安定に組み込まれ
ておりそして染色体宿主プロモーターの転写制御のちと
にある宿主細胞のいずれかである。
前記形質転換された真核宿主細胞の製造方法はハイブリ
ドベクターにより真核宿主細胞を形質転換することを含
んで成り、このプラスミドはプロモーター、及び天然に
存在するＮ−グリコシル化部位の１ｆｌｌ又は複数個が
これらの部位においてグリコジル化が起こり得ないよう
に変えられているヒト変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列を含んで成り、このＤＮＡ配列は前記プロモ
ーターの転写制御のらとにある。
真核宿主細胞の形質転換は、当業界において既知の方法
により行われる、例えば、ハイブリドベクターによる酵
母の形質転換は、旧ｎｎｅｎ等〔瞳ムＮａｔ１．＾ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、υＳ＾、）５　、１９２９（１９７８））
により記載された方法に従って行うことができる。この
方法は次の３段階に分けることができる。
（１）酵母細胞壁又はその部分の除去。
（２）ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）及びＣａ＋＋
イオンの存在下での形質転換用ＤＮＡによる“課の°°
酵母細胞の処理。
（３）寒天の固相中での細胞壁の再生及び形質転換され
た細胞の選択。
乱りし秋友汲 段階（１）： 浸透圧の安定した溶液（例えば１Ｍソルビトール）中で
、種々のグルカナーゼ標品、例えばカタツムリの消化液
〔例えばグルカナーゼ（Ｇｌｕｓｕｌａｓｅ）（商標）
又はヘリカーゼ（Ｈｅｌ　１ｃａｓｅ）　（商標）〕、
又は微生物から得られる酵素混合物〔例えばチモリアー
ゼ（Ｚｙ請ｏ１ｙａｓｅ）（商標）〕を用いて酵母細胞
壁を酵素的に除去する。
段ＩＰＪ（２）： ＰＥＧの存在下で→俳号スフェロプラストが凝集し、そ
して細胞質膜の局部的融合が誘導される。
“融合様”条件の形成が必須であり、そして多くの形質
転換された酵母細胞が形質転換の過程で２倍体となり又
は３倍体にさえなる。融合したスフェロプラストの選択
を可能にする方法を用いて形質転換体を濃縮することが
できる。すなわち、あらかじめ選択された融き生成物の
中から形質転換された細胞を容易にスクリーニングする
ことができる。
段階（３）： 細胞壁を有しない酵母細胞は分裂しないので、細胞壁が
再生されなければならない。この再生は、スフェロプラ
ストを寒天に封入することにより便利に行われる。例え
ば、溶融した寒天（約５０℃）をスフェロプラストと混
合する。この溶液を酵母の増殖温度（約３０℃）に冷却
した後、固相が得られる。この寒天層は、スフェロプラ
ストからの必須巨大分子の急速な拡散及び喪失を防止し
、それによって細胞壁の再生を促進するためのものであ
る。しかしながら、細胞壁の再生は、スフェロプラスト
をあらかじめ形成された寒天層の表面にプレートするこ
とによっても得られる（但し、効率は低い）。
好ましくは、再生寒天は形質転換された細胞の選択と再
生とを同時に可能にするように調製する。
アミノ酸生合成経路の酵素をコードする酵母遺伝子が一
般に選択マーカーく前記参照のこと）として使用される
ので、再生は好ましくは酵母最少培地寒天中で行う。非
常に高い効率の再生が必要とされる場合、次の２段階法
が有利である。すなわち、（１）富複合培地中での細胞
壁の再生、及び（２＞ａｌ胞層を選択寒天プレートにレ
プリカプレートすることによる形質転換された細胞の選
択である。
ハイブリドベクターがマーカー遺伝子を含有していない
場合には、形質転換された細胞は他の方法によって同定
することができる。このような方法は例えばハイブリド
ベクターの配列に相同なラベルされたＤＮＡ断片とのイ
ンシチュ・ハイブリダイゼーション〔例えば、旧ＩＩ　
ｆｌ　ｅ　ＩＩ等、前掲による〕、導入された遺伝子の
生成物に対する抗体が入手可能であればインシチュ・イ
ムノアッセイ、又は形質転換用プラスミドによりコード
された遺伝子生成物を測定する他のスクリーニング方法
を包含する。
他の方法として、酵母細胞を、この発明のハイブリドベ
クター及び酵母用遺伝マーカーを含有する第２ベクター
により同時形質転換することができる。２つの異るベク
ターが共通のＤＮＡ配列（これらはベクター上に存在す
る細菌配列であることができる）を有する場合、組換が
生じて融合された選択可能なバイブリド分子が導かれる
。
酵母はまた、線状ＤＮＡベクター（酵母プロモーター、
該プロモーターにより制御されるシグナル配列を含む場
合がある変異ｔ−ＰＡコード領域及び酵母遺伝子の転写
停止シグナルから成る）、及び酵母用選択マーカーを含
有するベクターにより形質転換され得る。同時形質転換
は、直接選択され得ないＤＮＡを取り込んだ酵母細胞の
濃縮を可能にする。コンピテント細胞はいかなるタイプ
のＤＮＡも取り込むから、選択ベクターにより形質転換
された細胞の多くが追加のＤＮＡ（例えば、上記の線状
ＤＮＡ）をも含有する。十分に長い相同配列（例えば、
約２０〜１００デオキシヌクレオチドの長さ）により、
ポリペプチド遺伝子は宿主染色体に安定に組み込まれる
であろう。
形質転換された宿主微生物、特に、この発明のバイブリ
ドプラスミドを含有するか又は宿主染色体に安定に組み
込まれた変異ｔ−ＰＡＩ！伝子を含有する線状ＤＮＡベ
クターを有する形質転換された酵母株は、変異ｔ−ＰＡ
の生産について、当業界において既知の方法を用いる変
異及び選択により改良され得る。変異は例えばＵ、■照
射又は適当な化学薬剤により行うことができる。生産さ
れた変異Ｌ−ＰＡの細胞内での１０テア一ゼ分解を防止
するために、プロテアーゼ欠損変異株、特に酵母変異株
を形成するのが好ましい。
５．１！ｉｌＬ肛 この発明に従って得られる、好ましくは１本鎖形である
新規な変異ｔ−ＰＡ蛋白質は、価値ある薬理学的性質を
示す、これらは既知のグラスミノーゲンアクチベーター
と同様に、ヒトにおいて、血栓症、又はプラスミノーゲ
ン活性化機構を介して局所的フィブリン溶解活性もしく
は蛋白質分解活性を生じさせることが望まれる池の状態
、例えば動脈硬化、心筋梗塞及び脳梗塞、静脈血栓、血
栓塞栓症、手術後血栓、血栓性静脈炎、及び糖尿病血管
疾患の予防又は治療のために使用され得る。
驚くべきことに、この発明の新規な変異ｔ−ＰＡ蛋白質
は十分にグリコジル化された天然ｔ−ＰＡの生物学的活
性に匹敵するか又はそれより浸れた生物学的活性を有す
ることが見出された。すなわち、この新規なＬ−ＰＡ変
異体はフィブリン溶解活性を有する。ユニークなフィブ
リン指向性、すなわちフィブリンの存在下でのみプラス
ミノーゲンを活性化する能力が十分に維持されている。
さらに、新規な蛋白質は真正なｔ−ＰＡに比べて長いイ
ンビボ安定性を有する。明らかに、Ｎ−リング炭水化物
鎖を完全に又は部分的に欠く新規な蛋白質は十分にグリ
コジル化された生成物に比べてプロテアーゼ分解に対し
て悪受性でない。
炭水化物残基を欠く糖蛋白質の生物学的活性の維持は予
想できずそして多様である。ある場合には、脱グリコジ
ル化又は部分的膜グリコジル化でさえ生物学的活性の棄
損又は喪失を導＜　（ＣＤ、Ｒ。
にａｒｐ等、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７　、
７３３０（１９８２）　；　Ｈ，Ｔ。
Ｋｅｎｔｍｔｎｓ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　２
２　、３０６７（１９８３）　；　１１．Ｒ。
Ｇｒａｄｎｉｃｋ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ
、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８０　、２７７１（１９８３））　
、この発明の変異ｔ−ＰＡの驚くべき性質は化学的に又
は酵素的に脱グリコジル化されたｔ−ＰＡから得られた
結果（Ｓ、Ｐ、Ｌｉｔｔｌｅ等、前掲、　ＰＣＴ　８４
／１９６０　、前掲）からは推定できない。なぜならし
−ＰＡの化学的又は酵素的処理は明らかに、Ｎ−リンク
炭水化物類が全体的に欠けているか、又は少なくともＮ
−リンク炭水化物類の幾つかが欠けている生成物を生じ
させないからである。
この発明はまた、療法的有効量の活性成分（１本鎖又は
２本鎖変異卜ＰＡ又はその混合物；１本鎖形が好ましい
）を、非経口的、すなわち筋肉内、皮下又は腹腔内投与
のために適当でありそして前記活性成分と不都合な反応
を行わない有機又は無機の固体又は液体の医薬として許
容される担体と共に含有する医薬製剤に関する。
注入溶液、好ましくは水性溶液又は懸濁液であり、これ
は例えば、活性成分を単独で又は担体、例えばマンニト
ール、ラクトース、グルコース、アルブミン等と共に含
有する凍結乾燥された調製物から使用に先立って調製す
ることができる。医薬製剤は無菌化され、そして所望に
より添加剤、例えば防腐剤、安定剤、乳化剤、溶解剤、
！！街剤及び／又は浸透圧調整塩と混合される。無菌化
は小さい孔サイズ（０，４５μ−以下の直径）のフィル
ターを通しての無菌濾過により達成することができ、所
望によりこの後、調製物を凍結乾燥することができる。
無菌状態を維持するため抗生物質を添加することもでき
る。
この発明の医薬製剤は単位投与形、例えば単位投与当り
１〜２０００ｍｇの医薬として許容される担体、及び単
位投与当り約１〜１００ｍｇ、好ましくは約３〜２５ｍ
ｇの活性成分（１本鎖もしくは２本鎖変異体ｔ−ＰＡ、
又はそれらの混合物、１本鎖形が好ましい）を含んで成
る単位投与形、例えばアンプルとして分配される。
疾患のタイプ並びに患者の年令及び状態に依存して、約
７０ｋｇの体重の患者の治療のために投手される日用量
は２４時間当たり３〜１００ｍｇ、好ましくは５〜５０
ｍｇである。心筋梗塞の症例においては、好ましくは、
約３０〜８０ｍｇを６０〜１２０分間以内に投与し、好
ましくは３回にわけて約９０分間以内に投与する。
この発明はまた医薬の製造方法を提供し、この方法はこ
の発明の生物学的に活性な蛋白質を医薬として許容され
る担体と混合することを特徴とする。
人体の予防又は治療的処置のための新規蛋白質の使用も
またこの発明の対象である。
この発明はまた、特に、例に記載されているＤＮＡ配列
、ハイブリドベクター、形質転換された宿主株、変異ｔ
−ＰＡ蛋白質、及びその製造方法に間する。
次の実験の部において、この発明の種々の具体例を図面
に言及しながら記載する。
次の例は本発明を例示するためのものであり、この発明
の範囲を限定するものではない。
火Ｗへ紙 例において次の略号を用いる。
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン； ＤＴＴ：１，４−ジチオスレイトール（１，４−ジメル
