JPS62282582A - ヒト組織型プラスミノ−ゲン活性化因子ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、アミノ酸残基１１７に機能的な炭水化物構造
を欠いていることを特徴とする新規ヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子に関する。この新規ヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子は、それ以外、アミノ酸残基１
８４および／または４４８の機能的な炭水化物構造にお
いては修飾されていない（天然のものと比較して）。驚
くべきことに、この新規ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子は、天然のものと比較すると、実質的に完全な
生物学的活性を保持しており、さらに、予想外に長くな
った生体内半減期を有している。

従来技術 ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子はプラスミノー
ゲンをプラスミンに変換する。こうして生成したプラス
ミンは、血餅の主要要素を構成しているフィブリンマト
リックスをタンパク質加水分解的（、こ切断する。これ
によりヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子は血餅溶
解に関与し、従って、種々の血栓溶解に関する疾患の治
療に有用である。

ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の略号ｔ−ＰＡ
は、血栓症および止血に関する国際委員会×Ｘ■（ｔｈ
ｅ　ＸＸＶＩ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｒｔｈｅ　Ｉ　ｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ；
Ｂｅｒｇａｍｏ、　Ｉ　ｔａｌｙ、２７　Ｊｕｌｙ　１
９８２）に提案された後、保用されたちのである。本明
細書中で用いる場合、「ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子」、ｒｔ−ＰＡＪ、［ヒトｔ−Ｐ　ＡＪ、また
は「組織プラスミノーゲン活性化因子」なる語句は、ヒ
トの外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子を意
味し、これは、たとえば天然原料の抽出および精製［コ
ーレン等（Ｃｏｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）：欧州特許出
願Ｎｏ、４１７６６（１９８０年６月１１日の最初の出
願に基いて１９８１年１２月１６日公開）、およびすＣ
ｈｅｍ、、２５６，７０３５（１９８１））を参照］、
ならびに組換え細胞培養システム［たとえば欧州特許出
願公開Ｎｏ、９３６１９（１９８２年５月５日の最初の
出願に基いて１９８３年１１月９日公開）に、アミノ酸
配列および物理的および生物学的性質とともに記載され
ている］によって調製される。

米国特許Ｎｏ、４３２６０３３は、ウロキナーゼの炭水
化物構造を化学的に修飾することによってウロキナーゼ
の半減期を長くすることについて報告している。ウロキ
ナーゼはヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子と免疫
学的に異なっている。

このようなウロキナーゼの炭水化物修飾が他の糖タンパ
ク質にも応用可能であると考える根拠は、この米国特許
Ｎｏ、４３２６０３３あるいはその他のいずれにも存在
しない。事実、たとえばセルロプラスミンからシアル酸
を除去するとその半減期は劇的に短くなり、さらに、別
の血清糖タンパク質であるトランスフェリンに同じ処理
を行っても半減期について有意の効果は見られない［ン
ヤロＷｅｓｌｅｙ　Ｐｕｂｌ、Ｃｏ、、　ｌ　９４−１
９６頁（１９７５））：アッシュウエル等（Ａｓｈｗｅ
ｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、４１．９９（１９７４））およびアレキサングー等（
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ　ａｔ　ａｌ、、　Ｓ　ｃｉｅｎｃ
ｅ、　２２６　。

１３２８（１９８４））をも参照］。

特許出願国際公開Ｎｏ、ＷＯ８４／　ＯＩ　７８６　（
１９８２年ＩＯ月２８日の最初の出願に基いて１９８４
年５月１０日公開）には組織型プラスミノーゲン活性化
因子の無差別修飾（これにより、未修飾のポリペプチド
と比べると生物学的活性が減少し、半減期が長くなった
と称される分子となる）が記載されている。唯一の実施
例は、部分的に精製したヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子を過ヨウ素酸ナトリウムで処理すること（これ
により、最初の、未修飾品の約７０−９０％の活性を有
すると報告されている生成物が得られる）を包含するも
のである。このＷＯ８４１０１７８６には、天然物質、
およびこれはさらに重要であるが、彼等か調製したその
修飾化物に存在する炭水化物構造の性質および特徴につ
いて、正しい認識が示されていない。事実、過ヨウ素酸
塩はすべての炭水化物構造を酸化によって修飾または破
壊することが知られている（アミノ酸結合からそれらを
同時に、実質的に除去することなく）。

また、ＷＯ３４１０１７８６には、ヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子がどれくらいこのような構造を有し
ているのか、あるいは実際の炭水化物構造が何であるの
かについて、未修飾化物あるいは彼等の修飾化物のいず
れについても示されていない。従って、彼等の過ヨウ素
酸塩処理した分子は、特定の部位に焦点をあてることな
く、無差別にすべての炭水化物構造を酸化することによ
って修飾されたものである可能性が高い。

最近、グリコジル化および脱グリコジル化されたヒト組
織型プラスミノーゲン活性化因子の生体内クリアランス
速度には有意差がないことが報告されたが、これは、ヒ
ト組織型プラスミノーゲン活性化因子のクリアランス速
度は炭水化物が存在しないことによって影響されないと
いう結論を導くものである［ラーメン等（Ｌａｒｓｅｎ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　　ｉｎ　　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ　　ａｎｄ　　Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎ。

１ｏｇｙ、ＵｃＬＡ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　Ｐａｒ
ｋ　　Ｃ１ｔｙ、Ｕｔａｈ。

Ｆｅｂｒｕａｒｙ　９−１４　、ｃ　ｌ　９８６　））
；リトル等（Ｌ　１ｔｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２３．６１９１　（１９８４））
を参照コ。

発明の目的および構成 本発明者らは、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
がアミノ酸残基１１７に特異的な炭水化物構造を有し、
これがアミノ酸残基１８４および４４８の炭水化物構造
とかなり異なっていること、およびこれを完全に除去す
ると（またはアミノ酸Ａｓｎに結合したＮ−アセチルグ
ルコサミン部分は別にして）、実質的に完全な生物学的
活性を保持し、かつ予想外に生体内半減期が長くなった
新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子が得られる
ことを見い出した。