カプト−２，３−ブタンジオール）；ＥＤＴ＾：エチレ
ンジアミン四酢酸； Ｐ、ＥＧ：ポリエチレングリコール６０００　。
ＳＤＳニドデシル硫酸ナトリウＡ　。
Ｓ　ＳＣ：　　１５０ｍＭ　Ｎａｃｉ’　、　１５−ク
エン酸ナトリウム、　０．５　ａ＋Ｍ　ＥＤＴ＾を含有
する溶液（ＩＩＣＩＧ、：よりｐＨ７，２に調整）； ＴＢＥ　：　９０ｍ１４　Ｔｒｉｓ　、　９０ｍＭ硼酸
、２．５ｍＭＴｉｔｒｉｐｌｅｘ（商標）を含有する溶
液；Ｔ　Ｅ　：　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・ｔｌｃｌ（
ｐＨ８，Ｏ＞及び０．１　ｍＭＥＤＴ＾（ｐＨ８，０）
を含有する溶液； Ｔ　ＮＥ　：　１００ｍＭ　ＮａＣ１、Ｉ　Ｃ）＋Ｍ　
Ｔｒｉｓ−１１ｃｉ’（ｐＨ７，５）及び１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴ＾を含有する溶液；Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　：　ＨＣｆ
ｆｉによりｐＨｆｌｑ整されたトリス−〈ヒドロキシメ
チル）−アミノメタン。
ａ）　プラスミドｐ３１／則牲−ＴＰＡ１８（ヨーロッ
パ特許出願Ｎｏ、１４３，０８１に記載されている）は
、ＰＨ０５プロモーター、及びｔ−１”ＡＭ造遺伝子（
第１図を参照のこと）にフレームを合わせて融合された
Ｐ）１０５シグナル配列を有する。このプラスミドをＥ
、コリの恒０株であるＤ　Ｈ−１（Ｆｅ、　ｒｅｃ＾１
　、　ｅｎｄ＾１゜ｄ　、　ｔｈ　ｉ−１、ｈｓｄＲ１
７（ｒＫｅ、　ｍｘ”）　、　凹Ｌｋ棟。
λ０）を通す。２個のａｍｐ’″コロニーを単離し、そ
して１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００
ｍＭのＬＢ培地中で増殖せしめる。細胞からプラスミド
ＤＮＡを単離する。　ＢａｍＨＩ及び旧ｎｄｌ［［（ベ
ーリンガー）による制限酵素消化物はｔ−ＰＡ遺伝子挿
入部の正しいサイズを示し、これをＰｓｔＩ（ベーリン
ガー）消化の制限パターンにより確認する。
ｂ）Ｅ、コリＤＨ−１株からの３μｓのｐ３１／則咀−
７ＰΔ１８を２０Ｕのｌｌ１ｎｄｌ［（ベーリンガー、
２０Ｕ／μＮ）と共に３７℃にて６０分間、５０μｌの
１　０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ・１ＩＣ１（ｐＨ７，５）　　
、　　６ｍＭ　　ＨｇＣｌ２　、　５　０ｍＭＮａＣｊ
！　、　６　ｍＮメルカプトエタノール中でインキュベ
ートする。アリコートをＴＢＥ［新液中１％アガロース
ゲル上でチェックすることにより完全な消化を確認する
。消化物を６５℃にて１０分間インキュベートする０次
に、０．５ｕｌの５ＭＮａＣｌを加゛え、次に１８Ｕの
［ｌａｍｌｌｌ（ベーリンガー、１８Ｕ／μりを加える
。これを３７℃にて６０分間インキュベートする。ＴＢ
Ｅ緩街液新液％アガロースゲル上でのアリコートの分析
は３．６Ｋｂベクタ一断片のほかに２．３Ｋｂ挿入部を
示す、挿入部を０．８％分収用アガロースゲル上で単離
する。ゲルスライスをＭｉｃｒｏ−Ｃｏｌｌｏｉｄｏｎ
（商標）チューブに移し、１００μｌのＴＥで覆い、そ
して電気溶出する（９０ｍＡにて５０分間電気泳動する
）、ＴＥ温溶液シリコン処理したチューブに集める。０
．１容量の１０ｘＴＮＥを添加した後、２．５容量の無
水エタノールによりＤＮＡを沈澱せしめる。ＤＮ、Ａベ
レットを冷８０％エタノールで洗浄し、そして真空乾燥
する。ＤＮＡを２０μｌのＴＨに再懸濁する（１３℃ｍ
ｏｌ／、ｕｆ）。
ｃ）　　３μｇの８１３＋ｐ８（ＲＦ形）を旧ｎｄ［Ｉ
及びＢａ＊ＨＩで切断し、そして）、３Ｋｂ断片を０．
８％分収用アガロースゲル上で単離し、電気溶出し、そ
して前記のようにして沈澱せしめる。ＤＮＡを２０μｌ
のＴＥ中に再懸濁する（３０．８ｌｍｏｌ／μｌ）。
ｄ）　　９２℃ｍｏｌのＭ１３ｍｐ８　ＢａｍＨＩ　　
ｌｌ１ｎｄｌ［Ｉ切断ベクターと１３０ｆｓｏｌのＢａ
５Ｈ’ｉ−旧ｎｄｌＩＩ切断ｔ−ＰＡ挿入部とを２０ｔ
ｔｌの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣ１’（ｐＨ７、５）
　、　１０−Ｈ軸ＣＩ２　　、１０１１８　ＤＴＴ　、
　２論Ｍ　ＡＴＰ　、　１μｇゼラチン（シグマ）中で
４００ＵのＴ４　ＤＮ＾リガーゼにューイングランドビ
オラブス、４００Ｕ／μｍ）を用いて１５℃にて１８時
間にわたり連結する。６５℃にて１０分間のインキュベ
ーションの後、連結混合物のアリコート１μ！を稀釈す
る（ＴＥにより１：１０）。２μ！及び８μｌのこの稀
釈された連結混合物を用いて、アメルシャムにより発行
されたマニュアル“Ｍ１３ＣＩｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｌ１ａｎｄｂｏｏｋ”に従ってＥ
、コリＪＭ１０１Ｃａ”＋細胞を形質転換する。２００
個の無色のプラーク（１：１０稀釈された連結混合物、
８μりから２５個を拾い、そして１本鎖形ＤＮＡ及び複
製形（ＲＦ）ＤＮＡを調製する（Ｊ、Ｍｅｓｓｉ＋＋ｇ
　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　　、
　１０１　、２ｌ−７８（１９８３）　）　、ＲＦ−Ｄ
ＮＡの分析の際、２＠のクローンが正しいサイズの挿入
部（２，３Ｋｂ　Ｄａｍｎ　Ｉ　−Ｈｉｎｄｍｔ−ＰＡ
遺伝子断片）を示す。を−ＰＡｊＦＩ伝子をＰ　＋Ｉ　
０５プロモーター及びターミネータ−と共に含有するこ
れらの２つのクローンをさらに分析する。Ｐｓｔｌ、ｆ
ｌｉｎｄｎｌ　　ＥｃｏＲＩ　、　Ｂａｎ１ｌ　Ｉ　　
ＥｃｏＲＩ消化物は２．３Ｋｂ断片の存在を確認する。
クローンの１つをｐ８＾−７と称し、その後の造成に使
用する。
以下余白 例２．１本鎖８＾−７を　いるＡｓｎ　１１７の第１グ
リ５′３′ 変ＷＥ（７ライ７−Ｉ　　　ＣＴＴＧＴＣＣ；ＴＵＧＣ
ＧＣＡＡＣＣ５′３′ 変異したコード鎖・・・ＴＧＧ＾＾ＣＡＧＣ川（：ＣＣ
ＴＴＧ　ＧＣＣ・・・すべての変異原プライマー及びシ
ーケンシングプライマーはホスホルアミダイト法（Ｍ、
ｌｌ。
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　、　Ｃ１＋ｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ
　Ｅｎｚ　ｍａｔｉｃ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　Ｇｅ
ｎｅ　Ｆｒａ　ｍｅｎ’ｓ（Ｈ，Ｇ、（：ａｓｓｅｎ及
び＾、Ｌａｎｇ編）Ｖ６ｖｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ　、パ
インハイム、西独〕を用いて＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｉ）ｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ製（モデル３８０Ｂ）合成機により合成
する。
シーケンシングプライマー■： ｄＧｃｃｃＡＧｃｃＴＧＡＴ（：（：Ｃ（：Ｔ以下余白 シーゲンシングプライマ−■： ｄＣＣＡＣ（：ＧＣＡＧＣＣＡＧＧ八ＣＧシーケンシへ
グプライマーＩ＝ ｄｃＡＧｃＡｃ（：ＴＧＧＣＡＣＣＡＧＧシーケンシン
グブライマー■： ｄＴ（：ＧＣＡ（：ＧＣ（：ＴＣＧＴＧＣ＾＾ユニバー
サルＭ１３シーケンシングプライマー二ｄＧＴ＾＾＾＾
ＣＧＡＣにＧＣＣＡにＴａ）　変異原ブライマーのリン
酸化 ２００ｐｍｏ　ｌの変異原プライマーＩを１μｌの１０
ｍＭ＾ＴＰを含有する２０ｔｔｌの５０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ　−ＦＩＣ１’　（ｐＨ７，５）　、　１０＋＊Ｍ　
ＨｇＣｌ２．５ｍＭ　ＤＴＴ、０．１ｍＭスヘ／レミジ
ン、０．１＋自Ｍ　Ｅ［）Ｔ＾中で８０のＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（ベーリンガー、８Ｕ／μｍ）を用い
てリン酸化する。３７℃にて４５分間インキュベートし
た後、６５℃にて１０分間加熱することにより反応を停
止する。
１１）変異原ブライマー１及びユニバーサルシーゲンシ
ングブライマーの１本鎖鋳型ρ８＾−７へのアニーリン
グ ０．８８μｇ＜１２：Ｈｍｏｌ）の１本鎖鋳型ｐ８＾−
７を２０ｐｍｏ　ｌのリン酸化された変異原オリゴデオ
キシリボヌクレオチドＩ　（１０ｐｍｏｌ／μｉ’）及
びｌＱｐｍｏｌのユニバーサルＭ１３シーケンシングプ
ライマーと共に、１０ｕｌの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・１ｌ
Ｃ１（ｐＨ７，５）　、　１０ｍＭＨｇＣ１ｚ　、　５
０　ｓ＋Ｍ　Ｎａｃｌ、　１　ｍＭ　ＤＴＴ中で５５℃
番こて５分間インキュベートし、そして室温にて５分間
冷却する。
Ｃ）　延長一連結反応 上記のアニール混合物に、１μｌのＭＷＩ液（０，２Ｍ
　Ｔｒｉｓ・１１Ｃ１’、ｐＨ７，５，０，１Ｍ　Ｍｇ
ＣＣ０，１Ｍ　ＤＴＴ＞を含む１０μｌの酵素−ｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ　、　ｄＴＴＰ　。
ｄＣＴＰ）溶液〔４μ！の２．５　ｓ＋Ｍ　ｄＮＴＰ混
合物、１μｌの１０ｍＭγ−＾ＴＰ、１．４μｌのＴ４
　ＤＮ＾リガーゼ（アメルシャム、２．５Ｕ／ｕｌ）、
０．６μｌのＫｌｅｎｏｗ　ＤＮ＾ポリメラーゼ（Ｂ　
ＲＬ　、　２．９９ｔＪ／μｍ）〕、を加える。
これを１５℃にて８時間インキュベートする。
６５℃にて１０分間インキュベートすることにより反応
を停止する・　　　　　　　　以下、ｉｉ　白ｄ）連結
混合物による形質転換 連結混合物をＴＥにより１：２０及び１　：　　２００
に稀釈する。これらの稀釈された液のそれぞれの１ｕｌ
及び５ｕ／を用いて０．２ｍｌのＥ、コリＪＭ１０１コ
ンピテント細胞を形質転換する（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ　ｙ　、　１
０１　、２ｌ−７８（１９８３）　）　。
３６個のプラークを拾い、Ｐ　Ｅ　Ｇ沈澱によりファー
ジを単離し、そして５０μｌのＴＥ中に再溶解する（０
．１〜０．１６μｇ／μｍ）。
ｅ）　ファージのスクリーニング ２μｌのファージＤＮＡを乾燥ニトロセルロース紙（ミ
リボアＳ、＾、Ｃａｔ、Ｎｏ、ＩＩＩＶＰ０９０　、ポ
アサイズ０．４６μ論）上にスポットする。空中で乾燥
した後、フィルターを真空中で８０℃にて２時間ベーキ
ングする。フィルターを５社の６ｘＳＳＣ、ＩＯＸデン
ハート（０，２％ＢＳＡ、０．２％ポリビニルピロリド
ン、０．２％フィコール）、０．２％ＳＤＳ中で６７℃
にて１時間、熱シールバッグ内でプレハイブリダイズせ
しめる。フィルターを取り出し、そして５０ｍ１の６ｘ
ｓｓｃ中で室温にて１時間すすぐ、フィルターをシール
バッグに入れる。３ｍｌの６ＸＳＳＣ，１０Ｘデンハー
ト及び１００ｕｌの３２ｐ−ラベル化変異原プライマー
Ｉを加える。このバッグを室温にて１時間置く、フィル
ターを取り出し、そして６ＸＳＳＣ（５０＋１Ｘ３）に
より室温にて合計１０分間洗浄する。フィルターを、強
化スクリーンを用いて一７０℃にて１時間オートラジオ
グラフにかける。フィルターを５０℃にて６ｘＳＳＣ（
５０ｍｌ’）で洗浄し、そして強化スクリーンを用いて
一７０℃にて１時間オートラジオグラフにかける。フィ
ルターを６０℃にて６　Ｘ　Ｓ　５Ｃ（５０社）で洗浄
し、そして強化スクリーンを用いて一７０℃にて２時間
オートラジオグラフにかける。６０℃にて洗浄されたフ
ィルター上に、最初のスクリーニング後に変異を有する
６個のコロニーが見出される。
ｆ）配列決定 ＡＧＣコドン（Ｓｅｒｌ１９）のＡＡＣコドン（＾５ｎ
ｌ１９）への変異が、チェインターミネータ−法（Ｆ、
５ａｎＨｅｒ、四人υ−，５４６３−５４６７（１９７
７）　）を用いて、シーケンシングプライマー■による
ＤＮＡ配列決定により、１つの陽性クローンについて確
認される。ＤＮＡ中での変異が、成熟ｔ−ＰＡのアミノ
酸位置１１９におけるＳ　ｅｒ−＊　Ａ　ｓｎの変化（
（Ａｓｎ””）　−ｔ−ＰＡ）をもたらす。
ｇ）　プラーク精製 ｐ８＾−７−ＭｏＩと称する陽性クローンをプラーク精
製する。ファージストックを稀釈しく１：１０’。
１０”　、　１０’　）　、ＹＴ７レー　ト上にプレー
トし、そして３７℃にて一夜インキユベートする。次に
、プラークを拾い、ファージを単離し、そして次に３２
ｐ−ラベル化変異原プライマー１を用いてスクリーニン
グする。１０フアージ中７フアージからのＤＮＡが所望
の変異を有する（第２図）。これらの１つｐ８＾−７−
ＭｏＩからＲＦ−ＤＮＡを調製し、そしてｐＪＤＢ　２
０フにクローニングするために使用する。
以下余白 酊ユ　１８＾−７を　いる＾５ｎ１８４における＋２コ
ード鎖　　　　　　・・・ＧＧＧ＾＾Ｔ　ＧＣＧ　ＴＣ
Ａ　にＣＣＴＡＣＣにＴ・・・３′５′ 変異したコード鎖　・・・ＣＧＧ＾＾Ｔｃｃｃ躾人（：
ＣＣＴＡＣＣＧＴ　、、・Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ プライマー■のリン酸化、アニーリング、延長一連結、
及び形質転換を例２と全く同様にして行う、３６個のプ
ラークを拾い、そしてファージを３２ｐ−ラベル化変異
原プライマー■を用いてスクリーニングする。フィルタ
ーを洗浄する温度を室温、５０℃及び６０℃とする。６
０℃での洗浄が４個の変異クローンの存在を示す。１つ
のクローンからのＤＮＡをシーケンシングブライマー■
を用いて配列決定し、第２グリコジル化部位における変
異を確認する（第２図）、このクローンからのファージ
をプラーク精製し、そして陽性変異についてスクリーニ
ングする。陽性クローンの１つをρ８＾−７−ＭＯ２と
称する。この変異がコドンＴＣ＾（Ｓｅｒ１８６）をＧ
Ｃ＾（＾１ａ１８６　）に転換し、成熟ｔ−ＰＡの位置
１８６におけるＳｅｒ−”Ａｌｔの変化（（Ａ　Ｉａ’
　”）（−ＰＡ）をもたらす。
１木鎖ｐ８＾−７−８０１及び変異原プライマー■を用
いて例２の方法を反復する。プラーク精製及びスクリー
ニングの後、陽性クローンの１つをｐ８＾−７−Ｍ０２
１と称する。このクローンのＤＮＡを、シーケンシング
ブライマー■及び■を用いて配列決定する。グリコジル
化部位１１７及び１８４における変異が確認される（第
２図）。ＤＮＡ中の２個の変異の組み合わせが位置１１
９及び１８６における２つのアミノ酸変化を有する変異
ｔ−ＰＡ分子（（Ａｓｎ”’。
Ａ　Ｉａ’　”　）−ｔ−Ｐ八）を導く。
以下余白 艶１１　　　？　　８＾−７−Ｍ０２１−ｔ−いる＾５
ｎ４４８の変異原プライマー■Ｇ＾＾ＴＴ（：　ＴＣＴ
　７匹−Ｃ＾Ｇ　Ｔ（：Ｇ　ＣＴＧ　Ｔ５′ 変異したコード鎖　・・・ＣＴＴ＾＾ＣＡＧＡυＣ（：
ＴＣＡＣＣＧ＾Ｃ＾１本鎖ｐ８＾−７−ＭＯ２１及び変
異原プライマーＩＶを用いてＦＡ２の方法を反復する。
フィルターの洗浄温度は室温、５０℃、６０℃及び６８
℃である。６８℃洗浄が陽性クローンを同定する。プラ
ーク精製後のこのような陽性クローンの１つをｐ８八−
７−８０４２１と称する。このクローンのＤＮＡをシー
ケンシングブライマー■、■及び■を用いて配列分析に
かけ、グリコジル化部位１１７．１８４及び４４８にお
ける変異を確認する（第２図を参照のこと）。ＤＮＡ上
の３個の変異により、生ずる変異ｔ−ＰＡ分子は位置１
１９．１８６及び４５０に３個のアミノ酸交換を有する
（〔八ｓ　ｎ　Ｉ　１　％、＾１ａ１　＠＠、＾ｓｎ４
５０）−ｔ−ＰＡ）、この変異体においては、Ｔｈｒ”
’をＡｓｎで置き換えることにより第４部位に新たなグ
リコジル化部位が形成されている。
コ−＋”　’ｉｎ　　　　　　　　　　　　−−・ＴＣ
Ａ　　ＣＡＡ　　ＣＡＴ　　ＴＴ八　ｅｒｒ　　ＡＡＣ
ＡＧＡ　　ＡＧＡ　　（：ＴｂＡｃｅ　　ＧＡＣ− ３′５′ 変異［７’？（ｖ−ＬＩ　　　　　　　　　　　Ｍ　Ｔ
Ｍ：　ＴＣＴ　ＣＧＴ　ＣＡＧＴ（：Ｃ５′３′ 変ｎし；’：コート’鎖　、、、ＴＣＡ　ＣＡＡ　ＣＡ
Ｔ　ＴｒＡ　ＣＴｒ　ＡＡＣＡＧＡ　（：ＣＡ　ＧＴＣ
ＡＣＣＧＡＣ・・・１本鎖ｐ８＾−７−Ｍ０２１及び変
異原ブライマー■−■を用いて例２の方法を反復する。
フィルターの洗浄温度は６ＸＳＳＣ中室温、５０℃、及
び６゜℃である。プラーク精製の後、陽性クローンの１
つを単離しそしてｐ８＾−７−Ｍ０４２１（１）と称す
る。このクローンからのＤＮＡをシーケンシングブライ
マー１．Ｕ及び■を用いて配列決定し、グリコジル化部
位１１７．１８４及び４４８における変異を確認する（
第２図を参照のこと）。ＤＮＡ上での３個の変異により
、生ずる変異ｔ−ＰＡ分子は位置１１９．１８６及び４
５０に３個のアミノ酸交換を有する（（八５０１１９゜
＾１ａ＋ｓｉ、＾Ｉａ”’）　−ｔ−ＰＡ）。
５′３′ コード鎖　　　　　　　　・・−Ｇ＾＾ＣＣＣＣＡＧＴ
　ＧＣＣＣＡＧ　Ｇ・・・３′５′ 変異原ブライマーＩＩＩ　　　ＣＴＴに　Ｇにに　ＴＴ
ＡＣＣに　にＴＣＣ５′３′ 変異したコード鎖　　　・・・Ｇ＾＾ＣＣＣＣ＾＾Ｔ　
ＧＣＣＣＡＣＧ・・・１本領ｐ８＾−７−Ｍ０４２１（
１）及び変異原ブライマー■を用いて例２の方法を反復
する。フィルターの洗浄温度は室温、５０℃及び６０℃
である。６０℃での洗浄が陽性クローンを同定する。プ
ラーク精製の後、陽性クローンの１つを単離しそしてｐ
８＾−７−Ｍ０４３２１　（１）と称する。このクロー
ンのＤＮＡを、シーケンシングプライマー■〜■を用い
て配列決定する。グリコジル化部位１１７．１８４．２
１８及び４４８における変異を確認する（第２図を参照
のこと）。ＤＮＡ上の４個の変異が位置１１９．１８６
．２２０及び４５０における４個のアミノ酸交換を有す
る変異ｔ−１’八分子を導く（〔＾５１１１！、＾１ａ
＋ａｌ＋。
＾ｓ、、２２０　　、　＾１　ａ４５　°）　　−ｔ−
ｐ　＾）。
［８，ｐＪＤＢ　２０７への変異ｔ−ＰＡ遺伝子挿入部
のクローニング ａ）　　ＲＦ−ＤＮＡの調製 迅速ＤＮＡ単離法（Ｄ、Ｓ、ＩＩｏｌｍｅｓ及びＭ、Ｑ
ｕｉｇｌｅｙ。
＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ、　１１４，１９３−１９
７（１９８１））によりｐ８＾−７−ＭｏＩ、ｐ８＾−
７−８０２、ｐ８＾−７−ＭＯ２１、ｐ８＾−７−８０
４２１、ｐ８＾−７−８０４２１（１）及びｐ８八−７
−８０４３２１（１）についてＲＦ−ＤＮＡを調製する
。
ｂ）　挿入部の単離 ６種類（７）ＲＦ−ＤＮＡを１６　Ｕ　ノＢａｎＨＩ及
び２０Ｕの旧ｎｄｌ［［により５０μｌの１０　ｓＭ　
Ｔｒｉｓ−１１ｃ１（ｐＨ７，６）　。
６ｍＭ　ＭｇＣ１’２．１０Ｏｎ＋Ｍ　ＮａＣ１，６ｍ
Ｎメルカプトエタノールにより３７℃にて１時間消化す
る。２μｌのＲＮアーゼ（セルバ、１　ｍｇ１社）を加
えそして３７℃にて５分間インキュベートした後、２．
３Ｋｂ挿入部を０．８％分収用アガロースゲル上で単離
する。
ＤＮＡを電気溶出により抽出し、そして沈澱せしめた後
５μｌのＴＥ中に溶解する＜４６．８ｒｍｏｌ／　１１
１＞。
ｃ）　　３μｇのｐＪＤＢ　２０７をＢａｍ１ｌ　Ｉ及
び旧ｎｄ［［で切断し、そして６．６Ｋｂベクターを単
離する。電気溶出及び沈澱の後、ＤＮＡを２０Ｊｉｌの
ＴＥ中に再溶解する（３５　ｆ＋＊ｏｌ／　μｊり。
ｄ）　　１４０ｆｍｏｌのｐＪＤＢ　２０７　［１ａｍ
ｌｌ　Ｉ　　ｌ１ｉｎｄｌ切断ベクター、及び２３４ｆ
ＩＩ＋ｏｌのＢａｌ１１１　Ｉ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ変異
ｔ−ＰＡ挿入部を２０μｌの５０　ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ・
１ｌＣ１（ｐｌｒ７．５）　、　１０＋ａＭ　ＨｇＣｌ
２．１０　ｍＭ　ＤＴＴ、　２−＾ＴＰ、ｔμｇゼ゛ラ
チン中で４００ＵのＴ４　ＤＮ＾リガーゼを用いて１５
℃にて１６時間連続する。６５℃にて１０分間インキュ
ベートすることにより反応を停止する。２μ！及び５μ
ｌのこれらの連結混合物を用いてＥ、コリＨＢＩＯＩ　
Ｃａ”＋　細胞を形質転換する（　Ｎ、Ｄａｇｅｒｔ及
びＳ、Ｄ、Ｅｈｒｌｉｃｈ、Ｇｅｎｅ凱２３−２８（１
９７９）　）　、　６個の連結混合物のそれぞれから６
Ｈのａｍｐ’コロニーを拾う、迅速単離法によりＤＮＡ
を調製する。ＢａｍＨＩ−ｔｌｉｎｄｌ［Ｉ及びＰｓｔ
ｌによるＤＮＡ分析において正しいサイズのバンドが観
察される。６個の連結のそれぞれからの１つのクローン
を１００μｇ／ｌａ１のアンピシリンを含有するＬＢ培
地１００ｍ１中に増殖せしめる。ｐ８＾−７−Ｍｏｌ、
ｐ８八−７−８０２、ｐ８＾−７−Ｍ０２１、ｐ８＾−
７−８０４２１、ｐ８＾−７−８０４２１（１）、及び
ｐ８＾由来のプラスミドＤＮＡを単離し、そしてｐＪＤ
Ｂ２０７／Ｐ１１０５−ＴＰＡ１８−Ｍｏｌ、ｐＪＤ［
１２０７／則競−ＴＰＡ１８−８０２、　ｐＪＤＢ２０
）／３Ｗ９艷−ＴＰＡ１８−８０２１、　ｐＪＤＢ２０
７／片１９艷−ＴＰＡ１８−Ｍ０４２１、　ｐＪＤＢ２
０フ／片１９艷−ＴＰＡ１８−８０４２１（１）、　及
びｐＪＤＢ２０フ／片１９艷−ＴＰＡ１８−Ｍ０４３２
１（１）８称す６・　　　　　　　　　　　　以下全白
ｌ　　ＰＨ０５プロモーター　インベルターゼシグナル
配列のオリゴデオキシリボヌクレオチドＩ−１、Ｉ−２
、！−３、及びＩ−４をＤＮＡ合成機（モデル３８０Ｂ
アブライドビオシステムス）により合成する。脱ブロッ
クの後、合成断片を８Ｍ尿素を含有する１２％ポリアク
リルアミドゲル上で精製する。　Ｓｅｐ、Ｐａｋ　（ウ
ォーターズ社）を用いて塩を含有しない純粋なオリゴデ