すなわち、本発明は、アミノ酸残基１１７に機能的な炭
水化物構造を欠き、その点を除けば機能的に修飾されて
いない炭水化物構造を有しくアミに完全な生物学的活性
を保持し、そして生体内半減期が長くなった（アミノ酸
残基１１７に無傷の４炭水化物構造を有する「天然の」
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子と比較して）新
規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子に関する。

さらに、本発明は、全配列中において１またはそれ以上
のアミノ酸が異なっているが、上に述べた特定の新規ヒ
ト組織型プラスミノーゲン活性化因子と同一の炭水化物
パターンを存する、生物学的に活性なヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子等個物に関する。また本発明は、
この新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造
に有用な方法、関連する組換えベクターおよび培養物に
関する。

本発明の範囲内に含まれるこのようなヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子等価物の１つは、タンパク質加水
分解酵素によって認識されるアミノ酸配列を除去するこ
とによりアミノ酸２７５と２７６の間の切断部位を破壊
した、いわゆる１本ば後記の方法に従い、関連するＤＮ
Ａコドンに部位特異的な突然変異誘発を行い、特定のア
ミノ酸を交換することによって行なわれる。

図面の説明 第１図は、未処理（レーンｌ）およびエンドＨ処理した
（レーン２）ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の
、コマッシー（Ｃｏｍａｓｓ　ｉｓ）染色した５ＤＳ−
ＰＡＧＥを表す。高分子量のバンドは１本領ｔ−ＰＡで
あり、その他のおもなバンドはタイプ■クリングル（Ｋ
ｌ）、タイプ■クリングル（Ｋ■）およびプロテアーゼ
（Ｐ）である。

第２図は、還元され、カルボキシメチル化されたｔ＝Ｐ
Ａのグリコンダーゼ消化を表す。レーン１ニーＮ−グリ
カナーゼ：レーン２：十Ｎ−グリカナーゼ；レーン３ニ
ーエンドＨ；レーン４：十エンドＨ０バンドの同定は第
１図と同じである。

第３図は出発プラスミドｐ（Ｊ　ＣＰ　ＡΔＨＤの制限
地図を表す。

第４図は、対照ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
（■）、酵素を用いずにエンドＨ処理工程に付したヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子（ム）、およびエン
ドＨ処理したヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（
・）についての、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈澱性放射
線活性の経時変化を表す。データは平均＋／−標準偏羞
（ＳＤ、ｎ＝５）である。

第５図は、対照ヒトｔ−ＰＡ（０）およびグルタミン、
、７ｔ−ｐＡ（ロ）についての、トリクロロ酢酸沈澱性
放射線活性の経時変化を表す。

第６図は、対照ヒトｔ−ＰＡ（ロ）およびグルタミン０
．グルタミン酸、、６　ｔ−ＰＡ（０）についての、ト
リクロロ酢酸沈澱性放射線活性の経時変化を表す。

詳細な説明 ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸残基
１１７の炭水化物構造、ならびにアミノ酸残基１８４お
よび４４８の炭水化物構造が、それぞれ以下のタイプの
組成物であることを見い出したニ アミノ酸残基１！７の炭水化物構造 二辷１塁ｉす」上互蝙す」旦ルＭ１貞 毒 ５ｉａ２＞３０ａｌ−＞４ＧｌｃＮＡｃ−ｉＴ２？ａｎ ＊４ ［構造式中、Ｍａｎはマンノース、Ｇａｌはガラクトー
ス、Ｆｕｃはフコース、Ｇ　ｌｃＮ　ＡｃはＮ−アセチ
ルグルコサミン、ｓ＋ａはシアル酸、およびＲはＨまた
は５ｉａ２−＋３Ｇａｌ−＋４ＧｌｃＮＡｃを表す］。

上記のｌ造は、ヒト組織型プラスミノーケ・ｉ’ｐ＋性
化因子に見い出されるＮ−結合オリゴ糖のタイプを表す
ものであるが、本発明がこれらの構造に限定されるもの
ではないことに注意すべきである。

グリコジル化部位のそれぞれはおそらく密接に関連した
同一ではない構造を数個含んでいるであろう。これは微
不均−性として知られており、糖タンパク質グリカン類
の一般的な性質である［Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｎ、、２
６０，４０４６（１９８５）を参照コ。

たとえば、高マンノース含有構造は存在するマンノース
単位の数が変わりうる。複合オリゴ糖では、微不均−性
は、シアル酸、フコース、ガラクトースおよびＮ−アセ
チルグルコサミンの残基数ならびに分岐の程度における
差異を包含することができる。このような微不均−性は
本発明の範囲内に含まれる。

アミノ酸１１７の高マンノース含有構造は、アミノ酸残
基１８４および４４８のより複雑な構造とその構造が異
なるのみならず、その機能を完全に除去することにより
（１８４および４４８の構くなった生体内半減期を有す
る、完全に生物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子が得られることにおいても独特であること
が判明した。

アミノ酸残基１１７の機能的な炭水化物構造の除去とは
、たとえば、後述する様に、グリコジル化シグナルを部
位指向性突然変異誘発によって破壊する完全な除去、ま
たはＡ８Ｌ＋ｔに結合した無傷のＮ−アセチルグルコサ
ミン残基を切り離すことができるエンドグリコシダーゼ
処理による実質的な除去を意味する。アミノ酸残基１８
４および／または４４８の機能的に修飾されていない炭
水化物構造とは、無傷の構造を保持しているか、または
そのような構造のすべてを実質的に保持しており、天然
タンパク質と機能的に等価であることを意味する。

好ましい態様では、アミノ酸残基１１７の機能的な炭水
化物構造の除去は、グリコジル化シグナルＡｓｎ　−Ｘ
　−Ｓ　ｅｒ／　Ｔｈｒ（Ｘはどんなアミノ酸であって
もよい）の関連ＤＮＡにおける部位特異的な突然変異誘
発によって行なわれる。組織型プラスミノーゲン活性化
因子の場合、このシグナルを表す配列はＡｓｎ＋＋７（
Ｓｅｒｚａ）Ｓｅｒｚｓである。従って、アミノ酸残基
１１７の機能的な炭水化物構造の除去は、たとえばこれ
らのアミノ酸残基に対応するコドンに突然変異誘発を行
なうことにより、シグナル機能を破壊することによって
得られる。