オキシリボヌクレオチドを得る。これらの断片は、高頻
度で使用される酵母コドンを有するインベルターゼシグ
ナル配列をコードするデュプレックスを構成する。
ＥｃｏＲＩ　　　　　　　ｌｌ１ｎｄｌ［［ＭｅｔＬｅ
ｕＬｅｕｌｌ：１ｎＡｌａｌ’ｂｃＬｅｕｌ’ｌ＋ｅＬ
ｅｕＬｅｕ１−１　　５’＾＾ＴＴＣＡＴＧＣＴＴＴＴ
ＧＣ＾八ＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴ　　３’
１−２　　　　　　３’ＧＴＡＣ（：＾＾＾＾ＣＧＴＴ
ＣＧ＾＾＾ＣＣ八＾八ΔＣＧ＾＾＾＾ＣＣＧＡへ　へ５
’以下余白 ＾１　ａＧ　Ｉ　ｙＰＩ＋ｅ＾１ａ＾ＩａＬｙｓｌｌｅ
Ｓｅｒ＾１ａ１−３　５’にＧＣＴＧ（：ＴＴＴＴにＣ
ΔＣＣＣ＾＾ΔΔＴＡＴＣＴにＣＡＴＣＴＴＡＧＣＧＴ
Ｃ３’１−４　　　　　３’Ｃ＾＾＾＾ＣＧＴＣＧＧＴ
ＴＴＴＡＴＡにＡＣにＴＡに＾＾ＴＣＧＣＡｔｌ；ＡＧ
ＣＴＨｇａ上−一 ｈｏ　１ １．５μビのｐ３１Ｒ／５Ｓ−ＴＰＡΔ２（ヨーロッパ
特許出願Ｎｏ、１４３，０８１を参照のこと）をＩＯＵ
のＥｃｏＲｌ　（ベーリンガー）により５０ｔｔｌの１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＩＩＣ／（ｐＨ７、５）　、　６１
１１８　ＭｇＣｌ２　、１０（ｌａＭ　ＮａＣ１、６＋
ａＭメルカプトエタノール中で３７℃にて１時間消化す
る。１１ｔｌの２．２　Ｍ　ＮａＣ１を加えた後、ＩＯ
ＵのＸｈｏｌ（ベーリンガー）を加え、そして３７℃に
て１時間インキュベートする。４．２Ｋｂベクターを０
．８％分収用アガロースゲル上で単離する。ゲルスライ
スをＭｉｃｒｏ　Ｃｏｌ　１ｏｉｄｏｎチユーブ（サル
トリウムＧｍｂｌｌ）に移し、２００μｌのＴＥ″Ｃ′
覆い、そして電気溶出する（００ｎ＋八にて５０分間電
気泳動する）。ＴＥ溶液を集め、０．１容量のｌ０ＸＴ
ＮＦを添加した後、２．５容量の無水エタノール中で沈
澱せしめる。
ＤＮＡペレットを冷８０％エタノールで洗浄し、５′そ
して真空乾燥する。ＤＮＡを６μＩＴＥ中に再懸濁する
（４０　ｐｍｏｌ／　μｊり。
１０μＺの０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｆｌＣｌ（ｐＨ８）中
に４種類゛のデオキシリボヌクレオチドを１０μｍｏｌ
ずつ含有する溶液を９５℃にて５分間水浴上でインキュ
ベートする。水浴を５時間にわたってゆっくり３０℃に
冷却する。このアリール混合物に２μ！ずつの０．１Ｍ
　ＭｇＣｊ！２，０．１Ｍ　ＮａＣｊ！、　３０ｍＭ　
ＤＴＴ。
４ｍＮＡＴＰ及び８Ｕ（１μｍ）のポリヌクレオチドキ
ナーゼ（ベーリンガー）を加える。３７℃にて１時間キ
ナーゼ反応を行う。アニールされキナーゼ処理されたオ
リゴデオキシリボヌクレオチド及び６０ｐｍｏｌのｐＲ
３１／５Ｓ−ＴＰＡΔ２　ＥｃｏＲＩ　　Ｘｂｏｌ切断
ベクター（１６５μｌ）を、４００Ｕ（１μりの７４　
ＤＮＡリガーゼ（ビオラプス）を用いて１４℃にて１７
時間連結する。６５℃にて１０分間インキュベートする
ことにより反応を停止せしめる。１０μｌのこの連結混
合物を使用してＥ６コリＨＢ１０１Ｃａ＋″）細胞を形
質転換する（　Ｎ、Ｄａｇｅｒｔ及びＳ、Ｄ、Ｅｈｒｌ
ｉｃｈ。
旺肱、四−，２３−２８（１９〕９）’１．２０個のａ
ｍｐ”コロニーを拾う、迅速単離法によりＤＮＡを調製
するＣ　Ｄ、Ｓ、ｌＩｏｌｍｅｓ及びＭ、Ｑｕｉｇｌｅ
ｙ　、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ、１１４゜１９３−
１９７（１９８１）　）　、　Ｄ　Ｎ　ＡをＥｃｏＲＩ
及びＸｈｏ（により消化し、ＥｃｏＲｌ末端において放
射性ラベルし、そしてマーカーとして放射性ラベルされ
たｐＢＲ３２２Ｈａｅ［［切断ＤＮＡを用いて、８Ｍ尿
素を含有する６％ポリアクリルアミドゲル上で分析する
。２０個のクローンすべてから得られたＤＮＡについて
正しいサイズのバンドが観察される。１つのクローンを
１００μｇ／ｌａｎのアンピシリンを含有するＬＢ培地
ＩＱＱｍＺ中で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを単離
し、そしてｐ３１ＢＩＴ−１２と称する。
３μｇのｐＪＤｔｌ　２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８（
ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、１４３，０８１）を３７℃に
て１時間１０ＵのＢａｍ１ｌ　Ｉと共に５０．ｕｉ’の
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）。
６　ｍＭ　ＨｇＣ１ｔ　、　１００ｍＭ　ＮａＣ１，６
＋＊Ｍメルカプトエタノール中でインキュベートする。
アリコートをＴＢＥ緩衝液中１％アガロースゲル上でチ
ェックし完全な消化を確認する。消化物を６５℃にて１
０分間インキュベートする０次に、０，５μｌの５ＭＮ
ａＣｆを加え、そして次に１５ＵのＸｈｏｌ（ベーリン
ガー）を加える。これを３７℃にて１時間インキュベー
トする。６．８にｂのベクターを０．８％分収用アガロ
ースゲル上で単離する。ＤＮＡを電気溶出により抽出し
、そして沈澱せしめた後ＴＥ中に溶解する。
ｂ）　　３１　　ＰＩ＋０５−ＴＰＡ１８のＸｈｏｌ消
イ３０μｇのｐ３１／ＰＩＩ０５−ＴＰＡ１８（ヨーロ
ッパ特許出願Ｎｏ、１４３，０８１　）を３７℃にて１
時間６０ＵのＸｈ。
１　（１５Ｕ／＋＋＋ｆ）と共に２００μｍの１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）　、　６ｍＭ　ＨｇＣ１
ｚ　、　１５０＋＊Ｍ　ＮａＣ１、６ｍＮメルカプトエ
タノール中でインキュベートし、同容量のフェノール／
クロロホルムで抽出し、そしてエタン−ル中で沈澱せし
める。
前記沈澱しなＸｈｏｌ切断ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ１
８　ＤＮＡを２５０μｆの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ｌＩ
Ｃ１’（ｐＨ７、５）　、　６　ｍＭ　ＨｇＣ１ｚ　。
５０ｍＭ　Ｍａｃｌ、　６躊Ｍメルカプトエタノール、
５Ｂ臭化エチジウム中に再懸濁し、２２．５ＵのＰｓｔ
ｌと共に３７℃にて３５分間インキュベートし、そして
同容量のフェノールで抽出し、次に同容量のクロロホル
ム−インナミルアルコール（５０：１）で抽出する。１
．６にｂ断片を１％分収用アガロースゲル上で単離する
。ＤＮＡを電気溶出により抽出し、そして沈澱せしめる
〔挿入部１〕。
ｄ）　　ｐ３１ＲＩＴ−１２のＳａｌ　Ｉ　−Ｘｌｔｏ
　ｌ消化３０ｇ（７）　ｐ３１ＢＩＴ−１２を３７℃に
て１時間６０ＵのＳａｌ　Ｉ　（ベーリンガ−１２Ｕ／
μｉ’）及び６０ＵのＸｈｏｌ（１５Ｕ／ｕｌ）と共に
２００μｌ’の１０ｍＭＴｒｉｓ・ｔｌＣｊ’（ｐＨ８
）　、　６　ａ＋Ｍ　ｓｇｃｚ、　、　１５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１，６ｍＭメルカプトエタノール中にてインキュベ
ートし、同量のフェノール−クロロホルムにより抽出し
そしてエタノール中で沈澱せしめる。　８６９ｂｐ断片
を１．２％の分収用アガロースゲル上で単離する。
ＤＮＡを電気溶出により抽出し、ＤＥ　−５２上で脱塩
し、そしてエタノール中で沈澱せしめる。
ｅ）　　Ｓａｌ　　−Ｘｈｏ　　　　３１Ｒ［Ｔ−１２
のＨＬＩＩ゛Ｓａｔ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ切断ｐ３１ＲＩ
Ｔ−１２を１００μ／の６ｍＭＴｒｉｓ・１１Ｃｉ’（
ｐＨ７，５）　、　１０ｍＭ　ＮＢＣｊ！ｚ　、　５０
＋ａＭ　ＮａＣ１’。
１ｍＭジチオスレイトール、ｌｏｎｇウシ血清アルブミ
ン中に再懸濁し、そして３７℃にて１時間６ＵのＨｇａ
ｌ（ビオラプス、０．５Ｕ／μＦ）と共にインキュベー
トする。　　６００ｂｐ断片を１．５％アガロース上で
単離する。ＤＮＡを電気溶出により抽出し、そしてエタ
ノール中で沈澱せしめる。
ｆ）　　１ン　−　１ゴ　フレ　　ドの７１−Ｉン次の
配列： ｓｔ　１ ５’　　ＣＴ（：ＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＣＴＣＡＴＣ
ＴＧＣ八　３′３′＾Ｇ＾＾ＴＧＧＴＴＣＡＣＴＡＣ５
’を有する９０１）Ｍｏｌの２種類のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドを、シリコン処理されたエッペンドルフ
チ、−ブ中１０μｌの０．５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８）中に懸濁する。溶液を９５℃にて５分間イン
キュベートし、そして次に徐々に室温まで一夜冷却する
。
ｇ）　　１ン　−の　　−ゼ几 上記の溶液に２μｌの０．１ＭＫＣｌ、２μｌの０゜Ｉ
ＭＨｇＣｂ、３μｌの３０ｍＭ　ＤＴＴ　、　１μｌの
２００論Ｎ　ＡＴＰ。
及び８Ｕのポリヌクレオチドキナーゼ（８Ｕ／μｌ）を
添加する。これを３７℃にて１時間インキュベートする
。
キナーゼ処理されたリンカ−溶液を乾燥Ｈｇａ断片を収
容するチューブに移し、そして次に４００ＵのＴ４ＤＮ
＾リガーゼを加える。この溶液を室温（２１℃〜２２℃
）にて９０分間インキュベートし、ＴＥにより１００μ
ｌに稀釈し、そして同容量のフェノール−クロロホルム
により抽出する。室温にてこの水溶液に０．６容量のイ
ソプロパツール及び０゜１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを
添加することにより断片を沈澱せしめる。
ｉ）　１言のｌａｍＨｌ　−Ｐｓｔ　ｌ消上記の乾燥Ｄ
ＮＡをＩＯＵのＢａａ＋ＨＩ及びＩＯＵのＰｓｔ　ｌに
より２０ｕｌの１０ｓＭ　Ｔｒｉｓ・１Ｉｃ１（ｐＨ）
、５）。
１００　ｓＭ　ＨｇＣ１ｔ　、　６ｍＭメルカプトエタ
ノール中で３７℃にて１時間消化する。１００μｌに稀
釈した後、溶液を同容量のフェノール−クロロホルムで
抽出し、そして水性相をイソプロパツール中で沈澱せし
める（挿入部２）。
ｊ）ｌ１皮へ１縫 １００１００ｐのｐＪＤｌｌ　２０７／Ｐ）１０５−Ｔ
ＰＡ１８　Ｂａｗｌ　Ｉ＝Ｘｈｏｌ切断ベクター断片、
及び２００ｐｍｏ　Ｉずつの池の２種類の挿入断片（１
及び２）を１０μｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
７，５）　、　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｔｍＨＤＴ
Ｔ。
２ａ＊ＭＡＴＰ、０．５μｇゼラチン中で４００Ｕの丁
４　ＤＮ＾リガーゼにより１５℃にて１６時間連結する
。６５℃にて１０分間のインキュベーションにより反応
を停止する。５μｌのこの連結混合物を用いてＥ。
コリＨＢ１０１Ｃａ”＋ｆａｌ胞を形質転換する。１０
個のａｍｐ’″コロニーを拾い、そして迅速単離法によ
りＤＮＡを調製する。　ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ、及びＢ
ａｍＨｌ　−ＨｌｎｃｌＩ［［による分析の際、正しい
サイズの断片が観察される。１つのクローンを１００μ
ｇ／ｌａｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地１００ｍ
Ｎ中で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを単離し、そし
てｐＪ［ｌＢ　２０）／ＰＩ＋０５−１−丁ＰＡと称す
る。
プラスミドｐＪＤＢ　２０７のＢａ５ＨＩ　−Ｈｌｎｄ
Ｉ［［ベクター断片を、ｐＪＤＢ　２０）／ＰＩＩ０５
−１−ＴＰＡ又はｐＪＤＢ　２０７／Ｐ１１０５−ＴＰ
Ａ１８から得られたＢａｍ１ｌ　Ｉ　−Ｓｅａ　ｌ断片
、及びｐＪＤＢ　２０７／Ｐ１１０５−Ｔｒ’＾１８−
８０４２１（１）から得られた５ｃａｌ−旧ｎｄｌ［ｌ
断片と連結する。
ａ）ベクターの調製 ３μｇのｐＪＤ［ｌ　２０７をＢａｍ１ｌｌ及び旧ｎｄ
ｌｌ［で切断し、そして６．６Ｋｂベクターを単離する
。電気溶出の後、ＤＮＡをエタノール中で沈澱せしめる
。
ｂ）　　ｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５ＴＰＡ１８−８０
４２１（１）のＳｃａ　１−Ｉｌｉｎｄｌｌｌｌｌ ｎｄｌμｇのプラスミドＤＮＡを７Ｕの５ｃａｌ（ベー
リンガー）及び６Ｕのｌｌ１ｎｄｌ［［により２０μｌ
の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１’（ｐＨ７，５）　、　
６ｍＭ　ＭｇＣ４’ｚ　、　５０ＭＮＮａＣ１、６輸Ｈ
メルカプトエタノール１時間消化する。フェノール処理
及びエタノール中での沈澱の後、９８フｂｐ断片を１．
２％分収用アガロースゲル上で単離する（挿入部１）。
ｃ）　　ｐＪＤＢ　２０７／ｐＨ０５　　ＴＰＡ１８及
びｐＪＤ［１　２０７／ｌ”１１０５−ｌ−ＴＰＡのＢ
ａｍＨ　Ｉ　−Ｓｃａ　ｌ消化１、５μｇの２種類のプ
ラスミドＤＮＡを７ＵのＢａｍＨ　Ｉ及び７ＵのＳｃａ
ｌにより２０μｌの１０＋ｎＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ（
ｐＨ７．　５　）　、　６　＋＊Ｈ　ｔ４Ｂｃ１２，　
６　＋＊Ｍメルカプトエタノール中で３７℃にて１時間
消１ヒする。フェノール処理及びエタノール中での沈澱
の７ｉ，１３００ｂｐ断片を１．２％分収用アガロース
ゲル上で単離するφ　　　　　　　　　　　　　　　以
下余白ｄ）　　３断片の連結 １００１００ｐのｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ
１８　Ｂａ５ｉｎ　Ｉ　−’　　１ｌｉｎｄ■切断ベク
タ一断片、及び２００ｐｍｏ　ｌずつの他の２種類の挿
入断片〔１及び２〕を１０μｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）　、　１０ｓ＋Ｍ　ＨｇＣ１ｔ
　、　１０輸Ｍ　ＤＴＴ　、　２−＾ＴＰ、０．５μｇ
ゼラチン中で４００ＵのＴ４　ＤＮ＾リガーゼにより１
５℃にて１６時間連結する。６５℃にて１０分間のイン
キュベーションにより反応を停止する。
５μｌのこの連結混合物を使用してＥ、コリＨＩ３１０
１Ｃａ”！胞を形質転換する。１０個のａｍｐ”コロニ
ーを拾い、そして迅速単離法によりＤＮＡを調製する。
ＥｃｏＲＩ　、Ｐｓｔ　Ｉ　、及びＢａｍ１ｌ　Ｉ　−
１１ｉｎｄ　ＩＩによる分析の際、正しいサイズの断片
が観察される。２つの造成のそれぞれからの１つのクロ
ーンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ
培地１００ｍ１中で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを
単離し、そしてｐＪＤＢ　２０７／則咀−ＴＰＡ１８−
８０４及びｐＪＤＢ　２０７／租蜆−１−ＴＰＡ−８０
４と称する。
以下余白 爵月工ＰＩ（０５ブロモ−−インベル　−ゼシプラスミ
ドｐＪＤ８２０７からのＢａＩＩＩＩ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ
ｌ［［ベクター断片を、ｐＪＤＢ　２０７／ＰＩＩ０５
−１−ＴＰＡからのＢａｍＨＩ　　Ｎａｒ　Ｉ断片及び
変異ｔ−ＰＡ遺伝子からのＮａｒ　Ｉ　−Ｈｌｎｄｌｌ
［断片と連結する。
ａ）ＲＦＤＮ＾の調製 ｐ８＾−７−８０１、ｐ８＾−７−８０２、ｐ８＾−７
−８０２１、ｐ８＾−７−８０４２１、ｐ８＾−７−８
０４２１（１）、及びｐ８＾−７−８０４３２１（１）
についてＲＦ−ＤＮＡを調製する。
ｂ）　変異ｔ−ＰＡ遺伝子からのＮａｒ　Ｉ　−Ｈｌｎ
ｄｌＩ［挿入部の単離 ６種類のＲＦ　−ＤＮＡ（ｌμｇ）をそれぞれ６ＵのＮ
ａｒＩ（ビオラプス）により２０ｕｌの１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓｉｌＣｌ（ｐＨ７，５）　、　６鍋Ｎ　ＨｇＣｂ　
、　６ｍＭメルカプトエタノール中で３７℃にて１時間
消化する。消化物を６５℃にて１０分間インキュベート
し、次に１μｌのＩＭＮａＣｌを加え、これに続いて６
Ｕの旧ｎｄ［［Ｉを加える。３７℃にて１時間のインキ
ュベーションの後、ＲＮアーゼ（２μＮ、０．５μｇ／
μｍ）を加える。３７°Ｃにて１５分間置きそしてフェ
ノール処理した後、ＤＮＡをエタノール中で沈澱せしめ
る。
１４５０ｂｐのＤＮＡ断片を１゜２％分収用アガロース
ゲル上で単離する。ＤＮＡを電気溶出により抽出し、そ
してエタノール中で沈澱せしめる（挿入部１）。
ｃ）　　Ｂａｎ＋ｌＩ　Ｉ　−Ｎａｒ　Ｉ挿入部の単離
３ｕｇのｐＪＤＩＩ　２０フ、／ＰＩＩ０５−１−ＴＰ
Ａを６０のＮａｒＩにより２０ｕｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、　
６ｍＭメルカプトエタノール中で３７℃にて１時間消化
する。次に、２μｌのＩＭＮａＣｌを添加し、そして６
ＵのＢａｍ１ｌ　Ｉを添加する。３７℃にて１時間のイ
ンキュベーション及びフェノール処理の後、ＤＮＡをエ
タノール中で沈澱せしめる。
９３０　ｂ　Ｉ）のＤＮＡ断片を１．２％分収用アガロ
ースゲル上で単離する。ＤＮＡ″！：電気溶出により抽
出し、そしてエタノール中で沈澱せしめる（挿入部２）
。
ｄ）　ベクターの調製 ３μｇのｐＪＤＢ　２０７をＢａＩＩＩＩ　Ｉ及びｌ１
ｉｎｄｌで切断し、そして６．６Ｋｂベクターを単離す
る。電気溶出の後、ＤＮＡをエタノール中で沈澱せしめ
る。
ｅ）　　３断片の連結 １００１００ｐのｐＪＤＢ　２０７／Ｐ１１０５−ＴＰ
Ａ１８　Ｂａ＋Ｊ　Ｉ　−旧ｎｄｌ［切断ベクター断片
、及び２００ｐｍｏ１ずつの他の２種類の挿入断片（１
及び２）を１０μｌの５０ＭＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７，５）　、　１０ｍＭ　ＨｇＣｌ２．１０＋＋ＭＤ
ＴＴ、２ｍＭ＾ＴＰ０．５μｇゼラチン中で４００　Ｕ
のＴ４　ＤＮ＾リガーゼにより１５℃にて１６時間連結
する。
６５℃にて１０分間のインキュベーションにより反応を
停止する。５μｌのこの連結混合物を使用してＥ、コリ
ＨＢ　ｌ０ＩＣａ”！胞を形質転換する。
１０個のａｍｐ’″コロニーを拾い、そして迅速単離法
によりＤＮＡを調製する。ＥｃｏＲＩ　、　Ｐｓｔ　Ｉ
　、及びＢａｍＨＩ−旧ｎｄｌＩＩを用いる分析の際、
正しいサイズの断片が観察される。６種類の造成のそれ
ぞれからの１つずつのクローンを１００μｇ／ｍ（ｌの
アンピシリンを含有するＬＢ培地１００＋ａＺ中で増殖
せしめる。
プラスミドＤＮＡを単離し、これらを ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＴＰ八−Ｍｏｌ、ｐ
ＪＤ［１２０７／ＰＨ０５−１−ＴＰＡ−８０２、ｐＪ
ＤＢ２０７／ＰＨ０５１−ＴＰＡ−８０２１、ｐＪＤ［
１２０７／　ＰＨ０５１ＴＰＡ−８０４２１、ｐＪＤＢ
２０７／Ｉ’１１０５−　Ｉ−ＴＰＡ−８０４２１（１
）、及びｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−１−ＴＰＡ−８０
４３２１（１）と称する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／■東−ＴＰＡｌＢ−ＮＯＩ
、ｐＪＤロ２０７／Ｐ１１０５−　ＴＰＡｌＢ−８０２
、ｐＪＤ８２０７／則性−ＴＰＡｌＢ　−８０４、ｐＪ
Ｄ［Ｉ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡｌＢ−８０２１、ｐＪ
ＤＢ２０７／　Ｐ！１０５−　ＴＰＡｌＢ　−８０４２
１、ｐＪＤＢ／ＰＨ０５−ＴＰＡｌＢ−４２１（１）、
ｐＪＤＢ２０７／則咀−ＴＰＡｌＢ−Ｈ０４３２１（１
）、ｐＪＤロ２０フ／１川騙Σ−１−ＴＰＡ−Ｈｏｔ、
ρＪＤＢ２０７／租鮫−１−ＴＰＡ−阿０２．１）ＪＤ
Ｂ２０７／眺咀−Ｉ−ＴＰＡ−ＭＯ４、ρＪＤＢ２０７
／ＰＩ＋０５−１−ＴＰＡ−Ｈ０２１、ｐＪＤＢ２０７
／眺蜆−１−ＴＰＡ−ＭＯ４２ＬｐＪＤＢ２０７／則咀
−１−ＴＰＡ−ＭＯ４２１（１）及びｐＪＤＢ２０７／
則鮫−１−ＴＰＡ−８０４３２１（１）のそれぞれをサ
ツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８（ａ、　ｈｉｓ
　３−１１．ｂｉｓ　３−１５．　ｌｅｕ　２−３　、
　ｌｅｕ２　二１１２　、　ｃａｎ”　）に、旧’ｎｎ
ｅｎ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７５　、１９２９（１９〕８）〕に
より記載されている形質転換法により形倉転換する。５
μｇずつのプラスミドＤＮＡを１００μ！のスフェロプ
ラスト懸濁液に加え、そして混合物をポリエチレングリ
コールで処理する。スフェロプラストを１０ｍ１の再生
寒天と混合し、そしてロイシンを含有しない酵母最少培
地プレート上にプレートする。３０”Ｃにて約３日間の
インキュベーションの後、約２００個の形質転換体が得
られ乞。
それぞれの酵母形質転換からの１藺ずつのコロニーを拾
う、異るコロニーを次ぎの様に称する。
以下余白 サツカロミセス・セレビシェ−（：ＲＦ１８／ｐＪＤＢ
２０７／匣享−ＴＰＡｌＢ−８０１サツカロミセス・セ
レビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０）／理毀−ＴＰＡ