詳述すると、突然変異誘発をこのシグナルの対応コドン
について行ない、たとえば位置１１７にはアスパラギン
（Ａｓｎ）以外のアミノ酸残基、および／または位置１
１９にはセリン（Ｓｅｔ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）
以外のアミノ酸残基、または位置１１８にはアミノ酸残
基プロリン（Ｐｒｏ）を有するヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子を調製することができる。最乙好ましい
態様では、構造か密接に近似していることに鑑みて、ア
スパラギン１，７をグルタミンに置き換えるか、または
２番目のクリングル領域における類似配列に鑑みて、セ
リン１、。

をメチオニンに置き換える。

突然変異誘発は自体既知の方法、たとえ（Ｌシラー等が
概説した方法［Ｚｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　’ｋｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１００．４
６８（１９８３）］に従って行なわれる。たとえば、位
置１１７のアスパラギンをコードしているコドンＡＡＣ
をＣＡＡまたはＣＡＧに変えることにより（２個のヌク
レオチド交換が必要）、発現産物は位置１１７にグルタ
ミンを含有するようになるであろう。本明細書中で行う
その他の突然変異は遺伝子コードの分析表に従って行な
う。

アミノ酸残基１１７の機能的な炭水化物を除去する別の
方法は、エンドグリコシダーゼ［たとえば、アミノ酸残
基１８４および４４８の複合構造に機能的に影響するこ
となくアミノ酸残基１１７（Ａｓｎ）の高マンノース炭
水化物構造を除去（実質的に）することができるエンド
グリコシダーゼＨ］の使用を包むものである。この処理
も自体既知の方法、たとえばタレンチノ等［Ｔａｒｅｎ
ｔｉｎｏ　ｅＬａｌ、。

Ｊ　、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４９．８１１（１９７
４）］およびトリンブル等［Ｔｒｉｍｂｌｅ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅなわれる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ 部位特異的な突然変異誘発を用いて、位置１１７にアミ
ノ酸残基グルタミンを有する組織型プラスミノーゲン活
性化因子をコードしているＤＮＡを、機能的に（ｏｐｅ
ｒａｂｌｙ）含有している発現ヘクターを、以下のよう
にして構築した。

Ａ、オリゴヌクレオチドの設計 配列・ ５°−ＴＧＣ−ＡＣＣ−ＡＡＣ−ＴＧＧ−Ｃ＊Ａ＊Ａ＊
−ＡＧＣ−ＡＧＣ−ＧＣ（、−３゜［２４−ｍｅｒ　Ｑ
ｌ　１７：配列中、＊は突然変異（ａｓｎ−＋ｇｌｎ）
コドンを表す］ で示される２４−ｍａｒオリゴヌクレオチドをフレア等
［Ｃｒｅａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８．２３３１（１９８０）］の
ホスホトリエステル法によって合成した。

プラスミドｐＵ　ＣＰ　ＡΔＨＤ（第３図）はｐＥＴＰ
ＦＲと称されるプラスミド（前記ＥＰＯ９３６１９に開
示されており、ｐＰＡＤＨＦＲ−６とも称される）の誘
導体であり、以下の修飾がなされている。すなわち、１
）エキソヌクレアーゼＢａ１３１を用いて、１６６ｂｐ
の５°非翻訳化ＤＮＡ７！ｌ＜ｔ−ＰＡ遺伝子の５゛末
端から削除されている：２）Ｈｉｎｄ［［部位が新しい
ｔ−ＰＡ遺伝子の５°栄端に付加されている；３）Ｅｃ
ｏＲＩＳＳａｃｌ、５ｅａｌ、ＢａｍＨＩＳＸｂａｌ、
５ａｌ（およびＰｕｖＩＩに対する認識部位を含有する
ポリリンカーがｔ−ＰＡ全発現導＜ＳＶ４０初期プロモ
ーターの５°末端に付加されている：４）ｐＥＴＰＦＲ
の位置３５３９のＨｉｎｄｕＩ部位がフレノウ（Ｋ　ｌ
ｅｎｏｗ）充填反応によって破壊されている。

プラスミドｐ［Ｊ　ＣＰ　ＡΔＨＤをＳｍａＩで消化し
、コドンＮｏ、　５０７を含むｔ−ＰＡ遺伝子を含有す
る約２　、　Ｏｋｂのフラグメントを、ゲルからのフラ
グメントの電気溶離およびＰＡＧＥによって単離した。

また、Ｍ１３ｍｐｌＯ［メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、上ｌ上
、２０（１９８３））］ベクターもＳ　ｍａ　Ｉで消化
し、フェノール、クロロホルムで１回抽出し、エタノー
ル沈澱させ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８，０）、１ｍＭ　
ＥＤ　Ｉ　Ａ（Ｔ　Ｅ）に再懸濁した。Ｔ４　　ＤＮＡ
リガーゼを用いて、このｐｕ　ＣＰ　ＡΔＨＤ由来の約
２　、０　ｋｂフラグメントを、Ｓ＋＋ａｌ切断したＭ
１３ｍｐｌＯにライゲートし、得られたＤＮＡを用いて
Ｅ、コリ（３３，（ｏｌｉ）ＪＭＩＯＩを形質転換した
。得られたファージを単離し、挿入体の存在を確認し、
その配向をファージ・ミニプリバレージョンの制限分析
によって決定した。組換えファージの１つ、すなわちＭ
１３／ｌ−ＰＡ−ＳＭＡを次いで行う突然変異誘発の鋳
型として選んだ。

Ｃ１突然変異誘発反応 突然変異誘発ブライ７−（２４−ｍｅｒ　Ｑ　１１７）
を１本鎖Ｍｌ　３／ｌ−ＰＡ−ＳＭＡ　ＤＮＡにアニー
リングし、ｄＮＴＰｓおよびＴ４　　ＤＮＡリガーゼの
存在下、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼ・フレノウフラグ
メントで処理してインビトロでヘテ本領本鎖ＲＦ分子を
創製した［アデルマン等（Ａｄｅｌｍａｎｅｔａｌ、、
ＤＮＡ、２，１８３（１９８３））の開示のようにして
コ。これらの分子を用いてＥ、コリ株ＪＭＩ　０１　（
ＡＴＣＣＮｏ、３３８７６）を形質転換し、所望の突然
変異を導入したファージを、突然変異誘発プライマーを
プローブとして用いるプラークハイブリダイゼーション
によって検出しな［アデルマン等（上記）］。突然変異
ファージの１つを単離し、Ｍｌ　３／ｌ−ＰＡ−ＳＭＡ
−ＧＬＮｌ１７と命名した。

ファージＭｌ　３／ｌ−ＰＡ−ＳＭＡ−ＧＬＮ　１１７
の２本鎖ＤＮＡをＳｍａＩＳＢｇｌＩ［およびＡｐａ■
で消化し、約１．４ｋｂのフラグメントをＰＡＧＥで精
製した。次いでこのフラグメントを用いてｐＵＣＰＡΔ
ＨＤ中の対応するフラグメントを置換した。

ｔ−ＰＡ遺伝子フラグメントを含有する組換えびＱｌ　
１７を、以下のようにしてＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞［ウ
ルラブ等（Ｕｒｌａｂ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、　７７．４２１６　（１９
８０））］に導入し、増幅した。りプラスミドＤＮＡを
、グラハム等［Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　、
Ｖ　１ｒｏ１．、５２．４５５（１９７３）］のリン酸
カルシウム沈澱法によって細胞に導入する；２）選択培
地［ヒボキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培
地（−ＨＧ　Ｔ　）］で生成したコロニーについて、フ
ィブリンおよびプラスミノーゲンを含有する寒天プレー
トにおけるフィブリンの消化によって判定されるプラス
ミンの生成を検出することによって、間接的にｔ−ＰＡ
全発現検定する［グラネリア等（Ｇ　ｒａｎｅｌｌｉａ
　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｅｘｌ）、Ｍｅｄ、、　１４８．２
２３（１９７８））が開示］；３）最も強く陽性を示す
クローン５つについて、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定を用いて細
胞あたりの分泌ｔ−ＰＡ量を定量的に検定する；４）最
高レベルのｔ−ＰＡを分泌するクローンを次のようにメ
トトレキセイト（ＭＴＸ）にプレートする・すなわちＭ
ｍｖ亡−１：　ｎ　　Ｉ　ｎ　ｎ七）−ＩＪＱ　ＣＡ−
＆／４女＋ｆ　Ｉ００ｙプレートに２ＸＩＯ５細胞をプ
レートする；５）ＭＴＸ存在下に生成した５つのクロー
ンを抽出し、上記工程３）と同様にしてＥＬ［ＳＡによ
って定量的に検定する；６）最高レベルのｔ−ＰＡを分
泌するクローンを上記工程４）と同様にしてより高濃度
のＭＴＸにプレートし、次いで生成する５つのクローン
を定量検定し、ｔ−ＰＡを最も多く産生ずるクローンを
選択する。

得られるセルラインからＬ−ＰＡ産生の増加が全く得ら
れなくなるまで上記の増幅およびスクリーニング操作を
繰り返し、対応する突然変異し−ＰＡを後に使用するた
めに分離する。

実施例２ 実施例１の記載と同様の方法を用い、配列：５’−ＣＣ
−ＡＡＣ−ＴＧＧ−ＡＡＣ−ＡＧＣ−Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊−Ｇ
ＣＧ−ＴＴＧ−Ｇ−３’Ｃ２４−ｍｅｒ　　Ｍｌ　　ｌ
　　９コで示される２４−ｍａｒオリゴヌクレオチドを
用いて対応するＭｅｔ＋＋ｓ突然変異体を調製し、ｐＵ
ｃＰ−ＡΔＨＤＭ１１９を得た。発現による対応Ｍ１１
９突然変異体の調製は上記実施例１と同様である。

実施例３ グルタミン１，７グルタミン酸ｚｔｓｔＰＡ突然変異体
を以下のようにして調製した。

上記のようにして調製したプラスミドｐｕｃｐＡΔ［（
ＤをＢｇｌｌＩおよび５ｃａｒで消化し、組織型プラス
ミノーゲン活性化因子ＤＮＡ配列のコドン１−２５４に
対応する約７６３ｂｐのフラグメントを、自体既知の方
法により５ＤＳ−ＰＡＧＥで精製した。

ヒトｔ−ＰＡ　ＤＮＡをプラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６
（ｐＥＴＰＦＲとも称される）およびｐＡ２５ＥＩＯか
ら得た。これら２種類の１−ＰＡプラスミドの調製は、
欧州特許出願公開Ｎｏ、０９３６１９に記載されている
。

プラスミドＭ２５ＥｌＯは、ｔ−ＰＡ遺伝子の最後のア
ミノ酸５０８個をコードしている配列および３゛非翻訳
化領域の塩基対７７２個を含有する。このプラスミドを
５ａｃＩおよびＢｇｌｎで消化して７４４塩基対のフラ
グメントを調製し、これを前記のような常法によって単
離した。このフラグメントはｔ−ＰＡのアミノ酸４１１
から５２７に対応するコドンを含有し、３゛非翻訳化領
域の一部を含有する。

プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６は、ｔ−ＰＡの完全な構
造遺伝子および３゛非翻訳化領域の一部を含有する。こ
のプラスミドをＳ　ａｃ　ＩおよびＢｇｌｌｌで消化し
て１２３０塩基対のフラグメントを調製し、これを単離
した。このフラグメントは、完全なｔ−ＰＡの最初のア
ミノ酸４１０個に対応するコドンを含有する。

常法を用い、これらのフラグメントをいっしょに１７で
ライゲートし、Ｂｇｌ［Ｉで消化した。全完熟ｔ−ＰＡ
配列に対応するコドンおよび３′非翻訳化領域の一部を
含有するｌ９７４塩基対のフラグメントを単離した。２
本鎖Ｍ１３ｍｐ８［メシング等（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ
　ａｌ、）、Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍ
ｐ。

ｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ　。

９８１）］をＢａｍＨＩでｌ白化し、Ｂｇｌ（１／肖化
したし−ＰＡとアニーリングしてＭ　［３ｍｐ８　ＰＡ
Ｂｇｌｌｌを生成させた。Ｅ、コリＪＭＩ　０１細胞（
ＡＴＣＣＮｏ、３３８７６）を、２本鎖の複製型Ｍ１３
ｍｐ８ＰＡＢｇｌｌＩで形質転換した。１本鎖および２
本鎖（ＲＦ）型のＭｌ　３ｍｐ８ＰＡＢｇｌｎを、こノ
ファージで感染させたＥ、コリＪＭ［ＯＩ細胞から単離
することもできる。この単一鎖型を、Ｌ−ＰＡの部位特
異的な突然変異誘発に用いた。

ヒトｔ−ＰＡ構造遺伝子を部位特異的な突然変異誘発に
よって修飾し、種々の位置にアミノ酸置換を有するｔ−
ＰＡを発現させた。Ｄ　Ｎ　Ａ配列ｌｕ Ｇ　　ＣＣＴ　　ＣＡＧ　　ＴＴＴ　　ＧＡＡ　　ＡＴ
ＣＡＡＡ　　ＧＧＡ　　Ｇ で示される合成オリゴヌクレオヂド（ブライマー２０９
）を、たとえばフレア等ＣＣｒｅａ　ｅシミｔ、、　Ｐ
　ｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、７５，
５７６５（１９７８）］の固相リン酸トリエステル法に
よって凋アデルマン等［Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、
、ＤＮＡ、２，１８３（１９８３）］の一般的な方法を
用いて、合成プライマーの突然変異配列を含有するｔ−
ＰＡクローンを調製した。上記に示した、アミノ酸１個
だけの突然変異を含有するプライマーを用い、突然変異
体ｔ−ＰＡクローンＭｌ　３ＲＦ２Ｃ９を調製した。

プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６（ｐＥＴＰＦＲとも称さ
れる二上記欧州特許出願公開Ｎｏ、９３６１９参照）に
おいては、天然のｔ−ＰＡ構造遺伝子の発現はＳＶ４０
　　Ｔ−抗原の初期プロモーターの制御下にある。また
、このプロモーターはＤＨＰＲ遺伝子の発現をもコント
ロールしている。ｐＰＡＤＨＦＲ−６をＢｇｌｌＩおよ
びＢｓｔＥＩＩで消化することによって得られる大きい
フラグメントを単離することにより、ベクターフラグメ
ントｌを得た。ｐＰＡＤＨＦＲ−６をＢｇｌＩＩおよび
ＢｓｔＸＩで消化することによって得られる４００塩基
対のｔ−ＰＡフラグメントを単離することにより、別の
フラグメント２を得た。突然変異ｔ−ＰＡクローンＭ１
３ＲＦ２Ｃ９由来のＲＦ　　ＤＮＡをＢｓｔＸＩおよび
ＢｓｔＥＩＩで消化することにより、所望の突然変異を
含有する１１４１塩基対のｔ−ＦＡフラグメント３を得
た。フラグメント１および２をフラグメント３とライゲ
ートした。このＤＮＡ混合物を用いてＥ、コリを形質転
換し、真核生物性発現ベクターｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ
９を得た。

上記および欧州特許出願公開Ｎｏ、　１９９５７４（公
開日＋１９８６年！０月２９日）の記載のようにして調
製したプラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９は、グルタ
ミン酸、？６組織型プラスミノーゲン活性化因子突然変
異体をコードしているＤＮＡ配列を含をしている。これ
を５ｃａｒおよびＡｐａｌで消化し、組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子ＤＮＡ配列のコドン２５４から４６６
に対応する約６３０ｂｐのフラグメントを、自体既知の
方法により５ＤＳ−ＰＡＧＥで精製した。

ＢｇｌＩＩ−Ｓｃａｌ（ｐＵＣＰＡΔＨＤ）および５ｅ
ａｒ−Ａｐａｌ（ｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９）の２種類
のフラグメントを、ｌ白化ｐＵ　ＣＰ　ＡΔＨＤからの
大きいＢｇｌ［（ｂｐ　５３１）　−Ａｐａｌ（１９２
６ｂｐ）フラグメントにライゲートし、得られたグルタ
ミン１，７グルタミン酸ｚｔｓｔ　　ＰＡ突然変異ＤＮ
Ａを含有するプラスミドを常法によりミニスクリーニン
グした。得られたプラスミドを上記のようにしてＤＨＦ
Ｒ欠失ＣＨＯ細胞に導入し、増幅し、そして対応する突
然変異ｔ−ＰＡを後に使用するために分離した。

実施例４ ｔ−ＰＡのアミノ酸配列は、Ｎ−結合グリコシル化の可
能性のある部位を４つ含んでいる［Ａｓｎ−Ｘ−５ｅｒ
／Ｔｈｒ；Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４１．
６７３（１９７２）］。これらはアスパラギン残基１１
７．１８４．２１８および４４８である［Ｎａｔｕｒｅ
、３０１．２１４（１９８３）］。しかし位置２１８は
、ｔ−ＦＡにおいてはグリコジル化されていないことが
見い出された。位置１８４は、タイプＩのｔ−ＰＡでは
グリコジル化されているが、りｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、２３．３７０１　（１９８４）］。

プロナーゼ消化したｒｔ−ＰＡをゲル濾過クロマトグラ
フィーにかけると２種類のＮ−結合オリゴ糖に分かれる
（第１表）。より高分子量の物質の組成は、フコース化
された複合タイプのオリゴ糖と一致した。より低分子量
の物質は、小さい高マンノースオリゴ糖に対して予想さ
れる組成（おそら＜ＭａｎｅＧｌｃＮＡｃｙ）を有しテ
ィた。