１８−ＭＯ２サツカロミセス・セレビシェ−（：ＲＦ１
８／ｐＪＤＢ２０）／印西−ＴＰＡ１８−Ｍ例サツカロ
ミセス・セレビシェ−（：ＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／
Ｐ１１郭−ＴＰＡｌＢ−８０２１サツカロミセス・セレ
ビシェ−（：ＲＦ１８／ｐＪＤＩ３２０７／匹姫−ＴＰ
ＡｌＢ　−ＭＯ４２１サツカロミセス・セレビシェ−（
：ＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０］／叩委−ＴＰＡｌＢ−８０
４２１（１）サツｌＪロミセスーセレヒシエ−ＧＲＦ１
８／ｐＪＤ０２０７／ｌ’１１０５−ＴＰＡｌＢ　−Ｍ
Ｏ４３２［１）サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１
Ｂ／ｐＪＤＢ２０フ／叩西−１−ＴＰＡ−８０１サツカ
ロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤ［１２０）
／叩西−ｆ　−ＴＰＡ−闇２サツカロミセス・セレビシ
ェ−（：ＲＦ１８／ｐＪＤ［１２０７／理饅−１−ＴＰ
Ａ−（資）４サツカロミセス・セレビシェ−ＣＲＦ１８
／ｐＪＤＢ２０フ／理毀−）　−Ｔｒ’＾−ＭＯ２１サ
ツカロミセス・セレビシェ−にＲＦ１８／Ｉ）ＪＤ［＋
２０）／則巨−１−ＴＩ’＾−ＭＯ４２１サツカロミセ
ス・セレビシェ−にＲＦ１８／９ＪＤＢ２０７／叩毀−
Ｉ　−ＴＰＡ−闇４２１（１）サツカロミセス・セレビ
シェ−ＧＲＦ１Ｂ／ｐＪＤＢ２０フ／匹西−Ｉ　−ＴＰ
Ａ−Ｈ０４３２１（１）プロテアーゼＢ活性を欠く変異
株Ｓ、セレビシェーＨＴ２３２株（Ｄ、Ｉｌ、Ｈｏ１ｆ
等、　Ｇ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ及び１！。
１１ｏ１ｚｅｒ＃ｉｉ　、　Ｌｉｍ１ｔｅｄ　Ｐｒｏｔ
ｅｏｌ　ｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｏｒ　ａｎｉ−リ且
、コンフェレンス　レポート、ベセスダ１９７８゜６１
頁〕及びＳ、セレビシェ−Ｈ４２３（ヨーロッパ特許比
！１ｉＮｏ、１４３，０８１）の戻し交雑（ｂａｃｋｃ
ｒｏｓ−ｓｉ＋ｔｇ）の反復（こよりＳ、セレビシＸ　
−ＨＴ　２４６株ヲ得る。
Ｓ、セレビシェ−ＨＴ２４６を、プラスミドｐＪＤＢ２
０７／　ＰＨ０５−ＴＰＡｌＢ−Ｍｏｌ、ｐＪＤ８２０
７／ＰＩＩ０５づＰＡ１８−ＭＯ２、ｐＪＤＢ２０７／
ＰＨ０５−ＴＰＡｌＢ−８０４，ｐＪＤ［Ｉ２０７．／
ＰＨ０５−ＴＰＡｌＢ−ＭＯ２１％ｐＪＤＢ２０７／Ｐ
Ｈ０５−ＴＰＡｌＢ−８０４２１、ｐＪＤＢ／ＰＨ０５
−ＴＰＡｌＢ　　４２１（１＞、ｐＪＤＢ２０７／ＰＩ
Ｉ０５　　ＴＰＡｌＢ−８０４３２１（１）−ｐＪＤｌ
］２０７／ＰＩＩ０５−　１　−ＴＰＡ−Ｍｏｌ、ｐＪ
ＤＢ２０７／胆０５−１−ＴＩ’Ａ−Ｈ０２、ｐＪＤＢ
２０７／Ｐ１１０５−Ｉ−ＴＰＡ−８０４、ｐＪＤ１１
２０７／ＰＩ＋０５−Ｉ　−ＴＰＡ−８０２１、ｐＪＤ
Ｂ２０フ／ＰＨ０５１Ｔｒ”Ａ−Ｈ０４２１，ｐＪＤ［
１２０７／ｆ’１１０５−１−ＴＰＡ−８０４２１（１
）　ＪびｐＪＤＢ２０７／ＰＩ１０５−１−ＴＰＡ−Ｈ
０４３２１（１）により、１ｌｉｎｎｅｎ等（前掲）の
形質転換法を用い、ロイシン原栄養性について選択しな
がら形質転換する（ｆＭ１２を、参照のこと）。１つず
つのクローンを拾い、そして次のように称する。
艷！、下金白 サツカロミセス・セレビシＸ−ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２
０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８−８０１サツカロミセス・
セレビシェ−ＩＩＴ２４６／ｐＪＤＢ２０７／理西−Ｔ
ＰＡ１８−陳ワサツカロミセス・セレビシェ−＋１Ｔ２
４６／ｐＪＤ［１２０７／皿毀−ＴＰＡ１８−ＭＯ４サ
ツカロミセス・セレビシェ−１ＩＴ２４６／ｐＪＤＢ２
０７／皿饅−ＴＴ’＾１８−園２１サツカロミセス・セ
レビシェ−ＩＴ２４６／ｐＪＤＢ２０７／皿姫−ＴＰＡ
１８−闇４２１サツカロミセス・セレビシェ−ＩＴ２４
６／ｐＪＤ［１２０７／Ｉ”１１０５−ＴＰＡ１８−Ｍ
０４２１（１）サツカロミセス・セレビシェ−１１Ｔ２
４６／ｐＪＤＢ２０フ／皿饅−ＴＰＡ１８−８０４３２
１（１）サツカロミセス・セレビシェ−１ＩＴ２４６／
ｐＪＤ［１２０ル」閲兵−１−ＴＩ’＾−（資）１サツ
カロミセス・セレビシェ−肝２４６／ｐＪＤＢ２０７／
皿亜−１−ＴＰ八−闇２サツカロミセス・セレビシェ−
１１Ｔ２４６／ｐＪＤＢ２０７／理饅−夏−ＴＰＡ−を
噌（）−１□サツカロミセス・セレビシ：ｒ−−１１７
２４６／ｐＪＤ［１２０７／ＰＩ１０５−１−ＴＩ’Ａ
　−ＭＯ２１サツカロミセス・セレビシｚ−Ｈ゛ｒ２４
６／ｐＪＤＤ２０７／Ｉ’１１０５　１　　Ｔｌ’＾−
ＭＯ４２１サツカロミセス・セレビシェ−１１Ｔ２４Ｇ
／ｐＪＤＢ２０７／匹姫−１−ＴＰＡ−（資）４２１（
１）サツカロミセス・セレビシェ−１１７２４６／ｐＪ
ＤＢ２０７／ｒ’ｔ１０５　１　　ＴＰＡ−ＭＯ４３２
１（１）餅セし酵母側　抽　　の調Ｉ　び【−＾パ　の
′酵母細胞を、５０社のエルシンマイヤーフラスコ中の
２０社のＨＥ−１７培地（８，４ｇのイースト・ナイト
ロゼン・ベース（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ
５ｅ）（ディフコ）、１０ｇのし一アスパラギン（シグ
マ）、１ｇのＬ−ヒスチジン（シグマ）、１１当り４０
ｍ１の５０％グルコース溶液〕中で３０℃にて振とうし
ながら２４時間、８〜ｌ０ＸＩＯ’／ｍｔ’の濃度に達
するまで培養せしめる。細胞を遠心分離し、１０ｍ１の
０．９％ＮａＣ１中に再懸濁する。２ｍｌの再懸濁細胞
を用いて、２５０社のエルシンマイヤーフラスコ中、１
０ｇ／ｌのＬ−アスパラギン（シグマ）及び１０ｇ／！
のＬ−ヒスチジンを加えた低−Ｐｉ最少培地（ヨーロッ
パ特許出Ｗ４Ｎｏ、１４３０８１に記載されている＞５
０鋤ｌに接種する。
１０社の低Ｐｉ最少培地から細胞を、２４時間及び４８
時間後に、ファルコン２０７０チューブ中で３００Ｏｒ
ｐｍにて１０分間遠心することにより集める。
細胞を１０社の低Ｐｉ培地により１回洗浄し、そして遠
心分離する。、［ｌ胞ベレットを細胞溶解緩衝液（６６
ｎ＋Ｍリン酸カルシウム（ｐＨ７，４）　、　４　ｍＭ
ツビッテルゲント（ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎＬ）　（カル
ビオチム）〕中に懸濁する。この細胞懸濁液に８ｇのガ
ラスピーズ（直径０．５〜０．７５−ｍ）及び小ガラス
棒を加え、そして懸濁液をポルテックス・ミキサー（サ
イエンティフィック・インストルメンツ社、米国）上で
、全速で、２分間ずつの間隔で４×２分間、氷上で振と
うする。この操作により９０％以上の細胞が破砕される
。　　３０００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心することに
より細胞破片及びガラスピーズを沈降せしめる。上清を
エッペンドルフチューブに移す、Ｊ。
Ｈ，Ｖｅｒｆ＋ｅｉｊｅｎ等（Ｔｈｒｏｍｂ、ＩＩａｅ
ｍｏｓｔ、４８　、２２６（１９８２））により記載さ
れているようにして色度法により１−ＰＡ活性を測定す
る。
得られた結果を第１表に要約する。
Ｓ、セレビシェ−の株　　　　１．Ｕ、／１１０Ｄ、、
、　　μｇ／１１００（１；１ＩＦ１８／１）ＪＤＢ２
０７／Ｐ１１０５−ＴＩ’＾１８−８０１　　　２５０
　　　　　９ＧＲＦ１８／１）ＪＤ８２０７／則鮫−Ｔ
ｌ’＾１８−８０２１　　９５０　　　　　３４ＧＲＦ
１８／ｐＪＤＢ２０７／則垣−ＴＰＡ１８−Ｍ０４２１
　　６５０　　　　　２３１１Ｔ２４６／１）ＪＤ８２
０フ／ＰＨ０５−ＴＰ八へ８−８０１　　　　　１１１
２　　　　　　　　　　４０ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２０
７／Ｐ１１０５−ＴＰＡ１８−８０２１　　５３３０　
　　　１９０）ＩＴ２４６／ｐＪＤＤ２０７／則咀−Ｔ
ＰＡ１８−Ｍ０４２１　２２４０　　　　　８０伊１Ｊ
工３Ｎ、でのラーを母の酵 すべての形質転換体を液体窒素（気相）の温度にて次の
組成（ｇ／ｌ）： グルタミン酸ナトリウム　　　　　　５０シユークロー
ス　　　　　　　　　　５０デキストロース　　　　　
　　　　　５０の媒体中に維持する。
形質転換されたＳ、セレビシェ−株のそれぞれの３１規
模の発酵のため、２つの前培養を準備する。
寒天スラント上に新しく増殖した培養物の細胞１白金耳
を、次の組成（ｇ／ｌ’）： イースト・ナイトロゼン・ベース （ディフコ０９１９−１５＞　　　８．４Ｌ−アスパラ
ギン　　　　　　　　　１０Ｌ−ヒスチジン　　　　　
　　　　　１グルコース　　　　　　　　　　　　２０
を有する前培養培地５０Ｔ１１１に接種し、そして３０
℃、１８０ｒｐｍにて４８時間インキュベートする。
１０％の第１前培養物を第２前培養に接種し、そしてさ
らに２４時間インキュベートする。
第２前培養物を遠心し、細胞を０．９％ＮａＣ１に再懸
濁し、そして次の組成（ｇ／ｌ’）を有する発酵培地３
１に光学濃度（ＯＤｉ。。）が０．２となるように接種
する。
グルコース　　　　　　　　　　　　２０バクトーペプ
トン　　　　　　　　１５硫酸アンモニウム　　　　　
　　　３ 酵母エキス・オキソイド　　　　　Ｉ Ｌ−ヒスチジン　　　　　　　　　　０．ｌＭｇ５Ｏ，
・７１１□０　　　　　　　　　　発酵は、３１のＭＢ
Ｒバイオリアクター（Ｍ　ＲＢバイオリアクター社、ベ
チコン、スイス）中で３０℃にて、５００ｒｐｍの撹拌
速度及び１５０１／時の通気速度で行う。
４８時間後、約１２の光学濃度が達成される。培養液を
４℃に冷却し、遠心し、そして細胞ペレットを５０ｍＮ
リン酸緩衝液（ｐｌｌ）、４）中４−ツビッテルゲント
（Ｚｗｉｔｌｅｒｇｅｎｔ）　９　１４　（カルビオケ
ム）から成る破砕ＭｆＲ液中に再懸濁する。
１５０ｇのガラスピーズ（直径０．５ｍａｉ）を加え、
そして多−チューブボルテキサ−（サイエンティフィッ
ク・マニュファクチリング・インダストリーズ社、米国
）上置くことにより３０分間細胞を破砕する。
憇遅り生産されｔ−血　ｔ−Ｐｈの　。
破砕された細胞の懸濁液（例１４を参照のこと）を遠心
し、そして上滑に固体硫酸アンモニウムを３５％硫酸ア
ンモニウム飽和になるまで添加する。
懸濁液を遠心し、そしてペレットを０６１％シンベロニ
ック（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ）（商１％）ＰＥ／Ｆを含
有する０、２Ｍ酢酸アンモニウム中に溶解し、セファロ
ース−４Ｂビーズに連結されたＤＥ−３阻害剤６８．５
ｇ（浮型ｉ）を加え、そして懸濁液を４℃にて一夜おだ