特異性の異なるグリコシド酵素を用いて、高マンノース
オリゴ糖の結合位置を決定した。用いた酵素はエンド−
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（エンドＨ；Ｇ
ｅｎｚｙｍｅ、　Ｉ　ｎｃ、　：この酵素は高マンノー
スオリゴ糖を除去するが複合タイプのオリゴ糖には作用
しない）およびペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｎ−
グリカナーゼ；Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｉ　ｎｃ、；この酵素
は高マンノースおよび複合タイプオリゴ糖の両者を除去
する）である。これらの実験に用いたｔ−ＰＡはプラス
ミンで２本鎖型に変換し、次いで還元し、カルボキシメ
チル化したもの５ＤＳ−ＰＡＧＥは、還元されカルボキ
シメチル化された２本領ｒｔ−ＰＡをタイプｒクリング
ル（１１７および１８４のグリコジル化）、タイプロク
リングル（１１７のグリコジル化）およびプロテアーゼ
（４４８のグリコジル化）に分離する。ｔ−ＰＡをＮ−
グリカナーゼ消化すると、タイプロクリングルよりわず
かに大きい移動度の位置にこのクリングルバンドを合体
させ、またプロテアーゼの移動度を増加させる（第２図
、レーン２）。Ｌ−ＰＡをエンドＨ消化すると、それぞ
れのクリングルバンドの電気泳動移動度を増加させるが
、プロテアーゼバンドの移動度には影響しない（第２図
、レーン４）。エンドＨによる結果は、タイプ１および
タイプロクリングルのそれぞれが高マンノースオリゴ糖
を含有していることを示している（これは、タイプ■お
よびタイプロクリングルの両者においてグリコジル化さ
れる唯一の位置である、残基１１７に位置していなけれ
ばならない）。

エンドＨ処理によっては、タイプＩクリングルはタイプ
■に変換されない。従って、タイプＩクリングルにおい
てグリコジル化されているがタイプ■においてはグリコ
ジル化されていない残基Ｉ８４は複合オリゴ糖を含有し
ている。また、Ｎ−グリカナーゼ処理するとｒｔ−ＰＡ
のプロテアーゼ部分の移動度が増加するが、エンドＨは
影響を及ぼさないので、位置４４８も複合構造を含有し
ていなければならない。

第１表　プロナーゼ消化した１−ＰＡ由来のオリゴ糖フ
ラクンヨンの炭水化物組成ａ）ａ：Ｆｕｃ＝フコース、
Ｍａｎ＝マンノース、Ｇａ１＝ガラクトース、ＧｌｃＮ
Ａｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、５ｉａ＝ンアル酸 ｂ：チオバルビッール酸検定 ｃ：３マンノースに規格化 ｄ：　２　Ｇ　ｌｃＮ　Ａｃに規格化 実施例５ エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（エン
ドＨ）をＧｅｎｚｙｍｅ、　Ｉ　ｎｃ、より購入した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥを、レンムリ［Ｌ　ａｅｍｍｌｉ、　
Ｎ　ａｔｕｒｅ。

２２７．６８０（１９７０）コの開示と同様にして行っ
た。上記ＥＰＡ９３６１９の記載と同様にして調製した
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子［０８辺９．０
．０１％ツイーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　８０を含有する０
、２Ｍリン酸アルギニン（ｐＨ６）からなるフオーミュ
レーション緩衝液０　、２　ｍＱ中］を、エンドＨ［０
，１単位、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＩ（６）０゜
０５１中］およびアジ化ナトリウム（０，０２％）と混
合した。この試料を３７°Ｃで２０時間インキュベート
した。エンドＨ溶液のかわりにリン酸ナトリウム緩衝液
（２５■のｏ、ｏ５ｍｃ）を用いること以外は同様にし
て、対照ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子試料を
調製し、インキュベートした。インキュベート後、これ
らの試料をフォーミュレーンヨン緩衝液で希釈して合計
容量０．７５．ｖ（２的に透析した。この試料を濾過し
く０４ミクロント■■フィルター、Ａｍ１ｃｏｎ）、４
°Ｃで貯蔵した。

脱グリコジル化は、還元およびカルボキンメチル化後の
５ＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした。

このようにして調製したヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子の一部（０，０５＋９、フォーミュレーンヨン
緩衝液０．０１ａＱ中）を、２５ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ６、Ｏ，０ＩＳｆｆｌ＆）および２０ｍＭジヂオ
トレイトール含有の２×レンムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試
料緩衝液（０，０２５ｘＱ）と混合した。この試料を９
５℃で５分間加熱し、次いで冷却した。ヨード酢酸（０
，０１５１，１Ｎ水酸化アンモニウム中の０．６７Ｍ溶
液）を加え、試料を暗所中、室温で３時間インキュベー
トした。還元され、カルボキシメチル化された試料を５
ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。

この分析において、未処理の対照２本鎖ヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子は、タイプＩクリングル（位置
１１７および１．８４のグリコンルル化）、およびプロ
テアーゼに対応する３つのおもなバンドに分かれる（第
【図、レーン１）。ヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子をエンドＨ消化すると、各クリングルバンドの電気
泳動移動度を増加させるが、プロテアーゼバンドの移動
度には影響しない（第１図、レーン２）。

エンドＨ処理したヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子のフィブリン溶解活性を、コーレン等［Ｃｏ１１ｅｎ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｃｌｉｎ、Ｐａｔｈ、、２１．７
０５（１９６８）］のインビトロ血餅溶解検定法によっ
て検定した。エンドＨ処理したヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子の活性は、この検定における未処理対照
のものと差がなかった。

ヒト組織プラスミノーゲン試料をヨウ素ビーズ法［マー
クウェル（Ｍａｒｋｗｅｌｌ、　Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　ｉ
ｏｃｈｅｍ、　、１２５．４２７（＋　９８２））コで
約２μＣｉ／μ９の比活性になる様にヨウ素化した。０
．２Ｍアルギニン、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ６，０）お
よび０．０１％ツイーン８０がすべてに用いた緩衝液で
ある。ヨウ素化に先だってすべての試料をこの緩衝液に
透析し、た。ヨウ素化に先だってトリス塩基でｐ）ｌを
８．２に調整した。このヨウ素化混合物を、緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃ　ｉａ）にかけ、空容量からの放射活性フラクショ
ンをプールし、５ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、そして乾燥ゲ
ルをオートラジオグラフィーにかけた。ラベルしたヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子のオートラジオグラ
フィーによって、９５％以上の放射活性がヒト組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子に導入されていることがわか
った。

ラベルしたヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のそ
れぞれを、非ラベルの原料とｔ　：２００（ラベル：非
ラベル、ｗ／ｗ）の割合で混合し、耳に動脈カテーテル
をセットしたウサギにポーラスとして静脈注射した。各
ウサギに、１１９７に９の非ラベルおよびｌＯμＣｉ／
ｋｇのラベルヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を
与えた。非ラベルヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子は、クリアランス経路における濃度依存性から起こる
こともある薬動力学における変化を避け、治療レベルを
達成するために、痕跡量のラベルヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子の担体（キャリアー）として用いた。

動脈血液試料を連続して２６分間にわたって集め、直ち
に、ＥＤＴＡおよびｐ　−ｐｈｅ　−ｐｒｏ　−ａｒｇ
−クロロメチルケテン（ＰＰＡＣＫ）の凍結乾燥混合物
を含有する試験管に、最終濃度それぞれ■μＭおよび４
　、８　ｍＭとなるように入れた。この試験管を氷上に
置き、血漿を分離した。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈澱
性（無傷のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子）お
よび合計放射活性を、それぞれの血漿試料について測定
した。また、ポリクローナル抗体を利用し、かつ少なく
とも３０ｎ９／ＩＩ（ｌの有効感度を有するサンドイッ
チＥＬＩＳＡ法によって、免疫反応性ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子も測定した。

ウサギにおける生体内クリアランス実験から２種類のデ
ータが得られた。１つは非ラベル物質のクリアランスの
尺度となるべき免疫反応性ヒト組織型プラスミノーゲン
活性化因子からのものであの、ヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子を表す、ＴＣＡ沈澱性の放射活性である
。免疫反応性およびＴＣＡ沈澱性カウントからの、時間
に対する血漿濃度曲線を、適当な多重指数モデルに適合
させ、得られた薬動力学的パラメーターを比較した。

実施例６ エンドＨ処理したヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子、対照ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子、およ
び２番目の対照ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
（酵素の非存在下、エンドＨ処理したヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子と同じ反応条件下で処理した）の
薬動力学的なプロファイルを第４図に示す。２種類の対
照が実質的に同じプロファイルであることは、１１７の
単糖を除去するのに必要な操作がヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子のクリアランスの変化に寄与しなかっ
たことを示している。このエンドＨは、よりゆっくりと
消失する。このデータを分析すると、β相に対するゼロ
時間外挿濃度の増加に加えてα相クリアランス速度の増
加があることがわかる。エンドＨ処理したヒト組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子は、時間と濃度の積の積分で
測定したとき（これは、曲線下領域と呼ばれ、比較的憶
測のない生物学的利用率の尺度である）、生物学的利用
率を約２倍増加した。

試験群それぞれにキャリアー量の非ラベルヒト組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子を与えた。すべての場合にお
いて、非ラベルヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
の薬効力学的なプロファイルは、試験したすべての群に
ついて異ならなかった。これは、所定のグループに割り
当てられたウサギが、たまたま異常なりリアランスの性
質を有するものではなかったことを証明するための内部
対照として役立つ。

グルタミンｚｔｔ−ＦＡおよび対照ヒトｔ−ＰＡの薬効
力学を第５図に示す。このグルタミン１，７ｔ−ＰＡは
対照よりゆっくりと消失する。

第６図に示すように、実施例３の記載のようにして調製
したグルタミン、１７グルタミン酸ｚｔｓｔ−ＰＡは同
様のプロファイルを示す。

フィブリン結合の性質 フィブリン結合性は、ヒト組織型プラスミノーゲン活性
化因子が生体内で有するフィブリン特異性におそらく直
接的に関係している、極めて重要な因子である。エンド
Ｈヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のフィブリン
結合性を２種類の方法で評価した。第１の方法は、標準
機Ｍ′ａ定皿のウェルに被覆したフィブリンによりヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子を捕捉し、次いで各
ウェルを洗浄し、プラスミンのための色素基質（Ｓ−２
２５１、Ｋａｂｉ）およびプラスミノーゲンの溶液を加
える方法である。現れた色は、最明の工程で捕捉された
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の量に比例する
［アングルスーカノ（Ａｎｇｌｅｓ−Ｃａｎｏ、Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｔ（ａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、
　５４　、　Ｉ　７１　（１９８５））］。第２のフィ
ブリン結合検定法は、プラスミノーゲンを含まないフィ
ブリノーゲンおよびヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子の溶液にトロンビンを加えたときに、その溶液に残
っているヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の量を
ＥＬｒＳＡによって測定するものである［リノケン等（
Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ、ｃ
ｈｅｍ、、　２５７　。

２９２０（１９８２））］。どちらの検定が、変性ヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子のフィブリン結合の
生体内での結果を満足に予想するかは、現在のところ明
確ではない。それぞれの検定からのデータに基いて、エ
ンドＨ処理したヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
は、改良されてはいないにしても、少なくとも変化して
いないフィブリン特異性を有していると結論することが
できる。

同様に、グルタミンＩ＋？グルタミン酸ｔｔｄ　　ＰＡ
（実施例３）のフィブリン結合の試験データから、フィ
ブリンの刺激および比活性において、グルタミン、１７
グルタミン酸ｔ’＋５ｔ−ＰＡがグルタミン酸７．。

る；とがわかった。

実施例７ 実施例１および２に記載したようにして調製したｇｌｎ
＋＋□およびｍｅＬ。突然変異体について、上記と同様
にして、それぞれフィブリン溶解活性を試験し、エンド
Ｈ処理した物質を用いたときと同様の結果を得た。また
それぞれの薬効力学ら、上記のように、対照ヒト組織型
プラスミノーゲン活性化因子と比較すると、エントドＩ
処理した物質のものと同様である。

実施例８　医薬組成物 本発明の化合物は、薬学的に許容しうる担体と混合し、
既知の方法に従って製剤化して薬学的に有用な組成物を
調製することができる。適当な担体およびその製剤（他
のヒトタンパク質、たとえばヒト血清アルブミンを含む
）は、たとえばマーチン（Ｅ　、Ｗ、Ｍａｒｔｉｎ、　
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ＳＰ　ｈａｒ＋＋＋ａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅｓ）が開示している。この
ような組成物は、宿主への有効投与に適した薬学的に許
容しバク質とともに適当量の担体を含有する。

たとえば、本発明のヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子を、心臓血管の疾患または症状に苦しんでいる患者
に非経口的に投与することができる。投与量および投与
速度は、他の心臓血管の血栓溶解剤の臨床研究に最近用
いられているものと同様であってよい（たとえば、心筋
梗塞、肺動脈塞栓症等に苦しんでいる患者に、１．５−
１２時間にわたって、静脈内または動脈内投与量として
約１−２ｔｎｇ／ｋｇ体重）。

適当な投与剤形の１例として、ヒト組織型プラスミノー
ゲン活性化因子５ｏｘ９、アルギニン、リン酸およびポ
リソルベート８０を含有するバイアルを、注射用滅菌水
５０ｘＱで戻し、適当量の０゜９％塩化ナトリウム注射
液と混合することもできる。

半減期が長くなったヒト組織型プラスミノーゲン活性化
因子は、迅速な静脈内注射に適している。

これは、複雑な投与法を不要なものにし、限られた医療
装置しかない場合において、たとえば準医療従事者が配
置されている救急機関において、Ｌ−ＰＡを使用する機
会を増加させろであろう。また、半減期が長くなったヒ
ト組織型プラスミノーゲン活性化因子は、より低い、よ
り安全な初期投与量を可能にし、血栓溶解に烏果がある
プラスミンレベルを４５分間またはそれ以上にわたって
維持するであろう。さらに、半減期がより長くなったヒ
ト組織型プラスミノーゲン活性化因子は、急性の血栓を
うま（溶解した後の再閉塞を避けるために必要になるこ
ともある低投与量長期治療に、あるいは周囲の血管が閉
塞している場合に必要になることもある長期間の面枠溶
解にも有用であろう。

以上、特定の好ましい態様を記載したが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。ここに開示した態様に基
いて種々の修飾が為されるであろうが、このような修飾
は本発明の範囲内に含まれるべきものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、未処理およびエンドＨ処理したヒトｔ−ＰＡ
について５ＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった結果を示す写真
の模写図であり、第２図は、還元され、カルボキシメチ
ル化されたｔ−ＰＡをグリコシダーゼ消化した結果を示
す写真の模写図であり、第３図は、プラスミドｐＵ　Ｃ
Ｐ　ＡΔＨＤの制限地図を表す模式図であり、第４図は
、対照ヒトｔ−ＰＡ、酵素を用いずにエンドＨ処理工程
を行ったヒトｔ−ＰＡ１およびエンドＨ処理したヒトｔ
−ＰＡについて、トリクロロ酢酸沈澱性放射活性の経時
変化を測定した結果を表すグラフであり、第５図は、対
照ヒトｔ−ＰＡおよびグルタミンＩＩ？ｔ−ＰＡについ
て、トリクロロ酢酸沈澱性放射活性の経時変化を測定し
た結果を表すグラフであり、第６図は、対照ヒトｔ−Ｐ
ＡおよびグルタミンＩ＋？グルタミン酸２７ｓｔ　　Ｐ
Ａについて、トリクロロ酢酸沈澱性放射活性の経時変化
を測定した結果を表すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａ）アミノ酸残基１１７に機能的な炭水化物構造
   を欠き、ｂ）その点を除けば機能的に修飾されていない
   炭水化物構造を有し、ｃ）実質的に完全な生物学的活性
   を保持し、そしてｄ）長くなった生体内半減期を有する
   ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子。 （２）位置１１７にアスパラギン以外のアミノ酸を含有
   する第（１）項記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性
   化因子 （３）位置１１９にセリンまたはトレオニン以外のアミ
   ノ酸を含有する第（１）項記載のヒト組織型プラスミノ
   ーゲン活性化因子。 （４）位置１１７にグルタミンを含有する第（１）項記
   載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子。 （５）位置１１９にメチオニンを含有する第（１）項記
   載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子。 （６）位置１１８にプロリンを含有する第（１）項記載
   のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（７）突然変
   異誘発された１本鎖の、第（１）項記載のヒト組織型プ
   ラスミノーゲン活性化因子。 （８）位置１１７にグルタミンおよび位置２７５にグル
   タミン酸を含有する第（７）項記載のヒト組織型プラス
   ミノーゲン活性化因子 （９）第（１）項記載のヒト組織型プラスミノーゲン活
   性化因子および薬学的に許容しうる担体を含有してなる
   医薬組成物。 （１０）実質的に完全な生物学的活性を保持し、そして
   長くなった生体内半減期を有するヒト組織型プラスミノ
   ーゲン活性化因子の製造方法であって、アミノ酸残基１
   １７の機能的な炭水化物構造を削除することからなる方
   法。 （１１）アミノ酸アスパラギンをコードしているコドン
   以外のコドンを位置１１７に有するか、またはアミノ酸
   セリンおよびトレオニンをコードしているコドン以外の
   コドンを位置１１９に有する、ヒト組織型プラスミノー
   ゲン活性化因子をコードしているＤＮＡを組換えＤＮＡ
   発現させることによって該ヒト組織型プラスミノーゲン
   活性化因子を製造する第（１０）項記載の方法。 （１２）グルタミンをコードしているコドンを位置１１
   ７に有する、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を
   コードしているＤＮＡを組換えＤＮＡ発現させることに
   よって該ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を製造
   する第（１０）項記載の方法。 （１３）メチオニンをコードしているコドンを位置１１
   ９に有する、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を
   コードしているＤＮＡを組換えＤＮＡ発現させることに
   よって該ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を製造
   する第（１０）項記載の方法。 （１４）グルタミンをコードしているコドンを位置１１
   ７に有し、グルタミン酸をコードしているコドンを位置
   ２７５に有する、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
   子をコードしているＤＮＡを組換えＤＮＡ発現させるこ
   とによって該ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を
   製造する第（１０）項記載の方法。