やかに撹拌する。ビーズを溶液から分離し、０．１％シ
ンベロニックを含有する０、２Ｍ塩化ナトリウムで２回
洗浄し、直径１０ｍｍのカラムに充填し、そして０．１
％シンベロニックを含有する９、２Ｍ塩化ナトリウム１
０社で洗浄し、次に０．１％シンベルニックを含有する
０、２Ｍ酢酸アンモニウム中０．２Ｍ　ＮＨ，ＳＣＨの
溶液１０社により洗浄する。
次に、０．１％シンベルニックを含有する０、２Ｍ酢酸
アンモニウム中１．２Ｍ　ＮＨ，ＳＣＮにより３０社／
時の流速でＴ−Ｐｈを溶出する。
最も高いフィブリン溶解活性を有する両分をプールする
。約９０％以上の純度で変異ｔ−ＰＡを含有するプール
を用いて特徴付は研究及び生物学的アッセイを行う。
［７＝生物学・アッセイにおける・　ｔ−ＰＡの°゛性
プラスミドＩＪＤＢ２０７／　ＰＨ０５ＴＰＡ１８−Ｍ
ｏ１、ｐＪＤＢ２０７／則咀−ＴＰＡ１８−　Ｍ０２、
ｐＪ［１Ｂ２０７／則姐−ＴＰＡ１８−ＭＯ４、ｐＪＤ
Ｂ２０７／租咀−ＴＰＡ１８−８０２１．１）ＪＤＢ２
０７／泄咀−ＴＰＡ１８−Ｍ０４２１、ｐＪＤＢ２０７
／咀蛭−ＴＰＡ１８−Ｍ０４２１（１）　、ｐＪＤＢ２
０７／則鮫−Ｉ−ＴＰＡ−Ｈｏｔ　、ｐＪＤＢ２０７／
則鮫−１−ＴＰＡ−８０２、Ｉ）ＪＤＢ２０７／ＰＩ！
０５　１　　ＴＰＡ−Ｍ０４、　ｐＪＤＢ２０７／艦Ｗ
艷艷−１−ＴＰ八−８０２１、ｐＪＤ１１２０７／則咀
−Ｉ−ＴＰＡ−８０４２１、及び 異ｔ−ＰＡ、すなわち〔＾ｓｎ目り）−ｔ−Ｐｈ、〔八
１ａ＋ｓａ）　−ｔ−Ｐｈ、〔Δｌａ”’）−ｔ−Ｐｈ
、〔＾ｓ１１目９．ΔＩａ’　”）　−ｔ−Ｐｈ、〔＾
ｓ　ｎ　Ｉ　ｌζ＾１ａ＋ｓｓ、八ｓｎ”’）−ｔ−Ｐ
ｈ、及び〔＾ｓ　ｎ　Ｉ　ｌ　＠、＾１ａＩＩＩ−＾１
ａ４５°）−ｔ−Ｐｈをもたらし、これらの活性は酵母
野性型ｔ−ＰＡの活性と同等であるか又はこれに勝る。
すべての変異ｔ−ＰＡは、カゼインプレート及びフィブ
リンプレート（Ｊ、Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ等。
１１ａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　１８　、３０１（１９８３
）　）上で、Ｊ、Ｈ，Ｖｅｒｈｅｉ−ｊｅｎ等（Ｔｈｒ
ｏａ＋ｂ、ｌＩａｅｍｏｓｔ、４８　、２６６（１９８
２）’）により記載されている色度アッセイにおいて、
及び基質としてＤｂｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−ＡＭ
Ｓを用いる蛍光アッセイにおいて活性を示す。
蛍光アッセイにおいては、すべてのｔ−Ｐｈ溶液を、０
．０１％トウィーン８０及び０．０５％ｌ（Ｓ八を含有
する６Ｃ）＋Ｍリン酸緩衝液（ｐｔ１７．４）中に正確
に２０ＦＵ／ｍＮ（０，２８μｓ／ｍｊ’）に稀釈する
。全ｔ−ＰＡの約９０％が１本鎖形でありそして約１０
％が２本鎖形であることが確立される。
基本的にＲｏＤ、Ｐｈ１ｌｏ及びＰ、Ｊ、Ｇａｆｆｎｅ
ｙ（ＴＩ＋ｏｍｂ、Ｈａｅ−リム、怪、１０７−１０９
（１９８１）に閏って、異る変異ｔ−ｒ’へのクロット
溶解活性を測定するための試験を行う。
溶解時間の対数対ｔ−ＰΔ濃度の対数のプロットが直線
となり、その勾配が添加されたブラスミノーゲンアクチ
ベーターのフィブリン親和性を示す。
標準調製物の凝血溶解と比較することにより１．ｔｌ。
／１１１１を決定することができる６種々の変異ｔ−Ｐ
Ａについて得られる結果を第３図に示す。
この図から、（Ａｓｎ”’）　−ｔ−ＰＡ（直線３）及
び〔Ａｓ　ａ　ｌ　ｌ　９．＾ｌａ”’：］　−ｔ−Ｐ
Ａ（直線４）は比軸用黒色腫ｔ−ＰＡ（ｒａｔ　　ＰＡ
、直線１）とおよそ同じ勾配でインビトロで凝血を溶解
することがわかる。測定されたすべてのｔ−ＰＡが類似
のフィブリン活性を有することが結論される。しかしな
がら、［Ａｓ　ｎ　ｌ　ｌ　１．＾１ａｌａ８゜＾ｎ　
Ｓ　４　ｓ　ｏ　］　−５−ＰＡ（直線５）は、黒色１
ｉｔ−Ｐ八、酵母野性型ｔ−ＰＡ（直線２．ヨーロッパ
特許出願Ｎｏ。
１４３．０８１）、〔Ａｓｎ”　’）　−ｔ−ＰＡ、及
び〔Ａｓ　ｎ　ロー＾１ａＩ８り−ｔ−ｆ’八に比べて
約２倍速く凝血を溶解する。
上記のアッセイにおいて得られる活性（１，υ／ｌ１１
）の比率を次の第２表に要約する。
、１・″ぶ白 第ｎ Ｖ　Ｉ　Ｕ　＝Ｖｅｒｊｅｉ　ｊｅｎ等（前掲）による
１、ｌＩ。
Ｆ　Ｕ　　＝ＺｉｍＩＩｅｒｍａｎｎ等（前掲〉による
蛍光測定ユニット。
ＣＩ　ＬＪ　＝Ｐｈｉｌｏ等（前掲）によるクロット溶
解ＩＪ、。
舅１８．灸交帆匿 ｔ−ＰＡを含有する粗酵母抽出物から精製された凝血溶
解活性の同定を黒色腫ｔ−ＰＡに対するラビット・ポリ
クローナル抗体を用いてウェスタンプロットで示す。
約１２Ｆυの種々のトＰへ分子を還元条件下で１２．５
％ゲルを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分離する。
次に、基本的に製造者の指示に従って（Ｓｃｈｌｅｉｃ
−ｂｅｒ＆５ｃｈｕｅｌ　Ｉ　、フェルトバッハ、スイ
ス）蛋白質をニトロセルロース膜に移行せしりる。移行
は移行ｗｉａｔｒ液（グリシン１４．４Ｈ／　１　、　
Ｔｒｉｓ　３　ｇ／　１　、メタノール２０％）中で４
０　Ｖ　／　ｃｍにて２．５時間行う。
３％ＢＳＡ中で１時間ブロックした後、ニトロセルロー
スを抗体（ラビット血清、４Ｃ）ｍｌのＢＳＡ−ｔｆｉ
　ｍ液に１００μｌ）と共に一夜インキユベートする。
次に、抗体／ｌ−ＰＡ複合体を１２５１−プロティンＡ
（４０＋ｉｉ’ＢＳＡ　　’ｒｉｍ液に４μＣｉ）によ
り修飾する。
十分に洗浄した後、ニトロセルロース膜をＸ−線フィル
ムに暴露する。結果を第４図に示す。すべての変異ｔ−
１’Ａはポリクローナル抗体により検出され、そしてグ
リコシル側鎖の欠失に対応するサイズの減少を示す。各
変異は約ＩＫＤの分子量の喪失を説明する。
Ｐ１１９．　亦１ｔ−ＰＡのグリコジルイＩ状、ゲル電
気泳動後の１２５ニ一コンカナバリンＡ重層アッセイに
よりグリコジル化を測定する。コンカナバリンＡは、マ
ンノース残基を特異的に認識する植物レクチンである。
やはり１２ＦＩＪの各変異ｔ−ＰＡを１２．５％ＰＡＣ
εに適用する。次に、１０種類の蛋白質を７％酢酸中で
３０分間固定する０次に、ゲルを次の組織を有するレク
チン緩衝液中で洗浄する。
０．１５８　ＮａＣｌ ３０．５ｍＮ　Ｔｒｉｓ（ｐ）１７．４）０．５ｔａＨ
ＣａＣｌ２ ０．５ｔｓＨＨｎＣｌｚ ｐＨが約７．３に、達するまで洗浄を続ける。
次に、ゲルに、３ｍｇのヘモグロビン、１００μｇのコ
ンカナバリンＡ及び２μＣ１の＋２Ｊ−コンカナバリン
Ａを含有するレクチン緩衝液２ｍｌを注意深く重層する
。
加湿チャンバー内で一夜、インキュベートした隣、ゲル
をレクチン緩衝液中で十分に洗浄し、乾燥し、そしてＸ
−線フイルムに暴露する。すべての変異ｔ−ＰＡは１２
ｓＪ−コンカナバリンＡにより染色される．〔＾８ｎＩ
Ｉ１，＾１ａ１　＠６，＾８ｎ２２０，＾ｌａ”’）　
−ｔ−ＰＡさえレクチンとわずかに反応するので、この
変異ｔ−ＰＡは残留〇一結合糖成分を含有するものと結
論される． 四μＬ　叉口１　　　λ　　１ 上記のようにして得られた１本鎖形、２本鎖形又はこれ
らの混合の〔＾ｓ　ｎ　ｌ　ｌ　ｔ，＾１，１　ａ＠，
＾ｌ　ａ　４　％　０　）−ｔ−ＰＡを含有する溶液を
、０．０１％のトウィーン８０を含有する０．３Ｍ塩化
ナトリウムに対して透析し、そして−８０℃にて貯蔵す
る。投与に先立って、濃度を７５μ１１／ｔａｌの全（
すなわち１本鎖＋２本ｍ＞ｔ−ＰＡ及び０．　３　Ｍ　
ＮａＣＩに調製する。この溶液を０．２２μＩｌｌのメ
ンプランフィルターを通して無苗化する。
上記のｔ−ＰＡのほかに、前記の例に記載した他のｔ−
ＰＡ、例えば〔八ｓ＋＋””］−Ｌ−ＰＡ、〔＾ｌａ”
’）　−ｔ−ｒ’＾、〔八ｌａ”’）−ｔ−ＰＡ、　〔
＾ｓ　ｎ　目！，八Ｉａ”＠）−ｔ−ＰＡ、又は〔＾ｓ
　ｎ　Ｉ　＋　！，＾ｌａ＋＠＠．＾ｓｎ”’）　−ｔ
−ＰＡを同じ量で使用することができる。
この方法は、非経口投与、例えば靜脈内投与のための、
１本鎖形もしくは２本鎧形又はこれらの混合の変異ｔ−
ＰＡの溶液を調製するために適当である．
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＨｅＬａ細胞からのｔ−ＰＡのＤＮＡ配列及
び対応するアミノ酸配列を示す冫グリコシル化部位に下
線が付してある．矢印は、１本鎖形から２本鎖形のｔ−
ＰＡを生じさせるＡｒｇ及びＩｌｅ間の予想開裂部位を
示す． 第２図はこの発明の変異ｔ−ＰＡ蛋白賞の変異ｔ−ＰＡ
遺伝子のＤＮＡ配列、及び対応するアミノ酸配列を示す
． 第３図は、変異ｔ−ＰＡ、すなわち〔＾ｓｎ”９）　−
ｔ−ＰＡ（直線３）、〔＾ｓ　ｎ　ｌ　ｌ　％，＾ｌａ
”’）　−ｔ−ＰＡ（直線４》、及び〔＾ｓｎ１１９．
＾ｌａ＋１１＋，＾ｓｎ”’）　−１ＰＡ（直線５）の
クロット溶解活性を真正なヒト黒色腫ｔ−ＰＡ（直線１
）及び酵母野性型ｔ−ＰＡ（直線２）と比較して示すグ
ラフである． 第４図は、ウエスタンプロットによる変異し−ＰＡの免
疫検出を示す模式図である。 閃而の＃書（内容？ご変更なし） 二Ｍクノ−１ 成熟ｒ−ＰＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列
ＦＭ面の浄書Ｃ内容に変更なしク 二Ｍクｉ−２ ａｒｔｃＡＧ　ＴＴＴ　ＣＧＣ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　″Ａ
゜０゜゜”゜７゜ＧＣＣ　ＧＡｃＡＴＣ　ＧＣＣ．ＴＣ
Ｃ，　ＣＡＣ　ＣＣＣ　ＴＣ堰ｉ＋，．． ｑｕＴＧｃ０００ＯＣｅＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡｃｅｔｃ
ｃＴＧＣＴＧＱＡＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＡＣ
ＴＧＣＰＩＩＫＧＬＮＧＬＬｌＡＲＣＰＨＩＰＲＯＰＲ
ＯＨｉｓＩＩＴＳＬｔυＴＩＩＲＶＡＬＩＬＥＬｕｌｌ
ＧＬＹＡＲＣ丁＋１ＲｓｙｅｉｃＣＡＯＧＡＱＡ（Ｏ丁
τＴＣＣＯＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＧＴＧＡＴ
ＣＴＴＱＧＣ．ＣＡＧＡＡＣＡＴＹＲ　ＡＲＣ　ＶＡＬ
　ＶＡＬ’ＰＲ。ＯＬＹ　ｃｔ．ｕ　（＋ＬＬＩ　ＯＬ
。ＣＬＮ　ＬＹＳ　Ｐｌｌ。ＧＬＵ　ＶＡＬ　（＋ＬＬ
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τＧＡＣ　ＡＡＣ　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＣＣｆ 図面の浄書（内容に変更なし） ＴＣＴ−ＡＡＣＡＧＣＡＡＣ−ＡＡＴ　Ｃ０ＧＳｅｒ−
−Ａｇｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ−Ａｇｎ　ＧｌｙτＣＴ　　
　　　　　　ＡＡＣＡＧＣＡＡＣ□晶τＧＧＧ手続補正
書（方式） 昭和６２年６月７３日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第２７２０３３号 ２、発明の名称 変異組織プラスミノーゲンアクチベーター及びその製造 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　チバーガイギー　アクチェンゲゼルシャフト４、
代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番ｌＯ号静光
虎ノ門ビル　電話５０４−０７２１５、補正命令の日付 ６　補正の対象 図面（第１図、第２図） ７　補正の内容 図面第１図及び第２図について別紙のとおり枝番を付し
た図番に補正する。 ８　添付書類の目録

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−グリコシル化部位に存在する少なくとも１個の
    Ｓｅｒ（又はＴｈｒ）残基がＮ−グリコシル化を回避す
    る他のアミノ酸により置き換えられている点において野
    性型組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）
    と異るヒトｔ−ＰＡ蛋白質。 ２、次の式（ I ′）： 【アミノ酸配列があります】（ I ′） （式中、Ａ＿１＿−＿１＿１＿６は成熟ｔ−ＰＡのアミ
    ノ酸１−１１６から成るＮ−末端アミノ酸配列であり；
    Ａ＿１＿２＿０＿−＿１＿８＿３は成熟ｔ−ＰＡのアミ
    ノ酸１２０−１８３から成るアミノ酸配列であり；Ａ＿
    １＿８＿７＿−＿２＿１＿７は成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸
    １８７−２１７から成るアミノ酸配列であり；Ａ＿２＿
    ２＿１＿−＿４＿４＿７は成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸２２
    １−４４７から成るアミノ酸配列であり；Ａ＿４＿５＿
    １＿−＿５＿２＿７は成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸４５１−
    ５２７から成るＣ−末端アミノ酸配列であり；Ｙ＿１、
    Ｙ＿２及びＹ＿３はそれぞれＳｅｒであるか、又はＴｈ
    ｒ以外の他の遺伝的にコードされたアミノ酸であり、そ
    してＹ＿４はＴｈｒであるか、又はＳｅｒ以外の他の遺
    伝的にコードされたアミノ酸であり、但し基Ｙ＿１、Ｙ
    ＿２、Ｙ＿３及びＹ＿４の内の少なくとも１つはＳｅｒ
    及びＴｈｒではない）で表わされる特許請求の範囲第１
    項に記載のヒトｔ−ＰＡ蛋白質。 ３、Ａ＿１＿−＿１＿１＿６、Ａ＿１＿２＿０＿−＿１
    ＿８＿３、Ａ＿１＿８＿７＿−＿２＿１＿７、Ａ＿２＿
    ２＿１＿−＿４＿４＿７及びＡ＿４＿５＿１＿−＿５＿
    ２＿７が前記の意味を有し；そして、基Ｙ＿１、Ｙ＿２
    及びＹ＿３の内の１個又は２個がＳｅｒであり、そして
    他がＡｌａ及びＡｓｎから成る群から選択され、そして
    Ｙ＿４がＴｈｒであるか；又はＹ＿１、Ｙ＿２及びＹ＿
    ３がそれぞれＳｅｒであり、そしてＹ＿４がＡｌａ及び
    Ａｓｎから成る群から選択される、特許請求の範囲第２
    項に記載の式（ I ）のヒトｔ−ＰＡ蛋白質。 ４、Ａ＿１＿−＿１＿１＿６、Ａ＿１＿２＿０＿−＿１
    ＿８＿３、Ａ＿１＿６＿７＿−＿２＿１＿７、Ａ＿２＿
    ２＿１＿−＿４＿４＿７及びＡ＿４＿５＿１＿−＿５＿
    ２＿７が前記の意味を有し、そして基Ｙ＿１、Ｙ＿２、
    Ｙ＿３及びＹ＿４の内の少なくとも１個がＡｌａ又はＡ
    ｓｎであり、そして他がＳｅｒ（Ｙ＿１、Ｙ＿２及びＹ
    ＿３）又はＴｈｒ（Ｙ＿４）である、特許請求の範囲第
    ２項に記載の式（ I ）のヒトｔ−ＰＡ蛋白質。 ５、Ａ＿１＿−＿１＿１＿６、Ａ＿１＿２＿０＿−＿１
    ＿８＿３、Ａ＿１＿８＿７＿−＿２＿１＿７、Ａ＿２＿
    ２＿１＿−＿４＿４＿７及びＡ＿４＿５＿１＿−＿５＿
    ２＿７が前記の意味を有し、そしてＹ＿１、Ｙ＿２、Ｙ
    ＿３及びＹ＿４が相互に独立にＡｌａ及びＡｓｎから選
    択されるアミノ酸基である、特許請求の範囲第２項に記
    載の式（ I ）のヒトｔ−ＰＡ蛋白質。 ６、［Ａｓｎ＾１＾１＾９］−ｔ−ＰＡ、［Ａｌａ＾１
    ＾８＾６］−ｔ−ＰＡ、［Ａｌａ＾４＾５＾０］−ｔ−
    ＰＡ、［Ａｓｎ＾１＾１＾９、Ａｌａ＾１＾８＾９］−
    ｔ−ＰＡ、［Ａｓｎ＾１＾１＾９、Ａｌａ＾１＾８＾６
    、Ａｓｎ＾４＾５＾０］−ｔ−ＰＡ、［Ａｓｎ＾１＾１
    ＾９、Ａｌａ＾１＾８＾６、Ａｌａ＾４＾５＾０］−ｔ
    −ＰＡ、及び［Ａｓｎ＾１＾１＾９、Ａｌａ＾１＾８＾
    ６、Ａｓｎ＾２＾２＾０、Ａｌａ＾４＾５＾０］−ｔ−
    ＰＡから成る群から選択される特許請求の範囲第１項に
    記載のヒトｔ−ＰＡ蛋白質。 ７、１本鎖形である特許請求の範囲第１項に記載のヒト
    ｔ−ＰＡ。 ８、Ｎ−グリコシル化のためのシグナルとして認識され
    るトリペプチド配列の部分であるセリン又はスレオニン
    をコードする少なくとも１個のコドンがＮ−グリコシル
    化のための認識部位を廃止する異るアミノ酸をコードす
    る他のコドンにより置き換えられていることを特徴とす
    る変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する
    ＤＮＡ。 ９、次の式（II′）： 【遺伝子配列があります】（II′） （式中、Ｎ＿１＿−＿３＿４＿８は成熟ｔ−ＰＡの遺伝
    子のデオキシリボヌクレオチド１−３４８から成るデオ
    キシリボヌクレオチド配列であり、Ｎ＿３＿５＿８＿−
    ＿５＿４＿９は成熟ｔ−ＰＡの遺伝子のデオキシリボヌ
    クレオチド３５８−５４９から成るデオキシリボヌクレ
    オチド配列であり、Ｎ＿５＿５＿９＿−＿６＿５＿１は
    成熟ｔ−ＰＡの遺伝子のデオキシリボヌクレオチド５５
    ９−６５１から成るデオキシリボヌクレオチド配列であ
    り、Ｎ＿６＿６＿１＿−＿１＿３＿４＿１は成熟ｔ−Ｐ
    Ａの遺伝子のデオキシリボヌクレオチド６６１−１３４
    １から成るデオキシリボヌクレオチド配列であり、そし
    てＮ＿１＿３＿５＿１＿−＿１＿５＿８＿１は成熟ｔ−
    ＰＡの遺伝子のデオキシリボヌクレオチド１３５１−１
    ５８１から成るデオキシリボヌクレオチド配列であり；
    そしてＷ＿１、Ｗ＿２及びＷ＿３はそれぞれ、Ｓｅｒを
    コードするコドンであるか、又はＴｈｒ以外の他のアミ
    ノ酸をコードするコドンであり、そしてＷ＿４はＴｈｒ
    をコードするコドンであるか、又はＳｅｒ以外の他のア
    ミノ酸をコードするコドンであり、但しコドンＷ＿１、
    Ｗ＿２、Ｗ＿３及びＷ＿４の内の少なくとも１つはＳｅ
    ｒ及びＴｈｒ以外のアミノ酸をコードする）で表わされ
    る、特許請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ。 １０、Ｎ−グリコシル化部位に存在する少なくとも１個
    のＳｅｒ（又はＴｈｒ）残基がＮ−グリコシル化を回避
    する他のアミノ酸により置き換えられている点において
    野性型組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ
    ）と異るヒトｔ−ＰＡ蛋白質をコードするＤＮＡ。 １１、プロモーター、並びにＮ−グリコシル化のための
    シグナルとして認識されるトリペプチド配列の部分であ
    るセリン又はスレオニンをコードする少なくとも１個の
    コドンがＮ−グリコシル化のための認識部位を廃止する
    異るアミノ酸をコードする他のコドンにより置き換えら
    れていることを特徴とする変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコード
    するＤＮＡ配列を有するＤＮＡを含んで成るハイブリド
    ベクター。 １２、Ｎ−グリコシル化部位に存在する少なくとも１個
    のＳｅｒ（又はＴｈｒ）残基がＮ−グリコシル化を回避
    する他のアミノ酸により置き換えられている点において
    野性型組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ
    ）と異るヒトｔ−ＰＡ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を
    含んで成る特許請求の範囲第１１項に記載のハイブリド
    ベクター。 １３、Ｎ−グリコシル化のためのシグナルとして認識さ
    れるトリペプチド配列の部分であるセリン又はスレオニ
    ンをコードする少なくとも１個のコドンがＮ−グリコシ
    ル化のための認識部位を廃止する異るアミノ酸をコード
    する他のコドンにより置き換えられていることを特徴と
    する変異ｔ−ＰＡ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含有
    する形質転換された真核宿主生物。 １４、Ｎ−グリコシル化部位に存在する少なくとも１個
    のＳｅｒ（又はＴｈｒ）残基がＮ−グリコシル化を回避
    する他のアミノ酸により置き換えられている点において
    野性型組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ
    ）と異るヒトｔ−ＰＡ蛋白質、及び医薬として許容され
    る担体を含んで成る医薬組成物。 １５、哺乳類においてプラスミノーゲンの活性化を介し
    て、血栓症又は局所的フィブリン溶解活性又は蛋白質分
    解活性を生成せしめることが望まれる他の状態の処置の
    ための方法であって、該哺乳類に、療法的に有効な量の
    、Ｎ−グリコシル化部位に存在する少なくとも１個のＳ
    ｅｒ（又はＴｈｒ）残基がＮ−グリコシル化を回避する
    他のアミノ酸により置き換えられている点において野性
    型組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）と
    異るヒトｔ−ＰＡ蛋白質を投与することを含んで成る方
    法。
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